Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез фосфолипидов в клетках миксомицета PHYSARUM POLYCEPHALUM и его изменения в ходе клеточного цикла

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез фосфолипидов в клетках миксомицета PHYSARUM POLYCEPHALUM и его изменения в ходе клеточного цикла"



••Л гД?

, ¿Гь

ч,

^ На правах рукописи

Макаров Петр Романович

БИОСИНТЕЗ ФОСФОЛИПИДОВ В КЛЕТКАХ МИКСОМИЦЕТА РНУБАКиМ РОЬУСЕРНАШМ И ЕГО ИЗМЕНЕНИЯ В ХОДЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 1997 г.

Работа выполнена в

Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Евтодиенко Ю. В. кандидат биологических наук Ротару В. К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ягужинский Л. С. доктор физико-математических наук Акатов В. С.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино

Защита состоится 1997 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская обл., г. Пущино, ИТЭБ РАН.

С диссертацией Можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

/

Нелипович П. А.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Фосфолиииды, помимо формирования липидного бислоя биологических мембранах, создающего барьер проницаемости для гдрофильных соединений, выполняют многочисленные регуляторные функции, осле того- как было обнаружено, что продукты гидролиза фосфатидилино-п'олдифосфата - 1,4,5-инозитолтрифосфат и диацилглицерол - выполняют >ль внутриклеточных мессенджеров [Berridge and Irvine, 1984], был достигнут ромный прогресс в исследованиии биосинтеза и регуляторных функций ино-толсодержащих фосфолипидов. Эти линиды участвуют в передаче сигнала утрь клетки как при запуске функциональных ответов дифференцированных сток, так и при стимуляции пролиферации клеток. В большей части исследо-ний регуляторная функция фосфолипидов показана на цитоплазматической мбране. Однако в последнее время фосфолипааа С (фермент, участвующий в ансмембранной передаче сигнала) найдена и в ядерной мембране [Martelli et 1992], показана ее активация в ходе клеточного цикла [Liu et al.-, 1996] и тружены рецепторы к продуктам гидролиза фосфоинозитидов - инозитол-и- и -тетрафосфатов - на внутренней и внешней мембране ядер [Humbert et 1996]. Показана также регуляторная роль таких фосфолипидов, как фосфа-цилэтаноламин [Menon et al., 1993], фоефатидилхолин [Exton, 1994] и сфин-шелин [Spiegel, 1993]. .

Особую роль играет метаболизм фосфолипидов в клеточном цикле. Важным ктором является отношение поверхности клеток (поверхность клеточных ябран, определяемая скоростью биосинтеза липидов) к общему объему (массе) !Ток. Предполагается, что этот фактор является одним из сигналов, приводя-х к делению клеток [Lloyd, 1982]. Нельзя исключить, что фосфолипидный тав плазматических мембран может изменяться в ходе клеточного цикла,и обстоятельство играет определенную роль в регуляции пролиферации. :кольку в ходе клеточного цикла существенную роль играют изменения

в цитозоле, является важным исследование поведения фосфатидилинози-ов, вызывающих увеличение [Са2+], в цикле роста и деления клеток. Прини-[ во внимание потенциальную регуляторную роль мембранных фосфолипи-, в настоящей работе проведено исследование метаболизма и состава фосфо-идов в процессе роста экспоненциальной и синхронной культур клеток сомицета Physarum polycephalum. Миксомицет P. poiycephalum является эным объектом для исследования процессов клеточного цикла, поскольку

обладает природной синхронностью деления ядер. Биосинтез фосфолипидов миксомицета изучен слабо, а в ходе клеточного цикла таких исследований не проводилось. Учитывая вышесказанное, представляется актуальным исследование метаболизма фосфолипидов и его изменении в клеточном цикле микеолда-цета Р. ро1усер1га1ит.

Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы было исследование биосинтеза основных фосфолипидов в экспоненциальной фазе роста и в ходе клеточного цикла миксомицета Р. ро1усерЬд1ит. Конкретными задачами были:

1) Изучение биосинтеза фосфолипидов и изменения их содержания в синхронной культуре миксомицета Р. ро1усерЫйит в ходе клеточного цикла.

2) Определение путей биосинтеза основных фосфолипидов в клетках миксомицета Р. ■ро1уырЬл1ит.

Научная новизна: Впервые исследованы процессы биосинтеза основных фосфолипидов в клетках миксомицета Р. ро1усерЬаЫт и изменение их содержания в ходе клеточного цикла? Определена динамика включения меченых предшественников & фосфолипиды в синхронной клеточной культуре и в экспс ненциальной фазе роста клеток. Обнаружено, что в ходе клеточного цикла в течение Э - начале С2 фаз происходит увеличение содержания основных фосфолипидов почти в 2 раза, что приводит к обогащению клеток липидами в СЛ фазе. Во второй половине С2 фазы содержание фосфолипидов снижается до исходного уровня. Скорость включения 32Р;, в фосфолипиды отражает изменения их содержания. Показано, что отношение средних удельных активностей исследованных фосфолипидов фосфатадилхолин: фосфатидилэтаноламин: фосфатидилинозитол в течение клеточного цикла составляет 0,17:1,0:2,5, что говорит о высокой скорости включения метки в фосфатидилинозитол и сниженной - в фосфатадилхолин. Также показано, что начале С 2 фазы происходит гидролиз инозитолсодержащих фосфолипидов и увеличивается содержание водорастворимой фракции продуктов их гидролизг что может быть связано с участием последних в регуляции клеточного цикла (прохождение сигнала через инозитольную сигнальную систему и принятие клеткой решения о прохождении следующего цикла).

В условиях стационарного роста асинхронной культуры клеток миксомицет установлено, что:

1) фосфатидилэтаноламин синтезируется исключительно из этаноламина;

2) около 14 % фосфатидилхолина синтезируется посредством метилирования

юсфатидилэтаноламина и около половины - с участием экзогенного фосфори-ированного предшественника;

) фосфатидилсерин синтезируется из фосфатидной кислоты, не является гновным предшественником фосфатидилхолина или фосфатидилэтаноламина и е синтезируется из них посредством обмена оснований, как это имеет место в летках дрожжей и млекопитающих.

Практическая ценность: Обнаруженные периодические усиление и замед-ение биосинтеза фосфолипидов на различных фазах клеточного цикла могут ыть использованы при разработке модели регуляции клеточного цикла. На римере фосфолипидов клеток миксомицета показано, что при эксперименталь-эм исследовании метаболизма с использованием меченых предшественников ля определения истинных скоростей биосинтеза необходим и полезен дополни-?льный анализ предшественников и продуктов исследуемого метаболита. Пред-эжена математическая модель для исследования биосинтеза внутриклеточных эмпонентов в условиях стационарного роста клеток. Полученные результаты огут быть полезны исследователям, занимающимся изучением процессов био-штеза в клетках, исследованием клеточного цикла и участием фосфолипидов в х) регуляции.

Апробация работы и публикации: Результаты работы были доложены на VI шпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г.). По гзультатам исследований опубликовано 3 работы.

Объём и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора 1тературы, методической и экспериментальной частей, заключения и списка (тературы наименований. Работа имеет рисунков и таблиц,

бщий объём диссертации ^ страниц.

И. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки миксомицета Р. ро1усерЪа1ит выращивали на шейкере при темпе-1туре 26 °С в суспензионной культуре. Синхронизацию осуществляли путем отяния клеток на бумажной подложке в солевой среде и все измерения проводи во втором клеточном цикле после слияния. Б фазу клеточного цикла опре-?ляли по включению [3Н]тимидина, а митоз - с помощью микроскопа с фазо-лм контрастом. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста путем 'бора части суспензии, осаждения клеток центрифугированием и возвраще-1ем среды в исходную суспензию. Для исследования метаболизма фосфоли-

пидов к клеткам добавляли меченый предшественник (J"Pj, [14С]этаноламин ил [3Н]л1Шмнозитод), отбирали аликвоты в определенное время, экстрагировали липиды и разделяли их методом тонкослойной хроматографии. Липиды визуализировали с помощью авторадиографии или в парах йода и идентифицировали комиграцией со стандартами. Идентифицированные компоненты соскабливали с пластинки и содержание фосфолипидов определяли по органическому фосфору, а уровень включения метки определяли на жидкостном сцш тиляционном счетчике. Математическую обработку результатов измерений и расчет параметров синтеза фосфолипидов с использовнием математической модели проводили в программе "Sigma plot"

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОСИНТЕЗА ФОСФОЛИПИДОВ МИКСОМИЦЕТА P. POLYCEPHALUM

а. Характеристика роста микроплазмодия миксомицета 1 polycephalum.

О 20 40 60 80 100 Время после засева (час)

Рис. 1. Типичные кривые роста клеток микроплазмодия Р. ро1усер}га1ит в суспензионной культуре (1) и при разведении для поддержания клеток в экспоненциальной фазе роста (2). Стрелкой обозначен момент добавки метки при изучении метаболизма фосфолипидов.

Миксомицеты представляют собой своеобразные организмы, напоминающие по ряду свойств грибы, но в некоторые периоды цикла своего развития они представляют собой амебы. В природе они встречаются в виде слизисто! протоплазмы (плазмодия) на разлагающихся опавших листьях или на стволах погибших деревье

В лабораторных условиях миксомицет Р. ро1усерка1ит адаптирован к росту в суспензионной (микроплазмодий) и поверхностной (макроплазмодий) культуре. Микроплазмодий -клетки небольшого размера с ограниченным числом ядер, а макроплазмодий - одна большая

клетка, растущая на бумажной подложке, с множеством синхронно делящихся ядер. В клеточном цикле миксомицета Р. ро1усерка1ит отсутствует фаза С1. Свойство миксомицета образовывать большую клетку с при-родно синхронным делением ядер широко используется исследователями клеточного цикла.

В данной работе использовали микроплазмодий для исследования путей биосинтеза фосфолипидов миксомицета и макроплазмодий для изучения изменения их содержания и биосинтеза в ходе клеточного цикла. Средний период двоения биомассы микроплазмодия в условиях наших экспериментов составлял 4,8 часа, а продолжительность клеточного цикла макроплазмодия - около 12 асов. На рис. 1 представлены кинетики роста микроплазмодия в суспензионной ультуре и при поддержании его в экспоненциальной фазе роста. Продолжи-гльность фаз клеточного цикла, определенная по скорости включения метки Н]тимидина в ДНК (в фаза) и с помощью светового микроскопа (митоз), редставлена на рис. 2.

б. Скорость включения метки в основные фосфолипиды и их содержание в клетках миксомицета Р. ■ра1уссрЪ.а1ит в ходе клеточного цикла.

Изменение содержания основных фосфолипидов - фосфатидилхолина (РС), осфатидилэтаноламина (РЕ) и фосфатидилинозитола (Р1) - в ходе клеточного *кла миксомицета Р. роХусерЬ&Хит показано на рис. 3. Приведено содержание осфолипидов, определенное по органическому фосфату, на единицу >верхности клетки макроплазмодия. В течение Б фазы и до начала фазы 02 »исходит увеличение содержания всех исследованных фосфолипидов. Этот юцесс длится около 5 часов, при этом их содержание увеличивается почти в 2 1за (несмотря на то, что для удвоения общей биомассы необходимо около 12

Б М

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время (час)

Рис. 2. Включение [3Н]тимидина в :летки макроплазмодия Р. polycepha.lv.rn I фазы клеточного цикла.

часов). Затем в течение 4-5 часов фазы С2. изменений содержания фосфолипидов практически не происходит. В конце С'2 фазы, перед началом митоза, наблюдается резкое падение их удельного содержания. Это падение продолжается в течение митоза и заканчивается толькс в начале следующей Б фазы. Изменение общего содержания фосфолипидов аналогично изменению каждого из них. В течение Б фазы и в начале фазы Сг2 содержание основны: фосфолипидов (РЕ, РС и Р1) увеличивается почти в 2 раза, хотя это время составляет только около 0,4 длительности клеточного цикла. Необходимо отметить, что существуют различия в характере увеличения содержания индивидуальных фосфолипидов. В начале в фазы скорость увеличения содержания РЕ выше, чем РС и Р1, тогда как в конце Зив начале С2 фаз скорость увеличения содерзкания последних превышает таковую для РЕ. Удвоение содержания Р1 происходит несколько позднее, чем РЕ и РС. Отношение среднего содержания ( ходе клеточного цикла) фосфолипидов РС:РЕ:Р1 равно 1,4:1,0:0,4. Обнаруженнь сильные различия в содержании фосфолипидов в ходе клеточного цикла должны привести к значительному обогащению клеток липидами в определенные фазы цикла и к изменению отношения липид/белок. Поскольку значительных изменений содержания белка на единицу поверхности клетки макроплазмодия в ходе клеточного цикла обнаружено не было, наиболее вероя1 ное, по нашему мнению, объяснение полученных результатов заключается в следующем. В течение первой трети клеточного цикла происходит увеличение скорости синтеза фосфолипидов и образование складок на плазматической мембране, затем имеет место сбалансированный синтез липидов и белка и, наи нец, в конце клеточного цикла происходит падение скорости синтеза липидов I

Рис. 3 Изменение содержания фосфолипидов в ходе клеточного цикла миксоиицета Р. polyce.pha.lum.

усиленным (или тем же самым) синтезом белка и соответствующим увеличением площади клеток.

Скорость включения "^Р; в фосфо-липиды в ходе клеточного цикла представлена на рис. 4. Как видно из рисунка, скорость включения метки в РЕ и Р1 резко возрастает в первой половине в фазы, затем почти не меняется до середины Сг2 фазы и с середины С 2 фазы и до конца митоза наблюдается снижение скорости ее включения. Эти данные хорошо коррелируют с изменением содержания фосфолипидов в ходе клеточного цикла (рис. 3). Скорость включения метки в РС существенно отличается от тако->ой для РЕ и Р1 (рис. 4): она незначительно возрастает до начала С2 фазы и >атем постепенно падает вплоть до конца митоза. Кроме того, на всех этапах слеточного цикла скорость включения метки в РС значительно ниже скорости (ключения метки в Р1 и РЕ, хотя его содержание превалирует над содержанием кггальных фосфолипидов (см. рис 3 и таблицу). Было высказано предположе-1ие, что это может быть связано с тем, что синтез РС осуществляется через гетилирование РЕ, как это происходит в дрожжах и, в меньшей степени, в :летках млекопитающих. Отношение средних удельных активностей основных эосфолипидов РС:РЕ:Р1 за время цикла равно 0,17:1,0:2,5. Высокая удельная ктивность РЕ может быть вызвана последующим синтезом РС из него, а Р1 -овышенным оборотом фосфатидилинозитолмоно- и -дифосфатов, синтези-уемых из Р1 и являющихся участниками системы передачи сигнала.

Исследование участия инозитольной сигнальной системы в регуляции кле-очного цикла в клетках миксомицета Р. ро!усерЯа1ит проводили после их агрузки [3Н]инозитолом.. Было обнаружено (рис. 5), что в начале С2 фазы удержание инозитолдифосфата (ГР2) и инозитолтрифосфата (1Рз) повышается в и 30 раз соответственно. Однако нами не было обнаружено повышения общего ровня 1Р3 в конце в фазы, как это было показано в работе Ве1уаУ5к1 апс! Эаиег

Рис. 4. Скорость включения ■32Р1 в фосфолипиды в ходе клеточного цикла миксомицета Р. ро!исерка1ит.

[1992]. Столь сильное увеличение уровня 1Рз может означать, что в этой точке

осуществляется прохожде-

М Б

Сг2

М Б

а » _

1=1 и. ч

500

2 к в *

^ £ 33 *Й

- а2

о и 5

В С .

¥ а

2 5 § 1 га

»0-ДНК

- 1Р2

о—о - 1Р,

л

4

ё 2 я

о х Я '

3 !»

' 8

с® §

т «5

ф ,

5 к я А

а>

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Время (час)

Рис 5. Изменение содержания водорастворимой фракции гидролиза фосфатидилинози-толов в клетках миксомицета Р. ро1усерка1ит в ходе клеточного цикла.

ние сигнала через инози-тольную сигнальную систему, что согласуется с данными других работ по участию фосфоинозитолов в передаче сигналов в других клетках [Вегпс^е, 1987].

Низкая скорость включения метки в РС и необычное отношение удельных активностей фосфолипидов (практически обратно пропорциональное содержанию фосфолипидов) послужили поводом для дальнейшего исследования метаболизма фосфолипидов в клетках миксомицета Р. ро1усер)ш1ит.

в. Биосинтез фосфолипидов клеток миксомицета Р. ■ро1усер}га1ит и математическая модель для расчета параметров их

биосинтеза.

Для прямой проверки возможного пути синтеза РС путем метилирования РЕ использовали непосредственный предшественник РЕ - [' )С]этаноламин. Как видно из рисунка 6, часть метки включается в РС, но уровень ее включения очень незначителен.

При использовании ^Р^-ортофосфорной кислоты, как предшественника фосфолипидов (рис. 7), наибольшие скорости увеличения удельной активности имеют фосфатидная кислота (РА) (определен только начальный участок кинетики, см. рис. 7, вставка) и Р1, затем в порядке убывания идут РЕ, фосфати-дилсерин (Рв) и РС. На начальной стадии увеличения удельной активности

0 2 4 6

Время инкубации (нас)

1- мин. кинетика 2 - РЕ З-И 4 -РБ 5-РС 6 - РА

1.1.1 80

Время инкубации с меткой Р. (час)

Рис. 7. Изменение удельной активности 5сфолипидов при инкубации клеток микео-щета Р. ро1усерка1ит с 32Р'1-

Рис. 6. Изменение удельной активности РЕ и РС при инкубации клеток миксомицета Р. ро1усерка1ит с [^"^этанол-амином (символы) и теоретически рассчитанные кинетики накопления метки (линии). Здесь и на рис. 7 и 10 на вставке показан начальный участок в увеличенном виде.

всех фосфолипидов, кроме РА, наблюдается лаг-фаза (рис 7, вставка), длительность

которой увеличивается в том же порядке: PI<PE<PS<PC. Наличие лаг-фазы РЕ в случае использования 32Р, (рис. 7) и ее отсутствие в случае [14С]этаноламина (рис. 6) говорят о том, что, используя различные меченые предшественники, можно проследить различные пути синтеза метаболитов в клетке. Следует подчеркнуть, что удельная активность РС значительно ниже таковой для всех рассматриваемых липидов.

Для оценки истинных скоростей синтеза и определения концентраций предшественников и продуктов в рассматри-

ваемой системе метаболитов предложена следующая модель:

— о ----н

Эта модель описывает последовательный синтез веществ Бз и из в], \ Бз с константами скоростей к^, кц и соответственно и отток рассматривае мого метаболита из анализируемого объема е константой ктт, равной констант скорости синтеза метаболитов, минимально необходимой для удвоения клеток ; время генерации (Т). кт,„ равна константе? скорости роста клеток (кипп = (1п2)/Т, в условиях наших экспериментов ктп =0.047). В стационарных условиях роста концентрации всех метаболитов (в дальнейшем размеры пулов и удельные скорости их синтеза постоянны. Скорость синтеза вещества-продукта из вещества-предшественника (в дальнейшем продукты и предшественники) равна потоку этого вещества, регистрируемому по потоку метки из

пула предшественника в пул продукте Таким образом, модель синтеза метаболитов может быть описана в терминах потоков метки. Система уравнений, описывающих эту модель, ее решение приведены в приложении (см. стр. 15). Теоретические кривые, соответствующие изме-нению удельно активности липидов при кт;п=0,047, представлены на рис. 7-10 (штрих-пунктирные кривые 1).

С помощью данной модели были теоретически рассчитаны динамики увеличения удельной активности пуло Б2 - (рис. 8) при добавлении метки пул в) (среда). Для удобства сравнени: размеры пулов приняты близкими по размерам пулам, характерным для исследуемого объекта: Б2 равен размеру предшественника РЕ, вз -пулу РЕ и - пулу РС (см в таблице), а удельная активность метки в среде 10

Рис. 8. Теоретические изменения удельной активности фосфолипидов при инкубации клеток с меткой. 1 -кинетика увеличения удельной активности при константе скорости синтеза, равной константе скорости оттока вещества из пула (ктп,п), 2 -пул Бг, 3 - пул Бз, 4 - пул 84.

:=4530 срт/нмоль Р,) постоянна и равна таковой в экспериментах. Константа юрости синтеза 84 принята равной константе скорости оттока (7стгп), а конс-нты скоростей синтеза пулов Эг и Б3 рассчитаны по уравнению (7). Как видно I рисунка, наличие исходно немеченных предшественников (Эг и Бз) значи-льного размера вызывает снижение скорости увеличения удельной активности гла 84 и появление лаг-фазы (кривая 4), что связано с наступлением изотоп->го равновесия в предшественниках. Пул 82 язляется предшественником Бз и I и имеет кинетику увеличения удельной активности (кривая 2) значительно ше минимально необходимой для удвоения клеток (кривая 1), что связано с топлением метки при протоке вещества через пул для синтеза метаболитов вз 84. Бг не имеет лаг-фазы, так как у его предшественника (среды) постоянная (ельнап активность. Если метаболит имеет исходно немеченный предшествен-1К значительных размеров и также сам является предшественником, то ско->сть увеличения удельной активности возрастает, но появляется лаг-фаза ривая 3). Таким образом, при исследовании метаболических путей клеток с ¡пользованием меченых предшественников скорость включения метки в ;таболиты зависит от величины их предшественников и наличия синтезируе-лх из них продуктов. Метаболит, имеющий большую скорость увеличения (ельной активности, может быть предшественником для метаболитов с мень-ей скоростью. На основе экспериментальных данных (рис. 7) и, исходя из «несказанного, можно сделать заключение, что все фосфолипиды, кроме РА, леют предшественники с переменной удельной активностью (о чем говорит 1личие лаг-фазы), а из сравнения скоростей увеличения удельных активностей жно предположить, что РЕ является предшественником РС и РБ, а РБ -эедшественником РС.

При использовании данной модели для анализа синтеза фосфолипидов клене миксомицета Р. ро1усерНа1ит в экспоненциальной фазе роста константы :оростей синтеза были получены из уравнений (1) - (3), описывающих кинети-1 накопления метки пулов - 84 соответственно, суммарный синтез рассчитан > уравнению (4) и размеры пулов-предшественников - по уравнениям (5) и (6). ги параметры для различных вариантов расчета приведены в таблице.

Определим параметры синтеза РЕ и РС по экспериментальным данным сличения удельной активности (рис. 6), полученным при использовании в шестве предшественника [11С]этаноламина. РЕ не имеет лаг-фазы в начале шетики накопления метки (следовательно, пул предшественника РЕ имеет хггоянную удельную активность) и, исходя из предположения, что РЕ является

Таблиц!

Содержание фосфолипидов клеток Р. ро 1усерНаЫт и расчетные параметры их синтеза.

Вари- Рассчитанные параметры

анты

(нмоль Е, Х2, л3> Л4, Е»

расчета Пул Рл)-(мг белка)-') ерш-(нмоль Рл)-1 час"1 час"1 час"1 (нмоль рл)-(мг белка)"1 (нмоль Р •(мг белка)"'

1 РЕ! 16,0 8996 0,181 - - 42,88 -

РС! 23,2 8996 0,181 0,017 - 5,77 3,4

2 РС2 23,2 4875 0,0093 - - 3,19 -

3 РЕ3 16,0 4557 0,173 0,174 - 41,32 26,5

РС3 23,2 4557 0,173 0.174 0,0130 4,46 2,8

4 РС4 23,2 2270 0,314 0,034 - 11,53 3,2

5 ИЗ! 1,9 4557 0,173 0,174 0,2250 6,33 4,0

6 Рв2 1,9 4571 0,142 0,088 - 2,47 2,2

7 Р1 6,5 4444 1,176 0,134 - 12,93 12,9

Примечание: 1. Параметры синтеза для РЕ1, РС^ и РС2, рассчитаны по кинетикам увеличения удельной активности ['4С1этаноламина, а для РЕд, РС3, РС,, Рй], РБ2 и Р1 - по 2. В приведенных в таблице вариантах при

расчете использовались следующие схемы: 1) в2-».РЕ! ->■ РС1; 2) Эх РС2 3) Э2 РЕ3 РС3; 4) Б2 РС4; 5) Б2 ->. РЕ! РВ1; 6) Э2 -н>- Р82; 7) Э2 -=»- Р1. 3. Л,- - суммарная константа скорости синтеза пула I 4. - Размер анализируемого пула. 5. - суммарный синтез вещества в, за время генерации. 6. .!>,•_] - размер рассчитанного пула предшественника для пула Б;. 12

эедшественпиком РС (вариант 1), синтез РЕ и РС мозкно рассчитывать как улы В2 и Б3 соответственно (см. модель). Расчетная кинетика увеличения цельной активности показывает хорошее совпадение с экспериментальными >чками для РЕ (рис. 6,кривая 1), но отличается для РС (кривая 2, появляется тительная лаг-фаза). Это говорит о том, что метилирование РЕ не является шовным путем синтеза РС. Расчет кинетики РС без учета параметров синтеза Е (вариант 2) дает лучшее совпадение с экспериментом (рис. 6, кривая 3). Дан->ге расчета параметров синтеза представлены в таблице (см. варианты I и 2). уммарный синтез РС за время генерации (см. в таблице для РС варианта 2) >ставляет 14% от величины его пула. Следовательно, посредством метилирова-1я РЕ синтезируется не более 14 % общего количества РС.

Определим параметры синтеза РЕ и РС по экспериментальным кривым включения метки 32Р} (рис. 7). Кинетика увеличения удельной активности РЕ имеет заметную лаг-фазу, что говорит о существовании пула предшественника РЕ значительного размера. Обозначим этот пул тогда РЕ будет Эд. Исходя из предположения, что РЕ является предшественником РС, пул РС будет $4 (вариант 3). Кривые, построенные по рассчитанным коэффициентам, представлены на рис. 9. Видно хорошее совпадение экспериментальной и расчетной кинетик для РЕ (кривая 2). Данные расчета параметров синтеза представлены в таблице (см. вариант 3). Исходя из равенства ■личеств РЕ, синтезированного с ипользованием [14С]этаноламина и ',2Р, (см. X] [Я вариантов 1 и 3), можно сделать вывод, что РЕ синтезируется исключитель-| из этаноламина (поскольку 32Р, включает все пути синтеза РЕ) и за время нерации синтезируется количество РЕ, более чем в 2 раза превышающее [.змер его пула.. Расчетная кинетика для РС дает более продолжительную лаг-1зу с последующим более быстрым увеличением удельной активности (кривая

50

40

8 X Н „

я ^

а д § § 30

9 |

'1120 5 о.

о Й о 8 X

Щ

л 0) й га

10

60

32

Время инкубации с Р.

Рис. 9. Изменение удельной актив->сти РЕ и РС при инкубации клеток

Р; (символы) и теоретически 1ссчитанные кинетики накопления ?тки (линии).

3). Это свидетельствует о том, что РЕ не является основным предшественником РС и путь обмена этаноламина на холин также не является основным путем синтеза РС. Расчет кинетики РС без учета параметров синтеза РЕ (вариант 4) дает лучшее совпадение с экспериментальными данными (кривая 4). В этом случае (см. в таблице вариант 4) удельная активность РС при наступлении изотопного равновесия (см. в таблице Е для варианта 4) в 2 раза ниже, чем у других фосфолипидов и за время генерации синтезируется только половина величины пула РС (11,53 (нмоль Рл)'(мг белка)"1). Но любой внутриклеточный метаболит (в том числе РС и его предшественники) должен, в конечном счете, достигать изотопного равновесия, равного удельной активности среды, что не имеет места в случае РС. Следовательно, в синтез РС вносит вклад другой фосфорилированный предшественник Х-Р (т. к. анализ проводился по включению метки 82Р|), находящийся во внешней среде (поскольку все внутриклеточные метаболиты, включающие 32Р4 в ходе клеточного синтеза, достигают изотог ного равновесия и удельной активности а2Р[). Так как отношения равновесных удельных активностей РС и других фосфолипидов равны 1:2, вклад этого внеклеточного метаболита в синтез РС равен вкладу внутриклеточного метаболита (синтезированного в клетке с участием 32Р;). Эти данные являются примером хемотрофного (сапротрофного) питания миксоми-цета и природа этого внеклеточной предшественника (Х-Р) является объектом дальнейшего исследования.

Проведены аналогичные расчеты параметров синтеза РБ и Р1 по экспериментальным данным. Показано, что РЕ не может быть

предшественником РБ, так как Рис. 10. Изменение удельной актив-

расчетная кривая увеличения

ности Рв при инкубации клеток с 32Р;

удельной активности Р» при (символы) и теоретически рассчитанные введении парамеТров синеза РЕ (с, кинетики накопления метки (линии). в табдице параметры рЕ варианта

3) не совпадает с экспериментальными точками (рис. 10, кривая 2), а размер

ула предшественника не совпадает с размером пула РЕ (см. в таблице вариант ). Расчет с незаданным предшественником дает лучшее совпадение (рис. 10, ривая 3). Последние параметры (см. в таблице вариант 6) показывают, что РЭ е может быть основным предшественником РЕ и РС, поскольку синтез РЭ ревышает величину своего пула только на 33%. Таким образом, остальная асть пула РС (около 36%) может синтезироваться только последним ставшимся из известных путем - через цитидиндифосфат-холшг, оминирующим в клетках эукариот (путь Кеннеди [1962]). РЕ не может быть редшественником Рв, так как расчетная величина пула предшественника РЗ 2,2 (нмоль Рл)'(мг белка)"1) значительно отличается от величины пула РЕ, но орошо совпадает с пулом фосфатидной кислоты, размер которого определен по ключению метки при наступлении изотопного равновесия (2,1 (нмоль Рл)'(мг елка)"1).

Количество Р1 (см. в таблице), синтезированное за время генерации, в 2 1аза превышает величину, необходимую для удвоения клеток, что, видимо, ызвано большой скоростью оборота фосфатидилинозитолфосфатов.

Приложение

Описание математической модели, используемой при исследовании интеза фосфолипидов. В модели приняты следующие обозначения: Рл - липидный фосфор;

5,- - концентрация вещества (размер пула) в}, (нмоль Рл)'(мг белка)"1;

И, - радиоактивность пула I, српт(мг белка)"1;

Х| - удельная радиоактивность пула 1, сргп*(нмоль Рл)"', =

«Т^ - поток вещества в пул Sj иа пула Б; (скорость синтеза вещества пула

из вещества пула в;), (нмоль Рл)-(мг белка)"1-час*1. ^ т1п - отток вещества пула Б), равный минимальной скорости синтеза, необходимой для удвоения пула за время генерации,

(нмоль Рл )-(мг белка)"1 •час"1; к^ - константа потока вещества из в Sj (константа скорости синтеза

вещества из в,), час"1; к^ — к-тт ~ константа скорости оттока вещества из пула Э;, , час"1;

к-тт 33 ^¡„тт/'^и Е - удельная радиоактивность среды, срт'(нмоль Р,)"';

Т - время генерации, час;

Sj - пул с постоянной удельной активностью метки. Изменение радиоактивности пулов веществ, описывается следующей системой дифференциальных уравнений: dR[/dt = О (R[ const) dR2/dt =Jl2X1-(J2,ni]1 + J23)X2 dR3/dt =Л2зХ2-(.Ь dR4/dt : Jm XV' J4,inui X4 С учетом начальных условий (при t=0 Х2==Хз=Х4=0) и постоянства размеров пулов (то есть i читок равен оттоку: Jj2 ~ -'2min + -'23. J23 — J3lIun + J34, J34 = J4mm) решением данной системы является следующая система уравнений: .Г, -- Е

Л'2=£( 1-ё^') (1)

IА', = Я[1 - ае~Хг' - (1 - ] (2)

I Л'4 - ¿'(1 - aye U - Д1 - а)е~Л>1 - [1-й/- /0(1 - й)]^"'} (3)

а____. ___у ^ .

Яз - Л2 A4 — Л3 - Ло

Л; = ^min + кг$\ Аз " kmin + k3i) Л4 ' kmin; Суммарный синтез вещества S, за время генерации равен:

V; - ЛЛ-Т. (4)

Размеры пулов предшественников:

для пула S3: Л'2 = - fclran); (5)

для пула S4'. S3 ~ Л.^/- /с^п).

(6)

Для расчета теоретического изменения удельной активности пулов определенных размеров S2, S;j и S4 констаны скоростей синтеза равны: = fcmm. Aü " ¿АЛ'-'з + fcmm и Л2 - A3S3/S2 + к^п- (7)

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены периодические изменения содержания и скорости биосинтеза фосфолигшдов в ходе клеточного цикла. Показано повышение удельного содержания фосфолигшдов почти в 2 раза в первой половине цикла - в фазе S и начале G2 фазы. На протяжении G2 фазы содержание их практически hi меняется, и с конца G2 фазы и до начала следующей S фазы наблюдается

адение содержания фосфолипидов до исходного уровня. Отношение среднего удержания фосфолипидов в ходе клеточного цикла РС:РЕ:РГ равно ,4:1,0:0,4.

корость включения метки 52Р( в фосфолипиды отражает изменение их эдержания в различных фазах клеточного цикла, Отношение средних дельных активностей меченых фосфолипидов за время цикла РС:РЕ:Р1 • авно 0,17:1,0:2,5.

( начале Б2 фазы наблюдается резкое повышение содержания продуктов идролиза фосфатидилинозитолов - инозитолди- и трифосфатов, что может видетельствовать о формировании сигнала, регулирующего пролифератив-ую активность, икозитольной сигнальной системой.

1редложена модель, которая позволяет по кинетике увеличения удельной ктивности фосфолипидов определять истинные параметры скоростей синтеза еществ предшественников и продуктов и размеры их пулов в цепи синтеза 1етаболитов.

1оказано, что: а) РЕ синтезируется исключительно из этаноламина; б) около 4 % РС синтезируется путем метилирования РЕ и около 50% - с использова-[ием экзогенного фосфорилированного предшественника Х-Р; в) наиболее ероятный путь синтеза РЭ - из РА через цитидиндифосфат-диацилглице-)ол; г) за время генерации синтезируется в 2 раза большее количество Р1 и 5Е, чем необходимо для удвоения количества биомассы. Это говорит о юльшой скорости обмена Р1 (за счет фосфатидилинозитолфосфатов, :интезируемых из Р1) и большой скорости утилизации РЕ.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах: йакаг<ж, Р.И., ЯсЛаги, У.К., РоИе'/а, Я.А., апс! Evtodienko, Уи.У. (1994.) FEBS 'лН., 344, 47-49.

Макаров П.Р., Ротару В.К., Полтева Н.А., Евтодиенко Ю.В. (1995) Тез. докл. VI ¡импозиума по биохимии липидов, изд-во Москва, с. 61-62. Макаров П. Р., Полтева Н. А., Юрков И. С. (1997) Пути синтеза фосфолипидов мембран миксомицета Ph.ysa.rum ро1усерЬхйит. Биохимия, дрчнята к почти», 6*2, ¿{'Р-2.53",