Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1

Ефремова, Любовь Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1"

На правах рукописи

ЕФРЕМОВА ЛЮБОВЬ МИХАЙЛОВНА

СОСТАВ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА _ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА ИЗ ФРАКЦИИ КОНА IV-1

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена на Нижегородском государственном предприятии по производству бактерийных препаратов - фирме «ИмБио»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Анастаснев В.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Шарова Ю.А.

доктор медицинских наук Мигунов В.Н.

Ведущая организация:

Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича

Защита диссертации состоится «_»_2003 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 при Государственном учреждении Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник В .Д. Реук

12 s4o

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДК - диеновый конъюгат

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТК - триеновый конъюгат

ХЛ - хемилюминисценция

ЦП - церулоплазмин

1шах - максимальная интенсивность хемилюминисценции в - общая антиоксидантная система

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние годы характеризуется возрастанием интереса к мультимедийной оксидазе - церулоплазмину. Установлена его структура. Определена роль ионов меди в ферментативном процессе (Hellman N. et al., 2002; Vachette P. et al., 2002). Показано, что ЦП окисляет токсические формы железа и переводит их в нетоксические, защищая ткани от повреждения их свободными радикалами. На протяжении многих лет ЦП успешно применяли в послеоперационном лечении онкологических больных. Введение ЦП оказывало нормализующее действие на окислительно-антиокислительный баланс (Н.В. Эделева с соавт.,1997; Н.В. Эделева с соавт.,2001).

В настоящее время полагают, что антиоксидантный эффект ЦП может быть важным при лечении различных нейродегеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера (Patel В. N. et al., 2002). Обнаружена фуппа наследственных заболеваний - ацерулоплазминемия. У больных с ацерулоплазминемией отмечено накопление железа в тканях, включая печень, поджелудочную железу и мозг, которое стимулирует производство свободных радикалов кислорода и вызывает повреждение тканей. Церулоплазмин уменьшает эту способность (Takeuchi Y.et al., 2002).

Существует вероятность, что ЦП как антиоксидант может быть поле jeu при явлениях гипоксии - реоксигенации, связанных с окислительными стрессами. В экспериментах на животных показано, что повреждения, вызванные гипоксией и реоксигенацией могут быть уменьшены введением ряда ферментов, контролирующих этот процесс (Horakova, L. et al. 1997).

Расширение спектра применения препарата сдерживается небольшими объемами его производства. Ведутся поиски различных источников получения ЦП, включая создание рекомбинантных форм фермента (Bielli Р. et al., 2001). Большинство производителей для получения ЦП используют фракцию III, хотя выход фермента не превышает 5-8 доз с одного килограмма осадка. Для повышения производства препарата необходимо расширить поиск других источников сырья. Ранее предпринимались попытки выделить ЦП из фракций, образующихся в процессе спиртово-каприлатного способа получения альбумина (А.И. Исрафилов, 1993), НО ОНИ гиглзяпигч, нрупаинмчи Не-___

смотря на многолетний опыт выделения фермента, остаются также нерешенными ряд проблем, связанными с методом получения - повреждениями структуры и потерей ферментативной активности в процессе производства и хранения.

Поэтому поиск новых источников сырья и разработка условий стабилизации ЦП является важнейшей научно-производственной задачей. Цель исследования:

Разработка технологии получения стабильного церулоплазмина из фракции плазмы крови IV-I Кона и оценка его свойств в эксперименте и клинике.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку содержания фермента в неиспользуемых фракциях спиртового метода при производстве иммуноглобулинов и альбумина.

2. Разработать технологию получения стабильного высокоочишенного препарата из фракции IV-I Кона и оценить изменения параметров лекарственного средства в процессе производства и хранения.

3. Изучить фармакокинетику препарата при введении экспериментальным животным.

4. Исследовать влияние церулоплазмина на экспериментальных животных в условиях гипобарической гипоксии.

5. Изучить влияние ЦП на биохимические показатели у больных с острым деструктивным панкреонекрозом.

Научная новизна

Разработан метод получения ЦП, включающий избирательную денатурацию балластных белков фракции IV-I при рН 5,6-5,7 температуре 60 °С, адсорбцию фермента из раствора на ДЕАЕ-сефадексе А-50, элюцию ЦП с анионообменника при данном рН с последующей его очисткой хлороформом и концентрированием этанолом. На новые элементы технологии получен патент на изобретение №2162338.27.01.2001.

Впервые установлено, что изменение физико-химических свойств и ок-сидазной активности ЦП на этапах лиофилизации и в процессе хранения связаны с превращением голоцерулоплазмина в апоцерулоплазмин и полимери-шцей апоцерулоплазмина.

Разработан новый способ стабилизации голоцерулоплазмина посредством добавления в препарат маннитола. На «Способ получения церулоплазмина» получена приоритетная справка № 2002113775 от 27.05.02.

Впервые продемонстрирован антигипоксический эффект ЦП на модели i ипобарической гипоксии. Показано, что антигипоксический эффект отмеча-е1ся как при внутрибрюшинном, так и при внутримышечном введении. На «Антигипоксический препарат» получена приоритетная справка № 2003103889 от 10.02.03.

Впервые показано, что ЦП способствует нормализации воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации при панкреонекрозах. На «Способ фармакологической коррекции эндогенной интоксикации при ост-

ром деструктивном панкреатите» получена приоритетная справка № 2003108464 от 01.04.03.

Практическая значимость

Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-! Кона внедрена на Нижегородском государственном предприятии - фирме «Имбио». По ма-> териалам настоящей диссертационной работы разработан промышленный

регламент на препарат церулоплазмин лиофилизированный для инъекций №01898718-30-2000, согласованный с Гематологическим научным центром РАМН.

В экспериментах на животных установлен факт поступления ЦП при внутримышечном введении в кровяное русло с сохранением ферментативной активности, что свидетельствует о возможности внутримышечного введения препарата.

Установлено, что введение ЦП больным панкреонекрозом снижает эндогенную интоксикацию организма, что может явиться основанием применения препарата при данном заболевании.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Технология получения ЦП из фракции 1У-1 Кона, состав и свойства препарата.

2. Антигипоксический эффект ЦП проявляется как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.

3. ЦП корректор эндогенной интоксикации у больных с панкреонекрозом

Апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции "Производственная трансфузиология на рубеже XXI века - Москва, 1999; на заседании Нижегородского общества иммунологов Н. Новгород 2001; на международном медицинском форуме «Человек и травма» Н. Новгород 2001; на заседании научно-технического совета Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов фирмы «ИмБио» совместно с кафедрой молекулярной биологии и иммунологии ИГУ им. Лобачев-! ского (Нижний Новгород, 2003).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, состоит I из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5-ти глав

собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы включает 165 источников, в том числе 51 отечественных и 114 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами.

Работа выполнена в отделе иммуноглобулинов Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов - фирмы «Имбио» (начальник отдела доктор биологических наук В.В. Анастаси-ев). Клинические исследования проводились совместно с кафедрой госпитальной хирургии Нижегородской государственной медицинской академии (зав. каф. проф. А.П.Медведев).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследований служили плазма крови человека, фракции III, IY-1 спиртового метода, а также производственные серии препарата церулоплазмина Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов - фирмы «ИмБио».

Изучение фармакокинетики ЦП проводили на кроликах породы шиншилла обоего пола массой 2,5-3,0 кг. Экспериментальные группы включали по 10 животных. Ампулу препарата, содержащую 100 мг белка, растворяли в 2 мл стерильного физиологического раствора. 1 мл полученного раствора, содержащий 50 мг ЦП, вводили внутривенно и внутримышечно. Пробы крови отбирали из краевой вены уха до введения ЦП и спустя различное время после введения.

Антигипоксические свойства ЦП изучали на модели гипобарической гипоксии согласно «Методических рекомендаций по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве ан-тигипоксических средств» (Москва. 1990).

Использовали модель острой гипобарической гипоксии - тест "смертельной площадки". С помощью вакуумной барокамеры животных помещали на "высоту" 11500 метров со скоростью 183 м/с. Регистрировали такие показатели, как время потери позы после подъема, время жизни - временной отрезок с завершения "подъема" до второго агонапьного вдоха, количество животных, восстановивших позу с начала "спуска" в течение трех минут.

Животных разбивали на три группы по времени до появления второго агонапьного вдоха

I .Низкоустойчивые - время жизни меньше трех минут;

2.Среднеустойчивые - время жизни от трех до десяти минут;

3.Высокоустойчивые - время жизни больше десяти минут.

В связи с необходимостью изучения метаболических параметров при гипоксии не дожидались смерти животных, особенно низкоустойчивых на "смертельной площадке", сразу же после второго агонапьного вдоха, давление в барокамере снижали до исходных значений. После эксперимента кровь животных забирали для проведения биохимических исследований. Данный раздел работы проводили на базе ЦНИЛ Нижегородской медицинской академии под руководством д.б.н. Мухиной И.В.

Молекулярный состав препаратов церулоплазмина исследовали методом колоночной гель-хроматографии на сефадексе G-200 и ультрогеле АсА-34 на комплекте оборудования «Pharmacia», «LKB» (Швеция). Содержание белковых примесей устанавливали методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы и иммуноэлектрофореза (Grabar P., Williams С., 1953) с использованием антисывороток к белкам сыворотки крови человека («ИмБио», Н. Новгород). Количественное определение ЦП проводили методом радиальной

иммунодиффузии по Mancini (1965) с помощью моноспецифических сывороток, полученных нами в результате иммунизации кроликов высокоочищен-ным ЦП. Определение удельной оксидазной активности препаратов проводили по методу Равина (1956).

Для оценки метаболических нарушений в зависимости от задачи иссле-I дования в сыворотке крови определяли: 1) содержание лактата, пирувата

(B.C. Асатиани, 1965); 2) интенсивность свободнорадикального окисления проводили методом индуцированной хемилюминесценции (Е.И. Кузьмина, 1998); 3) УФ-спектроскопия первичных продуктов ПОЛ (В.З. Ланкин с со-1 авт., 1979); 4) активность СОД по Nishicimi et al.,1972; 5) активность катала-

зы по Aebi,1970.

Статистический анализ представленных в диссертационной работе результатов проводили с помощью статистических методов, принятых в биологии и медицине (Лакин Г.Ф., 1990). Полученный данные были обработаны с помощью программного продукта «Microsoft Excel» на IBM PC/AT. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия Стьюдента (t). Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация технологии получения церулоплазмина

Поскольку ЦП относится к а2-глобул и нам, на первом этапе работы необходимо было установить их содержание во фракциях при спиртовом методе фракционирования и оксидазную активность фракций. Анализу по этим показателям были подвергнуты плазма крови человека и фракции IY-1 и III спиртового метода Кона. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица I

I Содержание а2-глобулинов и оксидазная активность во фракциях

спиртового метода (п=12, р<0,05)

Исследуемый материал Плазма Фракция III Фракция IY-I

Содержание а2-глобулинов, в (%) 9,5±0,2 11,1 ±0,2 38,9±0,3

Оксидазная активность, Ед/мг 0,57±0,03 0,40±0,24 2,60±0,36

Как свидетельствуют данные таблицы, по сравнению с плазмой наблюдалось небольшое увеличение а2-глобулинов фракции III, в то же время во фракции IY-1 их содержание возрастало в 4,1 раза. Наличие в этих фракциях функционально активного ЦП оценивалось по оксидазной активности осадков. Проведенные исследования позволили установить, что наибольшей

оксидазной активностью обладала фракция IY-1, ее активность была в 6,5 раза выше, чем фракция III.

Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что для выделения ЦП предпочтительнее использовать фракцию IY-1, содержащую максимальное количество фермента.

Существующая технология выделения ЦП из фракции III Кона предусматривала растворение фракции III в 0,05 М растворе хлористого натрия в соотношении 1:100, асорбцию ЦП на ДЭАЭ-целлюлозе и удаление не связавшихся белков с ионообменника посредством промывки целлюлозы 0,08М раствором хлористого натрия с последующей элюцией ЦП с сорбента 0,16 М раствором хлорида натрия. Для очистки от липопротеидов в технологический процесс включена стадия обработки элюата смесью хлороформ-этанол при конечной концентрации хлороформа в смеси 4%, этанола 24%. Недостатком указанной схемы являлись нестабильность ЦП в 0,05 М растворе хлористого натрия, низкая обменная ёмкость анионообменника, отсутствие дополнительных стадий вирусной инактивации и небольшой выход конечного продукта.

Используя принципы, заложенные в данной технологии, при извлечении ЦП из фракции IV-I была разработана новая технологическая схема. Для стабилизации ЦП фракцию на первой стадии суспендировали в 0,05 М ацетатном буфере с pH 5,6-5,7 и проводили прогрев суспензии при 60°С. При эгом большинство балластных белков денатурировалось, а термостабильный ЦП оставался в растворе. Как показали дальнейшие исследования прогрев фракции при 60°С не влиял на ферментативную активность ЦП. Пссле центрифугирования проводили сорбцию белков на анионообменнике. В качестве анионообменника ДЭАЭ-сефадекса А-50, который обладал обменной ёмкостью в 5,9 раза выше, чем ДЭАЭ-целлюлоза. Затем ЦП элюировали с анионообменника 0,4 М ацетатным буфером pH 5,6- 5,7. Дальнейшую очистку проводили, добавляя в элюат хлороформ до 2 %. Содержащиеся в элюа-те липопротеиды и другие белки удалялись с осадком. Очищенный ЦП концентрировали 30 %-ным этанолом. Осадок растворяли до содержания белка 5,0-6,0 % и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации. Препарат разливали в ампулы и лиофилизировали.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана новая технология получения ЦП из фракции IY-1. Выход фермента составил 25-40 доз с 1 кг осадка.

Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина

Новое сырье и внесенные технологические изменения вызвали необходимость изучения состава и свойств препарата.

Результаты исследования экспериментальных серий ЦП представлены в таблице 2.

Таблица 2

Основные биохимические показатели жидкого и лиофилизированного церулоплазмина, в сравнении с требованиями фармакопейной статьи

(п=12, р<0,05)

Показатель Ед. Измерения Требования ФС 42-3379-97 Жидкий препарат после получения Лиофилизи-рованный препарат

Удельная оксидазная активность Ед/мг белка Не менее 9,0 20,8±0,6 10,7±0,9

Цветность п ,см Не менее 0,35 0,44±0,06 0,38±0,06

Степень очистки Ешо/ Ех280 Не менее 0,025 0,047±0,008 0,028±0,008

Электрофоре-тический состав: а-глобулины; Р-глобулины; альбумин % Не менее 50,0 Не более 48,0 Не более 1,0 90,7±1,3 9,3±1,8 0,2(Ш),03 89,8±1,6 10,1±1,1 0,10±0,03

Молекулярный состав: полимеры -апоцеруло- плазмин голоцеруло- плазмин низкомолекулярные примеси % Показатель не предусмотренный ФС 2,10± 0,97 12,8±1,9 84,6±2,3 0,50+0,03 20,5±2,7 24,3±1,9 54,7±2,3 0,500±0,001

Анализ основных показателей, предусмотренных фармакопейной статьей, показал, что оксидазная активность жидкого препарата после получения составляла (20,8±0,6 ) Ед/мг белка и превышала минимальные требования фармакопейной статьи (не менее 9,0 Ед/мг белка) почти в 2 раза. Цветность раствора при допустимом показателе 0,35 составляла (0,44±0,06) единицы. Степень очистки возрастала до (0,047±0,008). Препарат имел в своем составе свыше 90 % а-глобулинов и менее 10 % Р-глобулинов.

Вместе с тем, предусмотренная действующей технологией лиофилиза-ция ЦП в 0,9%-ном растворе натрия хлорида приводила к значительному ухудшению качества препарата. Почти в 2 раза снижалась оксидазная активность, изменялись показатели цветности и степень очистки. При оценке электрофоретического состава установлены изменения во фракции а-глобулинов (рис.1). Лиофилизация приводила к изменению электрофорети-

ческой подвижности. Отмечено появление компонента с подвижностью (Х|-глобулинов.

Причина изменений в препаратах ЦП стала понятной при использовании метода гельфильтрации. Было показано, что в процессе лиофильной сушки происходило превращение голоцерулоплазмина в апоцерулоплазмин, что приводило к снижению его оксидазной активности. При этом, вероятно, освобождались гидрофобные участки молекулы ЦП (Е)е РШрр^ е1 а1., 1996), что способствовало его агрегации.

По данным хроматографии на ультрогеле АсА-34, если жидкий препарат содержал (2,10±0,97)% полимеров, то в результате лиофилизации их количество возрастало в 10 раз, фракция апоцерулоплазмина, составляющая (12,8±1,9)%, увеличивалась в 2 раза, а его активная часть - голоцерулоплаз-мин снижался с (84,6±2,3)% до (54,7±2,3)%. Практически не изменялись низкомолекулярные примеси. В то же время при иммуноэлектрофоретиче-ском анализе была подтверждена высокая степень очистки ЦП от других белков. В препарате присутствовала одна четкая дуга преципитации, соответствующая ЦП, и две другие диффузные дуги, одна из которых соответствовала альбумину, а вторая отнесена к белку а-глобулиновой природы.

Рис.1. Результаты электрофореза препарата на пленках из ацетата целлюлозы. 1- сыворотка крови человека; 2 - ЦП до лиофилизации; 3 - ЦП после лиофилизации. Стрелкой отмечено появление компонента с подвижностью а |-глобулинов

Вначале мы полагали, что эти изменения обусловлены жестким режимом лиофилизации препарата. Нами были использованы несколько щадящих режимов лиофилизации. Однако даже при этих режимах происходила потеря активности.

Как оказалось в дальнейшем, процесс снижения оксидазной активности и степени очистки происходил и в процессе хранения (таблица 3).

Полученные данные свидетельствовали о необходимости стабилизации препарата. В связи с этим, из состава препарата был полностью исключен натрия хлорид, а в качестве растворителей церулоплазмина были испытаны 5% глюкоза, 3% глицин и маннитол в концентрации от 0,5 до 5%. Введение, в препарат таких стабилизаторов, как глюкоза и глицин, не дало желаемых результатов, а в процессе сушки наблюдалось снижение оксидазной активности препарата в 1,6-1,8 раза.

Таблица 3

Изменение степени очистки и удельной оксидазной активности церулоплазмина в процессе хранения (п=12, р<0,05)

Препарат Степень очистки Ешс/ Ещо Удельная оксидазная активность, ЕД/мг

После лиофилизации 0,028±0,001 10,7±0,9

Через 1 год хранения 0,021±0,003 9,2±0,6

Через 2 года хранения 0,017±0,002 7,50±0,32

При испытании различных концентраций маннитола хорошие результаты были получены при концентрации маннитола 1%. При этом оксидазная активность не снижалась, а при электрофорезе на ацетате целлюлозы не отмечалось появления компонента с подвижностью агглобулинов (рис.2).

1234 5 6 7 89

Рис. 2 Результаты электрофореза на ацетат-целлюлозе образцов ЦП с

В различной концентрацией манни-

М Ш вЛ а* тола: 1 - лиофилизированный ЦП

• ЦЩЦЮ без маннитола; 2, 5-9 - образцы с

У; 1 . различной концентрацией манни-

* тола (2 - 1%, 5 - 2%; 6 - 3%, 7 -

4%, 8 -5%; 9 - 0,5%); 3, 4 - плазма крови человека.

Эти результаты послужили основанием для замены растворителя 0,9% натрия хлорида на 1% маннитол - соединение, используемое в медицине в качестве лекарственного средства.

С данным стабилизатором получено 15 экспериментальных серий ЦП. Показатели качества ЦП представлены в таблице 4.

Сравнительный анализ требований действующей фармакопейной статьи к составу и свойствам полученного препарата позволил повысить требования к степени очистки (0,035, вместо 0,028), электрофоретическому составу церулоплазмина, а также увеличить минимальное содержание а-глобулинов до 90,0% вместо 50,0%, снизить содержание Р-глобулинов до 10%, оксидаз-ную активность увеличить до 15 ед./мг, вместо 9,0. Предложено проводить определение молекулярного состава препарата - наиболее информативного

показателя, характеризующего присутствие в препарате различных форм ЦП: активной формы - голо-; неактивной - апоцерулоплазмина.

Таблица 4

Показатели качества церулоплазмииа в соответствии с проектом Фармакопейной статьи предприятия в сравнении с действующей фармакопейной статьей (п=15, р<0,05)

Показатели Ед. измерения Требования ФС 42-3379-97 По проекту ФСП Содержание, свойства

Цветность с ,см ь ш> Не менее 0,35 Не менее 0,35 0,43 ± 0,05

РН 7,0±0,5 7,0±0,5 7,26±0,09

Потеря в массе при высушивании % Не более 3% Не более 3% 1,2

Содержание натрия хлорида г Не более 0,5 Не предусмотрено -

Содержание манни-тола мг Не предусмотрено 18-25 20

Содержание белка мг 90-110 90-110 107,2±1,5

Степень очистки ЕбкУ Е280 0,025 0,035 0,044±0,005

Электрофоретиче-ский состав: а-глобулины; Р-глобулины; альбумин % Не менее 50,0 Не более 48,0 Не более 1,0 Не менее 90,0 Не более 10,0 Не более 1,0 92,3±1,1 7,7±0,9 0

Удельная оксидаз-ная активность Ед/мг белка Не менее 9,0 Не менее 15 20,2±1,3

Молекулярный состав: Полимеры Апо-ЦП -Голо-ЦП -Низкомолекулярные примеси % по ФС показатель не предусмотрен Не более 5,0 Не более 20 Не менее 70 5,0 1,6±0,3 1 б,2±2,3 76,4±9,1 5,0±1,9

Таким образом, в результате проведенных исследований получен препарат церулоплазмииа по степени очистки и ферментативной активности значительно превосходящий своего предшественника.

Изучение фармакокииетики церулоплазмииа в эксперименте на животных

Фармакокинетика ЦП была изучена при внутривенном и внутримышечном введении кроликам. Результаты исследования представлены на рисунках 3 и 5.

30 ^ 20 10

0 12 24 36 4» 60 72 14 96 108 120 132 144 156 ярсмя после введения. часы

—■—Оксишзная активность плазмы сд/10мл —■— комнеитраимя иммунореактавногоЦП. мг/ЮОмл

Рис. 3. Изменение содержания церулоплазмина человека и оксидазной активности плазмы при внутривенном введении препарата (п=15,

р<0,05)

Изменение уровней ЦП после внутривенного введения животным проходило в несколько фаз. В первые часы после введения его содержание резко повышалось, затем вследствие распределения его между сосудистым и внесосудистым руслом снижалось, в дальнейшем его содержание в крови стабилизировалось: в этот период кривая переходила в прямую линию, затем происходило снижение содержания ЦП и через 144 часа после введения он не обнаруживался в сыворотке крови. Это частично подтверждено и определением оксидазной активности сыворотки. Ее изменение, в основном, повторяло вид кривой определения содержания ЦП человека, исключение составила тенденция к нарастанию через 12 часов. Однако, поскольку оксидаз-ная активность плазмы животных являлась интегральным показателем содержания ЦП в крови животного и введенного препарата человека, после полной элиминации ЦП человека оставалась составляющая крови животного. На рис. 4 представлена фармакокинетическая кривая периода полужизни препарата. Этот период составил 72 часа.

{ О 12 24 36 41 60 72 14 « 101 120 132 144 156 | ярсмя, часы

' -»— концентрация ЦП

Рис. 4. Период полураспада церулоплазмина (п=15, р<0,05)

Результаты, полученные при внутримышечном введении препарата, свидетельствовали о том, что из места введения церулоплазмин человека тоже проникал в кровь с сохранением оксидазной активности (рис. 5). .

■рема поем мсаеим!. сутки —•—(хснллил» акпмиос» юлжи, ее/10 мл —■— кмшентрация иимунорсактиинго ЦП. мкг/мл

Рис. 5. Изменение содержания ЦП человека и оксидазной активности плазмы при внутримышечном ведении препарата (п=15, р<0,05)

Уже через сутки в крови животных обнаруживалось значительное количество активного фермента. Ферментативная активность повышалась до уровней, которые были установлены при внутривенном введении. Это свидетельствовало о том, что внутривенное введение, используемое для церуло-плазмина, не является единственно приемлемым способом. Внутримышечное введение, также позволяет достичь эффективных концентраций препарата в крови. Поскольку эта процедура не требует стационарных условий, этот способ введения препарата позволит значительно расширить область его клинического применения.

Изучение антигипоксического эффекта церулоплазмина

Оценка антигипоксического эффекта проводилась на белых беспородных крысах. С этой целью мы использовали две формы ЦП - с максимальной (18,9 Ед/мг) и минимальной (9,1 Ед/мг) ферментативной активностью. Образцы вводили по 50 мг белка внутрибрюшинно за 20 минут до создания гипоксии и в той же дозе внутримышечно и внутрибрюшинно за сутки до эксперимента. В контрольной группе использовали стерильный физиологический раствор в соответствующих количествах при внутрибрюшинном введении (табл. 5).

Таблица 5

Показатели выживаемости и устойчивости к гипобарической гипоксии белых беспородных крыс при превентивном применении 50 мг ЦП

(п=12)

Показатель Контроль При введении за сутки При введении за 20 минут, внутрибрюшинно

Внутримышечно Внутри-брюшинно ЦП с низкой активностью ЦП с высокой активностью

Время жизни, мин 16,5±0,5 55±1,5* 50±1,5* 42±2,1 * 24,5±1,8*

Высокоустойчивые животные 0 3 (25%) 2 (16%) 0 0

Низкоустойчивые животные 9 (75%) 6 (50%) 5 (42%) 8 (66%) 6 (50%)

Среднеустой-чивые животные 3 (25%) 3 (25%) 5 (42%) 4 (33%) 6 (50%)

Время потери позы, мин 6,5±0,3 10±0,4» 10,5±0,2* 14±0,32* 9,5±0,2*

Кол-во животных восстановивших позу 1 (8%) 7 (58%) 9 (75%) 2 (17%) 2 (17%)

Примечание: * - различия достоверны, р<0,05.

Проведенные исследования показали, что использование ЦП позволяло увеличить выживаемость животных при гипобарической гипоксии. При этом защитный эффект проявлялся при различных значениях оксидазной активности препарата и был максимально выражен при введении препарата за сутки до эксперимента, независимо от способа введения. Так, время жизни при введении ЦП за сутки увеличилось в 5,3 раза по сравнению с контролем при внутримышечном введении и в 5,0 раз - при внутрибрюшинном. Показатели устойчивости к гипоксии значительно улучшались при введении препарата за сутки до эксперимента: появились высокоустойчивые особи - 16% при внутрибрюшинном и 25% при внутримышечном введении; в то время как в контрольной и в опытных группах при введении ЦП за 20 минут до гипоксии таких животных не наблюдалось.

Что касается формы препарата с высокой ферментативной активностью, некоторые показатели устойчивости к гипоксии (время жизни, количество среднеустойчивых животных, время потери позы) были достоверно выше,

чем в контрольной группе, однако, значения время жизни и время потери позы были ниже, чем при использовании препарата с низкой ферментативной активностью.

Поскольку гипоксия сопровождалась проявлениями метаболического ацидоза, нами была проведена оценка влияния ЦП на показатели углеводного обмена в плазме крови животных (табл.6).

Таблица 6

Влияние ЦП на показатели углеводного обмена экспериментальных ' животных

Показатель Контроль п=14 Внутримышечное введение за сутки, п=13 Внутрибрюшинное введение за 20 минут

ЦП с низкой активностью, п=14 ЦП с высокой активностью, п=17

Пируват 0,33±0,05 0,29±0,02 0,32±0,04 0,32±0,04

Лактат 1,43±0,07 1,10Ю,03* 1,47±0,08 1,56±0,09

Л/П 4,30±0,02 3,800±0,013* 4,6010,02 4,900+0,025

Примечание: * - различия достоверны, р<0,05

Достоверное снижение лактацидоза и соотношения лактат/пируват в крови животных наблюдалось только при введении препарата за сутки до создания гипоксии.

Аналогичная зависимость отмечалась при анализе состояния про- и ан-тиоксидантной систем организма (табл.7). Основные показатели окислительной активности плазмы -1 шах, ДК, ТК - достоверно изменялись по сравнению с контролем при введении препарата за сутки до эксперимента: отмечалось достоверное увеличение активности СОД (основного медь-зависимого антиоксидантного фермента тканей) во всех опытных группах; однако, максимальные изменения наблюдались при введении препарата за сутки до эксперимента.

Таблица 7

Влияние препарата на показатели про- и антиоксидантной систем

организма экспериментальных животных (п=12)

Показатель Контроль Внутримышечно за сутки Внутрибрюшинно за 20 минут

ЦП с низкой активностью ЦП с высокой активностью

1 шах 4,3±0,2 3,5Ю,3* 4,210,2 4,1Ю,2

I/S 0,018+0,005 0,03110,004* 0,02410,003 0,02310,003

дк 0,075+0,005 0,05910,005* 0,06410,004 0,074Ю,0045

ТК 0,034±0,002 0,028+0,001* 0,03610,005 0,03110,002

СОД 183,7±9,6 284,3112,4* 226,011 ОД* 216,7111,5*

Катал аза 23,3±3,8 31,613,5 25,414,7 24,615,9

Примечание: * - различия достоверны, р<0,05

Таким образом, нами продемонстрировано антигипоксическое действие ЦП. Усиление эффекта препарата при введении за сутки свидетельствует о том, что эффект ЦП является не прямым, а опосредованным влиянием на другие защитные системы организма.

Влияние церулоплазмина на показатели эндогенной интоксикации у больных панкреонекрозом

Поскольку ЦП является белком острой фазы воспаления и стресса, повышение его концентрации характерно для любых заболеваний, сопровождающихся деструкцией тканей, развитием окислительного стресса и воспаления. В последние годы внимание исследователей было привлечено к специфической активности ЦП, т.е. отношению ферментативной активности к концентрации ЦП. Показано, что значение этого параметра изменяется при различных патологических состояниях, в частности, увеличивается при воспалительных заболеваниях (Ьоиго О., й а1., 2000). Специфическая активность ЦП отражает баланс окислительной/антиокислительной систем организма, поскольку имеются доказательства, что при некоторых условий ЦП способен проявлять прооксидантные свойства.

Нами проведен анализ зависимости специфической активности ЦП от характера течения острого деструктивного панкреатита (табл. 8). Пробы сыворотки пациентов с острым деструктивным панкреатитом были любезно предоставлены сотрудницей кафедры госпитальной хирургии Нижегородской государственной медицинской академии к. м. н. О.В. Горох.

Таблица 8

Зависимость специфической активности ЦП от характера течения острого деструктивного панкреонекроза

Группы пациентов Число пациентов Оксидазная активность плазмы, Ед/мл Концентрация ЦП, мкг/мл Специфическая активность ЦП. Ед/мкг

Пациенты с благоприятным течением заболевания 9 46,8±20,1 488,9±151,6 0,095±0,019 *

Пациенты с неблагоприятным течением заболевания 7 65,8±30,9 400,0±63,2 0,161±0,058*

различия достоверны, р<0,01

Полученные данные свидетельствуют о достоверном увеличении вероятности неблагоприятного течения заболевания при повышении специфической активности ЦП. Измеряемая таким методом специфическая активность

ЦП плазмы здоровых доноров в норме составляла 0,089±0,019 (Крайнова Т.А., 2003). Повышение доли активного фермента на фоне ухудшения течения заболевания свидетельствует о нарушении окислительного/антиокислительного баланса ЦП и о необходимости его коррекции.

Поскольку была показана необходимость коррекции окислительного потенциала плазмы крови пациентов с острым деструктивным панкреатитом, нами была проведена оценка влияния препарата ЦП на некоторые биохимические показатели плазмы крови при лечении пациентов с патологией такого рода. Исследование проведено на 35 больных с панкреонекрозом. Контрольную группу составили 25 пациентов. Всем пациентам проводилась общепринятая терапия. Больным исследуемой группы в комплексную герапию включалось внутривенное введение церулоплазмина в дозе 500 мг ежедневно в течение 5 дней. До введения препарата на 3 и 5 сутки оценивали показатели эндогенной интоксикации, функции печени, параметры системного воспалительного ответа и специфическую активность ЦП.

На фоне введения ЦП отмечалось значительное снижение параметров системного воспалительного ответа - С-реактивного белка и лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), в то время, как в контрольной группе величина С-реактивного белка оставалась на исходном значении, а ЛИИ увеличился (табл. 9).

Таблица 9

Изменение параметров системного воспалительного ответа (п=35)

Лабораторные показатели Контрольная группа Исследуемая группа

исходные значения 5-сутки Исходные значения 3-сутки 5-сутки

С-реактивный белок 124+15,7 123+14,7 126±17,5 102,3±14,6* 82,3±13,5*

Лейкоцитарный индекс интоксикации 14,7+3,47 22,3±3,15 13,1+2,47 8,85±1,35* 6,1 ±0,74*

Примечание: * - различия достоверны, р<0,05

При оценке явлений эндогенной интоксикации и функции печени в исследуемой группе имело место уменьшение гипербилирубинемии, снижение уровня трансаминаз, общего белка и мочевины к 3-суткам терапии. В контрольной фуппе явления печеночной недостаточности и эндотоксикоза сохранялись в течение 5 суток (табл.10). Кроме того, анализ специфической активности продемонстрировал нормализацию этого показателя при введении ЦП. Все указанные изменения сопровождались значительным улучшением течения заболевания.

Таблица 10

Изменение показателей эндогенной интоксикации, функции печени

(и=35)

Лабораторные показатели Контрольная группа Исследуемая гр' уппа

исходные значения 5-сутки исходные значения 3- сутки 5-сутки

Билирубин (мкмоль/л) 30,3+2,7 29,5+2,5 3!,5±2,3 26,1 ±2,7 19,0+1,1

Средние молекулы, ед/мл 0,64±0,13 0,69±2,70 67,1 ±4,97 63,4±3,16 60,7±2,9

Мочевина (моль/л) 10,20±],67 19,4±1,6 10,4+0,6 9,3±0,8 4,8±0,3

Специфическая активность ЦП, ед/мкг 0,124 ± 0,064 0,068± 0,033 0,119± 0,071 0,092± 0,020 0,085± 0,025

АлАТ (мкмоль/* час) 0,88+0,13 0,87+0,15 0,88+0,13 0,58±0,11 0,49±0,12

АсАТ (мкмоль/* час) 0,80+0,15 0,79±0,1 0,75+0,12 0,67±0,12 0,55±0,10

Общий белок (г/Л) 67,8±3,5 69,4±2,7 67,10+4,97 63,4±3,16 60,7±2,9

Глюкоза крови (моль/л) 7,3±0,9 6,1 ±0,4 5,9±0,3 5,1±0,7 4,30±0,13

Примечание: различия достоверны, р<0,05

Анализируя полученные данные, можно заключить, что ЦП способствует снижению системного воспалительного ответа и явлений эндогенной интоксикации, а также нормализует соотношение окислительного /антиокислительного потенциалов плазмы крови. Проявляя антигипоксиче-ские свойства, ЦП уменьшает ишемическое повреждение ткани печени и препятствует прогрессированию гепатоцитарной печеночной недостаточности. Поэтому использование ЦП перспективно при данной патологии.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения церулоплазмина из фракции плазмы крови IV-! Кона, включающая инактивацию вирусов. Получена жидкая форма препарата с оксидазной активностью, не менее 20 Ед/мг белка, содержанием голоцерулоплазмина более 80%, степенью очистки 0,047 и выше.

2. Показано, что изменение структуры церулоплазмина в процессе лио-филизации и хранения обусловлены превращением голоцерулоплазми-

на в апоцерулоплазмнн. Сохранение нативности препарата обеспечивается добавлением веществ, препятствующих образованию свободных радикалов, в частности маннитола.

3. Установлен факт поступления активного фермента в периферическую кровь при введении препарата церулоплазмина внутримышечно экспериментальным животным. Это доказывает возможность введения церулоплазмина внутримышечным способом.

4. Установлено, что человеческий церулоплазмин не обнаруживается в крови экспериментальных животных спустя 4-5 суток после внутри-брюшинном и внутримышечного введения. Показано, что период полужизни церулоплазмина при внутривенном введении составляет 72 часа.

5. В эксперименте на животных показано, что церулоплазмин обладает антигипоксическим эффектом, который наблюдается как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.

6. Установлено, что церулоплазмин способствует нормализации воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации и функции печени при панкреонекрозах.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Горох О.В., Парунова Т.Л., Ефремова Л.М., Крайнева Т.А., Парунов Д.Н. «Влияние церулоплазмина на течение эндогенной интоксикации у больных панкреонекрозом»// Нижегородский медицинский журнал.- Озон в биологии и медицине .-Н.Новгород.- 2003,- с.262.

2. Ефремова Л.М., Крайнева Т.А. «Оптимизация метода контроля ферментативной активности препарата церулоплазмина»// Проблемы гематологии и переливания крови.- 2001.- №3,- с.51.

3. Ефремова Л.М., Крайнева Т.А. «Оптимизация технологии получения церулоплазмина»// Здоровье населения нижегородской области (Итоги регионарной программы).- Н.Новгород.- 2002.- с.141-147. 4

4. Ефремова Л.М., Крайнева Т.А., Наумова Ю.К. «Новые подходы к получению церулоплазмина, обогащенного альбумином»// Производственная трансфузиология на рубеже веков XXI века. Тезисы докладов.- Москва, 16-18 января 1999.- с.9.

5. Ефремова Л.М., Крайнева Т.А., Пискарева Ю.К., Анастасиев В.В. «Применение пастеризации и тепловой денатурации в производстве церулоплазмина»// Тезисы докладов VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 10-14 апреля 2000 г.- с.495.

6. Крайнева Т.А., Ефремова Л.М, Пискарева Ю.К., Анастасиев В.В., Шерер Л.А. «Изучение свойств препарата «Церулоплазмин человека лиофили-зированный для инъекций»// Вестник службы крови России.- 2002 - №2,-с.38-41.

7. Крайнова Т.А., Ефремова Л.М. «Церулоплазмин - биологические свойства и клиническое применение». Изд. НГМА, Н.Новгород, 2000.

8. Крайнова Т.А., Ефремова Л.М., Анастасиев В.В., Пискарева Ю.К. «Изучение лечебного эффекта церулоплазмина при анемиях различного гене-за»// Вестник службы крови России.- 2002,- №1.- с.27-30.

9. Крайнова Т.А., Ефремова Л.М., Наумова Ю.К. «Создание новой лекарственной формы церулоплазмина»// Производственная трансфузиология на рубеже веков XXI века. Тезисы докладов.- Москва, 16-18 января 1999.-с. 16-17.

10. Крайнова Т.А., Наумова Ю.К., Анастасиев В.В., Герасимова Л.М. «Изучение возможности проведения пастеризации при получении церулоплазмина из плазмы крови человека»// Тезисы докладов V Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 21-25 апреля 1998г.-с.653.

11. КрайноваТ.А., Ефремова Л.М., Мухина И.В., Анастасиев В.В. «Изучение антиоксидантного и антигипоксического действия препарата «Церулоплазмин» на модели гипобарической гипоксии»// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003.- № 3.- стр 24-28.

12. Наумова Ю.К., Крайнова Т.А., Анастасиев В.В., Ефремова Л.М. Патент «Способ получения церулоплазмина» №2162338, опубл. 27.01.2001, Бюл.№3.

Подписано в печать 04.06.2003. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 716. Тир. 100.

Типография Нижегородскою госунивсрситста Лицеи шя № 18-0099 603000,11. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

►

Р1 2 5 4 О

о ,

» i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефремова, Любовь Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биохимическая характеристика церулоплазмина.

1.2. Способы выделения церулоплазмина.

I.3 Клиническое применение церулоплазмина.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. Материалы.

II.2. Методы.

II.2. 1. Количественное определение белка в препарате ЦП.

II.2. 2. Определение степени очистки.

II. 2. 3. Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы.

II.2. 4. Иммуноэлектрофорез по методу Grabar.

II.2. 5. Гель-проникающая хроматография низкого давления.

II.2. 6. Определение ферментативной активности.

II.2. 7. Электрофорез в полиакриламидном геле.

II.2. 8. Исследование антигипоксических свойств ЦП на модели гипобарической гипоксии.

II.2. 9. Определение пирувата.

II.2. 10. Определение количества лактата.

II.2. 11. Определение свободнорадикальной интенсивности методом индуцированной хемилюминесценции.

Щ, II.2. 12. УФ-спектроскопия первичных продуктов ПОЛ.

II.2. 13. Определение активности СОД.

II.2. 14. Определение активности каталазы.

II.2. 15. Количественное определение содержания ЦП.

II. 2.16. Общеклинические показатели.

II. 2. 17. Иммунизация животных.

II.2. 18. Методы статистической обработки.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. 1. Оптимизация технологии получения церулоплазмина.

111.2. Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина.

111.3. Изучение фармакокинетики ЦП в эксперименте на животных.

111.4. Антигипоксические свойства церулоплазмина.

Ш.5. Влияние церулоплазмина на показатели эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1"

Последние годы характеризуется возрастанием интереса к мультимедийной оксидазе - церулоплазмину. Установлена его структура. Определена роль ионов меди в ферментативном процессе (Hellman N. et al., 2002; Va-chette P. et al., 2002). Показано, что ЦП окисляет токсические формы железа и переводит их в нетоксические, защищая ткани от повреждения их свободными радикалами. На протяжении многих лет ЦП успешно применяли в послеоперационном лечении онкологических больных. Введение ЦП оказывало нормализующее действие на окислительно-антиокислительный баланс (Н.В. Эделева с соавт., 1997; Н.В. Эделева с соавт.,2001).

В настоящее время полагают, что антиоксидантный эффект ЦП может быть важным при лечении различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера (Patel В. N. et al., 2002). Обнаружена группа наследственных заболеваний - ацерулоплазминемия. У больных с ацерулоплазминемией отмечено накопление железа в тканях, включая печень, поджелудочную железу и мозг, которое стимулирует производство свободных радикалов кислорода и вызывает повреждение тканей. Церулоплазмин уменьшает эту способность (Takeuchi Y.et al., 2002).

Существует вероятность, что ЦП как антиоксидант может быть полезен при явлениях гипоксии - реоксигенации, связанных с окислительными стрессами. В экспериментах на животных показано, что повреждения, вызванные гипоксией и реоксигенацией могут быть уменьшены введением ряда ферментов, контролирующих этот процесс (Horakova, L. et al. 1997).

Расширение спектра применения препарата сдерживается небольшими объемами его производства. Ведутся поиски различных источников получения ЦП, включая создание рекомбинантных форм фермента (Bielli P. et al., 2001). Большинство производителей для получения ЦП используют фракцию III, хотя выход фермента не превышает 5-8 доз с одного килограмма осадка. Для повышения производства препарата необходимо расширить поиск других источников сырья. Ранее предпринимались попытки выделить ЦП из фракций, образующихся в процессе спиртово-каприлатного способа получения альбумина (А.Г. Исрафилов, 1993), но они оказались неудачными. Несмотря на многолетний опыт выделения фермента, остаются также нерешенными ряд проблем, связанными с методом получения - повреждениями структуры и потерей ферментативной активности в процессе производства и хранения.

Поэтому поиск новых источников сырья и разработка условий стабилизации ЦП является важнейшей научно-производственной задачей.

Цель исследования

Задачи исследования

2. Разработать технологию получения стабильного высокоочищенного препарата из фракции IV-I Кона и оценить изменения параметров лекарственного средства в процессе производства и хранения.

3. Изучить фармакокинетику препарата при введении экспериментальным животным.

4. Исследовать влияние церулоплазмина на экспериментальных животных в условиях гипобарической гипоксии.

5. Изучить влияние ЦП на биохимические показатели у больных с острым деструктивным панкреатитом.

Научная новизна

Разработан метод получения ЦП, включающий избирательную денатурацию балластных белков фракции IV-I при рН 5,6-5,7 и температуре 60°С, адсорбцию фермента из раствора на ДЕАЕ-сефадексе А-50, элюцию ЦП с анионообменника при данном рН с последующей его очисткой хлороформом и концентрированием этанолом. На новые элементы технологии получен патент на изобретение №2162338.27.01.2001.

Установлено, что изменение физико-химических свойств и оксидазной активности ЦП на этапах лиофилизации и в процессе хранения связаны с превращением голо-ЦП в апо-ЦП и полимеризацей апо-ЦП.

Разработан новый способ стабилизации голо-ЦП посредством добавления в препарат маннитола.

Впервые продемонстрирован антигипоксический эффект ЦП на модели гипобарической гипоксии. Показано, что антигипоксический эффект отмечается, как при внутривенном, так и при внутримышечном введений.

Впервые показано, что ЦП способствует нормализации параметров воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации при панкрео-некрозах.

Практическая значимость

Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона внедрена на Нижегородском государственном предприятии - фирме «Имбио». По материалам настоящей диссертационной работы разработан промышленный регламент на препарат церулоплазмин лиофилизированный для инъекций №01898718-30-2000, согласованный с Гематологическим научным центром РАМН.

В экспериментах на животных установлен факт поступления в кровяное русло ЦП при внутримышечном введении с сохранением ферментативной активности, что свидетельствует о возможности внутримышечного введения препарата.

Установлено, что введение ЦП больным острым деструктивным панкреатитом снижает эндогенную интоксикацию организма, что может явиться основанием применения препарата при данном заболевании.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона, состав и свойства препарата.

2. Антигипоксический эффект ЦП проявляется как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.

3. ЦП корректор эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ефремова, Любовь Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения церулоплазмина из фракции плаз-^ мы крови IV-I Кона, включающая инактивацию вирусов. Получена жидкая форма препарата с оксидазной активностью, не менее 20 Ед/мг белка, содержанием голоцерулоплазмина более 80%, степенью очистки 0,047 и выше.

2. Показано, что изменение структуры церулоплазмина в процессе лио-филизации и хранения обусловлены превращением голоцерулоплазмина в апоцерулоплазмин. Сохранение нативности препарата обеспечивается добавлением веществ, препятствующих образованию свободных радикалов, в частности маннитола.

3. Установлен факт поступления активного фермента в перифериче-^ скую кровь экспериментальным животным при введении препарата церулоплазмина внутримышечно. Это доказывает возможность введения церулоплазмина внутримышечным способом.

4. Установлено, что человеческий церулоплазмин не обнаруживается в крови экспериментальных животных спустя 4-5 суток после внутривенного и внутримышечного введения. Показано, что период полужизни церулоплазмина при внутривенном введении составляет 72 часа.

5. Показано в эксперименте на животных, что церулоплазмин обладает антигипоксическим эффектом, который наблюдается как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.

А 6. Установлено, что ЦП способствует нормализации параметров воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации и функции печени при панкреонекрозах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия внимание исследователей привлечено к проблеме перекисного окисления липидов и его роли в патогенезе различных заболеваний (Ю.А.Владимиров с соавт., 1989). Установлено, что развитие этого процесса играет ключевую роль в процессах воспаления, канцерогенеза, развитии атеросклероза (Е.А. Демуров, В.А. Игнатова, 1985). В связи с этим особое значение придается использованию в качестве терапевтических средств веществ, обладающих антиоксидантным действием. Особое место среди многочисленных антиоксидантов занимают вещества природного происхождения. Использование естественных антиоксидантов является оптимальным, поскольку их эффект наиболее приближен к физиологическим условиям организма, а ожидаемое побочное влияние сведено к минимуму (Ю.А.Зозуля с соавт., 2000).

Церулоплазмин является основным фактором, защищающим организм от повреждающего действия ПОЛ плазмы крови (О.Л. Санина, Н.К. Берлинских, 1986). Препарат церулоплазмина, выделенный из плазмы крови человека, на сегодняшний день является естественным антиоксидантом, чей фармакологический эффект максимально приближен к физиологическому. Благодаря возможности получения ЦП в чистом виде, он может успешно вводиться извне - для компенсации недостаточности АО-системы организма и достижения таких фармакологических эффектов, как стимуляция кроветворения, иммуномодуляция, ингибирование воспаления и свободнорадикаль-ного поражения. (В.А. Тихонов с соавт., 1982; Е.Л. Саенко с соавт., 1989; Ю.А.Зозуля с соавт., 2000).

Создавая препарат, мы приняли меры к обеспечению вирусологической безопасности. Препарат «Церулоплазмин» изготовлен из плазмы крови доноров, свободной от вирусов ВИЧ, гепатитов В и С. Технология производства предусматривает ряд мер, направленных на дополнительную инактивацию вирусных частиц.

Впервые препарат применяли в качестве антианемического средства (Katsunuma et al., 1961; Arimori, 1966; Shimizu, 1979). В настоящее время перечень заболеваний, при которых рекомендуется применение данного лекарственного средства, гораздо шире. Это и стимуляция гемопоэза, и предупреждение послеоперационной полиорганной недостаточности (Н.В. Эделева с соавт., 2001), в остром периоде критических состояний (А.К. Агаев, 1991; А.Ш. Альседерова с соавт., 1992), при лечении пневмоний (Г.А. Трубников с соавт., 1998), ревматоидного артрита, при сердечно-сосудистых патологиях (А.Н. Закирова с соавт.,1997), для уменьшения явлений постлучевой энцефалопатии на фоне лучевой терапии. (Н.К. Берлинских с соавт., 1992). Имеется ограниченный опыт применения ЦП на базе неврологического отделения Нижегородской областной больницы при различных видах аутоиммунной патологии, в частности при миастении гравис, синдроме Гийен- Барре.

Несмотря на многолетнюю историю применения, механизм действия препарата полностью не изучен. В последнее годы появились сообщения, что ЦП человека может усиливать, опосредуемое ионами меди, окисление ли-пидов низкой плотности. Эти результаты позволяют предположить, что ЦП может быть в частности, ответственным за окисление липидов низкой плотности в крови или стенке артерии, и что это может иметь физиологическое значение, отличающееся от предполагаемого в настоящее время.

При анализе данных литературы и при внедрении препарата в клиническую практику мы столкнулись с важной проблемой. Различные исследователи использовали разные дозы церулоплазмина, причем большинство авторов отмечают, что слабо выраженный клинический эффект церулоплазмина обусловлен введением его слишком малого количества, недостаточного для улучшения лабораторных и клинических показателей. (Н.В. Эделева с соавт.,1997; Н.В. Эделева с соавт.,2001). Примером этого является тот факт, что со времени первого использования ЦП для лечения апластической анемии рекомендуемая доза (15 мг) была увеличена в 10 раз. Однако клинический опыт показывает, что и эта дозировка должна быть значительно увеличена. В онкологической практике рекомендуется использовать от 500 до 1000 мг на одно введение. Для установления оптимального количества церулоплазмина, вводимого пациенту при лечении того или иного заболевания, необходимо проведение расширенных клинических испытаний. Кроме того, перечень показаний к лечебному применению ЦП может быть увеличен.

ЦП является препаратом, выделяемым из плазмы крови человека. Перед производителями лекарственных средств, созданных на основе компонентов крови человека, поставлены особые задачи. Это и максимальное использование всех фракций плазмы крови для выделения лекарственных средств, и обеспечение максимальной безопасности конечного продукта, особенно вирусологической.

В настоящее время для производства ЦП производителями препаратов крови используется фракция Б с проведением хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе (Исрафилов А.Г. с соавт., 1993). Недостатком указанной схемы являлись нестабильность ЦП, низкая обменная ёмкость анионообменника, отсутствие дополнительных стадий вирусной инактивации и небольшой выход конечного продукта. Нами предложен новый вариант метода выделения ЦП из фракции IY-1.

Поскольку ЦП относится к а2-глобулинам, на первом этапе работы, необходимо было установить содержание аг-глобулинов во фракциях при спиртовом фракционировании и оксидазную активность фракций. Мы установили, что максимальное количество аг-глобулинов содержится во фракции IY-1. Поэтому оптимальным источником для выделения ЦП следует признать именно эту фракцию, содержащую максимальное количество фермента.

Белковые препараты содержат различные количества биологически активных примесей, способных оказывать отрицательное воздействие на церулоплазмин. Кроме того, ферменты являются нестабильными соединениями, и способны подвергаться значительным изменениям в процессе производства препаратов.

Нами принят ряд мер к обеспечению вирусологической безопасности ЦП. Однако, применяемые методы, в комплексе с выполняемыми в процессе производства процедурами, ведут к снижению ферментативной активности препарата. Известно, что степень очистки ЦП (соотношение оптических плотностей образца при длине волны 610 нм и 280 нм) у высокоочищенных препаратов достигает 0,044-0,052 (Shimizu, 1979). В то же время, в выпускаемом препарате после процесса лиофилизации степень очистки не превышала 0,039. Необходимо было установить причину и характер изменений, происходящих с препаратом в процессе производства, а также оценить влияние этих изменений на биологическую активность препарата.

С этой целью нами был проведен ряд исследований. Во-первых, мы оценили характер изменения молекулы ЦП в процессе производства и при хранении препарата. Для этого были использованы методы: определение степени очистки методом электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы и гель-проникающая хроматография низкого давления, определение ферментативной активности. Было установлено, что молекула ЦП теряет ионы меди, при этом освобождаются некоторые гидрофобные участки молекулы ЦП (De Filippis et al., 1996), что способствует комплексообразованию. Нами показано, что изменения структуры церулоплазмина не связано с процессом фрагментации.

Необычным явился и тот факт, что ЦП длительное время сохранял активность в жидком виде. Это можно объяснить тем, что после разведения спиртового осадка ЦП не проводилось ультрафильтрации; и из-за присутствия примесей этилового спирта, препятствующего окислительной модификации ЦП, препарат сохранял свои биологические свойства. При лиофилизации спирт удалялся, и препарат немедленно подвергался окислению. Между тем процесс лиофилизации традиционно используется для сохранения свойств биологических препаратов в процессе хранения. Нами было установлено, что в процессе лиофилизации препарат подвергается тем же изменениям, которые были описаны Kang et al., (2001). Поэтому с целью сохранения нативно-сти конечного продукта мы ввели в состав препарата вещества, препятствующие окислительной модификации (Kang et al., 2001). Из перечня предложенных веществ Kang et al., (2001), по нашему мнению, маннитол является наиболее приемлемым для производства ЦП. При использовании методов электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы и гель-проникающей хроматографии, было установлено, что 1% концентрация маннитола является оптимальной для сохранения нативности ЦП.

Учитывая эти результаты, была разработана новая технологическая схема получения ЦП из фракции IV-I. Для стабилизации ЦП фракцию на первой стадии суспендировали в 0,05 М ацетатном буфере с рН 5,6-5,7 и проводили прогрев суспензии при 60°С. При этом, большинство балластных белков денатурировалось, а термостабильный ЦП оставался в растворе. Как показали дальнейшие исследования прогрев фракции при 60°С не влиял на ферментативную активность ЦП. После центрифугирования проводили сорбцию белков на анионообменнике. В качестве анионообменника ДЭАЭ-сефадекса А-50, который обладал обменной ёмкостью в 5,9 раза выше, чем ДЭАЭ-целлюлоза. Затем ЦП элюировали с анионообменника 0,4 М ацетатным буфером рН 5,6- 5,7. Дальнейшую очистку проводили, добавляя в элю-ат, хлороформ до 2%. Содержащиеся в элюате липопротеиды и другие белки удалялись с осадком. Очищенный ЦП концентрировали 30%-ным этанолом. Осадок растворяли до содержания белка 5,0-6,0%, стабилизировали маннитолом и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации. Препарат разливали в ампулы и лиофилизировали.

Следующей задачей данной работы, было изучение фармакокинетики, полученного препарата, при различных способах введения. Нами проводилась оценка активности и количества ЦП при введении экспериментальным животным, в данном случае кроликам. Исходя из ранее существовавшего предположения о связи биологического эффекта и ферментативной активности ЦП можно было ожидать, что немедленно после введения ЦП повысится оксидазная активность плазмы, которая будет снижаться постепенно, по мере выведения экзогенного ЦП из организма. Однако, немедленно после внутривенного введения ЦП наблюдалось резкое и кратковременное повышение оксидазной активности плазмы, за которым следовало ее снижение. При этом концентрация ЦП человека в плазме оставалась высокой. Поэтому снижение оксидазной активности плазмы нельзя объяснить протеолитиче-ским расщеплением - в этом случае происходило бы и адекватное снижение концентрации ЦП человека. Нами продемонстрирован период полужизни ЦП, который составил 72 часа. Интересно отметить зависимость оксидазной активности плазмы от ее исходного уровня - чем данный показатель был выше, тем ниже ее последующие значения после введения ЦП человека. При внутримышечном введении ЦП уже через сутки в периферической крови наблюдался ЦП человека, хотя концентрация его в плазме приблизительно в три раза меньше, чем при внутривенном введении. Таким образом, было показано, что внутримышечное введение ЦП также перспективно, что позволит применять препарат не только в стационарных условиях, но и больным, находящимся на амбулаторном лечении, при этом так же достигая оптимального эффекта.

Для оценки эффективности антиоксидантных свойств препарата была выбрана гипобарическая гипоксия. Она была выбрана потому, что в основе защитного действия лежат более сложные механизмы, чем просто ингибиро-вание перекисного окисления липидов. Обострение гипоксических повреждений после реоксигенации - важный механизм клеточных повреждений при трансплантации и при миокардиальном, печеночном, почечном, кишечном, церебральном и других ишемических синдромах. На основе предварительного клинического опыта мы предположили, что препарат обладает антиги-поксическим действием, поскольку после его применения в клинике происходило уменьшение или исчезновение симптомов энцефалопатии. Наибольший эффект наблюдался при введении препарата за сутки до создания гипоксии, независимо от способа введения. По-видимому, ЦП действовал не только как антиоксидант, но и как донор меди для медь-зависимых факторов. Действительно, спектр действия этих факторов многообразен - это и обеспечение функций нервной системы, и ингибирование ПОЛ, участие в процессах гемокоагуляции, синтез норадреналина и адреналина, метаболизм дигидроксифенилаланина с последующим синтезом меланина и др.

Нам удалось, прежде всего, доказать антигипоксическое действие ЦП. Это позволяет значительно расширить перечень клинических показаний к использованию ЦП. Кроме того, нами было показано, что внутримышечное введение препарата может быть использовано в качестве альтернативного способа, хотя известно, что степень биодеградации белковых препаратов при внутримышечном введении выше.

В последние годы внимание исследователей было привлечено к специфической активности ЦП, т.е. отношению ферментативной активности к концентрации ЦП. Показано, что значение этого параметра изменяется при различных патологических состояниях, в частности, увеличивается при воспалительных заболеваниях (Louro О., et al., 2000). Специфическая активность ЦП отражает баланс окислительной/антиокислительной систем организма, поскольку имеются доказательства, что при некоторых условий ЦП способен проявлять прооксидантные свойства.

Нами проведен анализ специфической активности ЦП и его влияния на некоторые биохимические показатели эндогенной интоксикации плазмы больных с острым деструктивным панкреатитом до и после проведенного курса лечения.

Острый деструктивный панкреатит занимает 3 место среди острых заболеваний органов брюшной полости. Его течение характеризуется высокой частотой осложнений, приводящих к летальному исходу. В 75% случаев отмечается тяжелая эндотоксемия, приводящая к развитию синдрома полиорганной недостаточности, что обуславливает актуальность выбора метода лечения (коррекции) эндотоксикоза у больных с данной патологией.

Правильно выбранная тактика лечения позволяет получить благоприятный исход даже при наиболее тяжелом остром деструктивном панкреатите, уменьшить степень развития осложнений, снизить летальность у этой категории пациентов.

Применение той или иной лечебной тактики, в том числе и упреждающей терапии, зависит от возможности прогнозирования течения заболевания.

Полученные данные свидетельствуют о достоверном увеличении вероятности неблагоприятного течения заболевания при повышении специфической активности ЦП. Повышение доли активного фермента на фоне ухудшения течения заболевания свидетельствует о нарушении окислительного/антиокислительного баланса ЦП и о необходимости его коррекции.

Анализируя полученные данные, мы пришли к заключению, что механизм действия препарата ЦП состоит в регуляции функции медьсодержащих белков, в том числе и в ауторегуляции, за счет коррекции как оксидазной активности, так и концентрации введенного ЦП. По-видимому, существует физиологически определяемый предел ферментативной активности ЦП и оптимальное соотношение его «активной» и «неактивной» форм.

Несомненно, «неактивная» т.е лишенная меди форма ЦП, также обладает биологическим эффектом.

Таким образом, при исследовании биологической роли ЦП и оценке возможности расширения клинического применения препарата необходимо обращать внимание, также на медь-зависимые факторы, которые он способен регулировать. Исходя из полученных нами данных, мы считаем, что должен быть изменен принципиальный подход к использованию ЦП в лечебной практике. Окислительные процессы лежат в основе большинства патологий, однако, несмотря на антиоксидантные свойства, ЦП далеко не всегда проявляет положительный эффект. Наибольший лечебный эффект проявлялся в том случае, если в основе патологии лежали метаболические расстройства.

Это доказывает, что эффект ЦП заключается в регуляции эндогенных факторов, опосредующих развитие патологических процессов. По нашему мнению, препарат обладает огромным, ещё не изученным потенциалом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефремова, Любовь Михайловна, Нижний Новгород

1. Абрамченко В.В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве. 2001.- Санкт-Петербург.

2. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микро-элементозы человека// 1991.- М. Медицина.- с. 496.

3. Агаев А.К. Церулоплазмин как показатель антиоксидантной системы крови у больных с полиорганной недостаточностью. Автореферат диссертации к.м.н. 1991.- Москва.

4. Альседерова А.Ш. Иммунопротективный эффект церулоплазмина в остром периоде у больных, перенесших критические состояния различного генеза// Анестезиол.-реаниматол.- 1992.- №2.- с.43-45.

5. Антоненко С.Г., Бердинских Н.К., Шишко Е.Д., Околот Е.Н. Имму-номодулирующее действие церулоплазмина при опухолевом росте и участие в нём циклических нуклеотидов // Вопросы онкологии.-1985.- т.31.- №5.- с.48-51.

6. Асаниани В.С.Новые методы биохимической фотометрии Москва. Наука,- 1965.-c.541.

7. Бердинских Н.К., Антоненко С.Г., Волощенко Ю.В., Чеботарёв Е.Е., Гавриш И.Н. Роль церулоплазмина в резистентности организма к рентгеновскому облучению // Радиобиология.- 1984.- т.24.- №2.-с.199-203.

8. Бердинских Н.К., Исмайлова И.М., Юдин В.М. Иммуномодулирую-щая активность экзогенного церулоплазмина при экспериментальном опухолевом росте // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 1992.- т.113.- №5.-с.520-522.

9. Бердинских Н.К., Савцова З.Д., Санина О.Л., Антоненко С.Г. и др. Антиоксидантное и иммуномодулирующее воздействия церулоплазмина при экспериментальной гриппозной инфекции // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 1994,- №9.- с.285-287.

10. Васильев В.Б., Качурин A.M., Рокко Р.П., Бельтрамини М.,и др. ф Спектральные исследования активного центра церулоплазмина приудалении и восстановлении в него ионов меди // Биохимия.- 1996.-Т.61.- №2.- с.296-307.

11. Васильев В.Б., Качурин A.M., Сорока Н.В. Дисмутирование супероксидных радикалов церулоплазмином детали механизма // Биохимия,- 1988.- Т.53.- №12.- с.2051-2058.

12. Владимиров Ю.А. Роль нарушения липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Пат.физиол. и эксперим. тер.-1989.-№4,- С.7-17.

13. А 13. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. -1991.-т. 29.-с. 3-250.

14. Гайцхоки B.C., Воронина О.В., Денежкина В.В., Плисс М.Г., Пучко-ва J1.B., Шварцман A.JI., Нейфах С.А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы // Биохимия.- 1990.- т.55.- №5.-с.927-937.

15. Государственная фармакопея СССР, издание XI, выпуск 2 , т. 2 .// -М.- Медицина.- 1990.- с.28.

16. Демуров Е.А., Игнатова В.А. Метаболические и нейрогуморальные 4 механизмы ишемических повреждений миокарда.// Итоги науки итехники. Серия:Физиология человека и животных.-М.,1985.-т.ЗО.

17. Закирова А.Н., Голубкова В.Н., Булгакова А.Д., Большакова А.Ю., Мингазетдинова J1.H. Влияние церулоплазмина на клинико-динамические показатели у больных ишемической болезнью сердца // Здравоохранение Башкортостана.-1997.- №4.- с.24-26.

18. Закирова А.Н., Закирова Н.Э. Влияние антиоксидантов на перекис-ное окисление липидов, реологические свойства крови и течение стенокардии // Здравоохранение Башкортостана.- 1999.- №2.- с.67-70.

19. Закирова А.Н., Мингазетдинова Л.Н., Камилов Ф.Х., Панкин В.З., Лебедев А.В., Коновалова Г.Г. Антиоксидант церулоплазмин: влияние на перекисное окисление липидов, гемореологию и течение стенокардии // Тер. Архив 1994. - т.66.- №9.- с. 24-28.

20. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологиях головного мозга // Знание-М.-2000.

21. Исрафилов А.Г. Получение церулоплазмина из отходов производства препаратов крови. Автореферат к.м.н. -1993.- Москва.

22. Карякина Е.В., Шабанова С.П., Белова С.В., Горячев В.И. и др. Церулоплазмин в коррекции аутоиммунного воспаления// Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,- 1999.- с.35.

23. Король Д.Р. Защитный эффект церулоплазмина при введении канцерогенных веществ и опухолевом росте. Автореферат к.м.н. -1988.-Киев.

24. Кудряшов Ю.Б. Лучевое поражение критических систем // Лучевое поражение / Под ред. Ю.Б. Кудряшова. М., 1987. -с. 5-72.

25. Кузьмина Е.И., Потехина Ю.П., Перетягин С.П., Масленников О.В. Экспериментальный подбор терапевтических доз озона на модели in vitro и их апробирование в клинике.//Нижегородский экспериментальный журнал. Н.Новгород.- 1998.-№3.-с.83-87.

26. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва. - Высшая школа. - 1990. - с.111-134.4

27. Маурер Г. «Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле».// Мир. Москва. - 1971.-е. 157-168.

28. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств.- Москва. 1990.- с. 18.

29. Морозова Ю.В., Крайнова Т.А., Ефремова Л.М. Антиоксидантная роль церулоплазмина при перенашивании беремености и в процессе родов.// Кафедра акушерства и гинекологии Нижегородской государственной академии.- Н.Новгород.- 2003.-с.85-89.

30. Нейфах С.А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков. // Усп. биол. химии. 1989.- №38.-с. 102-124.

31. Никифоров Н.Д., Санин Б.И., Шерстнев М.П, Владимиров Ю.А. и др. Клиническая эффективность препарата церулоплазмин при вирусных гепатитах В и С // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- 1999.- с.318.

32. Панченко Л.Ф., Герасимов A.M., Антоненко В.Д. Роль пероксисом в патологии клетки.- Москва.,Медицина.-1981.-е.208.

33. Плецитый Д.К. Витамин А и его синтетические производные как стимуляторы противоопухолевого иммунитета // Вопросы онкологии. -1988. т. XXXIV, в.1. - с.1283-1290

34. Погосян Г.Г., Налбандян P.M. Ингибирование липидной пероксида-ции супероксиддисмутазой и церулоплазмином.// Биохимия.- 1983.-т.48.-с.1129-1134.

35. Пучкова JI.B., Алейникова Т.Д., Вербина И.А., и др.// Биохимия.-1993.- Т.58.- №2.- с.1892-1901.

36. Пучкова J1.B., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Гайцхо-ки B.C. Реконструирование пути межклеточного переноса пептидной части молекулы церулоплазмина в организме млекопитающих // Биохимия.- 1997.- т.62.- №7.- с.817-825.

37. Саенко Е.Л., Скоробогатько О.В., Мжельская Т.Н. Защитное действие, оказываемое церулоплазмином человека на эритроциты при ге-патоцеребральной дистрофии// Биохимия.-1989.- т.54.-№10.-с.1617-1622.

38. Саманчина Б.Т., Миррахимов М.М. Влияние высокогорной терапии на иммунологические показатели больных с инфекционно-аллергической формой бронхиальной астмы.// Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии.- Душамбе.1983.-с.106-167.

39. Санина О.Л., Бердинских Н.К. Биологическая роль церулоплазмина и возможности его клинического применения. Обзор литературы // Вопр. Мед. Химии 1986.- т.32.- вып.5 - с.7-14.

40. Свиридова С.П., Горожанская Э.Г., Ларионова В.Б., Михаевич О.Д. и др. Предоперационная коррекция перекисного окисления липидов у больных раком лёгкого // Анестезиология-реаниматология.- 1983.-№3.- с.39-41.

41. Сенюк О.Ф., Скоробогатько О.В., Тарасенко П.Д., Ромашко В.В. и др. Исследование физиологических функций церулоплазмина человека. Влияние церулоплазмина на иммуноциты в норме и при патологии // Биохимия.- 1994.- т.59.- вып. 10.- с. 1503-1510.

42. Соколов А.В., Соловьев К.В. Роль факторов контактной активации свертывания крови в протеолизе церулоплазмина// Тезисы докладов 7-ая Пущинская школа-коференция молодых ученых "Биология-наука XXI века".- 2003.- Санкт-Петербург.

43. Тарасенко М.Ю. Профилактика и лечение ожоговых анемий. Автореферат диссертации к.м.н.- 1995.- Санкт-Петербург.

44. Тихонов В.А., Сало Д.П., Барабой В.А. Медико-биологические аспекты выделения и применения препаратов прополиса.// Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям, секция III- IV,- Ташкент. ФАН.-1982.-С.47.

45. Трубников Г.А., Журавлёв Ю.И. Антиоксиданты в комплексной терапии больных хроническим бронхитом // Российский медицинский журнал.- 1998.- №2.- с.38-40.

46. Ярополов А.Н. Механизмы антиоксидантного действия церулоплазмина// Доклады академии наук СССР.- 1986.- т.291.- №1.- с.237-241.

47. Aebi Н. Methoden der erymatiechen analyses // Biochemistry. 1970. - v. 2. - p. 636-647

48. Arimori S. Treatment on aplastic anemia, with special reference to ceru-loplasmin // Jap.J. Clin. Exper. Med. 1966.- v.43.- p. 1897.

49. Askwith C., Eide D., Van Ho A., Bernard P.S., Li L., Davis S., KaplanJ., Sipe D.M. The Fet3 gene of S . cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake // Cell 76.- 1994.-p. 403-410.

50. Askwith C., Kaplan J. Iron and copper transport in yeast and its relevance to human disease.// TIBS 23.- 1998.- p. 135-138.

51. Atanasiu R.; Gouin L.; Mateescu M.A.; Cardinal R.; Nadeau R. Class III antiarrhythmic effects of ceruloplasmin on rat heart // Can. J. Physiol. Pharmacol.- 1996.- v.74. -№6.- p.652-656.

52. Attieh Z.K., Mukhopadhyay C.K., Seshadri V., Tripoulas N.A., P.L. Fox N.A. Ceruloplasmin ferroxidase activity stimulates cellular iron uptake by a trivalent cation-specific transport mechanism // J. Biol. Chem. -1999.-v.-274.-p. 1116-1123.

53. Barras B.C., Coult D.B., Rich P. Substrate specificity of ceruloplasmin. Phenylalkylamine substrates. // Biochem. Pharmacol.- 1974,- v.23.- p.47-51.

54. Belch J.J., Chopra M., Hutchison S., Lorimer R., Sturrock R.D., Forbes C.D., Smith W.E. Free radical pathology in chronic arterial disease // Free Radic.Biol.Med. 1989.- V6.- №4.- p. 375-378.

55. Bielli P, Bellenchi GC, Calabrese L. Site-directed mutagenesis of human ceruloplasmin:. production of a proteolytically stable protein and structure-activity relationships of type 1 sites.// J Biol Chem. 2001.- №26.-v.276.-p.2678-85.

56. Bradbury M.W.B. Transport of iron in the blood-brain-cerebrospi-nal fluid system.// J. Neurochem. -1997.-№ 69.-p.- 443-451.

57. Broman L.,Kjellin K. A rapid semi-cotinuous method for purificatiop of ceruloplasmin from human serum // Bioch et bioph Acta.-1963.-v.82.-p.101-109.

58. Brown J.M., Powers L., Kincaid В., Larrabee J.A., Spiro T.G. Structural studies on hemocyanin active site. 1. Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) analysis. // J. Am. Chem. Soc. 1980.- v. 102.- p. 42104216.

59. Calabrese L., Malatesta F., Barra D. Purification and properties of bovine caeruloplasmin. // Biochem. J.- 1981.- v. 199.- p.667-673.

60. Calabrese L, Mateescu MA, Carbonaro M, Mondovi B. Reexamination of spectroscopic properties of ceruloplasmin freshly isolated with a novelvery rapid single-step procedure //Biochem Int.- 1988.-№16-v.2.-p.l99-208.

61. Craig W.Y., Poulin S.E., Palomaki G.E., Neveux L.M. Oxidation-related рл analited and lipid and lipoprotein concentration in helthy subjects. //

62. Thromb. Vase. Biol.- 1995,-v. 15.- p.733-739.

63. Crutchley D.L., Que B.G. Copper-induced tissue factor expression in human monocytic THP-1 cells and its inhibition by antioxidants // Circulation.- 1995.- v.92.- №2,- p.238-243.

64. Curzon G. The inhibition of caeruloplasmin by azide //Biochem J. -1966.-v.2.-p.295-302.

65. Dancis, D.S. Yuan, D. Haile, C. Askwith, D. Eide, C. Moehle, J., Kaplan, R.D. Klausner. Molecular characterization of a copper transport protein in

66. S . cerevisiae: an unexpected role for copper in iron transport // Cell. 76.1994.-p.239-402.

67. David В., Milne. Copper intake and assessment of copper status.// Am. J.Clin.Nutr.-1998.-v.67.-p. 1047-1045.

68. Davis W., Chowrimootoo G.F., Seymour C.A. Defective biliary copper excretion in Wilson's disease: the role of caeruloplasmin // Eur.J.Clin.Invest.- 1996.- v.l0.-p.893-901.

69. Dawson J.H., Dooley D.M., Clark R., Stephens P.J., Gray H.B. Spectroscopic studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites. //J. Am. Chem. Soc.- 1979.-V. 101.-p. 5046-5053.

70. De Filippis V., Vasiliev V.B., Beltramini M., Fontana A.,Salvato В., P Gaitskhoki V.S. Evidense for the molten globule state of human apoceruloplasmin // Biochim. Biophys. Acta.-1996.- v.1297.- №2.- p.119-123.

71. Del Maesrto R.F. et al., Цит. По Герасимову A.M., Фурцевой JI.H.// Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии.1. М.Медицина.-1986.-с.235.

72. Denko C.W. Protective role of ceruloplasmin in inflammation // Agents and Actions.- 1979.- v.9.- p.333-336.

73. Deutch H. The of crystalline ceruloplasmin from human plasma// Arch. Biochem and Biophys.-1960.- v.89.-№2.-p.225-229.

74. Dormandy T.L. Ceruloplasmin: Acute-phase antioxidant.// Agents Actions- 1981.-№8. p.185-197.

75. Duthie G.G., Beattie J.A., Arthur J.R., Franklin M. et al. Blood antioxidants and indices of lipid peroxidation in subjects with angina pectoris//Nutrition.- 1994.-v. 10. -№4.-p.313-6.

76. Dumoulin M.J., Chahine R., Atanasiu R., Nadeau R., Mateescu M.A. Comparative antioxidant and radioprotective effects of ceruloplasmin, superoxide dismutase and albumin //Arzneimittelforschung.-1996.- v.46.- №9.- p.855-861.

77. Ehrenwald E, Fox PL. Isolation of nonlabile human ceruloplasmin by chromatographic removal of a plasma metalloproteinase // Arch Biochem Biophys.- 1994.- №309.- V.2.-p.392-5.

78. Fanto J.C., Ward P.A. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukicytedependent inflammatory reactions //Am.J.Pathol.-1982.-v. 104.-№3.-p.397-418.

79. Fox P.L., Mazumder В., Ehrenwald E., Mukhopadhyay C.K. Ceruloplasmin and cardiovascular disease. // Free Radic. Biol. Med. -2000.-v.28.-p. 1735-44.

80. Gitlin J.D, Gitlin JI, Gitlin D. Localizing of C-reactive protein in synovium of patients with rheumatoid arthritis //Arthritis Rheum. 1977. -v.20. №8 - p. 1491-9.

81. Gitlin J.D. Aceruloplasminemia.//Pediatr. Res.- 1998.-V. 44.- p. 271-276.

82. Grabar P.,Williams C.A. methode permettant letude cojuguee despro-prietes electrophoretiques dun melange de proteins.// Application au serum sanguine, Biochim.Biophys.Acta.- 1953.- v.10.-p.193-194.

83. Halliwell B.O.,Gytteridge J.M. C. Free radicals in biology and medicine.

84. Oxford: Clarendon. Press.-1989.

85. Halliwell B.O.,Gytteridge J.M. C. The antioxidant of human extracellular fluids.// Arch. Biochim. Biophys.-1990.v.280.- p. 1-8.

86. Harris E.D. The transport of copper // Prog.Clin.Biol.Res.- 1993.-v.380. p.163-79.

87. Harris Z.L.,Takahashi Y.,Miyajima H., Serizawa M. et all. Aceruloplas-minemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.- 1995.- v.92. №7. - p.2539-43

88. Harris Z.L., Durley A.P., Tsz K.M., Gitlin J.D. Targeted gene reveals an essential role for ceruloplasmin in cellular iron efflux.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96.- 1999. -p.10812-10817.

89. Hellman NE, Kono S, Mancini GM, Hoogeboom AJ, De Jong GJ, Gitlin JD Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin//J Biol Chem.- 2002.- .№48.-v.277.-p.46632-8

90. Hilton M., Spenser D.S., Ross R., Ramsey A. et all // Biochim. Biophys. Acta.- 1995,- v.245.- p.153-160.

91. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigations in serum copper. II. Isolation of the copper containing protein, and a description of its properties // Acta Chem. Scand.- 1948. v.2.-p.550.

92. P 96. Horakova L, Stole S, Chromikova Z, Pekarova A, Derkova Mechanismsof hippocampal reoxygenation injury. Treatment with antioxidants.// J. Neuropharmacology.- 1997.- №36.- v.2.-p. 177-84.

93. Kaplan J., O'Halloran T.V., Iron metabolism in Eukaryotes: mars and venus at it again.//Science 271.-1996. P. 1510-1512.

94. Katsunuma H., et all. Clinical experience with ceruloplasmin on aplastic anemia// Jap. J. Clin. Med.- 1961.- v. 19.- p.424.

95. Kingston I.В., Kingston B.L., Putman F.M. Primary structure of a his-tidine-rich proteolytic fragment of human ceruloplasmin. II. Amino acid sequence of the tryptic peptides.// J.Biol.Chem.- 1980.- v.255.- p.2886-2896.

96. Klomp L.W., Gitlin J.D. Expression of the ceruloplasmin gene in the human retina and brain: implications for a pathogenic model in aceru-loplasminemia // Hum. Mol. Genet. 1996.- V.5. -№12.- p.1989-1996.

97. Klomp L.W.; Farhangrazi Z.S.; Dugan L.L.; Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J.Clin.Invest. 1996. - v.98. - №1. - p.207-15.

98. Koh T.S.; Peng R.K.; Klasing K.C. Dietary copper level affects copper metabolism during lipopolysaccharide-induced immunological stress in chicks // Poult.Sci. 1996. - v.75.- №7.- p.867 -72.

99. Kouoh Elombo F, Radosevich M, Poulle M, Descamps J, Chtourou S, Burnouf T, Catteau JP, Bernier JL, Cotelle N. Purification of human ceruloplasmin as a by-product of CI-inhibitor.// Biol Pharm Bull.- 2000.-№ 23.-V.12.-p.1406-9.

100. Laurie S.Y., Mohammed E.S. // Coord. Chem. Rev.- 1980.- v.33.- p.279-312.

101. Legras B, Durou MR, Cottencin M, Esvant JY, Cloarec L. Isolation and physico-chemical properties of rat ceruloplasmin //C R Seances Soc Biol Fil.-1980.-v.174.-p.82-6.

102. Levin LA, Geszvain KM. Expression of ceruloplasmin in the retina: induction after optic nerve crush.// Invest Ophthalmol Vis Sci.- 1998.-v.39.-p. 157-63.

103. Linder M.C. and Moor J.R. Plasma ceruloplasmin. Evidence for its presence in and uptake by heard and other organs of the rat. // Biochim. Bio-phys. Acta.- 1977,-v. 499.- p. 329-336.

104. Lindley P.F. et al. An X-ray structural study of human cepuloplasmin in relation to ferroxidase activy.// JBIC. 1997.- Vol. 2.-p. 454-463.

105. Louro M.O., Cocho J.A., Mera A., Tutor J.C. Immunochemical and enzymatic study of ceruloplasmin in rheumatoid arthritis.//J Trace Elem Med Biol.- 2000.-v. 14,- № 3.-p. 174-8.

106. Lowenstein H. Immunochemical investigation on human ceruloplasmin. Partial explanation of the "heterogeneity"// Int J Pept Protein Res 1975,-№7.-v.l.-p.l-9

107. Lu Y., Roe J.A., Gralla E.B., Valentine J.S. Metalloprotein ligand redesign: characterization of cooper-cysteinate proteins derived from yeast copper-zinc superoxide dismutase. // Chapman & Hall, New York.-1977.-p. 64-77.

108. Luza S.C., Speisky H.C. Liver copper storage and transport during development: implications for cytotoxicity //Am.J.Clin.Nutr.- 1996.- v.63. -№5.- p. 812-820.

109. Manolis A., Cox D.W. Purification of rat ceruloplasmin. characterization and comparison with human ceruloplasmin.// Prep.Biochem.- 1980. v.lO.- p.121-132

110. Mancini G., Carbonari A.O., Yeremaus J.// Immunochemistry. 1965.-v.2.-№3.-p.235-254.

111. Mateescu M.A., Chahine R., Roger S., Atanasiu R., Yamaguchi N., Lalumiere G., Nadeau R. Protection of myocardial tissue against deletenous effects of oxigen free radicals by ceruloplasmin // Arneimittel-forschung.- 1995.- v.45.- №9.- p.476-480.

112. Medda R, Padiglia A, Pedersen JZ, Lorrai A, Floris G. Substrate specificity of lentil seedling amine oxidase Biochem // Mol. Biol. Int. 1996.-v.40 №3.- p.629-37.

113. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. //Eur. J. Biochem. 1990.-v. 187.-p. 341-352.

114. Morell AG, Van den Hamer CJ, Scheinberg IH. Physical and chemical studies on ceruloplasmin. VI. Preparation of human ceruloplasmin crystals. J Biol Chem 1969.- v.244.- p.-3494-6.

115. Mondovi В., Graziani M.T., Mims W.B., Oltzik R., Pesach J. Pulsed electron paramagnetic resonance studies of types I and II copper in Rhus vernicifera laccase and porcine ceruloplasmin. // Biochemistry. 1977.- v. 16.- p. 4198-4202.

116. Moos Т., Morgan E.H. Evidence for low molecular weight, non-transferrin-bound iron in rat brain and cerebrospinal fluid.// J. Neurosci. Res.-1998.-№ 54.- p. 486-494.

117. Mukhopadhyay C.K., Attieh Z.K., Fox A.P. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake.// Science.- 1998.- № 279.-p. 714-717.

118. Neel I.V. Rare variants, private polymorphisms, and locus heterozygosity in Amerindian populations //Amer.J.Hum.Genet.- 1979.- v.30.-p.465-490.

119. Nishicimi M., Roo A., Xagi K. The occurence of superoxide anion in reaction of redused phenaxinemetasulfate and molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - v. 146.- №2. - P. 849-854.

120. Okumura M, Fujinaga T, Yamashita К, Tsunoda N, Mizuno S. Isolation, characterization, and quantitative analysis of ceruloplasmin from horses. // Am J Vet Res.-1991.- v. 12.-p. 1979-85.

121. Olivares M., Uauy R. Copper as an essential nutrient // Am.J.Clin.Nutr.- 1996.- v.63.- №5.- p.791s-796s.

122. Osaki.S. Investigation ceruloplasmin. Purification and some phisico-chemical properties of ceruloplasmin.//Biochimistry.- 1966.- v.48.-p.l90-198.

123. Oosthuizen MM, Nel L, Myburgh JA, Crookes RL. Purification of undegraded ceruloplasmin from outdated human plasma.// Anal Biochem. -1985 .-V.146.- p. 1-6.

124. Pan Y.; Katula K.; Failla M.L. Expression of ceruloplasmin gene in human and rat lymphocytes //Biochim. Biophys. Acta.- 1996. v. 1307.-№2.- p.233-238.

125. Patel B.N., David S., A novel Glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes// J. Biol. Chem.-1997.-v. 272 p.20185-20190.

126. Prohaska J.R.; Hoffman R.G. Auditory startle response is diminished in rats after recovery from perinatal copper deficiency // J.Nutr. -1996. v.126. - №3. - p.618-27.

127. Qian Z.M, Ke Y. Rethinking the role of ceruloplasmin in brain iron metabolism. // Brain Res Brain Res Rev.-2001.-v.35.-№3.- p.287-294

128. Qian Z.M., Shen X. Brain iron transport and neurondegenera-tion.//Trend. Mol. Med.- 2001.-№.7.-p.l03-108.

129. Qian Z.M., Tsoi Y.K. Ceruloplasmin promotes iron uptake rather than release in cultured brain astrocytes.// Exp. Brain Res. 2001.-v. 140.-№3.-p.369-74.

130. Qian Z.M., Wang Q., Expression of iron transport proteins and excessive iron accumulation of iron in the brain in neurodegenerative disorders.// Brain Res. Rev. -1998.- №27.- p.257-267.

131. Ravin H.A. Oxidase activity of ceruloplasmin// Lancet.-1956.- p.726-727.

132. Reilly C.A., Aust S.D. Stimulation of the ferroxidase activity of ceruloplasmin during iron loading into ferritin.// Arch. Biochem.Biophysl997. -№ 347.- p.242-248.

133. Richardson D.R. Role of ceruloplasmin and ascorbate in cellular iron release.// J. Lab. Clin. Med. 1999. -№134.- p. 454-465.

134. Richterich R., Temperli A.,Aebi H Die heterogenitat des ceruloplasmin: isolierung und charakterisierung von zwei cupoproteinem//Bioch et bioph Acta.-1961 .-v.56.-p.240-251

135. Ryden L. In "Copper protein and copper enzymes".- Lontie P. Ed.-CRC Press, Boca Raton, Florida.- 1984,- p.37-108.

136. Ryden L. Model of the active site in the blue oxidases based on the ceruloplasmin-plastocyanin homology.// Proc.Nat.Acad.Sci.USA.- 1982.-v.79.- p.6767-6771

137. Salzer J.L., Lovejoy L., Linder M.C., Rosen C. Ran-2, a glial lineage marker, is a GPI-anchored form of ceruloplasmin.// J.Neurosci. Res. -1998.-.№54,-p. 147-157.

138. Sato M.; Schilsky M.L.; Stockert R.J.; Morell A.G.; Stemlieb I. Detection of multiple forms of human ceruloplasmin// J.Biol.Chem.- 1990.-v. 265. -№5.- p.2533-2537.

139. Sayre L.M., Perry G., Smith M.A. Redox metals and neurodegeneratiove disease.// Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. -№ 3,- p. 220-225.

140. Shimizu M. Clinical results on the use of human ceruloplasmin in aplastic anemia.// Transfusion.- 1979.- v. 19.- p.742-748.

141. Shimizu N., Yamaguchi Y., Aoki T. Treatment and management of Wilson-s disease // Pediatr Int. -1999.-v.41.-p.419-422.

142. Sorenson J.R.J., Soderberg L.S.J., Chang L.W. Radiation protection and radiation recovery with essential metalloelements // Proc. Soci. for Exp. Biol. Med.- 1995.- v.210.- №3.- p. 191-204.

143. Stearman R., Yuan D.S., Yamaguchi-Iwai Y., Klausner R.D., Dancis A. A permease-oxidase complex involved in high-affinity iron uptake in yeast.// Science .- 1996,-v. 271. p. 1552-1557.

144. Steinbuch M., Quentin M. Preparation ceruloplasmin// Nature.-1961.- v. 190.- №4781 .-p. 1121.

145. Takahashi Y., Miyajima H., Shirabe S., Nagataki S., Suenaga A., Gitlin J.D. Characterization of a nonsense mutation in the ceruloplasmin gene resulting in diabetes and neurodegenerative diseases.// Hum. Mol. Genet. .-1996.-№ 5.- p.81-84.

146. Thomas Т.; Macpherson A.; Rogers P. Ceruloplasmin gene expression in the rat uterus // Biochim. Biophys. Acta.- 1995. -v. 1261. №1. - p. 77-82.

147. Van Eden M.E., Aust S.D., Intact human ceruloplasmin is required for the incorporation of iron into human ferritin.// Arch. Biochem. Biophys.- 2000.- №381.- p. 119-126.

148. Vachette P, Dainese E, Vasyliev VB, Di Muro P, Beltramini M, Svergun DI, De Filippis V, Salvato B. A key structural role for active site type 3 copper ions in human ceruloplasmin.//J Biol Chem.- 2002. № 25.-v.277.-p.40823-31.

149. Verbina I.A., Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Neifakh S.A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile // FEBS Lett.- 1992.-v.298.-p.l05-108.

150. Wallas E., Lovstad R.A., Wallas D. Free-radical formation of catecholamines by the action of ceruloplasmin. // Biochem. J.- 1964.- v. 92.-p. 18-19.

151. Wan Q.; Yang B.S.; Kato N. Feeding of excessive cystine and cysteine enhances defects of dietary copper deficiency in rats by differential mechanisms involving altered iron status // J.Nutr.Sci.Vitaminol.Tokyo. -1996. v.42. - №3. - p.185-93.

152. Wapnir R.A.; Devas G. Copper deficiency: interaction with high-fructose and high-fat diets in rats // Am.J.Clin.Nutr. 1995. - v.61. - №1. -p.105-10.

153. Wildman R.E.; Hopkins R.; Failla M.L.; Medeiros D.M. Marginal copper-restricted diets produce altered cardiac ultrastructure in the rat // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1995.- v.210. -№1.- p.43-49.

154. Wright H.S., Guthrie H.A., Wong M.Q., Bernardo V. The 1987-88 nationwide food conumption survey: an update on the nutrient intake of respondents // Nutr. Today.- 1991- v.26.- p.21-27.

155. Yoshida K., Furihata K., Takeda S., Nakamura A., Yamamoto K., Morita H., Hiyamuta S., Ikeda S., Shimizu N., Yanagisawa N. A mutation ofthe ceruloplasmin gene is associated with systemic hemosiderosis in humans.// Nat. Genet.- 1995.-№9.-p. 267-272.

156. Young S.P., Fahmy M., Golding S. Ceruloplasmin, transferrin and apotransferrin facilitate iron release from human liver cells.// FEBS Lett. 1997.v.41 l.p. 93-96.

157. Zgirski A, Witwicki J, Hilewicz-Grabska M, Witas H. A simple and rapid procedure for isolation of ceruloplasmin from porcine and bovine blood serum// Acta Biochim Pol.- 1978.-v.25.-p.361-8.

Информация о работе

Ефремова, Любовь Михайловна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1 ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефремова, Любовь Михайловна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ефремова, Любовь Михайловна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефремова, Любовь Михайловна, Нижний Новгород

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина из фракции Кона IV-1
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия