Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль цитокинов, имеющих общую Y-цепь рецепторов (IL-2, IL-7, IL-15), в регуляции функциональной активности T-лимфоцитов

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитокинов, имеющих общую Y-цепь рецепторов (IL-2, IL-7, IL-15), в регуляции функциональной активности T-лимфоцитов"

9 15-3/128

На

правахрукрг,

Сохоневич Наталия Александровна

РОЛЬ ЦИТОКИНОВ, ИМЕЮЩИХ ОБЩУЮ У-ЦЕПЬ РЕЦЕПТОРОВ (1Ь-2,1Ь-7,1Ь-15), В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2015

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта"

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Литвинова Лариса Сергеевна

Официальные оппоненты:

Колобовникова Юлия Владимировна

доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России

Хайдуков Сергей доктор биологических наук, старший научный

Валерьевич сотрудник отдела «Научно-инновационный цетр

Технопарк» ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (г. Санкт-Петербург)

Защита состоится 2015г. в уУ ч на заседании диссертационного

совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России и на сайте http://www.ssmu.ru

Автореферат разослан «/^» ¿ЛОЛЛ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова Ирина Викторовна

I Российская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ: ПСТВЗННЭЯ

- блиотека

Актуальность темы исследования. Современные исследования, посвященные ключевым вопросам физиологических механизмов иммунного контроля, сосредоточены, в основном, на изучении молекулярных и клеточных аспектов регуляции иммунной памяти (Radbruch A., Thiel А., 2004; Селедцов В.И. и др., 2010; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014). Клеточной основой иммунологической памяти являются селективная экспансия и дифференцировка клонов антиген-специфических В- и Т-лимфоцитов. Исследование структурно-функциональных свойств Т-клеток и анализ экспрессии их поверхностных маркеров позволяют выделять «наивные» лимфоциты, Т-клетки иммунной памяти и эффекторы (Sprent J.. Surh C.D., 2001; Селедцов В.И. и др., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2013). Наивные Т-лимфоциты проходят антиген-независимую дифференцировку (позитивная и негативная селекция) в тимусе, после которой появляются в периферическом кровотоке как зрелые наивные клетки. После антигенной стимуляции наивные Т-лимфоциты дифференцируются в периферических лимфоидных органах в эффекторные Т-клетки, а затем некоторые из них становятся Т-клетками памяти. Т-лимфоциты памяти долговечны и способны к дальнейшей дифференциации и пролиферации, чтобы стать эффекторными клетками при повторном контакте с антигеном (Sprent J., Surh C.D., 2001; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong С. et al., 2014).

Степень проработанности темы. В настоящее время признано существование четырех основных событий во время иммунного ответа: инициация, клональная экспансия, контракция/сжатие и образование пула Т-клеток памяти с дальнейшим поддержанием их численности за счет гомеостатических механизмов (Boyman О. et al. 2007; Rochman Y. et al., 2009; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong C. et al., 2014). Иммунная система, на основе гомеостатических механизмов, адаптируется к изменяющимся требованиям, возникающим в ходе стационарного существования и, особенно, при активации агентами инфекционной и неинфекционной природы (Ярилин A.A., 2010). Важными характерологическими особенностями лимфоцитов, ответственных за иммунную память, являются: 1) сохранение численного постоянства пула Т-клеток иммунной памяти in vivo (путем регуляции баланса процессов генерации, поддержания жизнеспособности и их гибели в организме в отсутствие антигенного стимула); 2) обеспечение ускоренной иммунной реакции на повторное антигенное воздействие (Geginat J. et al., 2002; Schluns К.S., Lefrançois L„ 2003; Luckey C.J. et al., 2006; Boyman O. et al. 2007; Rochman Y. et al.. 2009; Mahnke Y.D. et al., 2013; Gong C. et al., 2014).

Сущность ответной иммунной реакции организма на различные агенты инфекционной и неинфекционной природы определяется процессами пролиферации, дифференцировки и программированной гибели, которым подвергаются лимфоциты, как основные участники иммунного ответа. В ходе активационного (дифференцировочного) процесса на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются молекулы активации (ранней и поздней), пролиферации, дифференцировки и апоптоза (Кудрявцев И.В., 2014; Литвинова Л.С. и др., 2014; Chang J.T. et al., 2014; Farber D.L. et al., 2014). Одним из перспективных направлений в изучении физиологических основ иммунного ответа является поиск, оценка и последующее определение роли наиболее значимых поверхностных антигенов, экспрессирующихся на имунокомпетентных клетках, в реализации нормального иммунного ответа и при патологии.

Цитокины семейства I типа (IL-2, IL-4,1L-7,1L-9, IL-15 и IL-21), имеющие общую у-цепь. способны оказывать комплексное воздействие на клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки (Литвинова Л.С. и др., 2013; Yamane Н„ Paul W.E.. 2013; Färber D.L. et al., 2014; Lee В.. Hong С., 2015; Schmitt N„ Ueno H„

2015). Весьма вероятно, что действие некоторых цитокинов на Т-клетки носит дозозависимый характер, определяется типом клеток-мишеней и их функциональным статусом (степенью дифференцировки, функциональной активностью, состоянием рецепторного аппарата клетки). Учитывая это обстоятельство, одни и те же цитокины могут проявлять разнонаправленные эффекты на «наивные» клетки-предшественницы и Т-клетки иммунной памяти (Литвинова Л.С. и др.. 2013; Tkach К.Е. etal., 2014; SchmittN., Ueno H„ 2015).

В связи с вышесказанным, щелью настоящего исследования явилась комплексная оценка эффектов цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (1L-2,1L-7 и IL-15), на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих процессы активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза, в разных условиях культивирования in vitro

Задачи исследования:

1. Изучить влияние цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (1L-2, 1L-7 и IL-15), на процессы дифференцировки CD4+ и CD8+ популяций CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro.

2. Оценить эффекты ус-цитокинов (IL-2, 1L-7 и 1L-15) на процессы активации и пролиферации CD4+ и CD8+ популяций CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro.

3. Исследовать действие цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, 1L-7 и 1L-15). на позднюю активацию и апоптоз CD4+ и CD8+ Т-клеток в CD45RA- и CD45RO- культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей культивирования in vitro.

4. Установить общие закономерности и особенности влияния цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, 1L-7 и IL-15), на функциональную активность Т-клеток. в зависимости от степени их дифференцировки и условий культивирования in vitro.

Научная новизна. Впервые показано, что влияние in vitro цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на гомеостаз Т-клеток определяется степенью их дифференцировки (наивные лимфоциты, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и функциональным состоянием, фенотипически выражающимся изменением спектра поверхностных молекул активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза. Приоритетными являются данные, свидетельствующие, что в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro ус-цитокины (IL-2, IL-7 и IL-15), в разной степени, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ наивных клеток (TN) и CD4+ и CD8+ Т-клеток с фенотипом центральной памяти (Тсм) в эффекторные клетки разной степени зрелости. Впервые установлено, что эффекты ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD45RA+CD4+ и CD45RA+CD8+ Т-клеток (ассоциированные с экспрессией молекул - CD69 и CD25), в гомеостатической модели культивирования и на фоне TCR-стимуляции in vitro, имеют однонаправленный характер, но разную степень выраженности. Выявлено, что CD45RA+CD4+ Г-лимфоциты, в сравнении с CD45RA+CD8+ Т-клетками, менее чувствительны к пролиферативному действию ус-цитокинов. Приоритетными являются данные, что в гомеостатической модели культивирования in vitro CD45R01CD4+ Т-лимфоциты обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию цитокинов, в сравнении с CD45R0+CD8+ Т-клетками. В активационной модели in vitro, напротив, CD45R0+CD8+ Т-клетки демонстрируют меньшую чувствительность к активирующим и пролиферативным эффектам ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15). Впервые выявлено, что эффекты ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на экспрессию

молекулы CD95 (Fas/APO-1) CD4+ и CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток имеют разную направленность и разную степень выраженности. В гомеостатической и активационной моделях 1^льтивирования in vitro, ус-цитокины способствуют росту числа CD3 CD8 CD95 Т-клеток в популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (ТСм), тогда как экспрессия молекулы CD95 эффекторными CD8+ Т-клетками (CD62L") а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется. Показано, что в CD4+ и CD8+ популяциях эффекгорных (CD62L") CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, более 99% лимфоцитов с фенотипом - CD3*HLA-DR+, экспрессируют маркер CD95. Однако не все СВ95-позитивные Т-лимфоциты несут на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. Опосредованное влиянием цитокинов повышение содержания CD3+HLA-DR+CD95+ клеток в CD4+ и CD8+ популяциях эффекторных (CD62L-негативных) CD45RA- и CD45RO- Т-лимфоцитов, может свидетельствовать о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток под действием ус-цитокинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разнонаправленное влияние цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на гомеостаз CD4+ и CD8+ популяций Т-клеток определяется степенью их зрелости (наивные, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями культивирования in vitro (гомеостатическая и активационная модели), что фенотипически выражается изменением спектра поверхностных молекул активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза.

2. Цитокины, имеющие общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), в гомеостатической и активационной моделях in vitro культивирования, способствуют дифференцировке наивных CD4 и CD8 Т-клеток (TN) и CD4 и CD8 Т-клеток с фенотипом центральной памяти (ТСм) в незрелые и/или зрелые эффекторные Т-клетки (ТЕМ, Temra).

3. Эффекты ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации и пролиферации CD4+ и CD8+ популяций Т-клеток носят разнонаправленный характер, который определяется стадией их дифференцировки (наивные, Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями in vitro культивирования.

4. Экспрессия молекул HLA-DR и CD95 эффекторными популяциями (CD3+CD4+/CD8+CD62L ) CD45RA+ и CD45RO+ T-кпеток является фенотипическим признаком терминальной фазы дифференцировки и созревания Т-лимфоцитов. CD4+ и CD8+ эффекторные клетки (CD62L"), а также CD8+ Т-клетки центральной памяти (Тем), конститутивно экспрессируют молекулу CD95 на своей мембране.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые аспекты влияния цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на функциональную активность Т-клеток, ассоциированную с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих процессы активации, пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоз, лежащие в основе формирования первичных и вторичных иммунных реакций. Практическая значимость полученных данных о цитокинопосредованном контроле функциональной активности Т-клеток, в условиях гомеостатической и антигеннезависимой (TCR) - стимуляции, может представлять интерес для расшифровки фундаментальных иммунных механизмов генерации иммунной памяти, с одной стороны - как основного звена формирования и поддержания протсктивной противоинфекционной и противоопухолевой защиты, с другой - реализации аутоиммунной патологии. Результаты настоящего исследования могут быть положены в основу разработки технологии управления процессами клеточного гомеостаза и функциональным состоянием Т-клеточного звена с применением биомолекул (цитокинов).

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедрах фундаментальной медицины медицинского института БФУ им. И. Канта и кафедре молекулярной физиологии и биофизики химико-биологического института БФУ им. И. Канта г. Калининграда.

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны высокоинформативные методы исследования, которые выполнялись на базе современной научно-исследовательской лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Инновационного парка БФУ им. И. Канта. В качестве материала исследования использовали первичные культуры CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов, полученные из взвеси мононуклеарных клеток периферической венозной крови здоровых доноров.

Основные методы исследования:

1. Иммуномагнитная сепарация (получение монокультур CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов из взвеси мононуклеарных клеток здоровых доноров);

2. Культуральные методы исследования in vitro;

3. Оценка жизнеспособности CD3+CD45RA+ и CD3+CD45RO+ Т-клеточных культур и определение поверхностных маркеров (CD45RA; CD45RO; CD3; CD4; CD8; CD69; CD25; CD71; CD95; HLA-DR; CD62L и CD27) на Т-клетках, методом проточной цитофлюориметрии;

4. Статистический анализ результатов.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов (иммуномагнитная сепарация, культуральные методы исследования, проточная цитофлуориметрия) и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (г. Санкт-Петербург, 2011, 2012, 2013 гг.); международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» (г. Москва, 2013, 2015 гг.); III-ей Международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Fundamental and applied research in biology 3rd international scientific conference) (Украина, г. Донецк, 2014 г.); Международной научно-практической конференции «Перспективы развития науки и образования» (г. Москва, 2013, 2015 гг.); объединенном иммунологическом форуме (г. Нижний Новгород, 2013 г.); международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (г. Москва, 2015 г.); XII конференции иммунологов Урала (г. Пермь, 2015); XV всероссийском научном форуме с международным участием им. Акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2015), а также на научно-образовательных семинарах на базе Лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Балтийского Федерального Университета им. И. Канта (г. Калининград, 2012-2015). В работе приводятся результаты научно-исследовательских работ «Исследование молекулярно-биологических механизмов модуляции иммунологической памяти в норме и при аутоиммунной патологии» (ГК №П1252 от 27 августа 2009 г.); "Стероидная регуляция иммунной памяти» (Грант Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - докторов наук (МД-4999.2012.7); «Разработка технологии дозозависимого управления процессами клеточного гомеостаза и функциональным состоянием Т-клеток памяти с применением биомолекул (цитокинов)» (Соглашение 14.132.21.1778 от 01.10.12 г.); «Исследование влияния иммунорегуляторных цитокинов на регуляцию процессов активации, дифференцировки и самоподцержания Т-клеток иммунной памяти» (СП-454.2013.4 2013-2015гг. от 28.02.2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 8 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ и 12 статей и тезисов в материалах конференций и симпозиумов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 432 источника (44 - отечественных и 388 -иностранных). Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна и планировании исследования. Результаты получены, проанализированы и обобщены в выводах и положениях автором лично.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В основу работы положены результаты комплексного исследования 58 здоровых доноров (29 мужчин и 29 женщин в возрасте от 22 до 35 лет). Критериями исключения из исследования являлись: возраст моложе 18 и старше 35 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; инфекционные, онкологические, аутоиммунные, наследственные и психические болезни; алкогольная и наркотическая зависимости. Материалом для исследования служила венозная кровь (20 мл), взятая из локтевой вены с помощью стандартных вакуумных систем "BD VACUTAINER ТМ" («Greiner-bio-one», Австрия), стабилизированная К3ЭДТА. Разрешение на проведение исследования получено в локальном этическом комитете (№ 5 от 5 ноября 2013 г.). Все экспериментальные исследования проводились на базе лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий Инновационного парка БФУ им. И.Канта (зав. лабораторией - д-р мед. наук, Л.С. Литвинова).

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования, нами были использованы разные модели in vitro культивирования: гомеостатическая и активационная. Последняя отражает процесс взаимодействия Т-лимфоцитов разной степени дифференцировки с антиген-презентирующими клетками (активация Т-клеток через CD2, CD3 и CD28).

Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови осуществляли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урогрофин («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см3). Полученную взвесь мононуклеарных клеток доводили фосфатно-солевым буфером (с 0,5% BSA «Miltenyi Biotec», Германия) до 1 мл и в дальнейшем использовали для выделения фракций CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации (ИМС), в основе которого лежит технология MACS® («Miltenyi Biotec» Германия). Подсчёт клеточности в культурах Т-клеток разной степени дифференцировки проводили с помощью автоматического счётчика клеток (Countess Automated Cell Counter, «Invitrogen», США) с использованием красителя Trypan blue 0,4% («Invitrogen», США). Жизнеспособность составляла не менее 95-98% от общего числа клеток. В эксперименте использовали клеточные культуры, содержание CD3"CD45RA+CD 14CD19" и CD3+CD45RO+CD14' CD 19" клеток в которых, составляло, в среднем 97,5 ± 2,12%. Полученные культуры клеток с фенотипом - CD45RA+ и CD45RO* (1,0x106 кл/мл) культивировали в 48-луночном планшетах в бессывороточной среде Пскова («Sigma-Aldrich», США), содержащей 0.5% сывороточного альбумина человека («Микроген», Россия), 5* 10'5 M Р-меркаптоэтанола («Acros Organics», США) и 30 мкг/мл гентамицина в течение 24 и 48 ч при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. В эксперименте были использованы разные концентрации рекомбинантных форм цитокинов - IL-2.1L-7, IL-15 и клеточный активатор («Miltenyi Biotec», Германия). В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали реагент T-Cell Activation/Expansion Kit human (Ас/Exp)

(«Miltenyi Biotec», Германия) - антибиотиновые частицы MACSiBead™ с биотинилированными антителами против CD2+, CD3+, CD28+ человека

Для выполнения исследования были использованы следующие варианты культивирования: для гомеостатической модели: интактная проба; пробы с добавлением разных концентраций цитокинов: rlL-2/rIL-7 или rlL-15 (0,1 - 0,5 - 1,0 нг/мл); для активационной модели: интактная проба; проба с добавлением Т-клеточного активатора - Ас/Exp; пробы с добавлением разных концентраций цитокинов: rIL-2/rIL-7 или rIL-15 (0,1 - 0,5 -1,0 нг/мл) и Т-клеточного активатора.

Регистрацию жизнеспособности и подсчёт числа клеток в исследуемых клеточных культурах проводили с использованием реагента «GuavaViaCount» (Millipore, США) и одноименной программы, методом проточной лазерной цитометрии на проточном цитометре «GuavaEasyCite Plus» (Millipore, США), согласно протоколу производителя. Определение поверхностных маркеров: CD4, CD8, CD69, CD25, CD71, CD95, HLA-DR, CD62L, CD27 на CD45RA+ и CD45RO+ Т-клетках оосуществляли методом проточной цитометрии с использованием коктейлей моноклональных антител («eBioscience», США; «Abcam», Великобритания; "Miltenyi Biotec'', Германия), приготовленных ex temporo:

CD45RA или CD45RO-APC/CD3- Viablite/CD4-FlTC/CD8-PerCp. Су 5.5/CD62L-PE/CD2 7-РЕ.Су7;

CD45RA unu CD45RO-APC/CD3- Viabiue/CD4-FITC/CD8-PerCp. Су5.5/CD69-PE; CD45RA или CD45RO-APC/CD3-Viablue/CD4-PE.Cy7/CD8-PE/CD25-FITC; CD45RA или CD45RO-APC/CD3-Viablue/CD4-PECy7/CD8-PE/CD7J-FITC; CD45RA или CD45RO-APC/CD3-ViabIue/CD4-PE.Cy7/CD8-PerCp.Cy5.5/HLA-DR-FITC/ CD62L-PE;

CD45RA или CD45RO-APC/CD3- Viablue/CD4-PE. Cy7/CD8-PerCp. Су5.5/CD95-F1TC/CD62L-PE;

CD45RA или CD45RO-APC/CD3- Viablue/CD4-PE. Cy7/CD8-PerCp. Су5.5/HLA-DR-FITC/ CD62L-PEJCD95- APC-1 ю770.

Регистрацию результатов проводили на проточном цитофлуориметре MACS Quant ("Miltenyi Biotec", Германия). Данные цитометрического анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences). Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез (Кремер Н.Ш., 2004). При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: для нормально распределенных выборок вычисляли среднее арифметическое ( X), ошибку среднего (m); для выборок, распределение которых отличалось от нормального: медиану (М), первый и третий квартили (Q,. Оз)- Для оценки достоверности различий выборок, использовали параметрический (t-критерий Стьюдента) или непараметрический (Вилкоксона) для зависимых выборок. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный и регрессионный анализы. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 (Кремер Н.Ш., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка влияния цитокинов, имеющих общую у-цепьрецепторов (1L-2, IL-7 и 1L-15), на процессы дифференцировки CD4 и CDS Т-теток в CD45RA и CD4SRO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей in vitro

В контрольных образцах С D45 ЯАт-культур распределение по основным популяциям было следующим: число Т-клеток с «наивным» фенотипом (TN) -CD4+/CD8+CD27+CD62L - было равным 95,49 (79,79 - 96,28) и 64,49 (36,60 - 75,08)%; содержание зрелых эффекториых клеток (Temra. Е) - CD4+/CD8+ CD45RA+CD27" CD62L" составило - 2,36 (1,16 - 3,44) и 23,42 (13,79 - 45,76)%, соответственно; число Т-клеток с фенотипом незрелых «ранних» Temra Т-лимфоцитов (CD8+/CD4+CD45RA+CD27+CD62L~) составило 0,66 (0,43-1,58) и 4,91(4,33-5,91)%, соответственно, что, в целом, не противоречит данным литературы (Rufer N. et al., 2003; Sallusto F. et al., 2004; Di Mitri D. et al., 2011; Кудрявцев И.В., 2014; Chang J.T. et al., 2014).Число CD45RA+CD27"CD62L+ клеток в контрольных пробах CD4+ Т-клеток было в 4 раза ниже, чем в CD8+CD45RA+-nonynHurax Т-клеток. Предполагают, что эта популяция представляет собой прямой переход от наивных (CD45RA+CD27+CD62L+) Т-клеток в терминально-дифференцированные эффекторы (CD45RACD27) (Temra), на которых, однако, сохраняется экспрессия молекулы CD62L.

IL-2 - плейотропный цитокин, играет важную и сложную роль в регуляции функций иммунокомпетентных клеток (Stittrich А.В. et al., 2010). Выступая в качестве основного фактора роста Т-лимфоцитов, IL-2 поддерживает антигензависимую дифференцировку и пролиферацию разных клеточных субпопуляций, а также является регулятором апоптотической гибели клеток, опосредованной активацией, ограничивая, тем самым, чрезмерные иммунные реакции (Letourneau S. et al., 2009; Liao W. et al., 2011, 2013). Добавление rIL-2 (1,0 нг/мл) в CD45RA+ - культуры приводило к повышению числа незрелых (СD45 RA' СD27' СD62L") и зрелых (CD45RA+CD27"CD62L ) ' emra 1-клеток в CD4+ популяциях, в целом, за счет снижения содержания Т-лимфоцитов с наивным фенотипом CD4+CD45RA+CD27+CD62L+. Действие rIL-2 (0,1-1,0 нг/мл) на CD8+ популяцию сопровождалось равномерным увеличением числа только зрелых эффекторных Temra Т-клеток. rIL-2 (1,0 нг/мл) индуцировал образование цитотоксических Т-клеток центральной памяти (CD45RA"CD62L+CD27+, ТСм) (рисунок 1).

Выявленное нами, IL-2-опосредованное повышение числа CD4 и CD8' Т-лимфоцитов с фенотипом CD45RA CD62UCD27 (Е) в культурах CD45RA' Т-клеток, на фоне снижения содержания лимфоцитов с наивным фенотипом, позволяет предположить факт прямой дифференцировки наивных Т-клеток в эффекторные. Этот тезис подтвержден наличием взаимосвязей между содержанием зрелых Temra (CD45RA+CD62L"CD27~) Т-клеток и числом лимфоцитов с наивным фенотипом (TN) (г= - 0,67, г= - 0,70, р<0,05 для CD45RA+CD8+ Т-клеток при действии IL-2 (0,5-1,0 нг/мл) и г= - 0,856 р<0,05 для CD45RA+CD4+ Т-клеток при действии IL-2 (1,0 нг/мл), соответственно).

Рисунок 1 - Влияние ус-иитокинов (rIL-2, rlL-7 и rlL-15) на дифференцировку и созревание CD4 /CD8 Т-клеток в популяции CD45RA Т-лимфоцитов в гомеостатической модели in vitro

IL-7 и IL-15. наряду с IL-2, принадлежит важная роль в процессах врожденного и адаптивного иммунитета (Nishimura H. et al.. 2000; Fehnieer T.A., Caligiuri M.A., 2001; Chen J. et al., 2013; LeeN. et al., 2014; Marçais A. et al., 2014).

Увеличение числа зрелых (CD8+CD27"CD62L) TEMRA эффекторов регистрировалось только при добавлении максимальной концентрации rIL-7 (1,0 нг/мл). Перераспределение субпопуляционного состава эффекторных CD8+ Т-клеток регистрировалось на фоне снижения числа Т-лимфоцитов с незрелым эффекторным (CD8+CD27+CD62L ) фенотипом и не затрагивало наивные Т-клетки. Возможно, что действие цитокина на CD81 Т-лимфоциты может быть обусловлено способностью IL-7 активировать продукцию IL-2 Т-клетками, который, действуя аутокринно и паракринно, может способствовать дифференцировке и созреванию Т-клеток в «эффекторы», для которых характерна потеря экспрессии молекул хоуминга и костимуляции (Бойчук C.B., Дунаев П.Д., 2008; Bayer A.L. et al., 2013). CD4f субпопуляция CD45RA+ Т-клеток была нечувствительна к действию rIL-7. In vivo, наивные покоящиеся Т-клетки получают сигналы низкого уровня через контакт с IL-7 и молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые позволяют клеткам выживать в течение длительного времени в состоянии покоя, не подвергаясь антигеннезависимой дифференцировке (Sprent J., Surh C.D., 2002; Boyman О. et al. 2007; Ярлин A. A., 2010; Le Campion A. et al., 2012).

Действие IL-15 на CD8+CD45RA+ Т-клетки, в целом, было схожим с rIL-2. Добавление rIL-15 (0,5-1,0 нг/мл) в среду культивирования приводило к повышению числа CD45RA+CD8+CD27"CD62L" и ÇD45RACD8XD27+CD62L Т-клеток на фоне снижения CD45RAfCD8+CD27+CD62L+. rIL-15 (1,0 нг/мл) индуцировал повышение числа CD4+CD27'CD62L+ Т-клеток (рисунок 1). Данные научной периодики в отношении действия IL-15 на дифференциоовку Т-клеток. крайне противоречивы (Alves N.L. et al., 2003; Wallace D.L. et al., 2006). Liu К. и др. (2002) было установлено, что IL-15 имитируя связывание с TCR, приводи т к индукции клеточной пролиферации и повышению цитотоксической активности CD8+ Т-клеток (Liu К. et al., 2002).

Добавление активатора в культуры CD45RA1 Т-клеток сопровождалось ростом числа ТЕМ в популяциях CD4+ и CD8' Т-клеток за счет снижения содержания наивных Т-лимфоцитов. Активация приводила к резкому снижению числа CD8+ Temra эффекторов (в среднем, на 30%), что может быть обусловлено их гибелью, опосредованной крайней чувствительностью к дисбалансу инициирующих сигналов (Di Mitri D. et al., 2011; Libri V. et al., 2011), и, напротив, к росту содержания CD27" CD62Lf Т-клеток в CD4 и CD8* популяциях CD45RA' Т-клеток.

Инкубация CD45RA' Т-клеток с rIL-2 (1,0 нг/мл) и rIL-15 (0,5 нг/мл), сопровождалась увеличением (по сравнению с пробой только с добавлением активатора) зрелых цитотоксических Temra эффекторов (р<0,05) (рисунок 2).

rlL-2, rlL-15/Exp ""II.-2, rlL-15/Exp

Рисунок 2 - Влияние уопитокинов (rlL-2, rlL-7 и rIL-15) на дифференцировку и созревание CD4 /CD8 Т-клеток в популяции CD45RA Т-лимфоцитов, в активационной модели in vitro

Обнаруженная нами взаимосвязь между содержанием зрелых Temra эффекторов и наивных CD8* Т-клеток может свидетельствовать об цитокин-опосредованной

дифференцировке TCR-активированных клеток (г=0,60, р<0,05 при действии IL-2 (1,0 нг/мл) и г= - 0,72 р<0,05 при действии IL-15 (0,5 иг/мл), соответственно). В субпопуляции TCR-активированных CD4+ Т-клеток, эффекты rIL-2 и rIL-15 (1,0 нг/мл), напротив, были направлены на снижение числа CD45RA+CD4+CD27" CD62L" Т-клеток, что может быть связано с их повышенной гибелью (Sallusto F. et al., 2004; Кудрявцев И.И., 2014). Сочетанное действие активатора и rIL-7 (1,0 нг/мл) сопровождалось появлением в CD4+/CD8+CD45RA+ популяциях ТСм лимфоцитов, за счет снижения числа Т-клеток с наивным фенотипом, что подтверждают обнаруженные нами корреляционные взаимосвязи между содержанием Тсм и TN (г= - 0,55 и г= - 0,60, р<0,05 для CD45RA+ CD4+/CD8+ Т-клеток при действии 1,0 нг/мл rIL-7).

На момент окончания срока инкубации (48ч), число центральных Т-клеток памяти с фенотипом CD3+CD4+/CD8+CD62L CD27+ (Тсм) в интактных популяциях CD45RO+ Т-клеток составило 54,12 (49,02 - 58,66) и 21,19 (20,76 - 27,24)%; незрелых эффекторных клеток CD3+ CD47CD8+CD62L"CD27' (для CD45RO+CD8+ лимфоцитов: ТЕМ: Eml; Ет2) - 10,36 (8,07 - 13,26) и 31,90 (28,51 - 42,48)%, а зрелых эффекторов -CD3+CD4+/CD8+CD62L CD27" (для CD45RO+CD8+ лимфоцитов ТЕМ: ЕшЗ: Еш4) - 18,47 (18,28-20,16) и 34,90 (32,51 - 39,48)%. Также в популяциях CD4+/CD8 CD45RO' Т-лимфоцитов нами были обнаружены клетки с фенотипом - CD3+CD8+CD62L+CD27" (предположительно - эти клетки могут рассматриваться в качестве переходной формы между ТСм и Тем. индуцируемые in vitro). Эффекты rIL-2, rIL-7 и rIL-15 (1,0 нг/мл) in vitro на культуры CD45RO CDS' Т-клеток были ассоциированы с увеличением числа зрелых эффекторных Т-лимфоцитов с фенотипом - CD62LCD27" (Теш: ЕшЗ и Ет4) и CD45RO CD62L CD27" Т-клеток (Temra. Е). Все изменения регистрировались на фоне снижения содержания ТСм и ТЕМ (Eml и Ет2) Т-клеток (рисунок 3).

Рисунок i - Влияние ус-цитокинов (rlL-2, rlL-7 и rlL-15) на дифференцировку и созревание CD4 /CD8 Т-клеток в популяции CD45RO Т-лимфоцитов в i омеостатической модели in vitro

Нами были выявлены отрицательные ассоциации между числом CD84CD62L+CD27+ Т-клеток и содержанием CD8'CD62L/CD27" (Tem: ЕтЗ и Ет4) Т-лимфоцитов (г= - 0,70 и г= - 0,65, р<0,05 при действии rlL-2 и rIL-15 (1,0 нг/мл), соответственно); между содержанием CD8 CD62L CD27 Т-клеток и CD45RO" CD8'CD62L"CD27" (i= - 0,83, р<0,05 при действии rIL-2 (1,0 нг/мл), соотвегственно); а также между количеством CD8+CD62L"CD27+ Т-клеток содержанием CD8+CD62L" CD27" лимфоцитов (г= - 0,56 и г= - 0,70, р<0,05 при действии rIL-2 и rIL-15 (1,0 нг/мл), соотвегственно). В CD45RO+CD4+ - популяции, IL-2 (1,0 нг/мл) способствовал повышению числа CD45ROfCD62L"CD27" Т-клеток на фоне снижения содержания незрелых эффекторов - СD45RO'CD4' СD62L/CD27' (г= - 0,80, р<0,05). Интересно, что действие rIL-7 (1,0 нг/мл) на CD4'CD45RO+ Т-клетки индуцировало образование популяции незрелых TE^RA Т-клеток, в целом, за счет снижения содержания ТСм (г= -0,58, р<0,05). CD45RO CD4' Т-клетки бьши нечувствительны к действию rIL-15

(рисунок 3). Феномен дифференцировки in vivo Т-лимфоцитов памяти в эффекторные Т-клетки памяти и терминально-дифференцированные С045У1А-иозитивные Т-клетки (Temra)í под действием цитокинов, широко представлен в мировой литературе (Silva de Azevedo R.I., 2011; Кудрявцев И.В., 2014).

Добавление TCR-активатора в CD45RO - культуры, сопровождалось ростом содержания зрелых цитотоксических эффекторных Т-клеток (CD62LCD27") и TEmra (CD45ROCD62LCD27) Т-лимфоцитов на фоне снижения числа CD62L+CD27+ (Тш) Т-клеток. Выявленные взаимосвязи между содержанием CD62LCD27" (ТЕМ) и CD45RO"CD62L"CD27"(E) Т-клеток и числом CD62L+CD27+ Т-лимфоцитов (г= - 0,60 и г= - 0,70, р<0,05, соответственно) может свидетельствовать о дифференцировке центральных цитотоксических Т-клеток памяти в эффекторные лимфоциты. В популяции CD45ROtCD4+ Т-клеток, добавление in vitro активатора, напротив, приводило к повышению содержания незрелых эффекторных Т-клеток (рисунок 4).

rlL-2, rlL-7, rlL-15/Exp

CD45RO*CD27CD62' (TFM,Em3¡ F.m4) CD45RO*CD27*CD62 (Тем: Enil; Em2) CIMSROCD27CD62 (T«™».E)

CD4SRO+CD27*CD62*(Tcm)

rIL-2, rIL-7/Exp

_^.f CD45RO*CD2TCD62(TtM)

I CD45RO*CD27*CD62

"(T™)

н/ч

rll.-15/Kxp

Рисунок 4 - Влияние ус"ЦИТОКИНов (rIL-2, rlL-7 и созревание CD4 /CD8 Т-клеток в популяции CD45RO модели in vitro

rlL-15) на дифференцировку и Т-лимфоцитов в активационной

Инкубация TCR-активированных CD8+CD45RO+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-15 (0,5 - 1,0 нг/мл) а также с rIL-7 (1,0 нг/мл) приводила к дифференцировке и созреванию цитотоксических Т-лимфоцигов в эффекторные Т-клегки, фоне снижения содержания Тем (рисунок 4). Нами были выявлены отрицательные корреляции между содержанием CD8 CD62L CD27' Т-клеток и числом CD8+CD62L+CD27+ Т-лимфоцитов (г= - 0,50, г= -0,70,1= - 0,62, р<0,05 при действии rIL-2, rIL-15 и rIL-7 (1,0нг/мл), соответственно), а также между содержанием CD8'CD62L"CD27+ лимфоцитов и количеством CD8+CD62L CD27+ Т-клеток (г= - 0,70, р<0,05 при действии rIL-2 (1,0нг/мл), соответственно). На фоне TCR-активации, добавление в среду культивирования CD45RO+ Т-клеток rIL-2 (1,0нг/мл) и rIL-15 (0,5нг/мл), сопровождалось достоверным (по сравнению с пробами только с добавлением активатора), увеличением числа CD45RO"CD62L"CD27" Т-клегок (рисунок 4). Инкубация TCR-активированных CD45RO+CD4+ Т-клеток с rIL-2 и rIL-7 (1,0 нг/мл) приводила к дифференцировке Тем клеток в лимфоциты с фенотипом зрелых эффекторов (г= - 0,59, г= - 0,70, р<0,05 при действии rIL-2 и rIL-7 (1,0 нг/мл) соответственно). CD45RO'CD4+ Т-клетки были нечувствительны к действию rIL-15 (рисунок 4).

Оценка влияния цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (11^-2, ¡1^7 и IL-15), на процессы активации и пролиферации CD4 и CDS Т-клеток в CD45RA и CD45RO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей in

vitro

Одним из первых фенотипических признаков акгивации Т-клеток является появление мембранного рецептора - CD69, экспрессия которого опосредует увеличение концентрации внутриклеточного Ca+t и синтез различных цитокинов и их рецепторов, включая IL-2 и IL-2Ra (CD25) (González-Amaro R. et al., 2013; Литвинова Л.С. и др., 2014; De la Fuente H. et al., 2014). В гомеостатической модели in vitro, добавление rIL-2 в CD45RA1 Т-культуры приводило к значительному повышению

числа CD69+ (через 24 ч) и CD25+ (через 48ч) Т-клеток (рисунок 5). Следует отметить, что эффекты, оказываемые rIL-2 на CD45RA+ Т-клетки имели четкую зависимость от концентрации цитокина (Г =0,87, р<0,05, в отношении CD69+ Т-клеток; r=072, j><0,05, в отношении СD25+ Т-клеток, соответственно) и равномерно затрагивали CD4 и CD8+ Т-клетки. Следующим этапом эффективной активации Т-лимфоцита является появление на его мембране рецептора к трансферину (CD71/TfR 1), который, как правило, экспрессируется пролиферирующими клетками (Marsee D.K. et al., 2010; Литвинова Л.С. и др., 2014). Инкубация CD45RA+ Т-клеток с rIL-2 приводила к увеличению числа CD71 -позитивных Т-лимфоцитов. В отличие от CD45RA'CD8+ Т-клеток, CD45RA+CD4+ Т-лимфоциты были чувствительны только к максимальной концентрации rIL-2 (1,0 нг/мл). Данные литературы свидетельствуют, что действие высоких концентраций IL-2 (или IL-15) индуцирует in vivo и in vitro наивные CD8+ Т-клетки, несущие димерный ГС-2Я-комплекс, опосредуя их интенсивную пролиферацию и дифференцировку (Cho J. Н. et al., 2007; Bayer A.L. et al., 2013). В тоже время, низкая чувствительность CD4+ Т-клеток к действию rIL-2 может быть обусловлена как низкой экспрессией IL-2Ra и IL-2/15RP, гак и наличием механизмов, сдерживающих их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro (Geginat J. et al., 2001; Foulds K.E. et al., 2002; Moses C.T. et al.. 2003V

Добавление rIL-15 приводило к увеличению числа CD45RA+CD4+/CD8+CD69+ Т-клеток только при использовании максимальной концентрации. Рост числа CD45RA CD4 /CD8 CD25 Т- клеток регистрировался при инкубации Т-клеток с rIL-15 во всем спектре действующих концентраций (рисунок 5). CD4' Т-лимфоциты оказались нечувствительны к пролиферативному действию rIL-15, что может быть связано с низким уровнем экспрессии IL-2/IL-15Rfi этими клетками (Geginat J. et al., 2001), тогда как CD45RA+CD8+ Т-лимфоциты отвечали на весь спектр концентраций rIL-15 (рисунок 5). Как уже упоминалось, IL-15 может индуцировать in vitro многие реакции, опосредованные IL-2 (Cooper М.А. et al., 2002; Waldmann Т.А., 2006; Croce М. et al., 2012). На наивных Т-клетках регистрируются крайне низкие уровни экспрессии IL-15Ra и цепи IL-2/15RP, которые индуцируются при активации Т-клеток, в том числе, добавлением экзогенного IL-15. что повышает чувствительность наивных клеток к этому цитокину (Alves N.L. et al., 2003V rIL-7 дозозависимым образом увеличивал число CD69+ (^=0,65, р<0,05) и CD25+ (Г=0,72, р<0,05) в CD4+ популяции Т-клеток, не влияя при этом, на экспрессию этими клетками молекулы пролиферации CD71. В популяции CD45RA CD8' Т-клеток, добавление rIL-7 также способствовало увеличению числа CD69+ Т-лимфоцитов (г=0,80, р<0,05). Повышение числа CD8+CD25+ и CD8+CD71h Т-клеток происходило только под действием максимальной концентрации rIL-7 (рисунок 5).

CD45RA* rIL-2 rIL-7 rIL-15 rIL-2/Exp rlL-7/Exp rIL-15/Exp

. CD69 t t t (1.0) t $ T (0,5-1,0)

(СПИ' ) VlCD25 t T (1.0) t(0.1-1,0) t(0,1-1.0) t (1,0) t(0,5-l,0)

t (0,1-1,0) t (1.0) t(0,1-1,0) t(0,1-1,0) t(i,0) t(0,5-1,0)

лС069 t t t (1.0) t (1,0) t t

|ГСП4* ) V(CD25 t t t(0.1-1,0) t (1,0) t (1,0) t

t(1.0) t Í t T(|.0) t

Рисунок 5 - Влияние ус-цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на активацию и пролиферацию CD4/CD8 Т-клеток в популяции CD45RA Т-лимфоцитов в гомеопатической и акгивационной моделях in vitro

Примечание: здесь и в рисунках 6 и 7: 0,1-0,5-1,0 - концентрации цитокинов в пг/мл

^доютависимыс эффекты цитокинов; $ отсутствие изменений изучаемых показателей: изменение значений показателей во веем спектре действующих концентраций цитокинов

Выявленное нами в эксперименте повышение числа CD4*/CD8*CD25* и CD71* Т-клеток, может быть обусловлено способностью IL-7 выступать в качестве кофактора при субпороговой TCR-стимуляции Т-лимфоцитов, обеспечивая их гомеостатическую пролиферацию (Tan J.T. et al., 2001; Bradley L.M. et al., 2005; Fry T.J., Mackall C.L., 2005). В тоже время, данные научной периодики свидетельствуют, что IL-7 обладает способностью повышать экспрессию рецептора к а-цепи (CD25) на поверхности Т-лимфоцитов, что, в свою очередь, усиливает восприимчивость клеток к активационным сигналам (Бойчук C.B., Дунаев П.Д., 2008; Dooms H., Abbas А.К., 2010; Kameyama К., et al., 2010).

Добавление TCR-активатора в среду культивирования CD45RA+ Т-клеток сопровождалось достоверным ростом числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, несущих мембранные молекулы активации (CD69, CD25) и пролиферации (CD71). CD45RA CD4+ Т-клетки были чувствительны только к максимальным дозам rIL-2: содержание CD4+CD69+ и CD4+CD25+ Т-клеток в CD45RA+ Т-культурах возрастало (в сравнении с добавлением только активатора), а число CD71+ Т-клеток - не изменялось (рисунок 5). Эффекты IL-2 на CD45RA+CD8+ Т-клетки, в целом, носили стимулирующий характер (рисунок 5). Добавление максимальных концентраций IL-7 в культуры TCR-активированных CD45RA+ Т-клеток приводило к достоверному увеличению числа CD4+/CD8+CD25+ и CD4+/CD8+CD71 Т-клеток и не влияло на экспрессию молекулы ранней активации - CD69 (рисунок 5). Инкубация TCR-активированных CD45RA+ Т-клеток с rIL-15 (0,5-1,0нг/мл), приводила к повышению числа CD8+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации и пролиферации по сравнению с пробами только с добавлением активатора. CD4+ Т-клетки в активационной модели культивирования in vitro оказались нечувствительны к цитокину (рисунок 5).

Выявленное нами повышение количества CD45RO+CD4+/CD8+CD69+-icieTOK (через 24 ч) и CD45RO+CD4+/CD8+CD25+ (через 48 ч), индуцированное добавлением rIL-2, обусловлено его биологическими свойствами (Benczik M., Galïen S.L., 2004; Northrop J.K. et al., 2006; Spierings D.C. et al., 2006; Литвинова Л.С. и др., 2013). Действие rIL-2 на CD4+ и CD8+ субпопуляции CD45RO-KneroK имело четко выраженный дозозависимый характер (г2 = 0,76 и г2 =0,82, р<0,05, соответственно в случае CD4+ Т-клеток и г2 = 0,56 и г=0,82, р<0,05, соответственно в случае CD8+ Т-клеток).

rIL-7 оказывал влияние на активацию и пролиферацию CD45RO+CD8+ Т-клеток, значимо увеличивая количество лимфоцитов с фенотипом CD8+CD25+ и CD8+CD71+; не затрагивая, при этом экспрессию маркер» ранней активации - CD69. Инкубация CD4+ клеток с rIL-7 (1,0 нг/мл) сопровождалась ростом количества CD25+ позитивных лимфоцитов, и не влияла на экспрсессию молекул CD69 и CD71 (рисунок 6). CD45RO+CD4+ Т-клегки оказались менее чувствительны к пролиферативному эффекту IL-7. Согласно данным литературы, CD4+ Т-клетки памяти, в сравнении с цитотоксическими, более чувствительны именно к антигенному воздействию, их функциональная активность менее зависима от цитокиновой и мембранной костимуляции (Williams M.A., Bevan M.J., 2004; Селедцов В.И. и др., 2010).

Добавление максимальной концентрации rIL-15 (1,0 нг/мл) приводило к росту количества CD69+ клеток, преимущественно, за счет CD45RO+CD8 лимфоцитов и не оказывало значимого действия на экспрессию молекулы активации CD25. Выявлен дозозависимый эффект rIL-15 на экспрессию CD8 клетками маркера пролиферации -CD71 (г^=0,70, р<0,05) (рисунок 6). Эффекты riL-15 не затрагивали субпопуляцию CD4+ клеток (рисунок 6). Согласно данным литературы, CD8+ Т-клетки памяти проявляют большую чувствительность к IL-15-индуцированной пролиферации, нежели наивные CD8+ лимфоциты, а также CD4' клетки разной степени дифференцировки, что обусловлено высокой экспрессией IL-15R (Kennedy М.К. et al.. 2000; Schluns K.S., Lefrançois L„ 2003; Moniuszko M. et al., 2004; Ramanathan S. et al., 2009).

TCR-активация CD45RO+ Т-клеток, приводила к росту числа CD69* (через 24 ч), CD25+ и CD71+ (через 48 ч) Т-лимфоцитов; изменения, индуцированные активатором, равномерно затрагивали CD4+ и CD8+- субпопуляции. Инкубация TCR-

активированных С045Я0+ Т-клеток с г11_-2 (1,0 нг/мл) сопровождалась повышением числа С069+ Т-клеток за счет С 04' субопуляции (р<0,05) и не затрагивала С08+ Т-кпетки (р>0,05). В то же время г1Ь-2 (1,0 нг/мл) достоверно повышал содержание С045К() С[>47С08'С025' Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением активатора (р<0,05). К пролиферативному действию гГЬ-2 (1,0нг/мл) были чувствительны только активированные СВ451Ю'С04' Т-лимфоциты.

CD45RO* rlL-2 rIL-7 rIL-15 rlL-2/Exp rlL-7/Exp rlL-15/Exp

« CD69 t X t (1.0) t t t (0,5)

f CD8* ) \ЗС025 t t(0,1-1.0) t t(0,5-1,0) td.O) | (0,5-1,0)

t(0,l-l.0) t(i.0) t t $ t

. CD69 fCD4*) VZCD25 t t t(O.l-I.O) t t (1.0) $ t \ $ t(i,0) t(0,5-l,0) t 0.0) $ t (1,0) t (1,0) | (0,5) J t(0,5-l,0)

Рисунок 6 - Влияние цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) на активацию и пролиферацию CD4/CD8 Т-клеток в популяции CD45RO Т-лимфоцитов в гомеостатической и активационной моделях in vitro

Добавление в среду культивации rIL-15 (0,5 нг/мл) было ассоциировано со снижением количества С069-позитивных Т-клеток в TCR-аю ивированной CD45RO+CD4+ субпопуляции, и, напротив увеличением числа CD45RO+CD8+CD69+ Т-клеток (р < 0,05). На фоне TCR-активации in vitro, rIL-15 (0,5 - 1,0 нг/мл) обладал угнетающим действием на цитотоксические Т-клетки памяти, достоверно снижая число CD8+CD25+ Т-лимфоцитов (по отношению к пробе с активатором) (р<0,05). CD45RO+CD4+ клетки оказались менее чувствительны к эффектам rIL-15. Тем не менее, rIL-15 (1,0 нг/мл) способствовал увеличению числа CD4+CD71+ Т-клеток (р<0,05) и не влиял на CD45RO+CD8+-ioieTKH (рисунок 6). rIL-7 (1,0 нг/мл) на фоне TCR-активации, приводил к повышению содержания CD4+/CD8+CD25+ и CD4+CD71+ Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением Ас/Exp (р<0,05). Выявленная нами in vitro относительная резистентность процесса активации и пролиферации TCR-стимулированных цитотоксических Т-клеток памяти к эффектам ус-цитокинов (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), наряду с дифференцировкой в эффекторные клетки, может обеспечивать их устойчивость к активационному апоптозу, а также создавать необходимые предпосылки для эффективной реализации их цитотоксического потенциала в процессе развития вторичного иммунного ответа.

Оценка эффектов ус-цитокинов (11^2, IL-7и IL-15) на позднюю активацию и а поп пни CD4 и CDS Т-клеток в CD45RA и CD45RO культурах, в условиях гомеостатической и активационной моделей in vitro

Число CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток в контрольных пробах, несущих на своей поверхности молекулу CD95, составило^ 12,18 (10,02 - 15,51) и 20,84 (16,22-25,60)%, соответственно. В популяциях CD45RA1 Т-клеток, число жизнеспособных Т-клеток, оцениваемых в тесте «GuavaViacount», было равным, в среднем - 75,45 (71,98-78,23)%, а в популяции CD45ROf Т-клеток - 87,56 (83,23-90,10)%, соответственно. Интересным оказалось распределение числа CD95+ Т-клеток в CD4+ и CD8+ субпопуляциях CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов. В CD45RA' культурах преобладали CD8+CD95+ Т-клетки, тогда как в CD45RO+ - популяции, содержание CD4'CD95' Т-клеток было выше, чем CD8 CD95+ лимфоцитов. Кроме того, мы предприняли попытку оценить распределение маркера CD95 в негативных и позитивных по экспрессии CD62L -популяциях CD4 - и CD8 - Т-клеток: число CD95+ клеток в популяции

CD45RA+CD8+CD62L+ - было менее 5,6%; тогда как почти 89% CD8+CD62L" Т-клеток (Temra) экспрессировали молекулу CD95. В CD45RO-культурах, число CD95-позитивных лимфоцитов в популяциях - CD8+CD62L+ и CD8 CD62L" было равным, в среднем, 70 и 85% (рисунок 7).

В хелперных CD45RA+CD62L+ и CD45RA+CD62L" популяциях, число CD95+ Т-клеток не превышало - 2,3 и 10,98%, соответственно. В то же время соотношение центральных (ТСм) и эффекторных (Тем) клеток, экспрессирующих молекулу CD95, в CD45RO+CD4+ популяциях составляло, в среднем, 25 и 79% (рисунок 7). Вышесказанное позволяет предположить конститутивную экспрессию молекулы CD95 - CD4* и CDS+ клетками - эффекторами, а также CDS* Т-клетками центральной памяти. Согласно данным научной периодики, конститутивная экспрессия молекулы CD95 на эффекторных лимфоцитах и Т-клетках памяти, является не только признаком, определяющим их готовность к запуску активационного апоптоза, но и маркером их созревания и дифференцировки (Хайдуков C.B., 2003; Gupta S., Gollapudi S., 2008; Селедцов В.И. и да. 2010: Baneriee H. et. al.. 2012; Prabhu S.B. et. al.. 2013; Литвинова Л.С. и до.. 2014). Некоторые авторы свидетельствуют, что. экспрессия молекулы CD95 сама не является мерой чувствительности Т-клеток к Fas-опосредованному апоптозу (Jaleco S. et al., 2003). Инкубация CD45RA* и CD45RO* культур с rlL-2, сопровождалась ростом содержания CD95+ Т-клеток. Изменения, в основном, затрагивали CD8+ популяцию лимфоцитов. На фоне общего снижения числа CD8+CD62L+ (наивных и центральных) Т-клеток в CD45RA - и CD45RO -культурах, содержание CD95+ лимфоцитов в популяциях CD8+CD62L+ - возрастало с повышением концентрации цитокина. Число CD8+CD62L* Т-лимфоцитов, напротив, увеличивалось в CD45RA - и CD45RO - популяциях цитотоксических Т-лимфоцитов, а содержание CD95 - Т-клеток в этих популяциях эффекторных клеток, в целом, оставалось неизменным (рисунок 7). В пробах с добавлением максимальной концентрации IL-2, снижение числа CD62L+ Т-клеток коррелировало с ростом содержания CD95+ лимфоцитов (г=-0,86 и 1^0,69, р<0,05 соответственно). Инкубация CD45RA - и CD45RO - культур с rIL-2 ( 1,0нг/мл), также приводила к достоверному снижению числа жизнеспособных Т-клеток, в среднем, на 22% и 25%, соответственно. В нашем эксперименте, rIL-2 не влиял на изменение числа CD4+CD95+ Т-клеток в CD45RA и CD45RO - популяциях (рисунок 7).

Регистрируемое нами rIL-2-индуцированное увеличение числа мертвых клеток, а также рост содержания CD8+CD95+ лимфоцитов в культурах CD45RA и CD45RO+ Т-клеток (в том числе, в CD62L+ - популяциях), может быть обусловлено способностью IL-2, в отсутствии антигена, значительно усиливать апоптоз цитотоксических Т-клеток памяти и эффекторов in vivo (Ku С.С. et al., 2000; Kamimura D. et al., 2004). Кроме того, выявленная нами IL-2-опосредованная активация и пролиферация CD8+ Т-клеток in vitro, может значительно повышать их чувствительность к активационному апоптозу. Установлено, что IL-2 является фактором, одновременно обеспечивающим пролиферацию и сенсибилизацию клеток к клеточной гибели, индуцированной активацией (activation-induced cell death, AICD) (Kovanen P.E. et al., 2004; McKinstry К.К. et al., 2010). Добавление IL-7 и IL-15 (1,0 нг/мл) в культуры CD45RA+ и CD45R04 Т-лимфоцитов приводило к изменению содержания CD95+ Т-клеток (в сторону увеличения) в цитотоксических CD62L-no3HTHBHbix CD45RA и CD45RO - популяциях (рисунок 7) и не сопровождалось изменением соотношения живых/мертвых Т-клеток. Известно, что IL-7 и IL-15 способны усиливать в Т-клетках экспрессию антиапоптотических молекул, таких как Вс1-2 и Mcl-1 (Marsden V.S.. Strasser А., 2003), через JAK/STAT и PI3К/АКТ сигнальные пути (Shenoy A.R. et al., 2014), и, напротив, ингибировать проалоптогенные факторы - Вах и Bad (Dooms H. et al., 2007; Cai К. et al., 2013).

TCR-активация CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, наряду с увеличением общего числа клеток (в мл) и CD71+ Т-лимфоцитов, приводила к снижению содержания живых клеток в обеих популяциях CD45RA+ (в среднем, на 38%) и CD45RO+ Т-клеток (в среднем, на 33%) (ро<0,05. Увеличение содержания CD95+ Т-клеток в CD45RA+ и

CD45RO+ пробах с TCR-активатором, регистрировалось за счет обеих популяций Т-клеток (хелперных и цитотоксических) рисунок 7). В TCR-активированных CD45RA и CD45RO- пробах регистрировалось значительное увеличение CD95+ клеток в CD62L-позитивных популяциях, тогда как в CD62L' - эти цифры значимо не изменялись (рисунок 7). На наш взгляд, TCR-индуцированное повышение числа мертвых Т-клеток в обеих культурах - CD45RA+ и CD45RO+, происходит, как за счет эффекторных Т-клеток, в том числе Temra Т-лимфоцитов, так и наивных Т-клеток, крайне чувствительных к дисбалансу инициирующих сигналов, усиленных продукцией IL-2 активированными Т-клетками (Krueger A. et al., 2003: Bouillet Ph.. O'Reilly L.A., 2009+).

Действие rIL-2 на жизнеспособность TCR-активированных CD45RA+ и CD45RO Т-лимфоцитов носило однонаправленный характер и сопровождалось повышением числа мертвых Т-клеток по сравнению с пробой только с добавлением активатора. Рост числа CD95+ Т-клеток в культурах CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов регистрировалось, преимущественно, за счет CD8+ Т-клеток (рисунок 7). Перераспределение маркера CD95 в популяциях CD8+ клеток было однонаправленным: число CD95+ Т-клеток возрастало в CD62L- позитивных популяциях наивных клеток и клеток с центральным фенотипом, тогда как в популяциях эффекторных клеток (CD62L") - по-прежнему оставалось на прежнем уровне (>90%) (рисунок 7). rIL-2-индуцированное изменение числа CD95+ Т-клеток в популяциях CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов имело четкую взаимосвязь с содержанием мертвых клеток (г=0,60. г=0,78, р<0,05 - для CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов при действии 1,0 нг/мл rlL-2).

Многие авторы указывают на участие IL-2 в экспансии CD4 и CD8~ Т-лимфоцитов in vivo зя счет индукции их апоптотической гибели, которая должна произойти до кюнального пика (Blattman J.N. et al., 2003: Schluns К.S., Lelïançois L., 2003: Dooms H. et al.. 2007; Malek T.R. et al., 2010).

Добавление rIL-7 и rIL-15 в максимальной концентрации (1,0 нг/мл) в культуру активированных Т-клеток, увеличивало число живых CD45RO+ Т-лимфоцитов памяти (по сравнению с пробами только с добавлением активатора в среднем, на 20%), что согласуется биологическим действием этих медиаторов (Schluns K.S. et al., 2000; Schluns K.S., Lefrançois L„ 2003: Бойчук C.B., Дунаев П.Д., 2008). CD45RA+ T-лимфоциты оказались чувствительными только к протективному эффекту rIL-7. Нами было выявлено индуцированное rIL-7 перераспределение содержания CD95+ клеток в хелперных и цитотоксических популяциях - относительное число CD4+CD95+ Т-клеток снижалось (rlL-7 - 0,5нг/мл), тогда как содержание CD8+CD95+ (rlL-7 - 0.5-1,0нг/мл), напротив, возрастало (р<0,05). CD45RA+ Т-клетки были нечувствительны к действию rlL-15. При этом число CD95+ Т-клеток в CD62L+ - популяциях CD8+ Т-клеток, значимо возрастало, и не изменялось в CD4+ (рисунок 7).

Эффекты rIL-7 (0,5-1,0нг/мл) на активированные CD45RO+ Т-клетки сопровождались увеличением общего числа CD95+ Т-клеток, за счет CD8+ Т-клеток (по сравнению с активационной пробой) (р < 0,05). Добавление rlL-15 в активированные культуры CD45RO+ Т-клеток сопровождалось достоверным снижением числа CD45RO+CD4+CD95+ Т-лимфоцитов, и напротив, повышением содержания CD45RO+CD8+CD95+ Т-лимфоцитов (р<0,05) (рисунок 7). Перераспределение экспрессии молекулы CD95 в популяциях центральных (CD62L+) и эффекторных (CD62L) CD45RO+ клеток выражалось достоверным увеличением числа CD8+CD95+CD62L+ Т-клеток, а в популяции хелперных лимфоцитов - не изменялось (рисунок 7).

Еще одной из поверхностных молекул, характеризующих активационный статус Т-клеток, является HLA-DR. Согласно современным представлениям. HLA-DR является маркером не только поздней, но и длительной активации Т-клеток (Bertho N. et al., 2000; Хаитов P.M., 2009). Несмотря на то, что роль CD3+HLA-DR+ клеток, в целом, остается неясной, их появление и персистенция in vivo свидетельствуют, что CD3+HLA-DR+ - лимфоциты могут быть частью нормальной иммунорегуляции (Imamichi H., et.al., 2012; Arruvito L. et al., 2014).

В интактных С D45 ИЛ-культурах, содержание CD3 CD8'HLA-DR+ Т-клеток почти в 2 раза превышало количество CD3+CD4+HLA-DR+ Т-лимфоцитов и было равным 5,54 (4,05-6,22) и 3,13 (3,01-3,46) %, соответственно. Оценив распределение маркера HLA-DR+ в негативных и позитивных по экспрессии CD62L - популяциях CD4 - и CD8 - Т-клеток, нами были получены следующие результаты: в популяциях наивных -CD45RA+ CD4+/CD8+CD62L+ Т-клеток маркер HLA-DR обнаружен не был; тогда как почти 18 и 32% и CD4/+CD8+CD62L" Т-лимфоцитов экспрессировали HLA-DR на своей поверхности.

В культурах CD45RO+ Т-клеток, в отличие от CD45RA - популяций, преобладали хелперные CD3+HLA-DR+ Т-лимфоциты (рисунок 7). Как и ожидалось, число HLA-DR-позитивных лимфоцитов, в популяциях - CD8+/CD4+CD62L+ было равным, в среднем, 1,5 и 1.9%; в CD87CD4+CD62L - негативных популяциях это процентное распределение составило: 15 и 8% (рисунок 7). В эффекторных популяциях (CD62L") CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток, более 99% CD3+HLA-DR+ - Т-клеток экспрессировали CD95. Однако не все С095-позитивные Т-лимфоциты несли на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. Обнаруженные нами в CD45RA- и CD45RO-культурах CD3+HLA-DR+ Т-лимфоциты, представляют собой зрелые и/или незрелые эффекторные Т-клетки и Temra Т-лимфоциты. Можно предположить, что высокая экспрессия зрелыми эффекгорными Т-клетками молекулы HLA-DR, наряду с мембранной экспрессией CD95, могут являться признаками терминальной фазы дифференцировки и созревания (Wang Е.С. et al., 1993; Imamichi H. et al., 2012).

Инкубация СЕ)4511А-культур с rlL-2, rIL-7 (1,0 нг/мл) и rlL-15 (0,1-1,0 нг/мл), сопровождалась повышением содержания (в среднем в 1.5 раза) цитотоксических CD3 HLA-DR" CD95+ Т-лимфоцитов в популяциях зрелых и незрелых Iemra эффекторов. Полученные нами результаты могут быть обусловлены гибелью цитотоксических TEmra эффекторов, в связи с их низкой чувствительностью к антиапоптотическому влиянию этих цитокинов (Di Mitri D. et al., 2011; Imamichi H. et al., 2012). С другой стороны, цитокин-опосредованное снижение общего числа цитотоксических CD3 HLA-DR' Т-клеток в CD45RA+ культурах может быть обусловлено повышением содержания эффекторных (CD3+CD8+CD62L', Temra) Т-клеток в результате дифференцировки из наивных Т-лимфоцитов или незрелых Temra эффекторов. Выявленные нами изменения, индуцированные действием максимальных концентраций цитокинов (rlL-2 и rIL-15), имели положительную взаимосвязь между содержанием CD3 CD62L"HLA-DR+CD95+ лимфоцитов и количеством зрелых цитотоксических (CD62L CD27") TEMRA (г=0,67, р<0,05 для IL-2; г=0,80, р<0,05 для rlL-15).

Инкубация CD45RO Т-клеток с rIL-2 (1,0 нг/мл) приводила к росту числа HLA-DR"^ Т-клеток в CD62L+ и CD62L" субпопуляциях CD8+ Т-лимфоцитов, тогда как в хелперных - число HLA-DR+T-mieroK возрастало только в эффскторной (CD62L") популяции (рисунок 7). Следует отметить, что все CD3 HLA-DR+ клетки в эффекторных популяциях CD4+ и CD8 Т-клеток, экспрессировали молекулу С095.Возможно, что rIL-2-индуцированное увеличение числа CDTCD4'/CD8 IILA-DR+ Т-клеток в CD62I .-негативной популяции CD45RO-^bTyp, опосредовано пополнением этого пула клеток за счет прекурсоров - CD3+HLA-DR~, индуцированным rIL-2 в условиях культивирования in vitro. Подтверждением этому тезису явилось обнаружение взаимосвязи между снижением числа незрелых цитотоксических эффекторов (CD62L"CD27+, Тем: Eml и Ет2) и увеличением CD8+HLA-DR+ (г=^0,80, р<0,05) при действии rIL-2 (1,0x10 г/мл). Повышение числа CD3+CD8+HLA-DR+ лимфоцитов в CD62L+ популяции CD45RO Т-клеток также может быть обусловлено их пролиферацией (Amivito L. et al., 2014). rIL-7 и rIL-15 не оказывали значимого влияния на изменение числа CTO^LA-DR4 Т-лимфоцитов в CD45RO - культурах, однако в максимальных концентрациях, способствовали значимому росту числа CD3 CD8 HLA-DR CD95 в CD62L" - популяциях (рисунок 7).

Добавление активатора сопровождалось достоверным ростом числа CD3+HLA-DR+CD95+ Т-клеток в СЕ)62Е-негативных популяциях CD45RO и CD45RA - культур,

что может свидетельствовать о процессах терминальной дифференцировки и созревания эффекторных клеток. Данный тезис подтверждается фактами позитивной корреляции между содержанием CD3+CD8+CD62L"HLA-DR+CD95+ клеток и числом зрелых (CD62LCD27) TE4RA эффекторов (i=0,67, р<0,05 - для CD45RA+ культур); и CD3+CD8+CD62L"HLA-DR CD95 клеток и числом зрелых (CD62L CD27 ) эффекторов (г=0,70, р<0,05 - для CD45RO+ культур).

Действие rIL-2 (0,5-1,0 нг/мл) и IL-15 (0,1-1,0 нг/мл) на фоне TCR-активации бьшо направлено на снижение числа HLA-DR Т-клеток в CD62L- негативных CD45RA-популяциях Т-клеток, тогда как процентное содержание CD3+CD8*CD62LHLA-DR CD95+ возрастало (рисунок 7). В культурах CD45RO+ Т-клеток также регистрировалось перераспределение маркера HLA-DR в негативных и позитивных по экспрессии С062Ь-популяциях в сторону его уменьшения; тогда как относительное содержание СШ+ CD8*CD62LHLA-DR*CD95+ Т-клеток в CD45RO культурах, возрастало (рисунок 7). Одним из механизмов снижения числа CD45RA+HLA-DR+ и CD45RO+HLA-DR+ Т-клеток в СОб2Ь-негативных популяциях, опосредованных сочетанным действием цитокинов и Т-клеточного активатора, как уже упоминалось ранее, может быть их повышенная гибель, обусловленная низкой экспрессией белков семейства Bcl-2 CJiane О. et al.. 2004: Imamichi Н. et al.. 2012). а также увеличение содержания Фоакции CD62L' Т-лимсЬоцитов. вследствие цитокинопосредованной пролиферации и дифференцировки TCR-активированных Т-клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюмируя вышесказанное, можно выделить ряд закономерностей цитокинопосредованной регуляции функциональной активности Т-клеток, ассоциированных с изменением репертуара поверхностных молекул, отражающих проходящие процессы активации, пролиферации, дифференцировки и апоптоз, в разных условиях культивирования in vitro (рисунок 7).

Наше исследование позволило выявить, что в гомеостатической и активационной моделях in vitro, ус-цитокины (IL-2, IL-7 и IL-15), в разной степени, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ наивных клеток (TN) и CD4+ и CD8+ Т-клеток с фенотипом центральной памяти (Тш) в эффекторные клетки разной степени зрелости (рисунок 7). Установлено, что влияние цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD4+/CD8+ CD45RA+T-mieroK, в разных моделях культивирования in vitro, носят однонаправленный характер, но имеют разную степень выраженности. Продемонстрирована меньшая чувствительность CD45RA+CD4+ Т-лимфоцитов к пролиферативному действию у^иит0**1"08» в сравнении с CD45RA+CD8+ Т-клетками (рисунок 7), что может быть связано с механизмами, сдерживающими их гомеостатическую пролиферацию in vivo и in vitro. Показано, что в гомеостатической модели культивирования in vitro, хелперные популяции CD45RO+ Т-лимфоцитов обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию ус-иитокинов. в сравнении с цитотоксическими CD45RO+ Т-клетками. Напротив, цитотоксические CD45RO+Т-клетки в активационной модели in vitro, менее чувствительны к активирующим и пролиферативным эффектам ус-цитокинов, в сравнении с хелперными CD45RO+ Т-лимфоцитами (рисунок 7). Установлено, что эффекты rIL-2 в разных моделях in vitro, на жизнеспособность CD45RA+ и CD45RO Т-лимфоцитов, носят однонаправленный характер и сопровождаются увеличением числа CD95+ Т-лимфоцитов (в основном, в CD62L-позитивной популяции), на фоне снижения содержания жизнеспособных Т-клеток. Изменения, индуцированные IL-2, затрагивают, в основном, CD8+Т-клетки. IL-7 и IL-15, в гомеостатической модели культивирования не оказывают влияния на Т-клетки, тогда как в активационной модели in vitro, увеличивают число живых Т-лимфоцитов в CD45RO - культурах (по сравнению с пробами только с добавлением активатора) и не влияют на CD45RA+ Т-клетки.

Рисунок 7 - Влияние ус-цитокинов (г1Ь-2, \\L-1 и г!Ь-15) на функциональную активность Т-клеток (по результатам собственных исследований)

Показано, что влияние ve-цитокинов (1L-2. 1L-7 и 1L-15) на экспрессию молекулы CD95 (Fas/APO-1) CD4+ и CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток имеет разную направленность и разную степень выраженности. ус-цитокины (IL-2,1L-7 и IL-15), в разных моделях in vitro, способствуют росту числа CD3+CD95+ Т-клеток в CD8+ популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (Тем)- Тогда как экспрессия CD95 эффекторными CD8+ Т-клетками, а также CD4+ Т-клетками разной степени зрелости, не изменяется (vucvhok 7).

Установлено, что в CD4+ и CD8+ популяциях эффекторных (CD62L") CD45RA+ и CD45RO+ Т-клеток более 99% CD3+HLA-DR+ Т-клеток экспрессируют маркер CD95. Однако не все С095-позитивные Т-лимфоциты несут на своей поверхности маркер «поздней активации» HLA-DR+. Продемонстрировано, что ус-цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15) в разных моделях in vitro, обладают разнонаправленным действием на изменение содержания CD3+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RA- и CD45RO-кyльтypax. Выявлена способность ус-цитокинов повышать содержание CD3+HLA-DR+CD95+ Т-клеток в эффекторных CD4+ и CD8+ популяциях лимфоцитов (С062Ь-негативных). что может свидетельствовать о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток (рисунок 7).

Подводя итог вышесказанному, изучение физиологических аспектов регуляции функциональной активности Т-клеток, опосредованных биомолекулами, может быть основополагающим компонентом для дальнейшего, более детального исследования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе адаптивного иммунитета.

ВЫВОДЫ

1. Эффекты цитокинов. имеющих общ^ю у-цепь рецепторов (IL-2,1L-7 и 1L-15), на функциональную активность CD4+ и CD8 Т-клеток. фенотипически проявляющуюся мембранной экспрессией молекул активации (CD69, CD25). пролиферации (CD71), созревания (CD27. CD62L. HLA-DR) и апоптоза (CD95), определяются степенью зрелости Т-лимфоцитов (наивные. Т-клетки памяти, эффекторные клетки) и условиями культивирования in vitro (гомеостатическая и активационная модели).

2. В гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, ус-цитокины (IL-2, 1L-7 и 1L-15) в CD45RA-кyльтypax Т-клеток. в разной степени, способствуют образованию зрелых и незрелых эффекторных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов (Temra и Тем). а также Т-клеток с фенотипом центральной памяти (Тем) за счет снижения содержания наивных CD4+ и CD8 клеток (TN).

3. В культурах CD45RO+ Т-клеток цитокины (rIL-2, rIL-7 и rIL-15), в разных условиях культивирования in vitro, способствуют дифференцировке CD4+ и CD8+ лимфоцитов с фенотипом центральной памяти (ТСм) в эффекторные Т-клетки (Тем и Temra).

4. Влияние ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на процессы активации CD45RA CD4+ и CD45RA+CD8+ Т-клеток, ассоциированные с экспрессией молекул -CD69 и CD25, в гомеостатической модели культивирования и на фоне TCR-стимуляции in vitro, имеет однонаправленный характер, но разную степень выраженности. CD45RA+CD4+ Т-лимфоциты, в отличие от CD45RA+CD8+ Т-клеток, менее чувствительны к пролиферативному действию ус-цитокинов.

5. В гомеостатической модели культивирования in vitro, CD45RO+CD4T Т-лимфоциты обладают относительной резистентностью к активационному и пролиферативному действию ус-цитокинов по сравнению с CD45RO+CD8 Т-клетками. На фоне TCR-активации in vitro, CD45RO+CD8T Т-клетки менее чувствительны, по сравнению с CD45RO CD4 Т-лимфоцитами, к активирующим и пролиферативным сигналам цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15).

6. В разных условиях культивисювания in vitro, vc-цитокины (IL-2. IL-7 и IL-151 инициируют экспрессию молекулы CD95(Fas/APO-l). преимущественно, CD8+ популяциями CD45RA+ и CD45RO+ Т-лимфоцитов. Цитокины, в гомеостатической и активационной моделях культивирования in vitro, способствуют росту числа CD3+CD8+CD95+ Т-клеток в популяциях наивных лимфоцитов (TN) и Т-клеток с фенотипом центральной памяти (ТСм); экспрессия CD95 эффекторными CD8+ Т-клетками (CD62L") а также CD4+ Т-клегками разной степени зрелости, не изменяется.

7. Рост числа CD3+HLA-DR+CD95+ клеток в СD4+ и CD84 эффекторных (CD62L-негативных) популяциях CD45RA' и CD45RO" Т-лимфоцитов в разных условиях культивирования in vitro свидетельствует о процессах терминальной дифференцировки и созревания клеток под действием ус-цитокинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литвинова Л.С., Гуцол A.A., Сохоневич H.A., Кофанова К.А. Эффекты иммунорегуляторных цитокннов (IL-2, IL-7 и 1L-15) на процессы активации, пролиферации и аполтотической гибели Т-клеток иммунной памяти in vitro II Цитология. - 2013. - Том 55, №8. - С.566-571 (lF-0,340).

2. Литвинова Л. С., Маэунин И. О., Гуцол А. А., Сохоневич H.A., Хазиахматова О. Г., Кофанова К. А. Дозозависимые эффекты стероидных гормонов на экспрессию генов G61 и U2afl 14 в Т-лимфоцитах разной степени дифференцировки // Молекулярная биология. -2013. - Т. 47. № 4. - С. 656-667 (IF 0.740).

3. Гуцол A.A., Сохоневич H.A., Селедцов В.И., Литвинова Л.С. Влияние дексаметазона на активацию и пролиферацию Т-клеток иммунной памяти // Бюллетень экспериментальной биологии медицины. - 2013. - Т. 155. № 4 - C.468-471(IF-0,565).

4. Yurova К. A., Sokhonevich N. A., Khaziakhmatova О. G.,Litvinova L. S. Cytokine-medialed regulation of expression of Gfil and U2afll4 genes by activated T-cells with various differentiation status in vitro // Biochemistry (Moscow) Supplement series B: Biomedical Chemistry. -2015. -№2. -C. 145-149 (IF-0,365).

5. Литвинова Л.С., Гуцол A.A., Сохоневич H.A., Шуллецова В.В., Кофанова К.А., Хазиахматова О.Г., Кайгородова Е.В., Гончаров А.Г. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов // Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 6, № 1. - С. 7-26 (IF-0.359).

6. Сохоневич H.A., Юрова К.А., Гуцол A.A., Хазиахматова О.Г., Мазунин И.О., Литвинова Л.С. Эффекты иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на экспрессию генов Gfil и U2afll4 в Т-лимфоцитах разной степени дифференцировки // Бюллетень экспериментальной биологин н медицины. -2015. - Т. 159 (№ 2). - С. 196-200 (lF-0,565).

7. Сохоневич H.A., Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Шуплецова В.В., Литвинова Л.С. Феногипическая характеристика и функциональные особенности Т- и B-клеток иммунной памяти // Цитология. - 2015. - Т.57, №5. - С. 311-318. (IF-0,340).

8. Сохоневич H.A., Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Литвинова Л.С. Цитокин-индуцированная активация и пролиферации TCR-активированных Т-лимфоцитов памяти // Российский иммунологический журнал.-2015. -Т.9( 18), №2(1).-С. 318-319 (IF 0,286).

9. Sokhonevich N.A., Kofanova К.А., Khaziakhmatova O.G., Litvinova L.S. Influence of cytokine IL-2 on naïve T-cells differentiation in vitro // Fundamental and applied research in biology 3rd international scientific conference, Donetsk national university, 2014, February 24-27. -C. 231.

10. Кофанова К,А., Сохоневич H.A., Хазиахматова О.Г., Мазунин И.О., Литвинова Л.С. Оценка влияния IL-7 и IL-15 на пролиферацию и транскрипцию мРНК гена hTERT Т-клетками памяти (CD45RO+) с разным функциональным статусом // Сборник статей по материалам XX международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины». — М.: «(Международный центр науки и образования», 2013. — С. 72-79.

11. Кофанова К,А., Сохоневич H.A., Хазиахматова О.Г., Мазунин И.О., Литвинова Л.С. Влияние 1L-2 на пролиферативную активность и транскрипцию мРНК гена hTERT в Т-лимфоцитах разной степени дифференцировки // Международная научно-практическая конференция «Перспективы развития науки и образования». Москва. - 2013. - Т.1. - С. 4449.

12. Литвинова Л.С., Гуцол A.A., Сохоневич H.A., Шуплецова В.В., Гончаров А.Г., Селедцов В.И. Влияние ингерлейкина-2 на апоптоз и пролиферацию Т-клеток иммунной памяти //

Материалы докладов XVII-ой Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург, 20-21 апреля. - 2011. - С. 4445.

13. Сохоневич H.A., Гуцол A.A., Кофанова К.А., Литвинова Л.С. Влияние иммунорегуляторных цитокинов на экспрессию молекулы ранней активации CD69 в популяции Т-клеток иммунной памяти // Сборник тезисов докладов XVIII-ой межгородской научной конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии - 2013», г. Санкт-Петербург, 10-11 апреля.-2013. - С.110-112.

14. Сохоневич H.A., Гуцол A.A., Литвинова Л.С. Влияние иммунорегуляторных цитокинов на дифференцировку наивных Т-клеток // Материалы докладов XVIII-ой Межгородской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург, 20-21 апреля.-2012.—С. 119-121.

15. Сохоневич H.A., Литвинова Л.С. Эффекты цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на содержание CD3+CD4+/CD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RA- и CD45RO - культурах in vitro И Сборник статей по материалам международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация". - М.: МАИК «Наука», 2015 г. - С. 31-34.

16. Сохоневич H.A., Юрова К.А. Хазиахматова О.Г., Литвинова Л.С. Влияние цитокинов, имеющих общую уцепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15) на дифДеоенцииовку цитотоксических - CD8+CD45RO+ Т-лимфоцитов памяти in vitro II Медицинская иммунология. - 2015. - Т. 17. - С. 47-48.

17. Сохоневич H.A., Юрова К.А. Хазиахматова О.Г., Литвинова Л.С. Эффекты цитокинов (1L-2. IL-7 и IL-15} на процессы активации и rroojunbcDamm наивных Т-клеток in vitro // Международный научно-исследовательский журнал. - 2015. -№4(35). - С. 21-25.

18. Сохоневич H.A., Юрова К.А., Литвинова Л.С. Влияние 1L-7 и JL-15 на созревание и дифференцировку наивных Т-лимфоцитов in vitro // Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции «Перспективы развития науки и образования». 28 февраля 2015, г. Москва. - Мин-во обр. и науки. - М.: «Ар-консалт», 2015. - С. 12-13.

19. Сохоневич H.A., Юрова К.А., Литвинова Л.С. Влияние цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7 и IL-15), на изменение содержания числа CD3+CD8+/CD4+CD56+CD62L+CD95+ в популяциях Т-лимфоцитов II Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции Часть 1. М.: «Ар-Консалт». - 2015 г. - С. 25-27.

20. Юрова К.А., Сохоневич H.A., Хазиахматова О.Г., Литвинова Л.С. Влияние иммунорегуляторных цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, IL-7, IL-15) на взаимосвязь между транскрипцией мРНК гена hnRNPLL и мембранной экспрессией костимуляторной молекулы - CD28 в механизмах дифференцировки Т-клеток in vitro // Сборник статей по материалам XXXV международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины». — М.: Изд. «Международный центр науки и образования», 2015. - С.27-31.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CD45 - общелейкоцитарный рецептор CD45RA - Т-лимфоциты, несущие высокомолекулярную изоформу рецептора CD45 CD45RO - Т-лимфоциты, несущие

низкомолекулярную изоформу рецептора CD45 CD4 - популяция хепперных Г-клеток CD8 - популяция цитотоксических Т-клеток CD62L - молекула, отвечающая за поступление Т-клеток из кровяного русла во вторичные лимфоидные органы. CD27, CD28 - молекулы костимуляции. TCR-T-клеточный рецептор (T-cell receptor) Tn - наивные Т-клетки

Tscm - стволовые Т-клетки памяти

Тем - центральные Т-клетки памяти

Тгс (Тп-мил) - терминально дифференцированные

Т-клетки

Тем - эффекгорные Т-клетки Bel -антиапоттлический фактор CD - кластер дифференцировки (cluster of differentiation)

Fas - апоптотический антиген 1L - интерлейкин

МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex)

Подписано в печать 26.06.2015 формат 60X90 1/16 Уел печ листов 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 114 Отпечатано типографией Издательства Балтийского федерального университете им. И. Канте 236041, г. Калининград, ул. Гайдара, 6

2015675325

2015675325