Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитоскелета в термоадаптации миксомицета Physarum Polycephalum

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль цитоскелета в термоадаптации миксомицета Physarum Polycephalum"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ Ш. В.Ф. КУПРЕВМЧА

На правах ругаэписи

Щкшшвекий Алексей Ильич

РОЛЬ 1ШООКЕШЛ в ХЕРШАДАПТАШШ Ш№ШШ1(ЕТА ИИЗАИШ РШЛСШ1АШ1

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1992

Работа выполнена в отделе биофизики и радиобиологии Института клеточной биологии и генетической инженерии Академии наук Украины

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик АН Украины, профессор, ГРОДЗИНСКИЙ Д.М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член корреспондент АН Беларуси, профессор, КОНЕВ C.B.

доктор биологических наук, профессор, МУСИЕНКО Н.Н.

Ведущая организация:

Институт физиологии растений и генетики АН Украины

Защита состоится " " НХ>л6рХ 1992 г. в ^ "~часов на заседании специаливированного совета К 006.04.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича АН Беларуси (220072, г.Минск.ул.Ф.СКорины 27)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я.Колоса АН Беларуси.

Автореферат разослан " /? "

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного совета . гл

кандидат биологических наук ■й. В.Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Температурное воздействие вызывает в организме ряд нарушений как на оргаливменном, так и на молекулярном уровне (Neutran et al.1989). До настоящего времени окончательно не исследована зависимость между физиологическими проявлениям)! и биохимическими механизмами, регламентирующими ответ организма на тепловое воздействие.

Промежуточным звеном в реализации температурных эффектов мевду молекулярным и организменшлм уровнями могут служить изменения в системе клеточного скелета, ключевую роль в которой играют микротрубочки и микрофиламеиты. Система клеточного скелета занимает ключевое положение в регуляции многих внутриклеточных процессов: поддержании формы клеток, кеппинге рецепторов, в транспорте и позиционировании орга-нелл , в реализации клеточной подвижности, а.также в формировании веретена деления (Фултон,198?). Определённую роль система клеточного скелета играет в организмах, биологической особенностью которых является способность перемещаться в поисках питательной среды. К данной группе организмов относится миксомицет Physarum polycephalum.

Известно, что повышение температуры сказывается на выживаемости миксомицета Physarum polycephalum в зависимости от температуры и продолжительности термического воздествия. При температурной обработке нарушается цитоз - ритмичное движение цитоплазмы, происходят существенные изменения в структуре ядрышек и митохондрий (Lomagin,197a), подавляется синтез- общего белка и синтезируются белки теплового иока (Wright et al.1982).

Изучение возникновения и развития молекулярных нарушений и выяснение механизмов изменений, происходящих в системе клеточного скелета при гипертермии, является актуальной и важной задачей современной биохимии.

Центральную роль в функционировании системы микротрубочек и микрофиламентов играют белки: актин - основной белок микрофиламентов и тубулин - основной белок микротрубочек, которые являются ключевыми в формировании данных структур.

Многие факторы физической природы, в том числе и температура, значительно влияют на процессы, происходящие в клет-

ке. Затрагивают они и формирование цитоскелетных структур, в частности, при действии повышенных температур последние вероятно претерпевают ряд значительных изменений. В литературе имеются единичные работы о влиянии температуры на цитоске-летные структуры и их функционирование in vitro и практически отсутствуют данные о молекулярно-клеточных механизмах функционирования данных структур при гипертермии«. Изучение изменений, происходящих с элементами клеточного скелета как на организмениом, так и на молекулярном уровне при гипертермии, может сыграть важную роль в выяснении причин и механизмов, приводящих к функциональным изменениям в клетках и их гибели.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение, влияния повышенных температур на системы микротрубочек и микрофиламентов меточного скелета на примере миксо-мицета Physarum polyceplialum. Для достижения поставленной цели в задачи работы входило:

1. Изучить зависимость. подвижности миксомицета Physarum ро-lycephalum от состояния системы микротрубочек и микрофиламентов при температурной обработке 29° С, 33° С, 37° С и 41° С при продолжительности термического воздействия одна, две, пять и десять минут.

2. Определить, как сказывается тепловая обработка на количественных изменениях основного белка микротрубочек - ту-булина и основного белка микрофиламентов - актина.

3. Определить- характер зависимости между нарушениями в подвижности миксомицета и вызванными температурой количественными изменениями в содержании актина и тубулина в мик-сомицете.

4. Изучить зависимость процесса полимеризации и особенности-молекулярной структуры микротрубочек in vitro от температурного воздействия.

5. Изучить индукцию синтеза белков теплового шока после кратковременной температурной обработки плазмодия миксомицета.

Научная новизна работы. Установлена зависимость подвижности миксомицета от состояния элементов клеточного скелета - микрофиламентов и микротрубочек. Показаны закономерные изменения зависимости подвижности миксомицета Physarum poly-

cephalum от температурной обработки. Определены количестьен-ные изменения в содержании актина (основного белка микрофи-ламентов) и тубулина (основного белка микротрубочек) в клетках мшюомицета после кратковременного воздействия (1-10 мин) температур 29°, 33°, 37° и 41° С. Исследовано влияние температуры на процесс полимеризации микротрубочек in vitro и их организацию.Определена возможность избирательной индукции синтеза белков теплового шока кратковременным температурным воздействием.Впервые доказано значение систем клеточного скелета (микротрубочек и микрофиламентов) при адаптивном ответе организма на действие повышенных температур.

Теоретическая значимость работы. Полученные результаты способствуют более глубокому понимании функционирования систем микротрубочек и микрофиламентов миксомицета Physarum polycephalum в условиях температурного стресса. Анализ экспериментальных данных дополняет существующие представления о механизмах клеточных реакций на температурное воздействие, выделяя особый вклад элементов клеточного скелета в формирование адаптивных реакций организма.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Пятом Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, 1987), Шестой конференции молодых ученых Ужгородского госуниверситета (Ужгород, 1989), Шестом Украинском биохимическом съезде (Черновцы, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 248 наименований, иа которых 230 иностранных. Работы изложена на 167 страницах машинописного текста.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работу проводили на миксомицете Physarum polycephalum. Он относится к слизевикам, которые характеризуются признаками как грибов, так и животных организмов. Соматической стадией миксомицетов является свободноживущий многоядерный подвижный плазмодий (Evans et. al.1972).

Для инициирования культуры переживающую форму P.polyce-phalum (склероции) переносили в чашки Петри на агаризованную непитательную среду - 1,5%. агар на дистиллированной воде (голодный агар) и инкубировали при 25° С. После прорастания макроплазмодий переносили на овсяные хлопья,которые наносили на покрытую фильтровальной бумагой перевернутую чашку Пет ри. В дальнейшем чайку Петри помещали в кювету с кипяченой водопроводной водой таким образом, чтобы уровень жидкости был ниже уровня поверхности чашки Петри. Фронтальную часть плазмодия, сползшего йа воду, отбирали для- экспериментов. Пассажи осуществляли каждые два дня (Daniel et. ab 1964).

Подвижность плазмодия, определяли с помощью специальной установки, представляющей собой плексиглазовый столик со стационарными либо съёмными дорожками, образованными плек-сиглззовыми планками с наклеенной сверху миллиметровой бумагой, что позволяло определять скорость движения плазмодия как при постоянной температуре ,так и после температурной обработки. В данные дорожки наслаивали 1.5 % агар и наносили по 50 мг фронтальной части культуры плазмодия. Через три часа после адаптации мнксомицета к агару, что выражалось в начале движения последнего по агару, его использовали для дальнейших экспериментов.

Для изучения зависимости движения плазмодия от элемен-. тов клеточного скелета (микротрубочек и микрофиламентов) - в агар вносили, соответственно, специфические ингибиторы данных структур - колхицин (в концентрациях Ю~ 2 М, Ю-3 м.и Ю-4 М) и фаллоидин (10"э М, Ю-4 М, 1Q"5 М).

Для изучения температурной зависимости подвижности P.polycephalum его подвергали температурной обработке при 29° С, 33° С, 37° С и 41° С с временами экспозиции одна, две, пять и десять минут.В дальнейшем проводили наблюдение в течение шести часов при температуре 25° Соотносительную подвижность определяли по методу Мусиенко и др.(1984)

Для изучения синтеза белков теплового шока в плазмоди-альной форме P. polycephalum нами была использована стандартная методика ( Wright et al.1982) с модификациями. В среду инкубации вносили , смесь 14С-аминокислот до конечной активности 0.02 МБк/мл. Спустя час плазмодий подвергали об-

- Б -

работке соответствующими температурами. После температурной обработки отбирали (в течение четырех часов) часть плазмодия миксомицета для выделения суммарного белка.

Концентрацию белка в пробах определяли по методу ßreenberg et al.(1982).

Электрофоретическяй анализ белков проводили по Laemli (1970) с некоторыми модификациями.

Иммуноблоттинг проводили по методу Bjerniffl et al.(1986) с полусухим горизонтальным переносом белков на нитроцеллу-дозную мембрану при температуре 20° С и силе тока 0.8 мА/см2 в буфере, содержащем 48 мМ триса, 39 мМ глицина, 1.3 мМ ДСН и 20 X метанола (Kyhse-Andersen et al.1984). Иммуно-детекцию осуществляли по методу Towbin (1979) с использованием мышиных моноклоналышх антител против актина и мышиных моноклсшалъных антител против тубулина, Реакцию визуализации осуществляли с помбщью антител против иммуноглобулинов мыши. Ферментом детекции служила пероксидаза из хрена. В качестве субстрата использовали 4-хлоро-1-нафтол по методу, описанному Nakane (1968). Детекцию белковых зон с иммуноферментным окрашиванием осуществляли на денситометре "lîamag" (Швейцария) .

Микротрубочки выделяли из мозга крупного рогатаго скота двумя циклами полимеризация - деполимеризация (Shelansky et al.1973) В качестве буфера, стабилизирующего микротрубочки, использовали буфер Bershadsky et al.(1978). Сборку микротрубочек индуцировали добавлением ГТФ до конечной концентрации 1 мМ. Полимеризацию проводили при температурах 37° (контроль), 41° и 45° С, регистрируя её по изменению оптической плотности раствора (длина волны ЗБО нм) на спектрофотометре "Beckman DU-8" (Австрия).

Образцы для микроскопии готовили следующим образом. На подложки, покрытые формваром, наносили 20 мкл суспензии микротрубочек, которые отбирали из среды полимеризации спустя двадцать минут после индукции Процесса сборки, через 5-10 секунд избыток раствора отбирали фильтровальной бумагой. Препараты оттеняли 1 % уранил-ацетатом в течение 5-10 секунд. В дальнейшем препараты изучали и фотографировали на электронном микроскопе "JEM - 1200" (Япония).

■ Экспериментальные данные обрабатывались общепринятыми

методами вариационной статистики (Шмидт,1984). Расчеты проводились на ПЭВМ "Acer - 915V" ( Малайзия) с использованием прикладных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Участие микротрубочек и микрофиламентов в реализации подвижности у миксомицета Physaruni polycephalum.

Целью нашего исследования было выяснение роли цитоске-летных структур в термоадаптации у Physarum polycephalum. Однако, кроме исследований на молекулярном уровне нами был предложен также тест, позволяющий оценить состояние данных структур In vivo. Реализация данного теста требовала доказательств зависимости . подвижности миксомицета от систем как микротрубочек, так и микрофиламентов.

Для доказательства данного предположения нами были использованы специфические ингибиторы как системы Микротрубочек, так и системы микрофиламентов. В качестве ингибитора системы микротрубочек мы использовали алкалоид - колхицин в концентрациях 1 к 10~2 М, 1 х 10~э М и 1 х 10~4 М. Специфическим ингибитором системы микрофиламентов служил фаллоидин в концентрациях 1 х 10~3 М, 1 х 10~4 М, 1 х Ю-5 М. Данные ингибиторы вносились в голодный агар, который наслаивался на дорожки,по которым двигался миксомицет.

Ш рисунка 1,а видно, что при всех концентрациях колхицина относительная подвижность миксомицета к пятому часу наблюдения полностью ингибировалась. Такое ингибирующее действие обусловлено высоким сродством молекулы тубулина, основного белка микротрубочек, к колхицину, константа связывания которого равна 1 х 106 (Г1 (Sherline,1975). При этом колхицин связывается как с "плюс", так и с "минус" концом микротрубочки и полностью ингибирует процесс полимеризации (Bergen,1986),что в свою очередь приводит к полной остановке миксомицета.

Доказательство участия системы микрофиламентов в подвижности миксомицета были получены с помощью фаллоидина -соединения, стабилизирующего систему микрофиламентов. На рисунке 1,6 показана зависимость относительной подвижности миксомицета от концентрации фаллоидина. Нам не удалось заре-

Рис. Относительная подвижность мимсошцета Р. ро1усерЬа1ш от концентраций колхицина (А) /о - 10"2 М, О - 10~3 М, Л - 10~4 и/ и фаллоэдина (Б) /® - Ю-3 М, О - 10"4 Ы, А - Ю"5 Ш.

гистрировать полной остановки Р. ро1усерЬа1иш на протяжении шести часов наблюдения, однако, установлено, вначительное снижение скорости движения миксомицета от концентрации фал-лоидина.

Таким образом, удалось определить зависимость подвиж-" ности миксомицета от систем микротрубочек и микрофиламентов, что в дальнейшем позволило нам судить о состоянии данных систем в клетке при наложении температурного фактора.

Влияние температуры на подвижность Р. р'о1усерЬа1иго и количество актина и тубулина в клетках миксомицета.

Для выяснения вклада систем микрофиламентов и микротрубочек в реализацию подвижности Миксомицета после краткорвре-менного температурного воздействия нами были проведены эксперименты, в которых мы сопоставили подвижность миксомицета на пртяжении четырех часов после температурной обработки с количественными изменениями основных белков микрофиламентов - актина и микротрубочек - тубулина (табл.1). Температурное воздействие в течение-10 минут температурами 29°,33° и 37° I-значителыга ингибировало скорость движения миксомицета, а при температуре 41° С миксомицет погибал. Температурная обработка выше упомянутыми температурами в течение 5 минут также вызывала снижение скорости движения.

При температурных воздействиях в режиме 1 и 2 минут были получены следующие результаты (см.табл.1). При двухминутном температурном воздействии 29°, 33° и 37° С скорость движения миксомицета по дорож)<ам голодного агара была незначительно меньше контрольной. В то же время после 2 минутного (41°С) и 1 минутного (29°, 33°, 37° и 41° С) режимов обработки наблюдалось увеличение скорости движения миксомицета по дорожасам агара по сравнению с контролем. Максимальная скорость движения была зарегистрирована через час после 1 минутного воздействия 41° С. Примечательно, что количество актина и тубулина в клетках миксомицета,. в данный момент, превышало контрольные пказатели. С падением скорости движения миксомицета снижалось также содержание данных белков в клетках р.ро1усерЬа1ит. Аналогичная зависимость прослеживается при одноминутном воздействии температурами 29°, 33° и 37° С.

Временные режимы (2, 5 и 10 минут) температурного воз-

Таблица 1.

Зависимость относительной подвижности (Ш) и относительного содержания актина и тубулияа в клетках ыиксоыицета р. ро1усерЛа1ит от режимов температурной., об работки

часы ОП ^ктин |ТубуЛИН ОП |Актин | Тубулин ОП АКТИН | Тубулшн СИ [Актин | туоулин

29° С, 10 минут зз° с, ю минут С, 10 минут ' 41° С, 10 минут

1 а 37 125 117 а 39 121 77 0.06 148 119 . — - -

2 а за 70 90 0.28 71 60 а 15 75 Ю2 — - -

3 а 42 91 53 0.29 83 47 ол 99 74 - - -

4 0.37 61 59 а 23 122 126 0.07 36 80 - - -

23° С. 5 кинут • 33° С, 5 минут 37° С, 5 минут 41° с, 5 минут

1 0,36 »1 117 а 39 129 63 0.42 132 124 а 26 162 Я9

2 а« 61 84- 0.25 70 54 а 23 59 118 0.31 81 92

3 0.« Э7 67 а 21 99 51 а 24 88 П2 а 27 Ю2 59

4 а« 120 99 0.45 138 71 аза 96 126 а 26 129 102

23° С, 2 икнутм зэР с. 2 минут» 37° С. 2 минуты ! '41° С, 2 минуты

1 а 99 Ю8 70 0.9 116 вз 0.83 104 «9 а 91 128 СО

2 а 62 Ю8 а 89 57 118 а 78 60' 106 105 66 Ю4

3 а 73 Ю4 112 а 77 67 93 0.96 87 9? 102 90 90

4 0.79 89 63 а 61 91 83 0.71 119 134 а 77 125 126

23й С, 1 шмугэ 33° С, 1 минута 37° С, 1 кинута 11 41° С. 1 шиута

) 162 «9 63 139 125 95 112 «4 124 181 П9 132

2 1.5*. 56 109 1.25 75 Ю2 128 53 Ю8 116 71 • 108

3' 49 36 59 42 Ю9 55 1.2В 48 65 и 85 95

4 102 ¡09 75 104 169 131 1.06 53 90 а 97 • 126 !22

действия вызывали, как правило, снижение уровня основных цитоскелетных белков в клетках миксомицета.• Снижение "уровня синтеза общего белка, как реакция меток на гипертермию, хорошо известно в литературе (Neuman,1989). По данным Toye et al.(1989) температурный прогрев значительно угнетал синтез а- и а-тубулинов у Leishmania major. Findly et al. (1981) показали, что температурный прогрев может также снижать скорость транскрипции актинового гена.

Однако, относительное содержание основных цитоскелетных белков при общем замедлении движения миксомицета, в некоторых случаях превышало контрольный уровень. Наиболее часто данное явление наблюдалось в. первый час после наложения температурного фактора. Так, по данным Kerr и Carter (1990) стресовые условия могут стимулировать синтез некоторых цитоскелетных белков. По нашему мнению, температурное воздейс-. твие может не только влиять на синтез основных цитоскелетных белков в клетке, но и на позиционирование и ориентацию данных' органелл, когда количественные показатели не являются определяющими. Аналогичные результаты для микротрубочек были описаны Golinska (1988) и для микрофилаыентов Klopska (1089).

Влияние повышенной температуры на полимеризацию микротрубочек in vitro.

- Способность молекул к самосборке и последующему образованию надмолекулярных систем и субклеточных органелл является одним из наиболее интереоных биологических феноменов. Как и любой динамический процесс, самосборка молекул зависит от многих физических факторов, в том числе и от температуры.Одним из наиболее ярких проявлений процесса самосборки является образование,микротрубочек в растворе.

Для оценки данного процесса in vitro мы провели модельные эксперименты, в которых были использованы микротрубочки 'из мозга крупного рогатого скота, очистку которых осуществляли двумя циклами полимеризация - деполимеризация (Shelan-sky et al. 1973) Полимеризацию микротрубочек инициировали при температурах 37°, 41°, 45° С добавкой ГТФ до 1 мМ. Температура 37° С, которая является физиологической, была взята нами в качестве контроля. На рисунке 2 изображены кривые,

Десорбция. - 11 -отн.ед.

Рис.2. Зависимость полимеризации микротрубочек от температуры (• - контроль,о - 41° С.д- 45° С)

описывающие процесс полимеризации микротрубочек при различных температурах. Кривая, описывающая полимеризацию микротрубочек в контроле, проходит три фазы. Первая - 1-4 минута лагфаэа, которая характеризуется процессами.нуклеации и лоте-рального роста микротрубочек. Вторая - 4-12 минута фаза элонгации, то есть увеличение линейных размеров микротрубочек. Третья - 12-20 минута - стадия динамического равновесия. При полимеризации, которая проходила при температурах 41° и 45° С полностью отсутствовала лагфаза и максимум скорости полимеризации наблюдался на 4 минуте при температуре 45° С и на 6 минуте при температуре 41° С. В дальнейшем оптическая плотность раствора снижалась, что означало нарушение нормального процесса сборки микротрубочек. Особое внимание необходимо уделить природе пиков, характерных для прог цесса полимеризации микротрубочек, который проходил при повышенных температурах. Вероятнее всего, в первые минуты после инициации полимеризации при температурах 41° С и 45° С не происходит денатурации белковых молекул тубулина. В этот, промежуток времени могут формироваться нормальные тубулярные структуры, скорость образования которых детерминируется состоянием белковых молекул, входящих в состав микротрубочек. В дальнейшем, под действием температуры микротрубочки разрушаются. Причиной нарушения структуры микротрубочек, подвергшихся температурной обработке,являются, вероятнее всего, конформа-

ционные изменения .происшедшие в молекуле тубулина., На это указывает дальнейшие электронно-микроскопические исследования.

При электронно-микроскопическом анализе, который проводился через 20 минут после инициации полимеризации, были получены следующие результаты (рис.3). в контрольном варианте к 20 минуте полимеризации сформировались нормальные линейные трубчатые полимеры, которые по своей структуре полностью соответствуют таковым,описанным в литературе (Lloyd, 1982) (рис.Э,а). При температуре 41° 0 (рис.3,6), наряду с отдельными немногочисленными микротрубочками, присутствуют белковые агрегаты неправильной формы. Эти структуры в основном локализованы на "нормальных" микротрубочках в виде незамкнутых колец и обрывков трубчатых структур. Появление этих белковых агрегатов вызвано действием повышенной температуры,которая нарушает конформацмо белков,формирующих микротрубочки. На рисунке 3,в приведены фотографии тех структур, полимеризация которых проходила при температуре 45° С.

В

Рис 3. Электронно-микроскопические фотографии микротрубочек, сформировавшихся при температурах: А - 37 С (контроль). Б - 41° С(.В - 45° С.

Тубулярные структуры полностью отсутствую., а все образования представлены молекулярными агрегатами неправильной формы. Аналогичные образования наблюдал Сорочинский и др. (1990) после облучения микротрубочек в дозе 1000 Гр.

Синтез белков теплового шока у миксомицета P. polyce-phaluro после кратковременной температурной обработки

Большой интерес представлял вопрос об индукции . синтеза белков теплового шока у миксомицета после кратковременной температурной обработки, так как последние связаны с элементами клеточного скелета (Clark et al. 1984, Koyasu et. al. 1986). ~

Нами были выбраны следующие режимы температурной обработки, после которых проводилась детекция синтеза хитшоковых белков: 1) температурная обработка 29° С в течение 1 и 10 минут. 2) температурная обработка 37° С в течение 1, S, 10 минут. Для сравнения полученных нами результатов по' кратковременному действию температуры на синтез белков теплового шока индуцировали синтез белков теплового шока у миксомицета температурным воздействием 33° С в течение часа.

Абсорбция,

отя. ел.

0,9 •

0.8 '

0.7

0.6 ■

0.5 .

50 60 70 SO 90 ' 100 110 120 130 ММ

Рис.4. Зависимость синтеза суммарного белка миксомицета Р. ро1усерЬа1ш1 от температуры. 1 - конроль (25° С) 2 - после температурной обработки (33° С, 1 час),

' - 14 -При обработке 33° С в течение часа культуры клеток мик-сомицета нами был зафиксирован синтез четырех белков теплового шока с молекулярными массами 105, 82, 74 и 69 нД (см. рис.4). Эти результаты полностью согласуются с данными,описанными Wright et al. (1982): '

После температурной обработки в течение одной минуты нам не удалось обнаружить индукцию синтеза белков теплового шока у миксомицета Physarum polycephalum.

При температурной обработке 29° С в течение 10 минут в первый час после обработки удалось вафиксировать усиление синтеза .ряда высокомолекулярных белков с молекулярными массами в пределах от 82 до 69 кД (рис,. 5,а). Однако, необходимо отметить, что характер пиков и, соответственно, белковый спектр отличались от спектра белков теплового шока Р. polycephalum, полученных нами при тепловой обработке в течение часа (рис. 4). Вероятно,кратковременная тепловая обработка усиливала не только синтез уже известных белков теплового шока, но и некоторых других высокомолекулярных белков. Необходимо отметить, что усиливался также синтез ниакомолекуляр-ных белков с молекулярными массами 14-25 кД. К четвертому часу после температурной обработки 29° С в течение 10 минут (рис.5,6) синтез белков, вызванный кратковременным температурным воздействием, изменялся. В данном режиме температурного воздействия не детектировался белок теплового шока с молекулярной массой .105 кД, однако, синтезировались хигшоко-вые белки с молекулярными массами 82, 74 и 69 иД. Наблюдалось усиление синтеза низкомолекулярных белков.

После температурной обработки в течение. 5 минут 37° С в первый и четвертый чао после температурной обработки удалось зафиксировать значительное усиление синтеза белка теплового шока с молекулярной массой 74 кД . К четвертому часу после температурного воздействия, нами наблюдалось также усиление синтеза белка с молекулярной массой около 14 кД.

При изучении индукции синтеза белков теплового шока после температурной обработки 37° С в течение 10 минут не удалось зафиксировать индукцию синтеза высокомолекулярных белков -теплового шока. Однако, как в первый, так и в четвертый час после температурного воздействия удалось обнаружить индукцию синтева белка с молекулярной массой 14 кД.

Абсорбция, отн. ед.

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

Абсорбция, отн. ел.

0.9 -

•-1-<-1-1-1-<-т~

50 60 70 60 90 100 НО 120 130 мм

.0.8

0.7

0.6 -

0.5 -

' СП

т-.—г—I-1-г

50 60 70 80 90 100 110 120 130 №1

Рис.5. Зависимость синтеза суммарного бедка микссмицета Р.ро1усерЬа1ит от температурной обработки 29° С, 10 минут. А - в первый час после обработки, Б - в четвертый час после обработки. 1 - контроль (25° С). 2 - после температурного воздействия.

- 16 -

По нашему мнению, различия в индукции синтеза белков зависит от режимов температурной обработки. Нами обнаружено, что кратковременная температурная обработка индуцирует син-тев ниакомолекулярньш белков теплового шока, которые не индуцируются при длительных временах температурной обработки. В литературе (Лецтап еЬ а1. 1889) известна индукция синтеза низкомолекулярных белков теплового шока.

Роль белков теплового шока в клетках к настоящему времени не достаточно выяснена. В работе Шп1оп е1 а1. (1962) отмечается, что белки теплового шока могут играть роль стабилизаторов лабильных клеточных структур. Необходимо учесть, что подвижность миксомицета при температурных воздействиях 29° и 37° С в течение б и 10 минут была значительно ниже чем в контроле. Исходя из этого можно, предположить, что синтезируемые после кратковременной температурной обработки белки теплового шаса взаимодействуют с элементами клеточного скелета миксомицета, от состояния которого в значительной степени зависит жизнедеятельность последнего.

ВЫВОДЫ.

1. Подвижность миксомицета Physaruiri polycephalum зависит от функционального состояния систем микротрубочек и мик-рофиламентов. При нарушениях структуры последних подвижность миксомицета нарушается.

2. Изменения скорости движения миксомицета после воздействия температурами 29°,33°,37° и 41° С в течение 1, 2, 5 и 10 минут обусловлены температурой и временем экспозиции и детерминируются состоянием цитоскелетных структур.

3. Повышение температуры полимеризации in vitro с 37° до 41° и 45° С вызывает нарушения не только процесса полше-ризации, но и структуры микротрубочек, . выделенных из мозга крупного рогатого скота.

4. Количественные изменения в содержании актина - основного белка микрофиламентов и тубулина - основного белка микротрубочек в клетках миксомицета в течение четырёх часов после температурного воздействия ' зависят от режима температурной обработки.

5. Установлено, что синтез белков т ллового шока индуцируется у миксомицета P.polycephalum после кратковременной температурной обработки при 29° С СЮ минут) и 37° С (5 и 10 минут).

6. Показано, что изменение функционального состояния цитоскелетных структур при действии температурного стресса является одним из возможных путей реакции ¡теток на гипертермию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Прожневськкй О.I., Сорочинський Б.В. Деяк1 ссобливост! пол1меризац11 м1кротрубочок In vitro. //Тез.допов1д.5 Укр-DioxlM.з'1зду. -К. -1987. -Част.2, -С.172-173.

2.ПроХневский А.И..Сорочинский Б.В. Цитоскелет и реакция клетки на гипертермию. // Tea.докл.6 конференции молодых учёных Ужгородского госуниверситета.-Ужгород.-1989.-С.110.

3.Soroch1nsky В.V.,Prochnevsky А. I. ,Grodzinsky D.M. Cell Cytoskeleton - is it one more messenger system //In: Abstr. Int.Symp."Molec.Organ.Biol.Syst.".-Moskow.-1989.-Pt.2.-P.186.

4.Прохневский A.M..Сорочинский Б.В. Особенности сборки микротрубочек in vitro при действии повышенных температур. // Цитол. и генетика.-1991.- Т.25, N 6 -С.8-11.

5.Прохневский А.И., Гродзинский Д.М. Роль цитоскелетных структур в нарушении подвижности миксомицета при гипертермии. // Доклады АН Украины. -1992. N 3.-С.118-121. .

6.Прохневсьний 0.1. Вшшв температуря на синтез цитоскелет-них б!лк1в та рухлив!сть м!ксом1цету Physarum polycephalum. // Тез. допов1д. 6 Укр. б!ох1м. з'1зду. -К. -1992. -Част.1, -С.20.