Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль церулоплазмина в регуляции функционального состояния отдельных звеньев иммунитета

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рутницкий, Александр Юрьевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.ю

1.1. Церулоплазмин (Ср) как один из важнейших гликопротеинов организма человека.

1.1.1. Ср в системе белкового гомеостаза организма.

1.1.2. Функциональная активность Ср.

1.1.3. Изменение содержания Ср в плазме крови.

1.2. Обоснование применения препарата Ср в медицинской практике.

1.3. Современные аспекты иммунотерапии.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты работы и их обсуждение.

3.1. Воздействие Ср на некоторые факторы неспецифической резистентности организма.

3.1.1. Участие Ср в активации системы комплемента по классическому пути.

3.1.2. Роль Ср в регуляции функциональной активности фагоцитов доноров.

3.2. Воздействие Ср на основные показатели адгезии мононуклеарных клеток человека.

3.2.1. Влияние Ср на адгезивность мононуклеарных клеток доноров к синтетическому, волокну.

3.2.2. Воздействие Ср на относительное содержание Е-розеткообразующих Т-лимфоцитов в норме и при ожоговой патологии.

3.2.2.1. Влияние Ср на спонтанное розеткообразование Т-лимфоцитов доноров.

3.2.2.2. Воздействие Ср на количество Е-розеткообразующих Т-лимфоцитов ожоговых больных.

3.2.3. Значение Ср в регуляции относительного содержания мононуклеарных клеток, экспрессирующих антигены адгезии, в норме и при ожоговой патологии.

3.2.3.1. Роль Ср в регуляции экспрессии молекул контактного взаимодействия мононуклеарных клеток доноров.

3.2.3.2. Влияние Ср на уровень экспрессии адгезионных рецепторов мононуклеарных клеток ожоговых больных.

3.3. Воздействие Ср на относительное содержание основных популяций мононуклеарных клеток периферической крови в норме и при ожоговой патологии.

3.3.1. Влияние Ср на иммунофенотип мононуклеарных клеток доноров.

3.3.2. Воздействие Ср на иммунофенотип мононуклеарных клеток ожоговых больных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль церулоплазмина в регуляции функционального состояния отдельных звеньев иммунитета"

Актуальность проблемы

Последние десятилетия характеризуются интенсивным исследованием белков плазмы крови, причем выделено и охарактеризовано более 100 белков. Большой интерес представляют так называемые "белки острой фазы", к которым относятся свыше 20 белковых компонентов плазмы крови, в том числе медьсодержащий фермент церулоплазмин (Ср) [КФ 1.16.3.1.], заслуживающий особого внимания ввиду своей удивительной полифункциональности [Борисова Н.А. и др.,1998; Исрафилов А.Г. и др., 1998; Крайнова ТА, Ефремова Л.М., 2000; Arnaud P. et al., 1988; Mateescu М.А. et al„ 1995].

Известно, что Ср благодаря многочисленным эффектам проявляемой им функциональной активности обладает рядом защитных свойств. Они связаны, в частности, с его супероксидустраняющей активностью, особенно актуальной при воспалении [Закирова А.Н. и др., 1994; Halliwell В.,1994; Dumoulin M.J. et al., 1996; Cunningham J.J. et a!., 1996], способностью повышать устойчивость организма к гипоксии [Волчегорский И.А. и др., 1997], стимулировать эритропоэз [Пинчук В.Г. и др., 1985; Gutteridge J.M., 1991], снижать токсический эффект антибиотиков [Ильинская Е.В., Атаманова Н.В., 1997]. Однако, практически не исследованной является иммунотропная активность Ср, а именно проблема его участия в функциональной регуляции факторов неспецифической резистентности организма и механизмов адаптивного иммунного ответа, в частности, в модуляции поверхностного рецепторного пейзажа мононуклеарных клеток периферической крови. В настоящее время изучение регуляции экспрессии их мембранных маркеров различными соединениями приобретает статус самостоятельного направления иммунологических исследований, о чем свидетельствует ряд публикаций [Добротина Н.А. и др.,1992, Новиков Д.К. и др.,1993; Макарков А.И. и др., 1997]. 6

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы определена как исследование in vitro роли Ср в регуляции функционального состояния отдельных звеньев иммунитета.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние Ср на функциональную активность некоторых факторов неспецифической резистентности организма.

2. Изучить воздействие Ср на адгезивные свойства мононуклеарных клеток периферической крови человека.

3. Оценить влияние Ср на характер экспрессии мононуклеарными клетками антигенов адгезии в норме и при ожоговой патологии.

4. Исследовать воздействие Ср на иммунофенотипические признаки, показывающие принадлежность к основным популяциям лимфоцитов здоровых людей и ожоговых больных.

Новизна научных исследований

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование in vitro воздействия Ср на функциональную активность специфических и неспецифических (клеточных и гуморальных) факторов иммунитета периферической крови человека. Работа включает новые данные, касающиеся участия Ср в активации системы комплемента по классическому пути, а также в регуляции фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови доноров. Показано, что в концентрациях 125 и 250 мкг/мл Ср вызывает стимуляцию активности комплемента. Установлен дозозависимый эффект усиления Ср в физиологических концентрациях люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции нейтрофилов, что отражает увеличение фагоцитарной активности этих клеток под воздействием Ср.

Впервые изучено комплексное влияние Ср на показатели адгезии мононуклеарных клеток в норме и при ожоговой патологии, такие как 7 способность клеток к адгезии на синтетическом волокне, к формированию Е-розеток, а также на такие показатели, как относительное содержание мононуклеарных клеток, экспрессирующих различные молекулы адгезии.

Показано, что в малых концентрациях Ср повышает адгезивную способность мононуклеарных клеток доноров" (по данным теста адгезии клеток к синтетическому волокну, а также метода спонтанного розеткообразования), в то время как в физиологических дозах -наоборот, снижает. Установлено, что в концентрации 500 мкг/мл Ср в условиях in vitro статистически достоверно понижает количество CD2- и С018-положительных мононуклеарных клеток доноров, а также содержание CD11 b-положительных клеток ожоговых больных, что говорит об уменьшении экспрессии молекул адгезии при воздействии Ср.

Впервые изучено воздействие Ср на иммунофенотипические признаки, определяющие принадлежность к основным популяциям мононуклеарных клеток периферической крови как в норме, так и при ожоговой патологии. Выявлено, что в физиологических концентрациях Ср достоверно понижает в условиях in vitro относительное содержание донорских клеток, несущих молекулу CD8 (маркер цитотоксических Т-лимфоцитов). Среди мононуклеарных клеток ожоговых больных Ср в физиологических концентрациях вызывает падение относительного числа клеток, экспрессирующих молекулу CD22 (маркер В-лимфоцитов).

Научно-практическая ценность работы

Полученные данные расширяют существующие в настоящее время представления о функциональной регуляции факторов неспецифической резистентности, а также о физиологических механизмах модуляции иммунофенотипа мононуклеарных клеток, свидетельствуя об участии Ср в этих процессах. Теоретическую значимость представляют, в частности, данные, говорящие о дозозависимом эффекте Ср. В субфизиологических концентрациях он 8 повышает активность комплемента и стимулирует адгезивную способность мононуклеарных клеток доноров. В физиологических концентрациях Ср дозозависимым образом снижает адгезивную способность мононуклеарных клеток доноров и ожоговых больных и усиливает фагоцитарную способность донорских нейтрофилов. Кроме того, Ср в физиологических концентрациях" in vitro воздействует на уровень экспрессии ряда мембранных белков клеток крови, что проявляется в изменении относительного количества клеток, несущих такие белки.

Результаты проведенного исследования указывают на то, что Ср способен воздействовать на ряд факторов неспецифической резистентности, а также участвовать в регуляции морфофункциональных свойств клеток иммунной системы человека.

В практическом отношении данные настоящей работы могут служить обоснованием целесообразности применения препарата Ср в клинической практике для нормализации иммунологического гомеостаза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

• Ср оказывает иммуномодулирующее дозозависимое действие на функциональную активность факторов неспецифической резистентности периферической крови здоровых людей комплемента и нейтрофилов.

• Ср служит физиологическим регулятором адгезивных свойств клеток крови. В малых концентрациях Ср повышает адгезивные свойства мононуклеарных клеток, в то время как в физиологических дозах -наоборот, снижает.

• Ср воздействует на уровень экспрессии некоторых мембранных белков клеток крови человека как в норме, так и при ожоговой патологии, проявляя тем самым свойства эндогенного иммуномодулятора. 9

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Основные положения диссертации обсуждены на

• IV, V, VIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 1998, 2001),

• II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998),

• Третьей Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1998),

• XI Всероссийской конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 1998),

• на заседании Нижегородского областного научного общества иммунологов (2001).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами, 7 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики методов исследования, главы результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 156 источников, из которых 49 иностранных. Диссертация также включает приложения.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Рутницкий, Александр Юрьевич

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В настоящее время существуют отдельные сообщения об иммунотропной активности Ср [Пинчук В.Г. й др., 1985; Туркин В.В., Дробот И.В., 1991; Сенюк О.Ф. и др.,. 1994]. Однако они оставляют открытой проблему его комплексного воздействия на функционирование ряда факторов неспецифической резистентности организма, а также проблему системных мембранотропных эффектов Ср по отношению к мононукпеарным клеткам человека. Поэтому представляет закономерный интерес исследование влияния Ср на такие факторы естественной резистентности как система комплемента, нейтрофил-зависимый фагоцитоз, а также на звенья адаптивного иммунного ответа, в частности, на адгезивную способность мононуклеарных клеток и на экспрессию ими функционально важных мембранных белков, принимающих непосредственное участие в реализации механизмов иммунологического распознавания.

3.1. Воздействие Ср на некоторые факторы неспецифической резистентности организма.

3.1.1. Участие Ср в активации системы комплемента по классическому пути.

Известно, что система комплемента представляет собой набор сывороточных белков, активирующихся в результате каскада реакций ограниченного протеолиза. Инициация классического пути начинается со связывания первого компонента комплемента комплексом антиген-антитело [Козлов Л.В., 1997].

53

Для исследования воздействия Ср на активацию системы комплемента по классическому пути применяли гемолитический метод, в основе которого лежит взаимодействие белков комплемента с бараньими эритроцитами, сенсибилизированными кроличьими антителами.

Нами показано, что в концентрациях 25-100 мкг/мл, 500-2000 мкг/мл препарат Ср не вызывает заметных изменений активности комплемента. Однако, в дозах 125 и 250 мкг/мл Ср оказывает стимулирующее действие на активность комплемента, статистически достоверно повышая ее, соответственно, на 14,5 и 10,9% (Р<0,05) (табл. 2).

Полученные результаты дают основание предполагать, что in vivo Ср является фактором, повышающим эффективность активации системы комплемента по классическому пути. Один из вероятных механизмов усиления активации комплемента в присутствии Ср может реализовываться благодаря способности молекулы Ср к ограниченному протеолизу.

Установлено, что в свежевыделенных из плазмы крови препаратах Ср часть материала представлена в виде фрагментов молекулы этого белка. Спонтанная фрагментация Ср может быть промоделирована с помощью трипсина, действующего на полипептидную цепь в тех же уязвимых участках, что и неизвестная протеаза, сопутствующая Ср при его выделении [Нейфах С.А. и др., 1988]. В связи с этим некоторыми авторами высказано предположение о том, что ограниченный протеолиз молекулы Ср может протекать в плазме крови in vivo, в результате чего образуются фрагменты полипептидной цепи этого гликопротеина, выполняющие самостоятельную каталитическую функцию [Васильев В.Б., Кононова С.В.,1987; Arnaud P. et al.,1988]. Возможно, что в условиях целостного организма обладающие протеолитическим эффектом белки крови вызывают формирование каталитически

54

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной предпосылкой исследования иммунорегуляторных эффектов Ср явилась их недостаточная изученность. Детальный анализ литературных данных свидетельствует о том, что существуют лишь отдельные сообщения об иммунотропной активности Ср [Пинчук В.Г. и др., 1985; Туркин В.В., Дробот И.В.,1991; Сенюк О.Ф. и др., 1994], оставляющие открытой проблему его комплексного воздействия на функционирование клеточных и гуморальных факторов неспецифической резистентности организма, а также проблему системных мембранотропных эффектов Ср по отношению к мононуклеарным клеткам периферической крови человека.

В связи с этим цель настоящей работы определена как исследование влияния Ср на функциональное состояние отдельных звеньев иммунитета в физиологических реакциях in vitro, а также при интоксикации организма, сопровождающей ожоговую болезнь.

Для достижения указанной цели было изучено воздействие препарата Ср на такие факторы естественной резистентности, как система комплемента, нейтрофил-зависимый фагоцитоз, а также на механизмы адаптивного иммунного ответа, в частности, на адгезивную способность мононуклеарных клеток и на их иммунофенотип.

Первым этапом настоящей работы явилось исследование воздействия Ср на некоторые факторы неспецифической резистентности организма. Во-первых, нами было изучено влияние Ср на активность системы комплемента. Показано, что в концентрациях 125 и 250 мкг/мл Ср оказывает стимулирующее действие на активность комплемента, статистически достоверно повышая ее, соответственно, на 14,5 и 10,9% (табл. 2). Полученные результаты дают основание предполагать, что in vivo Ср является фактором, повышающим эффективность активации системы комплемента по классическому пути.

97

Во-вторых, было изучено влияние препарата Ср на функциональную активность нейтрофилов периферической крови здоровых людей. Обнаружен дозозависимый иммуномодулирующий эффект Ср, связанный с усилением «дыхательного взрыва» нейтрофилов. В концентрациях от 300 до 600 мкг/мл Ср вызывал выраженное повышение интенсивности ХЛ (табл. 3).

Мы склонны считать, что полученные нами результаты можно объяснить способностью Ср увеличивать резервы внутриклеточных ферментативных систем, реализующих эффекторные функции фагоцитов, то есть модулировать их способность реализовывать иммунное воспаление.

Далее было исследовано влияние Ср на показатели адгезии клеток крови, такие как способность мононуклеарных клеток к адгезии на синтетическом волокне, к спонтанному разеткообразованию, а также на такой показатель как содержание антиген-положительных мононуклеарных клеток, экспрессирующих ряд молекул контактного взаимодействия или, как их называют иначе, рецепторов адгезии.

Первый этап изучения воздействия Ср на адгезивные^ свойства мононуклеарных клеток периферической крови человека был проведен нами в условиях in vitro с помощью стандартизованной модельной системы, предусматривающей взаимодействие с синтетическим волокном популяции выделенных и отмытых от плазмы крови клеток. Синтетическое волокно применяли с целью моделирования физиологических процессов межклеточных взаимодействий во время иммунного ответа [Arnold L. et al., 1974].

Нами установлено выраженное дозозависимое действие Ср на адгезивную способность популяции мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови доноров. В зависимости от концентрации Ср разнонаправленно проявлял свою активность. Так, в интервале концентраций от 62,5 до 250 мкг/мл Ср вызывал достоверное увеличение количества адгезировавшихся на синтетическом волокне

98 клеток. Однако в дозах 500 и 600 мкг/мл Ср вызывал обратный эффект, который проявлялся в виде статистически недостоверного снижения количества прилипающих к синтетическому волокну мононуклеарных клеток, соответственно, на 24,8 и 21,9% по сравнению с контролем (табл. 4).

Таким образом, тест адгезии (прилипания клеток к синтетическому волокну) позволил выявить дозозависимый эффект действия препарата Ср на адгезивные свойства фракции мононуклеарных клеток, носящий двойственный характер. С одной стороны, в малых концентрациях препарат вызывал достоверное повышение адгезии. С другой стороны, эффект действия Ср в концентрациях, лежащих в пределах содержания Ср в плазме крови в норме (500 и 600 мкг/мл), проявлялся в виде тенденции к снижению адгезивности клеток к синтетическому волокну.

По всей вероятности, Ср в физиологических концентрациях несет функциональную нагрузку ограничителя избыточной экспрессии молекул адгезии мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей. Можно предположить, что in vivo Ср поддерживает количество экспонированных на клеточной поверхности антигенов адгезии на некотором оптимальном уровне, проявляя таким образом свои адаптогенные свойства.

Возможно, при различных патологических состояниях (в частности, при некрозах печени, болезни Вильсона-Коновалова), сопровождающихся снижением концентрации Ср в плазме крови, реализуется его иммунопотенцирующая функция регуляции экспрессии рецепторов адгезии на поверхностной мембране мононуклеарных клеток.

В последующих экспериментах в целях более детального исследования воздействия препарата Ср на показатели адгезии иммунокомпетентных клеток мы изучили его влияние на экспрессию ряда рецепторов контактного взаимодействия мононуклеарных клеток с помощью теста спонтанного розеткообразования, а также с помощью

99 метода непрямой иммунофлуоресценции с применением моноклональных антител к мембранным антигенам клеток иммунной системы.

Используя тест спонтанного разеткообразования, мы провели исследование влияния Ср на количественное содержание как "активных", так и "общих" Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) доноров в условиях in vitro.

Изменение количества Е-розеткообразующих Т-лимфоцитов может служить показателем уменьшения либо увеличения уровня экспрессии CD2 антигена. Наряду с методом непрямой иммунофлуоресценции тест спонтанного розеткообразования может быть использован в качестве модели для оценки воздействия различных соединений на уровень экспрессии Т-лимфоцитами молекулы адгезии CD2 [Макарков А.И. и др., 1997].

Показано, что в низких концентрациях Ср обладает эффективным стимулирующим действием на формирование как "активных", так и "общих" Е-розеток. Так, при использовании Ср в концентрациях 25 и 50 мкг/мл наблюдалось статистически достоверное увеличение количества "активных" и "общих" Е-РОК на 30-50% (табл. 6). Однако, при воздействии Ср в концентрациях физиологического диапазона (250-600 мкг/мл) отмечалась обратная тенденция. В сравнении с контролем происходило снижение количества формирующихся розеток обоих типов в среднем на 15-30% (табл. 6).

Полученные нами данные о влиянии Ср на процесс спонтанного розеткообразования Т-клеток доноров свидетельствуют о том, что изучаемый острофазный белок отличается выраженным диморфизмом активности (±регуляцией) в зависимости от концентрации, что можно охарактеризовать как дозозависимый иммуномодулирующий эффект, который в условиях in vitro проявлялся уже в малых дозах (25-50 мкг/мл).

100

Поскольку в тесте in vitro на клетках доноров нами обнаружено снижение количества Е-РОК под влиянием препарата Ср в диапазоне физиологических концентраций (250-600 мкг/мл), то можно предположить, что у здоровых людей Ср играет роль гомеостатического ограничителя избыточной экспрессии молекулы адгезии CD2.

В то же время, нами показано, что Ср в низких концентрациях (25100 мкг/мл) вызывает стимуляцию розеткообразования. Поэтому возможно, что при различных патологических состояниях, сопровождающихся снижением содержания Ср в плазме крови, этот белок выполняет функцию иммуномодулятора, повышающего экспрессию молекулы адгезии CD2 и тем самым стимулирующего антигенспецифический Т-кпеточный ответ, который, как известно, опосредуется С02-С058-адгезией [Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995].

Сравнивая результаты, полученные с помощью тестов адгезии и розеткообразования, можно заключить, что характер изменений иммунологических показателей был одним и тем же. То есть, по крайней мере часть эффекта, состоящего в уменьшении процента прилипающих к синтетическому волокну мононуклеарных клеток доноров под влиянием препарата Ср в концентрациях физиологического диапазона (500, 600 мкг/мл), можно объяснить снижением экспрессии молекулы адгезии CD2, показателем которого служит уменьшение количества Е-розеткообразующих мононуклеарных клеток, зарегистрированное в тесте розеткообразования.

В то же время, представляло интерес исследовать воздействие Ср на морфофункциональные свойства Е-рецепторов в условиях нарушенного иммунного статуса и эндоинтоксикации. Одним из ярких примеров патологии, сопровождающейся дисбалансом иммунных реакций, является ожоговая болезнь. Кроме того, при ожоговой болезни развивается ее характерный патогномоничный синдром эндоинтоксикация, отражающий тяжесть, остроту заболевания и

101 определяющий различные висцеропатии [Турсунов Б.С. и др., 1992]. В результате поражения клеточных мембран при ожогах также возникают нарушения нормального функционирования клеточных рецепторов [ЗаецТ.Л., Никулин В.И., 1990].

С помощью теста спонтанного розеткообразования нами было исследовано воздействие Ср на формирование «активных» и «общих» розеток мононукпеарными клетками периферической крови ожоговых больных, дающее возможность судить об изменении экспрессии молекулы адгезии CD2. Выявлена тенденция к снижению количества "активных" и "общих" Е-РОК под влиянием Ср в концентрациях 300 и 600 мкг/мл (табл. 7).

Основываясь на полученных нами данных, можно предположить, что in vivo Ср при ожоговой патологии, так же как и у здоровых людей, реализует функцию, связанную с поддержанием экспрессии Е-рецептора (=CD2 антигена) мононуклеарных клеток на определенном уровне, наиболее оптимальном для функционирования Т-клеточной популяции лимфоцитов. Так как известно, что CD2 антиген является ключевым звеном альтернативного пути активации Т-клеток [Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г., 1997], то мы склонны считать, что in vivo Ср при ожоговой болезни, вероятно, выполняет роль одного из факторов, сдерживающих развитие аутоиммунных процессов путем ограничения экспрессии CD2 антигена.

Поскольку CD2 антиген, выявляемый в тесте спонтанного розеткообразования Т-лимфоцитов, является лишь одним из нескольких рецепторов адгезии, в дальнейшей работе мы исследовали воздействие

Ср на количество мононуклеарных клеток, положительных по другим молекулам адгезии.

С помощью МКА было изучено воздействие Ср в физиологической концентрации (500 мкг/мл) на относительное содержание CD2-, CD11b-, CD18- и СР50-положительных мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей. Изменение содержания антиген-положительных

102 клеток может служить свидетельством уменьшения либо увеличения общего уровня экспрессии определенного дифференцировочного антигена.

Инкубация мононуклеарных клеток периферической крови доноров в присутствии Ср приводила к статистически достоверному снижению количества СР2-положительных лимфоцитов. Обнаружено также статистически значимое снижение содержания С018-положительных клеток, связанное с предварительной инкубацией мононуклеарных клеток в присутствии Ср. Кроме того, выявлена тенденция к снижению количества CD11Ь- и С050-положительных мононуклеарных клеток под влиянием Ср, которая хотя и не являлась статистически достоверной, но четко наблюдалась в большинстве экспериментов (рис. 5).

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что Ср оказывает ингибирующее воздействие на экспрессию исследованных в настоящей работе мембранных молекул адгезии мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей. Об этом свидетельствует тот факт, что предварительная инкубация мононуклеарных клеток в присутствии препарата Ср во всех случаях приводила к снижению количества антиген-положительных клеток. Эти результаты находятся в полном соответствии с данными, полученными в тесте спонтанного розеткообразования и в тесте адгезии мононуклеаров на синтетическом волокне, показавших, что в концентрациях 500 и 600 мкг/мл Ср вызывает снижение адгезивных свойств мононуклеарных клеток доноров (см. разделы 3.2.1. и 3.2.2.1.).

По-видимому, способность Ср in vitro модулировать уровень экспрессии CD2 и CD18 антигенов мононуклеарных клеток доноров может in vivo играть роль в регуляции иммунологических процессов, протекающих с участием молекул адгезии, которые необходимы для генерации армированных эффекторных Т-клеток, а также для реализации их функций.

103

Влияние препарата Ср на относительное содержание мононуклеарных клеток человека, экспрессирующих молекулы адгезии, было также изучено на примере ожоговой патологии. В тесте непрямой иммунофлуоресценции с помощью МКА серии ИКО исследовано воздействие препарата Ср в физиологической концентрации (500 мкг/мл) на количество CD11b-, CD18- и С050-положительных мононуклеарных клеток периферической крови ожоговых больных.

Зарегистрировано статистически достоверное снижение содержания CDHb-положительных мононуклеарных клеток. Преинкубация клеток с Ср приводила также к снижению количества СЭ18-положительных мононуклеарных клеток, что не носило характера статистически значимых изменений. Каких-либо различий в количестве С050-положительных клеток в опыте и контроле выявлено не было (рис . 5).

Известно, что молекула CD11 b участвует во взаимодействии клеток крови и эндотелия, в проникновении их сквозь высокий эндотелий кровеносных сосудов в ткани [Боценовский В.А., Барышников А.Ю., 1994; Боценовский В.А. и др., 1995]. Опираясь на полученные нами результаты, свидетельствующие о снижении экспрессии CD11b/CD18 гетеродимера мононуклеарных клеток ожоговых больных после преинкубации этих клеток с Ср, можно предположить, что in vivo Ср принимает участие в торможении процессов миграции лимфоцитов в ткани при ожогах. Лимфоциты, утратившие способность мигрировать, вероятно, несут признаки анергии. То есть, они коммитированы по апоптотическому пути вследствие ряда процессов, связанных с ожоговой патологией. Можно предположить, таким образом, что у ожоговых больных" Ср принимает участие в реализации отдельных звеньев механизма иммуносупрессии. По существующим в настоящее время представлениям последняя является компенсаторным механизмом в ответ на чрезмерную активацию иммунной системы, связанную с появлением в организме продуктов ожогового распада

104 биологических структур. Таким образом, и в данном случае можно говорить об адаптогенном воздействии Ср.

Анализируя иммуномодулирующее действие Ср по отношению к антигенам адгезии мононуклеарных клеток в норме и при патологии, наблюдаемое in vitro, можно заключить, что в малых концентрациях Ср повышает уровень экспрессии рецепторов контактного взаимодействия, в то время как в физиологических дозах - наоборот, снижает. Этой особенностью Ср, как физиологический, натуральный препарат отличается от химических иммунорегуляторов, которые меняют состояние показателей системы в одном направлении. Полученные нами данные, вероятно, свидетельствуют о том, что in vivo Ср в определенных концентрациях выступает в роли иммуномодулятора, то есть как в роли стимулятора, так и ограничителя экспрессии адгезионных рецепторов мононуклеарных клеток доноров и ожоговых больных.

На следующем этапе работы мы исследовали воздействие Ср на относительное содержание основных популяций мононуклеарных клеток периферической крови в норме и при ожоговой патологии. Сначала было изучено влияние Ср на количество CD4-, CD8-, CD22-, CD25- и С095~положительных мононуклеарных клеток, выделенных из крови доноров.

Показано статистически достоверное снижение количества CD8-положительных клеток под влиянием препарата Ср на 32,2% по сравнению с контролем. В то же время, Ср не вызывал достоверных изменений в содержании CD4-, CD22-, CD25- и С095-антиген-положительных клеток. Однако, была зарегистрирована общая тенденция к незначительному снижению относительного содержания данных популяций клеток под влиянием Ср, которое наблюдалось во всех случаях (табл. 9).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инкубация мононуклеарных клеток периферической крови с Ср в условиях in vitro

105 приводит к снижению количества клеток, несущих ряд мембранных антигенов. Падение уровня антиген-положительных клеток может быть объяснено снижением общего уровня экспрессии антигенов в популяции клеток под влиянием Ср.

Обсуждая возможные механизмы изменения препаратом Ср уровня экспрессии поверхностных маркеров мононуклеарных клеток человека, следует иметь в виду, что в живой клетке постоянно протекают два уравновешивающих друг друга процесса: погружение мембранных белковых структур в клетку (или сбрасывание их во внеклеточное пространство и реэкспрессия новых молекул на поверхности клетки. Предполагают, что изменение микроокружения иммунокомпетентных клеток влияет на процесс циркуляции антигенов клеточной поверхности [Макарков А.И. и др., 1997]. Видимо, Ср является одним из факторов микроокружения, которые влияют на экспрессию ряда дифференцировочных антигенов мононуклеарных клеток. Воздействие Ср на состояние клеточной мембраны, предположительно, может быть связано с антиоксидантными свойствами этого острофазного белка. Как показали полученные результаты, отсутствие Ср в микроокружении клеток вызывает повышение экспрессии мембранных белков, причем для разных белков такое повышение неодинаково. Возможно, обнаруженная реакция является защитной в условиях снижения антиоксидантного потенциала клеточного микроокружения, а также в условиях соответствующего повышения вероятности нарушения структурно-функционального состояния клеток.

Выявленное in vitro снижение в результате воздействия Ср содержания донорских мононуклеарных клеток, экспрессирующих CD8 антиген и молекулы адгезии, вероятно, отражает роль этого острофазного белка in vivo в регуляции иммунного ответа на различных этапах его реализации. Возможно, что Ср ограничивает генерацию и чрезмерную функциональную активность цитотоксических CD8-положительных клеток, обладающих высоким разрушительным

106 потенциалом, а также принимает участие в регуляции процессов адгезии, реализующихся как на уровне формирования эффекторных Т-клеток, так и на различных этапах выполнения ими своих функций.

Мы склонны считать, что в организме человека Ср выступает в роли физиологического ограничителя экспрессии ряда мембранных молекул, поддерживая клетки иммунной системы на определенном, оптимальном для ее функционирования гомеостатическом уровне.

Представляло интерес на примере ожоговой патологии, в условиях измененного антигенного пейзажа клеточной поверхности изучить воздействие на него препарата Ср в физиологической концентрации.

Установлено статистически достоверное снижение количества С022-положительных мононуклеарных клеток ожоговых больных под влиянием Ср. Однако, препарат не вызывал статистически достоверных изменений в содержании CD4-, CD8-, CD25- и СР95-положительных мононуклеарных клеток (рис . 6).

Поскольку нами было зафиксировано снижение количества CD22-положительных лимфоцитов ожоговых больных, то мы склонны считать, что in vivo Ср принимает участие в снижении уровня сигнала, проходящего через В-клеточный антигенный рецептор, а также в ограничении и оптимизации процессов активации В-лимфоцитов при ожоговой патологии. Активация этих клеток может проявляться такими явлениями, как выработка аутоантител к продуктам тканевого распада. Поэтому мы полагаем, что регулирующее действие Ср в организме ожоговых больных, реализуемое путем снижения содержания CD22положительных мононуклеарных клеток, вероятно, заключается в снижении интенсивности процессов, связанных с аутоантителообразованием.

Таким образом, воздействие Ср на иммунофенотипические характеристики мононуклеарных клеток ожоговых больных отличается от его воздействия на иммунофенотип клеток крови доноров. Это

107 свидетельствует об особенностях иммуномодулирующего действия Ср при ожоговой патологии в условиях развивающейся иммуносупрессии.

Суммируя полученные в ходе настоящей работы результаты, можно заключить, что Ср проявляет иммуномодулирующий эффект, направленный на ряд факторов неспецифической резистентности, а также на звенья адаптивного иммунного ответа. Иммуномодулирующее влияние Ср носит двойственный дозозависимый характер (по данным тестов адгезии мононуклеарных клеток к синтетическому волокну, спонтанного розеткообразования). В зависимости от концентрации Ср или стимулирует, или ингибирует процессы адгезии. Таким образом, на примере действия Ср ярко и убедительно подтверждается общебиологическая закономерность разнонаправленного действия биологически активных веществ в зависимости от их дозы [Ильинская О.Н., 1998].

Полученные нами результаты обосновывают целесообразность терапевтического применения препарата Ср как иммуномодулятора и адаптогена. Дальнейшее изучение иммуномодулирующих свойств Ср и механизмов его активности, поиск новых подходов к использованию этого острофазного белка в клинике представляют большой научный и практический интерес.

108

1. Ср в условиях in vitro оказывает действие на показатели неспецифической резистентности организма. В концентрациях 125250 мкг/мл Ср активирует систему комплемента. В физиологических дозах Ср повышает . люминолзависимую стимулированную хемилюминесценцию нейтрофилов, что отражает увеличение их фагоцитарной активности.

2. В субфизиологических концентрациях Ср повышает адгезивные свойства мононуклеарных клеток периферической крови доноров, в то время как в физиологических дозах - наоборот, снижает.

3. В малых дозах Ср стимулирует образование "активных" и "общих" Е-розеток доноров. В концентрациях физиологического диапазона Ср ингибирует формирование Е-розеток обоих типов.

4. В условиях in vitro Ср в концентрации 500 мкг/мл снижает относительное количество CD2+, CD18+ и CD8+ мононуклеарных клеток крови доноров, что свидетельствует об ограничении экспрессии указанных белков на поверхностной клеточной мембране.

5. При ожоговой патологии Ср в физиологических концентрациях снижает способность Т-лимфоцитов к формированию розеток, а также воздействует на уровень мембранной экспрессии CD11b и CD22 молекул, приводя в условиях in vitro к снижению относительного содержания соответствующих антиген-положительных клеток.

6. В целом, Ср обладает многонаправленным, двойственным и дозозависимым иммуномодулирующим эффектом, воздействуя как на показатели естественной резистентности, так и на морфофункциональное состояние клеток, участвующих в реализации адаптивного иммунного ответа.

109

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рутницкий, Александр Юрьевич, Нижний Новгород

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: в 3-х т. М.: Мир, 1993. - Т: 2. - 539 с.

2. Александров А.В., Джексон A.M., Румянцев А.Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM. // Иммунология. -1997.-№ 1.- С. 4- 11.

3. Алексеева Н.Н. Изменение активности церулоплазмина в сыворотке крови под воздействием различных факторов (обзор). // Гигиена и санитария. 1991 .- № 8. - С. 70 - 71.

4. Антоненко С.Г., Бердинских Н.К., Санина О.Л. и др. Влияние церулоплазмина на метаболические процессы в печени мышей при нейтронном воздействии. // Радиобиология. 1990. - Т. 30. - № 1. - С. 80 - 83.

5. Артюхов В.Г., Гусинская В.В., Зарубаева Г.И. Роль фотомодификации некоторых компонентов крови в изменении функциональной активности системы комплемента сыворотки доноров. // Иммунология. 1990. - № 6. - С. 9 - 12.

6. Асельдерова А.Ш. Иммунопротекторный эффект церулоплазмина в остром периоде у больных, перенесших критические состояния различного генеза. // Анестезиология и реаниматология. 1992. - № 2.-С. 43-45.

7. Асецкая И.Л., Егоров Д.Ю., Козлов А.В. и др. Антиоксидантная система церулоплазмин-трансферрин при атеросклерозе в эксперименте и клинике. // Вестник АМН СССР. 1990. - №12. - С. 41 -45.

8. Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Гусева М.Д. и др. Клиническое значение определения активности церулоплазмина в сыворотке крови при увеитах у детей. // Вестник офтальмологии. 1989. - Т. 105. - № 2. - С. 60-62.110

9. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. М.: Медицина, 1997. -212 с.

10. Бердинских Н.К., Волощенко Ю.В., Лившиц В.И. и др. Влияние церулоплазмина на рост экспериментальных опухолей и пролиферативную активность клеток. // Эксперим. онкология. 1984. -Т. 6-№3.-С. 63-66.

11. Бердинских Н.К., Исмайлова И.М., Юдин В.М. Иммуномодулирующая активность экзогенного церулоплазмина при экспериментальном опухолевом процессе. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1992. - Т. 113. - № 5. - С. 520 - 522.

12. Бердинских Н.К., Савцова З.Д., Санина О.Л. и др.Антиоксидантное и иммуномодулирующее воздействие церулоплазмина при экспериментальной гриппозной инфекции. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1994,- Т. 118. - №9. - С. 285 - 287.

13. Бобырев В.Н., Гайшенец В.Ф., Гавриш И.Н. Состояние свободнорадикального окисления липидов у крыс с алиментарной гиперхолестеринемией и его коррекция церулоплазмином. // Фармакология и токсикология. 1989. - Т. 52. - №6. - С. 73 - 74.

14. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии человека. // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 114. - Вып. 6 -С. 741 -753. ■

15. Боценовский В.А., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. и др. Моноклональные антитела ICO-108 к антигену CD18 и их характеристика методом проточной цитофлюорометрии. // Иммунология. 1995. - № 4. - С.45 - 48.111

16. Василец И.М. Церулоплазмины, их молекулярная структура и биологические функции. // Успехи биол. химии. 1973. - Т. 14. - С. 172-197.

17. Васильев В.Б., Кононова С.В. Различия в каталитических свойствах фрагментов молекулы церулоплазмина. // Биохимия. -1987. Т. 52. - № 3 - С. 387 - 395.

18. Васильев В.Б., Качурин A.M., Сорока Н.В. Дисмутирование супероксидных радикалов церулоплазмином детали механизма. // Биохимия. - 1988. - Т. 53. - № 12. - С. 2051 - 2058.

19. Васильев В.Б., Качурин A.M., Рокко Дж.-П. и др. Спектральные исследования активного центра церулоплазмина при удалении и возвращении в него ионов меди. // Биохимия. 1996. - Т. 61. - № 2. -С. 296 - 307.

20. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран. // Биофизика. 1987. - Т. 32. - № 5. - С. 830 - 841.

21. Волчегорский И.А., Львовская Е.И., Глузмин М.И. и др. Изменение антиокислительной активности сыворотки крови при воспалительной патологии. // Вопр. мед. химии. 1997. - Т. 43. - № 4. - С. 233 - 238.

22. Воробьев В.Г., Новиков В.В., Лебедева А.И. Иммунодиагностика острых лейкозов. Нижний Новгород: НГМА, 1998. - 68 с.

23. Гайцхоки B.C., Воронина О.В., Денежкина В.В. и др. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы. // Биохимия. -1990. Т. 55. - № 5. - С. 927 - 935.

24. Гамалея Н.Ф., Шишко Е.Д., Косинская Н.П. и др. Суточные ритмы Е-розеткообразующей способности лимфоцитов человека. // Иммунология. 1990. - № 1. - С. 21 - 23.

25. Гинзбург Р.Л. Ожоги. М.: Медицина, 1971. - 166 с.

26. Добротина Н.А., Казакова И.М., Ежова Г.П. Антигены клеток крови и других тканей человека: учебное пособие. Горький: Горьк. гос. унт, 1990.-67 с.112

27. Добротина Н.А., Ежова Г.П., Казацкая Ж.А. и др. Сравнительная характеристика биологической и иммуномодулирующей активности некоторых ферментных препаратов микробного происхождения. // Науч. докл. высш. школы. Биол. науки. 1992. - № 2. - С. 90 - 96.

28. Ершов Ф.И. Иммуномодуляторы новое поколение противовирусных средств. // Эксперим. и клин, фармакол. - 1995. - Т. 58. - № 2. - С. 74 - 78.

29. Ершов Ф.И., Малиновская В.В. Иммуномодуляторы в профилактике и терапии вирусных инфекций. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 3. -С. 122-125.

30. ЗаецТ.Л., Никулин В.И. Метаболизм при ожогах: учебное пособие. -М.: ЦОЛИУВ, 1990.-22 с.

31. Зайцев В.Н., Мошков К.А., Шавловский М.М. и др. Рентгенографическое изучение церулоплазмина человека и его модифицированных форм. // Биоорганич. химия. 1975. - Т. 1. - № 10.-С. 1521 - 1527.

32. Закирова А.Н., Мингазетдинова Л.Н., Камилов Ф.Х. и др. Антиоксидант церулоплазмин: влияние на перекисное окисление липидов, гемореологию и течение стенокардии. // Терапевт, арх. -1994. Т. 66. - № 9. - С. 24 - 28.

33. Ильинская Е.В., Атаманова Н.В. Экспериментальное исследование ультраструктуры спирального органа при введении канамицина и церулоплазмина. // Вестн. оториноларингологии. -1997. №4. - С. 24-26.113

34. Ильинская О.Н. Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз: Автореф. дис. д-ра биол. наук. -Казань: Казанский гос. ун-т, 1998. -45 с.

35. Исрафилов А.Г. Получение церулоплазмина из отходов производства препаратов крови: Автореф. дис. канд. мед. наук. -Уфа: Башкирский гос. ун-т, 1993. -22 с.

36. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. Санкт-Петербург: Гиппократ, 1992. - 225 с.

37. Козлов А.В., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А. и др. Антиоксидантная система трансферрин церулоплазмин при экспериментальной гиперхолестеринемии. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1984. - Т. 98. - № 12. - С. 668 - 670.

38. Козлов И.Г., Горлина Н.К., Чередеев А.Н. Рецепторы контактного взаимодействия. // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 14 - 24.

39. Козлов Л.В. Белки системы комплемента: активация и регуляция. // Иммунология. 1997. - № 2. - С. 8 - 13.

40. Крайнова Т.А., Ефремова Л.М. Церулоплазмин. Биологические свойства и клиническое применение. Нижний Новгород: НГМА, 2000.-31 с.

41. Кубышева Н.И. Состояние свободнорадикального окисления, иммунной системы организма и их взаимосвязь при воспалении на примере бронхиальной астмы: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Нижний Новгород: НГМА, 1999. 18 с.

42. Ларский Э.Г. Методы определения и метаболизм металло-белковых комплексов. // Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия.-Т. 41.-М.: ВИНИТИ, 1990.-198 с.114

43. Литвина М.М., Никонова М.Ф., Кондратенко И.В. и др. Нарушение CD3- и С02-зависимых путей активации Т-лимфоцитов при иммунодефицитных состояниях у детей. // Иммунология. 1998. - № 1.-С. 48-50.

44. Лихолетов С.М. Современные аспекты разработки вакцин, адъювантов и иммуномодуляторов. // Успехи современной биологии. -1988.-Т. 105.-№1,-С. 83-99.

45. Логинов А.С., Матюшин Б.Н., Ткачев В.Д. и др. Новый подход к диагностике холестаза по активности медьсодержащих ферментов. // Терапевт, арх. 1993. - Т. 65. - № 2. - С. 34 - 36.

46. Ляпон А.О. Комплексный анализ Т-лимфоцитов в тесте розеткообразования. // Лаб. дело. 1980. - № 1. - С.36 - 39.

47. Макарков А.И., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М. Механизмы регуляции экспрессии поверхностных структур дифференцированного лимфоцита. // Иммунология. 1997. - № 3. - С. 4 - 8.

48. Мальеа Л., Диас Х.В., Гонсалес-Гриего А. Простой метод выделения лимфоцитов из периферической крови человека. /Лаб. дело.- 1979.-№ 1.-С. 7-8. ,

49. Марри Р., Греннер Д., Мейес П. и др. Биохимия человека: в 2-х т. -М/. Мир, 1993.-Т.2.-415 с.

50. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. -Казань: Магариф, -1995. 192 с.

51. Мжельская Т.И., Завалишин И.А., Иванова-Смоленская И.А. и др. Активность церулоплазмина сыворотки крови при прогрессирующих заболеваниях центральной нервной системы. // Лаб. дело. 1989. -№ 11.-С. 12-16.

52. Мжельская Т.И., Иванова-Смоленская И.А., Коробова Н.В. Факторы, влияющие на концентрацию сывороточного церулоплазмина при болезни Вильсона-Коновалова. // Вопр. мед. химии. 1994. -Т. 40. - № 6. - С. 48 - 53.

53. Мотавкина Н.С., Ковалев Б.М., Шаронов А.С. Микрометод определения комплементарной активности сывороток крови и других биологических жидкостей. // Лаб. дело. 1980. - № 7. - С. 433 - 434.

54. Мошков К.А., Усатенко М.С., Бурмистров С.О. и др. Определение ферментативно-активного и иммунореактивного церулоплазмина в сыворотке крови человека. // Лаб. дело. 1985. - № 7. - С. 390 - 394.

55. Нейфах С.А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков. // Успехи биол. химии. 1988. - Т. 28. - С. 102 - 123.

56. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. Мн.: Беларусь, 1979.-222 с.

57. Новиков Д.К., Мельникова Л.А., Гресь А.А. Влияние иммуномодуляторов различной природы на экспрессию маркеров Т-лимфоцитов in vitro. // Иммунология. 1993. - № 1. - С. 28 - 30.

58. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 1995. - 224 с.

59. Пинчук В.Г., Бердинских Н.К., Волощенко Ю.В. Экспериментальное обоснование применения в клинике ферментного препарата крови церулоплазмина. // Вестник АМН СССР. - 1985. - № 1. - С. 22 - 27.

60. Подопригорова В.Г., Козлов А.В., Азизова О.А. Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы церулоплазмин трансферрин у доноров. // Лаб. дело. - 1989. - № 1. - С. 13-15.

61. Положенкова Л.А., Шехтман М.М. Болезнь Вильсона- Коновалова и беременность. // Сов. медицина.- 1988. № 12. - С. 93 - 95.116

62. Пржибыл Т., Алейникова Т.Д., Васильев В.Б. и др. Свойства церулоплазмина крысы, содержащего серебро. // Биохимия. 1989. -Т. 54. - №4.-С. 601 -609.

63. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В. и др. Некоторые свойства рецептора церулоплазмина, выделенного из мембран эритроцитов человека. II Биохимия. 1990. - Т. 55. - № 12. - С. 2182 -2189.

64. Пучкова Л.В., Денежкина В.В., Захарова Е.Т. и др. Биосинтез церулоплазмина в различных органах крысы. // Биохимия. 1990а. -Т. 55.-№11.-С. 2095-2102.

65. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Гайцхоки B.C. и др. Взаимодействие молекулярных форм Ср со специфическими рецепторами мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией. // Биохимия. -1991. Т. 56. - № 12. - С. 2261 - 2269.

66. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В. и др. Молекулярный дефект выведения меди через желчь у больных гепатолентикулярной дегенерацией. // Биополимеры и клетка. -1991а. Т.7.- № 3. - С. 24 - 30.

67. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Вербина И.А. и др. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печени крысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь. // Биохимия. 1993. - Т. 58. - № 12. -С. 1893-1901. .

68. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т. и др. Регуляция биосинтеза молекулярных форм церулоплазмина в онтогенезе крыс. II Биохимия. 1994. - Т.59. - № 9. - С. 1304 - 1311.117

69. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В. и др. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации у крыс. // Биохимия. 1994а - Т. 59. - № 2. - С. 296 - 302.

70. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д. и др. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 19946. - Т. 117. - № 1. - С. 83 - 85.

71. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д. и др. Взаимодействие церулоплазмина с рецептором плазматической мембраны клеток CV1.и его регуляция по типу обратной связи. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1995. - Т. 119. - № 4. - С. 417 - 420.

72. Пучкова Л.В., Захарова Е.Т., Алейникова Т.Д. и др. Сравнительный анализ молекулярной микрогетерогенности церулоплазмина крови и грудного молока человека. // Биохимия. -1997. Т. 62. - № 8. - С. 1082 - 1085.

73. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д. и др. Реконструирование пути межклеточного переноса пептидной части молекулы церулоплазмина в организме млекопитающих. // Биохимия. 1997а. - Т. 62. - № 7. - С. 817 - 825.

74. Рагимов Ч.Р., Касаганова Н.Ю., Тер-Асатуров Г.П. и др. Диагностическое значение соотношения показателей про- и антиоксидантных систем периферической крови в профилактике осложнений у больных после операций на мягких тканях лица и шеи.

75. Стоматология. 1991. - Т. 70. - № 1. - С. 45 - 47.

76. Рафиков Х.С. Выявление наследственных вариантов церулоплазмина и гаптоглобина в сыворотке крови человека на одной фореграмме. // Лаб. дело. 1980. - № 4. - С. 253 - 254.

77. Рослый И.М., Ромм А.Р., Азизова О.А. и др. Перекисное окисление липидов в крови больных гнойными менингитами. // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1990. - № 4. - С. 40 - 41.

78. Рузов В.И., Черняускене Р.Ч., Вилюнас С.А. и др. Возможности коррекции гелий-неоновым лазером антиоксидантной118недостаточности в условиях гиподинамии. // Вопр. курортологии, физиотерапии и лечеб. физ. культуры. 1991. - № 1. - С. 46 -47.

79. Рыльков В.В., Тарасьев М.Ю., Мошков К.А. Новая форма медьсодержащих центров в церулоплазмине человека. // Биохимия. 1990.-Т. 55.-№ 8.-С. 1367-1373.

80. Саенко Е.Л., Басевич В.В., Ярополов А.И. Особенности взаимодействия церулоплазмина со специфическим рецептором эритроцитов человека. // Биохимия. 1988. - Т. 53. - № 2. - С. 317 -320.

81. Саенко Е.Л., Скоробогатько О.В., Мжельская Т.И. и др. Защитное действие, оказываемое церулоплазмином человека на эритроциты при гепатоцеребральной дистрофии. // Биохимия. 1989. - Т. 54. - № 10.-С. 1617-1622.

82. Саенко Е.Л., Скоробогатько О.В., Ярополов А.И. Защитное действие церулоплазмина при лизисе эритроцитов человека, индуцированном ионами железа. // Биохимия. 1990. - Т. 55. - № 9. -С. 1563-1569.

83. Саенко Е.Л., Ярополов А.И. Защитное действие разных форм церулоплазмина человека при медьиндуцированном лизисе эритроцитов. // Биохимия. 1991. - Т. 56. - № 4. - С. 648 - 653.

84. Саенко Е.Л., Скоробогатько О.В., Ярополов А.И. Взаимосвязь между строением vi защитным действием препаратов нормального и патологического церулоплазмина при медьиндуцированном лизисе эритроцитов. // Биохимия. 1991. - Т. 56. - № 5. - С. 820 - 826.

85. Санина О.Л., Бердинских Н.К. Биологическая роль церулоплазмина и возможности его клинического применения (обзор литературы). // Вопр. мед. химии. 1986. - Т. 32. - № 5. - С. 7 - 14.119

86. Сенюк О.Ф., Скоробогатько О.В., Тарасенко П.Д. и др. Исследование физиологических функций церулоплазмина человека. Влияние церулоплазмина на иммуноциты в норме и при патологии. // Биохимия. 1994. - Т. 59. - № 10. - С. 1503 - 1510.

87. Сидельников Ю.Н., Сиворакша Г.А. Инактивация серотонина у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом. // Вопр. мед. химии. 1996. - Т. 42. - № 4. - С. 319 - 321.

88. Сорокин А.Б., Бубнова В.И., Русаков В.И. и др. Активность церулоплазмина сыворотки крови при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. -1990. Т. 145. - № 12. - С. 12 - 14.

89. Тарасьев М.Ю., Сабуренкова Е.П., Данциг И.И. и др. О влиянии конформации церулоплазмина на его активность: значение для клинического анализа. // Вопросы мед. химии. 1991. - Т. 37. - № 5. -С. 43-45.

90. Теселкин Ю.О. Влияние церулоплазмина на способность плазмы крови ингибировать перекисное окисление липидов. // Перекисное окисление липидов и антиоксидантная терапия при ишемической болезни сердца: Межвуз. сб. Горький: ГМИ, 1988. - С. 55 - 65.

91. Тинтерис Л.В., Шапошников A.M. Аллостерическая регуляция активности церулоплазмина. // Биохимия. 1978. - Т. 43. - № 6. - С. 979 - 987.

92. Туркин В.В., Дробот И.В. Иммуноферментный анализ церулоплазмина. II Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1991. - № 7. - С. 66 - 69.120

93. Турсунов B.C., Махмудов К.Х., Туйчиев Д.А. Целесообразность применения миелопида В-активина. в комплексном лечении ожоговой болезни. // Иммунология. 1992. - № 6. - С. 42 - 43.

94. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотропных лекарственных средствах. // Иммунология. 1996. -№6.-С. 4-9.

95. Характер Ж.З, Скорая Р.И., Платонова И.Л. Показатели церулоплазмина и перекисного окисления липидов у больных туберкулезом легких. // Врачеб. дело. 1989. - № 10. - С. 55 - 57.

96. Хмелевская И.Г., Рагулина В.А., Конопля А.И. и др. Некоторые иммобилизованные протеазы и их активаторы как иммунокорригирующие средства. // Антибиотики и химиотерапия. -1997. -Т. 42. -№3,- С. 11 -14.

97. Шавловский М.М., Чеботарь Н.А., Конописцева Л.А. и др. Влияние церулоплазмина на эмбриотоксический эффект ионов серебра. II Биохимия. 1994. - Т. 59. - № 8. - С. 1164 - 1173.

98. Ширинский B.C., Жук Е.А. Проблемы фармакодинамики и фармакокинетики иммуностимулирующих препаратов. II Иммунология. 1994. - № 6. - С. 27 - 29.

99. Щепотин И.Б., Черный В.А., Бердинских Н.К. и др. Применение церулоплазмина в сочетании с адьювантной полихимиотерапией при раке желудка. // Врачеб. дело. 1991. - № 3. - С.24 - 27.

100. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах. // Иммунология. 1996. - № 6. - С. 10 - 21.

101. Arnaud P., Gianazza Е., Miribel L. Ceruloplasmin. // Methods in Enzymology. 1988. -V. 163. - P. 441 -452.121

102. Arnold L, Zentnek D., Alan P. The induction of augmented granulocyte adherence by a plasma factor. // From the Department of medicine university of Pennsylvania school of medicine. Philadelphia, 1974. - P. 111-114.

103. Atanasiu R., Gouin L., Mateescu M.A. et al. Class III antiarrhythmic effects of ceruloplasmin on rat heart. // Can. J. Physiol. Pharmacol.1996. V. 74. - № 6. - P. 652 - 656.

104. Bieganowska K., Czlonkowska A. Diagnosis of Wilson disease by methods of molecular genetics. // Neurol. Neurochir. Pol. 1994. -V. 28. - № 4. - P. 577 - 583.

105. Cunningham J.J., Lydon M.K., Emerson R. et al. Low ceruloplasmin levels during recovery from major burn injury. // Nutrition. 1996. - V. 12. -№ 2.-P. 83-88.

106. Davis W., Chowrimootoo G.F., Seymour C.A. Defective biliary copper excretion in Wilson ■ s disease: the role of ceruloplasmin. // Eur. J. Clin. Invest. 1996. - V. 26. - № 10 - P. 893 - 901.

107. Dumoulin M.J., Chahine R., Atanasiu R. et al. Comparative antioxidant and cardioprotective effects of ceruloplasmin, superoxide dismutase and albumin. //Arzneimittel Forsch. - 1996. - B. 46. - № 9. - S. 855 - 861.

108. Engler R. Proteins of the inflammatory reaction. // Ann. Biol. Clin. Paris. 1988. - V. 46. - № 5. - C. 336 - 342.

109. Gambhir J.K., Lali P., Jain A.K. Correlation between blood antioxidant levels and lipid peroxidation in rheumatoid arthritis. // Clin. Biochem.1997. V. 30. -№ 4. - P. 351 - 355.

110. Gomi F., Matsuo M. Effect of copper deficiency on the activity levels of ceruloplasmin and superoxide dismutase in tissues of young and old rats. // Aging. Milano. 1995. - V. 7. - № 1. - P. 61 - 66.

111. Gutteridge J.M. Reduction of low molecular mass iron by reducing molecules present in plasma and the protective action of ceruloplasmin. // J. Trace Elem. Electrolytes Health Dis. 1991. - V. 5. -№ 4. - P. 279 -281.122

112. Halliwell В. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause or consequence? II The Lancet. 1994. - V. 344. - № 8924. - P. 721 -724.

113. Harris E.D., Percivai S.S. A role for ascorbic acid in copper transport. II Am. J. Clin. Nutr. 1991. - V. 54. - № 6. - P. 1193 - 1197.

114. Harris E.D. The iron-copper connection: the link to ceruloplasmin grows stronger. // Nutr. Rev. 1995. - V. 53. - № 6. - P. 170 - 173.

115. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H. et al. Aceruloplasminemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - № 7. - P. 2539 - 2543.

116. Harris Z.L., Gitlin J.D. Genetic and molecular basis for copper toxicity. II Am. J. Clin. Nutr. 1996. -V. 63. -V. 5. - P. 836-841.

117. Hogg N., Landis R.C. Adhesion molecules in cell interactions. // Curr. Opin. Immunol. 1993. - V. 5. - P. 383 - 390.

118. Klomp L.W., Gitlin J.D. Expression of the ceruloplasmin gene in the human retina and brain: implications for a pathogenic model in aceruloplasminemia. // Hum. Mol. Genet. 1996. - V. 5. - №12. - P. 1989- 1996.

119. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L. et al. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system. // J. Clin. Invest. 1996. -V. 98.- № 1,- P. 207-215.

120. Koch K.A., Репа M.M., Thiele D.J. Copper binding motifs in catalysis, transport, detoxification and signaling. // Chem. Biol. - 1997. -V. 4 - № 8. - P. 549 - 560.

121. Krsek-Staples J.A., Kew R.R., Webster R.O. Ceruloplasmin and transferrin levels are altered in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with the adult respiratory distress syndrome. // Am. Rev. Respir. Dis.- 1992.-V. 145.-№ 5.-P. 1009-1015.

122. Krsek-Staples J.A., Webster R.O. Ceruloplasmin inhibits carbonyl formation in endogenous cell proteins. II Free Radic. Biol. Med. 1993. -V. 14,-№2. - P. 115-125.123

123. Loeffler D.A., Lewitt P.A., Juneau P.L. et al. Increased regional brain concentrations of ceruloplasmin in neurodegenerative disorders. // Brain. Res. 1996. - V. 738. - № 2. - P. 265 - 274.

124. Luza S.C., Speisky H.C. Liver copper storage and transport during development: implications for cytotoxicity. // Am. J. Clin. Nutr. 1996. -V. 63. -№ 5. -P. 812-820.

125. Maes M., Scharpe S., Van-Grootel L. et al. Higher alpha 1-antitrypsin, haptoglobin, ceruloplasmin and lower retinol binding protein plasma levels during depression. // J. Affect. Disord. 1992. - V. 24. - № 3. - P. 183 -192.

126. Manjula S., Aroor A.R., Raja A. et al. Elevation of serum ceruloplasmin levels in brain tumours. // Acta. Neurol. Scand. 1992. - V. 86. - № 2. -P. 156-158.

127. Mateescu M.A., Chahine R., Roger S. et al. Protection of myocardial tissue against deleterious effects of oxygen free radicals by ceruloplasmin. // Arzneimittel-Forsch. 1995. - B. 45. - № 4. - S. 476 -480.

128. Mazumder В., Mukhopadhyay C.K., Prok A. et al. Induction of ceruloplasmin synthesis by IFN-gamma in human monocytic cells. // J. Immunol. 1997. - V. 159. - № 4. - P. 1938 - 1944.

129. Medda R., Calabrese L., Musci G. et al. Effect of ceruloplasmin on 6-hydroxydopamine oxidation. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. - V. 38. № 4. - P. 721 - 728.

130. Middleton R.B., Under M.C. Synthesis and turnover of ceruloplasmin in rats treated with 17 beta-estradiol. //Arch. Biochem. and Biophys. 1993.- V. 302. № 2. - P. 362 - 368.

131. Miyajima H., Takahashi Y., Serizawa M. et al. Increased plasma lipid peroxidation in patients with aceruloplasminemia. // Free Radic. Biol. Med.- 1996. -V. 20. -№ 5. P. 757 - 760.

132. Miyajima H., Takahashi Y., Shimizu H. et al. Late onset diabetes mellitus in patients with hereditary aceruloplasminemia. // Intern. Med. -1996a. V. 35. - № 8. - P. 641 - 645.124

133. Miyajima H., Takahashi У., Kamata Т. et al. Use of desferrioxamine in the treatment of aceruloplasminemia. // Ann. Neurol. 1997. - V. 41. -№ 3. - P .404 - 407.

134. Olivares M., Uauy R., Copper as an essential nutrient. // Am. J. Clin. Nutr. 1996. - V. 63. - № 5. - P.791 - 796.

135. Pan Y., Katula K., Failla M.L. Expression of ceruloplasmin gene in human and rat lymphocytes. // Biochim. et biophys. acta. 1996. - V. 1307. - № 2. - P.233 - 238.

136. Parijsl V., Biskins A., Ibragimov A. et al. Functional responses and apoptosis of CD25 (IL 2Ra) deficient T-cells expressing T - transgenic antigen receptor. // J. Immunol. - 1997. -V. 158. - № 8. - P. 3738 - 3745.

137. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes. // J. Biol. Chem. - 1997. - V. 272. - № 32. - P. 20185 - 20190.

138. Rebhun J., Madorsky J.G., Glovsky M.M. Proteins of the complement system and acute phase reactants in sera of patients with spinal cord injury. // Ann. Allergy. 1991. - V. 66. - №4. - P.335 - 338.

139. Resina A., Gatteschi L., Rubenni M.G. et al. Comparison of some serum copper parameters in trained professional soccer players and control subjects. // J. Sports. Med. Phys. Fitness. 1991. -V. 31. - № 3 -P. 413-416.

140. Reyes J., Holmgren J., Colombo M. Ceruloplasmin in patients with Duchenne muscular dystrophy. // Rev. Med. Chil. 1991. - V. 119. - № 3. -P. 258-261.

141. Rylkov V.V., Tarasiev M.Yu., Moshkov K.A. Labile conformation of type 2 Cu2+ centres in human ceruloplasmin. // Eur. J. Biochem. 1991. -V.197. - №1. - P. 185-189.

142. Saenko E.L., Skorobogutko O.V., Tarasenko P.D. et al. Modulatory effects of ceruloplasmin on lymphocytes, neutrophils and monocytes of patients with altered immune status. // Immunol. Invest. 1994. - V.23. -№2.-P. 99-114.125

143. Silva D.M., Aust S.D. Ferritin and ceruloplasmin in oxidative damage: review and recent findings. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1993. - V.71. -№9. -P. 715-720.

144. Song Y., Levenson C.W. Regulation of ceruloplasmin by retinoic acid in the developing rat. // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1997. - V. 67. - № 31. P. 141-144.

145. Tedder T.F., Tuscano J., Sato S. et al. CD22, a B-lymphocyte -specific adhesion molecule that regulates antigen receptor signaling. // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V.15. - P. 481 - 504.

146. Terada K., Kawarada Y., Miura N. et al. Copper incorporation into ceruloplasmin in rat livers. // Biochim. et biophys. acta. 1995. - V. 1270. -№1.-P. 58-62.

147. Yang F., Friedrichs W.E„ Degraffenried L. et al. Cellular expression of ceruloplasmin in baboon and mouse lung during development and inflammation. //Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1996. - V. 14. - № 2. - P. 161-169.

148. Yoshida K., Furihata K. Takeda S. et al. A mutation in the ceruloplasmin gene is associated with systemic hemosiderosis in humans. // Nat. Genet 1995. - V. 9. - № 3. - P. 267 - 272.

149. Zgirski A., Frieden E. Binding of Си (II) to non-prosthetic sites in ceruloplasmin and bovine serum albumin. // J. Inorg. Biochem. 1990. -V. 39.-№ 2.-P. 137-148.