Использование "искусственных семян" в технологии культивирования in vitro корней лекарственных растений

Прокофьева, Мария Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование "искусственных семян" в технологии культивирования in vitro корней лекарственных растений
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Использование "искусственных семян" в технологии культивирования in vitro корней лекарственных растений"

На правах рукописи

00505Ь'1°'

ПРОКОФЬЕВА Мария Юрьевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ «ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН» В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КОРНЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Москва - 2012

005055157

Работа выполнена в группе специализированного метаболизма корней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Кузовкина Инна Николаевпа

Официальные оппоненты:

Носов Александр Михайлович, доктор биологических наук, профессор, кафедра физиологии растений, биологический факультет, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, г. Москва, профессор кафедры

Слепян Лариса Ивановна, кандидат биологических наук, кафедра промышленной технологии лекарственных препаратов, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Санкт-Петербург, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева, агрономический факультет, г. Москва

Защита состоится «27» ноября 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва.

Автореферат диссертации размещен на сайгах ВАК РФ и www.ippras.ru Автореферат разослан «26» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Агробактериальная трансформация растительного материала позволила преодолеть значительные трудности в культивировании растительных органов в условиях in vitro. Так, метод культивирования изолированно растущих корней растений с середины 80-х годов XX века был обогащен использованием целенаправленной генетической трансформации растительных клеток с помощью почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes (Chilton et al., 1982). Это позволило получать корневые культуры, способные к росту в условиях in vitro на безгормональных питательных средах и к биосинтезу вторичных метаболитов, типичных для корней проростков или интактных исходных растений (Tepf'er, 1990). Генетически трансформированные корни послужили основой для разработки перспективной технологии биотехнологического получения вторичных метаболитов, таких как алкалоиды, фенольные соединения и ряд других (Flores & Filner 1985; Hamill et al., 1987; Giri & Narasu, 2000; Oksman-Caldentey & Arroo, 2000; Georgiev et al., 2010). Реализация метода трансформации растительного материала с помощью почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes сотрудниками Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН привела в 1999 году к созданию коллекции генетически трансформированных корней (КГТК), которая к настоящему времени насчитывает около 40 штаммов корневых культур, полученных от 29 видов растений, относящихся к 13 семействам. Наибольшую часть коллекции составляют корни ценных лекарственных растений, в которых биосинтез физиологически активных вторичных соединений локализован в подземной части. Биохимический анализ основных штаммов корневых культур показал, что корни в условиях in vitro сохраняют способность к образованию корнеспецифичных низкомолекулярных метаболитов на уровне, сопоставимом с их содержанием в корнях целых или ювенильных растений. Эта особенность делает привлекательным их применение при исследовании пространственной и временной организации вторичного метаболизма в корнях растений (Kuzovkina et al., 2004; Thorpe, 2007). Различные способы культивирования корней (пролонгированное выращивание, действие стрессовых факторов, использование предшественников биосинтеза конечных продуктов) позволяют увеличивать содержание в них ценных вторичных метаболитов до уровня, сравнимого с их концентрациями в корнях целого растения. Однако давно обсуждаемой в ряде публикаций проблемой является высокая вероятность

неконтролируемого инфицирования культур растительных тканей и органов, выращиваемых в условиях in vitro (Leifert & Cassells, 2001; Bunn, 2002). Собственный опыт работы с объектами коллекции генетически трансформированных корней различных видов растений показал возможность неожиданного проявления, в основном, бактериальной инфекции. Для элиминирования спонтанно проявляющейся бактериальной инфекции обычной практикой является добавление антибиотика в культуральные питательные среды, что не всегда бывает эффективным и лишь на время снижает интенсивность нежелательной контаминации (Leifert et al., 1994). Кроме того, антибиотик в ряде случаев ингибирует рост растительных клеток, что может привести к гибели ценных корневых культур.

Цели II задачи исследования. Целью настоящей работы являлось совершенствование техники культивирования генетически трансформированных корней ценных растений с помощью метода так называемых «искусственных семян» (ИС) для оздоровления и получения стабильно растущих корневых культур, а также для их сохранения и снижения экономических затрат при поддержании коллекционного материала.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить «искусственные семена» из корневых фрагментов ряда растений методом их инкапсулирования в гелевую оболочку и подобрать оптимальные условия для сохранения их жизнеспособности.

2. Исследовать влияние инкапсулирования на физиологические параметры корневых культур, возобновленных из «искусственных семян».

3. Разработать метод элиминирования (удаления) спонтанной бактериальной инфекции в культуре генетически трансформированных корней с помощью «искусственных семян».

Научная новизна. В работе впервые применен метод ИС для сохранения генетически

трансформированных корневых культур в инкапсулированном состоянии при

пониженной положительной температуре в условиях in vitro. Дана статистическая

оценка жизнеспособности инкапсулированных корневых фрагментов, а также оценка

физиологического состояния линий корневых культур некоторых видов растений, а

именно Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea, возобновленных из ИС.

Впервые выявлены и охарактеризованы физиологические изменения, возникающие при

выращивании в условиях освещения линий корневых культур Ruta graveolens и

Scutellaria baicalensis после их длительной низкотемпературной иммобилизации в виде ИС. Разработан метод эффективного оздоровления корневых культур, подверженных бактериальному инфицированию.

Научно-практическое значение. Разработанный метод длительного сохранения инкапсулированных корневых фрагментов в виде ИС вносит существенный вклад в технологию культивирования генетически трансформированных корней как в лабораторных условиях, так и при переходе к крупномасштабному выращиванию корней лекарственных растений. Длительное сохранение ростовой активности ИС, полученных из корневых культур ценных лекарственных растений, позволяет использовать их в качестве резервного фонда, а также, в случае необходимости, как компактно упакованные стерильные корневые экспланты для транспортировки растительного материала на дальние расстояния. Новый способ оздоровления инфицированных корневых культур с помощью ИС позволяет существенно снизить риск потери ценных линий корневых культур и сохранить их продуктивность в течение многих лет выращивания. Выявленные физиологические и биохимические особенности корневых культур, возобновленных из ИС, рекомендуется учитывать при выборе условий последующего культивирования корней лекарственных растений. Метод альгинатного инкапсулирования способен дополнить и усовершенствовать технику сохранения растительных ресурсов. Полученные данные могут быть включены в материалы лекций по физиологии растений.

Апробация работы. Материалы данной работы представлены на IX Международной Конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2007), на 2-м Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), на Симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), на IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), на Германо-Российском форуме по биотехнологии (Новосибирск, 2009), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), на 15-й Зимней студенческой школе «Биология растительной клетки» (Суздаль, 2011), на VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, 1 патент и 1 публикация в книге. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит 7 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 251 источник, в том числе 229 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительный материал. В качестве растительного материала для приготовления «искусственных семян» использовали фрагменты корней, полученных в результате генетической трансформации стерильных проростков растений с помощью Т-ДНК Ri-плазмиды диких (не модифицированных) штаммов почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes (Кузовкина и др., 2001). Основными объектами исследования были культуры трансформированных корней трех видов лекарственных растений - руты душистой {Ruta graveolens L.), шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) и родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), которые относятся к семействам Rutaceae, Lamiaceae и Crassulaceae соответственно.

Инкапсулирование корневых фрагментов. В основу метода получения

«искусственных семян» (далее ИС) путем инкапсулирования фрагментов генетически

трансформированных корней легли приемы, описанные в работах японских

исследователей (Uozumi et al., 1994; Honda, 2001). Все операции осуществляли в

стерильных условиях. При проведении работы использовали корневые культуры

разного возраста (2- и 4-недельные). Для получения ИС использовали гелеподобный

матрикс, который представлял собой раствор Na-альгината (Roth, Германия),

приготовленный на основе безгормональных питательных сред Гамборга (В5), Стрита

(S) и Мурасиге и Скуга с уменьшенным вдвое содержанием азота ('/2МС). Апикальные

участки корней (2-3 см) нарезали вручную острым ланцетом на фрагменты длиной 2-3

мм, которые затем смешивали с раствором Na-альгината. Для закрепления геля и

образования капсул использовали 70 мМ раствор СаС12 (Merck, Германия), в который

при помощи автоматической пипетки с диаметром наконечника около 3 мм по каплям

добавляли гелевую суспензию корневых фрагментов. Количество полученных таким

путем ИС составляло 250-300 шт. ИС помещали в стерильные чашки Петри для

хранения в условиях низкой положительной температуры (4° С), обеспечивая таким образом иммобилизацию корневых фрагментов.

«Проращивание» ИС и получение из них линий корневых культур. Жизнеспособность инкапсулированных корневых фрагментов, выдержанных при 4°С, определяли как «всхожесть» ИС, которую проверяли путем их «проращивания» в условиях, обычных для культивирования генетически трансформированных корней, после различных сроков хранения, и результаты выражали в процентах. Для «проращивания» ИС переносили на агаризованную питательную среду в чашки Петри, которые помещали в темноту в термостатируемые условия (25±2°С).

После прорастания апексов корневых фрагментов через оболочку ИС, кончики корней размером 1,5-2 см отделяли и помещали в колбы с жидкой питательной средой по 8-10 корневых кончиков на 40 мл среды. Полученные из ИС линии корневых культур выращивали в обычных для них условиях (при температуре 25±2°С в темноте, при постоянном качании 90 об./мин) до образования хорошо растущей массы корней. В конце пассажа проводили оценку физиологических параметров культур (ростовой активности корней, содержания в них сухого вещества, электропроводности и рН культуральных сред), а также тестировали их на наличие инфекции. При проведении каждого эксперимента число повторностей в опытном варианте было пятикратным. Каждый из экспериментов повторяли, по меньшей мере, троекратно, так как в ряде случаев наблюдались некоторые отклонения, связанные с изменяющимися условиями культивирования корней.

Исследование влияния света на корневые фрагменты при прорастании ИС. Часть прорастающих из ИС корневых фрагментов исследуемых культур помещали в термостатируемую световую камеру, оборудованную люминесцентными лампами дневного света (FT8 30W/33/cool light, Camelion, Китай), с уровнем освещения 30-35цЕ/м2 с в области ФАР и фотопериодом 18/6 ч (свет/темнота).

При регенерации зеленых побегов, наблюдавшейся в результате проращивания ИС Ruta graveolens ■ в условиях освещения, получение корнесобственных растений проводили на питательной среде Гамборга, содержавшей 0,5 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК, Sigma, США) и уменьшенную концентрацию сахарозы (0,2%), с последующим переносом их в почвенный субстрат и адаптированием к условиям in vivo (Bohidar, 2008).

В случае получения из ИС Scutellaria baicalensis линий корневых культур, зеленеющих в условиях освещения, исследовали поперечные тонкие срезы зеленых участков корней с помощью световой микроскопии, спектрофотометрически определяли содержание и соотношение хлорофилла а и b в корнях (Wintermans & De Mots, 1965), а также измеряли их фотосинтетическую активность методом регистрации индукции флуоресценции хлорофилла с помощью портативного флуориметра PAR-FluorPen FP 100-MAX-LM (PSI, Чехия) (Корнеев, 2002). Кроме того, проводили сравнительный анализ содержания флавонов в возобновленных из ИС линиях корневых культур Scutellaria baicalensis, выращенных в условиях освещения и в темноте. Содержание флавонов в корнях Scutellaria baicalensis, определяли с помощью аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ. Для химического анализа использовали метанольные экстракты лиофильно высушенных и тщательно измельченных корней (Кузовкина и др., 2005). Концентрацию отдельных флавонов в экстрактах рассчитывали по площадям пиков на основании калибровочных кривых, построенных для стандартов байкалина и байкалеина (Sigma-Aldrich, США) с применением программы OriginPro7.0. Окончательный расчет содержания каждого из флавонов (в мг на г сухих корней) и их суммарного содержания проводили с учетом навески растительного материала, объема растворителя и разведения экстракта, использованных при проведении анализа. Каждое определение проводили в двух биологических и двух химических повторностях.

Элиминирование бактериальной инфекции. Элиминирование внезапно проявлявшейся бактериальной инфекции в корневых культурах Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea проводили с помощью инкапсулирования инфицированных корневых фрагментов с добавлением в гелевый матрикс антибиотика клафоран (Cefotaxime, Aventis Pharma, Великобритания) в концентрации 300-600 мг/л, с последующим выдерживанием ИС в условиях пониженной температуры в течение 2-12 недель. Тестирование корневых культур на контаминацию осуществляли путем отбора проб культуральных сред с последующим инкубированием их на селективной среде для бактерий (YEB) при температуре 33°С с целью возможного выявления бактериальных колоний.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки результатов был использован пакет анализа программы Microsoft Office Excel 2010. Для каждой

группы данных определяли среднее значение, ошибку среднего и стандартное отклонение. В таблицах приведены данные в виде средних арифметических значений со стандартным отклонением, на рисунках — в виде средних арифметических с двусторонним доверительным интервалом (Р = 0,95).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфологическая характеристика генетически трансформированных корневых культур Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis н Rhodiola rosea. Для

апробации сохранения корневых культур коллекции с помощью метода ИС (с целью создания запасной культуры — stock culture) было необходимо изучить влияние инкапсуляции корневых фрагментов на ростовые и физиологические показатели возобновленных из них изолированно растущих корней растений, относящихся к разным семействам и имеющих морфологические и биохимические различия, что и объясняет выбор растительных объектов в данной работе.

Исследуемые культуры изолированно растущих корней трех видов растений (Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea) проявляют все морфологические особенности, характерные для pRi Т-ДНК трансформированных корней. Так, помимо быстрого роста корневых культур на безгормональных питательных средах, одним из основных признаков успешного проведения трансформации является утрата геотропической ориентации корней и проявление у них плагиотропного роста (рис.1).

Рис. 1. Культуры pRi Т-ДНК трансформированных корней: а - Ruta graveolens, б - Scutellaria baicalensis, в - Rhodiola rosea.

Параллельно с этим pRi Т-ДНК трансформированные корни сохраняют в условиях in vitro генетическую стабильность и способность к синтезу корнеспецифичных для данного растения вторичных метаболитов, что отличает их от культуры не

дифференцированно растущих клеток и тканей. Однако следует отметить, что генетически трансформированные корни, также как и корни ювенильных растений, имеют первичную структуру. Этот анатомический признак отличает их от корней сформированных интактных растений, у которых вторичный рост и утолщение корней обусловлены проявлением камбиальной активности.

2. Жизнеспособность инкапсулированных корневых фрагментов, иммобилизованных в виде ИС. Самой высокой всхожестью ИС из всех трех исследуемых культур обладали «семена», полученные из корней Rhodiola rosea, инкапсулированные фрагменты которых больше года сохраняли свою жизнеспособность в иммобилизованном при температуре 4°С состоянии. Как видно из рис.2, количество жизнеспособных ИС этой культуры даже после четырех месяцев сохранения в этих условиях составляло 90-95% от общего числа заложенных на хранение семян.

Рис. 2. Сравнительная оценка жизнеспособности корневых фрагментов отдельных культур по всхожести ИС в зависимости от продолжительности их иммобилизации при

Иммобилизация корневых фрагментов Scutellaria baicalensis и Ruta graveolens в виде ИС протекала с большими потерями. Так, было обнаружено, что процент жизнеспособных ИС Scutellaria baicalensis при их проращивании непосредственно после инкапсуляции корневых фрагментов составлял 75-80% от общего количества семян (рис.2). Однако максимальный подъем «всхожести» ИС (90-95%) наблюдался

о 4—^-т-т--г-. , , ■ I . . ■ .-г-^

О 2 4 6 8 10 12 14 16

Продолжительность иммобилизации, недели

■Scutellaria baicalensis -Ш-Ruta graveolens Rhodiola rosea

температуре 4°C.

после 2-неделыюго сохранения корневых фрагментов при температуре 4°С, что возможно было связано с адаптацией корневых фрагментов к стрессовому воздействию самого процесса инкапсуляции и низкой положительной температуры. После 4 месяцев хранения происходило резкое снижение жизнеспособности инкапсулированных корневых фрагментов Scutellaria baicalensis до 25-30%. Гибель фрагментов корней этой культуры наступала на пятый месяц их хранения при 4°С (рис.2).

На необходимость присутствия питательных веществ в гелевом матриксе ИС Scutellaria baicalensis указывала низкая «всхожесть» семян при инкапсулировании корневых фрагментов в гелевую оболочку, не содержащую питательных веществ: они гибли уже после 5-6-недельного хранения ИС при 4°С. Корневые фрагменты Ruta graveolens в гелевой оболочке без питательных веществ сохраняли жизнеспособность гораздо дольше, чем корни Scutellaria baicalensis, что возможно связано с генотипическими различиями корневых культур этих растений. Экспериментальный подбор компонентов гелевой оболочки ИС определил наиболее благоприятные условия сохранения жизнеспособности растительных тканей корневых фрагментов для каждой из культур. Корневые фрагменты Scutellaria baicalensis лучше сохранялись в гелевой оболочке, содержащей питательные вещества обычной для этих корней культуральной среды Гамборга (В-5), a Ruta graveolens - в оболочке со средой '/2МС, которая не является для нее культуральной (рис.3).

иммобилизации, недели иммобилизации, недели

-•-среда В-5 -♦-среда 1/2 МС~*~*вода

Рис. 3. Динамика прорастания корневых фрагментов из ИС в зависимости от продолжительности их хранения при температуре 4°С и от состава гелевой оболочки.

Несмотря на то, что для получения ИС были использованы молодые, апикальные участки корней, жизнеспособность ИС зависела также от возраста исходных корневых эксплантов, взятых для инкапсулирования. Так, было отмечено, что всхожесть ИС Scutellaria baicalensis после 4,5 месяцев хранения была выше у ИС, полученных из 2-недельных корневых культур. Она составляла 60% против 25% жизнеспособных инкапсулированных корневых фрагментов, полученных от 5-недельной культуры корней.

3. Основные ростовые и физиологические показатели исследуемых культур после применения метода инкапсулирования корневых фрагментов. Показатели физиологического состояния корневых культур (ростовая активность и оводненность корней, интенсивность потребления ими питательных веществ и изменение уровня рН среды), как правило, остаются стабильными от пассажа к пассажу, если не возникает каких-либо сбоев в контролируемых условиях культивирования — повышения или понижения температуры, отключения автоматической аэрации корней, нарушения стерильности культур и их инфицирования. Однако в течение одного пассажа эти характеристики могут изменяться в зависимости от продолжительности цикла культивирования, что определяется возрастом и жизнеспособностью апикальных меристем корневых культур, которые являются оптимальными для очередной пересадки корней. Так, было экспериментально установлено, что при 5-недельном выращивании масса корней Scutellaria baicalensis увеличивалась почти в 18 раз (РИ=17,5), а при пролонгированном культивировании (до 7 недель) - в 35 раз (РИ=34) (табл.1).

Таблица 1. Сравнительная оценка показателей ростовой активности возобновленных из ИС корневых культур Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea.

Физиологические показатели Культура корней Scutellaria baicalensis Ruta graveolens Rhodiola rosea

Сырой вес корней, г исходный эксплант в конце пассажа пролонгированная* 1,1±0,1 19,3±1,5 37,1±1,5 1,3±0,2 17,3±0,5 17,6±0,5 0,9±0,1 4,5±0,8 6,1±0,1

Содержание сухого вещества, % в конце пассажа пролонгированная* 6,2±0,2 5,1±0,2 8,4±0,1 5,5±0,3 7,8±0,1 10,1±0,1

Ростовой индекс (РИ) в конце пассажа пролонгированная* 17,5±1,4 33,7±1,4 13,3±0,5 13,5±0,5 5,0±0,8 6,8±0,5

♦Пролонгированная культура - длительное культивирование корней (до 7-8 недель) с обновлением питательной среды.

Цикл культивирования корней Ruta graveolens длился так же 5 недель, за которые корневая масса увеличивалась относительно исходного экспланта в 13 раз. Однако продолжительное (до 7 недель) культивирование корней Ruta graveolens не приводило к существенному увеличению их ростовой активности (табл.1). Пересадки корневой культуры Rhodiola rosea проводили через каждые 3 недели, при этом ростовая активность корней была, по сравнению с другими культурами, невысока (РИ=5), и при продолжительном культивировании ростовой индекс увеличивался до 7 (табл.1).

При оценке содержания сухого вещества в исследуемых образцах корневых культур трех растений Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea наблюдались как видовые различия, так и различия в течение одного цикла культивирования корней каждого вида. Наибольшим содержанием сухого вещества в конце пассажа характеризовалась корневая культура Ruta graveolens (8,4%), а наименьшим - корневая культура Scutellaria baicalensis (6,2%) (табл.1). Кроме того, длительное культивирования корней Scutellaria baicalensis и Ruta graveolens сопровождалось снижением содержания в них сухого вещества, которое к концу 7-й недели культивирования этих культур составляло около 5,5%. Иная картина наблюдалась в цикле выращивания корневой культуры Rhodiola rosea, содержание сухого вещества в которой при 7-недельном культивировании заметно увеличивалось и достигало 10%.

Для определения степени потребления корневыми культурами Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea минеральных элементов субстрата проводилось еженедельное измерение показателей электропроводности культуральных сред при выращивании исследуемых культур в течение пассажа. Контролем служили, питательные среды, электропроводность которых измеряли до помещения в них эксплантов корней. Данные измерения электропроводности питательных сред в конце цикла культивирования корней приведены в таблице 2. Кроме электропроводности, важной характеристикой питательных сред, отражающей физиологическое состояние корневых культур, является величина рН. В результате анализа показателей рН питательных сред в процессе выращивания исследуемых корневых культур было отмечено, что характерной особенностью интенсивно растущих корневых культур Scutellaria baicalensis и Ruta graveolens было незначительное подщелачивание питательных сред к концу пассажа с 5,6 до 6,5 и 5,8 соответственно (табл.3). В то же

время, при культивировании корней Rhodiola rosea значение рН питательной среды к концу пассажа практически не изменялось, однако при их длительном выращивании происходило подкисление питательной среды до 5,2 (табл.3).

Таблица 2. Сравнительная оценка электропроводности питательных сред при выращивании возобновленных из ИС корневых культур Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea7 ыСн/сн-

Культура корней Scutellaria baicalensis Ruta graveolens Rhodiola rosea

в начале пассажа 3,73±0,01 3,73±0,01 1,27±0,05

в конце пассажа 1,40±0,03 1,73±0,03 0,85±0,06

пролонгированная* 0,98±0,02 1,21±0,01 1,01±0,02

Таблица 3. Сравнительная оценка показателей рН питательных сред при выращивании возобновленных из ИС корневых культур Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea.

Культура корней Scutellaria baicalensis Ruta graveolens Rhodiola rosea

в начале пассажа 5,6±0,01 5,6±0,01 5,8±0,33

в конце пассажа 6,5±0,02 5,8±0,03 5,8±0,02

пролонгированная* 6,2±0,02 5,8±0,08 5,2±0,02

Необходимо отметить, что культуры изолированно растущих корней не только поглощали макро- и микроэлементы из питательных сред, но и выделяли в них некоторое количество продуктов вторичного метаболизма (фенольные соединения, алкалоиды), образующихся в них, что было заметно по окраске питательных сред.

После проведения оценки основных физиологических параметров корневых культур Scutellaria baicalensis, Ruta graveolens и Rhodiola rosea было установлено, что низкотемпературная иммобилизация корневых фрагментов в виде ИС практически не влияет на ростовые показатели и на метаболическую активность возобновленных из них корневых культур при обычных условиях культивирования. Однако дальнейшее исследование линий корневых культур показало, что возможно проявление морфологических и физиологических изменений корней Ruta graveolens и Scutellaria baicalensis, полученных из ИС в условиях освещения.

4. Морфологические и физиологические особенности корневой культуры Ruta graveolens, полученной из ИС в условиях освещения. В процессе «проращивания» ИС, полученных из культуры корней Ruta graveolens, на агаризованной питательной среде в условиях освещения на 3-4 неделе после прорастания корневых фрагментов через альгинатную оболочку происходило формирование зачатков зеленых побегов (рис.4). Наиболее склонными к регенерации целых растений оказались корневые фрагменты, полученные из молодых 2-недельных корневых культур, которые в виде ИС были выдержаны в условиях низкой положительной температуры в течение двух-шести недель. Следует отметить, что при проращивании инкапсулированных корневых фрагментов без их выдерживания при температуре 4°С, побегообразования не происходило. У исходной корневой культуры Ruta graveolens, не подвергавшейся иммобилизации с помощью ИС, при выращивании в жидкой питательной среде в темноте (так называемая «погруженная темновая культура») иногда наблюдалось на 6-7-й неделе культивирования формирование единичных этиолированных побегов, которые после помещения на свет также формировали розетки зеленых микропобегов. Однако при поверхностном культивировании корней Ruta graveolens на агаризованной питательной среде в чашках Петри побегообразования не происходило ни в условиях освещения, ни в темноте. Количество потенциальных хорошо дифференцированных стеблевых регенератов Ruta graveolens, формировавшихся при проращивании инкапсулированных корневых фрагментов, составляло около 10% от исходного количества подготовленных ИС, и из них в дальнейшем были получены полноценные растения.

5. Морфологические и физиолого-биохимические особенности корневой культуры Scutellaria baicalensis, полученной из ИС в условиях освещения.

Морфологические изменения, связанные с действием света на корневые фрагменты после их длительной иммобилизации при температуре 4°С, наблюдались также и у корневой культуры Scutellaria baicalensis. После помещения на свет чашек Петри с прораставшими из ИС корневыми фрагментами корни начинали интенсивно зеленеть, сохраняя это свойство при последующих пересадках в течение трех лет (рис.5). Накопление зеленого пигмента происходило, в основном, в базальных частях корней, которые при этом заметно утолщались, кончики же их оставались белыми.

gf, s

1мм , *§?>

Рис. 4. Формирование зачатков микропобегов при проращивании ИС, полученных из корневой культуры Ruta graveolens.

J ' п /f^y V \

Рис. 5. Морфологические изменения в корневой культуре Scutellaria baicalensis, растущей в условиях освещения, после длительной иммобилизации корневых фрагментов: а - прорастание зеленеющих корней через альгинатную оболочку ИС; б - культура изолированно растущих зеленых корней на агаризованной среде.

Рис. 6. Расположение хлоропластов (Хл) в клетках зеленых корней Sc.baicalensis (К - первичная кора корня; Эп - эпидерма; Аэ - аэренхима; KB - корневые волоски).

Следует отметить, что исходная длительно культивируемая корневая культура Scutellaria baicalensis, не подвергавшаяся иммобилизации с помощью метода ИС, не проявляла изменения окраски корней даже после 14 дней культивирования в условиях освещения.

В литературе описаны случаи формирования хлоропластов на свету в изолированно растущих корнях - как в корнях, отделенных от проростков (Burstrom, 1960, 1961; Смирнов, 1970), так и в корневых культурах, полученных в результате трансформации Ri-плазмидой (Flores et al., 1993; Tone et al., 1997; Bhadra et al., 1998; Kino-oka et al., 2001; Jacob & Malpathak, 2004). Однако практически во всех работах речь шла о культурах с небольшим сроком пассирования в условиях in vitro. Корневая культура Scutellaria baicalensis почти 18 лет неизменно выращивалась в условиях темноты и не проявляла изменения окраски корней при помещении ее на свет. Однако после проведения корневых фрагментов этой культуры через низкотемпературную иммобилизацию с помощью метода ИС в клетках корней в условиях освещения наблюдалось образование хлоропластов, появление которых могло быть связано с изменениями, вызванными действием низких положительных температур.

Таким образом, в результате низкотемпературной иммобилизации корневых фрагментов нами была получена линия изолированно растущих корней Scutellaria baicalensis, в клетках которых в условиях освещения наблюдалось формирование хлоропластов (рис.б). При исследовании поперечных тонких срезов зеленых участков корней с помощью световой микроскопии было обнаружено, что хлоропласта заполняли клетки всех слоев первичной коровой паренхимы корня, кроме внешнего слоя - эпидермы, и практически отсутствовали в клетках центрального цилиндра. Суммарное содержание хлорофилла а и b в зеленых корнях было почти в 3 раза ниже, чем в листьях целого растения, но в 1,5 раза выше, чем в его стеблях. При этом в зеленых корнях преобладал хлорофилл Ь, по сравнению с соотношением хлорофиллов а и b в надземной части растения Scutellaria baicalensis, что может быть следствием различий структурно-функциональной организации фотосинтетических аппаратов у исследуемых объектов. Сравнительный анализ кривых индукции флуоресценции хлорофилла а (OJIP) в зеленых корнях Scutellaria baicalensis и в фотосинтезирующих листьях интактного растения, показал, что кинетика нарастания участков O-J-1-P кривых и относительная амплитуда пиков в исследуемых объектах практически

идентичны. Определение нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла (NPQ) под действием насыщающих световых вспышек продемонстрировало адаптационную способность фотосинтетического аппарата хлоропластов зеленых корней Scutellaria baicalensis к условиям сильного света, что является характерной чертой для фотосинтезирующих листьев. Таким образом, можно заключить, что в хлоропластах корней Scutellaria baicalensis, культивируемых в условиях освещения, функционирует правильно сформированный комплекс фотосистемы II.

Для выявления участия света в биосинтезе основных действующих веществ корней Scutellaria baicalensis - флавонов байкалеина, вогонина и соответствующих им глюкуронидов байкалина и вогонозида - был проведен хроматографический анализ состава вторичных соединений в линиях корневой культуры Scutellaria baicalensis, полученных из ИС и выращенных в темноте («темновая культура») и на свету («световая культура»). При планировании эксперимента учитывалась длительность цикла культивирования исходных культур, экспланты которых использовали при пересадке, продолжительность пассажа и способ выращивания корней - в условиях погруженной и поверхностной культуры (то есть в жидкой и на агаризованной питательных средах соответственно). В ходе анализа метанольных экстрактов разных вариантов корневых культур Scutellaria baicalensis с помощью ВЭЖХ было установлено, что наиболее продуктивными по синтезу основных флавонов были корни, выращенные в погруженной культуре в темноте (рис.7, вариант 8).

Накопление вторичных метаболитов увеличивалось с возрастом культивируемых корней в течение одного пассажа. Так, б-недельная культура Scutellaria baicalensis содержала в 1,5 раза больше флавонов в пересчете на единицу сухого веса корней, чем 3-недельная, при этом количественное соотношение байкалина, вогонозида и их агликонов оставалось практически одинаковым (рис.7, варианты 7, 8). В условиях освещения в погруженной культуре корней Scutellaria baicalensis общая концентрация флавонов снижалась, по сравнению с темновой культурой, и изменялось количественное соотношение агликонов и глюкуронидов в корнях (рис.7, вар. 8, 9).

При поверхностном культивировании корневой культуры Scutellaria baicalensis на агаризованной питательной среде (рис.7, варианты 1-6) как в условиях освещения, так и в темноте наблюдалось снижение в корнях концентрации флавонов в 1,2-1,5 раза, по сравнению с погруженной корневой культурой (рис.7, варианты 7-8).

Поверхностная культура Погруженная культура

1 - 3-нед. в темноте - из 2-нед. экспланта 7- 3-нед. в темноте

2 - 3-нед. в темноте - из 6-нед. экспланта 8 - 6-нед. в темноте

3 - 5-нед. в темноте - из 6-нед. экспланта 9 - 6-нед. на свету

4 — 3-нед. на свету - из 2-нед. экспланта

5 - 3-нед. на свету - из 6-нед. экспланта

6 - 5-нед. на свету - из 6-нед. экспланта

Рис. 7. Качественный и количественный состав основных флавонов в корнях Scutellaria baicalensis в зависимости от условий их культивирования

Различалось и соотношение основных флавонов в корневых культурах - так, в корнях, выращенных на твердой питательной среде, концентрация агликона вогонина была в 1,5 раза выше, чем в корнях погруженной культуры Scutellaria baicalensis. При этом содержание его глюкуронида вогонозида оставалось в этих культурах неизменным, а количество байкалина и байкалеина заметно снижалось в поверхностных культурах корней, выращенных как в условиях освещения, так и в темноте. Следует отметить также, что возраст исходных корневых культур Scutellaria baicalensis, из которых отбирали экспланты для пересадки корней на агаризованную питательную среду, не

оказывал существенного влияния на общее содержание основных флавонов и на их соотношение в корневых культурах в конце пассажа (рис.7, варианты 1-6).

Сравнительный хроматографический анализ метанольных экстрактов корневых культур Scutellaria baicalensis, выращенных в темноте и в условиях освещения, а также экстрактов стеблей и листьев целого растения показал, что в изолированно растущих корнях, выращенных в темноте, количественное содержание фенольных соединений было наибольшим. Таким образом, полученные данные доказали стабильность корнеспецифического образования флавонов Scutellaria baicalensis и независимость их биосинтеза от присутствия в клетках хлоропластов.

6. Тестирование корневых культур на наличие инфекции и устранение контаминации в изолированно растущих корнях Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea. Изменение физиолого-биохимических параметров культивируемых in vitro генетически трансформированных корней иногда может провоцироваться их неконтролируемым инфицированием. Проводимое тестирование питательных сред на контаминацию (заражение) выявляло в корневых культурах Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea наличие бактериальной инфекции. Для установления источника контаминации были взяты не только пробы культуральных питательных сред, но и 96%-го спирта, используемого для стерилизации инструментов перед их прожиганием в пламени спиртовки в процессе пересадок культур. Все пробы на контаминацию дали положительный результат. В пробах 96%-ного спирта также были выявлены колонии бактерий, которые и становились причиной перекрестного заражения здоровых корневых культур in vitro при повторном использовании простерилизованных с помощью такого спирта инструментов.

Микроскопический анализ бактериальных колоний позволил выяснить предположительную причину неизвестной контаминации. Возбудителем инфекции в стерильной культуре являлась грамположительная спорообразующая бактерия рода Bacillus. К настоящему времени известно много фактов микробной контаминации антисептиков, используемых в медицинской практике (Rutala & Cole, 1984; Красильников, 1995), в том числе и этилового спирта (Hsueh et al., 1999; Гольдинберг и др., 2005). Авторами было описано заражение 95%-го этилового спирта почвенной грамположительной спороносной бактерией Bacillus polymyxa (в современной номенклатуре — Paenibacilluspolymyxa (Ash et al., 1993; Truper, 2005)).

Для удаления проявляющейся бактериальной инфекции в практике культивирования изолированно растущих корней в условиях in vitro обычно проводят добавление антибиотика в питательную среду, что не всегда бывает эффективным и лишь на время снижает интенсивность нежелательной контаминации. В связи с этим нами был разработан способ локального элиминирования (удаления) бактериальной инфекции из корневых культур, основные этапы которого представлены на рисунке 8.

Рис. 8. Основные этапы удаления инфекции из корневой культуры в условиях in vitro (на примере Scutellaria baicalensis):

а - инкапсулирование корневых фрагментов в гелевую оболочку, содержащую антибиотик клафоран (300-600 мг/л) и выдерживание полученных ИС при температуре 4°С в течение 2-6 недель;

б - проращивание ИС в обычных условиях культивирования и отделение прорастающих через альгинатную оболочку кончиков корней;

в - культивирование корневых кончиков в питательных средах без внесения антибиотика;

г - получение массы оздоровленных корней.

Экспериментально подобранная концентрация 450 мг/л клафорана в гелевом

матриксе ИС была наиболее оптимальной. При этом количестве антибиотика даже

после 2-недельной иммобилизации инфицированных корневых фрагментов в случае Scutellaria baicalensis, и 4-недельной - в случае Rhodiola rosea, ИС давали начало оздоровленным линиям корневых культур, сохранявшим стерильность в течение последующих пассажей. Можно предположить, что положительный эффект от сохранения ИС, содержащих в своей оболочке антибиотик, при пониженной температуре в течение 2-4 недель, был обусловлен длительным локальным и поэтому более эффективным бактерицидным действием клафорана, в результате которого происходило полное удаление инфекции из корневых фрагментов и их оздоровление.

В результате применения разработанного на основе метода ИС нового способа оздоровления длительно растущих и подверженных инфицированию культур корней Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea контаминация в них не проявлялась в течение последующих 1,5 лет (15 пассажей для Scutellaria baicalensis и 25 пассажей для Rhodiola rosea), а жизнеспособность корней заметно возросла. Так, на примере корневой культуры Scutellaria baicalensis, в таблице 4 представлены результаты сравнительной оценки ростовой и биосинтетической активности корней до и после применения метода иммобилизации корневых фрагментов с помощью ИС.

Таблица 4. Сравнительная оценка основных физиологических показателей культуры корней Scutellaria baicalensis до и после обновления с помощью метода ИС.

Основные показатели Исходная неинфицированная Инфицированная корневая культура Корневая культура, полученная из ИС (2010 год)

корневая культура (2007 год) до обновления (2009 год)

Сырой вес корней, г 18,5±1,3 11,4±1,3 19,3±1,5

Содержание сухого вещества, % 6,3±0,2 9,9±0,2 6,4±0,2

Содержание основных флавонов, мг/г сух.веса 22,4±0,2 8,2±0,1 21,4±0,4

Продуктивность 6-

недельной культуры, 26,1±0,3 9,3±0,2 26,4±0,4

мг/колба

Масса обновленной культуры корней Scutellaria baicalensis, выращенной в одной колбе в течение пассажа, почти в 2 раза превысила массу корней, которая была ранее ослаблена проявлявшейся инфекцией, и стала сопоставимой с показателями исходной, неинфицированной культуры (табл.4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование природного феномена генетической трансформации растительного материала почвенной бактерией Agrobacterium rhizogenes в биотехнологических целях привело к получению изолированно растущих в условиях in vitro культур корней растений, представляющих интерес для человека. Такие корневые культуры, стабильно растущие на безгормональных питательных средах, уже многие годы служат объектами исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в корневой системе растений, а также успешно используются при изучении симбиотических взаимоотношений корней с представителями ризосферы.

Способность генетически трансформированных корней к сохранению биосинтеза корнеспецифичных вторичных метаболитов в условиях in vitro стала предпосылкой для их возможного использования в качестве альтернативного экологически чистого лекарственного сырья в медицинской и пищевой промышленности, и в связи с этим для их крупномасштабного выращивания в биореакторах, что уже реализовано в ряде лабораторий зарубежных стран. Однако переход к крупномасштабному культивированию больших масс корней лекарственных растений диктует необходимость тщательной отработки отдельных этапов его использования, в число которых входят такие факторы как надежность сохранения стерильности растительного материала - маточных инокулятов корней - и безопасность их успешной транспортировки на ближние и дальние расстояния.

В данной работе проведена экспериментальная апробация метода получения «искусственных семян», заключающегося в инкапсулировании корневых фрагментов в гелевую оболочку, в качестве нового способа совершенствования техники культивирования изолированно растущих pRi Т-ДНК трансформированных корней in vitro. Понятие «искусственные семена» применительно к работе с культурой трансформированных корней как с потенциальным источником лекарственного сырья имеет несколько иное значение, чем в работах исследователей, целью которых было микроклональное размножение растений с применением метода ИС (Murashige, 1978; Khor & Loh, 2005). В данном случае речь идет о сохранении корневых культур лекарственных растений в виде ИС для последующего возобновления из них массы корней, представляющих собой особую живую систему, изолированно растущую в условиях in vitro.

выводы

1. На примере корневых культур трех видов растений - Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea - показано, что инкапсулированные в гелевую оболочку фрагменты корней сохраняют свою жизнеспособность в иммобилизованном при температуре 4°С состоянии в течение длительного времени (от 6 до 12 месяцев) и при обычных условиях культивирования дают начало обновленным, хорошо растущим линиям корневых культур.

2. Длительность хранения корневых фрагментов в иммобилизованном состоянии в виде ИС определяется, прежде всего, их жизнеспособностью после переноса в обычные условия культивирования, а также зависит от состава питательных веществ в гелевом матриксе ИС, возраста исходных корневых эксплантов, взятых для инкапсулирования, и от морфологических и физиологических особенностей исходных корневых культур.

3. Низкотемпературная иммобилизация корневых фрагментов в виде ИС не вызывает существенного изменения основных ростовых и физиолого-биохимических параметров возобновленных из них корневых культур.

4. Культивирование возобновленных из ИС линий корневых культур Ruta graveolens и Scutellaria baicalensis в условиях освещения приводит к проявлению стеблевого органогенеза в первом случае и к интенсивному образованию хлоропластов в клетках корней - во втором, что может быть обусловлено фенотипическими особенностями реакции этих растений на стрессовые факторы.

5. Впервые доказано, что иммобилизация фрагментов инфицированных корней в виде ИС, гелевый матрикс которых содержит антибиотик, является новым эффективным способом элиминирования бактериальной инфекции.

6. Длительное сохранение жизнеспособности корневых фрагментов в виде ИС. позволяет использовать их в качестве резервного фонда, для транспортировки культур на дальние расстояния, а также при подготовке маточных инокулятов в случае перехода к крупномасштабному культивированию корней ценных лекарственных растений в биореакторах.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вдовитчснко М.Ю., Кузовкнна И.Н. (2006) «Искусственные семена» - способ сохранения жизнеспособности растительных тканей. (IX) Международная Конференция молодых ботаников, Санкт-Петербург, с. 138 (тезисы).

2. Вдовптчепко М.Ю., Кузовкина И.Н., Паетц X., Шнайдер Б. (2007) Культивируемые in vitro корни копеечника чайного и образование в них фенольных соединений. Физиология растений. Т. 54, № 4, с. 604-613.

3. Кузовкина И.Н., Альтерман И.Е., Вдовптчепко М.Ю. (2007) Генетически трансформированные корни растений как потенциальный источник экологически чистого лекарственного сырья. 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности», Москва, с. 55 (тезисы).

4. Кузовкнна H.H., Вдовптчепко М.Ю. Альтерман И.Е., Гусева A.B., Суслов Н.И. (2008) Биотехнологический способ получения экологически чистого лекарственного сырья исчезающего ценного растения. Симпозиум «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, с. 102 (тезисы).

5. Вдовптчепко М.Ю., Кузовкина И.Н. (2008) «Искусственные семена» как способ сохранения жизнеспособности растительных тканей. IX Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, с.64-65 (тезисы).

6. Kuzovkina I.N., Vdovitchcnko M.J., Suslov N.I., Churin A.A., Gusseva A.V. (2009) Biotechnological production of ecologically pure raw material of valuable medicinal plant. German-Russian Forum Biotechnology. Novosibirsk, p. 30 (тезисы).

7. Вдовптчепко М.Ю. «Искусственные семена» как способ получения экологически чистого лекарственного сырья и сохранения исчезающих видов растений. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, с. 249 (тезисы).

8. Вдовптчепко М.Ю., Кузовкнна H.H. (2011) «Искусственные семена» как способ сохранения и оздоровления культивируемых in vitro корней лекарственных растений. Физиология растений. Т. 58, №3. с. 461-468.

9. Вдовитченко М.Ю., Кузовкнна И.Н. (2011) «Искусственные семена» как способ получения экологически чистого лекарственного сырья и сохранения исчезающих видов растений. Вестник Московского университета. Сер. 16, Биология. N2. С.4-6.

10. Вдовитчеико М.Ю., Кузовкнна И.Н. (2011) «Искусственные семена» как способ сохранения и оздоровления культур pRi Т-ДНК трансформированных корней лекарственных растений. VII Съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и шшовационных биотехнологий», Нижний Новгород, с. 130 (тезисы).

11. Вдовитченко М.Ю., Кузовкнна И.Н. (2011) Сохранение и оздоровление культивируемых in vitro корней лекарственных растений с помощью искусственных семян. Международная научно-практическая конференция «Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС», стр. 120-132. Минск, Белоруссия (тезисы).

12. Вдовитченко М.Ю., Кузовкнна И.Н. (2011) Способ получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi). Патент РФ № 2415928.

13. Кузовкнна И.Н., Вдовитченко М.Ю. (2011) Генетически трансформированные корни как модель изучения физиологических и биохимических процессов корневой системы целого растения. Физиология растений. Т.58, № 5, с. 787-797.

14. Кузовкнна И.Н., Вдовитченко М.Ю. (2012) Генетически трансформированные корни как модельная система для изучения физиологических и биохимических процессов корневой системы целого растения. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл. В. Кузнецова, В. В. Кузнецова, Г. А. Романова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. С. 37-53.

15. Прокофьева (Вдовитченко) М.Ю. (2012) Влияние света на биосинтез фенольных соединений в культивируемых in vitro корнях шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi). VIII Международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, с. 422 (тезисы).

Подписано в печать:

23.10.2012

Заказ № 7740 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метод «искусственных семян» в биотехнологии растений.

1.1.1. Строение искусственных семян.

1.1.2. Инкапсулируемый растительный материал.

1.1.3. Особенности получения искусственных семян.

1.1.4. Сохранение растительного материала с помощью искусственных семян.

1.2. Метод культивирования изолированно растущих генетически трансформированных корней растений.

1.3. Контаминация в культуре растительных клеток, тканей и органов в условиях in vitro.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительные объекты.

2.1.1. Получение культуры генетически трансформированных корней Rhodiola rosea.

2.1.2. Условия культивирования генетически трансформированных корней Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea.

2.2. Инкапсулирование корневых фрагментов.

2.3. Условия проращивания «искусственных семян» и получение из них линий корневых культур.

2.4. Оценка физиологического состояния линий корневых культур, возобновленных из «искусственных семян».

2.5. Получение растений из «искусственных семян» Ruta graveolens в условиях освещения.

2.6. Исследование фотосинтетических параметров у зеленеющей в условиях освещения корневой культуры Scutellaria baicalensis.

2.7. Методы химического анализа.

2.7.1. Определение опинов.

2.7.2. Определение содержания флавонов в корнях Scutellaria baicalensis.

2.7.3. Определение содержания хлорофилла в корнях Scutellaria baicalensis.

2.8. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Морфологическая характеристика генетически трансформированных корневых культур Ruta graveolens, Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea как исходного материала для получения «искусственных семян».

3.2. Жизнеспособность инкапсулированных корневых фрагментов, иммобилизованных в виде «искусственных семян».

3.2.1. Влияние длительности хранения «искусственных семян» на жизнеспособность инкапсулированных корневых фрагментов.

3.2.2. Влияние состава гелевого матрикса «искусственных семян» на жизнеспособность инкапсулированных корневых фрагментов.

3.3. Оценка физиологического состояния линий корневых культур, возобновленных из «искусственных семян».

3.3.1. Ростовая активность корней, возобновленных из «искусственных семян».

3.3.2. Содержание сухого вещества в корневых культурах, возобновленных из «искусственных семян».

3.3.3. Электропроводность и рН культуральных питательных сред.

3.4. Физиолого-биохимические особенности корневых культур, возобновленных из «искусственных семян» в условиях освещения.

3.4.1. Морфологические и физиологические особенности корневой культуры Ruta graveolens, полученной из «искусственных семян» в условиях освещения.

3.4.2. Морфологические и физиолого-биохимические особенности корневой культуры Scutellaria baicalensis, полученной из «искусственных семян» в условиях освещения.

3.5. Тестирование корневых культур на наличие инфекции и устранение контаминации в изолированно растущих корнях Scutellaria baicalensis и Rhodiola rosea.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование "искусственных семян" в технологии культивирования in vitro корней лекарственных растений"

С древних времен большинство растений используется человеком для лечения различных заболеваний. Натуральные средства и, в особенности, вторичные метаболиты растительного происхождения по-прежнему широко используются в терапевтической практике. Как показывают статистические данные, 28% новых химических соединений, полученных за период с 1981 г. по 2002 г., представляли собой натуральные компоненты, выделенные из растительного сырья, и 24% этих веществ обладали физиологической активностью (Raskin et al., 2002; Balunas & Kinghorn, 2005).

Получение медицинских препаратов на основе экстрактов диких или культивируемых растений в настоящее время лимитируется исчезновением ценных видов по мере заготовки лекарственного сырья, трудоемкостью культивирования растений на плантациях, а также геополитической ситуацией (Verpoorte et al., 2002). Для решения этой проблемы в течение последних десятилетий было предпринято множество попыток оценки возможности получения лекарственных препаратов из культивируемых в условиях in vitro культур растительных клеток и тканей (Berlin, 1986; Alfermann & Petersen, 1995). Однако в большинстве случаев вторичные соединения в культурах не обнаруживались или их содержание было очень низким. В связи с этим были разработаны такие стратегические приемы работы с клеточными культурами, как скрининг и отбор высокопродуктивных линий растительных клеток, клеточная иммобилизация, элиситация, а также получение культур дифференцированных тканей (Zenk et al., 1975; Bensaddek et al., 2008). Было отмечено, что практически в каждом случае возникали осложнения, которые не позволяли развивать коммерческое биотехнологическое получение вторичных соединений (Verpoorte et al., 2002). Многолетний опыт использования различными исследователями метода культуры тканей и клеток как модели изучения вторичного метаболизма растений привел к совершенствованию способов манипулирования растительными клетками и к обогащению их современными приемами генетической инженерии. Возможности для более углубленного изучения специфики метаболизма корней, включающего в себя весь комплекс процессов, характерных для корневых клеток, открыла модельная система — культура генетически трансформированных корней, так называемых «hairy roots», получаемых при инокуляции стерильных двудольных растений штаммами почвенной агробактерии Agrobacterium rhizogenes (Chilton et al., 1982).

Агробактериальная трансформация растительного материала позволила преодолеть значительные трудности в культивировании растительных органов в условиях in vitro. Это привело к получению быстрорастущих корней, характеризующихся интенсивным ветвлением и способностью к биосинтезу вторичных метаболитов, характерных для корней проростков или корней интактных исходных растений. Генетически трансформированные корни послужили основой для разработки перспективной технологии биотехнологического получения вторичных метаболитов, таких как алкалоиды, фенольные соединения и ряд других (Flores & Filner 1985; Hamill et al., 1987; Giri & Narasu, 2000; Oksman-Caldentey & Arroo, 2000; Georgiev et al., 2010).

Таким образом, копирование в лабораторных условиях давно известного явления - естественно происходящей в природе трансформации растений -привело к появлению в середине 80-х годов XX века метода культивирования генетически модифицированных корней растений, который моментально был взят на вооружение многочисленными исследователями в лабораториях различных стран (Mugnier, 1988). Поток публикаций, посвященных новым аспектам применения генетически трансформированных корней в физиологических и биохимических исследованиях, не ослабевает до настоящего времени (Veena & Taylor, 2007; Mishra & Ranjan, 2008; Mrosk et al., 2009). Основное направление исследовательских работ состоит в изучении биосинтетической активности клеток и тканей корневого происхождения, культивируемых в условиях in vitro, которая проявляется в их способности к сохранению биосинтеза корнеспецифичных низкомолекулярных метаболитов (алкалоидов, кумаринов, фенольных соединений, эфирных масел). Многие из этих корнеспецифичных соединений обладают высокой физиологической активностью, в связи с чем они играют существенную роль при установлении контактов корневой системы целого растения с почвенной микрофлорой и при взаимодействии растений в биоценозах. Кроме того, развитие метода генетической трансформации растений агробактерией Agrobacterium rhizogenes, а также культивирование корневых культур и их биотехнологическое использование для получения лекарственных средств открывают новые перспективы в фармацевтической и пищевой промышленности (Guillon et al., 2006; Georgiev et al., 2007; Srivastava & Srivastava, 2007).

Реализация метода трансформации растительного материала с помощью почвенной бактерии Agrobacterium rhizogenes сотрудниками Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН привела в 1999 году к созданию коллекции генетически трансформированных корней (КГТК), которая к настоящему времени насчитывает около 40 штаммов корневых культур, полученных от 29 видов растений, относящихся к 13 семействам. Наибольшую часть коллекции составляют корни ценных лекарственных растений, в которых биосинтез физиологически активных вторичных соединений локализован в подземной части. Биохимический анализ основных штаммов корневых культур показал, что корни в условиях in vitro сохраняют способность к образованию корнеспецифичных низкомолекулярных метаболитов на уровне, сопоставимом с их содержанием в корнях целых или ювенильных растений. Эта особенность делает привлекательным их применение при исследовании пространственной и временной организации вторичного метаболизма в корнях растений (Kuzovkina et al., 2004; Thorpe, 2007). Различные способы культивирования корней (пролонгированное выращивание, действие стрессовых факторов, использование предшественников биосинтеза конечных продуктов) позволяют увеличивать содержание в них ценных вторичных метаболитов до уровня, сравнимого с их концентрациями в корнях целого растения. Способность генетически трансформированных корней к сохранению биосинтетической потенции в условиях in vitro и к синтезу вторичных метаболитов явилась предпосылкой для их крупномасштабного выращивания в биореакторах и сохранение ростовой активности ИС, полученных из корневых культур ценных лекарственных растений, позволяет использовать их в качестве резервного фонда, а также, в случае необходимости, как компактно упакованные стерильные корневые экспланты для транспортировки растительного материала на дальние расстояния. Новый способ оздоровления инфицированных корневых культур с помощью ИС позволяет существенно снизить риск потери ценных линий корневых культур и сохранить их продуктивность в течение многих лет выращивания. Выявленные физиологические и биохимические особенности корневых культур, возобновленных из ИС, рекомендуется учитывать при выборе условий последующего культивирования корней лекарственных растений. Метод альгинатного инкапсулирования способен дополнить и усовершенствовать технику сохранения растительных ресурсов. Полученные данные могут быть включены в материалы лекций по физиологии растений.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИС - искусственные семена МС - среда Мурасиге и Скуга

Уг МС - среда Мурасиге и Скуга с уменьшенной вдвое концентрацией азота РИ - ростовой индекс ФСИ - фотосистема II нефотохимическое тушение Рт -максимальный выход флуоресценции хлорофилла Р„ - минимальны выход флуоресценции хлорофилла

Ру/Рш ~ квантовый выход ФСН (соотношение вариабельной и максимальной флуоресценции хлорофилла)

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Прокофьева, Мария Юрьевна

ВЫВОДЫ

6. Длительное сохранение жизнеспособности ИС, позволяет использовать их в качестве резервного фонда, для транспортировки культур на дальние расстояния, а также при подготовке маточных инокулятов в случае перехода к крупномасштабному культивированию корней ценных лекарственных растений в биореакторах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьева, Мария Юрьевна, Москва

1. Бутенко Р.Г. (1985) Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений. Новые направления в физиологии растений. M.: Наука. С. 270.

2. Бутенко Р.Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС. 160 с.

3. Быков В.А., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. (1999) Родиола розовая (Rhodiola rosea L.): Традиционные и биотехнологические аспекты получения лекарственных средств (обзор). Хгш.-фармац. журнал. Т.ЗЗ, № 1. С.28-37.

4. Гавриленко В.Ф., Рубин Б.А. (1965) Влияние некоторых метаболитов на биосинтез железопорфиринов в изолированных корнях. Научные доклады высшей школы. Бнол. науки. № 9. С. 100-105.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Литвиненко В.И., Попова Т.П., Суслов Н.И.1994) Шлемник байкальский. Фитохимия и фармакологические свойства. Томск: Изд-во Том. ун-та С. 9.

6. Гусева A.B. (2000) Введение в культуру трансформированных корней шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi.) и содержание в них флавоноидов. Дисс. канд. биол. наук, Томск, 116 с.

7. Загоскина Н.В., Дубравина Г.А., Запрометов М.Н. (2000) Особенности формирования хлоропластов и накопление фенольных соединений в фотомиксотрофных культурах чайного растения. Физиология растений. V.47. Р. 537-543.

8. Запрометов М.Н., Колонкова C.B. (1967) О биосинтезе фенольных соединений в хлоропластах чайного растения. Докл. АН СССР. Т. 176. С. 470473.

9. Заирометов M. H. (1996) Фенольные соединения и их роль в жизни растения: 56-е Тимирязевское чтение. М.: Наука. 45 с.

10. Запрометов М.Н., Николаева Т.Н. (2003) Способность изолированных хлоропластов из листьев фасоли осуществлять биосинтез фенольных соединении. Физиология растений. 2003. Т. 50. №5. С. 699-702.

11. Коноплева М.М. (2007) Фармакогнозия: Природные биологически активные вещества Витебск. 272 с.

12. Корнеев Д.Ю. (2002) Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. К.: «Альтпресс». 188 с.

13. Красилышков А.П. (1995) Справочник по антисептике. Минск: Выш. шк. 367 с.

14. Кузовкина И.Н., Кузнецова Г.А., Смирнов A.M. (1971) Синтез кумаринов в корневой культуре Ruta graveolens L. Herba Himgarica. V. 10. P. 39-42.

15. Кузовкина И.Н. (1992) Культивирование генетически трансформированных корней растений: возможности и перспективы использования в физиологии растений. Физиология растений. Т. 39. С. 1208-1214.

16. Кузовкина И.Н., Мантрова О.В., Альтерман И.Е., Якимов С.А. (1996) Получение культуры генетически трансформированных корней марены красильной, продуцирующей антрахиноны. Физиология растений. Т.43. №2. С.121.

17. Кузовкина И.Н. Гусева A.B., Альтерман И.Е., Карначук P.A. (2001) Образование флавоноидов в трансформированных корнях Scutellaria baicalensis и пути их регуляции. Физиология растений. Т. 48. С. 523-528.

18. Кунах В.А. (1999) Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro. Физиология растений. Т.46, №6. С.919-929.

19. Пирузян Э.С, Андрианов В.М. (1994) Создание трансгенных растений. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. №5. С.36- 37.

20. Рубин Б.А., Гсрманова В.Ф. (1959) О синтезе пигментов в корнях. Докл. АН СССР. Т. 124. С. 940-943.

21. Смирнов A.M. (1970) Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. М.: Наука. 455 с.

22. Agrios G.N. (1997) Plant pathology, 4th ed. London: Academic Press. 635 pp.

23. Aitken-Christie J., Kozal Т., Smith M.A.L. (1995) Glossary. In: Automation and environmental control in plant tissue culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. P. 9-12.

24. Alfermann A.W., Petersen M. (1995) Natural product formation by plant cell biotechnology Results and perspectives. Plant Cell Tiss Org. V. 43. P. 199-205.

25. Aronen Т., Krajnakova J., Haggman H., Ryynanen L. (1999) Genetic fidelity of cryopreserved embryogenic cultures of open-pollinated Abies cephalonica. Plant Science. V. 142. P. 163-172.

26. Ash C., Priest F.G., Collins M.D. (1993) Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Proposal for the creation of a new genus Paenibacillus. Antonie Van Leeuwenhoek. V.64. P.253-260.

27. Bajaj Y.P.S. (ed.) (1995) Biotechnology in agriculture and forestry 30: somatic embryogenesis and synthetic seed 1. Springer-Verlag, Berlin, Germany.

28. Ballester A., Janeiro L.V., Vieitez A.M. (1997) Cold storage of shoot cultures and alginate encapsulation of shoot tips of Camellia japonica L. and Camellia reticulata Lindley. Scientia Horticulturae. V. 71. P. 67-78.

29. Balunas M.J., Kinghorn A.D. (2005) Drug discovery from medicinal plants. Life Sci. V. 78. P. 431-441.

30. Bapat V.A., Mhatre M., Rao P.S. (1987) Propagation of Moms indica L. (mulberry) by encapsulated shoot buds. Plant Cell Reports. V. 6. P. 393-395.

31. Bapat V.A., Rao P.S. (1990) In vitro growth of encapsulated axillary buds of mulberry (Morus indica L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V. 20. P. 69-70.

32. Bapat V.A. (1993) Studies on synthetic seeds of sandalwood (Santalum album L.) and mulberry {Moms indica L.) In: Synseeds: Applications of synthetic seeds to crop improvement. (Redenbaugh, K., Ed.). CRC Press Inc., Boca Raton, CA, USA. P. 381-407.

33. Barrett C., Cassells A.C. (1994) An evaluation of antibiotics for the elimination of Xanthomonas campestris pv. Pelargonii (Brown) from Pelargonium domesticum cv. Grand Slam explants in vitro. Plant Cell Tiss. Organ Cult. V. 36. P. 169-175.

34. Barrett C., Cobb E., McNicol R., Lyon G. (1997) A risk assessment study of plant genetic transformation using Agrobacterium and implications for analysis of transgenic plants. Plant Cell Tiss. Organ Cult. V. 47. P. 135-144.

35. Becard G., Piche Y. (1990) Physiological factors determining vesicular-arbuscular mycorrhizal formation in host and non-host Ri T-DNA transformed roots. Canadian Journal of Botany. V. 68. P. 1260-1264.

36. Berlin J. (1986) Secondary products from plant cell cultures. In: Biotechnology a comprehensive treatise, Rehm H.J. & Reed G. (eds). Verlag Chemie, Verlagsgesellschaft, Weinheim. V. 4. P. 630-658.

37. Beaumont M.D., Knorr D. (1987) Effects of immobilizing agents and procedures on viability of cultured celery (Apium graveolens) cells. Biotechnology Letters. V.9. No 6. P. 377-382.

38. Bhadra R., Morgan J.A., Shanks J.V. (1998) Transient studies of light-adapted cultures of hairy roots of Catharanthus roseus: Growth and indole alkaloid accumulation. Biotechnology and Bioengineering. V. 60. № 6. P. 670-678.

39. Bhattacharya R., Ray A., Gangopadhyay M., Bhattacharya S. (2007) In vitro conservation of Plumbago indica a rare medicinal plant. Plant Cell Biotechnol. Mol. Biol. V. 8. P. 39-46.

40. Bjorn L.O., Papageorgiou G.C., Blankcnship R.E., Govindjcc. (2009) A viewpoint: Why chlorophyll al Photosynth Res. V. 99. P. 85-98.

41. Bohidar S., Thirunavoukkarasu M., Rao T.V. (2008) Effect of plant growth regulators on in vitromicropropagation of «Garden rue» (Ruta graveolens L.). International Journal of Integrative Biology. V.3. №1. P. 36-43.

42. Boulanger F., Berkaloff A., Richaud F. (1986) Identification of hairy root loci in the T-regions of Agrobacterium rhizogenes Ri-plasmids. Plant. Mol. Biol. V. 6 (4). P. 271-279.

43. Brodelius P., Linse L., Nilsson K. (1982) Viability and biosynthetic capacity of immobilized plant cells. In: Fujiwara A. (ed) Plant Tissue Culture 1982, Proc. 5th Int. Cong, of Plant Tissue and Cell Culture Maruzen, Tokyo, pp. 371.

44. Bunn E., Tan B. (2002) Microbial contaminants in plant tissue culture propagation. Microorganisms in Plant Conservation and Biodiversity / Eds Sivasithamparam K., Dixon K.W., Barrett R.L. Kluwer Academic Publishers. P. 307-335.

45. Burstrom H., Hejnowicz Z. (1958) The formation of chlorophyll in isolated roots. Kgl. fysiorg sallskap. Lund forhandl. V. 28. P. 65-69.

46. Burstrom H. (1960) Influence of iron and gibberellic acid on the light sensivity of roots. Physiol. Plantarum. V. 13. P. 597-615.

47. Burstrom H. (1965) Light in the regulation on root growth. / Proc. Internal Conf. Plant Tissue cultire. P. 45-60.

48. Butler M.S. (2005) Natural products to drugs: natural product derived compounds in clinical trials. Nat Prod Rep. V. 22. P. 162-195.

49. Cadiz N., Vivanco J., Flores H. (2000) Coculture of Pachyrhizus erosus (L.) hairy roots with Rhizobium spp. In Vitro Cellular and Development Biology Plant, V. 36. № 4. P. 238-242.

50. Cassclls A.C. (ed) (1997) Pathogen and microbial contamination management in micropropagation. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 384 p.

51. Cassells A.C., Doyle B.M., Curry R.F. (2000) Methods and markers for quality assurance in micropropagation. Acta Hortic. P. 530.

52. Chabot S., Becard G., Piche Y. (1992) Life cycle of Glomus intraradix in root organ culture. Mycologia. V. 84. P. 315-321.

53. Chand S., Singhet A.K. (2004) Plant regeneration from encapsulated nodal segments of Dalbergia sissoo Roxb., a timber-yielding leguminous tree species. J. Plant Physiol. V. 161. P.237-243.

54. Chilton M.D., Tepfer D.A., Petit A., Casse-Delbart F., Tempe J. (1982) Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. V.295. P. 432-434.

55. Chithra M., Martin K.P., Sunadakumari C., Madhusoodanan P.V. (2005) Somatic embryogenesis, encapsulation, and plant regeneration of Rotula aquatica Lour., a rare rhoeophytic woody medicinal plant. In Vitro Cell. Dev. Biol Plant. V. 41. P. 28-31.

56. Cho H.J., Farrand S.K., Noel G.R., Widholm J.M. (2000) High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. V.210.1. 2. P. 195-204.

57. Christey M.C. (2001) Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cell Dev. V. 37. P. 687-700.

58. Clemow S.R., Clairmont L., Madsen L.H., Guinel F.C. (2011) Reproducible hairy root transformation and spot-inoculation methods to study root symbioses of pea. Plant Methods. V. 7. P. 46.

59. Collier R., Fuchs B., Walter N., Kevin Lutke W., Taylor C.G. (2005) Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. V.43(3). P. 449-457.

60. Curtis W.R. (1993) Cultivation of Roots in Bioreactors. Current Opinion in Biotechnology. V. 4(2). P. 205-210.

61. Curtis W.R. (2000) Hairy Roots: Bioreactor Growth / In: Encyclopedia of Cell Technology. V. 2 (Spier, R.E., ed.) John Wiley & Sons, New York. P. 827-841.

62. Datta S.K., Potrykus I. (1989) Artificial seeds in barley: encapsulation of mierospore-derived embryos. Theor Appl Genet. V. 77. P. 820-824.

63. Devi P., Radha P., Sitamahalakshmi L., Syamala D., Kumar S.M. (2004) Plant regeneration via somatic embryogenesis in mung bean Vigna radiata (L.) Wilczek. Scientia Horticulturae. V. 99. P. 1-8.

64. Doran P.M. (ed). (1997) Hairy roots: culture and applications. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. 239 p.

65. Durand-Tardif M., Broglie R., Slightom J., Tepfer D. (1985) Structure and expression of Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes in Nicotiana tabaciun. Organ and phenotype specificity. JMol Biol. V. 186. P. 557-564.

66. Eckardt N.A. (2006). The Role of Flavonoids in Root Nodule Development and Auxin Transport in Medicago tmncatula. The Plant Cell. V. 181. 7. P. 1539-1540.

67. Endrcss R. (1994) Immobilization of plant cells. Ch. 7. in: Plant cell biotechnology. Springer-Verlag, Berlin, 256-269.

68. Engelmann F. (1997) In vitro conservation methods. In: Callow JA., Ford-Lloyd & Newbury H.J. (eds) Biotechnology and Plant Genetic Resources. CAB International, Oxford. P. 119-161.

69. Esau K. (1977) Anatomy of Seed Plants. John Wiley & Sons, New York, USA.

70. Estruch J.J., Chriqui D., Grossmann K., Schell J., Spano A. (1991) The plant oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates. European Molecular Biology Organization Journal. V. 10. I. 11. P. 2889-2896.

71. Flores H.E. (1992) Roots as chemical factories. Chem. bid. V.10. P.374-377.

72. Flores H.E., Curtis W.R. (1992) Approaches to understanding and manipulating the biosynthetic potential of plant roots. Ann NY Acad Sci. V.65. P. 188209.

73. Flores H.E., Dai Y., Cuello J.L., Maldonado-Mendoza I.E., Loyola-Vargas

74. V.M. (1993) Green Roots: Photosynthesis and photoautotrophy in an underground plant organ. Plant Physiol. V. 101. P. 363-371.

75. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. (1968) Nutrient Requirements of Suspension Cultures of Soybean Root Cells. Exp. Cell Res. V. 50. P. 151-158.

76. Ganapathi T.R., Suprasanna P., Bapat V.A., Rao P.S. (1992) Propagation of banana through encapsulated shoot tips. Plant Cell Reports. V.l 1. P. 571-575.

77. Gelvin S.B. (1990) Crown Gall Disease and Hairy Root Disease. Plant Physiol. V.92. P. 281-285.

78. Georgiev M.I., Pavlov A.I., Bley Th. (2007) Hairy root type plant in vitro system as sources of bioactive substances. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 74. P. 11751185.

79. Georgiev M., Ludwig-Mueller J., Bley Th. (2010) Hairy root culture: copying nature in new bioprocesses, chapter 10, In: Medicinal Plant Biotechnology (R. Arora, Ed.), CAB International, Wallingford, United Kingdom, pp. 156-175.

80. Giri A., Narasu M.L. (2000) Transgenic hairy roots: recent trend and applications. Biotechnology' Advances. V. 18. P. 1-22.

81. Govindjee (1995) Sixty three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. Aust. J. Plant Physiol. V. 22. P. 131-160.

82. Govindjee (2004) Chlorophyll a fluorescence, a bit of basics and history. In: Papageorgiou, G.C., Govindjee (ed.): Chlorophyll Fluorescence: a Signature of Photosynthesis. Springer, Dordrecht. P. 1-42.

83. Gray D.J., Compton M.E., Harrell R.C., Cantliffe D.J. (1995) Somatic embryogenesis and the technology of synthetic seeds. In: Bajaj, Y.P.S. (Ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry 30. Springer-Verlag, Berlin, Germany. P. 126-151.

84. Giiillon S., Tremouillaux-Guiller J., Kumar P.P., Rideau M., Gantet P. (2006) Harnessing the Potential of Hairy Roots: Dawn of a New Era. Trends Biotechnol. V. 24. P. 403-409.

85. Haberlandt G. (1902) Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. G. Haberlandt. Sitzungsber. Akad. der Wiss., Wien, Math. Wiss. Reine. Bd.l 11. S. 69 92.

86. Hamill J.D., Parr A.J., Rhodes M.J.C., Robins R.J., Walton N.J. (1987) New routes to plant secondary products. BioTechnol. V. 5. P. 800-804.

87. Hammerschlag Q., Lui Q., Zimmerman R. H., Gercheva P. (2000) Generating apple transformants free of Agrobacterium tumefaciens by vacuum infiltrating explants with an acidified medium and with antibiotics. Acta Horde. V.530 P. 103108.

88. Hasan S.M.Z., Takagi H. (1995) Alginate coated nodal segments of yam (Dioscorea spp.) for germplasm exchange and distribution. Plant Gen. Res. Newsletter. V. 103. P. 32-35.

89. Hashem E.A., Davey M.R. (1992) Hairy root induction on Solatium nigrum plants by using Ri T-DNA of Agrobacterium rhizogenes. Egyptian J. of Appl. Sci. V. 7. P. 583-592.

90. Hashem E.A. (2009) Estimation of the Endogenous Auxins and Cytokinins in Hairy Roots Incited on Solanum Dulcamara Plants by Ri-Plasmid of Agrobacterium Rhizogenes. Australian Journal of Basic and Applied Sciences. V. 3. I. I. P. 142147.

91. Hawes M.C., Brigham L.A., Wen F., Woo H.H., Zhu Y. (1998) Function of root border cells in plant health: Pioneers in the Rhizospere. Annu.Rev.Phytopathol. V. 36. P. 311-327.

92. Herman E.B. (1990b) Bacterial contamination in micropropagation. Agricell Rep. V. 14. P. 41-43.

93. Herman E.B. (1990a) Non-axenic plant tissue culture: possibilities and opportunities. Acta Hortic. V. 280. P. 112-117.

94. Hilton M.G., Wilson P.D.G, Robins R.J., Rhodes M.J.C. (1988) Transformed root cultures fermentation aspects. In: Manipulating secondary metabolism in culture, ed. Robins R.J. and Rhodes M.J.C. - Cambridge:Cambridge University Press. -P.239-245.

95. Hirata K., Goda S., Phunchindawan M., Du D., Ishio M., Sakai A., Miyamoto

96. K. (1998) Cryopreservation of horseradish hairy root cultures by encapsulation-dehydration. J. Ferment. Bioeng. V. 86(4). P. 418-420.

97. Hirata K., Mukai M., Goda S., Ishio-Kinugasa M., Yoshida K., Sakai A., Miyamoto K. (2002) Cryopreservation of hairy root cultures of Vinca minor L. by encapsulation-dehydration. Biotechnology Letters. V. 24. P. 371-376

98. Honda H., Liu C., Kobayashi T. (2001) Large-scale plant micropropagation. Advances in Biochemical Engineering: Biotechnology. V. 72. P. 157-182.

99. Hoober J.K. (2007) Chloroplast Development: Whence and Whither. In: The Structure and Function of Plastids. Robert R. Wise and J. Kenneth Hoober (eds.). Springer. P. 27-51.

100. Hsueh P.R., Teng L.J., Yang P.C., Pan H.L., Ho S.W., Lull K.T. (1999) Nosocomial Pseudoepidemic Caused by Bacillus cereus Traced to Contaminated Ethyl Alcohol from a Liquor Factory. J. Clin. Microbiol. V.37.1.7. P.2280-2284.

101. Hung C.D., Trueman S.J. (2011) Encapsulation technology for short-term preservation and germplasm distribution of the African mahogany Khaya senegalensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V. 107. P. 397-405.

102. Ishimaru K., Arakawa H., Yamanaka M., Shimomura K. (1994) Polyacetylenes in Lobelia sessilifolia hairy roots. Phytochemistiy. V. 35. P. 365-369.

103. Jacob A., Malpathak N. (2004) Green hairy root cultures of Solatium khasianum Clarke a new route to in vitro solasodine production. Current science. V. 87.1. 10. P. 1442-1447.

104. Jayasree N., Devi B.P., Reddy P.V. (1997) Production of synthetic seeds and plant regeneration in Rosa hybrida L. cv. 'King's ransom'. Indian Journal of Experimental Biology. V. 35. P. 310-312.

105. Jaziri M. (1995) Establishment of normal and transformed root cultures of Artemisia annua L. for artemisinin production. Plant Phisiol. V.145, №1-2. P. 175177.

106. Jouanin L., Guerche P., Pamboukdjian N., Tourneur C., Casse-Delbart F., Tourneur J. (1987) Structure of T-DNA in Plants Regenerated from Roots Transformed by Agrobacterium rhizogenes Strain A4. Mol. Gen. Genet. V. 206. P. 387-392.

107. Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., DuIIoo M.E. (2008) Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya. Plant Cell Rep. V.27. P. 1529-1539.

108. Kamada H., Okamura N., Satake M., Harada H., Shimomura K. (1986) Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna. Plant Cell Reports. V.5. P.239-242.

109. Kamada H. (1987) Artificial seed. In: Tanaka R. (Ed.) Practical technology on the mass production of clonal plants. CMC Publisher, Tokyo, Japan (in Japanese, cited in Redenbaugh et al.). P. 48.

110. Kautsky H., Hirsch A. (1934) Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensaureassimilation. Das Fluoreszenzverhalten grtiner Pflanzen. Biochem. Zeitschrift. V. 274. P. 423-434.

111. Khor E., Ng W.F., Loh C.S. (1998) Two-coat systems for encapsulation of Spathoglottis plicata (Orchidaceae) seeds and protocorms. Biotechnol. Bioeng. V. 59. P. 635-639.

112. Khor E., Loh C. (2005) Artificial seeds. In: Applications of Cell Immobilisation Biotechnology / Eds Nedovic V., Willaert R. Springer: Netherlands,. P. 527-537.

113. Kim, Y.H., Yoo, Y.J. (1996). Peroxidase production from carrot hairy root culture. Enzyme and Microbial Technology. V. 18. P. 531-535.

114. Kim Y.J., Wyslouzili B.E., Weathers P.J. (2002) Invited review: Secondary metabolism of hairy root cultures in bioreactors. Vitro. Cell. Dev. Biol. Plant. V.38. P. 1-10.

115. Kino-oka M., Nagatome H., Taya M. (2001) Characterization and application of plant hairy roots endowed with photosynthetic functions. Advances in Biochemical Engineering. Biotechnology. V. 72. P. 183-218.

116. Kinoshita I., Saito A. (1990) Propagation of Japanese white birch by encapsulated axillary buds 1. Regeneration of plantlets under aseptic conditions. J. Jpn. For. Soc. V. 72: P. 166-170.

117. Kohmura H., Ikcda Y., Sakai A. (1994) Cryopreservation of apical meristems of Japanese shallot (.Allium wakegi) by vitrification and subsequent high plantregeneration. CtyoLetters. V. 15. P. 289-298.

118. Krause G.H., Weis E. (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The Basics. Annu. Rev. Plant Physiol. Plants Mol. Biol. V. 42. P. 313-349.122

119. Kruger G.H.J., TsimiHi-Michael M., Strasser R.J. (1997) Light stress provokes plastic and elastic modifications in structure and function of Photosystem II in camellia leaves. Physiology Plantarum. V. 101, №. 2. P. 265-277.

120. Kumar M.B.A., Vakeswaran V., Krishnasamy V. (2005) Enhancement of synthetic seed conversion to seedlings in hybrid rice. Plant Cell Tiss Organ Cult. V. 81. P. 97-100.

121. Kuzovkina I., Alterman I., Schneider B. (2004) Specific accumulation and revised structures of acridone alkaloid glucosides in the tips of transformed roots of Ruta graveolens. Phytochemistiy. V. 65. P. 1095-1100.

122. Kuzovkina I.N., Schneider B. (2006) Genetically Transformed Root Cultures-Generation, Properties and Application in Plant Sciences. Progress in Botany / Eds Esser K., Luttge U., Beyschlag W., Murata J. Berlin: Springer-Verlag, 2006. V. 67. P. 275-314.

123. Lam K.S. (2007) New aspects of natural products in drug discovery. Trends Microbiol. V. 15. P. 279-289.

124. Lambardi M., Fabbri A., Caccavale A. (2000) Cryopreservation of white poplar (Populus alba L.) by vitrification of in vitro-grown shoot tips. Plant Cell Reports. V. 19. P. 213-218.

125. Lambert E., Goossens A., Panis B., Van Labeke M.S., Geelen D. (2009) Cryopreservation of hairy root cultures of Maesa lanceolata and Medicago truncatula. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V.96.1. 3, P.289-296.

126. Lata H., Chandra S., Khan I.A., ElSohly M.A. (2009) Propagation through alginate encapsulation of axillary buds of Cannabis sativa L. an important medicinal plant. Physiol. Mol. Biol. Plants, V. 15.1. 1. P. 79-86.

127. Leifert C., Camotta H., Waites W. M. (1991c) Effect of antibiotics on micropropagated plant cultures. Plant Cell Tiss. Organ Cult. V. 29. P. 153-160.

128. Leifert C., Waites W. M. (1992) Bacterial growth in plant tissue cultures. J. Appl. Bacteriol. V.72. P.460-466.

129. Leifert C., Morris C., Waites W. M. (1994a) Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue cultured and field grown plants. CRC Crit. Rev. Plant Sci. V.13. P.139-183.

130. Leifert C., Waites B., Keetley J.W., Wright S., Nicholas J.R., Waites W.M.1994b) Effect of medium acidification on filamentous fungi, yeasts and bacterial contaminants in Delphinium tissue cultures. Plant Cell Tiss. Organ Cult. V.36. P.149-155.

131. Leifert C., Berger F., Steward G.S.A.B., Waites W.M. (1994c) Plasmid profiles of Lactobacillus plantarum found as contaminants in Hemerocallis plant tissue cultures. Let. Appl. Microbiol. V.19. P. 377-379.

132. Leifert C., Woodward S. (1998) Laboratory contamination management, the requirement for microbiological quality assurance. Plant Cell Tiss. Organ Cult. V.52. P. 85-88.

133. Leifert C., Cassells A.C. (2001) Microbial Hazards in Plant Tissue and Cell Cultures. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. V. 37. P. 133-138.

134. Li Q., Wu Z., Wong M.L., Li S.J. (2002) The Ri Plasmid of Agrobacterium rhizogenes and Its Application in Plant Science. Biotechnology. V.5. P. 21-25.

135. Liere K., Borner T. (2006) Transcription of plastid genes: In Regulation of transcription in plants. Grasser K.D. (ed.) Oxford: Blackwell. P. 184-224.

136. Lopez-Juez E. (2007). Plastid biogenesis, between light and shadows. Journal of Experimental Botany. V. 58. P. 11-27.

137. Lulsdorf M.M., Tautorus T.E., Kikcio S.I., Bethune T.D., Dunstan D.I. (1993) Germination of encapsulated embryos of interior spruce (Picea glauca engelmannii complex) and black spruce (Picea mariana Mill.). Plant Cell Rep. V.12. P. 385-389.

138. Mamiya K., Sakamoto Y. (2001) A method to produce encapsulatable units for synthetic seeds in Asparagus officinalis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V.64. P. 27-32.

139. Martin G.C., Miller A.N., Castle L.A., Morris J.W., Dandekar A.M. (1990) Feasibility studies using b-glucuronidase as a gene fusion marker in apple, peach and radish. J. Am. Soc. Hort. Sci. V.l 15. P.686-691.

140. Maruyama E, Hosoi Y., Ishii K. (2003) Somatic embryo culture for propagation, artificial seed production, and conservation of sawara cypress (Chamaecyparis pisifera Sieb. etZucc.). J For Res. V. 8. P. 1-8.

141. Mathur J., Ahuja P.S., Lai N., Mathur A.K. (1989) Propagation of Valeriana wallichii using encapsulated apical and axial shoot buds. Plant Sei. V. 60. P. 111116.

142. Maxwell K., Johnson G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence a practical guide. J. of Experimental Botani. V. 51. №345. P. 659-668.

143. Mehrotra S., Rahman L., Kukreja A. (2010) An extensive case study of hairy-root cultures for enhanced secondary-metabolite production through metabolic-pathway engineering. Biotechnol. Appl. Biochem. V. 56. P. 161-172.

144. Mishra B., Ranjan R. (2008) Growth of hairy-root cultures in various bioreactors for the production of secondary metabolites. Biotechnol. Appl. Biochem. V. 49. P.l-10.

145. Mrosk C., Forner S., Hause G., Küster H., Kopka J., Hause B. (2009) Composite Medicago truncatula plants harbouring Agrobacterium rhizogenes-transformed roots reveal normal mycorrhization by Glomus intraradices. J Exp Bot. V.60(13). P.3797-807.

146. Mugnier J., Mosse B. (1987) Vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in transformed root-inducing T-DNA roots grown axenically. Phytopathology. V.77. P. 1045-1050.

147. Mugnier J. (1988) Establishment of new axenic hairy root lines by inoculation with Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Reports. V. 7. P. 9-12.

148. Mukunthakumar S., Matur J. (1992) Artificial seed production in the male bamboo (Dendrocalamus strictus L.). Plant Science. V. 87. P. 109-113.

149. Murashige T. (1978) Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In: Frontiers of Plant Tissue Culture. Ed. Thrope T. Calgary: International Association of Plant Tissue Culture. P. 15-26.

150. Ooms G., Twell D., Bossen M.E., Hoge J.H.C., Burrell M.M. (1986) Development regulation of Ri T-DNA gene expression in roots, shoots and tubers of transformed potato {Solatium tuberosum cv. Desiree). Plant Mol Biol. V. 6. I. 5. P. 321-330.

151. Padmaja G., Reddy L.R., Reddy G.M. (1995) Plant regeneration from synthetic seeds of groundnut, Arachis hypogaea L. Indian Journal of Experimental Biology. V. 33. P. 967-971.

152. Parr A.J., Hamill J.D. (1987) Relationship between Agrobacterium rhizogenes transformed hairy roots and intact, uninfected Nicotiana plants. Phytochemistiy. V.26. P.3241-3245.

153. Parsons T.J., Sinkar V.P., Stettler R.F. Nester E.W., Gordon M.P. (1986) Transformation of poplar by Agrobacterium tumefaciens. BioTechnology. V.4(6). P. 533-536.

154. Patel A.V., Pusch I., Mix-Wagner G., Vorlop K.D. (2000) A novel encapsulation technique for the production of artificial seeds. Plant Cell Reports. V.19. P. 868874.

155. Pattnaik S., Chand P.K. (2000) Morphogenic response of the alginate-encapsulated buds from in vitro shoot cultures of six mulberries. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V. 60. P. 177-185.

156. Pattnaik S.K., Sahoo Y., Chand P.K. (1995) Efficient plant retrieval from alginateencapsulated vegetative buds of mature mulberry trees. Scientia Horticulturae. V. 61. P. 227-239.

157. Paulet F., Endgelmann F., Glaszmann J.-C. (1993) Cryopreservation of apices of in vitro plantlets of sugarcane {Saccharum spp. hybrids) using encapsulation-dehydration. Ciyo-lett. V. 12. P. 525-529.

158. Petit A., David C., Dahl G.A. (1983) Further Extension of the Opine Concept: Plasmids in Cooperate for Opine Degradation. Mol. Genet. V. 190. P. 204—214.

159. Piccioni E., Standardi A. (1995) Encapsulation of micropropagated buds of six woody species. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V. 42. P. 221-226.

160. Phunchindawan M., Hirata K., Sakai A., Miyamoto K. (1997) Cryopreservation of encapsulated shoot primordia induced in horseradish (Armoracia rusticana) hairy root cultures. Plant Cell Reports. V.16. P.469-473.

161. Plessis P., Leddet C., Collas A., Dereuddre J. (1993) Cryopreservation of Vitis vinifera L. cv. 'Chardonnay' shoot tips by encapsulation-dehydration: Effect of pretreatment, cooling and postculture conditions. Cryo-lett. 14: 309-320.

162. Plovie E., De Buck S., Goeleven E., Tanghe M., Vercauteren I., Gheysen G.2003) Hairy roots to test for transgenic nematode resistance: think twice. Nematology. V. 5.1. 6. P. 831-841.

163. Pond S.E., Cameron S.I. (2003) Artificial seeds. In: Encyclopedia of Applied Plant Sciences. B. Thomas, D. Murphy and B. Murray (eds.). Elsevier Ltd. P. 1379-1388.

164. Pype J., Everaert K., Debergh P. C. (1997) Contamination by micro-arthropods. In: Cassells, A. C., ed. Pathogen and microbial contamination management in micropropagation. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. P. 259-266.

165. Rafferty S.M., Williams S., Falkiner F.R., Cassells A.C. (2000) Persistence of human food poisoning pathogens {Escherichia coli and Serratia marcescens) in micropropagated cabbage. Acta Hortic. P. 530.

166. Rao P.V.L., Singh B. (1991) Plantlet regeneration from encapsulated somatic embryos of hybrid Solatium molengena L. Plant Cell Rep. V.10. P.7-11.

167. Redenbaugh K., Fujii J.A., Slade D. (1988) Encapsulated plant embryos. In: Mizrahi, A. (Ed.) Advances in biotechnological processes. Liss, New York, USA. V. 9. P. 225-248.

168. Redenbaugh K. (1990) Application of artificial seeds to tropical crops. Hort Science. V. 25. P. 251-255.

169. Redenbaugh K., Fujii J., Slade D., Vîss P., Kossler M. (1991) Artificial seeds -encapsulated somatic embryos. In: Biotechnology I Agriculture and Forestry, V. 17 (ed. Y.P.S. Bajaj), Springer-Verlag Berlin, Heidelberg;. P. 395-415.

170. Redenbaugh K. (1992) Synseeds: Applications of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press, Boca Raton, USA.

171. Repunte V.P., Taya M., Tone S. (1996) Conservation of root regeneration potential of cell aggregates from horseradish hairy roots used as artificial seeds. Journal of Chemical Engineering of Japan. V. 29. P. 874-880.

172. Roder F.T., SchmuIIing T., Gatz C. (1994) Efficiency of the tetracycline-dependent gene expression system: complete suppression and efficient induction of the rolB phenotype in transgenic plants. Mol Gen Gene. V. 243. P. 32-38.

173. Rutala W.A., Cole E.C. (1984) Antiseptics and disinfectants safe and effective? Infect. Control. V. 5. P. 215-218.

174. Rutala W.A., Cole E.C. (1987) Ineffectiveness of hospital disinfectants against bacteria: a collaborative study. Infect Control. V. 8(12). P. 501-506.

175. Saderquist R., Lee J.M. (2005) Plant cell immobilisation application. In: Applications of Cell Immobilisation Biotechnology. Eds. V. Nedovic and R. WillaertSpringer, Netherlands. P.469-478.

176. Saito K. (1974) Possible site of flavonoid synthesis in the photosynthetic apparatus. Biochem. J. V.144, N 2, P. 431-432.

177. Sajina A., Minoo D., Gcetha S.P., Samsudeen K., Rema J., Nirmalbabu K., Ravindran P.N. (1997) Production of synthetic seeds in few spice crops. Biotechnology of Spices, Medicinal & Aromatic Plants. P. 65-69.

178. Sakai A., Matsumoto T., Hirai D., Niino T. (2000) Newly developed encapsulationdehydration protocol for plant cryopreservation. Cryo-lett. V.21. P.53

179. Sakamoto Y., Mashiko T., Suzuki A., Kawata H. (1992) Development of encapsulation technology for synthetic seeds. Acta Horticulturae. V. 319. P.71-76.

180. Sanchez M., Pena M. (1996) Changes in dehydrodiferulic acides and peroxidase activity against ferulic acid associated with xell walls during groeth of pinus pinaster hypocotyl. Plant physiology. Vol. 111,1. 3, P. 941-946.

181. Schreiber U., Neubauer C., Klughammer C. (1989) Devices and Methods for Room Temperature Fluorescence Analysis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. V. 323. P. 241-251.

182. Scowcroft W.R. (1984) Genetic variability in tissue culture: impact on germplasm conservation and utilization. Technical Report, IBPGR. Rome, Italy. 41 p.

183. Sevon N., Oksman-Caldentey K.-M. (2002) Agrobacterium rhizogenes-mcdiated transformation: root cultures as a source of alkaloids. Planta Med. V. 68. P. 859868.

184. Shen W.H., Petit A., Guern J., Tempe J. (1988) Hairy roots are more sensitive to auxin than normal roots. Proc Natl Acad Sci USA. V. 35. P. 3417-3421.

185. Shigeta J., Mori T., Sato K. (1993) Storage of encapsulated somatic embryos of carrot. Biotechnology Techniques. V. 7(3). P. 165-168.

186. Signs M.W., Flores H.E. (1990) The biosynthetic potential of plant roots. BioEssays. V.12. P.7-13.

187. Singh A.K., Varshney R., Sharma M., Agarwal M.S., Bansal K.C. (2006) Regeneration of plants from alginate-encapsulated shoot tips of Withania somnifera (L.) Dunal, a medicinally important plant species. Journal of Plant Physiology. V. 163. P. 220-223.

188. Soukupova J., Cvikrova M. (2000) Histochemical and Biochemical Approaches to the Study of Phenolic Compounds and Peroxidases in Needles of Norway Spruce (Picea abies). Research New Phytology. V. 146. P.403-414.

189. Spano. L., Wullems G.J., Schilperoort R.A., Costantmo P. (1981) Hairy root: in vitro growth properties in tissues induced by Agrobacterium rhizogenes on tobacco-Plant. Sci. Lett. V. 23. P. 299-305.

190. Srivastava S., Srivastava A.K. (2007) Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Crit Rev Biotechnol. V. 27. P.29-43.

191. Strasser B.J., Strasser R.J. (1995) Measuring fast fluorescence transients to address environmental questions: The JlP-test. In: Mathis P (ed) Photosynthesis: From Light to Biosphere. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. P. 977-980.

192. Street H.E. (1957) Exciesed root culture. Biol. Revs Cambridge Philos. Soc. V.32. P. 117-187.

193. Tan T.K., Loon W.S., Khor E., Loh C.S. (1998) Infection of Spathoglottis plicata (Orchidaceae) seeds by mycorrhizal fungus. Plant Cell Rep. V. 18. P. 14-19.

194. Teoh K.H., Weathers P.J., Cheetham R.D., Walcerz D.B. (1996) Cryopreservation of transformed (hairy) roots of Artemisia annua. Ciyobiology. V.33(l). P.106-17.

195. Tepfcr D., Casse-Delbart F. (1987) Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Microbiol. Sci. V. 4. P. 24-28

196. Tepfer D. (1990) Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes. Physiol. Plant. V. 79. P. 140-146.

197. Thorpe T. (2007) History of Plant Tissue Culture. Molecular Biotechnology. V.37. P. 169-180.

198. Tone S., Taya M., Kino-oka M. (1997) Alteration of metabolite formation and morphological properties of hairy roots by environmental stimuli. In: Hairy Roots: Culture and Application. Ed. Doran P.I. Australia: Harwood Academic. P. 65- 72.

199. Torrey J.G., Clarkson D.T., eds (1975) The development and function of roots. Academic Press, New York. 618 pp.

200. Towill L.E., Jarret R.L. (1992) Cryopreservation of sweet potato (.Ipomoea batatas (L.) Lam.) shoot tips by vitrification. Plant Cell Rep. V.l 1. P. 175-178.

201. Uozumi N., Asano Y., Kobayashi T. (1992) Production of artificial seed from horseradish hairy root. J. Ferment. Bioeng. V. 74. P. 21-26.

202. Uozumi N., Nakasbimada Y., Kato Y., Kobayasbi T. (1992) Production of artificial seed from horseradish hairy root. J. Ferment. Bioeng. V. 74. P. 21-26.

203. Uozumi N., Asano Y., Kobayashi T. (1994) Micropropagation of horseradish hairy root by means of adventitious shoot primordial. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. V. 36. P. 183-190.

204. Uozumi N., Ohtake A., Nakashmada Y., Morikawa Y., Tanaka N., Kobayashi

205. T. (1996) Efficient Regeneration from GUS-Transformed Ajuga Hairy Roots. J. Ferment Bioeng. V. 81. P. 374-378.

206. Uozumi N., Kobayashi O. (1997) Artificial Seed Production through Hairy Root Regeneration. In: Hairy Roots: Culture and Application. Ed. Doran P.I. Australia: Harwood Academic. P. 113- 121.

207. Vcena V., Taylor C.G. (2007) Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications. In Vitro Cell.Dev.Biol. Plant. V. 43. P. 383-403.

208. Verpoorte R., Contin A., Memclink J. (2002) Biotechnology for the production ofsplant secondary metabolites. Phytochem Rev. V. 1. P. 13-25.

209. Wang Q., Tanne E., Arav A., Gafny R. (2000) Cryopreservation of in v/7/-o-grown shoot tips of grapevine by encapsulation-dehydration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture V. 63. P. 41-46.

210. Wardell W.L., Skoog F. (1969) Flower formation in excised tobacco stem segments; I. Methodology and effect of plant hormones. Plant Physiol. V. 44. P. 1402-1406.

211. Williams E.G., Maheswaran G. (1986) Somatic embryogenesis: factors influencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group. Ann. Bot. V.57. P. 443-462.

212. Winkelmann T., Heintz D., Dorsselaer A., Serek M., Braun H.-P. (2006) Proteomic Analyses of Somatic and Zygotic Embryos of Cyclamen persicum Mill. Reveal New Insights into Seed and Germination Physiology. Planta. V. 224. P. 508-519.

213. Wintermans J.F., De Mots A. (1965) Spectrophotometric characteristics of chlorophyll a and b and their pheophytins in ethanol. Biochimica et Biophysica Acta. V. 109. P. 448-453.

214. Wysokinska H., Chmicl A. (1997). Transformed root cultures for biotechnology. Acta Biotechnologica. V. 17. P. 131-159.

215. Yamada T., Sakai A., Matsumura T., Higuchi S. (1991) Cryopreservation of apicalmeristems of white clover (Trifolium repens L.) by vitrification. Plant Sci. V.78.P. 81-87.

216. Yonemitsu H. (1995) Production by hairy root culture of Lobelia inflata L. Plant Cell Repts. V. 9, № 10. P.307-310.

217. Zenk M.H., El-Shagi H., Schulte U. (1975) Anthraquinone production by cell suspension cultures of Morinda citrofolia. Planta Med. P.79-101.

218. Zhang D., Shelby R., Savka M.A., Dessaux Y., Wilson M. (1998) Separation, detection, and quantification of imine-liked opines by high-performance liquid chromatography. J. Chromatography A. V. 813. P. 247-253.

Информация о работе

Прокофьева, Мария Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Использование "искусственных семян" в технологии культивирования in vitro корней лекарственных растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы