Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования внутриклеточных пулов Ca2+ и их роль в сократительной активности миксомицета Physarum polycephalum

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочегаров, Андрей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Описание объекта

1.2. Автоколебания сократительной активности и [Са2+], в Physarumpolycephalum

1.3. Роль внеклеточного Са2+ в генерации автоколебаний

1.4. Са2+ во внутриклеточных органеллах

1.5. Поддержания низкого уровня Са2+ в цитоплазме клеток

1.6. Внутриклеточные Са -каналы

1.7. Трансмембранный потенциал в Physarum polycephalum

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследования внутриклеточных пулов Ca2+ и их роль в сократительной активности миксомицета Physarum polycephalum"

В противоположность большинству клеток животных в плазмодии миксомицета Physarum polycephalum колебания концентрации Са2+ происходят постоянно и независимо от внешних стимулов. Цитоплазматический кальций управляет сократительным процессом в актомиозиновой системе плазмодия, обеспечивая возвратно-поступательный поток протоплазмы и движение клетки. При этом уровень [Са2+]ш, возрастая в фазе сокращения и снижаясь в фазе расслабления колеблется с минутным периодом, характерным для колебаний сократительной активности (Ridgway & Durham, 1976; Natsume et al., 1992). Показано, что сократительные колебания в плазмодии могут продолжаться более часа в бескальциевой среде, а затем прекращаются, по-видимому, вследствие опустошения внутриклеточных пулов (Wohlfarth-Bottermann & Gotz von-Olenhusen, 1977). Эти данные указывают на то, что

9+ осцилляции [Са ]i„ генерируются за счет внутриклеточных пулов кальция, а не потоков этого иона через цитоплазматическую мембрану.

Хотя внутриклеточные кальциевые каналы Physarum polycephalum не идентифицированы, существуют косвенные указания на наличие двух типов каналов, обнаруженных во многих животных и растительных клетках, а именно, рианодинового рецептора и ПУрецептора (Matthews, 1977; Бейлина & Белявский 1986).

В целом механизмы транспорта кальция в Physarum polycephalum изучены в значительно меньшей степени, чем в клетках животных, что, отчасти, объясняется трудностями окрашивания Physarum эфирными формами флуоресцентных индикаторов Са2+. Эта общая для клеток растений и грибов проблема, по-видимому, возникает из-за внеклеточного гидролиза эфирных форм кальциевых индикаторов, либо вследствие низкой активности внутриклеточных гидролаз. Поэтому хлортетрациклин (ХТЦ), свободно проникающий в клетки, является единственным для нашего объекта инструментом исследования внутриклеточных пулов. Механизм окрашивания клеток хлортетроциклином основан на пассивной аккумуляции индикатора как комплекса Са2+-ХТЦ, и его накоплении во внутриклеточных органеллах с повышенной концентрацией Са2+.

Целью настоящей работы было изучение транспорта Са2+ во внутриклеточных пулах миксомицета Physarum polycephalum, и их роль в автоколебаниях цитоплазматического уровня Са2+, управляющего сократительной активностью.

Новизна исследования. Данная работа является первой работой по исследованию уровня Са2+ во внутриклеточных компартментах Physarum polycephalum с помощью флуоресцентного индикатора. Были подобраны оптимальные условия окрашивания суспензии микроплазмодиев ХТЦ. Был также предложен метод флуоресцентных измерений, позволяющий избавиться от внеклеточной флуоресценции, основанный на способности плазмодия адаптироваться к широкому диапазону рН. Помимо флуоресцентных измерений проводились также исследования сократительных колебаний и измерения внешнего Са2+ с помощью Са2+-селективного электрода. Полученные данные позволяют предпологать наличие рианодинового рецептора в объекте исследования.

Научно-практическое значение работы. Одной из наиболее фундаментальных проблем является выяснение механизма автоколебаний и принципов регуляции периодичности колебаний уровня Са2+ в клетке, который является универсальным посредником в регуляции и интеграции клеточных функций, в частности, в управлении локомоции амебоидных клеток. Выбранный объект исследования является переспективной моделью для изучения регуляции клеточных функций кальцием, а также возникновение и поддержание колебательных процессов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кочегаров, Андрей Александрович

ВЫВОДЫ

Кратко суммируя вышеизложенное можно сделать следующее резюме:

1) Поскольку BHQ, но не тапсигаргин, вызывает выход Са2+ из ХТЦ-окрашенного пула, в Physarum имеется механизм закачки отличный по своим фармакологическим

Л I свойствам от Са -АТРазы типа SERCA.

2) Выход Са в ответ на BHQ и иономицин из ХТЦ-окрашенного пула, происходит через рианодиновый (или по крайней мере, близкий к нему) рецептор по механизму кальций-индуцированного выхода Са (CICR) так как прокаин полностью снимает этот выход.

3) Рианодиновый канал не является обязательным для поддержания автоколебаний сократительной активности, (и, соответственно, колебаний [Ca2+]jn) поскольку блокаторы этого канала - рианодин и прокаин не вызывают их прекращения.

4) Блокатор кальциевых каналов - кадмий, вызывает медленный выход Са2+ из ХТЦ-окрашенного пула. Обнаружено, что в присутствии - кадмия, сократительные колебания сохраняются 10-40 мин, а затем прекращаются, по-видимому, вследствие опустошения пулов кальция.

5) Эти данные (п.З и п.4) указывают на наличие в плазмодии другого внутриклеточного канала (предположительно ВРз-рецептора), способного обеспечивать автоосцилляции [Ca2+]in.

6) Кофеин - активатор рианодинового рецептора, также вызывает выход Са2+. Однако величина ответа гораздо меньше, чем в случае с иономицином и BHQ, что свидетельствует об отличии механизма выхода Са в ответ на кофеин от CICR.

7) Прокаин и рианодин по разному ингибируют ответы на BHQ и кофеин, что указывает на наличие двух различных изоформ рианодинового рецептора.

3.10. Заключение

В плазмодии Physarum обнаружен ХТЦ-окрашенный пул, выход Са2+ из которого происходит под действием BHQ, но не тапсигаргина. Результаты показали наличие в Physarum Са2+-АТРазы чувствительной к BHQ, но не к тапсигаргину. Такая Са2+-АТРаза отличается по своим фармакологическим свойствам от SERCA. Поскольку тапсигаргин вызывает эффект наблюдаемый по изменению сократительной активности, можно предположить наличие мишени чувствительной к этому агенту, а именно, Са2+-АТРазы типа SERCA на пуле слабоокрашенном ХТЦ (вследствие кислого рН) или на каком-то небольшом пуле незаметным по флуоресценции.

Ингибирование прокаином кальций-индуцированного выхода Са2+ (CICR) вызываемого BHQ и иономицина свидетельствует в пользу наличия рианодинового рецептора, через который происходит выход Са2+. Кофеин также вызывает выход Са2+, но в меньшей степени, чем BHQ и иономицин. Прокаин и рианодин по

Ver

2+

Рис. 28. Схема действия BHQ, прокаина, кофеина и блокаторов Са -каналов. ОС осциллирующий пул, ВС - вспомогательный пул, плюсы показывают активирующее

2+ влияние, тупые стрелки - ингибирующее, обычные стрелки - потоки Са . разному ингибируют ответы на BHQ и кофеин, что наводит на мысль о существовании двух подклассов рианодинового рецептора.

Результаты показали также, что рианодиновый канал не является обязательным для поддержания автоколебаний сократительной активности, (и, соответственно, колебаний [Са ]jn) так как рианодин и прокаин не вызывают их прекращения. Это указывает на наличие в плазмодии другого внутриклеточного канала, способного обеспечивать осцилляции. Являются ли эти каналы взаимозаменяемыми, как в яйцеклетках морских ежей (Galione, 1993) или один из них вовлечен в работу задающего осциллятора, а другой является вспомогательным (рис. 28), остается неясным, поскольку единственный блокатор ПУрецептора - гепарин является непроникающим через клеточную мембрану соединением.

Расположены ли рианодиновый рецептор и другой неизвестный Са2+-канал (предположительно 1Рз-рецептор на одном и том же пуле или на разных - также остается невыясненным вопросом. Обычно, по литературным данным, их считают локализованными на разных пулах. Поскольку выход кальция в ответ на кадмий не ингибируется в присутствии 10 мМ прокаина можно предположить, что его высвобождение происходит через 1Рз-рецептор. То, что кадмий, вызывая выход Са2+, ослабляет ответ на BHQ свидетельствует в пользу того, что ЕРз-чувствительный пул и BHQ-чувствительный пул хотя бы частично перекрываются. С другой стороны, это взаимное ингибирующее влияние BHQ и кадмия может и не быть результатом

94совместной локализации 1Р3-рецептора и Са -АТРазы чувствительной к BHQ на одном и том же типе везикул, а может быть результатом сопряжения Нечувствительного и

94

BHQ-чувствительного пула потоками Са циркулирующими между этими пулами. Было сделано предположение, что потоки Са2+, выходящие из ЕРз-чувствительного пула тут же закачиваются в рианодин-чувствительный пул, и также потоки Са2+ выходящие из рианодин-чувствительного пула закачиваются в 1Рз-чуствительный пул, и таким образом, в клетке совершается как бы «круговорот» Са2+. Такой «круговорот» Са2+ мог

94- 94бы быть возможен при близкой локализации Са -канала с Са -АТРзой. Другой возможный механизм сопряжения мог бы быть обусловлен разностью в характеристиках Са2+-каналов и Са2+-АТРаз. Са2+-каналы, как уже отмечалось в «Обзоре литературы» обладают разными диапазонами активирующих и ингибирующих концентраций Са2+: 1Рз-рецептор активируется при довольно низком уровне Са2+, тогда как рианодиновый рецептор работает при более высоком уровне Са2+. Относительно свойств Са2+-АТРаз ничего не известно, но можно предположить, что они также

•у, активируются/инактивируются при разных уровнях Са . Таким образом, можно предположить следующую модель «круговорота» Са2+. Первоначально выход Са2+

2+ происходит через ПУрецептор, который повышает [Са ]jn до уровня необходимого чтобы активировать рианодиновый рецептор. При этом, работает Са2+-АТРаза на рианодиновом пуле, обладающая низким порогом активации. Затем, при повышении [Ca2+]jn ЕРз-рецептор и Са2+-АТРаза рианодинового пула инактивируются, тогда как активируется, обладающие высоким порогом активации, рианодиновый рецептор и Са2+-АТРаза 1Р3 -чувствительного пула. Са2+-АТРаза 1Р3 -чувствительного пула понижает [Ca2+]in до такого уровня, пока снова не включится в работу Са2+-АТРаза рианодин-чувствительного пула, которая затем доводит уровень Са2+ до минимального значения, при котором ГРз-рецептор будет не активен. Затем, через некоторое время

94концентрация Са снова должна повыситься до уровня активации 1Рз-рецептора. Из этого следует, что должен существовать какой-то ток утечки, либо из ЭР, либо через

Л I плазмалемму, повышающий [Са ]jn. Возможно, что эта утечка происходит через специальный Са2+-канал, регулируемый заполненностью пулов Са2+. При заполнении пулов Са2+ эта утечка увеличивается, приводя к более быстрому повышению [Са2+]ш, и соответственно, к активации ЕРз-рецептора. Таким образом, регуляция тока утечки может иметь решающее значение для авторегуляции периода колебаний.

Механизм прекращения колебаний при блокировании кадмием потока кальция в цитоплазму скорее всего связан с нарушением суммарного равновесия потоков через плазмалемму, что при неизменной скорости откачки приведет к потере кальция клетками. Такая потеря будет, в первую очередь, происходить за счет внутриклеточных пулов, участвующих в колебаниях, и через некоторое время приведет к прекращению колебаний вследствие понижения уровня Са2+ в таких пулах. Время сохранения осцилляций сократительной активности в присутствии кадмия, так же как скорость выхода кальция, варьировали в разных экспериментах, причем, чем большей была скорость выхода, тем меньшим был ответ на последующую добавку иономицина или BHQ. Утрата способности к CICR, по-видимому, прямо связана с опустошением рианодинового пула и может отражать степень его вовлечения в колебания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочегаров, Андрей Александрович, Пущино

1. Бейлина С.И., Белявский М.А. Кальциевый обмен плазмодия Physarum polycephalum на разных стадиях клеточного цикла. Studia Biophysica, 1986, 116:195-203.

2. Гимельбрант А.А. Мобилизация внутриклеточного кальция: как дойти другим путем. Биохимия, 1994, 59:748-749.

3. Зинченко В.П. Механизмы рецептор-зависимой генерации ионных сигналов в клетках асцитной карциномы Эрлиха: Диссертация д-ра биол. наук, Санкт-Петербург, СПГУ, ИБК РАН, 1992, с. 47.

4. Павлов Е.В. Изучение свойств и функций Са-активируемого канала митохондрий. Диссертация канд. биол. наук, Пущино, ИТЭБ РАН, 1999, с. 77.

5. Юрков И.С., Зинченко В.П., Макаров П.Р., Кузнецова С.М. Внутриклеточное распределения кальция и характеристика Са2+-транспортирующих систем в клетках реснитчатой инфузории Tetrahymena pyriformis. Биологические мембраны, 1996, 13:522-528.

6. Achenbach F., Achenbach U., Kessler D. Calcium binding sites in plasmodia of Physarum polycephalum as revealed by the pyroantimonate technique. J. Histochem. Cytochem., 1984,32:1177-1184.

7. Achenbach F., Wohlfarth-Bottermarm K.E. Reactivation of cell-free models of endoplasmic drops from Physarum polycephalum after glycerol extraction at low ionic strength. Eur. J. Cell. Biol., 1986,40:135-138.

8. Akitaya Т., Hirose Т., Ueda Т., Kobatake Y. Variation of Intracellular Cyclic AMP and Cyclic GMP Following Chemical Stimulation in Relation to Contractility in Physarum polycephalum. J. of General Microbiology, 1984, 130:549-556.

9. Azhar M., Manogaran P.S., Kennady P.K., Pande G., Nanjundiah V. A Ca(2+)-dependent early functional heterogeneity in amoebae of Dictyostelium discoideum, revealed by flow cytometry. Exp. Cell Res., 1996, 227:344-351.

10. Babcock D.F., Herrington J., Goodwin P.C., Park Y.B., Hille B. Mitochondrial participation in the intracellular Ca2+ network. J. Biol. Chem. 1997, 136:833-844.

11. Beil F.U., von Chak D., Hasselbach W., Weber H.H. Competition between oxalate and phosphate during active calcium accumulation by sarcoplasmic vesicles. Z. Naturforsch C., 1977, 32:281-287.

12. Belyavsky M., Sauer H.W. Intrinsic Fluctuation of Phosphoinositol Levels are Involved in the Progression of the Naturally Synchronous Cell Cycles in Physarum polycephalum. Eur. J. Cell Biol., 1992,58:371-376.

13. Berrige M. A Tale of Two Messengers. Specific Binding of Cyclyc ATP-ribose to Calcium-storing Microsomes from Sea Urchin Eggs. Nature, 1993, 365:388-389.

14. Beylina S.I., Cieslawska M., Hrebenda В., Baranowski Z. The Relationship Between the Respiratory Rate and the Period of the Contraction-Relaxation Cycle in Plasmodia of Physarum polycephalum. Acta Protozoologica, 1989, 28:165-174.

15. Bezprozvanny I., Watras J., Ehrlich B.E. Bell-shaped calcium-response curves of 1ш(1,4,5)Рз- and calcium-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum. Nature, 1991,351:751-754.

16. Bragadin M., Pozzan Т., Azzone G.F. Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. Biochemistry, 1979, 18:5972-5978.

17. Bragadin M., Pozzan Т., Azzone G.F. The activation energies and enthalpies during Ca2+ transport in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 1979, 104:347-335.

18. Braatz R. Differential Histochemical Localization of Calcium and Its Relation to Shuttle Streaming in Physarum. Cytobiologie, 1975, 12:74-78.

19. Brandl C.J., Green N.N., Korszak В., MacLennan D.H. Two Ca2+ ATPase genes: homologies and mechanistic implications of amino acid sequence. Cell, 1986, 44:597-607.

20. Brownlee C., Wood J.W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells oiFucus serratus. Nature, 1986, 320:624-626.

21. Bush D.S., Jones R.L. Measurement of cytoplasmic calcium in aleurone protoplasts using Indo-1 and Fura-2. Cell Calcium, 1987, 8:455-472.

22. Byron K.L., Babnigg G., Villered M.L. Bradykinin-induced Ca2+ -entry, release and refilling of intracellular Ca2+ stores. J. Biol. Chem., 1992, 267:108-118.

23. Carafoli E. Intercellular calcim homeostasis. Annu. Rev. Biochem., 1987, 56:395-433.

24. Caroni P., Carafoli E. The Ca -pumping ATPase of heart sarcolemma. Characteterization, calmodulin dependence, and partial purification. J. Biol. Chem. 1981, 256:3263-3270.

25. Caswell A.H., Hutchison J.D. Visualization of membrane bound cations by a fluorescent technique. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971,42:43-49.

26. Caswell A.H., Hutchison J.D. Selectivity of cation chelation to tetracyclines: evidence for special conformation of calcium chelate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, 43:625630.

27. Caswell A.H., The migration of divalent cations in mitochondria visualised by a fluorescent chelate probe. J. Membr. Biol., 1972, 7:345-364.

28. Chen Т.Н., Lee В., Yang C., Hsu W.H. Effects of caffeine on intracellular calcium release and calcium influx in a clonal beta-cell line RINm5F. Life Sci., 1996, 58:983-990.

29. Chouabe C., Drici M.D., Romey G., Barhanin J., Lazdunski M. HERG and KvLQTl/IsK, the cardiac K+ channels involved in long QT syndromes, are targets for calcium channel. Mol. Pharmacol., 1998, 54:695-703.

30. Clapper D.L., Walseth T.F., Dargie P.J., Lee H.C. Pyridine nucleotide metabolites stimulate calcium release from sea urchin egg homogenates. J. Biol. Chem., 1985, 260:13947-13954.

31. Cork, R.J. Problems with the application of quin-2 AM to measuring cytoplasmic free calcium in plant cells. Plant Cell Environ., 1985, 9:157-160.

32. Cozens В., Reithmeier R.A. Size and shape of rabbit skeletal muscle calsequestrin. J. Biol. Chem., 1984, 259:6248-6252.

33. Crompton M., Capano M., Carafoli E. The sodium-induced effiix of calcium from heat mitochondria. Eur. J. Biochem., 1976, 69:453-462.

34. Daniel J.W., Baldwin H.H. Methods of culure for plasmodial myxomycetes. In: Methods of Cell Physiology (Prescott J., editor), Academic Press Inc., New York, 1964, Vol. 1, 941.

35. Daniel J.W., Jarlfors U. Light-induced changes in the ultrastructure of a plasmodial myxomycete. Tissue Cell, 1972, 4:405-426.

36. Davies B.A., Schwartz F.J., Samaha., Kranias G. Regulation of cardiac SR Ca2+-calmodulin-dependent phosphorylation. J. Biol. Chem., 1983, 258:13587-13591.

37. Di Virgilio F., Gomperts B.D. Cytosol Mg2+ modulates Ca2+ ionophore induced secretion from rabbit neutrophils. FEBS Lett., 1983, 163:315-318.

38. Dierkes U. Ca-histochemistry in slime mold plasmodia. In: Ninth International Congress On Electron Microscopy, Toronto, 1978, 130-132.

39. Dixon D., Brandt N., Haynes D. Chlortetracycline Fluorescence Is a Quantitative Measure of the Free Internal Ca2+ Concentration Achieved by Active Transport. J. Biol. Chem., 1983,259:13737-13741.

40. Ehrlich B.E., Kaftan E., Bezprozvannaya S., Bezprozvanny I. The Pharmacology of Intracellular Ca2+-release Channels. Trends in Pharmacol. Sci., 1994, 13:145-149.

41. Engelmann В., Schumacher U., Duhm J. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Cell Physiol., 1990, 143:357-363.

42. Erdahl W.L., Chapman С.J., Wang E., Taylor R.W., Pfeiffer D.R. Ionophore 4-BrA23187 transports Zn2+ and Mn2+ with high selectivity over Ca2+. Biochemistry, 1996, 35:1381713825.

43. Ettienne E. Subcellular localization of calcium repositories in plasmodia of the acellular slime mold Physarum polycephalum. J. Cell Biol., 1972, 54:179-184.

44. Favre C.J., Jerstrom P., Foti M., Stendhal O., Huggler E., Lew D.P., Krause K.H. Organization of Ca2+ stores in myeloid cells: association of SERCA2b and the type-1 inositol-1,4,5-trisphosphate receptor. Biochem. J., 1996, 316( Pt 1):137-142.

45. Fey G., Reiss M., Kersten, Interaction of tetracyclines with ribosomal subunits from Escherichia coli. A fluorometric investigation. Biochemistry, 1973, 12:1160.

46. Flaadt H., Jaworski E., Malchow D. Evidence for two intracellular calcium pool in Dictyostelium: the cAMP-induced calcium is directed into NBD-C1- and 2,5-di-(tert-butyl)l,4-hydroquinone-sensitive pool. J. Cell Sci., 1993, 105(Pt 4):1131-1135.

47. Flucher B.E., Conti A., Takeshima H., Sorrentino V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. J. Cell Biol., 1999, 146:621-630.

48. Fukao M., Hattori Y., Sato A., Liu M.Y., Watanabe H., Kim T.Q., Kanno M. Relationship between NaF- and thapsigargin-induced endothelium-dependent hyperpolarization in rat mesenteric artery. Br. J. Pharmacol., 1999, 126:1567-1574.

49. Galione A. Ca(2+)-induced Ca2+ release and its modulation by cyclic ADP-ribose. Trends Pharmacol. Sci., 1992, 13:304-306.

50. Galione A, McDougall A., Busa W.B., Willmott N., Gillot I., Whitaker M. Redundant Mechanisms of Calcium-induced Calcium Release Underlying Calcium Waves During Fertilisation of Sea Urchin Eggs. Science, 1993, 261:348-352.

51. Galione A., White A. Ca2+ Release Induced by Cyclic ADP-ribose. Trends in Cell Biol., 1994,4:431-436.

52. Gotz von Olenhusen K., Wohlfarth-Bottermarm K.E. Effects of Caffeine and D20 on Persistence and de novo Generation of Intrinsic Oscillatory Contraction Automaticity in Physarum. Cell Tissue Res., 1979, 197:479-499.

53. Gyorke I., Gyorke S. Regulation of the Cardiac Ryanodine Receptor Channel by Luminal Ca2+ involves luminal Ca2+ Sensing Sites. Biophysical J., 1998, 75:2801-2810.

54. Harrer J.M., Ponniah S., Ferguson D.G., Kranias E.G. Expression of phospholamban in C2C12 cells and regulation of endogenous SERCA1 activity. Mol. Cell. Biochem., 1995, 146:13-21.

55. Hatano S. Specific effect of Ca2+ on movement of plasmodial fragment obtained by caffeine treatment. Exp.Cell Res., 1970, 61:199-203.

56. Hatano S., Oosawa F. Movement of cytoplasm in plasmodial fragment obtained by caffeine treatment. J. Physiol. Soc. Jpn. 1971, 33:589-590.

57. Herrington J., Park Y.B., Babcock D.F., Hille B. Dominant role of mitochondria in clearance of large Ca2+ loads from rat adrenal chromaffin cells. Neuron, 1996, 16:219-228.

58. Hofer A.M., Fasolato C., Pozzan, T. J. Capacitative Ca2+ entry is closely linked to the filling state of internal Ca2+ stores: a study using simultaneous measurements of ICRAC and intraluminal Ca2+. J. Cell Biol., 1998, 140:325-334.

59. Holmes R.P., Stewart P.R. Calcium uptake during mitosis in the myxomycete Physarum polycephalum. Nature, 1977, 269:592-594.

60. Iizuka K., Yoshii A., Dobashi K., Horie Т., Mori M., Nakazawa Т. 1пэРз, but not novel Ca2+ releaser, contributes to agonist-initiated contraction in rabbit airway smooth muscle. J. Physiol., 1998, 511: 915-933.

61. Jilka R.L., Martonozi A.N., Tillack T.W. Effect of the purified (Mg2+ + Ca2+)-activated ATPase of sarcoplasmic reticulum upon the passive Ca2+ permeability and ultrastructure of phospholipid vesicles. J Biol Chem, 1975, 250:7511.

62. Jeng J.H., Hsieh C.C., Lan W.H., Chang M.C., Lin S.K., Hahn L.J., Kuo M.Y. Cytotoxicity of sodium fluoride on human oral mucosal fibroblasts and its mechanisms. Cell Biol. Toxicol., 1998, 14: 383-389.

63. KamiyaN. Protoplasmic streaming. Protoplasmatologia, 1959, 8(3a):l-199.

64. Kamiya N., Abe S. Bioelectric phenomena in the myxomycete Plasmodium and their relation to protoplasmic flow. J. Colloid Sci., 1950, 5:149-163.

65. Kato Т., Tonomura Y. Uptake of Calcium Ions into Microsomes Isolated from Physarum polycephalum. J. Biochem., 1977, 81, 207-213.

66. Kessler D., Lathwell M.J. Cessation of protoplasmic streaming during mitosis in Plasmodia of Physarum polycephalum. In: Motility in Cell Function (F.A. Pepe, J.W. Sanger, and Nachmias, eds.), Academic Press Inc., New York, 1979, 463-465.

67. Kirshberger M.A., Tada A., Katz A.M. cAMP-dependent protein kinase-catalysed phosphorilationreaction and its relationship to Ca2+ transport in cardiac SR. J. Biol. Chem., 1974,249:6166-6174.

68. Kukulies J., Stockem W., Wohlfarth-Bottermann K.E. Caffeine-induced Surface Blebbing and Budding in the Acellular Slime Mold Physarum polycephalum. Z. Naturforsch, 1983, 38:589-599.

69. Kuo Т.Н. Guanin nucleotide- and inositol trisphosphate-induced inhibition of the Ca2+ pump in rat sarcolemmal vesicles. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 152:1 Hill 16.

70. Kuroda H., Kuroda R. Origin of the membrane potential in plasmodial droplets of Physarum polycephalum. Evidence for an electrogenic pump. J. Gen. Physiol., 1981, 78:637-655.

71. Kuroda R, Kuroda H. Calcium accumulation in vacuoles of Physarum polycephalum following starvation. J. Cell Sci., 1980, 44:75-85.

72. Kuroda R., Hatano S., Hiramoto Y. Kuroda H. Change of Cytosolic Ca-Ion Concentration in the Contraction and Relaxation Cycle of Physarum Microplasmodia. Protoplasma, 1988, Suppl. 1,72-80.

73. Lee H.G. Specific Binding of Cyclic ATP-ribose to Calcium-storing Microcosms from Sea Urchin Eggs. J. Biol. Chem., 1991, 266:2276-2281.

74. Lee H.C., Aarhus R. A derivative of NADP mobilizes calcium stores insensitive to inisitol triphosphate and cyclic ADP-ribose. J. Biol. Chem., 1995, 270:2152-2157.

75. Lee H.C., Walseth T.F., Bratt G.T., Hayes R.N., Clapper D.L. Structural determination of a cyclice metabolite of NAD+ with intracellular Ca2+ mobilizing activity. J. Biol. Chem., 1989, 264:1608-1615.

76. Livingstone C.D., Schachter D. Calcium modulates the lipid dynamics of rat hepatocyte plasma membranes by direct and inderect mechanisms. Biochemistiy, 1980, 19:4823-4827.

77. Ludlow C.T., Durham A.C.H. Calcium ion fluxes across the external surface of Physarum polycephalum. Protoplasma, 1977, 91:107-113.

78. Luterbacher S., Schatzmann HJ. The Site of action of La3+ in the reaction cycle of the human red cell membrane Ca -pump ATPase. Experientia, 1983, 39:311-312.

79. Luthra M.G., Olson M.S. Studies on an activator of the (Ca2+ plus Mg2+)-ATPase of human erythrocyte membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1976,440:744.

80. Lytton J., MacLennan D.H. Molecular cloning of cDNAs from human kidney coding for two alternatively splised products of cardiac Ca2+-ATPase gene. J. Biol. Chem. 1988, 263: 15024-15031.

81. MacLennan D.H., Brandl C.J., Korszak В., Green N.M. Aminoacide sequence of Ca2+, Mg2+-dependent ATPase from rabbit muscle SR, deduced from its complementary DNA sequence. Nature, 1985,316:696-700.

82. Matthews L.M. Ca++ regulation in caffeine-derived microplasmodia of Physarum polycephalum. J. Cell Biol., 1977, 72:502-505.

83. Matveeva N.B., Beylina S.I., Teplov V.A., Layrand D.B. Active proton transport across the surface membrane of the slime mold Physarum polycephalum. Acta Protozool., 1979, 18:169-171.

84. Meldolesi J., Pozzan T. The heterogeneity of ER Ca2+ stores has a key role in nonmuscle cell signaling and function. J. Cell Biol. 1998, 142:1395-1398.

85. Miller D.M., Anderson J.D., Abbott B.C. Potentials and ionic exchange in slime mold Plasmodia. Сотр. Biochem. Physiol., 1968, 27:633-646.

86. Morris M.B., Auland M.E., Xu Y.H., Roufgalis B.D. Charactereation of the Mg(2+)-ATPase activity of human erythrocyte membrane. Biochem. Mol. Biol. Int., 1993, 31:823832.

87. Morisava M., Steinhardt R.A. Changes in intracellular pH of Physarum plasmodium. Acta Protozool., 1982, 18:169-171.

88. Nakamura S., Kamiya N. Oscillation of Cytoplasmic pH of Physarum Plasmodium Relation to Motility. Cell Struct. Funct., 1985, 10:133-141.

89. Natsume К., Miyake Y., Yano M., Shimizu H. Development of Spatio-temporal Pattern ofл I

90. Ca on the Chemotactic Behavior of Physarum Plasmodium. Protoplasma, 1992, 166:5560.

91. Nett W., Deitmer J.W. Intracellular Ca2+ regulation by the leech giant glial cell. J. Physiol., 1998, 507(Pt 1): 147-162.

92. Newman E.C., Frank C.W. Circular dichroism spectra of tetracycline complexes with Mg+2 and Ca+2. J. Pharm. Sci., 1976, 65:1728-1732.

93. Nicholls D.G., Akerman K. Mitochondrial calcium transport. Biochim. Biophys. Acta., 1982, 683:57-88.

94. Neyses L., Reinlib L., Carafoli E. Phosphorylation of the Ca2+-pumping ATPase of heart sarcolemma and erythrocyte plasma membrane by the cAMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem., 1985, 260:10283-10287.

95. Niggli V., Adunyah E.S., Carafoli E. Acidic phospholipids, unsatuturated fatty acids and limited proteolysis mimic the effect of calmodulin on the purifield erythocyte Ca2+-ATPase. J. Biol. Chem., 1981, 256:8588-8592.

96. Nolta K.V., Padh H., Steck T.L.,. Acidosomaes from Dictyostelium. Initial biochemical characteresation. J. Biol. Chem., 1991,266:18318-18323.

97. Ozog A., Pouzet В., Bobe R., Ьотргй A.M. Characterization of the 3' end of the mouse SERCA 3 gene and tissue distribution of mRNA spliced variants. FEBS Lett, 1998, 427: 349-352.

98. Park Y.B., Herrington J., Babcock D.F., Hille B. Ca clearance mechanisms in isolated rat adrenal chromaffin cells. J. Phisiol., 1996, 492:329-346.

99. Popov P.G., Vaprzarova K.L., Kosselkova G.K., Nikolov T.P. Fluorometric study of tetracycline-bovine serum albumin interaction. The tetracyclines a new class of fluorescent probes. Biochem Pharmacol, 1972,21:2363.

100. Pozzan Т., Azzone G.F. The coupling of electrical ion fluxes in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 1977, 71:62-67.

101. Pozzan Т., Bragadin M., Azzone C.F. The disequilibrium between steady state Ca2+ accumulation ratio and membrane potential in mitochondria. Pathway and role of Ca2+ efflux. Biochemistry, 1977, 16:5618-5625.

102. Rakoczy L. The myxomycete Physarum nudum as a model organism for phitobiological studies. Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd., 1973, 86:141-164.

103. Ridgway B.E., Durham A.C.H. Oscillations of calcium ion concentrations in Physarum polycephalum. J. Cell Biol., 1976, 69:223-226.

104. Rizzuto R., Simpson W.M., Brini M., Pozzan T. Rapid changes of mitichondrial Ca2+ revealed by specifically targered recombinant aequorin. Nature, 1992, 358:325-327.

105. Rooney E.K., Gross J.D. ATP-driven Ca2+/H+ antiport in acid vesicles from Dictyostelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:8025-8029.

106. Rooney E.K., Gross J.D., Satre M. Characterisation of an intracellular Ca pump in Dictyostelium. Cell Calcium, 1994, 16:509-522.

107. Sachsenmaier W., Blessing J., Brauser В., Hansen K. Protoplasmic streaming in Physarum polycephalum: Observation of spontaneous and induced changes of theoscillatory pattern by photomeric and fluorometric techniques. Protoplasma, 1973, 77:381396.

108. Sato H., Hatano S., Sato Y. Contractility and protoplasmic streaming preserved in artificially induced plasmodial figments. The «caffeine drops». Protoplasma, 1981, 109:187-208.

109. Schaffer W.T, Olson M.S. Chlorotetracycline-associated fluorescence changes during calcium uptake and release by rat brain synaptosomes. J Neurochem, 1976, 27:1319-1325.

110. Schatmann H.Y. The plasma membrane calcium pump of erytrocytes and other animal cells. In: Membrane transport of calcium (Carafoli ed.), Academic Press Inc., London, 1982,41-108.

111. Schlatterer C., Schaloske R., Calmidazolium leads to an increase in the Ca2+ concentration in Dictyostelium discoideum by induction of Ca release from intracellular stores and influx of extracellular Ca2+. Biochem. J., 1996,313(Pt 2):661-667.

112. Sjaastad M.D., Lewis R.S., Nelson W.J. Mechanisms of integrin-mediated calcium signaling in MDCK cells: regulation of adhesion by EP3- and store-independent calcium influx. Mol. Biol. Cell, 1996, 7:1025-1041.

113. Shin J.H., Yoo G.H., Lee C.J., Suh C.K. Fast and slow gating types of SR ryanodine receptor/channel purified from canine latissimus dorsi muscle. Yonsei Med. J., 1996, 37:72-80.

114. Slack J.P., Grupp I.L., Ferguson D.G., Rosenthal N., Kranias E.G. Ectopic expression of phospholamban in fast-twitch skeletal muscle alters sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport and muscle relaxation. J. Biol. Chem., 1997, 272:18862-18868.

115. Slater E.C., Cleland K.W. The effect of calcium on the respiratory and phosphorilative activities of heart-muscle sarcosomes. Biochem. J., 1953, 55:566-580.

116. Smith D.A., Saldana R. Model of the Ca2+ oscillator for shuttle streaming in Physarum polycephalum. Biophys. J., 1992, 61:1049.

117. Somlyo A.P., Bond M., Somlyo A.V. Calcium content of mitochondria and endoplasmic reticulum in liver frozen rapidly in vivo. Nature, 1985, 322:633-635.

118. Staron K. Release of pigment from Physarum polycephalum induced by low temperature and trifluoperasine. Eur. J. Cell Biol., 1984, 35:12-16.

119. Stauderman K.A., Pruss R.M. Dissociation of Ca entry and mobilization responses to Angiotensin П in bovine adrenal chromaffin cells. Biochem. J., 1989,264:12838-12848.

120. Stegemann M., Meyer R., Haas H.G., Wiemer J., Stockem W. The plasma membrane of Physarum cell fragments: a morphological and electrophysiological study. Protoplasma, 1987, 141:83-94.

121. Tada M., Katz A.M. Phosphorylation of sarcoplasmic reticulum and sarcolemma. Annu. Rev. Physiol., 1982, 44:401-423.

122. Tauc L. Phenomenes bioelectrques observes dans le plasmode d'un myxomycete (Physarum polycephalum). J. Physiol., (Paris), 1954, 46:659-669.

123. Taylor C.W., Traynor D. Calcium and Inositol Triphosphate Receptors. J. Membrane Biol, 1995, 145:109-118.

124. Tribe R.M., Borin M.L., Blaustein M.P. Functionally and spatially distinct Ca2+ stores are revealed in cultured vascular smooth muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 5908-5912.

125. Tripathy A., Xu L., Mann G., Meissner G. Calmodulin activation and inhibition of skeletal muscle Ca2+ release channel (ryanodine receptor)., Biophys. J., 1995, 69:106-119.

126. Tsong TY. Effect of phase transition on the kinetics of dye transport in phospholipid bilater structures. Biochemistry, 1975, 14:5409-5415.

127. Ueda Т., Gotz von Olenhusen K., Wohlfarth-Bottermann K.E. Reaction of the contractile apparatus in Physarum to injected Ca++, ATP, ADP and 5'AMP. Cytobiologie, 1978, 18:76-94.

128. Vasington F.D. Murphy J.V. Ca uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. J. Biol. Chem., 1962,236:2670-2677.

129. Watanabe A., Kodati M., Kinoshita S. Uber die Beziehung zwischen der Protoplasmastromung und den elektrischen Potentialveranderungen bei Myxomyceten. Bot. Mag., Tokyo, 1937, 51:337-349.

130. White J.R., Pearce F.L. Characteresation of chlotetracycline (aureomycin) as a calcium ionophore. Biochemistry, 1982, 21:6309-6312.

131. Wohlfarth-Bottermann K.E. Weitreichende, fibrillare protoplasmadifferenzierungen und ihre bedeutung fur die protoplasmastromung. I. Elektronenmikroskopischer nachweis und feinstruktur. Protoplasma, 1962, 54:514-539.

132. Wohlfarth-Bottermann K.E. Plasmalemma invaginations as characteristic constituents of Plasmodia of Physarum polycephalum. J. Cell Sci., 1974, 16:23-27.

133. WoldeMussie E., Moran N.C. Histamine release by compound 48/80: evidence for the depletion and repletion of calcium using chlortetracycline and 45calcium. Agents Actions, 1984, 15:267-272.

134. Xu A., Hawkins C., Narayanan N. Phosphorylation and activation of the Ca2+-pumping ATPase of cardias sarcoplasmic reticulum by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase. J. Biol. Chem, 1993, 268:8394-8397.j I

135. Yoshimoto Y., Kamia N. Ca oscillation in the homogenate of Physarum plasmodium. Protoplasma, 1982, 110:63-65.

136. Yoshimoto Y., Matsumura F., Kamiya, N. Simultaneous oscillations of Ca2+ efflux and tension generation in the permealized plasmodial strand of Physarum. Cell Motility, 1981, 1:433-443.

137. Yoshimoto Y., Sakai T. Kamiya N. ATP Oscillation in Physarum Plasmodium.Protoplasma, 1982, 109:159-168.

138. Zahradnikova A., Bak J., Meszaros L.G. Heterogeneity of the Cardiac Calcium Release Channel As Assessed by Its Response to ADP-ribose. Bioch. Biophys. Res. Comm., 1995, 210:457-463.

139. Zhang S., Zhou Z., Gong Q., Makielski J.C. January CT Mechanism of block and identification of the verapamil binding domain to HERG potassium channels. Circ Res, 1999, 84:9, 989-98.

140. Zubrzycka-Gaam E., Korczak В., Osinska H.E. Identification of Sarcoplasmic Reticilum1.ke System in Physarum polycephalum. FEBS Lett., 1979, 107:335-339.

141. В заключение хочу выразить благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. Зинченко Валерию Петровичу за постоянную помощь и за предоставление компьютерного места в ходе написания диссертации.

142. Я благодарю Бейлину С. И. (особая благодарность за материальную и финансовую поддержку) и Матвееву Н. Б. за ценные советы и постоянную помощь в работе, за критическое обсуждение рукописей.

143. Я благодарен Каймачникову Н. П. за ценные советы в компьютерной и математической области.

144. Я весьма благодарен Ширяеву Саше (Белок) за предоставление полезного реактива.

145. Хочу также поблагодарить Долгачеву Л. П. и всех коллег по работе за помощь в работе и дружеское участие.