Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мяты болотной (Mentha pulegium L.) в культуре in vitro

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение мяты болотной (Mentha pulegium L.) в культуре in vitro"

УДК 602.6:582.929.4

JMßQdjUdC

На правах рукописи

МУБАРАК Маниа Мабрук Абдельхалк

ИЗУЧЕНИЕ МЯТЫ БОЛОТНОЙ (MENTHA PULEGIUM L.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 НОЯ 2015

Москва-2015

005564487

Работа выполнена на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева»

Научный руководитель: Чередниченко Михаил Юрьевич

кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства, ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева»

Официальные оппоненты: Егорова Наталья Алексеевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, доцент, заведующая лабораторией биотехнологии, Государственное бюджетное учреждение Республики Крым «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» Молканова Ольга Ивановна кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией биотехнологии растений ФГБУН Главный ботанический сад имени Н.В. Цицина РАН

Ведущая организация: ФГБНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»

Защита диссертации состоится « 16 » декабря 2015 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 19, тел/факс: +7(499) 976-17-14, e-mail: dissovet@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и на сайте http://www.timacad.ru/

Автореферат разослан «21 » октября 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета / Л.С. Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растения рода Mentha L. занимают большие площади как в России и Западной Европе, так и на Востоке: Египет, Пакистан, Индия. Мяту болотную Mentha pulegium L. использовали в фитотерапии на протяжении веков. Растение является антисептическим, спазмолитическим, ветрогонным, потогонным, успокаивающим и тонизирующим средством (Launert, 1981; Mills, 1985). Чай из листьев традиционно используется в лечении лихорадки, головной боли, незначительных респираторных инфекций и различных других заболеваний (Camejo-Rodrigues et al., 2003; Pôvoa et al., 2006; Mkaddem et al., 2007). Наружно настой используется для лечения зуда, кожных воспалений, таких как экзема, и ревматических заболеваний, таких как подагра (Chevallier, 1996). Мята болотная используется как ароматизатор алкогольных напитков, кондитерских изделий, как отдушка в дезодорантах, парфюмерии и косметике (Hayes et al., 2007; Barceloux, Hoboken, 2008).

Чрезмерно высокий сбор лекарственного сырья может привести к сокращению генетического разнообразия. Одним из возможных решений возникающего противоречия между растущей потребностью в растительном сырье и необходимостью сохранения биоразнообразия является биотехнология, т.е. культивирование растений в искусственных, строго контролируемых условиях (Mulabagal et al., 2004; Kahrizi et al., 2011). Изучение биотрансформации и биосинтеза вторичных метаболитов в каллусных (суспензионных) культурах имеет несомненные перспективы для их использования в производстве ценных продуктов вторичного синтеза (Носов, 1999). С целью индукции сомаклональных вариантов и получения нового исходного материала для селекции необходимо исследовать генетическую изменчивость клеток в каллусных культурах и механизмы регуляции морфогенеза (Бутенко, 1986). Соответственно, существует необходимость углубленного изучения морфологических, цитологических, цитогенетических и биохимических особенностей растений, получаемых в культуре in vitro.

К биологически активным веществам, входящим в состав растительного сырья и являющимся основой фармакотерапевтического действия его на организм человека, относятся ферменты, флавоноиды, различные микроэлементы и регуляторы роста, алкалоиды, кумарины и др. (Барабой, 1984; Lagouri, 1993). Большинство исследовательских работ с представителями рода Mentha L. было проведено на мяте перечной (Л/. х piperita L.) и мяте колосистой (М х spicata L.), в связи с этим представлялось необходимым изучить морфогенетический потенциал мяты болотной (А/. pulegium L.) в культуре in vitro и охарактеризовать при этом анатомические и биохимические особенности асептических растений.

Цель работы - изучение морфогенетических, анатомических и биохимических особенностей мяты болотной (Mentha pulegium L.) в культуре in vitro.

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработка технологии введения мяты болотной (М. pulegium L.) в культуру in vitro-,

2. индукция каллусогенеза и соматического органогенеза из различных типов эксплантов М. pulegium L.;

3. разработка системы генетической трансформации М. pulegium L. посредством Agrobacterium tumefaciens;

4. характеристика анатомического строения каллусных клеток и нижнего эпидермиса листьев растений М. pulegium L., полученных при различных условиях культивирования;

5. анализ цитотоксичности экстракта, полученного из микропобегов М. pulegium L. in vitro;

6. анализ общего содержания фенольных соединений в растениях М. pulegium L., полученных при различных условиях культивирования.

Научная новизна работы. Впервые проведено разностороннее изучение культуры in vitro мяты болотной (Mentha pulegium L.) и предложена полноценная технология культивирования in vitro мяты болотной, от введения семян в культуру in vitro до анализа фармацевтического действия экстракта из полученных растений. Проанализированы и обобщены результаты индукции каллусогенеза и соматического органогенеза в культуре in vitro и установлены анатомические особенности строения каллусной ткани мяты болотной. Определены особенности строения устьичного и железистого аппарата, а также трихом нижнего эпидермиса листа. Впервые проведена генетическая трансформация растений мяты болотной (Mentha pulegium L.) с использованием Agrobacterium tumefaciens. Впервые показано цитотоксическое действие на клетки опухолевой линии М HeLa экстракта, полученного из микрорастений мяты болотной (Mentha pulegium L.) in vitro. Впервые проанализировано содержание растворимых фенольных соединений в растениях мяты болотной, выращенных в различных условиях культивирования (in vitro и in vivo).

Теоретическая и практическая значимость работы. Предлагаемая технология культивирования in vitro растений мяты болотной (Mentha pulegium L.) может быть применена для получения исходного растительного материала как источника БАВ и АФИ. Разработка методики генетической трансформации мяты болотной открывает широкие перспективы для создания трансгенных растений с улучшенными качественными показателями. Полученные

результаты можно использовать в учебном процессе при проведении занятий по следующим учебным дисциплинам: «Физиология растений», «Сельскохозяйственная биотехнология», «Прикладная биотехнология», «Культура тканей и клеток растений», «Вторичный метаболизм высших растений» для студентов бакалавриата и магистратуры, обучающихся по направлениям «Биотехнология», «Агрономия» и «Садоводство».

Методология и методы диссертационного исследования. Диссертационная работа выполнена с использованием классических и современных методов культуры клеток и тканей, микроскопирования, биохимического анализа, а также генетической инженерии, на современном оборудовании.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Технология культивирования in vitro мяты болотной (Mentha palegium

L.);

2. Система генетической трансформации Mentha pulegium L. посредством Agrobacterium tumefaciens;

3. Особенности анатомического строения каллусных клеток и нижнего эпидермиса листьев растений Mentha pulegium L., полученных при различных условиях культивирования;

4. Цнтотоксические свойства экстракта из микропобегов Mentha pulegium L., полученных в культуре in vitro, по отношению к линии опухолевых клеток М Не La;

5. Общее содержание фенольных соединений в растениях Mentha pulegium L. как косвенная характеристика адаптивного потенциала в культуре in vitro.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих научных конференциях и симпозиумах: XIV Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2014 г.), 2nd International Symposium «Secondary Metabolites: Chemistry, Biology and Biotechnology» (Москва, 2014 г.), Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвященная созданию объединённого аграрного вуза в Москве (Москва, 2014 г.), Международная конференция «Научное и кадровое обеспечение продовольственной безопасности России» (Москва, 2014 г.), Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвященная 150-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2015 г.), Symposium on Euroasian Biodiversity (SEAB-2015) (Азербайджан, Баку, 2015 г.), Международная научно-практическая конференция «Пути повышения конкурентоспособности отечественных сортов семян, посадочного материала и

технологий на мировом рынке» (Ялта, 2015 г.).

Личный вклад автора. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены лично автором на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Автор принимал непосредственное участие в разработке программы исследований, планировании и проведении экспериментов по культивированию in vitro мяты болотной (Mentha pulegium L.), по ее генетической трансформации, изучению ее анатомических и биохимических особенностей, а также по подготовке публикаций. Гистологический анализ был проведен совместно с к.б.н., ведущим научным сотрудником лаборатории клеточной биологии Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии (Москва) E.H. Барановой. Исследования по определению цитотоксичности растительных экстрактов были проведены совместно с к.б.н., научным сотрудником лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН (Московская область, г. Черноголовка) A.A. Балакиной.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из которых 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, библиографического списка и приложения. Общий объем рукописи 131 страница, содержит 21_ таблицу, 28 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 250 источников, в том числе 215 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в период с 2013 по 2015 гг.

Объектом исследования были семена мяты болотной (Mentha pulegium L.) двух сортов: Соня (производства агрофирмы «СеДеК») и Пеннироял (производства ООО «Биотехника»).

Семена стерилизовали 0,1 %-ным раствором HgCl2 или, соответственно, 5 %-ным раствором NaOCl с различной экспозицией, после чего дважды отмывали в стерильной дистиллированной воде и помещали в чашки Петри на питательную среду Мурасиге и Скуга (MC) без добавления фитогормонов и регуляторов роста. Повторность опыта 5-кратная, по 10 семян на чашку Петри.

Для индукции каллусогенеза и соматического органогенеза in vitro использовали питательную среду Мурасиге и Скуга с полным (MC) и половинным содержанием минеральных солей и витаминов ('AMC) (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением регуляторов роста (табл. 1). Опыты проводили в 3-кратной повторности по 10 эксплантов различных типов (сегменты листьев и

стеблей, черешки) в каждой. Полученные регенеранты пересаживали в стерильные пробирки на питательную среду следующего состава: 'AMC в сочетании с 0,5 мг/л ИУК для обеспечения корневого органогенеза.

Таблица 1

Состав питательных сред с добавлением регуляторов роста_

Обозначение среды Концентрация регуляторов роста, мг/л Обозначение среды Концентрация регуляторов роста, мг/л

БАП кинетин НУК БАП кинетин НУК

MCI 0,5 - - МС9 1 - 0,5

МС2 1,0 - - МС10 1 - 1

МСЗ 1,5 - - МС11 0,5 - 0,5

МС4 2,0 - - MC 12 0,5 - 1

МС5 - 0,5 - МС13 . 1 0,5

МС6 - 1,0 - MC 14 - 1 1

МС7 - 1,5 - МС15 - 0,5 0,5

MC 8 - 2,0 - МС16 - 0,5 1

Для проведения генетической трансформации использовали различные типы эксплантов; штамм Agrobacterium tumefaciens, несущий векторную конструкцию pLH7000 с различными вариантами гена белка 4/1: ccll; NDR; Nt-4/l; At-4/l с генами bar и gfp (любезно предоставлены НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, МГУ имени М.В. Ломоносова). Для изучения влияния клафорана и фосфинотрицина на морфогенез стеблевые и листовые экспланты помещали на среду для регенерации в сочетании с различными концентрациями клафорана (0...1000 мг/л) или, соответственно, фосфинотрицина (2...6 мг/л). Приготовление агробактерии осуществляли по стандартной методике. Использовали 2 варианта опыта: без прекультивации и с прекультивацией в течение 3 суток. Обработка агробактерией проводилась в течение 20 мин. в колбе на шейкере (100 об./мин.). После кокультивации экспланты помещали на среду для регенерации. Каждые 2 суток снижали концентрацию антибиотика клафорана с 500 мг/л до 0 мг/л для избавления от агробактерии. Итоговая среда содержала дополнительно 0,5 мг/л ИУК для индукции корневого органогенеза. Регенеранты после генетической трансформации были пересажены на селективную питательную среду с содержанием 6 мг/л фосфинотрицина. Выжившие растения проверяли на наличие селективного гена с помощью ПЦР. Продукты реакции амплификации разделяли с помощью электрофореза.

Гистологическое исследование проводили на каллусной ткани,

образованной листовыми и стеблевыми сегментами. Участки каллусной ткани фиксировали по стандартной методике (Уикли, 1975). Полутонкие срезы толщиной 1...2 мкм приготавливали с использованием ультрамикротома LKB-V (LKB, Швеция), затем монтировали их на предметные стекла и заключали в смесь эпоксидных смол. Препараты фотографировали и анализировали с помощью микроскопа Olympus ВХ51 (Olympus, Япония) с камерой Color View II (Soft Imaging System, Германия).

Изучение морфолого-анатомических особенностей строения листовых пластинок растений проводили, используя микроскопы Primo Star Carl Zeiss и JIOMO МИКМЕД-1 при увеличении 70х, 150х и 280х, согласно общепринятым методикам (Сербии, 2006). Размер волосков, устьиц и желёзок определяли при помощи окуляр-микрометра 9х Ernst Leitz Wetzlar и объект-микрометра ОМ-П с длиной основной шкалы 1 мм. Фотофиксация результатов проведенного анализа проводилась с использованием цифровой фотокамеры Canon Power Shot А 95.

Выделение экстракта проводили по стандартной методике из микропобегов мяты болотной, полученных на питательной среде MC. Изучение цитотоксичности проводили на линии клеток эпителиоидной карциномы шейки матки человека М HeLa. Культивирование опухолевых клеток проводили согласно общепринятой методике (Фрешни, 2011). Для определения количества выживших клеток использовали метод МТТ-теста. Измерение поглощения проводили при длине волны 570 нм на планшетном фотометре «Эфос». Затем проводили расчет интенсивности МТТ-окрашивания в процентах относительно контроля (контроль — 100 %).

Растительный экстракт для определения общего содержания фенольных соединений (ОСФС) получали из микропобегов, полученных на стерильных питательных средах различного гормонального состава in vitro и in vivo. ОСФС определяли при длине волны 725 нм на спектрофотометре.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием критериев Стьюдента, Фишера и Дункана с помощью программы AGROS (версия 2.11) и статистических функций приложения Excel (Microsoft Office).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Возможность управлять морфогенетическими процессами in vitro в случае лекарственных растений, обладающих ценными биологическими и фармацевтическими веществами вторичного метаболизма, открывает перспективы для разностороннего использования как целых растений, так и их частей (органов, тканей, клеток).

1. Культивированне мяты болотной (Menthapulegium L.) in vitro Изучение влияния режима стерилизации семян на их прорастание.

Для получения выровненного и свободного от внешней инфекции растительного материала М. pulegium было необходимо провести изучение влияния режима стерилизации на эффективность прорастания и дальнейший рост побегов мяты болотной. Эффективность прорастания после стерилизации семян при различных режимах представлена в табл. 2.

Таблица 2

Выход асептических проростков Mentha pulegium L. в зависимости от режима __стерилизации_

Выход асептических проростков, %

Сорт 5 %-ный раствор гипохлорита натрия 0,1 %-ный раствор хлорида ртути (II)

10 минут 15 минут 5 минут 10 минут

Соня 62,0 ±8,0 78,0 ± 4,9 66,0 ± 6,8 50,0 ±5,6

Пеннироял 90,0 ± 0,0 96,0 ± 2,4 66,0 ± 6,8 78,0 ±3,7

Установлено, что выход асептических проростков при обработке 0,1 %-ным раствором хлорида ртути (II) семян сорта Пеннироял был существенно ниже, чем при использовании 5 %-ного раствора гипохлорита натрия. Аналогичная ситуация отмечена и для сорта Соня при максимальных экспозициях обоих стерилизующих агентов. Таким образом, для введения в культуру in vitro семян М. pulegium L. можно рекомендовать использование 5 %-ного раствора NaOCl при обработке в течение 15 минут.

Параллельно был заложен опыт по проращиванию семян in vivo. Визуальная оценка показала, что растения сорта Пеннироял развивались лучше, чем растения сорта Соня: имели преимущество в высоте побега и в размере листьев. Было установлено, что наибольшими темпами развивались проростки, полученные из простерилизованных семян, а наименьшими - проростки in vivo.

Изучение влияния состава питательной среды на эффективность каллусогенеза. Для индукции каллусогенеза использовали питательные среды на основе полной или половинной концентрации базовых компонентов питательной среды МС с добавлением веществ ауксиновой и цитокининовой природы. Каллусогенез на питательной среде, содержащей полную концентрацию основных компонентов МС, происходил в случае обоих сортов только на средах, содержавших БАП и НУК. Эффективность каллусогенеза при этом была высокой (83,6...100,0 %, табл. 3). На основе 'ЛМС частота образования каллуса также была наибольшей на средах с 0,5...1,0 мг/л БАП и

0,5...1,0 мг/л НУК, хотя каллусогенез отмечался и на некоторых других

вариантах питательных сред. При этом нужно отметить отсутствие

существенных различий между типами эксплантов по способности к каллусогенезу.

Таблица 3

Частота каллусогенеза в зависимости от сорта, минерального состава _питательной среды, регуляторов роста и типа экспланта_

Обозначение Содержание Эффективность каллусогенеза в

гормонального основных зависимости от типа экспланта, %

состава среды компонентов МС, % лист черешок стебель

Сорт Пеннироял

МС9 100 97,6ге 91,ЗИ 97,6ге

50 97,6ге 97,6гв 91,3]-8

МС10 100 94,91-8 98,95 97,6ге

50 94,91-Б 97,6гэ 97,6ге

МС11 100 98, 9Б 97,6ге 98,9э

50 97,6 ге 97,6ге 98,9б

МС12 100 98,9в 97,6« 100,05

50 97,6ге 91,31-5 100,05

Сорт Соня

МС9 100 94,9к-ч 83,6Ь-ч 98,9ч

50 97,6п-ч 83,3 (к) 91,3.1-ч

МС10 100 97,6п-я 98,9ч 97,6п-ч

50 97,6п-ч 83,61-4 98,9ч

МС11 100 98,9ч 97,6рч 98,9ч

50 98,9ч 98,9ч 98,9ч

МС12 100 100,0ч 98,9ч 98,9ч

50 98,9ч 98,9ч 98,9ч

Примечание: Варианты, отмеченные одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (а = 0.05).

Изучение влияния гормонального состава питательной среды на эффективность соматического органогенеза. При изучении стеблевого органогенеза существенные различия по вариантам опыта как между сортами и типами эксплантов, так и по составу среды отсутствовали. Хотя стеблевой органогенез проходил на всех вариантах питательных сред 'ЛМС, частота органогенеза побегов была низкой (до 16,6 %). Наибольшие значения частоты корневого органогенеза отмечались на средах /2МС13...16 (0,5...1 мг/л

кинетина + 0,5.„1 мг/л НУК), составляя от 65,3 до 100 %. В остальных вариантах опыта частота морфогенеза была низкой (1,2—19,3 %). Таким образом, процессы морфогенеза происходили преимущественно на средах ViMC.

В связи с тем, что частота стеблевого органогенеза у обоих сортов на всех типах эксплантов была довольно низкой (аналогичные данные были получены и другими исследователями, например, Li X et al. (1999) на мяте колосистой М. х spicata L.), методику индукции соматического органогенеза у данных сортов нельзя считать достаточно эффективной. Поэтому был проведен эксперимент по индукции стеблевого органогенеза на питательной среде 'ЛМС с добавлением регуляторов роста из сегментов узлов, которые по своей природе содержат меристематические ткани (Sato et al., 1993; Sunandakumari et al., 2004). Наибольшие показатели эффективности регенерации были получены на питательных средах, содержащих либо только БАП (МС1...4), либо только кинетин (МС5...8), а также сочетание кинетина и НУК (МС13...16). Наименьшая частота органогенеза побегов была отмечена на средах МС9...12, содержащих в среде БАП и НУК в концентрациях 0,5... 1,0 мг/л.

Генетическая трансформация Mentha pulegium L. Большинство экспериментов по генетической трансформации представителей рода Mentha L. были проведены на самых распространенных и популярных гибридных видах — мяте перечной (М х piperita L.) и мяте колосистой (М * spicata L.). В связи с этим нашей задачей была разработка методики агробактериальной трансформации растений М. pulegium L. При изучении влияния антибиотика клафорана на морфогенез мяты болотной регенерация проходила на всех концентрациях антибиотика (0...1000 мг/л), но с различной эффективностью. Прямая зависимость между концентрацией антибиотика и эффективностью регенерации отсутствовала. В процессе работы мы использовали концентрацию 500 мг/л. При изучении влияния фосфинотрицина на морфогенез мяты болотной было установлено, что при концентрации 6 мг/л регенерация отсутствовала практически во всех вариантах опыта. Именно это концентрация была выбрана для селективного отбора растений после генетической трансформации. По результатам экспериментов регенеранты после генетической трансформации были получены только из узловых эксплантов. Наибольшая эффективность регенерации была отмечена после трансформации конструкцией с геном Nt-4/l на обоих сортах: 100 % регенерации в варианте с прекультивацией, 100 % и 90 % соответственно в варианте без прекультивации. Также высокая эффективность регенерации была при использовании конструкции с геном ccll с прекультивацией (90 и 80 % соответственно). При использовании конструкции с геном NDR не было получено ни одного

регенеранта. Эффективность регенерации после трансформации конструкцией с геном At-4/l составила около 50 %. После проведения предварительного селективного отбора на питательных средах с б мг/л фосфинотрицина с выжившими растениями была проведена ПЦР. Продукты ПЦР разделяли путем электрофореза в \ %-ном агарозном геле. Положительные результаты были получены только у двух растений сорта Соня с геном Л4-4/1 в варианте с прекультивацией. Низкий выход трансформантов свидетельствует о необходимости продолжения разработки методики генетической трансформации растений мяты болотной.

2. Изучение анатомических особенностей мяты болотной (Mentha pulegium L.) в культуре in vitro Гистологический анализ каллусной ткани Mentha pulegium L. Гистологический анализ показал, что каллусная ткань, сформированная из стеблевых и листовых сегментов растений М. pulegium L., характеризовалась значительным разнообразием клеток по размеру и форме (рис. 1}.

Ряс. 1. Строение каллусной ткани, сформированной из эксплантов стебля (А) и листа (Б) Mentha pulegium L. сорта Соня. Масштабная линейка - 100 мкм.

Паренхимные клетки каллусной ткани, сформированной из тканей листа, имеют округлую, овальную или удлиненную форму. В отличие от паренхимных клеток каллусной ткани, сформированной из тканей листа, паренхимные клетки каллуса, образованного из стеблевых сегментов, характеризуются неправильной формой и большим размером. В меристематических очагах каллусной ткани можно наблюдать расположение клеток рядами. В ней присутствуют элементы проводящей системы - трахеидоподобные элементы. Анализ полученных микрофотографий позволяет видеть в меристематических и паренхимных клетках каллусной ткани, сформированной из обоих типов

эксплантов, большое количество включений, по-видимому, соединений вторичного метаболизма.

Анализ устъичного аппарата нижнего эпидермиса листьев растений Mentha pulegium L., полученных при различных условиях культивирования. Анализ устьичного аппарата производился по двум показателям: количество устьиц на единицу площади листа и площадь устьиц. Количество и площадь устьиц косвенно характеризуют продуктивный потенциал, обозначая адаптационные возможности растения (табл. 4 и 5, рис. 2).

Таблица 4

Количество устьиц на нижнем эпидермисе листьев растений М. ри1е^шт Ь., _ полученных при различных условиях культивирования__

Вариант опыта Количество устьиц, шт./мм2

Листья верхнего яруса Листья среднего яруса Листья нижнего яруса

Сорт Пеннироял

(С) 179,0 ±8,9 191.0 ±9,5 183,0 ±9,2

(Ч) 146,0 ± 7,3 167,0 ±8,1 147,0 ± 7,5

(Р) 103,0 ±5,1 134,0 ±6,7 125,0 ± 6,2

(II) 154,0 ±7,7 176,0 ±8,9 171,0 ±8,5

(Т) 228,0 ± 11,5 198,0 ± 9,9 216,0 ± 10,8

Сорт Соня

(С) 152,0 ±7,6 171,0 ±8,6 177,0 ± 8,9

(Ч) 225,0 ± 11,2 179,0 ±8,9 149,0 ± 7,4

(Р) 180,0 ±9,1 213,0 ± 10,7 232,0 ± 11,8

(П) 235,0 ± 14,7 168,0 ±8,4 187,0 ± 9,4

(Т) 235,0 ± 14,7 241,0 ± 12,0 235,0 ± 14,7

Примечание: (С) - растение, полученное из семян in vitro, (Ч) - растение, полученное в результате клонального микроразмножения in vitro, (Р) - растение-регенерант из каллуса in vitro, (II) - растение, полученное из семян in vivo, (Т) -растение-регенерант после генетической трансформации in vitro

По количеству устьиц на нижнем эпидермисе листьев по ярусам не удалось установить ни у одного сорта четкой зависимости, хотя существенные различия по ярусам присутствовали (табл. 4). У сорта Пеннироял можно отметить, что количество устьиц на листьях среднего яруса в большинстве вариантов превышает аналогичный показатель листьев верхнего и нижнего яруса. Также наблюдали низкое количество устьиц в варианте растений-регенерантов сорта Пеннироял, полученных из каллуса in vitro. По-видимому,

Таблица 5

Площадь устьиц на нижнем эпидермисе листьев растений М. ри1е2шт Ь., _ полученных при различных условиях культивирования_

Вариант опыта Площадь устьиц, мкм2

Листья верхнего яруса Листья среднего яруса Листья нижнего яруса

Сорт Пеннироял

(С) 259,0 ± 12,9 241,2 ± 12,0 207,2 ± 10,4

(Ч) 215,9 ± 10,8 193,0 ±9,6 161,6 ±8,0

(Р) 202,0 ± 10,1 165,8 ±8,2 176,6 ± 8,8

(П) 196,3 ± 9,8 211,9 ± 10,6 208,0 ± 10,4

(Т) 323,8 ± 16,2 291,2 ± 14,6 242,5 ± 12,1

Сорт Соня

(С) 235,5 ± 11,6 170,6 ± 8,5 196,3 ±9,8

(Ч) 182,4 ±9,1 161,6± 8,1 167,9 ±8.4

(Р) 176,6 ±8,8 190,3 ±9,5 172,7 ± 12,1

(П) 245,3 ± 12,3 183,6 ±9,2 215,9 ± 10,6

(Т) 302,2 ± 15,1 282,8 ± 14,5 294,4 ± 14,9

Примечание: (С) - растение, полученное из семян in vitro, (Ч) - растение, полученное в результате клонапьного микроразмножения in vitro, (Р) - растение-регенерант из каллуса in vitro, (П) - растение, полученное из семян in vivo, (Т) -растение-регенерант после генетической трансформации in vitro

Рис. 2. Устьичный аппарат диацитного типа на нижнем эпидермисе листа М. pulegium Ь.. увеличение 40х: а) сорт Пеннироял, б) сорт Соня

этот факт связан с нарушением развития растительной ткани при переходе от дифференцированного состояния к дедифференцированному и обратно. Противоположная ситуация наблюдалась в случае сорта Соня. Однако наиболее интересным результатом, проявившимся на обоих сортах на всех ярусах, оказался абсолютный максимум в варианте с растениями-регенерантами,

полученными после генетической трансформации. Представляется возможным, что к такому эффекту привело как нарушение развития тканей в ходе де- и редифференциации, так и дополнительные стрессорные факторы: кокультивация с агробактерией, культивирование на питательной среде, содержащей антибиотик клафоран, а затем культивирование на среде с селективным агентом фосфинотрицином.

По площади устьиц на нижнем эпидермисе листьев растений двух сортов М. pulegium, полученных при различных условиях культивирования, различимая тенденция по ярусам или вариантам культивирования in vitro или in vivo отсутствует (табл. 5). Однако бросается в глаза заметное увеличение площади устьиц в случае растений-регенерантов после генетической трансформации. На фоне также заметно большего количества устьиц на единицу площади листа можно предположить, что оба эти изменения являются следствием воздействия на растительные ткани многих стрессовых внешних факторов.

Анализ железистого аппарата нижнего эпидермиса листьев растений Mentha pulegium L., полученных при различных условиях культивирования. Секреторными приспособлениями у М. pulegium L. являются эфиромасличные железки (рис. 3). Их наличие, а также размер можно рассматривать«, как косвенную характеристику продуктивного потенциала растений, а также как таксономическую характеристику (Эверт, 2015). Были проведены измерения диаметра эфиромасличных железок на нижнем эпидермисе листьев различных ярусов растений мяты болотной, полученных при культивировании в различных условиях (табл. 6).

Рис. 3. Эфиромасличные железки на нижнем эпидермисе листа М. pulegium Ь., увеличение 40х: а) сорт Пеннироял; б) сорт Соня

Диаметр эфиромасличных железок у сорта Пеннироял колеблется от 47,5 до 53,3 мкм, а у сорта Соня - от 50,8 до 58.3 мкм. Листья верхнего яруса во всех вариантах эксперимента уступают по размеру железок листьям среднего и

нижнего яруса, что отражает объективные физиологические механизмы накопления эфирного масла в растениях мяты болотной. У обоих сортов наибольший диаметр эфиромасличных железок наблюдался в случае растений-регенерантов после генетической трансформации. Возможно, к этому эффекту привело использование при культивировании в питательной среде фитогормонов и регуляторов роста. У растений in vivo не наблюдалось преимущества по рассматриваемому показателю по сравнению с растениями in vitro, что может косвенно свидетельствовать об отсутствии нарушений развития продуктивного аппарата при культивировании растений мяты болотной на искусственных питательных средах. В целом, можно отметить, что растения сорта Соня обладают более крупными эфиромасличными железками, чем растения сорта Пеннироял, а также более четкой тенденцией к росту диаметра от верхнего яруса листьев к нижнему.

Таблица 6

Диаметр эфиромасличных железок на нижнем эпидермисе листьев М. рикщтт Ь., полученных при различных условиях культивирования

Вариант оиьгга Диаметр эфиромасличной железки, мкм

Листья верхнего яруса Листья среднего яруса Листья нижнего яруса

Пеннироял Соня Пеннироял Соня Пеннироял Соня

(С) 47,5 ± 1,0 50,8 ± 0,6 49,0 ± 1,5 54,2 ± 1,5 50,8 ± 1,6 55,0 ± 2.0

(Ч) 48,3 ± 1,2 51,5 ±0,6 49,0 ± 1.2 52,5 ± 1,0 50,8 ± 0,6 54,0 ± 1,5

(Р) 48,3 ± 1,5 51,5 ±0,6 49,0 ± 1,2 53,3 ± 1,5 50,0 ± 1,0 55,0 ± 1,7

(П) 50,0 ± 1,7 50,8 ± 0,6 51,5 ± 1,5 54,0 ± 0,6 51,5 ± 1,2 54,0 ± 0.6

(Т) 52,5 ± 1,7 52,5 ± 1,0 53,3 ± 1,5 55,8 ± 1,2 52.5 ± 1,0 58,3 ± 0,6

Примечание'. (С) - растение, полученное из семян in vitro, (Ч) - растение, полученное в результате клоналыюго микроразмножеиия in vitro, (Р) - растение-регенерант из каллуса in vitro, (П) - растение, полученное из семян in vivo, (Т) -растение-регенерант после генетической трансформации in vitro

Анализ крупных волосков (трихом) нижнего эпидермиса листьев растений Mentha pulegium L., полученных при различных условиях культивирования. Крупные волоски (трихомы) могут выполнять в растении различные функции: снижение транспирации путем усиления отражения солнечной радиации, что понижает температуру листьев, механическая защита от насекомых, также секреторные (железистые) трихомы могут обеспечивать

химическую защиту (Эверт, 2015). Помимо этого структура трихом может рассматриваться как таксономическая характеристика. Нами была измерена длина трихом на нижнем эпидермисе листьев растений двух сортов М. ри1е%\ит, полученных при различных условиях культивирования (табл. 7). Длина трихом у сорта Пеннироял колеблется от 25,8 до 32,5 мкм, а у сорта Соня - от 21,8 до 30,0 мкм. За редкими исключениями не наблюдается существенных различий между длиной трихом на разных ярусах листьев. У обоих сортов растения-регенеранты после трансформации обладали наибольшей длиной трихом на листьях верхнего яруса, однако на среднем и нижнем ярусе такого преобладания не наблюдалось.

Таблица 7

Длина крупных волосков (трихом) нижнего эпидермиса листьев растеннй М. ри!едшт [>., полученных при различных условиях культивирования_

Вариант опьгга Длина трихом, мкм

Листья верхнего яруса Листья среднего яруса Листья нижнего яруса

Пеннироял Соня Пеннироял Соня Пеннироял Соня

(С) 25,8 ±0,5 21,8 ±0,6 26,5 ± 0,5 25,0 ± 1.0 28,3 ± 0,5 27,5 ± 1,0

(Ч) 26,5 ± 0,5 23,3 ± 0,6 28,3 ± 0,5 25,8 ± 1,2 26,5 ± 0,5 26,8 ± 1,2

(Р) 28,3 ± 0,5 22,5 ± 1,0 28,3 ± 0,5 24,3 ± 1,5 27,5 ± 0,8 27,5 ± 1,0

(П) 27.5 ± 1,4 22.5 ± 1,0 28,3 ± 1,2 27,5 ± 1,0 29,0 ± 0.5 29.3 ± 1.2

(Т) 32,5 ±0.8 28,3 ±2,1 30.0 ±2,2 25,8 ± 0,6 30,0 ±0,8 30,0 ± 1,0

Примечание: (С) - растение, полученное из семян in vitro, (Ч) - растение, полученное в результате клонального микроразмножения in vitro, (Р) - растение-регенерант из каллуса in vitro, (П) - растение, полученное из семян in vivo, (Т) -растение-регенерант после генетической трансформации in vitro

Отсутствие существенных различий по длине трихом между растениями, выращенными в почве (in vivo) и на искусственных питательных средах (in vitro) может косвенно свидетельствовать об отсутствии нарушений развития эпидермальных выростов при культивировании in vitro растений мяты болотной. В целом, можно отметить, что растения сорта Соня обладают более короткими трихомами, чем растения сорта Пеннироял, а также более четкой тенденцией к росту длины трихом от верхнего яруса листьев к нижнему.

3. Изучение биохимических особенностей мяты болотной (Mentha pulegium L.) в культуре in vitro Анализ цитотоксичности экстракта Mentha pulegium L. на линии клеток М HeLa. В эксперименте необходимо было выявить концентрацию, вызывающую 50 %-ную гибель клеток эпителиоидной карциномы шейки матки (клон М HeLa), то есть 1С50 для каждого сорта М. pulegium L. Результаты для различных концентраций экстрактов представлены на рис. 4. Концентрация 50 мкг/мл не приводит к достоверному снижению жизнеспособности опухолевых клеток. Повышение концентрации до 500 мкг/мл обнаруживает различия в реакции клеток на экстракты из двух сортов: достоверно большая цитотоксичность сорта Пеннироял не приводит, однако, к принятому в фармакологической практике стандартному уровню 50 %-ной гибели клеток, при котором исследуемый образец может считаться перспективным для практического использования. При концентрации 2500 мкг/мл оба экстракта приводят почти к 100 %-ной гибели опухолевых клеток. Различия в уровне цитотоксичности между сортами М. pulegium L. могут быть связаны с различным биохимическим составом, т.е. с различным соотношением между основными компонентами вторичного метаболизма.

140 120

100

OJ

I 80

5

3

со

6 60

О

£

S 40

20 О

Рис. 4. Доля жизнеспособных клеток линии М HeLa в зависимости от концентрации экстракта из микропобегов мяты болотной (Mentha pulegium L.)

Анализ общего содержания фенольных соединений в растениях Mentha pulegium L, полученных в различных условиях. Фенольные соединения являются структурными элементами клеток, в определенных ситуациях жизни клеток могут являться энергетическим материалом, а также защищают клетки от разнообразных стрессовых воздействий, при этом

3 Сорт Соня ■ Сорт Пеннироял

500 мкг 2500 мкг

способность к синтезу фенольных соединений видо- и сортоспецифична (Загоскина и др., 1994). Результаты изучения общего содержания фенольных соединений (ОСФС) в растениях М. pulгgium Ь., полученных в различных условиях, представлены в табл. 8.

Таблица 8

Общее содержание фенольных соединений в растениях Mentha pulegium L., _полученных в различных условиях выращивання_

Минеральный состав питательной среды Гормональный состав питательной среды Вариант опыта* Общее содержание фенольных соединений (мг/г сырой массы)

Пеннироял Соня

МС 2 мг/л БА11 (Ч) 20,9 ± 1.4 22,4 ± 1,8

(Р) 32,8 ± 2,6 30,1 ±2,3

МС 1 мг/л БАП (Ч) 21,3 ±0,6 24,0 ± 2,8

(Р) 30.8 ±3,5 20,9 ± 1,4

МС 1 мг/л Кин (Ч) 30,3 ±3,6 24,1 ± 1,5

(Р) 18,6 ±0,9 34,2 ± 1,3

МС 0.5 мг/л ИУК (Ч) 20,4 ± 0,7 16,0 ± 0,2

(Р) 24,6 ± 1,6 33,0 ± 1,5

'ЛЫС 2 мг/л БАП (Ч) 31,1 ± 1,5 34,1 ±1,2

(Р) 17,8 ±0,1 26,2 ± 1,3

1А МС 1 мг/л БАП (Ч) 18,7 ±0,9 19,8 ± 0.8

(Р) 20,1 ± 1,3 29,3 ± 1,8

1А МС 1 мг/л Кин (Ч) 18,8 ± 1,7 19,5 ± 0,8

(Р) 19,0 ± 1,7 26,7 ±0,1

'А МС 0.5 мг/л ИУК (Ч) 22,2 ± 1,5 22,2 ± 0,5

(Р) 20.0 ± 1,5 24,7 ± 1,2

МС (С) 24.3 ± 1,8 27,8 ± 1,3

(П) 41,5 ±2,3 21,1 ± 1,9

МС 0,5 мг/л Кин + 1 мг/л НУК (Т) 25,9 ± 1,5 21,1 ± 1,7

Примечание: (Ч) - растение, полученное в результате клоналыюго микроразмножения in vitro, (Р) - растение-регенерант из каллуса in vitro, (С) -растение, полученное из семян in vitro, (П) - растение, полученное из семян in vivo, (Т) - растение-регенерант после генетической трансформации in vitro

Основной объем значений ОСФС располагается в пределах 20...30 мг/г сырой массы. Однако 37,5 % значений, полученных in vitro на среде с полным содержанием основных компонентов питательной среды Мурасиге и Скуга,

превышали 30 мг/г сырой массы, а 12,5 % были ниже 20 мг/г сырой массы. На питательной среде с половинным содержанием основных компонентов среды ситуация была противоположной: в 37,5 % вариантов показатели были ниже 20 мг/г сырой массы и только в 12,5 % - выше 30 мг/л. Таким образом, выращивание растений на «полной» среде МС положительно сказывалось на накоплении фенольных соединений. Предстоит дальнейшее изучение как накопления ФС в клетках растений М. pulegium L. in vitro, так и зависимости между этим показателем и морфометрическими показателями растений.

Сравнение по вариантам минерального и гормонального состава питательной среды, а также по способу получения побегов не выявили существенных различий in vitro. Можно отметить, что растения мяты болотной сорта Соня, полученные из семян in vitro, превосходят растения сорта Пеннироял по ОСФС, но в опыте in vivo и в случае растений-регенерантов после генетической трансформации ситуация противоположна.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что оптимальным режимом стерилизации семян мяты болотной является обработка 5 %-ным раствором гипохлорита натрия в течение 15 минут, что позволяет получать в 80-90 % случаев асептические проростки.

2. Доказано, что для индукции каллусогенеза и соматического органогенеза необходимо использовать питательную среду, содержащую Í4 концентрации минеральных солей по прописи Мураснге и Скуга, а также 0,5... 1,0 мг/л БАП и 0,5... 1,0 мг/л ПУК. Эффективность стеблевого органогенеза в случае культивирования узловых эксплантов на питательной среде в присутствии только веществ с цитокининовой активностью составляет от 61,8 до 100%.

3. Методом агробактериальной трансформации получены два трансгенных растения Mentha pulegium L. сорта Соня, несущих генетическую вставку (Nt-4/l+har+gfp), трансгенная природа которых подтверждена ПЦР.

4. Установлены сортовые особенности и выявлены различия между растениями-регенерантами и растениями-трансформантами по таким морфологическим показателям, как размер и количество устьиц, размер эфиромасличных железок и трихом. По всем изученным показателям, кроме длины трихом, максимальные значения отмечены у растений сорта Соня, растения этого сорта обладают более короткими трихомами, чем растения сорта Пеннироял.

5. Показано, что экстрактивные вещества из растений Mentha pulegium L. оказывают цитотоксическое действие на клетки линии эпителиоидной карциномы шейки матки человека М HeLa. При этом концентрация

2500 мкг/мл вызывает 100 %-ную гибель клеток.

6. Доказано, что общее содержание фенольных соединений в растениях

Mentha pnlegium L. колеблется от 20 до 30 мг/г сырой массы. Растения сорта

Пеннироял в условиях in vivo накапливают достоверно больше фенольных

соединений, чем в условиях in vitro и во всех исследованных образцах сорта

Соня.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мубарак, М.М. Использование методов биотехнологии для размножения мяты болотной (Mentha pulegium L.) / М.М. Мубарак, М.Ю. Чередниченко // Тезисы XIV Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 16 апреля 2014 г. -С. 51-52.

2. Moubarak, М.М. Using in vitro-methods for propagation and producing secondary metabolites from european pennyroyal plants (Mentha pulegium L.) / M.M. Moubarak, M.U. Cherednichenko // International Journal of Secondary Metabolite: Vol. 1, Issue 1 (Special Issue - Abstracts), June 2014. - P.50.

3. Мубарак, М.М. Индукция морфогенеза in vitro из различных эксплантов мяты болотной (Mentha pulegium L.) / М.М. Мубарак, М.Ю. Чередниченко // Тезисы 15-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 8 апреля 2015 г. -С. 32-33.

4. Moubarak, М.М. Using in vitro technique for induction of somatic organogenesis from different explants of pennyroyal (Mentha pulegium L.) / M.M. Moubarak, M.Yu. Cherednichenko // Abstract book. Symposium on Euroasian Biodiversity (SEAB-2015). 01-05 June 2015, Baku, Azerbaijan. - P. 38.

5. Мубарак, M.M. Индукция каллусогенеза и соматического органогенеза у различных типов эксплантов мяты болотной (Mentha pulegium L.) / М.М. Мубарак, P.O. Новаковский, Е.Н. Баранова, М.Ю. Чередниченко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. — 2015. - Вып. 3. - С. 5-15.

6. Мубарак, М.М. Использование технологии in vitro для сохранения и размножения мяты болотной (Mentha pulegium L.) как продуцента лекарственных веществ /' М.Ю. Чередниченко, М.М. Мубарак // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2015. - № 4. - С. 278-282.

7. Мубарак, М.М. Международный опыт использования мяты болотной (Mentha pulegium L.) в кормлении птицы / М.Ю. Чередниченко, О.Б. Поливанова, М.М. Мубарак II Кормопроизводство. - 2015. - № 8. - С. 37-43.

8. Мубарак М.М. Оценка цитотоксического действия экстрактов из лекарственных растений на клеточную линию М HeLa / A.A. Балакина, Е.А. Кузьмина, А.Н. Древова, М.М. Мубарак, Н.П. Карсункина, Е.А. Калашникова, М.Ю. Чередниченко // АгроЭкоИнфо. - 2015. - № 5. -http ://agroecoinfo.narod.Ri/iournal/STATYT/2015/5/st_22. doc.

9. Мубарак М.М. Использование методов биотехнологии для размножения и производства вторичных метаболитов мяты болотной (Mentha pulegium L.) / М.М. Мубарак // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная созданию объединенного аграрного вуза в Москве: Сборник материалов Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной созданию объединенного аграрного вуза в Москве, г. Москва, 3-4 июня 2014 г., ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. - М.: Издательство РГАУ-МСХА, 2015. -С. 38-40.

10. Мубарак М.М. Разработка системы генетической трансформации мяты болотной (Mentha pulegium L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens / М.М. Мубарак // Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвященная 150-летию РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева, г. Москва, 2-3 июня 2015 г.: Сборник статей. - М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2015. - С. 58-60.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность моему научному руководителю, к.б.н., доценту М.Ю. Чередниченко за всестороннюю помощь мне на протяжении обучения в аспирантуре.

Хочу выразить благодарность к.б.н., в.н.с. лаборатории клеточной биологии ВНИИСБ E.H. Барановой и к.б.н., н.с. лаборатории молекулярной биологии ИПХФ РАН A.A. Балакиной за помощь в проведении экспериментов.

Также хочу поблагодарить преподавательский состав кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства: заведующего кафедрой, д.б.н., проф. A.A. Соловьева, д.б.н., проф. Е.А. Калашникову, а также доцентов кафедры к.б.н., А.Н. Князева, к.б.н. JI.C. Большакову, к.б.н. М.Р. Халилуева за под держку на протяжении моей работы над диссертационным исследованием.

Еще я благодарен студентам и аспирантам кафедры разных лет, с которыми мне довелось работать, которые поддерживали меня и помогали мне: О.Б. Поливанова, А. Энхтайван, Р.Н. Киракосян, A.A. Овод, К.А. Куприна, Ле Тхи Хоа, P.O. Новаковский, Е.А. Кузьмина, А.Н. Древова и др.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 15.10.2015 г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 566.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул.,44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-40-64