Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост и физиологическая характеристика культуры ткани Ruta graveolens

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смолов, Александр Петрович

I. ВВЕДЕНИЕ.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Метод культуры тканей и клеток растений и его использование

2. Рост и темновое дыхание культуры ткани и клеток а) Состав питательной среды и рост культуры ткани и клеток. б) Действие компонентов питательной среды на рост культуры ткани и клеток. в) Действие внешних факторов на темновое дыхание хдгльтуры ткани и клеток. г) Способ и начальный этап утилизации сахарозы культурой ткани и клеток д) Соотношение ростовой и дыхательной активности культуры ткани и клеток и пути утилизации экзогенной сахарозы

3. Фотосинтез и рост культуры ткани и клеток а) Влияние компонентов питательной среды на синтез пигментов в культуре ткани и клеток. б) Структурная организация фотосинтетического аппарата и функциональная активность изолированных хлоропластов культуры ткани и клеток в) Фиксация COg и пути углерода при фотосинтезе культуры ткани и клеток. г) Действие света на накопление биомассы культурой ткани и клеток. д) Автотрофные культуры тканей и клеток: современное состояние проблемы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рост и физиологическая характеристика культуры ткани Ruta graveolens"

Одной из важнейших проблем, стоящих перед биологической наукой является проблема рационального использования возможностей растительной клетки дош нуад народного хозяйства. Решение этой задачи особенно актуально в настоящее время, когда начинают разрабатываться биотехнологические цриемы получения целого ряда полезных для человека соединений, специфичных для растительной клетки (алкалоиды, стероидные соединения, гликозиды и др.).

Важным направлением, которое успешно и интенсивно разрабатывается в последнее время, является изучение способности растительных клеток и тканей in vitro к синтезу веществ вторичного происхождения. Культуры клеток и тканей в ряде случаев синтезируют вещества высокой биологической активности, что позволяет использовать эти объекты в качестве сырья для фармацевтической, парфюмерной, а в перспективе, и пищевой промышленности (Березнеговская и др., 1978).

Преимущество культур тканей in vitro перед высшими растениями состоит в том, что получение медикаментов и/или специфических ингредиентов из них не связано с сезонными сборами растительного материала, зависящего от погодных условий. Интерес к культурам тканей растений-продуцентов возрастает также в связи с тем, что природные ресурсы или истощаются, или не в полной мере удовлетворяют интересы человека из-за трудности выращивания и акклиматизации некоторых тропических растений-продуцентов с длительным вегетационным периодом.

Изучение большого количества культур тканей лекарственных растений (к недавнему прошлому их насчитывалось около пятидесяти) показало, что в них сохраняется почти полный набор веществ вторичного происхождения, свойственный высшим растениям. Однако, количества этих веществ обычно во много раз ниже, чем в соответствующем органе целого растения (Воллосович, 1970). Известны лишь отдельные случаи, когда в культуре ткани появлялись вещества несвойственные данному виду растения (Воллосович, 1970).

Увеличение количества ценных веществ вторичного происхождения в культуре клеток и тканей возможно двумя путями: путем количественного увеличения биомассы или путем усиления синтеза необходимого метаболита. Поэтому вопрос стимуляции роста и накопления вторичных метаболитов приобретает решающее значение для биотехнологического использования культуры ткани как продуцента важных фармакологических соединений.

Кроме того, обычно культуры тканей выращиваются на питательных средах, богатых дорогостоящими органическими соединениями, необходимыми для роста, поэтому переход с гетеротрофного на авто-трофный способ питания может существенно снизить затраты на получение практически ценных лекарственных веществ.

Очевидно, что решение задачи стимуляции роста и снижения материальных затрат на выход больших количеств биомассы невозможно без знания физиологических и биохимических процессов, протекающих в культуре клеток и тканей.

Необходимость физиолого-биохимической направленности исследований в изучении процессов роста и его стимуляции вполне очевидна. Ростовые характеристики растительного объекта во многом зависят от рН среды культивирования, температуры, аэрации, а в случае выращивания зеленых культур тканей, и освещения. Известно, что изменение условий культивирования приводит к изменению (или смене) биохимической направленности процессов катаболизма и анаболизма, что в свою очередь также отражается на ростовых характеристиках.

Однако, недостаточность знаний в области фундаментальных исследований физиологической и биохимической регуляции роста и регуляции вторичного метаболизма культур клеток и тканей, по-видимому, и является ограничением в создании высокорентабельных технологий.

Как отмечает член-корреспондент АН СССР Дутенко Р.Г. (Бутен-ко, 1983), одной из особенностей культивируемых клеток растений, определяющей характер создаваемых на их основе технологий является ".способность образовывать клеточную биомассу, содержащую экономически важные продукты, в специальной аппаратуре, позволяющей параметрическое регулирование, в том числе и с помощью компьютерной техники".

Культура ткани Ruta graveolene содержит богатый состав лекарственных веществ вторичного происхождения, среди которых особую ценность составляют фуровумарины (Кузовкина, 1975). Исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено, что многие производные кумаринов обладают активным антикоагулирующим, спазмолитическим и фотосенсибилизирующим действием. На основе фурокума-ринов отечественной фармацевтической промышленностью получены несколько препаратов, которые успешно используются при лечении ряда серьезных заболеваний ("пастинацин", "аммифурин", "бероксан" и др.). Антимитотическая активность некоторых кумаринов может оказаться полезной при изучении их противоопухолевого действия (цит. по: Кузовкина, 1975).

В отличие от целого растения, культура ткани Ruta graveolene наряду с сохранением почти всего спектра веществ вторичного про-исховдения имеет существенное преимущество, которое состоит в возможности регуляции роста и метаболизма составом питательной среды.

Целью настоящей работы было исследование роста, изучение изменений таких физиологических показателей, как поглощение субстрата, темновое дыхание, фотосинтез и взаимосвязи между ними, а также апробация некоторых подходов для получения автотрофной по углероду каллусной ткани Ruta graveolens.

Основные задачи работы состояли в следующем:

1. Изучение роста гетеротрофной и фотогетеротрофной культуры ткани руты и его связи с поглощением экзогенного субстрата в цикле выращивания.

2. Определение степени участия темновых и светозависимых процессов (темновое дыхание, фотосинтез) в накоплении биомассы.

3. Поиск возможных путей повышения фотосинтетической активности фотогетеротрофной культуры ткани руты.

4. Отработка метода получения автотрофной по углероду каллусной ткани руты.

Положения, выносимые на защиту:

- рост, как темновой, так и фотосинтезирующей культуры ткани зависит от содержания сахарозы в питательной среде. Для обеих культур эта зависимость носит линейный характер. Полное исчезновение сахарозы из питательной среды приводит к остановке роста;

- фотостимуляция ассимиляции экзогенной сахарозы фотогетеротрофной культурой ткани контролируется продуктом световой стадии фотосинтеза. Наиболее вероятным регулятором является НАДФ^,*

- углеродное обеспечение фотосинтеза в достаточной мере осуществляется темновым дыханием. Вклад процесса фотосинтеза в накопление сухой массы фотогетеротрофной культуры ткани в 3-4 раза меньше, чем темнового дыхания;

- фотосинтетические показатели фотогетеротрофной культуры ткани могут быть повышены путем отбора наиболее зеленых участков каллуса и последующего их культивирования на обедненных сахарозой питательных средах;

- показана возможность получения автотрофной по углероду каллус-ной ткани. Однако, необходимо отметить ее низкую скорость роста, несмотря на высокую фотосинтетическую активность как изолированных хлоропластов, так и самого каллуса.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Метод культуры тканей и клеток растений и его использование

Получение новых сведений о сущности биологических явлений и о функциях клеточных структур в значительной мере зависит от применения моделей, максимально приближенных к нативному состоянию, и разработки высокоразрешагащих и точных методов исследования.

Интенсивно разрабатываемый в последние годы метод культуры изолированной ткани и клеток представляет собой пример управляемого биологического моделирования.

Под методом культуры ткани и клеток принято понимать способ выращивания in vitro отдельных органов, тканей и клеток в стерильных условиях на твердых (гелеобразных) или жидких питательных средах. В соответствии с условиями выращивания следует различать культуру тканей и культуру клеток растения. Культура тканей -выращивание в длительной пересадочной культуре сообщества клеток, возникших путем пролиферации изолированных сегментов какого-либо органа, культура клеток - выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.

К числу первых попыток применения этого метода на растительном объекте следует отнести работу Хаберландта (цит. по Бутенко, 1964), который, работая с клетками палисадной паренхимы, считал, что такие клетки менее требовательны к составу питательной среды, так как хотя бы частично мо:цут обеспечивать свой рост in vitro за счет питательных веществ, образующихся в процессе фотосинтеза. Однако, исследователю не удалось наблюдать ни деления, ни роста клеток в условиях in vitro.

Неудача, постигшая Хаберландта, привела к потере интереса исследователей в разработке метода культуры ткани и клеток на растительных объектах на длительное время.

Новый импульс в развитии метода был получен в 30-40 г.г. Основанием для этого послужили успехи в культивировании тканей и клеток животного происхождения.

В новых систематических исследованиях наряду с традиционными способами совершенствования приемов культивирования (подбор питательных сред, техника изоляции и др.) были начаты работы по изучению действия химических и физических факторов на процессы роста и деления клеток, а в последние годы интенсивно изучаются вопросы гормональной, метаболитной и физиологической регуляции жизнедеятельности растительной клетки.

Метод культуры ткани и клеток находит все более широкое применение для решения целого ряда задач, имеющих теоретическое значение. К ним относятся: цроблемы дифференциации и дедифференциа-ции растительных клеток; вопросы морфогенеза; изменение генетической информации путем воздействия физическими и химическими мутагенными факторами; интеграция генетического материала различных видов растительных клеток; изучение опухолевого роста и ДР.

Практическое значение этого метода связано с возможностью биотехнологического использования культур тканей и клеток в качестве продуцентов экономически важных, в первую очередь лекарственных. веществ. Практическое значение для сельского хозяйства имеет метод при выведении гибридных сортов растений, а также цри освобождении посадочного материала овощных и плодово-ягодных культур от вирусных заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Смолов, Александр Петрович

17. ВЫВОДЫ

1. Рост как темновой, так и фотосинтезирующей культуры ткани зависит от содержания сахарозы в питательной среде. Для обеих культур эта зависимость носит линейный характер. Полное исчерпание сахарозы из питательной среды приводит к остановке роста.

2. Впервые установлено, что превышение скорости роста и накопление биомассы фотогетеротрофной ткани, по сравнению с гетеротрофной, вызвано двумя светозависимыми процессами: фотосинтезом и фотостимуляцией ассимиляции экзогенного субстрата.

3. Впервые оценен вклад процесса фотосинтеза в накоплении биомассы фотогетеротрофной ткани. Величина этого вклада составляет примерно 20-25 % от общего количества накопленной биомассы.

4. Определены составляющие общего газообмена при изменении концентрации кислорода в газовой фазе. Получены данные, свидетельствующие о необходимости присутствия кислорода в газовой фазе даже при выращивании каллуса в автотрофных условиях. Максимальное потребление кислорода наблюдается между экспоненциальной и стационарной фазой роста.

5. Фотосинтетические показатели фотогетеротрофной ткани (скорости выделения 02, поглощения С02) могут быть повышены в 2-3 раза при снижении концентрации сахарозы в питательной среде о 3 % до 2 %,

6. Снижение скорости роста при значительном увеличении фотосинтетической активности автотрофной культуры ткани, а также анатомическое строение данного объекта ставят под сомнение идею получения длительно культивируемой, активно растущей и автотрофной по углероду каллусной ткани.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, характер кривой роста и суммарное накопление биомассы гетеротрофной и фотогетеротрофной культурой ткани Ruta gravedens зависит от содержания сахарозы в питательной среде. Независимо от способа культивирования, гетеротрофного или фотогетеротрофного, эта зависимость носит линейный характер (рис.10) в течение периода активного роста в цикле выращивания. Остановка в накоплении биомассы (прекращение роста) совпадает с полным истощением основного компонента питательной среды - сахарозы. Оптимальная концентрация сахарозы для роста фотогетеротрофной культуры ткани (рис.7) не является оптимальной ни для накопления хлорофилла, ни для активности фотохимических реакций изолированных хлоропластов (табл.8).

Основным цроцессом, обеспечивающим строительным и энергетическим материалом растущие клетки каллуса, является темновое дыхание. Даже при выращивании культуры ткани на свету интенсивность процесса темнового дыхания значительно выше интенсивности процесса фотосинтеза (рис.14).

Расчет количеств выделенной С02 (и соответственно поглощенного 02) растущим каллусом фотогетеротрофной ткани культуры показывает, что наибольшее количество С02 выделяется (поглощается 02) в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста. Этот результат может быть использован при подборе условий аэрации для получения культур тканей и клеток в контролируемых условиях биотехнологического цроцесса или для получения из них полезных для человека метаболитов.

Наличие процесса фотосинтеза в фотогетеротрофной культуре ткани руты положительно сказывается и на увеличение сухой массы в цикле выращивания. Однако, вклад этот невелик, и как показывает расчет (уравнение I и У) составляет 20-25 % от общего количества накопленной биомассы. Важно отметить, что интенсивность процесса темнового дыхания в достаточной мере обеспечивает процесс фотосинтеза углекислым газом. Именно за счет этого и увеличивается эффективность использования углерода сахарозы фотогетеротрофной культурой ткани. Как недавно было показано Нато с соавт. (Natо et al., 1983), до 90 % углерода сахарозы может использоваться на биосинтетические процессы фотогетеротрофной культурой ткани.

Помимо процесса фотосинтеза в фотогетеротрофной культуре ткани руты существует и другой светозависимый процесс, стимулирующий поглощение экзогенного субстрата - сахарозы.

Относительно стимулирующего действия света на поглощение экзогенной сахарозы можно сказать, что эта стимуляция находится под контролем продукта световой стадии фотосинтеза. На основании опытов с диуроном, КЦХФГ (табл.2 и рис.12) и нечувствительности ассимиляции сахарозы к экзогенно добавленной АТФ (рис.11), а также анализа литературных данных по первичным продуктам фотосинтеза цри фиксации 14С02 на свету, можно высказать предположение, что наиболее вероятным ретулятором этого процесса является НАДФН2.

Высокая активность темнового дыхания, по сравнению с интенсивностью процесса фотосинтеза фотогетеротрофной культуры ткани, может обеспечиваться только при достаточном наличии атмосферного кислорода. В случае, когда кислород выступает лимитирующим фактором темнового дыхания, утилизация сахарозы осуществляется по пути цроцесса брожения (рис.19 и 20), что должно приводить к торможению ростовой функции (Steward et al., 1952; Dalton, Street, 1976).

Несмотря на то, что сахароза является основным источником углерода для роста фотогетеротрофной культуры ткани, ее функция, по-видимому, не исчерпывается только участием в темновом процессе поддержания и роста каллусных клеток. При снижении концентрации сахарозы в питательной среде с 3 % до 2 % происходит заметное усиление фотохимических характеристик изолированных хлоропластов и усиление фотосинтетической способности каллуса.

Замена углерода сахарозы на углерод GOg, т.е. переход на автотрофный способ питания, также приводит к повышению и скоростей фотохимических реакций изолированных хлоропластов, и скорости фиксации COg. Однако, в условиях автотрофного культивирования сразу же наблюдается значительное снижение активности ростовой функции. Культивирование каллусной ткани в автотрофных условиях позволяет поддерживать слабый рост в течение 5-6 циклов выращивания цри продувании смесью воздуха и углекислоты (99 % и I %, соответственно). Замена этой газовой смеси на газовую смесь, содержащую I % GO2 и 99 % азота сразу же приводит к обесцвечиванию зеленого каллуса и полному прекращению роста.

К настоящему времени, за единственным исключением (Corduan, 1970), удалось длительно культивировать в автотрофных условиях с высоким коэффициентом роста только культуры клеточных суспензий (Katoh et al., 1979; Sato et al., 1980; Dalton, 1980; Horn et al., 1983; Bergmann, 1967).

Возможно, что подобное различие между автотрофной каллусной тканью и автотрофной клеточной суспензией по отношению к цродук-ционному процессу связано не только с различием в структурно-морфологической организации этих объектов, но и возможностью обеспечения продуктами фотосинтеза потребляющие процессы, направленные на увеличение биомассы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смолов, Александр Петрович, Пущино

1. Бенина P.M., Щувалов В.А., Лысенко Г.Г., Мошенцева В.Н., Лебедева А.Ф. Исследование механизма фотоокислительных превращений органических кислот в хлоропластах. - Физиология растений, 1975, т.22, № 4, с.680-687.

2. Бойко Г.Н. Изучение морозостойкости изолированных тканей вишни, яблони и груши. Физиология и биохимия культурных растений, 1976, т.8, Л I, с.49-52.

3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. Изд-во "Наука", М., 1964, 270 с.

4. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии состояние и нерешенные цроблемы. - Тезисы докладов "Культура клеток растений и биотехнология". Изд-во "Штиинца", Кишинев, 1983, с.5.

5. Васильев Б.Р., Звонцова Н.А., Савинов И.П., Шмидт В.М. Математический анализ роста листьев. Ботанический журнал, 1973, т.58, № 9, с.1294-1301.

6. Вийль Ю., Лайск А., Оя В., Пярник Т. Стимулирующее действие кислорода на фотосинтез. ДАН СССР, 1972, т.204, № 5,о.1269-1271.

7. Воллосович А.Г. Культура изолированных тканей как продуцент фармакологически важных соединений. В сб. "Культура изолированных органов, тканей и клеток растений". Под ред. Бутенко Р.Г. Изд-во "Наука, М., 1970, с.234-245.

8. Гамбург К.З., Высоцкая Е.Ф., Леонова Л.А., Опарова Л.М.,

9. Дише 3. Цветные реакции, основанные на восстанавливающих свойствах Сахаров. В сб. "Методы химии углеводов". Под ред. Кочеткова Н.К. Изд-во "Мир", 1967, с.53-54. .

10. Заботин А. И. Определение фотоиндуцированных изменений рН при исследовании фотофосфорилирования. В сб. "Методы исследования фотофосфорилирования". Под ред. Кириченко Е.Б. Пущино-на-Оке, 1970, с.182-195.

11. Зеленский М.И. Применение полярографического метода определения кислорода к исследованию фотосинтеза. В сб. "Методы комплексного изучения фотосинтеза". Под ред. Быкова О.Д. Изд-во ВИР им.Н.И.Вавилова, Л., 1969, с.102-126.

12. Игнатьев А.Р., Полевая B.C., Шабаева Э.В., Маркова Е.Б. Фотосинтетический и темновой метаболизм углерода культуры ткани Ruta graveolens разного возраста. Физиология растений, 1979, т.26, 3 I, с.5-13.

13. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Изд-во "Наукова думка", Киев, 1980, 488 с.

14. Кретович В.Л. Основы биохимии растений. Изд-во "Высшая школа", М., 1971, 464 с.

15. Кузнецова Л.Г. Пути ассимиляции углерода тканями растений в культуре in vitro: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1973, 28 с.

16. Кузовкина И.Н. Образование кумаринов в изолированной корневой ткани руты душистой (Ruta graveolene) : Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1975, 32 с.

17. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. -Изд-во "Наука", М., 1976, 646 с.

18. Ленинджер А. Биохимия Изд-во "Мир", М., 1974, 957 с.

19. Мещеряков А.Б., Холодова В.П. К вопросу о роли электрохимического градиента протона в мембранном транспорте моносахаридов в клетки суспензионной культуры сахарной свеклы. Физиология растений, 1983, т.30, № 5, с.990-997.

20. Мокроносов А.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма: ХШ Тимирязевские чтения от 3 июня1981 г., М., "Наука", 1983 , 63 с.

21. Обручева Н.В., Ковалев А.Г. О физиологической интерпретации сигмоидных кривых роста органов растения. Физиология растений, 1979, т.26, № 5, с.1029-1043.

22. Опритов В.А., Орлова О.В. О роли электрохимического градиента протона в транспорте сахарозы через плазматические мембраны клеток высших растений. ДАН СССР, 1983, т.272, Л 3, с.758-761.

23. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. Изд-во "Колос", М., 1968, 183 с.

24. Полевая B.C., Игнатьев А.Р., Шабаева Э.В. Рост и фотосинтетическая активность фотогетеротрофной и автотрофной культуры ткани руты. Цущино, 1982, 5 с., (Препринт), НЦБИ АН СССР, ИФС АН СССР.

25. Попов А.С. Криогенное хранение культур клеток растений. В сб. "Культура клеток растений". Под ред. Бутенко Р.Г. Изд-во "Наука", 1981, с.150-162.

26. Рубин Б.А., Ладыгина М.Е. Физиология и биохимия дыхания растений. Изд-во МГУ, М., 1974, 512 с.

27. Семихатова О.А., Чулановская М.В. Манометрические методы изучения дыхания и фотосинтеза растений. Изд-во "Наука", М.-Л., 1965, 168 с.

28. Семихатова О.А. Смена дыхательных систем. Критический анализ методов исследования. Изд-во "Наука", Л., 1969, 128 с.

29. Смолов А.П., Полевая B.C. Дыхание и становление фотосинтеза культуры ткани руты на различных стадиях ростового цикла. ДАН СССР, 1979, т.244, 3, с.781-783.

30. Туманов И.И., Бутенко Р.Г., Оголевец И.В. Применение метода изолированных тканей для изучения процессов закаливания растительных клеток. Физиология растений, 1968, т. 15, № 5, с.409-413.

31. Хавкин Э.Е. Формирование метаболитических систем в растущих клетках растений. Изд-во "Наука", М., 1977, 221 с.

32. Холодова В.П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений. В сб. "Культура клеток растений". Под ред. Бутенко Р.Г. Изд-во "Наука", М., 1981, с.196-201.

33. Холодова В.П., Мещеряков А.Б., Чернявская Т.Н. Транспорт 3-0-метил-Д-глюкозы в клетки суспензионной культуры сахарной свеклы. Физиология растений, 1982, т.29, № 5, с.876-885.

34. Чернышова Т.П., Кузовкина И.Н. Метаболизм 14с -сахарозы в растущих клетках каллусной ткани руты душистой. Физиология растений, 1980, т.27, № 6, C.I20I-I2I0.

35. Чулановская М.В., Глаголева Т.А., Заленский О.В. Действие АТФ на фотоассимиляцию глюкозы хлореллой. Физиология растений, 1981, т.28, J£ 4, с.757-766.

36. Ширяева Г.А., Гамбург К.З. Фотосинтез и культура изолированных тканей растений. В сб. "Биохимия и биофизика фотосинтеза". Труды симпозиума "Биохимия и биофизика фотосинтеза". 14-18 июля 1970, Иркутск, Под ред. Реймерс Ф.Э. Иркутск, 1971, с.196-201.

37. Ширяева Г.А., Яценко-Хмелевский А.А. Фиксация 14С02 изолированными зелеными тканями Picea abies (L) Kurst. ДАН СССР, 1974, т.216, & 2, с.459-461.

38. Яшина С.Г., Христин М.С., Шабаева Э.В., Полевая B.C. Особенности НАДФ-восстанавливающей системы в хлоропластах культуры ткани Ruta graveolens. ДАН СССР, 1978, Т.241, № 4,с.981-984.

39. Arnon D.I. Copper enzymes in isolated chloroplast. Polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Plant physiology, 1949, v.24, No.1, p.1-15.

40. Akemine Т., Kikuta Y., Tagava T. Respiratory changes during callus formation in potato tuber tissue cultured in vitro.- J. Fac. Agr. Hokkaido Univ., 1970, v.56, No.3, p.323-336.

41. Akemine Т., Kikuta Y., Tagava T. Effect of kinetin and naphthalene acetic acid application on the respiratory metabolism during callus development in potato tuber tissue cultured in vitro. Y. Рас. Agr. Hokkaido Univ., 1975, v.58, No.2,p.247-261.

42. Anstis P.Y.P., Northcote D.H. Chlopophyll accumulation by callus tissue of Glycine max. Planta, 1974, v.116, No.2, p.105-108.

43. Ball E. Studies of the nutrition of the callua culture of Sequoia sempervirens. Am. biol., 1955, v.31, No.3, p.80-105.

44. Bergmann L., Balz A. Der Einfluss von farblicht auf wachstum und zusammensetzung pflanzlicher gewebekulturen. I. Mitteilung Nicotiana tabacum var "Samsun". Planta, 1966, v.70, No.3, p.285-303.

45. Bergmann L., Wachstum gruner Suspensions kulturen von Nicotiana tabacum var. "Samsun" mit COg als Kohlenstoffquelle. -Planta, 1967, v.74, No.3, p.243-249.

46. Bergmann L. Plating of plant cells. Ins Plant tissue culture and its bio-technological application. Ed. Barz We, Reinhard Ed. Barz W., Reinhard E., Zenk Ш, 1977, p.213-225.

47. Berlyn M.B., Zelitch J. Photoautotrophic growth and photosynthesis in tobacco callus cells. Plant Physiol., 1975, v.56, No.6, p.752-756.

48. Berlyn M#B., Zelitch J., Beaudette P.D. Photosyntetic characteristoc of photoautotrophically grown tobacco callus cells, Plant Physiol., 1978, v.61, No,4, p.606-610.

49. Bormann C.H., Panshawe N.C. Welwitschia mirabilis callus studies. II. Some effects of sucrose. Z. Pflanzenphysiol., 1978, v.78, No.3, p.217-221.

50. Brangeon J., Nato A. Heterotrophic tobacco cell cultures during greening. I. Chloroplast and cell development. Physiol. Plant., 1981, v.53, No.3, p.327-334.

51. Button J. The effect of some carbohydrates on the growth and organization of Citrus ovular callus. Z. Pflanzenphysiol., 1978, v.88, No.1, p.61-68.

52. Chand S., Roy S.C. Auxin autotrophic callus tissues in Nigella sativa. Curr. Sci., 1980, v.49, No.3, p.105-106.

53. Chandler M.T., de Marsac N.T., Kouchkovsky Y. Photosynte-tic growth of tobacco cells in liquid suspension. Can. J. Bot., 1972, v.50, Uo.11, p.2265-2270.

54. Copping L.D., Street H.E. Properties of the invertases of cultured Sycamore cells and changes in their activity during culture growth. Physiol, plant., 1972, v.26, No.3, p.346-354.

55. Corduan G. Autotrophe gewebekulturen von Ruta graveolens und deren 14c02~markierungsprodukte. Planta, 1970, v.91, N0.4, p.291-301.

56. Craigie J., Krotkov G., Wetmore R.H. The utilization of 14evently чЗ-labeled sugars and glutamine by normal and crown gall explant of Boston ivy. Am. J. Bot., 1958, v.45, No.5, p.373-377.

57. Dalton C.C., Street H.E. The role of the gas phase in the greening and growth of illuminated cell suspension cultures of spinach (Spinacea oleracea). In Vitro, 1976, v.12, No.7, p.485-494.

58. Dalton C.C. Photoautotrophy of Spinach cells in continuous culture: photosynthetic development and sustained photoauto-trophic growth. J. Exp. Bot., 1980, v.31, No.122, p.791-804.

59. Delmer D.P., Albersheim P. The biosynthesis of sucrose and nucleoside diphosphate glucoses in Phaseolus aurens. Plant Physiol., 1970, v.45, N0.6, p.782-786.

60. Delmer D.P. The purification and propertios of sucrose synthetase from etiolated Phaseolus aurens seedling. J. Biol. Chem., 1972, v.247, No.12, p.3822-3828.

61. Edelman J., Hanson A.D. Sucrose suppression of chlorophyll synthesis in carrot tissue cultures. J. Exp. Bot., 1972, v.23, No.75, p.469-478.

62. Fowler M.W. Studies on the growth in culture of plant cells. 14. Carbohydrate oxidation during the growth of Acer pseudoplatanus L. cells in suspension culture. J. Exp. Bot., 1971, v.22, Ho.72, p.715-724.

63. Furuchashi K., Usui H., Yatazawa M. Unusual features of respiration in mixotrophic green tobacco callus tissues. Plant Cell Physiol., 1979, v.20, Ho.2, p.363-367.

64. Gamborg O.L., Miller R.A., Ogima K. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell. Res., 1968, v.50, No.1, p.151-158.

65. Givan C.V., Collin H.A. Studies on the growth in culture of plant cells. II. Changes in respiration rate nitrogen content associated with growth of Acer pseudoplatanus L. cells in suspension culture. J. Exp. Bot., 1967, v.18, No.55, p.321-331.

66. Givan C.V., Torrey J.G. Respiratory response of Acer pseudoplatanus cells to pyruvate and 2,4-dinitrophenol. Plant Physiol., 1968, v.43, No.4, p.635-640.

67. Goris A., Monier R. Essai sur le comportement metaboli-que de quelques sucres dans les tissus de racine de carotte cul-tiver in vitro. Ann. sci. natur. Bot. et biol. veget., 1962, v.12, No.3, p.415-423.

68. Hanover P. Formation des polyfructosanes dans les tissus des tubercules de Topinambour cultive in vitro. C. r. acad. sci., 1964, v.258, No.11, p.3081-3084.

69. Hanson A.D., Edelman J., Phloem in carrot calluses. -Planta, 1970, v.93, N0.2, p.171-174.

70. Hanson A.D., Edelman J., Secretion of photosynthetic products by carrot tissue cultures. Planta, 1971, v.98, No.2,p.97-108.

71. Hanson A.D., Edelman J. Photosynthesis by carrot tissue cultures. Planta, 1972, v.102, No.1, p.11-25.

72. Hildebrandt A.C., Wilmar J.C., Jones H,, Riker A.J. Growth of edible chlorophyllous plant tissues in vitro. Am. J. Bot., 1963, v.50, Ho.3, p.248-254.

73. Horn M.E., Sherrard J., Widholm J.M. Photoautotrophic growth of soybean cells in suspension culture. I. Establishment of photoautotrophic cultures. Plant Physiol., 1983, v.72, Ho.2, p.426-429.

74. Hricova D., Strem J., Bauer S. Preparation and characterisation of the culture of Spruce (Picea excelsa Link). Biol, plant., 1974, v.16, Ко.2, p.118-122.

75. Husemann W., Barz W. Photoautotrophic growth and photosynthesis in cell suspension cultures of Chenopodium rubrum. -Physiol, plant., 1977, v.40, No.2, p.77-81.

76. Husemann W., Plohr A., Barz W. Photosynthethic characteristics of photomixotrophic and photoautotrophic cell suspension cultures of Chenopodium rubrum. Protoplasma, 1979, v.100, No.1, p.101-112.

77. Jaspars E.M.J., Pigmentation of tobacco crown-gall tissues cultured in vitro in dependence of the composition of the medium. Physiol, plant., 1965, v.18, No.4, p.933-940.

78. Jessup W., Fowler M.W. Interrelationships between carbohydrate metabolism and nitrogen assimilation in cultured plant cells. I. Effects of glutamate and nitrate as alternative nitrogen sources on cell growth. Planta, 1976, v.132, No.2, p.119-123.

79. Jessup W., Fowler M.W. Interrelationships between carbohydrate metabolism and nitrogen assimilation in cultured plant cells. II. The effect on the nitrogen source and concentration on lutrient uptake and respiratory activity in cultured Sycamore cells.

80. Planta, 1976, v.132, Ho.2, p.125-129.

81. Jones L.H., Barrett J.N. Gopal P.P.S. Growth and nutrition of a suspension culture of Pogostemon cablin Bent. (Patchouli) . J. Exp. Bot., 1973, v.24, Ho.78, p.145-158.

82. Kanamori I., Ashihara H., Komamine A. Changes in the activities of the pentose phosphate pathway and pyrimidine nucleotide biosynthesis during the growth of Vinca rosea cells in suspension culture. Z. Pflanzenphysiol., 1979, v.93, Ho.5, p.437-448.

83. Katoh K., Oha Y., Hirose Y., Iwamura T. Photoautotrophic growth of Marchantia polymorpha L. cells in suspension culture. -Planta, 1979, v.144, No.5, p.509-510.

84. Kennedy R.A., Barnes J., Laetsch W.M. Photosynthesis in C^-plant tissue cultures. Significance of Kranz anatomy to C^ acid metabolism in C^-plant. Plant Physiol., 1977, v.59, Ho.4, p.600-603.

85. Key J.L. Hormones and nucleic acid metabolism. In: Ann. Rev. Plant Physiol. Ed. Michlis L. Palo Alto California, USA, 1969, v.20, p.449-584.

86. Kikuta J., Akemine Т., Tagawa T. Role of the pentose phosphate pathway during callus development in explants from potato tuber. Plant. Cell Physiol., 1971, v.12, No.1, p.73-79.

87. King P.J., Mansfield K.J., Street H.E. Control of growth and metabolism of cultured plant cells. Can. J. Bot., 1973, v.51, No.10, p.1807-1823.

88. Klerk-Kiebert УJJ.de, Kneppers T.J.A., Matthijs H.C.P., Verleur J.D. Sugar uptake in soybean (Glycine max) cells in suspension culture. Physiol. Plant., 1983, v.57, Ho.12, p.217-221.

89. Klis F.M., Hak A. Wall-bound invertase activity in Convolvulus callus: increase after subsulturing and paradoxical effects of actinomycin D, cycloheximide and thienylalanine. -Physiol. Plant, 1972, v.26, Ho.3, p.364-368.

90. Kohno H., Yoshida F. Culture of chlorophyllous tobacco-cells not requiring any organic additives except sucrose in the medium. I. Effects of light and temperature on the growth of the cell. Plant Cell Physiol., 1977, v.18, Ho.5, p.907-913.

91. Komamine A., Morohashi J., Shimokorijama M. Changes in respiratory metabolism in tissue cultures of carrot root. Plant Cell Physiol., 1969, v.10, Ho.2, p.411-413.

92. Komamine A., Shimizu Т., Ashihara H«, Shimokorijama M. The mechanism of changes in respiratory activity during callus formation in carrot root slices cultured in vitro. Plant Cell Physiol., 1972, v.13, Ho.5, p.821-829.

93. Krauss G., Heumann D., Gr'eger D. Light induced chloro-plast development in photoorganotrophic cell suspension cultures of Peganum harmala. Biochem. Physiol. Pflanzen., 1980, v.175, Ho.1, p.77-82.

94. Kulandaivelu G., Gnanam A. Physiological studies with isolated leaf cells. Early products of photosynthesis and their metabolic interconversions. Plant Physiol., 1974, v.54, Ho.4,p.569-574.

95. Laetsch Y/.M., Kortschak H.P. Chloroplast structure and function in tissue cultures of a C^-plant. Plant Physiol., 1972, v.49, Ho.6, p.1021-1023.

96. Maretzki A., Thorn M. The existance of two membrane transport systems for glucose in suspension of sugarcane cells. Bio-chem. Biophys. Commun., 1972, v.47, No.1, p.44-50.

97. Maretzki A., Thorn M. Membrane transport of sugars in cell suspensions of sugarcane. I. Evidence for sites and specificity. Plant Physiol., 1972, v.49, No.2, p.177-182.

98. Maretzki A., Thom M., Nickell L.G. Utilization and metabolism of carbohydrate in cell and callus culture. In: Tissue culture and plant science. Ed. Street H.E. L.-N:Y. Acad, press 1974, p.329-361.

99. Marvin J.W., Morselli M., Mathes M.C. Rapid low temperature hydrolysis of starch to sugars in maple stems and in maple tissue cultures, Cryobiology, 1971, v.8, No.4, p.339-344.

100. McLaren Y., Thomas D.R. C02 fixation, organic acids and some enzymes in green and colourless tissue cultures of Kalanchoe crenata. New Phytol., 1967, v.66, No.4, p.683-695.

101. McVetty P.B.E., Canvin D.T. Inhibition of photosynthesis by low oxygen concentrations. Can. J. Bot., 1981, v.59, No.5, p.721-725.

102. Miura G.A., Miller C.O. Cytokinins from a variant strain of cultured soybean cells. Plant Physiol., 1969, v.44, No.7,p.Ю35-Ю39.

103. Hash D.T., Davies M.E. Some aspects of growth and metabolism of Paul's Scarlet rose cell suspensions. J. Exp. Bot., 1972, v.23, Ho.74, p.75-91.

104. Hato A., Bazetoux S., Mathieu Y. Photosynthetic capacities and growth characteristics of Hicotiana tabacum (cv. Xanthi) cell suspension cultures. Physiol. Plant., 1977, v.41, Ho.2, p.116-123.

105. Hato A., Mathieu Y., Brangeon J. Heterotrophic tobacco cell cultures during greening. II. Physiological and biochemical aspects. Physiol. Plant., 1981, v.53, Ho.3, p.335-341.

106. Hato A., Hoarau J., Bourdu R. Effect of the ligth intensity during growth on physiological and photosynthetic characteristics of cell suspension cultures of Hicotiana tabacum. Biol, cell, 1983, v.47, Ho.2, p.213-218.

107. Hesius K.K., Fletcher J.S. Contribution of non-autotro-phic carbon dioxide fixation to protein synthesis in suspension cultures Paul's Scarlet Rose. Plant Physiol., 1975, v.55, Ho.4, p.643-645.

108. Heumann K.-H., Raafat A. Further studies on the photosynthesis of carrot tissue cultures. Plant Physiol., 1973, v.51, Ho.4, p.685-690.

109. Hitsch J.P., Hirsch C. Auxin-dependent growth of excised Helianthus tuberosus tissues. 2. Organic nitrogenous compaunds.- Am. J. Bot., 1957, v.44, H0.6, p.555-564.

110. Ohira K., Yamaya Т., Ojima K. Studies on the greeningof cultured Soybean and Ruta cells. I. Pigmentation as influenced by the composition of the medium. Tohoku J. Agr. Res., 1975,v.26, No.3-4, p.136-148.

111. Ojima K., Yamada Т., Ohira K. Studies on the greening of cultured Soybean and Ruta cells. III. Effects of minorelements deficiency on the growth and photosynthesic activities of Ruta cells. Soil Sci. Plant Nutr., 1977, v.23, No.1, p.67-75.

112. OpekarovaM., Kotyk A. Uptake of sugars by tobacco callus tissue. Biol, plant. (Prague), 1973, v.15, Ho.5, p.312-315.

113. Pannier P.P., Pannier R.P., de Garcia E. Estudios sobre-el cultivo de tejido medular de Nicotiana glauca. II. Capacidad fotosintetica de los tejidos verdes. Acta cientifica venezolano,1967, v.18, No.6, p.167-171.

114. Pollock C.J., Rees T. Effect of cold on glucose metabolism by callus and tubers of Solanum tuberosum. Phytochemistry, 1975, v.14, No.9, p.1903-1906.

115. Pollock C.J., Rees T. Cold-induced sweetening of tissue cultures of Solanum tuberosum L. Planta, 1975, v.122, No.1,p.105-Ю7.

116. Ricardo C.P.P., apRees Т., Puller W.A. Effects of sugar on invertase activity of carrot cells. Phytochemistry, 1972, v.11. No.8, p.2435-2436.

117. Richards T.G. The quantitative analysis of growth. -Ins Plant Physiol (a treathise), N.-Y., Acad, press, 1969, v.50, P.1.

118. Richez M. Accumulation et migration du phosphore dans des fragments de tubercules de carrote cultives in vitro. C. r. acad. sci., D., 1964, v.258, No.15, p.3894-3897.

119. Roberts R.M. The metabolism of L-fucose by Sycamore (Acer pseudoplatanus L.) cell cultures. Arch. Biochem. Biophys.,1968, v.128, No.3, p.818-820.

120. Rose D., Martin S.M., Clay P.P.P. Metabolic rates formajor nutrients in suspension cultures of plant cells. Can. J. Bot., 1972, v.50, Ho.6, p.1301-1308.

121. Rose D., Martin S.M. Effect of ammonium on growth of plant cells (Ipomea sp.) in suspension cultures. Can. J. Bot., 1975, v.53, Ho.17, p.1942-1949.

122. Sato P., Asada K., Yamada Y. Photoautotrophy and the photosynthetic potential of chlorophyllous cells in mixotrophic cultures. Plant Cell Physiol., 1979, v.20, Ho.1, p.193-200.

123. Sato P., Hishida K., Yamada Y. Activities of carboxyla-tion enzymes and products of ^C02 fixation in photoautotrophycal-ly cultures cells. Plant Sci. Letter, 1980, v.20, Ho.2, p.91-97.

124. Sawhney V.K., Srivastava L.M., Morley D. Inhibitors of RHA and protein synthesis and the kinetics of growth of lettuce hypocotyle induced by gibberellic acid. Can. J. Bot., 1977, v.55, Ho.13, p.1829-1837.

125. Seeni S., Gnanam A. Carbon assimilation in photohetero-trophic cells of peanut (Arachis hypogaea L.) grown in still nitrients medium. Plant Physiol., 1982, v.70, Ho.3, p.823-826.

126. Shimizu Т., Clifton A., Komamine A., Fowler M.W. Changes in metabolite levels during growth of Acer pseudoplatanus (sycamore) cells in batch suspension culture. Physiol. Plant., 1977, v.40, Ho.2, p.125-129.

127. Simpkins J., Street H.E. Studies on the growth in culture of plant cells. 7. Effects of kinetin on the carbohydrate and nitrogen metabolism of Acer pseudoplatanus L. cells grown in suspension culture. J. Exp. Bot., 1970, v.21, Ho.66, p.170-185.

128. Sjolund R., Y/eier T. Ultras true tural aspects of chloro-plast development in callus cultures of Streptanthus tortuosus (Cruciferae). Am. J. Bot., 1967, v.54, Ho.5, part 2, p.637.

129. Smith D.D., Sjolund R.D. Photosynthetic activity and membrane polypeptide composition of supergranal chloroplasts from plant tissue cultures containing a viruslike particle. Plant Physiol., 1975, v.55, No.3, p.520-525.

130. Stetler D., Laetsch W. Kinetin-Indused chloroplast maturation in cultures of tobacco tissue. Science, 1965, v.149, No.3690, p.1387-1388.

131. Stetler D., Laetsch W. Prolamellar body-lake structures in tobacco tissue cultured on a medium lacking kinetin. Am. J. Bot., 1968, v.55, No.6, p.709.

132. Steward P.O., Caplin S.M., Miller P.K. New techniques for the investigation of metabolism, nutrition and growth in differentiated cells. Ann. Bot., 1952, v.16, No.61, p.57-77.

133. Steward P.O., Thompson J.E., Pollard J.R. Contrast in nitrogenous composition of rapid growing and non-growing plant tissues. J. Exp. Bot., 1958, v.9, No.25, p.1-10.

134. Steward P.C., Bidwell R.G.S. Storage pools and turnoversystems in growing and non-growing cells: experiments with 1^C-glu-1Лtamine and 4)-asparagine. J. Exp. Bot., 1966, v.17, No.53, p.726-741.

135. Stobart A.K., McLaren I., Thomas D.R. Chlorophylls and carotenoids of colourless callus, green callus and leaves of Kalan-choe crenata. Phytochem., 1967, v.6, No.11, p.1467-1474.

136. Straus J., Gerding R.K. Auxin oxidase in tissue culture of Ephedra. Plant Physiol., 1962, v.37, No.3, p.342-348.

137. Street H.E. The nutrition and metabolism of plant tissue and organ cultures. In: Cell and tissue in culture. London - N.-Y. Acad. Press, 1966, v.3, p.553-629.

138. Sunderland N., Wells B. Plastid structure and development in green callus tissue Oxalis dispar. Ann. Bot., 1968, v.32,1. Uo.126, p.327-346.

139. Sutton-Jones В., Street H.E. Studies on the growth in culture of plant cells. 3. Changes in fine structure during the growth of Acer pseudoplatanus L. cells in suspensions culture. J. Exp. Bot., 1968, v.19, No.58, p.114-118.

140. Takayama S., Misawa M., Ко К., Misato 0?. Effect of cultural conditions on the growth of Agrostemma githago cells in suspension culture and concomitant production of an anti-plant virus substance. Phisiol. Plant., 1977, v.41, N0.4, p.313-320.

141. Thorpe T.A., Meier D.D. Sucrose metabolism during tobacco callus growth. Phytochem., 1973, v.12, No.3, p.493-497.

142. Venketeswaran S. Studies on the isolation of green pigmented callus tissue of tobacco and its continued maintenance in suspension cultures, Physiol. Plant., 1965, v.18, No.3, p.776-789.

143. Vasil J.K., Hildebrandt A.C. Growth and Chlorophyll production in plant callus tissues grown in vitro. Planta, 1966, v.68, No.1, p.69-82.

144. Verma D., Huystee R. van. Derivation, Characteristics and largescale culture of a cell line from Arachis hypogaea L.1. Ф • ' ' * V * J ' »cotyledins. Exp. Cell Res., 1971, v.69, No,2, p.402-408.

145. West K.R., Wislich J.T. Photosynthetic control by isolated pea chloroplasts. Biochem. J., 1968, v.109, No. , p.527-532.

146. Wilmar J.C., Hildebrandt A.C., Riker A.J. Iron nutrition for growth and chlorophyll development of some Plant tissue cultures. Nature, 1964, v.202, No.4938, p.1235-1236.