Структурно-функциональная характеристика комплексов церулоплазмина с белками лейкоцитов и их роль при воспалительных процессах

Соколов, Алексей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная характеристика комплексов церулоплазмина с белками лейкоцитов и их роль при воспалительных процессах
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика комплексов церулоплазмина с белками лейкоцитов и их роль при воспалительных процессах"

На правах рукописи

СОКОЛОВ Алексей Викторович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСОВ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА С БЕЛКАМИ ЛЕЙКОЦИТОВ И ИХ РОЛЬ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССАХ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 ИЮЛ 2015

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2015 г.

005570480

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины» (ФГБНУ «ИЭМ»), Санкт-Петербург

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, Васильев Вадим Борисович доктор биологических наук, профессор, Панасенко Олег Михайлович

Официальные оппоненты:

Субботина Татьяна Федоровна, доктор медицинских наук, доцент, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Отдел биохимии Научно-исследовательского центра, Лаборатория биохимического мониторинга, заведующая лабораторией

Маргулис Борис Александрович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН, Отдел клеточных культур, заведующий отделом

Шпаков Александр Олегович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Лаборатория молекулярной эндокринологии и нейрохимии, заведующий лабораторией

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Защита состоится «22» октября 2015 г. в часов на заседании Диссертационного совета

Д001.022.03 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 1973764, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12, ФГБНУ «ИЭМ»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 1973764, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12, ФГБНУ «ИЭМ» и на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov03.htm

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Хныченко Людмила Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Повреждение клеток или присутствие инфекционного раздражителя вызывает в организме человека развитие воспалительного процесса, который способствует элиминации продуктов повреждения и раздражающих агентов, что в конечном итоге приводит к восстановлению зоны повреждения. Воспаление является неотъемлемой частью большинства патологических процессов и сопровождается определенными паттернами реакций: покраснение, боль, отек, жар и нарушение функции. Воспалительная реакция реализуется в основном за счет механизмов врожденного иммунитета, ассоциированных с активностью нейтрофилов (НФ), которые могут приводить к повреждению собственных биополимеров организма в случае избыточного развития воспаления [Scapini and Cassatella, 2014; Hazeldine et al., 2014]. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия участников воспалительных реакций может быть полезно для разработки методов диагностики тяжести воспалительного процесса, оценки адекватности применяемой противовоспалительной терапии, а также для создания новых противовоспалительных препаратов.

В настоящее время известно, что при развитии воспаления происходит индукция синтеза ряда белков, называемых положительными белками острой фазы воспаления. Концентрация в плазме крови некоторых из них, например С-реактивного белка и сывороточного амилоида Р, возрастает в первые дни воспалительной реакции в 300 раз, достигая значений 0,03 мкМ. Одним из превалирующих белков острой фазы воспаления является церулоплазмин (ЦП, ферроЮг-оксидоредуктаза). Его концентрация достигает 10 мкМ [Gitlin, 1988], что сравнимо с увеличением концентрации таких мажорных белков острой фазы воспаления, как фибриноген и гаптоглобин [Jain et al., 2011]. Исследования ЦП в Институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург) продолжаются уже более 40 лет [Шапошников и соавт., 1967]. Однако в течение этого времени так и не сформированы ясные представления о (пато)физиологической роли данной медь-содержащей ферроксидазы [Gutteridge and Stocks 1981; Floris et al., 2000; Musci et al., 2014].

Особенности наследственных заболеваний, связанных с нарушением синтеза ЦП: ацерулоплазминемии (функциональные дефекты гена ЦП) и болезни Вильсона-Коновалова (дефекты гена медь-транспортной АТФазы 7В), с одной стороны, раскрывают часть функций данного белка, с другой - демонстрируют наличие систем, способных компенсировать функции ЦП [Vassiliev et al., 2005; Vashchenko and MacGillivray, 2013]. Так, при ацерулоплазминемии отмечены массивные отложения закисного железа в тканях, провоцирующие окислительный стресс, который поражает в первую очередь нервную систему и поджелудочную железу, приводя к нейродегенерации и сахарному диабету. Однако, несмотря на то, что на долю ЦП приходится около 90-95 % меди, обнаруживаемой в сыворотке крови, метаболизм меди не нарушен ни у людей, больных ацерулоплазминемией, ни у мышей в экспериментах с выключенным геном ЦП [Meyer et al., 2001; Kono, 2013]. Доля несвязанной с ЦП меди в плазме крови может быть больше, чем предполагали раньше [Twomey et al., 2007]. Болезнь Вильсона-Коновалова, приводящая к накоплению меди в нервной ткани, печени и других органах, характеризуется пониженным содержанием активного ЦП в плазме крови пациентов. Однако до сих пор не отмечено каких-либо значительных нарушений метаболизма железа у таких больных, что можно объяснить наличием альтернативной ферроксидазы II, ассоциированной с медь-содержащими липопротеинами низкой плотности. Кроме того, мембраносвязанный гомолог ЦП, гефестин, дополняет функции ЦП [Fox, 2003].

Степень разработанности темы исследования. Возвращаясь к возможным функциям ЦП при воспалительных реакциях, следует отметить роль функционирования гена ЦП в выживании нейронов при воспалении. Так, у мышей с выключенным геном ЦП в ответ на введение бактериального липополисахарида (ЛПС) происходят накопление закисного железа, значительная демиелинизация и гибель нейронов. Заражение контрольных мышей S. pneumonia приводит к увеличению синтеза ЦП клетками, выстилающими сосудистую стенку, а у нокаутированных по гену ЦП мышей в тех же клетках увеличивается синтез Р-селектина. Это указывает на участие ЦП в регуляции проницаемости барьера между кровеносной и нервной системами. Вероятно, ЦП защищает нервную систему от токсических факторов микробной

инфекции [Glezer et al., 2007]. Наконец, мыши, нокаутированные по гену ЦП, не выживают при развитии экспериментального колита, что, как считают авторы исследования, связано с отсутствием защитного противовоспалительного действия ЦП [Bakhautdin et al., 2013].

Одним из способов модуляции функций ЦП при воспалении может быть его участие в белок-белковых взаимодействиях. В 90-х годах прошлого века и в начале нынешнего столетия были описаны комплексы ЦП с протеином С [Walker and Fay, 1990], плацентарной щелочной фосфатазой [Hilton et al., 1995], миелопероксидазой [Segelmark et al., 1997], ферритином [Juan and Aust, 1998], нейропептидом PACAP38 [Tams et al., 1999], ферропортином 1 [Jeong and David, 2003] и фактором, ингибирующим миграцию макрофагов [Meyer-Siegler et al., 2006].

Исследования, проведенные в нашей лаборатории за последние 15 лет, продемонстрировали способность ЦП образовывать комплексы с белками НФ [Vasilyev, 2010]. В частности, были обнаружены in vivo комплексы ЦП с лактоферрином (ЛФ) и миелопероксидазой (МПО) -основными белками, секретируемыми НФ при воспалении из секреторных и азурофильных гранул соответственно. Оказалось, что образование комплексов катионных белков с анионным ЦП довольно стереотипно. Вместе с тем описанные нами взаимодействия специфичны, и в настоящее время из множества обнаруженных in vitro комплексов ЦП только его комплексы с ЛФ и МПО обнаружены от vivo [Соколов и соавт., 2007].

Цель. Цель работы состояла в изучении структурно-функциональных взаимоотношений компонентов в комплексах, образуемых церулоплазмином с белками лейкоцитов и плазмы крови, участвующих в воспалительных реакциях.

Задачи. Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать белки, формирующие комплексы с церулоплазмином при воспалительных процессах.

2. Исследовать сайты взаимодействия церулоплазмина с белками лейкоцитов и охарактеризовать сродство компонентов в комплексах.

3. Уточнить стехиометрию компонентов в комплексах церулоплазмина с миелопероксидазой и лактоферрином.

4. Изучить протеолитические системы, регулирующие активность церулоплазмина при воспалительных состояниях.

5. Исследовать механизмы влияния церулоплазмина на провоспалительные функции катионных белков лейкоцитов: миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов, 5-липоксигеназы и белков серпроцидинового семейства.

6. Осуществить моделирование окислительной деструкции церулоплазмина под действием пероксида водорода и HOCl/HOBr и поиск протективных механизмов, препятствующих его повреждению. Изучить влияние модификации церулоплазмина на его антиоксидантные свойства.

7. Изучить избирательность взаимодействия церулоплазмина в плазме крови с белками лейкоцитов и возможность образования многокомпонентных комплексов.

Научная новизна:

1. Охарактеризована стехиометрия комплексов церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой.

2. Впервые описаны комплексы церулоплазмина с белками семейства серпроцидинов, пероксидазой эозинофилов, 5-липоксигеназой, матриксными металлопротеиназами 2 и 12, а также с тромбином.

3. Впервые выявлены мультикомпонентные комплексы церулоплазмина с миелопероксидазой и липопротеинами плазмы крови у пациентов с атеросклерозом. Показано антиатерогенное действие интактного церулоплазмина в отношении липопротеинов низкой плотности, модифицированных хлорирующей миелопероксидазой.

4. Впервые исследованы изменения свойств церулоплазмина в комплексах с белками лейкоцитов, охарактеризованы специфичность образуемых комплексов и сродство их компонентов.

5. Выявлены конкурентные механизмы ингибирования интактным церулоплазмином провоспалительных свойств пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы.

6. Прояснен механизм защитного действия апо-лактоферрина при деструкции церулоплазмина пероксидом водорода, а также тиоцианата при повреждении церулоплазмина системой миелопероксидаза/пероксид водорода/хлорид (бромид).

7. Показано, что церулоплазмин, модифицированный НОС1, НОВг или HOSCN, сохраняет способность снижать продукцию активных форм кислорода активированными нейтрофилами.

8. Впервые охарактеризованы системы протеиназ, разрушающих церулоплазмин /и vivo. Тромбин идентифицирован как протеиназа, вызывающая ограниченный протеолиз церулоплазмина при получении и хранении его препаратов. Показано образование комплекса между церулоплазмином и тромбином.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования позволяют уточнить молекулярные механизмы регуляции церулоплазмином воспалительных процессов, сопровождающих многие патологические состояния. Полученные в ходе исследования характеристики компонентов комплексов, образуемых с участием церулоплазмина, позволяют дополнить сведения об общих механизмах образования и о свойствах белок-белковых комплексов. Показано, что идентифицированные комплексы церулоплазмина могут быть дополнительными маркерами течения воспалительного процесса, а характеристика протеолитической деградации церулоплазмина в биологических жидкостях может быть одним из маркеров осложнения воспаления. Изученные в ходе исследования механизмы противовоспалительного действия церулоплазмина могут быть полезными для отработки стратегии лечения осложнений воспалительных заболеваний. Разработанные в ходе исследования методы выделения недеградированного церулоплазмина могут составить основу новых технологий промышленного получения церулоплазмина с целью создания диагностических и лекарственных препаратов на его основе. Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов биохимии, иммунологии и цитологии в ВУЗах биологического и медицинского профиля.

Методология и методы исследования. Исследование структурно-функциональных характеристик комплексов ЦП с белками, участвующими в воспалительных процессах, выполнено с использованием высокоочищенных препаратов белков, а также биологических жидкостей, полученных от пациентов с воспалительными заболеваниями. С помощью биохимических, биофизических и иммунохимических методов охарактеризованы структурная организация и изменения функций компонентов комплексов, состоящих из ЦП и белков-партнеров. Изучено действие ЦП на провоспалительные функции НФ и моноцитов/макрофагов. Для очистки белков и антител, идентификации белков и комплексов, характеристики изменения свойств белков и клеток было использовано более 50 методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Взаимодействие церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой приводит к образованию пентамера: 2ЛФ-2ЦП-МПО.

2. Ингибирование церулоплазмином миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы эффективно в случае интактности связи, соединяющей 5-й и 6-й домены церулоплазмина.

3. Среди представителей семейства серпроцидинов наибольшим сродством к церулоплазмину обладает азуроцидин (Kd ~ 13 нМ).

4. Тромбин гидролизует церулоплазмин по сайтам K887-V888 и R481-S482, приводя к нарушению противовоспалительных функций белка.

5. В плазме крови миелопероксидаза образует многокомпонентные комплексы с церулоплазмином и аиоВ-100-содержащими липопротеинами. Интактный церулоплазмин снижает проатерогенное действие хлорирующей миелопероксидазы на липопротеины низкой плотности.

Степень достоверности и апробации результатов. Результаты получены с помощью современных методов. Объем выборок и число независимых экспериментов позволил оценить значимость результатов после обработки с помощью адекватных методов статистического анализа. Материалы работы докладывались на следующих конференциях: V, VI и VII национальных научно-практических конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007, 2009,

2011), VHIth, Xth, Xlth International Conference on Lactoferrin "Structure, Function & Applications" (Франция, Ницца, 2007; Мексика, Масатлан, 2011; Италия, Рим 2013), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международных конференциях «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (2008, 2012, 2014, Минск, Беларусь), IV, V, VI, VII, VIII и IX крымских конференциях «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2008-2013), Biochemical Society London Conference "Experimental approaches to protein:protein interactions" (Великобритания, Шеффилд, 2010), Международной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты воспаления» (Беларусь, Минск, 2011), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), IV Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2013), 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013), XXVI Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis (Нидерланды, Амстердам, 2013), 11th International Conference Biology and Synchrotron Radiation (Германия, Гамбург, 2013), 8th International Human Peroxidase Meeting (Австралия, Сидней, 2013), Biochemical Society London Conference "The Biological and Biomedical Consequences of Protein Moonlighting" (Великобритания, Лондон, 2014).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в 29 публикациях, в их числе 23 статьи в рецензируемых журналах, из них 19 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, представленных в "PubMed"; получен 1 патент РФ.

Личный вклад соискателя. Автор проанализировал литературу по проблеме исследования, осуществил планирование экспериментов и получил основную часть результатов, которые представил в докладах на конференциях и опубликовал в научных статьях. Соискателем были разработаны методы очистки белков; оптимизированы методы определения их ферментативной активности; получены аффинные сорбенты, с использованием которых выделены белковые препараты и получены моноспецифические поликлональные антитела к ним; проведена биохимическая оценка свойств изучаемых белковых комплексов; отработаны методы определения белков с помощью иммуноферментного анализа; выявлены комплексы в образцах биологических жидкостей; подготовлены образцы для масс-спектрометрического анализа; проведена статистическая обработка полученных данных. Рентгеноструктурные исследования ЦП и его комплексов проведены к. ф-м. н. В.Р. Самыгиной (Институт Кристаллографии РАН, г. Москва) на станции синхротронного излучения BW6, DESY в сотрудничестве с Г. Бартуником и Д.И. Свергуном (Гамбург, Германия). Исследования деструкции ЦП под действием пероксида водорода проведены к. б. н. К.В. Соловьёвым и к. б. н. М.О. Пулиной (ФГБНУ «ИЭМ», Санкт-Петербург). Опыты по влиянию ЦП на активность 5-липоксигеназы выполнены асп. Е.А. Голенкиной и д. б. н. Г.Ф. Судьиной (НИИ Физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ, г. Москва). Опыты по исследованию продукции пероксида водорода нейтрофилами выполнены асп. Д.В. Григорьевой и к. б. н. И.В. Горудко (Белорусский государственный университет, г. Минск).

Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список сокращений» «Список литературы», включающий 448 источников, из них 44 - отечественных, и «Приложение». Диссертация изложена на 232 страницах. Результаты и обсуждение представлены в 23 таблицах и иллюстрированы 67 рисунками.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ: №№ 05-0448765, 06-04-48602, 08-04-00905, 09-04-00742, 09-04-01059, 10-04-00820, 11-04-01262, 12-0400301, 13-04-01186, 14-04-00807, грантов президента РФ: МК-1484.2012.4, МК-6062.2014.4, а также программы РАМН «Протеом человека».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовали реактивы фирм "Amersham" (меченные пероксидазой хрена антитела), "BD Biosciences" (антитела), "BioRad" (хроматографические смолы, реактивы для электрофореза и Вестерн-блотгинга), "ICN" (субстраты ферментов), "Merck" (неорганические реактивы, растворители); "Pharmacia" (хроматографические смолы), "Serva" (полный и неполный

адъюванты Фрейнда, красители, органические реактивы), "Sigma" (ингибиторы и субстраты ферментов, ферменты и белки, органические реактивы), «Лаборатория МЕДИГЕН» (реактивы для электрофореза), «РЕАХИМ» (кислоты). Растворы, содержащие NaOBr (NaOSCN), получали перед опытом в ходе реакции NaBr (NaSCN) с NaOCl. Измерение значений pH буферных растворов производили на портативном рН-метре «Аквилон рН-410», точность измерения 0,01 pH. Пептиды были синтезированы твердофазным методом («НПФ Верта», Санкт-Петербург), чистота 99,5 % (по данным ВЭЖХ, масс-спектрометрии и аминокислотного анализа).

Получение белковых препаратов. Для выделения ЦП из плазмы крови использовали три метода, различающихся по типу аффинного сорбента для очистки ЦП: с использованием протамин-Сефарозы [Соколов и соавт., 2005], неомицин-агарозы [Соколов и соавт., 2011; Соколов и соавт., 2012] и АЕ-агарозы [Musci et al., 1993]. Первые два метода требуют предварительной очистки ЦП на ионообменных смолах и позволяют получить стабильный при хранении препарат с критерием чистоты Лбк/Лзяо = 0,051-0,052. Для получения ЛФ из грудного молока был применен двухэтапный метод [Zakharova et al., 2000]. Выделение серпроцидинов и МПО из лейкоцитов человека осуществляли с помощью последовательного отделения азуроцидина (САР37) и МПО на гепарин-Сефарозе, отделения эндогенных ингибиторов от протеиназ (нейтрофипьной эластазы (NE), катепсина G (CG) и протеиназы 3 (PR3)) при гель-фильтрации на Сефадексе G-75, отделения PR3 на апротинин-Сефарозе и очистки белков на CM-Toyopearl. Препараты протеиназ и САР37 были на 99 % представлены 30 кДа зонами по данным SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), не содержали примесных протеолитических активностей и фрагментов гомологов по данным масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза. Дополнительные порции МПО и пероксидазы эозинофилов (ЭПО) получали после экстракции белков катионным детергентом СТАВ [Olsen and Little, 1983]. Критерии чистоты ЭПО A4n/A2so (RZ) = 1,09 и МПО Л41,/Л2но (RZ) = 0,83 не уступали описанным в литературе. Липопротеины выделяли методом ультрацентрифугирования плазмы крови, последовательно наслаивая на плазму растворы с плотностью 1,0055 г/мл для липопротеинов очень низкой (ЛОНП), 1,063 г/мл для липопротеинов низкой (ЛНП) и 1,21 г/мл для липопротеинов высокой плотности с отделением соответствующей флотирующей фракции липопротеинов. Отобранные липопротеины диализовали против PBS. Фракции липопротеинов хранили при 4 °С и использовали в течение 3-4 дней после выделения.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Для анализа гомогенности, молекулярной массы и элеетрофоретической подвижности использовхчи различные варианты электрофореза (ЭФ) в ПААГ. Диск-ЭФ нативных белков (pl<7) проводили в 7,5%-ном разделяющем ПААГ, содержащем Tris-HCl буфер, pH 8,9 [Davis, 1964]. Специфическую оксидазную активность ЦП выявляли путем окрашивания гелей раствором о-дианизидина (o-DA) [Owen and Smith, 1961]. Диск-ЭФ нативных белков (pl>7) проводили в 7,5%-ном разделяющем ПААГ, содержащем КОН-СНзСООН буфер, pH 4,3 [Маурер, 1971]. Пероксидазную активность МПО и ЭПО выявляли с помощью 4-хлор-1-нафтола и пероксида водорода [Sokolov et al., 2011; 2015]. Молекулярную массу, а также чистоту белка анализировали с помощью ЭФ в ПААГ в присутствии SDS, содержащем Tris-HCl буфер, pH 8,9 [Laemmli, 1970]. Для разделения белков с улучшенным разрешением использовали ЭФ в высокомолярной Tris-буферной системе [Fling and Gregerson, 1986]. Желатиназная активность in situ была выявлена после ЭФ проб в SDS-ПААГ, содержащем 0,1%-ный желатин [Cainelli et al., 2003]. Для разделения липопротеинов и их комплексов использовали ЭФ в четырехслойном ПААГ [Wadae/a/., 1973].

Масс-спектрометрия и N-концевой аминокислотный анализ. При приготовлении образцов для масс-спектрометрического анализа белки разделяли ЭФ в ПААГ, вырезали из геля участки, содержащие белковые зоны, и подвергали их триптическому гидролизу [Соколов и соавт., 2009]. Масс-спектры снимали на тандемном MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II ("Bruker", Германия), оснащенном УФ лазером (Nd). N-концевую аминокислотную последовательность белков, перенесенных с помощью полусухого электропереноса на мембрану Immobilon Р, определяли с помощью автоматического секвенатора Procise 491 cLC Protein Sequencing System ("Applied Biosystems", США).

Иммунохимические методы. Для увеличения иммунного ответа у кроликов и крыс антигены (ЦП, МПО, ЛФ, CG, PR3, САР37 и NE) перед иммунизацией подвергали диск-ЭФ в ПААГ, после электрофореза края геля отрезали и окрашивали на Кумасси R.-250. Неокрашенную полоску ПААГ

с основным количеством белка разделяли на части, содержащие около 100 мкг белка. Части ПААГ замораживали при -70 "С и хранили до иммунизации. Для освобождения от примесных белков из антисыворотки выделяли IgG. Для выявления специфических зон в ПААГ после ЭФ применяли метод электрофоретического переноса на нитроцеллюлозный фильтр и детекцию специфических зон с помощью Вестерн-блоттинга [Anderson et al., 1982]. Концентрацию МПО, ЦП и САР37 определяли с помощью специально отработанных протоколов твердофазного иммуно-ферментного анализа [Sokolov et al., 2010].

Клеточные методы. НФ выделяли из свежеотобранной донорской крови с 1,2 г/л ЭДТА (в качестве антикоагулянта). Часть крови оставляли без антикоагулянта для получения сыворотки и опсонизированного зимозана (OZ). Все опыты с НФ проводили непосредственно в день отбора крови и проведения эксперимента. Изучали влияние ЦП на активность 5-липоксигеназы (5-LO) и продукцию супероксидных анион-радикалов НФ [Соколов и соавт., 2010], а также на продукцию пероксида водорода НФ с помощью скополетина [Timoshenko et al., 1998]. Анализ проатерогенности липопротеинов низкой плотности (ЛНП) проводили после их инкубации с моноцитами, стимулированными 50 нМ фоброл-12-миристил-13-ацетатом (РМА). Через 12 и 72 часа после инкубации с ЛНП определяли поглощение клетками холестерина и его эфиров [Sokolov et al., 2014].

Хроматографические процедуры. Все хроматографические процедуры проводили при 4 "С в термостатируемом хроматографическом шкафу, в остальных случаях условия указаны дополнительно. Хроматографию при комнатной температуре осуществляли на хроматографе DuoFlow ("Bio-Rad", США). Для иммобилизации молекул, содержащих NH2-rpynny, применяли метод BrCN-активации. BrCN получали бромированием цианида калия. Активацию проводили при -20 °С [Соколов и соавт., 2005]. Для получения «АЕ-Агарозы» Сефарозу 6В обрабатывали эпихлоргидрином и 2-хлорэтиламином [Musci et al., 1993]. Гель-фильтрацию белков и их комплексов проводили на сорбентах Toyopearl HW-55 Fine (пределы разрешения 1-700 кДа), Сефакрил S-200 HR (пределы разрешения 5-250 кДа), Сефакрил S-300 HR (пределы разрешения 10—1500 кДа), Superóse 6 (пределы разрешения 5-5000 кДа). Аффинную хроматографию проводили для идентификации партнеров ЦП среди белков экстракта лейкоцитов [Соколов и соавт., 2007; 2010], а также определения вклада ионных сил во взаимодействие белков и липопротеинов с ЦП и МПО [Sokolov et al., 2011 ; 2015].

Спектральные методы исследования. Спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой области, а также скорость ферментативных реакций измеряли с помощью спектрофотометра СФ-2000-02 («ОКБ-Спектр», Санкт-Петербург).

Фотонную корреляционную спектроскопию (ФКС) с использованием программы Contin применяли для оценки диаметра белков и их комплексов с помощью субмикронного анализатора N5 Beckman Coulter. В качестве референтных белков, для которых были определены диаметры частиц, использованы белки с известными значениями молекулярной массы: миоглобин (19 кДа), альбумин (67 кДа), ЛФ (78 кДа), ЦП (132 кДа), МПО (145 кДа), альдолаза (158 кДа), ферритин (450 кДа). В экспериментах использовали воду и буфер TBS (150 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4), профильтрованные через фильтр с порами 0,22 мкм. Концентрацию белков в растворах варьировали эмпирически в пределах 1-10 мг/мл, поскольку интенсивность рассеянного света, контролируемая до проведения измерений, должна быть в определенных пределах согласно инструкции прибора.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре Е-4 ("Varían", США) при комнатной температуре. В качестве спиновой ловушки радикалов использовали а-(4-пиридил-1-оксил)->4-т/>ет-бутилнитрон (4-ПОБН).

Хемилюминесцещия. Для регистрации образования НОС1 использовали хемилюминометр SMARTLUM 5773 ("Interoptika-S", Россия) с постоянным перемешиванием образца. Стандартный образец содержал: 10 мМ Na-фосфатный буфер (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 0,2 нМ МПО, 10 мкМ люминола. Реакцию запускали добавлением через диспенсер 5 мкМ Н2О2. Результат представляли в виде светосуммы за первые 10 секунд от момента добавления Н2О2. При изучении влияния белков и других реагентов на хемилюминесценцию МПО их добавляли в реакционную смесь в необходимых количествах перед введением Н2О2. Люминол-зависимую хемилюминесценцию НОС1 регистрировали аналогичным образом, добавляя необходимое количество последнего через

диспенсер к 10 мкМ раствору люминола в 10 мМ Na-фосфэтном буфере (рН 7,4).

Измерение активности ферментов. Пероксидазную активность МПО и ЭПО измеряли по окислению хромогенного субстрата 2,2'-диазинобис(3-этилбензотриазолин-6-сульфоната) натрия (ABTS) [Sokolov et al., 2008]. Помимо ABTS использовали такие субстраты, как гваякол, орцинол, o-DA, 4-хлор-1-нафтол и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. (Псевдо)галогенирующую активность МПО и ЭПО определяли по утилизации пероксида водорода с помощью электрохимического сенсора либо по реакции производных таурина и НОС1 (HOBr, HOSCN) с 5-тио-2-нитробензойной кислотой [Sokolov et al., 2014; 2015]. Активность эластазы и протеиназы 3 измеряли по гидролизу р-нитрофенол-t-BOC-Ala (NBA) [Freinstein and JanofF, 1975]. Активность катепсина G измеряли по гидролизу этилового эфира №бензоил-Ь-тирозина (ВТЕЕ) [Atassi and Manshouri, 1993]. Активность тромбина (Flla) измеряли по скорости гидролиза хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Arg-/>NA HBr [Баркаган и соавт., 2004]. Для оценки взаимодействия с субстрат-связывающими сайтами ЦП измеряли кинетику ферроксидазной и /?-фенилендиамин-(р-РО)-оксидазной активностей [Sokolov et al., 2009]. Супероксиддисмутазную (SOD) активность ЦП оценивали по торможению восстановления ресазурина супероксидным анион-радикалом. Для определения типа ингибирования или активации, а также адекватного выбора формул для расчета констант ингибирования (КО или активации (Ка) использовали обзорную статью с уточнением уравнений для двухпараметрических типов ингибирования и активации [Крупянко, 2007].

Антимикробную активность апо-ЛФ и системы «МПО-НгОг-хлорид/тиоцианат» оценивали по замедлению роста Escherichia coli (штамм ML-35p) спектрофотометрическим методом в присутствии метаболического индикатора ресазурина [Cooper et al., 2013].

Модификация белков и липопротеинов. Апо-форму нефрагментированного ЦП получали путем добавления к 20 мкМ ЦП аскорбиновой кислоты (0,1 М), азида натрия (0,1 М) и ЭДТА (0,5 М) [Соколов и соавт., 2010]. Протеолизованный ЦП (ЦПпр) получали с помощью ограниченного протеолиза плазмином более 90 % белка после такой обработки было представлено фрагментами с М 116 и 19 кДа [Sokolov et al., 2014]. Модификацию ЦП пероксидом водорода проводили при 37 °С, варьируя время инкубации (до 5 часов), концентрацию Н202 (0,1-15 мМ), белков (ЛФ, ЧСА) и рН среды с помощью 10 мМ Na-фосфатного буфера (рН 5,5-7,4). Реакцию модификации ЦП останавливали, добавляя 10 нМ каталазы. К раствору ЦП (50 мкМ) добавляли 100-3000 мкМ HOCl, HOBr, HOSCN в 50 мМ Na-фосфэтном буфере, рН 7,4, тем самым достигалось мольное соотношение окислитель:ЦП = (2-60): 1. Через 30 минут инкубации при 37 °С анализировали изменение спектральных характеристик ЦП, его оксидазных активностей и влияние на респираторный взрыв НФ.

К ЛНП (0,5 мкМ по апоВ-100) добавляли окислители: НОС1 (1:100, моль/моль), HOBr (1:100, моль/моль) или смесь 5 нМ МПО с 50 мкМ Н2О2 в PBS, без или с добавлением 5 мМ NaBr или 0,2 мМ NaSCN, также использовали добавки 5 мкМ гидразида 4-аминобензойной кислоты (АВАН), 6 мкМ ЦП либо ЦПпр, 1мкМ пептида EQIQDDCTGDED, соответствующего а. о. 445^56 апоВ-100 (Р445-456). После 30 минут инкубации при 37 °С модификацию останавливали, добавляя 50 мкМ цистеина. Модифицированные ЛНП исследовали на проатерогенные свойства при инкубации с моноцитами. Для оценки аффинности модифицированных ЛНП к МПО их диализовали в течение 12 часов при 4 "С против 500-кратного объема PBS.

Рентгеиоструктуриые исследования очищенных ЦП и его комплексов проведены к. ф-м. н. В.Р. Самыгиной (Институт кристаллографии РАН, г. Москва) на станции синхротронного излучения BW6, DESY в сотрудничестве с Г. Бартуником и Д.И. Свергуном (г. Гамбург, Германия). Трехмерные структуры ЦП с разрешением 2,6 А (4еп:) и комплекса 2ЦП-МПО с разрешением 4,7 А (4ejx) находятся в открытом доступе в базе данных Protein Data Bank. Условия кристаллизации белков, сбора дифракционных данных, данных SAXS и получения трехмерных моделей белков и их комплексов подробно описаны в нашей работе [Samygina et al., 2013].

Обработка экспериментальных данных. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel 2002. Для проверки гипотезы, что анализируемая выборка имеет нормальное распределение, использовали критерий Колмогорова-Смирнова для а = 0,05. Расчет стандартного квадратичного отклонения от измеренных значений, стандартного квадратичного отклонения для коэффициентов а и Ь, стандартного квадратичного отклонения от координаты пересечения графиком оси х, проводили по стандартным формулам. Для расчета

коэффициентов а и Ь линейной зависимости у=ах+Ь по экспериментальным данным использовали метод наименьших квадратов. Для сравнения фактических значений у и значений, получаемых из уравнения прямой, вычисляли коэффициент детерминированности Я (нормированный от 0 до 1). Доверительные интервалы рассчитывали как Х^ст/п"2)^-,^, значения Г (^критерий Стьюдента) были взяты из табличных значений при условии, что а = 0,05. В случае сравнения экспериментальных данных с расчетным значением использовали одновыборочный 1-критерий, нулевую гипотезу принимали при р > 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структура комплексов, формируемых при взаимодействии церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой.

Состояние проблемы на момент исследования. До начала исследований вопрос о стехиометрии компонентов в комплексах, формируемых ЦП с ЛФ и МПО, не был разрешен. Ряд опытов по разделению комплексов с помощью электрофореза и гель-фильтрации убедительно свидетельствовал в пользу эквимолярного соотношения компонентов (^акЬаюта с! а!., 2000; Соколов и соавт., 2006; Соколов и соавт., 2007]. В частности, при добавлении к ЦП как ЛФ, так и МПО они элюировапись при гель-фильтрации в объемах, соответствовавших соотношению компонентов 1:1 по данным калибровки колонки. С другой стороны, влияние компонентов на ферментативные свойства друг друга [Соколов, 2007] и особенности строения белков (внутримолекулярная гомология ЛФ и ЦП, димерное строение МПО) свидетельствовали в пользу сложного строения комплексов. В частности, для активации />-РО-оксидазной активности ЦП достаточно было добавить 1 моль димерной МПО на 2 моля ЦП [Соколов, 2007]. Изучение влияния ЛФ на ферментативную активность ЦП показало наличие двух центров связывания для ЛФ: 1) связывание с высокоаффинным сайтом непосредственно усиливало сродство ЦП к ионам Ре и скорость их окисления; 2) связывание с низкоаффинным сайтом уменьшало сродство ЦП к р-РО по механизму обратимого конкурентного ингибирования [Соколов, 2007]. Изучение комплексов таких лабильных и крупных белков, как ЦП, МПО и ЛФ, методом рентгеноструктурного анализа осложнено. В литературе описаны единичные примеры получения пригодных для анализа кристаллов крупных секреторных белков. В нашей работе мы проверили полученные ранее данные о стехиометрическом соотношении компонентов в комплексах, получаемых при смешивании ЦП, ЛФ и МПО, с помощью хроматографических и спектральных методов. Полученные результаты сравнили с трехмерными моделями комплексов 2ЦП-МПО (по данным рентгеноструктурного анализа) и ЦП-ЛФ, 2ЦП-2ЛФ-МПО (по данным рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами - 5АХ5).

Таблица 1

Спектральные свойства белков и их смесей_

Белки и их смеси амг/а4){)

ЦП 22,0 > 100

МПО 14,4 1,3

Расчетные значения

1ЦП:1ЛФ 35,0 > 100

1ЦП:2ЛФ 47,8 > 100

1ЦПММПО 14,8 2,4

2ЦП:1МПО 16,5 3,5

1ЦП:1ЛФ:1МПО 18,7 3,0

2ЦП:2ЛФ: 1 МПО 22,6 4,7

Значения, полученные для комплексов после гель-фильтраиии

ЦП+ЛФ 35,1 ±0,2 (р = 0,48) > 100

ЦП+МПО 16,3 ± 0,2 (р = 0,23) 3,4 ±0,1 (р = 0,48)

ЦП+ЛФ+МПО 22,4 ± 0,2 (р = 0,23) 4,6 ±0,1 (р = 0,23)

1.1. Исследование методом гель-фильтрации. Для уточнения стехиометрических соотношений компонентов в комплексах, формируемых ЦП, ЛФ и МПО, использовали опыты с гель-

фильтрацией на колонке с Toyopearl HW-55 fine. Наблюдалась совместная элюция ЦП, ЛФ и МПО в виде симметричных единичных пиков, молекулярная масса которых соответствовала эквимолярному соотношению ЦП-ЛФ, ЦП-МПО и ЦП-ЛФ-МПО: 215 ± 5, 280 ± 6 и 350 ± 5 кДа, соответственно. Но при этом в случае комплекса ЦП-МПО и ЦП-ЛФ-МПО при равномолярном смешивании компонентов в ходе гель-фильтрации вслед за комплексами, содержавшими МПО, элюировалась примерно половина свободной МПО. Поскольку в опытах использовались белки, обладающие хромофорными группами, измерение соотношения характерных для ЦП (А^ю) и для МПО (А430) поглощений во фракциях, соответствовавших комплексам, позволило соотнести их с теоретически возможными и сделать вывод о соотношении компонентов (таблица 1).

Оказалось, что при смешивании ЦП и МПО образуется комплекс 2ЩГ.1МПО, а при смешивании ЦП с ЛФ и МПО формируется комплекс со стехиометрией: 2ЦП:2ЛФ:1МПО. В случае комплекса ЦП и ЛФ данные гель-фильтрации и измерения спектральных характеристик однозначно свидетельствовали в пользу образования комплекса 1ЦП: 1ЛФ.

1.2. Исследование методом фотонной корреляционной спектроскопии. Метод ФКС удачно объединяет особенности хроматографических методов, т.е. позволяет оценить монодисперсность системы, и в то же время, являясь спектральным методом, он не предполагает иного воздействия на исследуемый образец, кроме измерения его взаимодействия со светом. Это исключает артефактное взаимодействие компонентов комплексов с хроматографическими сорбентами и позволяет избежать экстремальных условий электрофоретического разделения (концентрирование образца при диск-ЭФ, перепады рН среды, низкая ионная сила, локальный перегрев). В ходе предварительных опытов проверялось соответствие полученных значений диаметра для ряда белков по результатам ФКС, данным кристаллографических исследований и SAXS. Коэффициент корреляции Пирсона между экспериментальными и описанными в литературе значениями диаметра белковых частиц (d) составил 0,97. Калибровочная прямая зависимости диаметра частиц (d, нм) от логарифма молекулярной массы (М, кДа) характеризовалась уравнением d = 5,191gA/-3,66 и коэффициентом детерминированности R2 = 0,99. Значения диаметра частиц и соответствующие значения М комплексов ЦП с ЛФ и МПО суммированы в таблице 2. Белки смешивали в различных соотношениях, оценивали диаметр образующихся частиц, среднеквадратичное отклонение и индекс полидисперсности, свидетельствовавший об однородности системы. При определении диаметра частиц, образующихся при смешивании ЦП и ЛФ, значения с низким индексом полидисперсности были получены только для смеси белков 1ЦП:1ЛФ. При добавлении к ЦП количеств ЛФ, превышающих эквимолярное соотношение, значения диаметра частиц уменьшались, а стандартное квадратичное отклонение увеличивалось. Это свидетельствовало о накоплении в смеси частиц свободного ЛФ наряду с комплексом 1ЦП:1ЛФ, поскольку метод ФКС позволяет выявить в смеси частицы, диаметр которых различается более чем в 2 раза - в противном случае происходит усреднение значений диаметра и увеличение его стандартного отклоне!шя. Полученное значение диаметра комплекса ЦП-ЛФ — 8,4 нм близко к значению, полученному нами с помощью метода SAXS - 8,6 нм [Sabatucci et al., 2007]. При добавлении ЦП к МПО значения диаметра частиц с низким индексом полидисперсности были получены для смеси с молярным соотношением 2ЦП:1МПО. Значение молекулярной массы этого комплекса (386 ± 55 кДа) подтверждает правильность заключения о таком молярном соотношении. Добавление к комплексу 2ЦП: 1МПО 2-х молярного количества ЛФ привело к увеличению размера комплекса. Это подвергает сомнению возможность образования комплекса со стехиометрией 1МПО:1ЦП:1ЛФ, диаметр которого должен быть меньше, чем у комплекса 2ЦП:1МПО. Судя по значению молекулярной массы полученного комплекса (585 ± 44 кДа), наиболее вероятно образование пентамера: 1МПО:2ЦП:2ЛФ. Дальнейшее увеличение количества добавленного ЛФ привело к уменьшению диаметра частиц и увеличению стандартного квадратичного отклонения.

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о наличии двух сайтов связывания для ЦП на димерной молекуле МПО, что весьма вероятно, учитывая необходимость взаимодействия ЦП как ингибитора с каждым из двух активных центров МПО. Этот вывод также подтверждается исследованиями влияния МПО на активность ЦП в отношении р-РТ>, в которых 1 моля МПО было достаточно для активации 2 молей ЦП [Соколов, 2007]. При добавлении ЛФ к комплексу 1МПО-2ЦП каждая из молекул ЦП, взаимодействующих с мономерами МПО, оказывается способной

присоединить ЛФ. В результате этого образуется пентамер следующего состава: ЛФ-ЦП-МПО-ЦП-ЛФ, что соответствует результатам полученным методом SAXS [Samygina et al., 2013].

Таблица 2

Диаметры комплексов (</) при ФКС и значения молекулярной массы (Л/), полученные при _ смешивании ЦП с ЛФ и МПО_

Смесь (число определений) d, нм М, кДа

Измерено Рассчитано

1ЦП-1ЛФ (15) 8,4 ± 1,2 209 ± 30 (р = 0,98) 210

1МПО-2ЦП (12) 9,8 ± 1,4 386 ± 55 (р = 0,54) 409

1МПО-2ЦП-2ЛФ (16) 10,7 ±0,8 585 ± 44 (р = 0,51) 565

2. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином.

Состояние проблемы на момент исследований. До начала наших исследований вопрос о партнерах ЦП среди белков лейкоцитов практически не был разрешен. Нами были впервые предприняты попытки идентификации белков экстракта лейкоцитов, взаимодействующих с иммобилизованным ЦП. Были определены уже известные партнеры ЛФ и МПО, идентифицированы новые партнеры: серпроцидины (эластаза, катепсин G, протеиназа 3 и азуроцидин), а также основной белок эозинофилов [Соколов и соавт., 2007]. Из плазмы крови больных воспалительными заболеваниями нами был впервые выделен и идентифицирован с помощью масс-спсктрометрии комплекс ЦП-МПО [Соколов и соавт., 2007]. Более детальное исследование смеси белков лейкоцитов, сорбирующихся при аффинной хроматографии на ЦП-Сефарозе, а также идентификация комплексов, выделяемых совместно с ЦП при очистке его препаратов, позволили идентифицировать еще несколько партнеров ЦП.

2.1. Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном церулоплазмине. При анализе белков лейкоцитов, элюированных с ЦП-Сефарозы 1 М NaCl, Вестерн-блоттинг с антителами против 5-липоксигеназы (5-LO) выявил зону с М~ 78 кДа. Именно такая молекулярная масса была определена при изучении 5-LO [Segal, 2005]. Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза 78 кДа-зоны также выявила пептиды, соответствующие 5-LO (обнаружено 4 пептида, 9 % последовательности). В той же белковой зоне с М ~ 78 кДа нами была идентифицирована активность пероксидазы эозинофилов (ЭПО) при окраске геля на пероксидазную активность после SDS-ПААГ-электрофореза без кипячения проб и восстановления дисульфидных связей. МПО в этом случае была выявлена в зоне с М ~ 150 кДа по данным Вестерн:блоттинга.

2.2. Анализ комплексов церулоплазмина, выделяемых при очистке его препаратов. При выделении ЦП на протамин-Сефарозе нами были предприняты попытки идентифицировать комплексы, выделявшиеся совместно с ЦП. Для этого в качестве стартового материала использовали 1 л плазмы, исключили из схемы хроматографию на QAE-Сефадексе и на стадии элюции с протамин-Сефарозы ЦП элюировали 1 М NaCl, рН 7,4. Выделенный практически чистый ЦП (A610/A280 = 0,050, чистота 99,7 %) подвергали гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-200 Superfine (90x2,5 см), уравновешенной PBS. Фракции (по 1 мл), соответствовавшие отдельным пикам, объединяли и концентрировали центрифугированием при 2000 g (4 °С) в ячейке Vivaspin 20 с фильтром, удерживающим белки с молекулярной массой выше 10 кДа. Таким образом, при гель-фильтрации 300 мг практически чистого ЦП на колонке с Сефадексом G-200 перед основным пиком ЦП (рис. 1, а; начало пика - с фракции 5) элюировался пик (фракции 1-3), содержащий около 2 мг белка, т.е. менее 1 % от нанесенного количества ЦП.

При ПААГ-электрофорезе в отсутствие SDS в опережающем пике были выявлены зоны, которые окрашивались хромогенным субстратом ЦП - о-DA, однако отличались по электрофоретической подвижности от основного пика ЦП (рис. 1, б). Ранее в литературе были описаны так называемые димерные изоформы ЦП с молекулярной массой ~ 200 кДа [Sato et al., 1990]. Если предположить, что в минорном пике содержатся димеры ЦП, то их спектральные характеристики не должны значительно отличаться от мономерного ЦП. Однако являющееся критерием чистоты ЦП соотношение поглощения ионов меди I типа и остатков ароматических аминокислот (Лбю/Лгго) в данной ЦП-содержащей фракции оказалось равным 0,027 ± 0,001, что

почти в два раза меньше, чем соотношение, характерное для гомогенного ЦП в основном пике -0,051 ± 0,001. Более того, димерное строение никак не объясняло наличия двух близких по электрофоретической подвижности ЦП-содержащих зон (рис. 1, б*).

<84 ■<66 -<55

-<24

■<20

Рис. 1. а) Участок профиля элюции белков, полученный при гель-фильтрации препарата ЦП на Сефадексе G-200. Фракция 5 - начало основного пика, содержащего 99,3 % белка, нанесенного на колонку. Объем фракции - 1 мл. б, в) Электрофоретический анализ в ПААГ фракций белков, полученных гель-фильтрацией препарата ЦП на Сефадексе G-200; б) в отсутствие SDS (окрашивание o-DA), дорожки 1-7 - фракции 1-7 (20 мкл), звездочкой отмечены зоны, подвергнутые масс-спектрометрическому анализу; в) анализ желатиназной активности in situ фракции 2 (2 мкл) в присутствии SDS (окрашивание Кумасси R-250).

Таким образом, в данных фракциях содержались два близких по электрофоретической подвижности комплекса ЦП. Проведенный масс-спектрометрический анализ белков в ЦП-содержащих зонах с уменьшенной электрофоретической подвижностью (рис. 1, б*) показал, что в этих зонах, кроме фрагментов трипсинолиза ЦП, содержатся фрагменты двух метаплопротеиназ -ММП-2 (обнаружено 7 пептидов, 19 % последовательности) и ММП-12 (обнаружено 5 пептидов, 23 % последовательности). Выявление желатиназной активности in situ после электрофореза в SDS-ПААГ подтвердило наличие ММП в выделенном препарате комплексов ЦП (рис. 1, в). Оказалось, что зоны 72, 67 и 22 кДа проявляют желатиназную активность, что выразилось в полном отсутствии окрашенного красителем желатина в указанных участках геля. Согласно литературным данным, зоны 72 и 67 кДа соответствуют проферменту и активной форме ММП-2, а зона 22 кДа соответствует активной форме ММП-12 [Xie et al., 2005].

2.3. Идентификация компонентов комплексов, обнаруживаемых у пациентов при воспалительных процессах. При ЭФ проб плазмы крови больных атеросклерозом в четырехслойном ПААГ, позволяющем разделять основные классы липопротеинов, которые задерживаются в процессе электрофореза на входе во второй (ЛОНП), третий (ЛНП) и четвертый (липопротеины высокой плотности) слои ПААГ, нам удалось идентифицировать комплексы, включающие апоВ-100-содержащие липопротеины (ЛНП и ЛОНП), МПО и ЦП (рис. 2). Добавление к этим пробам моноклонапьных антител к апоВ-100 вызвало разобщение комплексов с липопротеинами до комплекса ЦП-МПО. В итоге комплексы ЛНП-МПО-ЦП были выявлены нами в 44 из 100 проанализированных образцов плазмы крови, в 33 из них были выявлены также комплексы ЛОНП-МПО-ЦП.

1 2 3 4 1 2 3 4

Г< Г- »> Су rv taL

МПО, нг/мл 1000

|ЛОНП

I лнп

I ЦП-МПО

1 ЦП

800

600

400

лонп лнп лнп

н.о.

Рис. 2. Идентификация комплексов ЛНП(ЛОНП)-МПО-ЦП после электрофореза образцов плазмы крови (50 мкл) больных атеросклерозом в четырехслойном ПААГ: а) окраска на активность МПО; б) окраска на активность ЦП; в) содержание МПО в исследованных образцах в соответствии с обнаружением комплексов, содержащих ЛНП и ЛОНП, только ЛНП либо отсутствием комплексов (н. о.).

Следует отметить, что в тех образцах плазмы крови, где были выявлены комплексы, содержащие ЦП, МПО и липопротеины, уровень МПО всегда превышал 800 нг/мл. У здоровых доноров (65 человек) уровень МПО не превышал 200 нг/мл, и комплексов, содержащих МПО. обнаружено не было. Эти результаты показали, что МПО может взаимодействовать в кровотоке одновременно с ЦП и с апоВ-100-содержащими липопротеинами.

Таким образом, нами были впервые идентифицированы новые партнеры ЦП: 5-LO, ЭПО, ММП-2 и ММП-12, а также комплексы ЦП с МПО и апоВ-100-содержащими липопротеинами.

3. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами и пероксидазой эозинофилов.

Состояние проблемы на момент исследования. Ранее серпроцидины были идентифицированы нами как белки, способные взаимодействовать с ЦП [Соколов и соавт., 2007]. Гомология аминокислотных последовательностей МПО и ЭПО достигает 70% [Sakamaki et al., 1989], что объясняет сходство их функциональных и ферментативных свойств [Furtmiiller et al., 1998]. Вопрос о специфичности комплексов, формируемых ЦП, ЭПО и серпроцидинами. оставался неразрешенным.

3.1. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами. В контрольных опытах было показано, что положительно заряженные серпроцидины без ЦП не входят в ПААГ при диск-электрофорезе в щелочной системе, но при добавлении NE, PR3, CG и САР37 к ЦП его подвижность уменьшалась (рис. 3, а). Следует отметить, что при смешивании ЦП с серпроцидинами в эквимолярном соотношении только с САР37 весь ЦП входил в комплекс. В случае добавления NE, PR3 и CG более половины ЦП не вступало во взаимодействие. Предварительная инкубация серпроцидинов с ингибитором PMSF не оказывала влияния на комплексообразование. Синтетический пептид RKARPRQFPRRR (5-13, 61-63 САР37), имитирующий катионный мотив САР37, необходимый для проявления антимикробных свойств САР37 и связывания с гепарином [McCabe et al., 2002], вытеснял САР37 из комплекса с ЦП. а добавление избытка гепарина вызывало диссоциацию комплекса ЦП-САР37 с образованием свободного ЦП (рис. 3, б). Добавление САР37 к комплексу ЦП с ЛФ и МПО либо к комплексу ЦП

с МПО приводило к вытеснению из этих комплексов МПО с образованием комплексов, включающих в себя соответственно ЦП, ЛФ и САР37 либо ЦП и САР37 (данные не приводятся). Таким образом, САР37 эффективно конкурирует с МПО за общий сайт взаимодействия с ЦП. Добавление каждого из изучаемых серпроцидинов к плазме крови человека, крысы, мыши, кролика, дельфина, собаки и лошади приводило к изменению электрофоретической подвижности оксидазоположительных зон ЦП только в случае с САР37 (рис. 3, в; приведены данные только для САР37). Вероятно, предпочтительными партнерами для серпроцидинов с протеиназной активностью (№, Св и Р113) в плазме являются серпины, концентрация которых и сродство к протеиназам превышают таковые для ЦП. Образование гетерологичных комплексов между САР37 и ЦП различных млекопитающих позволяет предположить эволюционную консервативность структурных мотивов в ЦП, взаимодействующих с САР37.

а 1 234567812345 £

1 234 5 67 812345

ж - * ^ • «■ИмиИИ

в 1 1' 2 2 3 3 4 4' 5 5' 6 6 7 7

ЯВИ!

ш.

ШШшйШШшШШт;.

шшт

Рис. 3. Электрофоретический анализ взаимодействия ЦП с серпроцидинами. Окраска о-ОА. а) Взаимодействие ЦП (1 мкг) с серпроцидинами (0,25 мкг) в присутствии РМЭР (0,01 мкг): 1 -ЦП + ЫЕ + РМ8Р, 2 - ЦП + СО + РМ5Р, 3 - ЦП + РЯЗ + РМБИ, 4 - ЦП, 5 - ЦП + САР37, 6 - ЦП +

ЫЕ, 7 - ЦП + Св, 8 - ЦП + РЯЗ. б) / - ЦП (1 мкг), 2 - ЦП (1 мкг) + САР37 (0,25 мкг) + ЮСАИР1«ЗРР1Щ1 (0,1 мкг), 3 - ЦП (1 мкг) + САР37 (0,25 мкг), 4 - ЦП (1 мкг) + САР37 (0,25 мкг) + гепарин (0,2 мкг), 5 - ЦП (1 мкг) + ЯКА11РК0РР1Ш1 (0,1 мкг). в) Сыворотка крови: 1 -человека (2 мкл), 2 - мыши (10 мкл), 3 - дельфина (10 мкл), 4 - лошади (10 мкл), 5 - кролика (2 мкл), б- крысы (1 мкл), 7- собаки (5 мкл). В опытах Г-7 добавлен САР37 (0,1 мкг).

Для оценки сродства САР37 к ЦП нами была предпринята попытка определить комплекса, формируемого САР37 с иммобилизованным ЦП. Измерение концентрации свободного САР37 после инкубации с ЦП-Сефарозой и контрольной Сефарозой позволило оценить специфическое связывание САР37 с иммобилизованным ЦП. С помощью графиков в координатах Скэтчарда по результатам добавления САР37 к аликвотам ЦП-Сефарозы 0,5 и 1 мкМ получены одинаковые значения Кл 13,7 ± 0,4 и 12,8 ± 0,4 нМ. Участки аппроксимирующих прямых пересекли ось

абсцисс в точках 53 и 111 иМ. Таким образом, отношение концентраций центров связывания весьма близко к отношению аликвот ЦП-Сефарозы (0,5/1 ~ 53/111), использованных в опытах.

3.2. Изучение взаимодействия церулотазмина и пероксидазы эозинофилов. Комплексообразование между ЦП и ЭПО было подтверждено с помощью трех независимых методов. При аффинной хроматографии ЭПО сорбировалась на колонке с ЦП-Сефарозой при использовании PBS в качестве элюента. Последующая элюция ступенчатым градиентом NaCl либо буферными растворами с последовательным понижением pH приводила к полной элюции ЭПО при ионной силе 450 мМ NaCl и выше, а также при pH 3,5 и ниже. Это говорит об электростатической природе взаимодействия, учитывая, что ЦП является кислым белком (pi 4,7), а ЭПО - катионным (pi 10,8) [Weiler et at., 1992]. Для катионной МПО нами ранее наблюдалась элюция с ЦП-Сефарозы при ионной силе выше 300 мМ NaCl либо при pH ниже 3 9 [Соколов и соавт., 2007]. При гель-фильтрации смеси ЦП и ЭПО (1:1, моль/моль) они элюировались совместно в виде единичного пика, в котором соотношение А610/Аш и A4is/A2so составило 0,032 и 0,30 соответственно, тогда как для чистого ЦП соотношение A6«/A2so = 0,050, а для ЭПО соотношение А4!3/А2т = 1,09. Объем элюции (Ve) комплекса ЦП-ЭПО был больше, чем свободный объем колонки, хотя расчетная молекулярная масса такого комплекса 210 кДа предполагала его элюцию в свободном объеме при использовании колонки с Сефакрилом S-200 HR в качестве сорбента. Завышение Vc было характерно и при гель-фильтрации образца ЭПО. Завышение Vc для ЭПО и ее комплекса с ЦП, по всей видимости, связано с взаимодействием катионной ЭПО с сорбентом, поскольку этого эффекта удавалось избежать при проведении гель-фильтрации с 0,5 М NaCl в качестве элюента. Однако в таких условиях комплекс ЦП с ЭПО диссоциировал и белки элюировались с колонки по отдельности. Такое влияние ионной силы на взаимодействие ЦП с ЭПО согласуется с данными об элюции ЭПО 0,45 М NaCl с ЦП-Сефарозы при аффинной хроматографии и свидетельствует об электростатической природе данного взаимодействия. Взаимодействие катионных белков НФ, МПО и представителей семейства серпроцидинов, с сорбентами, применяемыми для гель-фильтрации, наблюдалось при исследовании их комплексов с ЦП с помощью этого метода. Взаимодействие ЦП и ЭПО также подтверждалось данными диск-электрофореза в ПААГ без SDS. Электрофоретическая зона ЦП, окрашиваемая хромогенным субстратом o-DA, смещалась при добавлении ЭПО и окрашивалась на пероксидазную активность, в отличие от контрольного ЦП. Контрольная ЭПО в условиях диск-электрофореза практически не мигрировала в ПААГ.

4. Изучение взаимного влияния церулоплазмина и белков лейкоцитов на их ферментативные свойства.

Состояние проблемы на.момент исследования. Ранее нами было подробно изучено влияние ЛФ на активность ЦП [Соколов, 2007]. В частности, было показано наличие двух различных сайтов для ЛФ на молекуле ЦП: высокоаффинного (активация ферроксидазной активности ЦП за счет увеличения сродства к субстрату и скорости его окисления) и низкоаффинного (ингибирование окисления p-PD за счет конкуренции ЛФ с субстратом за связывание с ЦП). В случае связывания ЦП с МПО была выявлена исключительно активация p-PD-оксидазной активности ЦП, связанная с увеличением аффинности ЦП к субстрату в присутствии МПО [Соколов, 2007]. Следует также отметить, что при исследовании кинетики ингибирования пероксидазной активности МПО в присутствии ЦП, во-первых, была показана конкуренция ЦП с субстратами пероксидазного цикла МПО - в частности, с увеличением размера субстрата эффективность ЦП как ингибитора возрастала. Во-вторых, оказалось, что эффект ЦП как ингибитора строго регулируется его протеолитической деградацией. В частности, белок, протеолизованный по связи, соединяющей 5-й и 6-й домены, практически не ингибировал ни пероксидазную, ни хлорирующую активность МПО [Соколов, 2007]. Следует отметить, что при комплексообразовании ЦП с МПО происходило изменение положения полосы Соре (максимум спектра пероксидаз в области 400-500 нм), отражающей конформационное состояние связанного с пероксидазой гема. Этот факт нашел подтверждение при исследовании структуры комплекса ЦП-МПО, в котором вход в гемовый карман МПО контактирует с петлей ЦП, соединяющей 5-й и 6-й домены белка.

4.1. Влияние серпроцидинов и пероксидазы эозинофилов на ферментативные свойства церулоплазмина. Предварительные опыты по исследованию влияния серпроцидинов и ЭПО на активность ЦП в отношении различных субстратов (Fe2+, синтетические и биогенные амины)

показали, что они оказывают влияние только на окисление р-РБ. При этом серпроцидины ингибировали окисление р-РЭ как обратимые конкурентные ингибиторы, увеличивая Км и не изменяя Утах (таблица 3).

Таблица 3

Влияние серпроцидннов на кинетические свойства ЦП

Км, мМ Vmas, ДА53О/МИН Kj, нМ

ЦП 0,53 ± 0,01 0,33 ± 0,01 -

ЦП + NE 0,94 ±0,02 0,33 ±0,01 131 ±8

ЦП + PR3 0,83 ±0,01 0,34 ±0,01 182 ±9

ЦП + CG 1,34 ±0,02 0,32 ±0.01 67 ±5

ЦП + САР37 3,27 ±0,02 0,34 ±0,01 20 ±3

В присутствии ЭПО (1:1, моль/моль) ^-PD-активность ЦП возрастала, при этом увеличивалось сродство к субстрату, что было видно по уменьшению Км с 0,53 до 0,15 мМ, но практически не изменялась Vmax. Расчет константы активации по формуле Ка = [ЭПО]/(Км/Км' - 1), привел к значению 41 нМ. Наибольший эффект среди серпроцидннов проявлял САР37, значение Ki составило 20 нМ (таблица 3).

Учитывая, что катализируемая ЦП реакция окисления f-PD происходит при рН 5,0, ингибирующий эффект серпроцидннов на активность ЦП нельзя было объяснить его протеолитической деградацией. Во-первых, САР37, оказавший наибольшее влияние на активность ЦП, в принципе не обладает протеолитической активностью. Во-вторых, то, что серпроцидины не активны при таком значении рН, подтвердили контрольные опыты, не выявившие протеолитической деградации ЦП за время инкубации с серпроцидинами во время измерения скорости оксидазной реакции.

4.2. Изучение механизма ингибирования церулоплазмином миелопероксидазы, пероксидазы зозинофилое и 5-липоксигеназы.

Изучение механизма ингибирования ЦП активности МПО ранее ограничилось измерением кинетики пероксидазной активности МПО в присутствии ЦП и изучением влияния протеолитической деградации ЦП на его свойства как ингибитора [Соколов, 2007].

12 3 4

-ЭПО в 1,2

.эпо+цп

■ЦП 1

г (эпо, цп) 0.8

А 0.6

0,4

0.2 0

— ЭПО

... ЭПО+ЦЛпр

— ЦПпр

£ (ЭПО, ЦПпр)

400 420 440 Л, ИМ

Рис. 4. а) Электрофореграмма после электрофореза в ЗОБ-ПААГ. 1 - ЭПО (11 мкг), 2 - ЦП (10 мкг), 3 - ЦП+ЭПО+плазмин (10 мкг + 11 мкг + 0,02 мкг, после 1 часа инкубации), 4 - ЦП+плазмин

(10 мкг + 0,02 мкг, после 1 часа инкубации), стрелками указаны положения маркеров молекулярной массы, кДа. б) Спектры поглощения ЦП (1 мкМ), ЭПО (1 мкМ), смеси ЦП и ЭПО (1 мкМ+1 мкМ), арифметическая сумма спектров ЦП и ЭПО. в) Спектры поглощения ЦПпр (1 мкМ), ЭПО (1 мкМ), смеси ЦПпр и ЭПО (1 мкМ+1 мкМ), арифметическая сумма спектров ЦПпр и ЭПО.

В присутствии ЭПО не происходило расщепления связи между 5-ми 6-м доменами ЦП плазмином (рис. 4, а), тогда как в ее отсутствие ЦП в течение 1 часа практически полностью расщеплялся на фрагменты с М 116 и 19 кДа. Защитный эффект от ограниченного протеолиза ЦП сериновыми протеиназами в присутствии МПО ранее наблюдался при исследовании

взаимодействия ЦП и МПО [Соколов, 2007]. В спектре поглощения смеси интактного ЦП и ЭПО максимум поглощения гема смещался с 413 до 408 нм и отличался от суммы спектров отдельных белков (рис. 4, б), в то же время ЦПпр не вызывал смещения полосы Соре (рис. 4, в).

Для гем-содержащих пероксидаз - пероксидазы из корней хрена, лактопероксидазы и МПО -полоса Соре регистрируется при 403, 413 и 430 нм соответственно. Эти различия максимума поглощения обусловлены особенностями конформации гема в структуре пероксидаз. Так, гем имеет плоскую конформацию в пероксидазе из корней хрена, слегка выгнутую в лактопероксидазе, и наиболее выгнут в МПО [Furtmüller et al., 2006]. Ранее было показано, что ЦП не влияет на положение полосы Соре и на активность лактопероксидазы и пероксидазы из корней хрена [Соколов, 2007]. В то же время смещение полосы Соре МПО при взаимодействии с ЦП согласуется с ингибированием активности МПО в присутствии ЦП и с данными рентгеноструктурного анализа о взаимодействии уязвимой к протеолизу петли ЦП, соединяющей его 5-й и 6-й домены, с входом в гемовый карман МПО. Обнаруженные изменения спектра ЭПО в присутствии интактного ЦП были предпосылкой для исследования влияния ЦП на пероксидазную и (псевдо)галогенирующую активность ЭПО.

При исследовании влияния ЦП и ЦПпр на сродство ЭПО к субстратам пероксидазного цикла ABTS и Н2О2 было показано, что только интакгный ЦП снижает сродство ЭПО к ABTS, увеличивая Км и не изменяя Vmax (таблица 4). Напротив, ЦП не влияет на сродство ЭПО к пероксиду водорода, поскольку в его присутствии снижается Vmu, но не изменяется Км (таблица

4).

Таблица 4

Влияние ЦП и ЦПпр на пероксндазную активность ЭПО_

Субсграт/Ингибитор Км, мкМ Vmaxi 1/С I, нМ КьнМ

ABTS 281 ±2 3,32 ± 0,02 0 -

ABTS/ЦП 359 ±3 3,32 ±0,01 10 35,9 ±1,2

ABTS/ЦП 428 ±2 3,31 ±0,01 20 38,1 ± 1,1

ABTS/ЦПпр 281 ±2 3,32 ±0,01 10 -

ABTS/ЦПпр 284 ±2 3,32 ± 0,02 20 -

н2о2 30,5 ± 0,4 5,34 ±0,01 0 -

н2о2/цп 30,8 ± 0,3 4,26 ± 0,03 10 39,2 ± 1,6

н2о2/цп 30,6 ± 0,3 3,36 ±0,01 20 33,8 ± 1,8

Н202/ЦПпр 30,5 ± 0,4 5,33 ±0,01 10 -

Н202/ЦПпр 30,3 ± 0,2 5,32 ± 0,02 20 -

Таким образом, интактный ЦП является неконкурентным ингибитором в отношении пероксида водорода, но конкурирует с донором электронов (ABTS). Расчет Ki, отражающих сродство ингибитора и фермента (ЦП и ЭПО), по формулам: Ki = [ЦП]/(Ута,/Утах' - 1) и Ki = [ЦП]/(Км'/Км - 1) показал для двух использованных систем весьма близкие результаты: 34-39 нМ (таблица 4).

В отличие от интактного ЦП, ЦПпр не ингибировал пероксидазную активность ЭПО. Неэффективность ЦПпр как ингибитора активности МПО была показана нами ранее [Соколов, 2007]. Исследование конкуренции ЦП с субстратами ЭПО, различающимися по размеру, показало, что он наименее эффективен как ингибитор окисления малых субстратов (гваякола и орцинола), однако с увеличением размера субстрата эффективность конкуренции ЦП за активный центр ЭПО возрастает (рис. 5, а, 6). Зависимость эффективности ЦП как ингибитора пероксидазной активности от размера пероксидазного субстрата была показана нами ранее для МПО [Соколов, 2007]. Это наблюдение согласуется со стерическим барьером, создаваемым ЦП у входа в гемовый карман МПО. Вероятно, таким же образом ЦП препятствует контакту больших субстратов с гемовым карманом ЭПО.

Тем не менее, физиологическими субстратами МПО и ЭПО являются галогенид (СГ, Вг~) и псевдогалогенид (SCN-) ионы, поскольку значения Км МПО и ЭПО для них наиболее близки к их физиологическим концентрациям. Исследование влияния ЦП на (псевдо)галогенирующую активность ЭПО и МПО показало, что ЦП эффективно ингибирует хлорирующую активность ЭПО и МПО. Значительно хуже ЦП подавляет бромирующую активность МПО и практически не

влияет на таковую у ЭПО. тиоцианата (таблица 5).

Наконец, ЦП не влияет на активность ЭПО и МПО в отношении

Таблица 5

Влияние ЦП на (псевдо)галогенирующую активность МПО н ЭПО

Фсрмент/Субстрат/Ингибитор Км, мМ ^maxi I, мкМ К|, мкМ

ЭПО/NaCl 127 ± 3 5,1 ±0,2 0 -

ЭПОЛМаС1/ЦП 124 ±3 0,5 ±0,1 3 0,34 ± 0,02

МПО/NaCl 51 ±2 117 ± 1 0 -

МПО/ЫаС1/ЦП 50 ±2 16± 1 3 0,46 ± 0,02

ЭПО/NaBr 1,4 ±0,1 4,5 ±0,1 0 -

ЭПО/ЫаВг/ЦП 1,5± 0,1 4,5 ±0,1 3 -

МПО/NaBr 2,1± 0,1 19,8 ±0,2 0 -

МПОЛМаВг/ЦП 2,0± 0,1 11,4 ± 0,2 3 4,0 ± 0,05

ЭПО/NaSCN 0,094 ± 0,002 16,6 ±0,5 0 -

ЭПОЛМаЭСИ/ЦП 0,094 ± 0,002 16,6 ±0,5 3 -

МПО/NaSCN 0,072 ± 0,002 158 ± 4 0 -

MnO/NaSCN/ЦП 0,072 ± 0,002 167 ±4 3 -

Таким образом, несмотря на образование специфического комплекса с ЭПО и ингибирование ее пероксидазной активности непротеолизованным ЦП, его эффективность как ингибитора в отношении субстратов галогенирующего цикла МПО и ЭПО драматически снижается по мере увеличения сродства пероксидаз к данным субстратам. Из таблицы 5 видно, что ЦП не влияет на аффинность ЭПО и МПО к субстратам галогенирующего цикла, и если он проявляет ингибирующий эффект, то только за счет уменьшения Утах.

|СЯ, нМ 1000

--fc

д 4-хлор-1-нафтол

-708 СГ 0523 аЧ

-m-i

€

М, Да

Рис. 5. а) Относительная скорость окисления гваякола, орцинола, o-DA, 4-хлор-1-нафтола, ТМВ

и ABTS в зависимости от концентрации ЦП (логарифмическая шкала). Реакционная смесь содержала 50 мкМ Н202, 10 нМ ЭПО, 0-1 мкМ ЦП и 0,5 мМ субстрата в 50 мМ Ыа-фосфатном

буфере, pH 6,0. б) Зависимость IC50 (ЦП. нМ) от М(Да) пероксидазного субстрата ЭПО (логарифмические шкалы, по данным графика а). Значения ICso(hM) и структурные формулы субстратов указаны рядом с точками.

Хлорирующую активность МПО также оценивали методом хемилюминесценции после введения Н2О2 в среду инкубации комплексов ЦП-МПО, содержащую хлорид и люминол. Уже при мольном соотношении ЦП:МПО = 1:2 светосумма хемилюминесценции уменьшалась на 2530 % (рис. 6). Дальнейшее увеличение мольного соотношения ЦП/МПО сопровождалось еще более значительным снижением хемилюминесценции, свидетельствуя об угнетении хлорирующей активности МПО. Для сравнения на этом же рисунке приведены результаты эксперимента.

полученные с использованием ЦПпр (рис. 6, а, кривая 2): ЦПпр, не содержащий интактных молекул белка с М ~ 132 кДа, не тушил вспышку хемилюминесценции в ответ на добавление Н2О2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибирующий эффект ЦП не связан с прямым перехватом НОС1 (поскольку ЦПпр не менее эффективно взаимодействует с НОС1), а обусловлен изменением конформации активного центра МПО.

Белок/МПО, моль/моль Белок/МПО, моль/моль

Рис. 6. а) Зависимость светосуммы хемилюминесценции, выраженной в % по отношению к контролю, от мольного соотношения нативный ЦП/МПО (1) или ЦПпр/МПО (2). Концентрация МПО 0,2 нМ. о) Зависимость светосуммы хемилюминесценции, выраженной в % по отношению к контролю, от мольного соотношения ЦП/МПО (1), ЛФ/МПО (2) или ЦП/МПО (3) в присутствии постоянной концентрации ЛФ 0,34 нМ. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).

Было изучено: влияет ли на активность МПО свободный ЛФ в растворе, а также вошедший в состав комплекса МПО-ЦП-ЛФ. Результаты экспериментов приведены на рис. 6, б. ЛФ сам по себе не оказывал достоверного влияния на активность МПО. Будучи встроенным в тройной комплекс МПО-ЦП-ЛФ, ЛФ не препятствовал ингибирующему эффекту ЦП в отношении МПО (рис. 6, б). Используя метод хемилюминесценции, нам удалось подтвердить тот факт, что ЦП, образуя комплексы с МПО, ингибирует ее хлорирующую активность, а ЛФ не изменяет активность МПО и не оказывает влияния на ингибирующий эффект ЦП в отношении МПО в составе тройного комплекса МПО-ЦП-ЛФ.

Результаты определения антимикробной активности апо-ЛФ. систем «МПО-Н2О2-хлорид/тиоцианат», их совместного эффекта, а также влияния ЦП суммированы в таблице 6. Видно, что в случае использования хлорида в качестве субстрата МПО, ЦП препятствовал ее антимикробному эффекту, а также препятствовал синергизму такой системы с апо-ЛФ. Эти результаты хорошо согласуются с данными об ннгибировании хлорирующей активности МПО при комплексообразовании белков по данным люминол-зависимой хемилюминесценции. С другой стороны, ЦП не оказывал влияния на систему «МПО-НгОг-тиоциаиат» и не препятствовал синергизму МПО и апо-ЛФ в присутствии тиоцианата в качестве субстрата (псевдо)галогенирующего цикла МПО. Этот результат находится в полном соответствии с неспособностью ЦП ингибироватъ МПО-зависимую продукцию гипотиоцианата. Таким образом, синергизм антимикробной системы «лактоферрин-МПО-пероксид водорода-тиоцианат» не подавляется в присутствии ЦП (таблица 6).

Учитывая, что гипотиоцианат является наименее токсичным из продуктов, образующихся в цикле гапогенирования МПО, нами были проведены исследования по защите ЦП от МПО-зависимой системы генерации НОС1 и/или НОВг в присутствии БСЫ". Действительно, тиоцианат защищал ЦП от повреждения гипогалоидными кислотами (НОС1 и НОВг), образующимися при функционировании галогенирующего цикла МПО (рис. 7).

Таблица 6

Эффект ЦП на антимикробную активность ЛФ и системы «МПО-НгОг-хлорид/тиоцианат» в

отношении Е. coli

Система М1С50*, нМ

ЦП -

Апо-ЛФ 980 ± 40

Апо-ЛФ:ЦП 990 ±30

МП0(Н202-ЫаС1) 45 ± 12

2ЦП:1МП0(Н202-ЫаС1)

2апо-ЛФ: 1 МП0(Н202-ЫаС1) 4± 1

2ЦП:2апо-ЛФ:1МПО(Н,02-№С1) 860 ± 30

МП0(Н202-На8С]М) 38 ± 11

2ЦП: 1 МП0(Н202^а5СЫ) 42 ±9

2апо-ЛФ: 1 МП0(Н202-Ыа8С1\|) 7 ± 2

2ЦП:2апо-ЛФ: 1 MП0(H202-NaSCN) 8 ± 2

* - выражена как концентрация белка, находившегося в системе в меньшей концентрации по сравнению с другими компонентами, приводившая к снижению показателя Л5зо-Лбзо в 2 раза по сравнению с контролем. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).

ЦП мпо

ГО+D-Glc NaCI NaBr NaSCN

+ + +

+ + + + +

+ + + + + + +

иии

Рис. 7. Защитный эффект тиоцианата при действии на ЦП системы МП0/Н202/хл0рид и/или бромид. Реакционная смесь содержала 1 мкМ ЦП, 10 нМ глюкозоксидазы (ГО), 100 мкМ О-глюкозы (0-С1с) и различные комбинации 3 нМ МПО, 100 мМ №С1, 1 мМ 1МаВг, 200 мкМ Ыа8СЫ в 0,1 М №-цитрат-фосфатном буфере, рН 6,8. После инкубации в течение 1 часа при 37 °С в пробы добавляли 0,2 мМ таурина и 10 нМ каталазы. На дорожку наносили по 20 мкл из пробы, подвергали диск-электрофорезу в ПААГ и окрашивали о-ЭА.

Влияние ЦП на активность 5-1Х) было изучено с помощью количественного определения продуктов оксигенирования арахидоновой кислоты. Действие ЦП на активность 5-ЬО с достоверностью проявляется после 30 минут инкубации клеток с белком перед добавлением стимула - 02. Влияние ЦП носит дозозависимый характер (рис. 8) и, вероятно, связано не только с непосредственным взаимодействием ЦП с 5-1Х), но и с влиянием ЦП на эндогенные регуляторы активности 5-1.0. Протеолизованный ЦП (р < 0,001) и его апо-форма (р < 0,001) не ингибировали активность 5-ЬО.

а>

150

3 Ю0

о. с

+ЧСА

1 т

ЦПпр апо-ЦП

0 20 50 О

100

5 10 20 50 ЦП, мкг/мл

Рис. 8. Влияние ЦП на образование 5-липоксигеназных метаболитов в НФ человека. НФ инкубировали 30 минут с различными концентрациями ЦП в безбелковой среде (светлые столбики) или в среде с добавлением 0,3 мг/мл сывороточного альбумина человека (ЧСА, серые и черные столбики), затем добавляли 2 мг/мл OZ на 20 минут. Количество продуктов определяли методом обращенно-фазовой жидкостной высокоэффективной хроматографии. Апо-ЦП - апо-1 ЦП, черные столбики - протеолизованный ЦП (ЦПпр). Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).

5. Влияние апо-лактоферрина на деструкцию церулоплазмина индуцированную пероксндом водорода.

При добавлении ЦП к Н2О2 в присутствии спиновой ловушки 4-ПОБН нами был зарегистрирован спектр ЭПР (рис. 9, /), представляющий собой низкоинтенсивный, но вполне различимый характерный для аддуктов данной ловушки триплет дублетов с константами сверхтонкого расщепления арН = 0,169 мТл и аы = 1,537 мТл, которые в точности совпадают с соответствующими константами аддукта 4-ПОБН/"ОН [Панасенко и соавт., 2002]. Данный факт позволяет предположить, что в системе Н2Ог + ЦП образуется радикал "ОН. Для проверки этого предположения был проведен опыт по регистрации спинового аддукта в системе Фентона, в которой, как известно, образуется *ОН. Для этого к Н2О2 в присутствии 4-ПОБН добавляли раствор РеСЬ. Зарегистрированный спектр ЭПР приведен на рис. 9, 3. Его спектральные параметры полностью соответствуют описанным ранее параметрам аддукта 4-ПОБН/*ОН [Панасенко и соавт., 2002], а также совпадают с параметрами аддукта, зарегистрированного в системе 4-ПОБН + Н2Ог + ЦП (см. таблицу 7).

Таблица 7

Спектральные параметры спиновых аддуктов радикалов, образующихся в системе Фентона

и системе «ЦП + Н;02» в отсутствие и в присутствии ДМСО и этанола

Изучаемая система Образующийся радикал Параметры спиновых аддуктов

авн, мТл а"1, мТл

4-ПОНБ + Н202 + РеС12 •он 0,173 1.547

4-ПОНБ + Н202 + ЦП •ОН 0,169 1,537

4-ПОНБ + ДМСО + Н202 + ИеСЬ •СНз 0,285 1,660

4-ПОНБ + ДМСО + Н202 + ЦП *СНз 0,285 1,662

Время жизни радикала "ОН очень мало и не превышает 10"9 секунды [Ргуог, 1986], а его спиновый аддукт 4-ПОБН/"ОН крайне нестабилен [Gunther et а!., 1995]. Об этом свидетельствуют слабая интенсивность сигнала на рис. 9, 3 и падение интенсивности сигнала во время его регистрации.

ЦП+Н202+4-П0БН+ДМС0

4 ~w—---w—■—-—

апо-ЦП+Н2Ог+4-ПОБН+ДМСО

5 ----,--

FeCI2+H202+4-n0BH+flMC0

•MHV

1 мТ 1мТ >

Рис. 9. ЭПР сигналы спиновых аддуктов, образующихся в результате 2 мин. инкубации при комнатной температуре в системах: (У) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н2О2 + 5,68 мкМ ЦП в 50 мМ

фосфатном буфере, рН 7,4; (2) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н202 + 3,02 мкМ апо-ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; (3) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мМ Н202 + 10 мМ РеС12 в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4; (4) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н202 + 5,68 мкМ ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5 % ДМСО; (5) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мкМ Н202 + 3,02 мкМ апо-ЦП в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5 % ДМСО; (6) 120 мМ 4-ПОБН + 10 мМ Н202 + 10 мМ РеСЬ в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 в присутствии 5 % ДМСО.

Видно, что в присутствии ДМСО в системе «4-ПОБН + Н202 + ЦП» регистрируется сигнал с параметрами арН = 0,285 мТл и ан = 1,662 мТл, которые практически совпадают с параметрами сигнала, зарегистрированного в системе Фентона в присутствии ДМСО (арН = 0,285 мТл и а = 1,660 мТл). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что ЦП в присутствии Н2О2 генерирует радикал "ОН. Происходит это с участием ионов меди, поскольку, как видно из рис. 9 (2 и 5), апо-ЦП, не содержащий медь, не способен восстанавливать Н202 до радикала "ОН.

Рис. 10, а демонстрирует данные электрофореза в денатурирующих условиях. Видно, что после пятичасовой совместной инкубации ЦП, ЛФ и Н2Ог сохранялись зоны, соответствующие как ЛФ, так и ЦП (дорожка 3), тогда как ЦП, инкубированный с Н2О2 без ЛФ, был полностью разрушен (дорожка 2). Сходное с ЛФ защитное действие оказывал ЧСА, который, как известно, содержит высокоаффинный сайт связывания иона меди. Сами по себе ЛФ и ЧСА в концентрации 3 мкМ не разрушались в присутствии 10 мМ Н202 (рис. 10, б, дорожки 4 и 6), однако при добавлении в реакционную смесь 50 мкМ Си804 происходила деградация ЛФ и ЧСА, о чем говорят данные электрофореза (рис. 10, 6, дорожки 5 и 7), где полностью исчезала окраска белковых зон.

ЦП+Н202+4-П0БН

апо-ЦП+Н202+4-ГЮБН

FeCI2+H202+4-n0BH

ЦП + + +

НА- - -

ЛФ - - +

JL L3.

LJ w

132

67 ►

119

+ CyS04

. . + + ЧСА + + + + HO — - - ЛФ 2

4У5 ШМ

Wk г

?4§

Рис. 10. Электрофореграмма после электрофореза в БОБ-ПААГ (окраска Кумасси Я-250). а) 1 - интактный ЦП; 2 - ЦП, инкубированный с 10 мМ Н7О2 при рН 7,4; 3 - 2 в присутствии апо-ЛФ; б) 4,6 - ЛФ, ЧСА, инкубированные с 10 мМ Н2О2 при рН 7,4; 5,7 - 4,6 в присутствии 50 мкМ СиЭС^, соответственно. Стрелками указаны значения М, кДа.

6. Изучение протеолитической деградации церулоплазмина in vivo и in vitro.

Состояние проблемы на момент исследования. ЦП человека чрезвычайно легко деградирует под действием протеиназ [Ryden, 1971]. Эта особенность и тот факт, что белковая цепь ЦП включает в себя три гомологичные части, явились причиной того, что более 30 лет с момента открытия ЦП в литературе дебатировался вопрос о том, состоит ли молекула ЦП из одной полипептидной цепи или из гомологичных субъединиц [Poulik, 1968; Simons and Beam, 1969; Ryden, 1972; McCombs and Bowman, 1976; Takahashi et al., 1984]. При хранении препаратов ЦП, выделенных различными способами без добавления ингибиторов протеиназ, целостная белковая цепь распадалась на характерные протеолитические фрагменты (рис. 11): 116 кДа и 19 кДа (гидролиз связи K887-V888 между 5-м и 6-м доменами белка), фрагменты 72 кДа или 67 кДа и 52 кДа (гидролиз связи R481-S482 между 3-м и 4-м доменами) [Ryden, 1971; Kingston et al., 1977; Kingston et al., 1979; Moshkov et al., 1979; Prozorovski et al., 1982]. Выделение недеградированного и стабильного ЦП до сих пор остается весьма трудной задачей [Соколов и соавт., 2005]. Многие авторы сообщали о присутствии в препаратах ЦП примеси протромбина [Bianchini et al., 1999], неидентифицированной металлопротеиназы [Ehrenwald and Fox, 1994], а также рекомендовали использование ингибиторов протеиназ на всех стадиях выделения ЦП [Moshkov et al., 1979]. При выделении ЦП в его препаратах нами были идентифицированы примеси комплексов ЦП с матриксными металлопротеиназами 2 и 12; кроме того, ЦП взаимодействует с представителями семейства серпроцидинов: эластазой, катепсином G и протеиназой 3. Целостность молекулы ЦП имеет большое значение для функций этого фермента. Такие его антиоксидантные свойства, как глутатион-зависимая пероксидазная активность [Kim and Park, 1998], эффективная загрузка железа в ферритин [Van Eden and Aust, 2000], ингибирование хлорирующей и пероксидазной активности миелопероксидазы [Соколов, 2007], утрачиваются после протеолитической деградации связи, соединяющей 5-й и 6-й домены белка. Протеолиз ЦП in vitro с применением целого ряда протеиназ, например плазмина, эластазы, трипсина, катепсина G и др., не приводил к появлению протеолитических фрагментов, характерных для «спонтанного» протеолиза ЦП при хранении [Соколов, 2007].

132 kDa R481 S482 К887 V888

|1 ® ]2 Ф |з 4 (D |5 6 ФФФ ]

116 kDa R481 S482

® ! Ф | CD i

18 kDa

ФФПР]

67 к Da

52 к Da

19 к Da

qxMPl

67 к Da

72 kDa

1 Ф<П)<Ш)]

Рис. 11. Схема протеолитического расщепления полипептидной цепи ЦП человека на фрагменты при «спонтанном протеолизе» [Опе1 е/ а!., 1984].

Пептидные связи, уязвимые для таких протеиназ, как трипсин, плазмин, эластаза, встречаются в полипептидной цепи ЦП достаточно часто, что приводит к образованию большего числа фрагментов, отличающихся по молекулярному весу от фрагментов «спонтанного» протеолиза [Kingston et al., 1977; Kingston et al., 1979; Sang, 1995]. Следует отметить, что одним из ферментов, претендующих на роль протеиназы, приводящей к деградации ЦП при хранении, является тромбин (Fila). Во-первых, Fila является «редкощепящей» протеиназой и мог бы привести к образованию небольшого числа фрагментов, наблюдаемых при «спонтанном» протеолизе ЦП. Во-вторых, протромбин сопутствует ЦП при выделении на большинстве применяемых для очистки ЦП ионообменных смол (DEAE- и QAE-Сефадекс) и аффинных сорбентах (АЕ-агароза, протамин-Сефароза) [Musci et al., 1996; Соколов и соавт., 2005]. В-третьих, ЦП гомологичен FV и FVIII (относящихся к суперсемейству купредоксинов, как и ЦП), являющихся физиологическими субстратами FHa [Church et al., 1984]. До сих пор в литературе не было показано картины ограниченного протеолиза ЦП под действием Fila, а также не было предпринято попыток предотвратить протеолитическую деградацию ЦП ингибиторами Fila. Ранее было показано, что добавление гепарина к свежевыделенному ЦП полностью предотвращало протеолитическую деградацию при хранении белка в течение месяца при 37 °С, что косвенно указывало на участие факторов свертывания крови в протеолизе ЦП [Соколов и соавт., 2005]. Первым примером обнаружения протеолизованного ЦП в биологических жидкостях было исследование образцов плазмы крови больных гемофилией А и В с помощью Вестерн-блоттинга. Оказалось, что у таких больных наряду с повышением общей протеолитической активности плазмы выявляются фрагменты ЦП, которые не удается обнаружить при анализе образцов плазмы здоровых доноров. Следует отметить, что у таких больных также отмечается снижение антиоксидантного статуса плазмы крови, в частности снижение SOD-активности плазмы крови [Алексанян, 2007].

6.1. Протеолитическая деградация церулоплазмина в биологических жидкостях при воспалении.

При анализе образцов синовиальной жидкости 24 больных ревматоидным артритом в 11 из них при Вестерн-блоттинге выявлялся ЦП в виде недеградированного 132-кДа белка (рис. 12, а, дорожка 8), а в 13 образцах выявлялись его протеолитические фрагменты (рис. 12, а, дорожки 1-7, 9-12). В качестве положительного контроля использовали препарат недеградированного ЦП (рис. 12, а, дорожка к). В 11 образцах с недеградированным 132-кДа ЦП в синовиальной жидкости практически не выявлялась активность Fila и МПО. Напротив, в 13 образцах, содержавших деградированный ЦП, активность Fila была в среднем в 17 раз выше, и активность МПО — в 33 раза выше, чем в образцах с недеградированным ЦП (рис. 12, б). Эти данные согласуются с нашим выводом о том, что протеолитическая деградация ЦП приводит к отсутствию у него способности

ингибировать МПО [Соколов. 2007]. Учитывая, что набор протеолитических фрагментов в образцах синовиальной жидкости напоминал картину спонтанного протеолиза ЦП, и там же выявлялся активный Fila, проведено исследование динамики ограниченного протеолиза ЦП под действием синовиальной жидкости и Fila.

1234 56 к 7 89 10 11 12

12 ♦

11 ♦

♦ ЦП без 132 «Да

а ЦП с 132 кДа со о

0 &

0 0,5 1 1,5 2 2,5 Fila, NIH/мл

Рис. 12. а) Выявление ЦП при Вестерн-блоттинге синовиальной жидкости (5 мкл). Вестерн-блоттинг с аффинными антителами кролика против ЦП (разведение 1:10000, разведение пероксидазного конъюгата антител козла против антител кролика 1:5000): 8 - образцы, содержавшие нефрагментированный 132-кДа ЦП, 1-7, 9-12 - образцы, не содержавшие 132-кДа ЦП, к - образец нефрагментированного ЦП. Стрелками указаны значения М, кДа, горизонтальная линия на уровне 125 кДа. б) Активность МПО и Fila в образцах синовиальной жидкости (цифры соответствуют дорожкам на панели а).

С целью первичной идентификации протеиназы, вызывающей протеолитическую деградацию ЦП в синовиальной жидкости, был изучен протеолиз очищенного ЦП с добавкой синовиальной жидкости в зависимости от времени инкубации и присутствия специфического ингибитора Fila, гирудина (рис. 13, а, б). Добавление образца синовиальной жидкости, содержащей только 50 кДа-фрагмент ЦП (по данным Вестерн-блоттинга), к недеградированному ЦП привело к накоплению 50 кДа-фрагмента во времени (рис. 13, а). Добавление ингибитора Fila - гирудина - практически полностью защитило ЦП от протеолитической деградации, вызванной протеиназой, присутствующей в синовиальной жидкости (рис. 13, б). Анализ синовиальной жидкости с помощью диск-электрофореза без SDS (рис. 13, в) показал наличие в синовиальной жидкости апо-формы ЦП. Ультрафильтрация синовиальной жидкости с помощью специальных ячеек, удерживающих молекулы с М выше 3 кДа, и последующий атомно-адсорбционный анализ показали, что в синовиальной жидкости около 1/3 меди не связано с высокомолекулярной фракцией.

с; 2

О С

о; то i со

S fe

2,5 2 1,5 1

0,5

♦ 5 ? ♦

- ♦

1 2 3 4 5 6 7 8

6 в 1 2 3 4 5 1 2 3

Рис. 13. Анализ деградации ЦП в синовиальной жидкости по результатам электрофореза в SDS-ПААГ (а, 6) и ЭФ в ПААГ без SDS (в). Вестерн-блоттинг с аффинными антителами кролика против ЦП (разведение 1:10000, разведение пероксидазного конъюгата антител козла против антител кролика 1:5000). а) 1 - недеградированный ЦП (20 мкг), 2-8 - ЦП (20 мкг) после инкубации с 0,5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 12, а) после инкубации при 37°С в течение 15, 30,45, 60, 90, 120 и 240 минут, б) 1 - недеградированный ЦП (20 мкг), 2, 3 -ЦП (20 мкг) после инкубации с 0,5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 12, а)

после инкубации при 37°С в течение 1 и 12 часов, 4 - ЦП (20 мкг) и гирудин (2 мкг) после инкубации с 0,5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 12, а) после инкубации при 37°С в течение 12 часов, 5-20 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 12, а), в) 1 - апо-ЦП (1 мкг), 2 - ЦП (1 мкг), 3-5 мкл синовиальной жидкости (образец на дорожке 12, рис. 12, а). Стрелками указаны значения М, кДа.

6.2. Идентификация протеиназ, деградирующих препараты церулоплазмина. Хранение препаратов ЦП, выделенных без ингибиторов протеолиза, приводило к протеолитической деградации 132-кДа полипептида с образованием элекгрофоретических зон с М ~ 116, 72, 67, 52 и 19 кДа, описанным ранее как фрагменты спонтанного протеолиза [Kingston et al., 1977, Prozorovski et al., 1982]. Ограниченный протеолиз ЦП с помощью Fila приводил к образованию фрагментов с такими же молекулярными массами (рис. 14). Фрагменты, образовавшиеся при хранении препаратов ЦП, и фрагменты, полученные при ограниченном протеолизе Fila, были подвергнуты масс-спектрометрическому анализу. Ни в одном из сравниваемых фрагментов не было найдено отличий по масс-спектру пептидов, которые бы свидетельствовали о различной локализации фрагментов, образуемых при гидролизе Fila, и фрагментов «спонтанного» протеолиза, описанных в литературе (рис. 11).

По данным литературы и наших собственных исследований, 19-кДа фрагмент ЦП при «спонтанном» протеолизе образуется при гидролизе связи K887-V888, соединяющей 5-й и 6-й домены ЦП. Это заставило нас предполагать, что Fila гидролизует полипептидную цепь ЦП, расщепляя связь за остатком К. Действительно, определение N-концевой аминокислотной последовательности 19-кДа фрагмента ЦП, образующегося при гидролизе Fila (выделена прямоугольной рамкой на рис. 14), однозначно показало последовательность VFNPRRKLEF, идентичную последовательности этого фрагмента, образующегося при «спонтанном» протеолизе ЦП [Kingston el al., 1977]. Таким образом, было показано, что Fila гидролизует последовательность ЦП 884-891: связь K887-V888.

Таблица 8

Сравнение первичной последовательности гирудинов, ЦП, FV и FVIII

Белок Сайт Последовательность Гомология, %

Гирудин 1 55-63 DGDFEEIPE

Гирудин 2 62-70 NGDFEEIPE

Церулоплазмин 247-255 DKDNEDFQE 67

608-616 DKEDEDFQE 56

946-954 NKDDEEFIE 67

Фактор V 689-677 DEDSYEIFE 56

961-969 IQDTDEDTA 44

1535-1543 EDDYAEIDY 67

Фактор VIII 358-366 NEEAEDYDD 77

738-746 YEDSYEDIS 56

132 116

72 67

Рис. 14. Разделение фрагментов ЦП, полученных при ограниченном гидролизе Fila, и фрагментов «спонтанного» протеолиза, образовавшихся при хранении препаратов ЦП. 1 — исходный препарат

ЦП (50 мкг), 2-8 - протеолиз ЦП (ЦП:РИа= 100:1, w/w) в течение 5, 10, 15,30,45, 60 и 120 минут, 9 - маркеры молекулярной массы, 10-12 - препарат ЦП после спонтанного протеолиза (5, 10, 20 мкг), выделенный на протамин-Сефарозе, 13, 14 - препарат ЦП после спонтанного протеолиза (10, 20 мкг) выделенный на АЕ-агарозе.

Известно, что факторы свертывания крови V и VIII содержат гомологичные ЦП купредоксиновые домены. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ЦП, FV,

FVIII и гирудина показал, что ЦП также содержит последовательности, гомологичные последовательности гирудина (таблица 8).

Следует отметить, что в ЦП сайт расщепления 887-888 расположен раньше сайта 946-954, гомологичного последовательности гирудина, взаимодействующей с экзосайтом I в Fila. С осторожностью можно предположить, что сродство ЦП к Fila, связанное с наличием гомологичной гирудину последовательности, приводит к расщеплению вышележащего неканонического сайта, который, в отличие от N-концевого кора гирудина, не ингибирует Fila. Рекомбинантные ингибиторы Fila, гирудин 2 (НМ2) и его модифицированный фрагмент (1-47, S2R), не только полностью блокировали деградацию препарата ЦП в присутствии Fila, но и препятствовали деградации ЦП в сыворотке крови при ее хранении в стерильных условиях.

9 12345678

О 20 40 60 80 100 120

время протеолиза, мин

Рис. 15. Влияние ограниченного протеолиза под действием Fila на ферроксидазную активность ЦП и его способность ингибировать пероксидазную активность МПО. а) Электрофореграмма после SDS-ЭФ в ПААГ препарата ЦП, гидролизованного Fila. 1 -недеградированный препарат ЦП (50 мкг), 2-8 - препарат после ограниченного протеолиза Fila (ЦП:Р11а = 50:1, w/w) в течение 5, 10, 15,30, 45, 60 и 120 минуг. б) Зависимость ферроксидазной активности ЦП (200 мкМ Fe2+, 120 нМ ЦП, 50 мМ Na-ацетатный буфер, pH 5,5) и активности МПО в отношении ABTS в присутствии ЦП (20 нМ МПО, 120 нМ ЦП. 100 мкМ Н202, 1 мМ ABTS, 100 мМ Na-ацетатный буфер, pH 5,5, за 100 % принимали активность МПО без добавления ЦП) от времени ограниченного протеолиза, опосредованного Fila. Данные представлены как среднее и доверительный интервал

(а = 0,05).

До сих пор ни один из традиционных ингибиторов протеиназ (ЭДТА, 6-аминокапроновая кислота), кроме гепарина, не ингибировал «спонтанный» протеолиз свежевыделенного ЦП. Тот факт, что ЦП содержит последовательности, гомологичные ингибитору Fila гирудину, а также, выделенный с помощью различных методов, содержит примеси Fila, позволил предположить возможность комплексообразования между Fila и ЦП. Действительно, в условиях гель-фильтрации ЦП и Fila элюировались совместно. Молекулярная масса комплекса по данным калибровки соответствовала 171 ± 6 кДа, что говорит о стехиометрии ЦП:П1а =1:1.

Поскольку гирудиноподобные участки ЦП, указанные в таблице 8, по данным рентгеноструктурного анализа расположены на вершине пирамидальной молекулы ЦП, рядом с сайтом взаимодействия с Fe2+, обеспечивающим взаимодействие ЦП с субстратом ферроксидазной реакции, исследовано влияние Fila на ферроксидазную активность ЦП. Для того чтобы исключить влияние протеолитической деградации ЦП под действием Fila, был использован Fila, инактивированный суицидным ингибитором PMSF. Действительно, FIIa-PMSF ингибировал ферроксидазную активность ЦП, увеличивая Км для Fe2+ с 57 до 138 мкМ, но не влиял на Vmax. Конкурентный характер ингибирования ферроксидазной активности ЦП в присутствии Fila находится в соответствии с первоначальной гипотезой о том, что связывание с Fila может повлиять на связывание Fe2+ с ЦП. Значение K¡ 220 ± 20 нМ свидетельствует о высоком сродстве между Fila и ЦП.

В процессе ограниченного протеолиза ЦП под действием Fila наблюдалось накопление ЦПпр по данным SDS-ЭФ в ПААГ (рис. 15, а). В определенные промежутки времени к ЦП был добавлен PMSF, а затем измерена его ферроксидазная активность и способность ингибировать пероксидазную активность МПО в отношении ABTS (рис. 15, б). По мере накопления ЦПпр ферроксидазная активность практически не изменилась (количество Fila в смеси с ЦП было недостаточно для значительного ингибирования ферроксидазной активности), в то же время практически исчезла способность ЦП ингибировать пероксидазную активность МПО в отношении ABTS. Это находится в полном соответствии с нашими данными о неэффективности ЦПпр как ингибитора активности МПО.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия Fila в протеолитической деградации ЦП в биологических жидкостях (сыворотка крови, синовиальная жидкость пациентов с ревматоидным артритом) и его препаратах. Ингибирование протеолитической деградации ЦП гирудином, специфическим ингибитором Fila, является наиболее веским доводом в пользу основного вклада Fila в деградацию ЦП. Гомология ЦП с факторами свертывания крови V и VIII является структурно-функциональной предпосылкой для взаимодействия ЦП и Fila. Последний влияет на связывание ионов Fe2+ с ЦП, а также снижает способность ЦП ингибировать активность МПО. Этот вывод подкрепляется обнаружением в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом одновременно активного Fila, протеолизованного ЦП и активной МПО.

7. Проатерогенное действие миелопероксидазы при связывании с липопротеинами.

Моноциты, выделенные из периферической крови, инкубировали с ЛНП, модифицированными в различных условиях, и измеряли накопление эфиров холестерина в клетках (рис. 16). Для оценки влияния взаимодействия МПО с ЛНП на накопление внутриклеточного холестерина использовали параллельные пробы, содержащие пептид Р445-456 (EQIQDDCTGDED), разобщающий взаимодействие МПО с ЛНП. Немодифицированные ЛНП сами по себе, а также в присутствии МПО, ЦП или ЦПпр не вызвали накопления эфиров холестерина. В то же время ЛНП, модифицированные НОС1 либо НОВг, приводили к достоверному накоплению эфиров холестерина. Однако ЛНП, модифицированные системами МПО/Н2О2/СГ или МПО/Н202/Вг~, вызывали соответственно в 4 и 7 раз большее накопление эфиров холестерина клетками. Разобщение взаимодействия МПО с ЛНП (модификация в присутствии Р445-456) снимало эффект накопления эфиров холестерина клетками, так что, по сравнению с ЛНП, модифицированными НОС1 и НОВг, ЛНП, модифицированные функционирующей МПО с разобщением взаимодействия, вызывали увеличение накопления эфиров холестерина лишь в 2 и 1,5 раза соответственно. Тиоцианат (SCN~) является субстратом галогенирующего цикла МПО. Фермент катализирует его превращение в относительно слабый окислитель HOSCN [van Dalen et al, 1997]. Видно, что ЛНП, модифицированные в присутствии системы Mn0/H202/SCN~, не приводили к накоплению клетками эфиров холестерина. Конкурируя с С17ВГ, SCN" способен изменять

галогенирующую активность МПО, снижая или предотвращая выход НОС1/НОВг. Действительно, ЛНП, модифицированные системами МП0/Н202/СГ(Вг") в присутствии 5С>Г, не вызывали накопления эфиров холестерина моноцитами/макрофагами. Пептид Р445^56, разобщающий взаимодействие МПО и ЛНП, практически не влиял на антиатерогенные эффекты ЗСЫ".

Рис. 16. Влияние Р445-456 (80 нМ) на накопление эфиров холестерина моноцитами/макрофагами, инкубированными 12 и 72 часа с нативными или модифицированными ЛНП (40 нМ). ЛНП предварительно модифицировали, инкубируя их в течение 30 мин в присутствии НОС1, НОВг, МП0/Н202/СГ, МП0/Н202/ВГ или МП0/Н202/5СИ", добавляя в ряд проб ингибиторы или модуляторы активности МПО: АВАН (5 мкМ), ЦП (6 мкМ), ЦПпр (6 мкМ), ЭОГ (200 мкМ). Контроль - инкубация клеток без ЛНП. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).

Синтетический ингибитор активности МПО, АВАН, действовал аналогично ЗСК", а именно: ЛНП, обработанные системами МП0/Н202/СГ(Вг") в присутствии АВАН, не вызывали накопления эфиров холестерина клетками. Добавление ЦП в концентрации 6 мкМ к ЛНП при модификации системой МП0/Н202/СГ снижало накопление внутриклеточных эфиров холестерина на 62 %, но не снижало уровня накопления эфиров холестерина, если ЛНП были модифицированы бромид-содержащей системой (МП0/Н202/Вг~). Добавление ЦПпр не повлияло на проатерогенные свойства МПО, свидетельствуя в пользу того, что снижение накопления эфиров холестерина в присутствии ЦП обусловлено ингибированием активности МПО.

8. Антиоксидантные свойства ЦП, модифицированного окислителями. Было показано, что ЦП является неэффективным ингибитором активности МПО и ЭПО в отношении бромида и тиоцианата, хотя последний показал себя как эффективный протектор ЦП (рис. 7). Поскольку нельзя однозначно исключить возможность реакции ЦП с окислителями, образующимися в очаге воспаления в ходе функционирования МПО, а именно: НОС1, НОВг и НОЗСМ, было решено исследовать влияние этих окислителей на антиоксидантные свойства ЦП.

При взаимодействии ЦП с НОС1, НОВг и НОБСЫ происходило постепенное снижение поглощения при 610 нм, характерного для ионов меди I типа (рис. 17).

X, нм л, нм нм

Рис. 17. Спектры поглощения ЦП (50 мкМ) после добавления НОС1, НОВг и HOSCN (0-600 мкМ). Длина оптического пути 1 см.

Активность ЦП в отношении Fe2+ и p-PD снизилась по мере увеличения избытка НОС1 и НОВг, но не HOSCN, однако, SOD активность модифицированного ЦП даже несколько выросла по сравнению с немодифицированным белком (рис. 18).

В целом изменение оксидазных свойств ЦП можно объяснить тем, что предпочтительной мишенью для использованных окислителей являются остатки цистеина и метионина. Именно они участвуют в координации ионов меди 1 типа, необходимых для окисления Fe2+ и р-PD. Часть дисульфидных связей ЦП была окислена, что вызывало изменение его электрофоретической подвижности (рис. 7). В то же время для проявления SOD активности ЦП достаточно лишь части его каталитического центра, а именно ионов меди II и III типа, лигандами для которых являются остатки гистидина. Не исключено, что увеличение SOD активности окисленного ЦП вызвано тем, что свойства ионов меди I типа после окисления остатков цистеина и метионина становятся близки к ионам меди II и III типа. Ингибирование пероксидазной активности МПО модифицированными формами ЦП показало, что обработка НОС1 и HOSCN не влияет на ингибирующую активность ЦП, тогда как модификация НОВг снижает этот вид антиоксидантной активности ЦП (таблица 9).

883 892

Учитывая, что способность пептида ЦП ( RPYLKVFNPR ) ингибировать пероксидазную активность МПО снижалась при обработке НОВг и НОС1, но не HOSCN, можно предположить, что бромирование и хлорирование затрагивает значимый для взаимодействия с активным центром МПО аминокислотный остаток. На роль такого остатка претендует Y885

Таблица 9

Значения IC50 (нМ) для ингибирования пероксидазной активности МПО в отношении ABTS пептидом ЦП (883-892) и ЦП, в том числе после модификации пептида 4-молярным и ЦП 20-

молярным избытком НОС1, НОВг либо HOSCN

Ингибитор МПО Без модификации НОС1 НОВг HOSCN

ЦП 38 ±6 650 ± 40 840 ± 60 49 ± 13

Пептид ЦП (883-892) 158 ± 14 920 ± 60 1260 ±80 186 ± 18

При оценке продукции активных форм кислорода (АФК) - супероксидного анион-радикала и пероксида водорода - активированными НФ оказалось, что вне зависимости от типа окислителя ЦП сохраняет способность ингибировать респираторный взрыв НФ (таблица 10).

£ 1,2

250

500 750 НОХ. мкМ

1000

1250

500

1000 1500 НОХ, мкМ

2000

2500

НОС1 -о-НОВг ^НОвСИ

1000 1200

НОХ, мкМ

Рис. 18. Влияние модификации ЦП (50 мкМ) НОС1, НОВг и HOSCN на его (а) ферроксидазную, (б) р-РР-оксидазную и (в) ЭСЮ активности. Данные представлены как среднее и доверительный интервал (а = 0,05).

Таблица 10

Значения 1С50 (мкг/мл) для ингибирования церулоплазмином продукции нейтрофилами АФК, в том числе после модификации 20-молярным избытком НОС1, НОВг либо HOSCN

Продуцируемый АФК Без модификации НОС1 НОВг HOSCN

Супероксидный анион-радикал 2,24 ± 0,09 1,61 ±0,07 1,73 ±0,06 1,29 ±0,11

Пероксид водорода 124 ± 19 88 ± 11 72 ±9 64 ±8

Для доказательства того, что ЦП влияет на продукцию пероксида водорода только снаружи клеток (рис. 19, а, б), суспензию НФ отмывали PBS от внесенного в нее ЦП, после чего добавляли активатор fMLP. Достоверных различий в графиках снижения уровня флуоресценции скополетина контрольной и «отмытой» суспензий НФ не наблюдалось (рис. 19, в), что позволяет говорить о том, что ЦП влиял только на внеклеточную продукцию пероксида водорода. Была обнаружена отрицательная корреляционная связь (г = -0,92) между концентрацией ЦП в образцах сыворотки, полученной от здоровых доноров и пациентов с болезнью Вильсона-Коновалова, и скоростью продукции пероксида водорода НФ, полученных из крови здоровых доноров, при добавке этих образцов сыворотки к клеткам до активации (рис. 19, г).

=г i ш

с;

-е-

-В-

fMLP (100 нМ) I

2мкМ ЦП

контроль

5 10

время, мин

fMLP (100 нМ)

— контроль

— "отмывка" от ЦП

2,5 ' 5 время, мин

В 3

I-Ф

ц 2

с:

•н

1,5 3 ЦП, мкМ

2,4 *

| 1,6

0,6

Ол х"

«X

4,5

12 3 4 ЦП, мкМ

Рис. 19. Исследование влияния ЦП на продукцию НФ пероксида водорода, а) Уровень флуоресценции скополетина до и после внесения в суспензию НФ 100 нМ fMLP в присутствии 2 мкМ ЦП и без него (контроль), б) Уровень продукции Н2О2 в суспензии клеток в отсутствие ЦП и при различных его концентрациях в системе, в) Уровень флуоресценции скополетина после «отмывки» суспензии НФ от предварительно внесенного в нее ЦП с помощью PBS с последующей активацией 100 нМ fMLP. г) Зависимость скорости продукции нейтрофилами Н2О2 при добавлении сыворотки от концентрации ЦП (мкМ) в этой сыворотке.

При добавлении Си,2п-500 к суспензии НФ вместе с ШЬР наблюдалось значительное увеличение скорости окисления скополетина (рис. 20). Это может служить подтверждением того, что при добавлении (МЬР запускается респираторный взрыв НФ и образуется 02", который в дальнейшем дисмутирует в Н202. Этот процесс практически полностью ингибировался ЦП в дозе 300 мкг/мл (2 мкМ).

■а

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 О

■ ^'wiAii.

- fMLP (100 нМ)

- + Cu,Zn-SOD (25 мкг/мл)

- + ЦП (300 мкг/мл)

время, мин

■е-

1.0 0,8 0,6 0,4

0,2 о

fMLP (100 нМ) + Cu,2n-SOD (25 мкг/мл) ♦ ЦП (300 мкг/мл)

4 5 время, мин

Рис. 20. Сравнение влияния ЦП (300 мкг/мл) и Си^п-ЗСЮ (25 мкг/мл) на продукцию пероксида водорода НФ, активированными ШЬР (100 нМ). Показаны результаты для двух независимых

опытов выделения клеток.

Необходимо отметить, что, в отличие от действия Cu,Zn-SOD, при добавлении ЦП пероксид водорода в системе практически не образовывался, что свидетельствует о том, что в основе SOD активности ЦП лежит не дисмутирование 02' до пероксида водорода, а его окисление до воды.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу способности ЦП снижать образование Or и Н202 активированными НФ. В основе этого эффекта лежит SOD-подобная активность ЦП, которая не снижается при действии активных форм галогенов, продуцируемых МПО. Хотя ЦП и его пептид (883-892) теряют способность ингибировать активность МПО после обработки НОС1 и НОВг, влияние ЦП на продукцию субстратов МПО активированными НФ препятствует проявлению ее активности. Наконец, корреляция между концентрацией ЦП в образцах сыворотки крови и скоростью продукции НФ пероксида водорода в присутствии образцов сыворотки свидетельствует в пользу участия ЦП в сдерживании респираторного взрыва НФ в кровяном русле.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования прояснили общие закономерности образования комплексов ЦП с белками лейкоцитов. Кроме обнаруженных ранее партнеров ЦП: ЛФ, МПО, серпроцидинов (NE, CG, PR3 и САР37), впервые было обнаружено взаимодействие ЦП с 5-LO и ЭПО. Также были обнаружены комплексы ЦП с ММП-2, ММП-12 и Fila. При аффинной хроматографии экстракта лейкоцитов на ЦП-Сефарозе партнеры ЦП элюировались при повышении ионной силы элюирующего раствора (1 М NaCI). Для катионных белков, взаимодействующих с ЦП, характерно присутствие в первичной последовательности гепарин-связывающих мотивов. Таким образом, комплексообразование ЦП с данными белками обеспечивается электростатическими взаимодействиями. Тот факт, что с одной молекулой ЦП связывается 6-7 молекул нейропептида РАСАР 38 [Tarns et al., 1999] и 6 молекул протамина [Соколов и соавт., 2005], говорит о возможности образования многокомпонентных комплексов ЦП с катионными белками лейкоцитов. Действительно, нами были обнаружены комплексы, включающие ЦП, ЛФ и МПО, показано образование комплекса ЦП-ЛФ-САР37 [Соколов и соавт., 2010]. За счет поливалентности МПО формируются комплексы, содержащие ЦП, МПО и апоВ-100-содержащие липопротеины (ЛНП и ЛОНП) [Sokolov et al., 2010]. Несмотря на определенную стереотипность образования комплексов ЦП с катионными белками лейкоцитов, использование ряда методов (анализ влияния партнеров на кинетические параметры реакций, катализируемых ЦП; использование конкурентных пептидов; исследование трехмерной структуры комплексов)

позволило различить, по крайней мере, два центра связывания ЦП с катионными белками. Связывание ЦП с ЛФ (и с протамином) в области 1-го и б-го доменов влияет на трехъядерный центр ЦП и активирует окисление Fe2+ [Соколов, 2007]. Fila, связывающийся вблизи сайта связывания Fe2+, ингибирует ферроксидазную активность ЦП, конкурируя с субстратом. Связывание МПО, ЭПО и серпроцидинов (либо низкоаффинное связывание второй молекулы ЛФ) в области 4-го домена ЦП влияет на окисление p-PD из-за близости к сайту связывания этого субстрата, при этом серпроцидины ингибируют p-PD-оксидашую активность ЦП, а МПО и ЭПО ее активируют. Следует отметить, что аффинность связывания ЛФ и САР37 в различных сайтах на ЦП характеризуется практически одинаковыми значениями K¿ ~ 13 нМ [Sokolov et al., 2009; Соколов и соавт., 2010].

Конкурентный механизм ингибирования ЦП активности МПО и ЭПО, очевидно, не эффективен в случае окисления такого специфического субстрата, как тиоцианат [Костевич и Соколов, 2010]. Важно отметить, что Км для перокснда водорода не изменяется в присутствии ЦП [Соколов, 2007], а учитывая, что процессивность (кса|) МПО около 90/с почти на 2 порядка превышает таковую (0,5/с) для окисления наиболее специфичного субстрата ЦП, Fe21" [Stoj and Kosman, 2003], едва ли ЦП может восстанавливать высокореактивное Соединение I МПО [Chapman et al., 2013]. В модельной системе в присутствии глюкозоксидазы, генерирующей пероксид водорода, ЦП терял оксидазную активность под действием хлорирующей и бромирующей МПО (рис. 7), тиоцианат же препятствовал модификации ЦП. Модификация ЦП продуктами катализа МПО (НОС1, НОВг) приводила к снижению его ферроксидазной и p-PD-оксидазной активности, при этом несколько повышалась его SOD-активность (рис. 18), что совпадало со способностью модифицированного ЦП ингибировать респираторный взрыв НФ (таблица 10). Однако ЦП и его пептид (883-892) после модификации НОС1, НОВг становились неэффективными ингибиторами активности МПО (таблица 9). В то же время, мягкий окислитель HOSCN, образование которого при катализе МПО не ингибируется ЦП, практически не снижал ни один из видов оксидазной активности ЦП, его способность ингибировать и МПО, и респираторный взрыв НФ. Таким образом, направляя МПО на окисление тиоцнаната, а не хлорида, ЦП способствует образованию относительно безопасного для человека гипотиоцианата, являющегося эффективным антимикробным агентом. ЛФ, как участник пентамерного комплекса 2ЛФ-2ЦГ1-МПО, ограничивает образование активных форм кислорода по нескольким механизмам: во-первых, способствуя окислению Fe"+, катализируемому ЦП, ЛФ снижает окислительный потенциал прооксидантных ионов железа [Соколов и соавт., 2005]; во-вторых, связывая ионы Си"\ ЛФ препятствует образованию гидроксильных радикалов при НаОг-индуцированиой деградации ЦП (рис. 10) [Sokolov et al., 2012]. Наконец, ЛФ не препятствует ингибированию ЦП хлорирующей активности МПО (рис. 6), и кроме того, он связывает ионы Fe3+, снижая вероятность образования гидроксильных радикалов в реакции НОС1 с Fe2t.

При хроническом воспалении антиоксидантый потенциал организма исчерпывается, и липопротеины подвергаются окислительной модификации под действием МПО. Если хлорирующая активность МПО эффективно ингибируется ЦП, то бромирующая активность МПО (и ЭПО) и окисление тиоцианата практически не подавляются концентрациями ЦП, присутствующими в плазме (таблица 5). Такие различия можно объяснить тем, что сродство МПО и ЭПО к бромиду и тиоцианату превышает сродство к хлориду, т. е. ЦП труднее конкурировать за активный центр МПО и ЭПО с предпочтительными для них субстратами. Продукты окисления тиоцианата считаются наименее опасными для «биомолекул организма хозяина», было показано, что гипотиоцианат не способствует проатерогенной модификации ЛНП (рис. 16) и практически не снижает оксидазные свойства ЦП (рис. 18). Учитывая, что для ЦП также были показаны антиатерогенные свойства, не исключено, что обнаружение комплексов, содержащих ЦП, МПО и липопротеины, у больных атеросклерозом является свидетельством компенсаторного процесса [Sokolov et al., 2010]. Отдельного внимания заслуживает тот факт, что протеолизованный ЦП практически не проявил антиатерогенных свойств на модели моноцитов/макрофагов после предъявления им ЛНП, подвергнутых окислительной модификации [Sokolov et al., 2014].

Учитывая, что протеолитическая деградация ЦП в синовиальной жидкости коррелировала с наличием активных Fila и МПО (рис. 12), можно предположить, что интактный ЦП является одним из противовоспалительных и антиоксидантных факторов, присутствующих в синовиальной

жидкости. Известно, что одним из патологических факторов развития ревматоидного артрита является Fila, содержание комплексов которого с антитромбином III повышено у больных ревматоидным артритом. Применение гирудина при терапии ревматоидного артрита существенно облегчает течение заболевания. В наших опытах гирудин эффективно ингибировал протеолиз ЦП в сыворотке крови и синовиальной жидкости (рис. 13). Учитывая, что только интактный ЦП обладает способностью ингибировать провоспалительный фермент лейкоцитов, МПО, можно предположить, что именно Fila снижает антиоксидантные свойства ЦП путем его протеолитической деградации (рис. 15). Впервые был выявлен протеолизованный ЦП в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом. Появление фрагментированного ЦП с молекулярной массой около 50 кДа было также показано при исследовании ЦП в сыворотке крови пациентов с болезнью Альцгеймера [Squítti et al., 2008]. Авторы считают, что фрагментация ЦП приводит к появлению «свободной» меди в кровотоке больных, которая может быть источником свободных радикалов. Не исключено, что и в синовиальной жидкости фрагментация ЦП приводит к образованию пула «свободной» меди, усугубляя течение ревматоидного артрита.

В целом полученные результаты дополняют картину участия ЦП в противовоспалительных реакциях, а также показывают возможность участия протеолизованного ЦП и прооксидантных ионов меди, которые он может терять при определенных условиях, в развитии осложнений воспаления. С одной стороны, ЦП ингибирует продукцию супероксидного анион-радикала и пероксида водорода активированными НФ, лишая МПО возможности синтезировать НОС1, способствует встраиванию прооксидантных ионов железа в апо-ЛФ, при комплексообразовании с ЦП подавляются провоспалительные функции практически всех его партнеров (5-LO, МПО, ЭПО). С другой стороны, протеолитическая деградация ЦП, которая наблюдается в образцах синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, лишает его способности ингибировать провоспалительные свойства 5-LO и МПО. Усиление продукции лейкотриенов должно способствовать привлечению в очаг НФ. Оксиданты, образующиеся под действием МПО, способны модифицировать ЦП, снижать его ферроксидазную активность и приводить к освобождению прооксидантных ионов меди. Действительно, в синовиальной жидкости часть ЦП присутствует в апо-форме, а медь обнаруживается в низкомолекулярной фракции при ультрафильтрации синовия. Образующиеся окислители могут модифицировать также и другие белки. Как показали наши недавние исследования [Gonidko et al., 2014], ЧСА, модифицированный НОС1, может активировать НФ и усиливать респираторный взрыв клеток, который сопровождается частичной секрецией МПО и протеиназ НФ. При активации НФ усиливается активация каскада свертывания крови, в том числе повышается концентрация Fila. Увеличение концентрации Fila способствует снижению антиоксидантной активности ЦП за счет усиления его деградации, что коррелирует с присутствием активной МПО в синовиальной жидкости. Таким образом, провоспалительные белки, взаимодействующие с ЦП, могут влиять на целостность его молекулы, лабильность связанных с ним прооксидантных ионов меди и определять способность ЦП регулировать функции НФ при воспалении.

ВЫВОДЫ

1. Для церулоплазмина характерно образование комплексов электростатической природы с белками, содержащими гепарин-связывающие мотивы: лактоферрином, миелопероксидазой, пероксидазой эозинофилов, серпроцидинами (нейтрофильная эластаза, катепсин G, протеиназа 3, азуроцидин), тромбином, матриксными металлопротеиназами 2 и 12.

2. В молекуле церулоплазмина можно выявить два сайта для взаимодействия с белками, при этом значения констант диссоциации для предпочтительных партнеров близки (~ 13 нМ). Первый сайт расположен между 1 -м и 6-м доменами церулоплазмина, и связывание с ним белка-партнера (лактоферрин, тромбин) влияет на ферроксидазную активность, второй расположен в 4-м домене и позволяет связавшемуся белку (миелопероксидаза, серпроцидины, пероксидаза эозинофилов) влиять на лора-фенилендиамин-связывающий сайт в церулоплазмине.

3. Церулоплазмин взаимодействует с лактоферрином и миелопероксидазой, образуя пентамерный комплекс (2ЛФ:2ЦП:МПО), в котором с димерной миелопероксидазой взаимодействуют две молекулы церулоплазмина, каждая из которых взаимодействует с лактоферрином.

4. Протеолитическая деградация церулоплазмина лишает его способности ингибироватъ активность провоспалительных ферментов: миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и 5-липоксигеназы.

5. Протеолитическая деградации церулоплазмина обусловлена его гомологией с факторами свертывания V и VIII, что проводит к гидролизу тромбином неканонического сайта K887-V888. Выявление активного тромбина в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом коррелирует с протеолитической деградацией церулоплазмина и наличием там же активной миелопероксидазы.

6. Апо-лактоферрин защищает церулоплазмин от деструкции пероксидом водорода, препятствуя образованию гидроксильных радикалов, а тиоцианат - от повреждения системой «миелопероксидаза/пероксид водорода/хлорид (бромид)» вследствие конкуренции с субстратами за активный центр миелопероксидазы. Модифицированный под действием НОС1, НОВг или HOSCN церулоплазмин сохраняет супероксиддисмутазную активность и способность снижать продукцию активных форм кислорода активированными нейтрофилами.

7. Способность миелопероксидазы связывать церулоплазмин и апоВ-100-содержащие липопротеины приводит к появлению в плазме крови мультикомпонентных комплексов. Интактный церулоплазмин снижает проатерогенное действие хлорирующей миелопероксидазы на липопротеины низкой плотности.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ (представленные в "PubMed", для русскоязычных статей представлены PMID англоязычных версий):

1. Sabatucci, A. Structural characterization of the ceruloplasmin: lactoferrin complex in solution / A. Sabatucci, C.B. Angelucci, M. Массаггопе, I. Cozzani, E. Dainese, M. Beltramini, B. Salvato, P. Vachette, V.B. Vasilyev, A. Sokolov, M. Pulina // Journal of Molecular Biology. - 2007. - Vol. 371. -№4.-P. 1038-1046.

2. Sokolov, A.V. Ceruloplasmin and myeloperoxidase in complex affect the enzymatic properties of each other / A.V. Sokolov, K.V. Ageeva, M.O. Pulina, O.S. Cherkalina et al. II Free Radical Research. -2008. - Vol. 42. - № 11-12. - P. 989-998.

3. Панасенко, O.M. Влияние церулоплазмина и лактоферрина на хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом хемилюминесценции / О.М. Панасенко, А.В. Чеканов, И.И. Власова, А.В. Соколов и др. // Биофизика. - 2008. - Т. 53. - № 4. - С. 573-581. [PMID: 18819272]

4. Sokolov, A.V. Effect of lactoferrin on oxidative features of ceruloplasmin / A.V. Sokolov, K.V. Ageeva, M.O. Pulina, E.T. Zakharova et al. II BioMetals. - 2009. - Vol. 22. - № 3. - P. 521-529.

5. Горудко И.В. Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека / О.С. Черкалина, А.В. Соколов, М.О. Пулина, Е.Т. Захарова и др. // Биоорганическая химия. - 2009. - Т. 35. - № 6. - С. 629-639. [PMID: 19915640]

6. Соколов, А.В. Исследование взаимодействия церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы с помощью фотонной корреляционной спектроскопии / А.В. Соколов, В.Н. Прозоровский, В.Б. Васильев // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - № 11. - С. 1506-1509. [PMID: 19916937]

7. Соколов, А.В. Идентификация комплексов церулоплазмина с матриксными металлопротеиназами 2 и 12 / А.В. Соколов, М.О. Пулина, К.В. Агеева, О.С. Черкалина и др. // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - X» 12. - С. 1703-1708. [PMID: 19961422]

8. Sokolov, A.V. Identification and properties of complexes formed by myeloperoxidase with lipoproteins and ceruloplasmin / A.V. Sokolov, K.V. Ageeva, O.S. Cherkalina, M.O. Pulina et al. II Chemistry and Physics of Lipids. - 2010. - Vol. 163. - № 4-5. - P. 347-355.

9. Соколов, A.B. Взаимодействие церулоплазмина с серпроцидинами / А.В. Соколов, К.В. Агеева, В.А. Костевич, М.Н. Берлов и др. // Биохимия. - 2010. - Т. 75. - № 11. - С. 1544-1552. [РМШ: 21314603]

10. Соколов, А.В. Взаимодействие церулоплазмина и 5-липоксигеназы / А.В. Соколов, Е.А. Голенкина, В.А. Костевич, В.Б. Васильев, Г.Ф. Судьина // Биохимия. - 2010. - Т. 75. - № 12. - С. 1687-1694. [PMID: 21314617]

11. Sokolov, A.V. Revealing binding sites for myeloperoxidase on the surface of human low density lipoproteins / A.V. Sokolov, V.A. Kostevich, V.B. Vasilyev, A.V. Chekanov ct al. II Chemistry and Physics of Lipids. - 2011. - Vol. 164. - № 1. - P. 49-53.

12. Sokolov, A.V. Protection of ceruloplasmin by lactoferrin against hydroxyl radicals is pH dependent / A.V. Sokolov, K.V. Solovyov, V.A. Kostevich, A.V. Chekanov et al. II Biochemistry and Cell Biol. - 2012. - Vol. 90. - № 3. - P. 397-404.

13. Соколов, A.B. Двухстадийный метод получения церулоплазмина на основе его взаимодействия с неомицином / А.В. Соколов, В.А. Костевич, Д.Н. Романико, Е.Т. Захарова, В.Б. Васильев // Биохимия. - 2012. - Т. 77. - № 6. - С. 775-784. [PMID: 22817463]

14. Samygina, V.R. Ceruloplasmin: macromolecular assemblies with iron-containing acute phase proteins / V.R. Samygina, A.V. Sokolov, G. Bourenkov, M.V. Petoukhov et al. II PLoS One. - 2013.-Vol. 8. -№ 7.-e67145.

15. Панасенко, O.M. Хлорноватистая кислота как источник свободных радикалов / О.М. Панасенко, И.В. Горудко, А.В. Соколов // Успехи биологической химии. - 2013. - Т. 53. - С. 195244. [PMID: 24490735]

16. Sokolov, A.V. Proatherogenic modification of LDL by surface-bound myeloperoxidase / A.V. Sokolov, V.A. Kostevich, O.L. Runova, I.V. Gorudko et al. II Chemistry and Physics of Lipids. - 2014. -Vol. 180.-P. 72-80.

17. Sokolov, A.V. Lactoferrin, myeloperoxidase, and ceruloplasmin: complementary gearwheels cranking physiological and pathological processes / A.V. Sokolov, E.T. Zakahrova, V.A. Kostevich, V.R. Samygina, V.B. Vasilyev // Biometals. - 2014. - Vol. 27. - № 5. - P. 815-828.

18. Sokolov, A.V. Interaction of ceruloplasmin with eosinophil peroxidase as compared to its interplay with myeloperoxidase: reciprocal effect on enzymatic properties / A.V. Sokolov, V.A. Kostevich, E.T. Zakharova, V.R. Samygina et al. И Free Radical Research. - 2015. - Vol. 49. - P. 800-811.

19. Sokolov, A.V. Thrombin inhibits the anti-myeloperoxidase and ferroxidase functions of ceruloplasmin: relevance in rheumatoid arthritis / A.V. Sokolov, L. Acquasaliente, V.A. Kostevich, R. Frasson et al. II Free Radical Biology and Medicine. - 2015. (doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.05.016) Патент:

20. Соколов, А.В. Способ получения особо чистого препарата ферроксидазы церулоплазмина и/или фактора свертывания крови протромбина. Аффинный сорбент для их получения / А.В. Соколов, Е.Т. Захарова, В.А. Костевич, В.Б. Васильев // Патент РФ № 2488403, 15 декабря 2011 года.

Статьи в рецензируемых журналах:

21. Соколов, А.В. Протеолитическая деградация церулоплазмина тромбином - пример неканонического гидролиза связи K887-V888 / А.В. Соколов, В.А. Костевич // Медицинский Академический Журнал. - 2010. - Т. 10. - № 5. - С. 63-64.

22. Костевич, В.А. Взаимодействие церулоплазмина и тиоцианата как ингибиторов миелопероксидазы в плазме крови / В.А. Костевич, А.В. Соколов // Медицинский Академический Журнал.-2010.-Т. 10.-№ 5.-С. 210.

23. Соколов, А.В. Возможности регуляции проатерогенных свойств миелопероксидазы с помощью веществ, ингибирующих ее активность и препятствующих ее взаимодействию с липопротеинами низкой плотности / А.В. Соколов, В.А. Костевич // Медицинский Академический Журнал. - 2012. - Т. 12. - № 3. - С. 80-81.

24. Соколов, А.В. Комплекс церулоплазмина и лактоферрина в слезной жидкости / А.В. Соколов, М.О. Пулина, O.JI. Рунова, Е.Т. Захарова, В.Б. Васильев // Медицинский Академический Журнал. -2013. - Т. 13. - №2. - С. 3943.

Тезисы конференций:

25. Complexes of ceruloplasmin with proteins of neuthrophils and their probable biochemical roles / V. Vasilyev, A. Sokolov, K. Ageeva, O. Cherkalina et al. II A Biochemical Society focused meeting. Experimental Approaches of protein:protein interactions (11-12 January 2010, University of Sheffield, United Kingdom). - 2010. - P. 12.

26. Thrombin binds human ceruloplasmin and proteolytically hinders its antioxidant activity / De V. Filippis, L. Acquasaliente, A. Sokolov, V. Kostevich et al. II XXVI Congress of International Society of Thrombosis and Haemostasis (29 June4 July, 2013, Amsterdam). - 2013. - P. 475.

27. Structural and functional features of ceruloplasmin in complexes with other proteins of acute phase / A. Sokolov, V. Samygina, E. Zakharova, H. Bartunik, D. Svergun, V. Vasilyev // FEBS Journal, Special Issue: 38th FEBS Congress (July 6-11,2013, Saint Petersburg, Russia). - 2013. - Vol. 280, SI. - P. 111112.

28. Role of myeloperoxidase binding to the surface of low-density lipoprotein in their proatherogenic modification by reactive halogen species / A.V. Sokolov, V.A. Kostevich, O.L. Runova, I.V. Gorudko et al. II 8th International Human Peroxidase Meeting (September 9-12, 2013, Sydney). - 2013. - P. 87.

29. Ceruloplasmin: macromolecular assemblies with iron-containing acute phase proteins lactoferrin and myeloperoxidase / A.V. Sokolov, V.R. Samygina, G. Bourenkov, M.V. Petoukhov et al. II XIth International Conference on Lactofeirin Structure, Function and Applications (6-10 October 2013, Rome, Italy). -2013-P. 33.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

4-ПОБН - а-(4-пиридил-1-оксил)->1-т/>ет-бутилнитрон

5-LO - 5-липоксигеназа

а. о. - аминокислотный остаток

АФК - активные формы кислорода

ДМСО - диметилсульфоксид

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛОНП - липопротеины очень низкой

плотности

ЛПС - липополисахарид ЛФ - лакгоферрин

ММП - матриксная металлопротеиназа

МПО - миелопероксидаза

НФ - нейтрофилы

ПААГ - полиакриламидный гель

ФКС - фотонная корреляционная

спектроскопия

ЦП - церулоплазмин

ЦПпр - протеолизованный церулоплазмин ЧСА - альбумин сыворотки человека ЭПО — пероксидаза эозинофилов ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЭФ - электрофорез

АВАН - гидразид 4-аминобензойной кислоты ABTS - 2,2'-диазинобис(3-этилбензо-триазолин-6-сульфонат) натрия АЕ - аминоэтил

ВТЕЕ - Ы-бензоил-Ь-тирозина этиловый эфир

САР37 - азуроцидин CG - катепсин G

СТАВ - цетилтриметиламмония бромид Cu,Zn-SOD - Си^п-супероксиддисмутаза ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

Р(римская цифра) - фактор свертывания крови

FII - протромбин Fila - тромбин

fMLP - формил-метионил-лейцил-фенилаланин

IC50 - концентрация полумаксимального

ингибирования

Ig — иммуноглобулины

Ка - константа активации

kcat - число оборотов фермента

K<¡ - константа диссоциации

K¡ - константа ингибирования

Км - константа Михаэлиса

MALDI - матрично-активированная лазерная

десорбция/ ионизация

NBA - лара-нитрофенол-t-BOC-Ala

NIH - единица коагуляционной активности

Fila в соответствии со стандартом National

Institute of Health

NE - эластаза нейтрофилов

Or — супероксидный анион-радикал

o-DA - орто-дианизидин

ОН" - гидроксильный радикал

OZ - опсонизированный зимозан

Р445—456 - пептид EQIQDDCTGDED (апоВ-

100 а. о. 445-456)

РАСАР38 - пептид гипофиза, активирующий аденилатциклазу

PBS - 150 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,4

РМА - форбол-12-миристат-13-ацетат PMSF — фенилметилсульфонил фторид р-PD - иара-фенилендиамин PR3 - протеиназа 3

SAXS — рассеяние рентгеновских лучей под

малыми углами

SDS - додецилсульфат натрия

SOD - супероксиддисмутазная (активность)

ТМВ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

Ve - объем элюции

Vmax - максимальная скорость реакции

Подписано в печать 18.06.2015 Формат 60x84 '/i6 Цифровая Печ. л. 2.0 Тираж 200 Заказ №07/06 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)

Информация о работе

Соколов, Алексей Викторович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2015
ВАК 03.01.04

Автореферат

Структурно-функциональная характеристика комплексов церулоплазмина с белками лейкоцитов и их роль при воспалительных процессах - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы