Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ иммунотропной активности полиоксидония и белковых препаратов крови в системе in vitro

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ иммунотропной активности полиоксидония и белковых препаратов крови в системе in vitro"

На правах рукописи

ПРОХОРОВА Марина Владимировна

АНАЛИЗ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИОКСИДОНИЯ И БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ КРОВИ В СИСТЕМЕ IN VITRO

Специальность 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2005

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Добротина Наталия Аркадьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Анастасиев Валентин Васильевич

доктор медицинских наук, профессор

Литовская Анна Владимировна

Ведущая организация:

Нижегородская государственная медицинская академия

Защита состоится г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950 г. Н. Новгород, пр. Гагарина, 23 корп. 1, биологический факультет

e-mail: kmb@bio.unn.ru тел: (8312) 65-82-07

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан » г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

А.С. Корягин

м

LP06 -f 2 2 ОЦ

Список сокращений

АОА - антиоксидантная активность

БАВ - биологически активные вещества

Е-РОК - розеткообразующие клетки

ИАН - индекс активации нейтрофилов

ИЗФ- индекс завершенности фагоцитоза

ИКК - иммунокомпетентные клетки

HCT - нитросиний тетразолий

ПО - полиоксидоний

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РО - розеткообразование.

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЭБ - эритроциты барана

Alb - альбумин

IgG - гамма-глобулин

Ср - церулоплазмин

Актуальность проблемы. Обоснованием настоящего исследования является актуальность проблем физиологической иммунологии, адаптации, и, в связи с этим, широкий поиск и выяснение механизмов действия различных иммуностимуляторов и иммуномодуляторов.

В настоящее время большое значение придается изучению проблем нарушения иммунной системы человека, вызванных действием различных факторов (Хаитов P.M., с соавт., 2004; Ройт А., 1991). Среди них следует выделить антропогенные и техногенные факторы, влияющие на возникновение и формирование различных патологий человека, прежде всего экозависимых заболеваний: комплексное влияние химических, радиационных и других факторов, климатогеографические особенности региона и др. (Ярилин A.A. с соавт., 1997).

Злободневной проблемой являются также нарушения не только эк-30-, но и эндоэкологии организма человека. Это обусловлено, прежде всего, тем, что постоянно меняющаяся и ухудшающаяся экологическая среда обитания, нарастание антигенного груза и нарушение регуляции гомеостаза вносит разрушительный вклад Во внутреннее благополучие организма. Необходимость приспособления к условиям жизни изменяют показатели «нормы реакции», вынуждает пересматривать критерии адаптации к патологическим воздействиям и учитывать влияние экологической составляющей в оценке этиопатогенеза заболеваний (Доброти-на H.A., Копытова Т.В., 2004). Возможная эндоинтоксикация является следствием нарушения протекания различных биохимических реакций внутри организма, вызванного патологическими процессами. (Малахова

Общая характеристика работы

М.Я., 2000).

РОС. НАЦИОНАЛЫ! U БИБЛИОТЕКА

Эта совокупность проблем приводит к необходимости поиска новых иммуномодулирующих препаратов (Hadden J.W., 1993; Werner G.H., 1996). Основными научными направлениями ведущих клиник являются изучение И внедрение в клиническую практику новых иммуномодулято-ров, иммуностимуляторов и методов фармакотерапии иммунной недостаточности и аллергических заболеваний (Манько В. М., 2002). В медицинской практике большое внимание уделяется новому химически синтезированному препарату - полиоксидонию (ПО), который обладает иммуномодулирующим, детоксицирующим и другими эффектами (Петров Р.В., Кабанов В.А., 2002). В настоящее время действие ПО in vivo является достаточно изученным, именно поэтому ПО широко применяется в клинической практике (Дьяконова В.А. с соавт, 2002; Дамбаева C.B. с соавт., 2000). Однако, неисследованным остается эффект взаимодействия ПО с другими препаратами, которые обладают специфической и параспецифической физиологической активностью.

В связи с этим целью настоящей работы является изучение физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуля-торов различного происхождения (химически синтезированного ПО и белковых препаратов) на клеточные реакции и факторы неспецифической резистентности в условиях in vitro.

В соответствии с целью определены следующие задачи:

1. Исследование действия синтетического иммуномодуля гора полиоксидония на иммунологические реакции и факторы неспецифической резистентности организма человека in vitro, а также определение границ физиологического и цитотоксического действия на выделенные клетки.

2. Изучение действия ПО на иммунологические показатели клеточных реакций и факторы неспецифической резистентности организма человека при ожоговой интоксикации.

3. Выяснение эффектов воздействия церулоплазмина (Ср), гамма-глобулина (IgG) и альбумина (Alb) на иммунологические реакции и показатели неспецифической резистентности in vitro.

4. Изучение совместного влияния препаратов различного происхождения (ПО и Ср, ПО и IgG, ПО и Alb) на функциональную активность лимфоцитов периферической крови человека и неспецифическую резистентность in vitro.

Положения, выносимые на защиту.

1. На выделенной из крови человека популяции лимфоцитов в экспериментах in vitro определены физиологически действующие, не-повреждающие концентрации ПО и доказана его иммуномодулирующая активность.

2. Выявлено иммуностимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие иммунокомпетентных клеток, обеспечивающее реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров. Установлено активирующее влияние ПО на систему комплемента и снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО в условиях in vitro.

3. Установлено, что стимулирующее воздействие ПО на иммунологические реакции и неспецифическую резистентность сохраняется при использовании с нативными иммуномодуляторами (Ср, IgG, Alb).

4. В экспериментах in vitro доказана обоснованность применения ПО при ожоговой интоксикации в ряде случаев.

Научная новизна.

• Проведенные исследования позволили установить стимулирующее влияние ПО в системе in vitro на иммунокомпетентные клетки (ИКК), снижение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), причем мелкодисперсных (повреждающих); выявлена умеренная стимуляция системы комплемента. Установлен дозозависимый антиокси-дантный эффект ПО на процессы ПОЛ в сыворотке крови.

• Установлено действие ПО in vitro на иммунологические реакции крови пациентов с термической травмой как модели воспалительной и интоксикационной патологии.

• Впервые получены данные о комплексном влиянии препаратов различного происхождения (эндогенных и химически чистых) на иммунологические реакции.

Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что получены дополнительные данные, обосновывающие применение ПО в качестве иммуномодулятора. Показана принципиальная возможность комплексного использования препаратов различного происхождения с целью повышения эффективности этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на III сессии молодежной школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Сэров, 2003),8-й Международной Путинской конференции молодых ученых (Пущино, 2004), Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям...» (Тверь, 2002.), IX нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2004), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и

благодарность сотрудникам кафедры молекулярной биологии и иммунологии, в особенности к.б.н., доц. Ж.А. Казацкой, д.б.н., проф. В.В. Новикову за помощь при подготовке работы; д.б.н., проф., зав. каф. клинической лабораторной диагностики К.Н. Конторщиковой, к.м.н., зав. кли-нико-иммунологической лаборатории ННИИТО М.Ю. Лебедеву.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены настраницах машинописного текста, иллюстрированы ^л таблицами и ¿У рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ^^У источника, из которых ^ на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы следующие препараты: иммуномодулятор ПО («Иммафарма», Москва), препараты крови - Alb, IgG (ННИИЭМ), Ср (ИмБио).

Объектом исследований служила донорская кровь и сыворотка, полученная в Нижегородском областном центре крови; кровь больных, предоставленная Нижегородским ожоговым центром. В качестве модельной системы в работе применен разработанный ранее на кафедре молекулярной биологии и иммунологии (МБИ) комплекс лабораторных методов (Добротина H.A., Казацкая Ж.А., 1997).

С целью изучения влияния препаратов на розеткообразование (РО) и адгезию популяцию лимфоцитов получали путем фракционирования периферической крови человека в градиенте плотности фикол-верографина (1,077) - 15 мин. 3000 об/мин. Выделенные клетки дважды центрифугировали (10 мин. 1000 об/мин) с целью отмывания клеток от градиента. Подсчет концентрации лимфоцитов в 1 мл проводили в камере Горяева. Полученную взвесь разводили раствором Хенкса до концентрации 2*106 кл/мл.

Жизнеспособность лимфоцитов оценивали в тесте с трипановым синим, окрашивая мертвые клетки 0,5% раствором трипанового синего (МеньшиковВ.В., 1987)

Розеткообразующую способность Т-лимфоцитов определяли методом спонтанного розеткообразования (ГО). Индикаторными частицами служили эритроциты барана (ЭБ). Розеткообразующими считали лимфоциты, связавшие 3 и более ЭБ. С целью изучения влияния различных препаратов на розеткообразующие свойства Т-лимфоцитов клеточную взвесь инкубировали с различными концентрациями препаратов в течение 1 часа при 37°С (Ляпон А.О., 1980). Традиционно метод спонтанного розеткообразования используется для определения количества Т-лимфоцитов в крови. В нашей работе метод применен для изучения

тайного розеткообразования используется для определения количества Т-лимфоцитов в крови. В нашей работе метод применен для изучения влияния различных физиологически активных веществ на розеткообра-зующую активность Т-лимфоцитов.

Для изучения адгезивных свойств иммунокомпетентных клеток полученную, по описанной выше методике, взвесь лимфоцитов, в объеме 1 мл наносили на синтетический носитель (20 мг), помещенный в туберкулиновый шприц (высота колонки 1см). Клетки предварительно обрабатывали различными концентрациями исследуемых препаратов. Контролем служила взвесь необработанных клеток. В камере Горяева производили подсчет клеток до и после пропускания через пористую волокнистую поверхность. Затем рассчитывали процент адгезированных на синтетическом волокне клеток (Arnold L.,1974).

Активацию системы комплемента под действием препаратов оценивали по гемолизу в геле агарозы (Мотавкина Н.С. с соавт., 1980). Учет уровня активации комплемента в изучаемом субстрате проводили по диаметру кольца лизиса сенсибилизированных ЭБ (классический путь активации), сопоставляя его с диаметром кольца лизиса контрольной пробы, принимаемого за 100%.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) оценивали методом Т.В. Копытовой (1991), принцип которого заключается в осаждении ЦИК полиэтиленгликолем.

Для определения антиоксидантной активности (влияние на процесс ПОЛ) использовался метод измерения интенсивности свечения индуцированной хемилюминесценции (Конторщикова К.Н., 2000).

Для определения общей окислительно-восстановительной активности нейтрофилов использовался НСТ-тест, основанный на способности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать его в гранулы нерастворимого диформазана синего цвета. Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций «метаболического взрыва», сопровождающего процесс фагоцитоза, а также повышенного метаболизма активированного нейтрофила.

Влияние ПО на бактерицидную активность нейтрофилов изучали методом определения индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) клеток периферической крови человека (Матусис З.Е., Пылаева С.И., 1972). Принцип метода основан на способности фагоцитирующих клеток поглощать и переваривать живые микроорганизмы. Методика использовалась для определения фагоцитарной активности клеток крови в отношении золотистого стафилококка. ИЗФ определялся по формуле: ИЗФ = исход/опыт.

Результаты исследований обрабатывались статистически с использованием t - критерия Стьюдента при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Модулирующее действие ПО на иммунологические реакции и неспецифическую резистентность

Принципиальное значение для дальнейшего исследования действия препаратов на клеточные реакции имеет установление оптимальных и пороговых цитотоксических концентраций.

В результате проведенных исследований по влиянию на жизнеспособность лимфоцитов показано, что в концентрации 1000 мкг/мл и выше ПО не проявляет цитотоксического эффекта. По данным исследований, проведенных ранее на кафедре молекулярной биологии и иммунологии установлено, что даже такие физиологические препараты, как Ср, IgG, в определенных концентрациях обладают токсичностью или способствуют сдвигу иммунного гомеостаза. Нами показано, что Ср не вызывает токсического эффекта в концентрации до 500 мкг/мл, IgG - до 25 мг/мл.

Таким образом, определение концентрации токсичности ПО на клеточном уровне обосновывает исключительный факт - отсутствие выраженной токсигенности химически синтезированного ПО даже в сравнении с аутогенными белковыми препаратами.

Комплексное исследование влияния ПО на реакции клеточного иммунитета и неспецифической резистентности позволило выявить им-муномодулирующий эффект изучаемого препарата в условиях in vitro.

Используя тест спонтанного розеткообразования, мы провели исследование влияния ПО на количественное содержание как «активных», так и «общих» Е-розеткообразующих лимфоцитов доноров в условиях in vitro. Предполагается, что наиболее адгезивно активные Е-РОК определяются после минимальной инкубации («активные» розетки), а менее активные - при более длительном контакте эритроцитов с лимфоцитами («общие» розетки).

Нами установлено, что под воздействием ПО на выделенные лимфоциты происходит увеличение числа розеткообразующих клеток (Е-РОК). ПО в различных концентрациях оказывает стимулирующее действие, как на "общие", так и на "активные" Е-РОК (табл. 1).

Максимальное достоверное увеличение (на 48,6%) количества "активных" Е-РОК наблюдается при использовании ПО в концентрации 30 мкг/мл (р<0,05); "общих" Е-РОК (на 60%) - в концентрации 60 мкг/мл (р<0,05).

С целью выяснения механизмов нарастания розеткообразующей активности Т-лимфоцитов, были изучены адгезивные свойства иммуно-компетентных клеток. Адгезия - общебиологический физиологический феномен, характерный для различных клеток, в том числе этот феномен работает и в иммунной системе (Hynes L., Zhao J., 2000). Основная функция рецепторов адгезии состоит в поддержании межклеточных

взаимодействий и взаимодействий между клетками и экстраклеточным матриксом (Wagner J., Roth W., 2000).

Таблица I

Влияние полиоксидония иа иммунные реакции и неспецифическую резистентность (М ± ш, п = 10)

Препарат, мкг/мл Е-РОК, % Количество адгезированных клеток, % Активность комплемента (диаметр кольца гемолиза, мм)

«активные» «общие»

К 100 100 100 100

ПО(ЗО) 148,6±8,57* 147,2±7,2* 148,9±7,7* 104±1,2*

П0(60) 126,7±9,5 160,4±5,5* 149,8±5,5* 110±0,6*

ПО( 125) 143,8±13,6* 157,4±8,1* 149,8±4,3* 120±2,0*

* - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).

При сравнительном анализе изменения адгезии, как одного из показателей рецепторной функции клеток крови, под действием исследованных БАВ в большинстве случаев выявлен параллелизм между изменением розеткообразующей и адгезивной активностью. Это, по-видимому, связано с перестройкой рецепторного пейзажа лимфоцитов и возможной активацией субпопуляции лимфоцитов, которые в неактивном состоянии не обладают способностью связывать ЭБ. Представленные в работе результаты свидетельствуют о том, что ПО усиливает эффект адгезии до 50% (р<0,05) во всех исследуемых концентрациях (табл.

О-

Согласно поставленным в работе задачам, было исследовано влияние ПО на активность системы комплемента как один из важнейших факторов неспецифической резистентности организма человека. В диапазоне исследованных концентраций препарата не обнаружено дозоза-висимого эффекта; активность системы комплемента повысилась иа 1022% (р<0,05) в сравнении с контролем (табл. 1).

Повышение активности системы комплемента, вероятно, может быть взаимосвязано со способностью заряженных групп макромолекулы ПО взаимодействовать с активным центром компонентов комплемента, стимулируя, таким образом, протекание следующих протеолитических процессов.

Исследовано влияние препарата на реакции образования циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Образование ЦИК - это важнейшая реакция иммунного и патоиммунного процессов, взаимосвязанная также с процессами детоксикации (Добротина H.A., Копытова Т.В., 2004). В результате экспериментов нами выявлено стабильное снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием препарата во всех иссле-

дованных концентрациях. Максимальное снижение - со 100% до 23% (р<0,05) - наблюдалось в концентрации 80 мкг/мл. Уровень крупнодисперсных ЦИК снижается незначительно (на 5-16%) (рис. 2.).

Возможно, это взаимосвязано со способностью молекул ПО (в частности полярных групп) изменять комплексообразование ЦИК. Фактически это коррелирует с детоксицирующим эффектом ПО. Мелкодисперсные иммунные комплексы, возникающие в условиях небольшого избытка антигена, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплементактивирующей способности (Осипов С.Г., 1983), поэтому их снижение под влиянием ПО можно рассматривать как положительный эффект.

Антиоксидантные свойства ПО in vitro исследованы с помощью метода оценки активности ПОЛ (измерение интенсивности свечения индуцированной хемилюминесценции).

0 1 10 50 100 250 500

ПО, мкг/мл

Рис. 1. Влияние полиоксидония на общую антиоксидантную активность

Статистически достоверное снижение Б (показатель светосуммы хемилюминесценции) в диапазоне концентраций 50-500 мкг/мл в сравнении с контролем свидетельствует о повышении общей антиоксидант-ной активности (АОА); в концентрациях 1-10 мкг/мл наблюдается тенденция к повышению Б (рис.1), т.е. снижению АОА.

Потенциальная способность системы к ПОЛ оценивалась с помощью ¡„их. Под действием ПО в концентрации 100-500 мкг/мл значение 1П)ач снижено в сравнении с контролем, что говорит о снижении потенциальной способности системы к ПОЛ.

Влияние ПО на иммунологические показатели пациентов с термической травмой

Терапия ожоговой болезни представляет большие трудности; в частности требуется исключительная индивидуализация коррекции гомео-стаза. В настоящее время в патогенезе ожоговой болезни наряду с токсемией обязательным компонентом выделяется вторичный иммунодефицит в сочетании с аутоиммунными процессами (Алексеев А А , Лавров В.А., 1998). Принципиальным вопросом является необходимость применения иммуностимуляторов, однако возможность использования иммуномодуляторов с адаптационным и детоксицирующим эффектом является обоснованной.

Тиб ища -

Влияние полиоксидония на розеткообразование Т-лимфоцитов ожоговых больных и доноров

ПО, мкг/мл Ожоговые больные Доноры

Е-РОК,% Е-РОК,%

"активные" "общие" "активные" "общие"

К 100 100 100 100

ПО (5) 142,2±6,6* 145,7±7,6* 120,4±16,9 117,4±9,8

ПО( 10) 143,7±7,4* 150,8±9,1* 124,6±17,6 126,7±9.3*

* - р<0,05 по сравнению с контролем (без ПО)

В таблице 2 представлены данные, отражающие изменение числа Е-РОК под действием полиоксидония у пациентов с термической травмой (средняя площадь ожога - 36% поверхности тела) и практически здоровых доноров.

Полученные результаты свидетельствуют, что розеткообразуюшая способность Т-лимфоцитов ожоговых больных была достоверно выше, чем доноров. При этом используемые дозировки препарата практически не отличались по эффективности действия на данный показатель. Стимуляция розеткообразования отмечалась как для "активных", так и для "общих" розеток (табл. 2).

При изучении действия ПО на уровень ЦИК в сыворотке ожоговых больных, учитывая различия пациентов в площади ожога, они были разделены на две группы: 1-я группа - пациенты с ожогом от 10 до 30% поверхности тела, 2-я группа - пациенты с ожогом от 30 до 60% поверхности тела.

В сыворотке больных с ожогом менее 30% поверхности тела содержание мелкодисперсных иммунных комплексов было достоверно большим, чем в группе больных с ожогом, превышающим 30 %.

Под влиянием ПО наблюдалось снижение уровня мелкодисперсных ЦИК у обеих групп пациентов, причем наибольший эффект отмечен при использовании концентрации 10 мкг/мл (в первой группе больных -на 22 %, во второй - на 37%). Применение ПО в концентрации 30 мкг/мл приводило к увеличению содержания мелкодисперсных ЦИК на 17% в сыворотке больных с площадью ожога более 30% поверхности тела, то есть в данном случае наблюдался обратный (реципрокный) эффект препарата.

Таблица 3

Действие полиоксидония на уровень мелко- и крупнодисперсных ЦИК в сыворотке пациентов с термической травмой

ПО, мкг/мл ЦИК, единицы оптической плотности

мелкодисперсные ЦИК крупнодисперсные ЦИК

ожог 10-30% п.т. ожог 30-60% п.т. ожог 10-30% п.т. ожог 30-60% п.т.

0 0,410±0,015 0,150±0,007 0,055±0,001 0,040±0,001

3 0,365±0,016* 0,130±0,005* 0,047±0,002* 0,039±0,001

10 0,320±0,014* 0,095±0,004* 0,046±0,001* 0,039±0,002

30 0,390±0,016 0,175±0,010* 0,052±0,001 0,042±0,002

* - р<0,05 по сравнению с контролем (без ПО)

Под влиянием полиоксидония в концентрации 3 и 10 мкг/мл снижение содержания крупнодисперсных иммунных комплексов наблюдалось только в 1-ой группе пациентов (на 17 и 15% соответственно) и тенденция к снижению в дозе препарата 30 мкг/мл (табл. 3).

Таким образом, в результате проведенного исследования показано дозозависимое действие полиоксидония на уровень ЦИК в сыворотке пациентов с термической травмой.

При изучении действия ПО на функциональную активность ней-трофилов установлено, что в группе пациентов с ожогом менее 30% поверхности тела индекс активации нейтрофилов был близок к норме и достоверно не отличался от показателя у доноров (ИАН у практически здоровых доноров составляет 15±1%) Во второй группе больных с ожогом свыше 30 % поверхности тела индекс активации нейтрофилов на момент исследования был выше нормальных значений.

При использовании ПО в концентрации 10 и 100 мкг/мл в группе пациентов с ожогом менее 30% поверхности тела прослеживалось снижение индекса активации нейтрофилов. При увеличении дозы полиоксидония до 500 мкг/мл наблюдалось повышение изучаемого показателя в данной группе пациентов.

В группе пациентов с ожогом более 30% поверхности тела под

действием ПО наблюдалось достоверное увеличение этого параметра по отношению к контролю (наибольшая стимуляция отмечена при использовании ПО в концентрации 100 мкг/мл (в 3,2 раза).

Полученные результаты свидетельствуют, что действие полиок-сидония на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте отличалось в разных группах больных, то есть наблюдалась зависимость между эффектом препарата и тяжестью состояния пациентов.

Для изучения действия ПО на поглотительную функцию нейтрофилов определяли индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) в отношении стафилококка (Staphylococcus aureus, штамм 600).

В группе пациентов с площадью ожога менее 30 % поверхности тела исходные значения индекса завершенности фагоцитоза были достоверно снижены по сравнению с показателями у практически здоровых ••доноров. Действие ПО проявлялось в этой группе пациентов повышением переваривающей способности нейтрофилов в отношении стафилококка. У пациентов с ожогом более 30% поверхности тела индекс завершенности фагоцитоза был в среднем повышен по отношению к норме. Влияние ПО на нейтрофилы пациентов этой группы также зависело от дозы препарата.

Полученные данные показывают, что ПО оказывал стимулирующее влияние на индекс завершенности фагоцитоза нейтрофилов в обеих группах пациентов.

Совместное действие ПО и белковых препаратов

Закономерно, что в современной доказательной биомедицине обосновывается применение системной коррекции патологических состояний вместо монотерапии.

Появляясь в крови, ПО действует не изолированно, а во взаимодействии с белками крови, поэтому следующим этапом работы было исследовано совместное влияние ПО с Ср, IgG и Alb на иммунологические реакции.

В результате проведённых экспериментов был обнаружен более выраженный эффект совместного действия препаратов ПО и Ср на клеточные реакции по сравнению с отдельно взятыми препаратами. Исследованы различные комбинации концентраций, но определенной зависимости влияния доз препаратов на степень стимуляции иммунных реакций не выявлено. Под действием ПО и Ср в концентрациях от 30 до 125 мкг/мл количество «активных» Е-РОК увеличилось на 64-88%, «общих» - на 24-44%, адгезивная способность мононуклеаров увеличивается на 35 - 77% (р<0,05) (табл.4).

Таким образом установлен стимулирующий эффект ПО как отдельно взятого, так и с Ср на кооперативное взаимодействие ичм\некомпетентных клеток, причем совместное применение ПО и Ср характеризовалось синергетическим эффектом.

п

Таблица 4

Влияние полиоксидония и церулоплазмина на иммунные реакции (М ± m, п = 10)

Препарат, мкг/мл Е-РОК,% Количество адгезиро-ванных клеток, % Активность комплемента (диаметр кольца гемолиза, мм)

«активные» «общие»

К 100 100 100 100

ПО (125) 143,8±13,7» 159,5±8,18* 149,8±5,5* 120±2,0*

Ср (125) 109,5±10,9 133,6±9,9 130,2±4,9* 120±2,0*

Ср+ПО (125) 164,4±14,4* 144,4±6,0* 176,9±5,8* 118±0,4*

* - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).

При исследовании действия препаратов ПО и Ср в модельной системе in vitro, важным аспектом, кроме собственно иммунологических реакций, является изучение их влияния на такие показатели неспецифической резистентности, как активацию системы комплемента.

В результате проведенных экспериментов установлено, что при совместном действии ПО и Ср повышение комплементарной активности составило 10-20% (р<0.05) (табл. 4), т. е. суммации стимулирующего влияния препаратов не обнаружено.

120

100

8е 80 ж

S

I 60 «

ш

I 40

20

Ср+ПО(166) Ср+П0(80) Ср(16б) Ср(80) ПО(|66) П0(80| К

□ Мелкодисперсные ЦИК ■ Крупнодисперсные ЦИК препарат

Рис. 2. Влияние препаратов ПО и Ср на уровень циркулирующих иммунных комплексов.

Одним из этапов исследования ПО и Ср на иммунологические реакции было изучение их действия на мелкодисперсные и крупнодисперсные иммунные комплексы (ИК). Установлено, что отдельно взятые препараты ПО и Ср и при их совместном использовании однонаправ-ленно влияют на уровень ИК: значительно снижают содержание мелкодисперсных ИК: со 100% до 23% (р<0.01) в концентрации 80 мкг/мл, уровень крупнодисперсных ЦИК снижается незначительно - на 5-16% -под действием всех исследованных концентраций (р<0.01) (рис.2.). Это еще раз подчеркивает значение адаптационного эффекта действия исследованных препаратов, учитывая, что патофизиологическое влияние мелко- и крупнодисперсных ЦИК различно.

В результате изучения совместного действия ПО и IgG на клеточные реакции был отмечен эффект суммации. Следует учесть, что IgG сдерживает, регулирует развитие некоторых иммунологических реакций; в частности, обнаружено, что IgG снижает количество «активных» розеткообразующих клеток на 41,5%, «общих» - на 40,5% (р < 0 05). что имеет соответствующее физиологическое объяснение, как предупреждение гиперергических реакций. Однако совместное применение ПО и IgG отменяет эффект действия IgG и активация розеткообразующих клеток увеличивается на 15-17% (р>0,05) (табл. 5).

По нашим предположениям, молекула или агрегаты иммуноглобу -лина взаимодействуют с лимфоцитом, за счет специфических рецепторов (CD32, CD16) (Ярилин A.A., Добротина H.A., 1997) или неспецифических взаимодействий, стерически закрывая рецепторы для клеток мишеней, либо вызывает изменения мембраны лимфоцита, приводящие к снижению функциональной способности CD2 антигена к взаимодействию с CD58 молекулой на поверхности эритроцита.

Таблица 5

Совместное влияние полиоксидония и иммноглобулина G на иммунные реакции (М±ш, п=10)

Препарат, мкг/мл Е-РОК,% Количество 1

«активные» «общие» клеток адгезии. % '

К 100 100 100

IgG (16000) 58,42±6,8* 59,5±4,5* 76,4±9,1 1

ПО (10) 130,0110,52* 137,6±4,2* 140,2±9,1*

IgG (1600)Н"Ю( 10) 114,7±12,6 116,8±8,9 131,1±15,2*

• - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).

Подтверждением результатов, полученных нами при изучении влияния IgG на розеткообразование, служат данные, свидетельствующие о снижении способности мононуклеарных клеток крови к адгезии на синтетическом носителе (на 23,6%). При совместном использовании ПО с IgG активация лимфоцитов увеличивается в сравнении с контролем (без препарата) на 31% (р<0.05) (табл.5).

Одной из задач работы являлось изучение совместного влияния препаратов ПО и Alb на иммунные реакции. В связи с этим мы провели исследование воздействия различных концентраций коммерческого альбумина, близких к физиологическим на функциональное состояние отдельных звеньев системы иммунитета в условиях in vitro.

В результате экспериментов показано, что альбумин снижает уровень Е-РОК и адгезивные свойства мононуклеарных клеток крови. Под действием альбумина обнаружена тенденция к снижению активности системы комплемента, не установлено его влияния на уровень ЦИК.

Таблица 6

Совместное действие полиоксидония и альбумина на иммунные реакции (М±ш, п=10)

Препарат, мкг/мл Е-РОК,% Количество клеток адгезии, %

«активные» «общие»

К 100 100 100

ПО 138,7±8,3* 122,9±3,1* 135,8±14,8*

Alb 93,5±6,2 86,8±7,9* 86,8±10,3

Alb+ПО 118,4+11,9 102,5±8,2 119,7±10,3

* - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).

Следует предположить, что снижение количества РОК в присутствии альбумина происходит, как и в случае с Ig, из-за экранирования прикрепившимся альбумином рецепторов межклеточного взаимодействия Эти данные о влиянии альбумина на розеткообразование и адгезию мононуклеаров наводят на предположение о сдерживающем характере действия альбумина на активацию иммунной системы и его ограничивающей роли в условиях in vivo.

Как и в случае с другими нативными препаратами, при совместном использовании ПО и Alb наблюдается эффект суммации действия препаратов, стимулирующее действие ПО и ингибирующее влияние альбумина на иммунокомпетентные клетки в сумме вызывают тенденцию к повышению количества розеткообразующих и адгезированных клеток в реакциях РО и адгезии соответственно (табл. 6).

Обобщая результаты исследований, можно заключить, что в модельной системе in vitro получены новые данные по действию иммуно-модулятора ПО на клетки иммунной системы и факторы неспецифической резистентности не только в норме, но и при патологии (ожоговая травма).

Принципиальное значение имеет исследование действия ПО совместно с нативными белковыми препаратами сыворотки крови. Полеченные данные раскрывают новые механизмы действия препаратов ра!-личного происхождения и имеют научно-практическое значение

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах in vitro на популяции лимфоцитов, выделенных и i крови человека, установлено отсутствие повреждающего токсического эффекта ПО; доказана выраженная иммуномодулирующая активность ПО в изучаемой системе.

2. Выявлено стимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие иммунных клеток (в реакциях розеткообразования I-лимфоцитов и адгезии мононуклеаров) и систему комплемента. Отмечено снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО.

3. В модельной системе in vitro на клетках крови пациентов с термической травмой показано стимулирующее действие ПО на клеточные реакции и неспецифическую резистентность. Выявлено дозозависи-мое влияние ПО на уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке ожоговых больных.

4. Обнаружена зависимость влияния ПО на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте от используемой дозы препарата и тяжести состояния ожоговых больных. Фагоцитарно-бактерицидная способность нейтрофилов в отношении микробных клеток увеличивается независимо от используемой дозы ПО и площади ожога.

5. Установлено более эффективное совместное действие препаратов ПО с церулоплазмином, гамма-глобулином и альбумином на кооперативные свойства иммунокомпетентных клеток, чем действие отдельных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Добротина, H.A. Иммунитет и здоровье, современные аспекты ' H.A. Добротина, Ж.А. Казацкая, A.A. Бабаев, М.В. Прохорова. Е.А. Гостюжова // Экологическая и промышленная безопасность ■ тез. докл. III сессии молодежной школы-семинара. - Саров, 2003. -

С. 18-19.

2. Казацкая, Ж.А. Современные проблемы нормализации иммунитета, значение в терапии и профилактике / Ж.А. Казацкая, A.A. Бабаев, М.В. Прохорова, Е.А. Гостюжова, H.A. Добротина // Вестник ННГУ. Сер. Инновации в образовании. - 2003. - С. 258-261.

3. Кравченко, Г.А. Физиолого-иммунологическое обоснование применения натуральных биологических активных добавок (ферментных препаратов) / Г.А. Кравченко, М.В. Прохорова, H.A. Добро-тина // Сб. материалов межд. конф. молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям...». - Тверь, 2002. -

Вып. 2. - С.27-28. 11

4. Прохорова, М. В. Иммуномодулятор полиоксидоний и белки крови в системе иммунологических реакций in vitro / М. В. Прохорова, « Ж. А. Казацкая // Актуальные проблемы медицины и биологии. -

2004. - Вып. 3. - С. 306.

5. Прохорова, М.В. Механизмы регуляторноЙ активности некоторых иммуномодуляторов в системе крови человека in vitro / М.В. Прохорова, Е.А. Гостюжова, Е.С. Васильева // Тез. докл. 8-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущине. - 2004. - С. 126.

6. Прохорова, М.В. Механизмы активности некоторых современных иммуномодуляторов / М.В. Прохорова, Е.А. Гостюжова // Тез. докл. IX нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). - Н. Новгород. - 2004. - С. 230 - 231.

7. Добротина, Н. А. Характеристика активности полиоксидония в системе иммунологических реакций in vitro / Н. А. Добротина, М. В. Прохорова, Ж. А. Казацкая // Иммунология. - 2005. - №.3. -С.

152- 156. ¡*

4

Подписано в печать 19.10.2005. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 1396. Тир. 100.

Типография Нижегородского госуниверситета. Лиц. ПД № 18-0099 от 04.05.2001. 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

№20570

РНБ Русский фонд

2006-4 22084

Г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прохорова, Марина Владимировна

• Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Современные проблемы иммунокоррекции.

1.1.1. Иммунодефицитные состояния: формы, механизмы, принципы терапии.

1.1.2. Основы иммунокоррекции.

1.1.3. Различные подходы к классификации иммуномодуляторов и механизмы их действия.

1.2. Характеристика некоторых биологически активных препаратов.

1.2.1. Биологическая роль церулоплазмина, альбумина, иммуноглобулина G; возможности клинического применения.

1.2.2. Синтетический иммуномодулятор полиоксидоний (ПО).

1.2.2.1 .Основы синтеза и свойства ПО.

1.2.2.2 Механизм иммунотропного действия ПО.

1.2.2.3. Клинические аспекты применения ПО.

1.3. Некоторые показатели иммунного гомеостаза.

1.3.1. Адгезивность.

1.3.2 Образование иммунных комплексов.

1.3.3. Активность комплемента.

1.3.4. Окислительно-восстановительная активность фагоцитов.

1.3.5. Фагоцитарно-бактерицидная функция фагоцитов.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты работы и их обсуждение.

3.1. Воздействие ПО на иммунологические реакции.

3.1.1. Определение физиологических и цитотоксических концентраций ПО.

3.1.2. Влияние ПО на спонтанное розеткообразование Тлимфоцитов доноров.

3.1.3. Действие ПО на адгезивность мононуклеарных клеток доноров к синтетическому носителю.

3.1.4. Влияние препарата ПО на классический путь активации системы комплемента.

3.1.5. Воздействие ПО на циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК).

3.1.6. Влияние ПО на активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

3.2. Действие ПО на реакции клеточного иммунитета и неспецифической резистентности у пациентов с термической травмой.

3.2.1. Влияние ПО на розеткообразующую способность Т-лимфоцитов ожоговых больных и доноров.

3.2.2. Действие ПО на уровень циркулирующих иммунных комплексов.

3.2.3. Воздействие ПО на функциональную активность нейтрофилов пациентов с термической травмой.

3.2.4. Влияние ПО на фагоцитарную активность нейтрофилов у ожоговых больных.

3.3. Препараты белков сыворотки крови человека.

3.3.1. Возможности использования церулоплазмина (Ср) как иммуномодулятора.

3.3.1.1. Влияние Ср на кооперативные свойства Т-лимфоцитов (в тесте розеткообразования и адгезии) и факторы неспецифической резистентности.

3.3.1.2. Исследование совместного действия ПО и Ср на иммунные реакции (возможности использования в практической иммунокоррекции).

3.3.2.1. Воздействие препарата иммуноглобулина (IgG) на показатели состояния иммунной системы в условиях in vitro.

3.3.2.2. Комплексное влияние препаратов ПО и IgG на иммунные реакции.

3.3.3.1. Влияние альбумина (Alb) на реакции клеточного иммунитета и неспецифической резистентности.

3.3.3.2. Эффекты совместного действия Alb и ПО.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ иммунотропной активности полиоксидония и белковых препаратов крови в системе in vitro"

Актуальность проблемы

Последние десятилетия характеризуются интенсивным поиском новых иммуномодулирующих средств, причем особый интерес исследователей вызывают химически синтезированные препараты.

В медицинской практике большое внимание уделяется новому химически синтезированному высокомолекулярному иммуномодулятору - полиоксидонию (ПО), который обладает широким спектром фармакологического действия (Петров Р.В., Кабанов В.А., 2002). ПО - оригинальный отечественный препарат, не имеющий аналогов в мире. Впервые синтезирован д.х.н. профессором А.В. Некрасовым и разработан в государственном научном центре Институте иммунологии МЗ РФ, Москва. ПО является одним из наиболее эффективных препаратов для стимуляции иммунной системы. Лечение многих хронических заболеваний становится более результативным при активации иммунитета больного с помощью ПО в комплексе с терапией основного заболевания. В настоящее время действие ПО in vivo является достаточно изученным, именно поэтому ПО широко применяется в клинической практике (Дьяконова В.А. и др., 2002; Дамбаева С.В. и др., 2000). Однако неисследованными остаются аспекты функционального взаимодействия ПО с белками крови, которые обладают специфической и параспецифической физиологической иммуномодулирующей активностью.

В связи с этим целью настоящей работы является изучение физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуляторов различного происхождения (химически синтезированного ПО и белковых препаратов крови человека) на клеточные реакции и факторы неспецифической резистентности в условиях in vitro.

В соответствии с целью определены следующие задачи:

1. • Исследование действия синтетического иммуномодулятора • ПО на иммунологические реакции и факторы неспецифической резистентности организма человека in vitro, а также определение границ физиологического и цитотоксического действия на выделенные клетки.

2. Изучение действия ПО на иммунологические показатели клеточных реакций и факторы неспецифической резистентности организма человека при ожоговой интоксикации.

3. Выяснение эффектов воздействия церулоплазмина (Ср), гамма-глобулина (IgG) и альбумина (Alb) на иммунологические реакции и показатели неспецифической резистентности in vitro.

4. Изучение совместного влияния препаратов различного происхождения (ПО и Ср, ПО и IgG, ПО и Alb) на функциональную активность лимфоцитов периферической крови человека и неспецифическую резистентность in vitro.

Новизна научных исследований ф

• Проведенные исследования позволили установить стимулирующее влияние ПО в системе in vitro на иммунокомпетентные клетки (ИКК), снижение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), причем мелкодисперсных (повреждающих); выявлена умеренная стимуляция системы комплемента; установлен дозозависимый антиоксидантный эффект ПО на процессы ПОЛ в сыворотке крови.

• Показано действие ПО in vitro на иммунологические реакции крови пациентов с термической травмой как модели воспалительной и интоксикационной патологии.

• Впервые получены данные о комплексном влиянии препаратов различного происхождения (эндогенных и химически чистых) на иммунологические реакции.

Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что получены дополнительные данные, • обосновывающие применение ПО в качестве иммуномодулятора.

Показана принципиальная возможность комплексного использования препаратов различного происхождения с целью повышения эффективности этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

• На выделенной из крови человека популяции лимфоцитов в экспериментах in vitro определены физиологически действующие, не повреждающие концентрации ПО и доказана его иммуномодулирующая активность.

• Выявлено иммуностимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие (ИКК), обеспечивающее реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров. Установлено активирующее влияние ПО на систему комплемента и снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО в » . ч условиях in vitro.

• Установлено, что стимулирующее воздействие ПО на иммунологические реакции и неспецифическую резистентность сохраняется при использовании с нативными иммуномодуляторами (Ср, IgG, Alb).

• В экспериментах in vitro доказана обоснованность применения ПО при ожоговой интоксикации в ряде случаев.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Основные положения диссертации обсуждены на

• III сессии молодежной школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003),

• 8-й Международной Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2004),

• Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям.» (Тверь, 2002.),

• IX нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2004),

• XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 158 источников, из которых 30 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Прохорова, Марина Владимировна

109 ВЫВОДЫ

1. В экспериментах in vitro на популяции лимфоцитов, выделенных из крови человека, установлено отсутствие повреждающего токсического эффекта ПО; доказана выраженная иммуномодулирующая активность ПО в изучаемой системе.

2. Выявлено стимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие иммунных клеток (в реакциях розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезии мононуклеаров) и систему комплемента. Отмечено снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО.

3. В модельной системе in vitro на клетках крови пациентов с термической травмой показано стимулирующее действие ПО на клеточные реакции и неспецифическую резистентность. Выявлено дозозависимое влияние ПО на уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке ожоговых больных.

4. Обнаружена зависимость влияния ПО на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте от используемой дозы препарата и тяжести состояния ожоговых больных. Фагоцитарно-бактерицидная способность нейтрофилов в отношении микробных клеток увеличивается независимо от используемой дозы ПО и площади ожога.

5. Обнаружено более эффективное совместное действие препаратов ПО с церулоплазмином, гамма-глобулином и альбумином на кооперативные свойства иммунокомпетентных клеток, чем действие отдельных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной предпосылкой данной работы явилась недостаточная изученность клеточно-молекулярных механизмов действия ПО на функционирование клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что действие ПО in vivo является достаточно исследованным, именно поэтому ПО широко применяется в клинической практике. Неизученным также остается эффект совместного воздействия ПО с другими препаратами на иммунологические реакции.

В связи с этим цель настоящей работы определена как изучение влияния препарата ПО на иммунологические реакции in vitro в норме и при патологии, а также исследование физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуляторов различного происхождения (химически синтезированного ПО и белковых препаратов) на клеточные реакции и факторы неспецифической резистентности в условиях in vitro.

Для достижения указанной цели было изучено действие препарата ПО отдельно и в комплексе с белками крови на некоторые показатели адаптивного иммунного ответа и факторы неспецифической резистентности.

Первым этапом настоящей работы явилось исследование влияния ПО на кооперативное взаимодействие иммунокомпетентных клеток крови человека, обеспечивающее реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров in vitro.

Изучение влияния ПО на экспрессию рецепторов контактного взаимодействия мононуклеарных клеток периферической крови человека in vitro был проведен нами с помощью теста спонтанного розеткообразования.

Используя тест спонтанного розеткообразования, мы провели исследование влияния ПО на количественное содержание как «активных», так и «общих» Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) доноров в условиях in vitro.

Изменение количества Е-розеткообразующих Т-лимфоцитов может служить показателем уменьшения либо увеличения уровня экспрессии CD2 антигена. Наряду с другими методами тест спонтанного розеткообразования может быть использован в качестве модели для оценки воздействия различных соединений на уровень экспрессии Т-лимфоцитами молекулы адгезии CD2 (Макарков А.И. и др., 1997). Показано, что во всех исследованных концентрациях ПО обладает эффективным стимулирующим действием на формирование как «активных», так и «общих» Е-РОК.

С целью выяснения механизмов нарастания розеткообразующей активности Т-лимфоцитов, были изучены адгезивные свойства иммунокомпетентных клеток. Данное исследование было проведено нами в условиях in vitro с помощью стандартизованной модельной системы, предусматривающей взаимодействие с синтетическим волокном популяции выделенных и отмытых от плазмы крови клеток. Синтетическое волокно применяли с целью моделирования физиологических процессов межклеточных взаимодействий во время иммунного ответа (Arnold L. et al., 1974).

Нами установлено стимулирующее действие ПО на адгезивную способность популяции мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови доноров во всех исследованных концентрациях препарата.

Сравнивая результаты, полученные с помощью тестов розеткообразования и адгезии, можно заключить, что изменения иммунологических показателей носили однонаправленный характер. То есть, по крайней мере, часть эффекта, состоящего в увеличении процента прилипающих к синтетическому волокну мононуклеарных клеток доноров под влиянием препарата ПО можно объяснить повышением экспрессии молекулы CD2, показателем которого служит увеличение количества Е-розеткообразующих лимфоцитов.

Следующим этапом работы явилось изучение влияния ПО на один из факторов неспецифической резистентности организма - систему комплемента. В диапазоне исследованных концентраций препарата не обнаружено дозозависимого эффекта; активность системы комплемента повысилась на 10-22% в сравнении с контролем, что, вероятно, может быть взаимосвязано со способностью заряженных групп макромолекулы ПО взаимодействовать с активным центром компонентов комплемента, стимулируя, таким образом, протекание следующих протеолитических процессов.

В дальнейшем было исследовано влияние ПО на реакции образования ЦИК. В результате экспериментов нами выявлено стабильное снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО во всех исследованных концентрациях. Возможно, это взаимосвязано со способностью полярных групп молекул ПО изменять комплексообразование ЦИК. Фактически это коррелирует с детоксицирующим эффектом ПО.

Наряду с иммуномодулирующим и детоксицирующим эффектом ПО в системе in vitro нами были исследованы антиоксидантные свойства с помощью метода оценки активности ПОЛ. В результате проведенных экспериментов установлено дозозависимое действие ПО на общую антиоксидантную активность и потенциальную способность системы к ПОЛ.

В то же время представляло интерес исследовать воздействие ПО на некоторые иммунологические реакции в условиях нарушенного иммунного статуса и эндоинтоксикации. Одним из ярких примеров патологии, сопровождающейся дисбалансом иммунных реакций, является ожоговая болезнь. Кроме того, при ожоговой болезни развивается ее характерный патогномичный синдром - эндоинтоксикация, отражающая тяжесть, остроту заболевания и определяющий различные висцеропатии

Турсунов Б.С. и др. 1992).

С помощью теста спонтанного розеткообразования нами было исследовано воздействие ПО на формирование «активных» и «общих» Е-РОК лимфоцитами периферической крови ожоговых больных, дающее возможность судить об изменении экспрессии молекулы адгезии CD2. Нами было выявлено стимулирующее действие ПО на розеткообразующие свойства Т-лимфоцитов крови пациентов с термической травмой, которое оказалось достоверно выше, чем у доноров.

Одним из этапов работы было исследовано влияние ПО на реакции образования ЦИК в сыворотке пациентов с термической травмой. Установлено дозозависимое действие ПО на уровень ЦИК в сыворотке ожоговых больных.

При исследовании влияния ПО на нейтрофилы периферической крови ожоговых больных обнаружено, что ПО не оказывает цитотоксического действия в изучаемой модельной системе. Установлено, что влияние ПО на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте зависит от используемой дозы препарата и тяжести состояния ожоговых больных. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови пациентов с ожогом менее 30 % поверхности тела под влиянием ПО в концентрации до 100 мкг/мл снижалась, а под действием концентрации 500 мкг/мл - повышалась. У пациентов с ожогом более 30 % поверхности тела функциональная активность нейтрофилов периферической крови под действием всех исследуемых концентраций ПО достоверно повышалась. Показано, что под влиянием ПО фагоцитарно-бактерицидная способность нейтрофилов в отношении микробных клеток увеличивается независимо от используемой дозы препарата и площади ожога.

Одной из задач настоящего исследования явилось изучение эффектов совместного воздействия ПО с белками сыворотки крови на иммунологические реакции in vitro.

В результате проведённых экспериментов была обнаружена более выраженная стимуляция клеточных реакций (розеткообразования и адгезии) при совместном действии ПО и Ср по сравнению с отдельно взятыми препаратами.

Одним из этапов исследования ПО и Ср на иммунологические реакции было изучение их действия на мелкодисперсные и крупнодисперсные иммунные комплексы. Установлено, что отдельно взятые препараты ПО и Ср и при их совместном использовании однонаправлено влияют на уровень ИК: значительно снижают содержание мелкодисперсных ИК, уровень крупнодисперсных ЦИК снижается незначительно под действием всех исследованных концентраций. Это еще раз подчеркивает значение адаптационного эффекта действия исследованных препаратов, учитывая, что патофизиологическое влияние мелко- и крупнодисперсных ЦИК различно.

Комплексное воздействие ПО с IgG и Alb на иммунные реакции характеризовалось суммирующим эффектом, учитывая, что ПО оказывает стимулирующего влияние на изучаемые реакции, a IgG и Alb, -сдерживающее. Мы предполагаем, что снижение стимулирующего эффекта ПО при совместном использовании с IgG происходит вследствие рецепторных взаимодействий молекул IgG с лимфоцитом, уменьшающих (стерически) свободную для контакта с молекулой ПО поверхность клетки. В случае с Alb, возможно, происходит адсорбирование ПО молекулами Alb, что приводит к снижению концентрации ПО, поскольку в условиях in vivo Alb обладает выраженной комплексирующей и адсорбционной функцией.

Обобщая результаты исследований, можно заключить, что в модельной системе in vitro получены новые данные по действию иммуномодулятора ПО на клетки иммунной системы и факторы неспецифической резистентности не только в норме, но и при патологии (ожоговая травма).

Принципиальное значение имеет исследование действия ПО совместно с белковыми препаратами сыворотки крови. Полученные данные раскрывают новые механизмы действия препаратов различного происхождения и имеют научно-практическое значение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохорова, Марина Владимировна, Нижний Новгород

1. Коррекция иммунологических нарушений у больных с панкреонекрозом / В. Л. Аверкиев, В. С. Тарасенко, Т. В. Латышева и др. // Иммунология. 2002. - № 6. - С. 356 - 359.

2. Александров А.В. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии 1С AM / А.В. Александров, A.M. Джексон, А.Г. Румянцев // Иммунология. 1997. - № 1. - С. 4-11.

3. Апиханов, Х.А. Современное комбинированное лечение сепсиса / Х.А. Алиханов, А.И. Хрипун, И.Н. Хуторянский // Тез. докл. V Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М. -1998.-С. 10.

4. Асельродова, А.Ш. Иммунопротекторный эффект церулоплазмина в остром периоде у больных, перенесших критические состояния различного генеза / А.Ш. Асельродова // Анастезиология и реанематология. -1992. №2. - С. 43-45.

5. Иммуномодулятор полиоксидоний в комплексной терапии больных туберкулезом легких / С. С. Аршинова, Б. В. Пинегин, В. А. Стаханов и др. //Иммунология. -2001. -№ 3.-С. 35-40.

6. Беляков, Н.А. Эндогенные интоксикации и лимфатическая система / Н.А. Беляков // Эфферент. терапия 1998. - №2. - С. 10-17.

7. Антиоксидантное и иммуномодулирующее воздействие церулоплазмина при экспериментальной гриппозной инфекции / Н.К. Берлинских, З.Д. Савцова, О.Л. Санина и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1994. - Т. 118. - №9. - С.285-287.

8. Боценовский, B.A. Молекулы клеточной адгезии человека / В.А. Боценовский, А.Ю. Барышников // Успехи современной биологии. -1994. Т. 114. - Вып.6. - С.741-753.

9. Вавилова, JI.M. Система комплемента. Механизмы активации и регуляции, значение в биологии и медицине / JI.M. Вавилова, Т.В. Голосова // Итоги науки и техники. Иммунология. 1990. - Т.24. -С.12-16.

10. Величковский, Б.Т. Свободно-радикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации организма к факторам окружающей среды / Б.Т. Величковский // Вестн. Акад. мед. наук. -2001-№9. С. 45-52.

11. Вершигора, А.Е. Основы иммунологии / А.Е. Вершигора. — Киев: Вища школа, 1980. 504 с.

12. Веретенникова, Н.И. Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторов / Н.И. Веретенникова Рига: Зинатне. 1990.-322с.

13. Вельбри, С.К. Одновременная оценка уровня иммунных комплексов и иммуноглобулинов для характеристики патологического процесса / С.К. Вельбри, A.JI. Лиллеорг, С.Л. Линдстрем // Лабораторное дело. — 1987.-№5. —С.7- 11.

14. Воложин, А.И. Иммунитет, типовая форма его нарушения и принципы коррекции / А.И. Воложин, Т.И. Сашкина, З.И. Савченко. М.: Моск. мед. стомат. ин-т им. Н.А. Семашко. - 1997. - 100 с.

15. Влияние полиоксидония на уровень интоксикации у ожоговых больных / Н.А. Гординская, С.И. Пылаева, В.Г. Сидоркин и др. // Иммунология. 2002. - №6. - С.363-365.

16. Иммунонлогическая и клиническая эффективность применения полиоксидония в терапии сосудистых осложнений диабета / Т.И. Гришина, А.В. Жданов, А.В. Хаев и др. // Тез. докл. II съезд иммунологов России, Сочи. 1999. - 262 с.

17. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров Дамбаева С.В., Мазуров Д.В., Голубева Н.М. и др. // Иммунология. -2000.-№6.-С. 15-20.

18. Добротина, Н.А. Эндоинтоксикация организма человека: методологические и методические аспекты / Н.А. Добротина, Т.В. Копытова. — Н.Новгород, 2004. 63с.

19. Долгушин, И.И. Иммунология травмы / И.И. Долгушин, Л .Я. Эберт, Р.И. Лифшиц. Свердловск, 1989. - 187с.

20. Дударев, И.В. Эффективность полиоксидония в экстракорпоральной терапии сепсиса у больных с врожденными пороками сердца / И.В. Дударев, Л.П. Сизякина, А.А. Дюжиков // Иммунология. 2002. - №6. - С.353-356.

21. Изучение взаимодействия полиоксидония с клетками иммунной системы с помощью проточной цитофлюориметрии / В.А. Дьяконова, С.В. Климова, В.В. Кулаков и др. // Иммунология. 2002. - №6. -С.334-337.

22. Жданова, Л.И. Противовирусная эффективность иммуноглобулина и виферона у детей с врожденными пороками сердца / Л.И. Жданова,

23. JI.С. Лозовская, В.А. Тоболин // Тез. докл. IV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М. 1997. - С. 219.

24. Земсков, A.M. Доступные методы оценки и коррекции иммунных нарушений у больных / A.M. Земсков, В.М. Земсков, В.И. Золоедов // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 3. - С. 3 - 4.

25. Синдром вторичной иммунной недостаточности (протоколы диагностики) / Н. И. Ильина, Т. И. Латышева, Б. В. Пинегин и др. // Иммунология. 2000. - № 5. - С. 8 - 9.

26. Исследование иммуностимулирующей активности комплекса веществ мурамилпептидной природы в опытах in vivo и in vitro / А.Н. Ильинская, Л.В. Пичугина, В.В. Кулаков // Иммунология. 2004. - № 5.-С. 271-275.

27. Исрафилов, А.Г. Получение церулоплазмина из отходов производства препаратов крови: Автореф. дис.канд. мед. наук / А.Г. Исрафилов. -Уфа. 1993.-22с.

28. Истамов, Х.И. Экологические аспекты биологического действия ксенобиотиков / Х.И Истамов. Пермь, 1994. - 206 с.

29. Караулов, А.В. Иммунотерапия и иммунореабилитация в клинике внутренних болезней / А.В. Караулов // Тез. докл. II съезд иммунологов России, Сочи. 1999. - С. 209 - 210.

30. Кетлинский, С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев, А.А. Воробьев. СПБ. Гиппократ, 1992.

31. Опыт клинического применения иммуномодулятора полиоксидония у детей с лимфомой Ходжкина и гистиоцитозом из клеток Лангерганса / А.В. Киселев, Г.А. Гордина, В.В. Ильяшенко и др. // Иммунология. -2002. №6. - С.370-372.

32. Иммуномодулирующая реактивность организма в условиях естественного дефицита цинка / Р.В. Ковальчук, В. Л. Сусликов, Л.М. Карзакова // Иммунология. 2004. - №6. - С. 336-369.

33. Полиоксидоний в комплексной терапии рецидивирующих инфекций урогенитального тракта / М.Х. Коджаева, Н.М. Подзолкова, А.В. Кулаков и др. // Иммунология. 2002. - №6. - С. 376-379.

34. Козлов, JI.B. Белки системы комплемента: активация и регуляция / JI.B. Козлов // Иммунология. 1997. - № 2. - С. 8 - 13.

35. Константинова, Н.А. Иммунные комплексы и повреждение тканей / Н.А. Константинова. М.: Медицина, 1996. - 256 с.

36. Копытова, Т.В. Информационное значение показателей гуморального гомеостаза при различных формах ИБС: Дис. канд. биол. наук: / Т.В. Копытова. Н. Новгород. 1991. - 186 с.

37. Иммуномодулирующие и микробицидные эффекты полиоксидония в терапии ВИЧ-инфекции / Т.Н. Кузина, Л.П. Сизякина, И.И. Андреева и др. // Иммунология. 2002. - № 6. - С. 346-349.

38. Кульберг, А .Я. Сывороточный иммуноглобулин как ингибитор лектинов: новый подход к изучению функционального взаимодействия факторов естественного и приобретенного иммунитета / А.Я. Кульберг, Ю.Б. Беркун // Иммунология. 1998. - № 2.-С. 26-30.

39. Лазарева, Д. Н. Стимуляторы иммунитета / Д. Н. Лазарева, Е. К. Алехин. М.: Медицина, 1985. - 256 с.

40. Ларский, Э.Г. Методы определения и метаболизм металлобелковых комплексов / Э.Г. Ларский. Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. - М.: ВИНИТИ, 1990. - Т.41- 198с.

41. Лесков, В.П. Клиническая иммунология для врачей / В.П. Лесков, Л.Н. Чередеев, Н.К. Горлина. Фармарус Принт, 1997. - 120 с.

42. Литман, Г. Иммуноглобулины / Г. Литман, Р. Гуд. М.:Мир. 1981. -495с.

43. Луйк, А.И. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов / А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук. М.:Медицина. 1984. - 224с.

44. Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической практике / Л. В. Лусс, А. В. Некрасов, Н. Г. Пучкова и др. // Иммунология. -2000.-№5.-С. 34-39.

45. Ляпон, А.О. Комплексный анализ Т-лимфоцитов в тесте розеткообразования / А.О. Ляпон // Лаб. дело. 1980. - №1. - с.21 -22.

46. Макарков, А.И. Механизмы регуляции экспрессии поверхностных структур дифференцированного лимфоцита / А.И. Макарков, Г.В. Порядин, Ж.М. Салмаси // Иммунология. 1997. - №3. - С. 4-8.

47. Малахова, М.Я. Эндогенная интоксикация как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме / М.Я. Малахова // Эфферент. терапия. 2000. — №4. - С. 3-14.

48. Мальева, Л. Простой метод выделения лимфоцитов из периферической крови человека / Л. Мальева, Х.В. Диас, А. Гонсалес-Гриего //Лаб. дело. 1979. - №1. - с. 7 - 9.

49. Манько, В. М. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы / В. М. Манько, Р. В. Петров, Р. М. Хаитов // Иммунология. 2002. - № 3. - С. 132 - 138.

50. Матвеев, Н.А. Медицинские проблемы экологии / Н.А. Матвеев. Н. Новгород, 1992. - 172 с.

51. Матусис З.Е. К методике определения индекса завершенности фаноцитоза / З.Е. Матусис, С.И. Пылаева // Лаб. дело. 1972. - №4. -С.237-240.

52. Машковский, М. Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей / М. Д. Машковский. М.: Медицина, 1993. - Ч. 2. - С. 192 - 209.

53. Характеристика функциональной активности нейтрофилов крови человека с помощью реакции восстановления нитросинего тетразолия / Маянский А.Н., Виксман М.Е., Котельников П.Н. и др. // Микробиология. 1977. - № 6. - С. 108 - 110.

54. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука. 1983. - 340с.

55. Маянский, А.Н. Клинические аспекты фагоцитоза / А.Н. Маянский, О.И. Пикуза. Казань. 1993. -135с.

56. Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков. М.: Медицина, 1987. - 365 с.

57. Активность церулоплазмина сыворотки крови при прогрессирующих заболеваниях центральной нервной системы / Т.И. Мжельская, И.А. Завалишин, И.А. Иванова-Смоленская и др. // Лаб. дело. 1989. -№11.-С.12-16.

58. Михайлова, А.А. Индивидуальные миелопептиды — лекарства «нового поколения», используемые для иммунореабилитации / А.А. Михайлова // Int. Iwunoreabil. 1996. - №2. - С. 27-31.

59. Мотавкина, Н.С., Микрометод определения комплементарной активности сыворотки и др. биологических жидкостей / Н.С. Мотавкина, Б.Н. Ковалев, А.С. Шаронов //Лаб. дело. 1980. - №1. - с. 433-434.

60. Мушкамбаров, Н.Н Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов / Н.Н. Мушкамбаров, С.Л. Кузнецов. -М.:МИА. 2003.-535с.

61. Насонов, Е.Л. Иммунные комплексы при ревматических заболеваниях / Е.Л. Насонов // Итоги науки и техники. Иммунология. 1981. -T.l 1. -С. 104-144.

62. Некрасов, А.В. Механизм катионной полимеризации азотсодержащих циклов: Авторев. дис.канд. хим. наук: 02.00.08 / А.В. Некрасов М., 1971.

63. Некрасов, А.В. Химические аспекты создания полиоксидония / А.В. Некрасов, Н.Г. Пучкова, С.А. Иванова // Иммунология. 2000. - №5. -С.9-16.

64. Некрасов, А.В. Полиоксидоний: основы синтеза и свойства / А.В. Некрасов, Н.Г. Пучкова // Иммунология. 2002. - №6. - С.329-334.

65. Нейфах, С.А. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых бежов / С.А. Нейфах, В.Б. Васильев, М.М. Шавловский // Успехи биол. химии. —1988. Т. 28. - С. 102-123.

66. Нестерова, И.В. Программа иммунореабилитации больных вторичными иммунодефицитами / И.В. Нестерова // Int. Immunorehabil. 1991. - №9. - С.40-46.

67. Нестерова, И.В. Современная иммунотерапия в клинической медицине: возможности и перспективы / И.В. Нестерова // Тез. докл. II съезд иммунологов России, Сочи. 1999. - С. 229.

68. Николаев, А.И. Подавление и стимуляция иммунитета лекарственными препаратами / А.И. Николаев, О.А. Федоренко. -Ташкент: Медицина. 1984. 224с.

69. Осипов, С.Г. Методы определения циркулирующих иммунных комплексов / С.Г. Осипов, В.В. Еремеев, В.И. Руднев // Лаб. дело. -1983. -№11. с. 3-8.

70. Пальцев, М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. М.: Медицина. 1995. - 224с.

71. Петров, Р. В. Я или не я. Иммунологические мобили / Р. В. Петров-М., 1987.

72. Петров, Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. М.: Медицина, 1987. - 414 с.

73. Петров, Р.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. -1994.-№6.-С. 6-10.

74. Петров, Р.В. Иммунодиагностика иммунодефицитов / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1997. - № 4. - С. 4 - 7.

75. Петров, Р.В. Полиоксидоний иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, А.В. Некрасов // Алл. аст. и клин, иммунол. -1999. -№3.- с. 3-6.

76. Петров, Р.В. Полиоксидоний препарат нового поколения иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, А.В. Некрасов // Иммунология. - 2000. -№5.-с. 24-28.

77. Конъюгированные полимер-субъединичные иммуногены и вакцины / Р.В. Петров, В.А. Кабанов, P.M. Хаитов и др. // Иммунология. 2002. - №6. - С.324-329.

78. Пинегин, Б.В. Иммунодефицитные состояния: возможности применения иммуномодуляторов / Б.В. Пинегин // Леч. Врач. 2001. №3. - С. 35-37.

79. Плате, Н.А. Физиологически активные полимеры / Платэ Н.А., Васильев А.Е. М., 1986.

80. Плейфер, Дж. Наглядная иммунология / Дж. Плейфер М.: ГЭОТАР Медицина. 1998.-96с.

81. Пономарева, A.M. Иммунобиологические препараты: сб. науч. трудов / А.М. Пономарева, В.А. Алешкин, М.Н. Розина. М., 1989. - 190с.

82. Взаимодействие церулоплазмина с рецептором плазматической мембраны клеток CV-1 и его регуляция по типу обратной связи / Л.В. Пучкова, Л.К. Сасина, Т.Д. Алейникова и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1995. - Т.119. - №4. - С.417-420.

83. Реконструирование пути межклеточного переноса пептидной части молекулы церулоплазмина в организме млекопитающих / Л.В. Пучкова, Л.К. Сасина, Т.Д. Алейникова и др. // Биохимия. 1997. -Т.62. -№7. — С.817-825.

84. Романова, А. В. Применение полиоксидония в комплексной терапии больных с тяжелой формой бронхиальной астмы / А. В. Романова, Т.

85. B. Латышева // Иммунология. 2002. - № 6. - С. 372 - 376.

86. Ройт, А. Основы иммунологии / А. Ройт. М.: Мир, 1991. - 327с.

87. Русанов, В. М. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови / В. М. Русанов, Л. И. Скобелев. — М.Медицина. 1983.-224с.

88. Рутницкий, А.Ю. Роль церулоплазмина в регуляции функционального состояния отдельных звеньев иммунитета: Дис.канд. биол. наук: 03.00.13, 14.00.36 / А.Ю. Рутницкий. Н. Новгород. 2001. - 125 с.

89. Самсыгина, Г.А. Иммунокоррегирующая терапия тяжелых форм кандидоза новорожденных / Г.А. Самсыгина // Тез. докл. IV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», М. -1997.-С. 233.

90. Санина, О.Л. Биологическая роль церулоплазминаи возможности его клинического применения / О.Л. Санина, Н.К. Берлинских // Вопр. мед. химии. -1986. Т.32. - №5. - С7-14.

91. Сараф, А.С. Перспектива применения нового отечественного иммуномодулятора полиоксидония в комплексном лечении офтальмохламидиоза / А.С. Сараф, С.А. Борзенок, А.В. Некрасов // Тез. докл. II съезд иммунологов России, Сочи. 1999. - С. 156.

92. Села, М. Перспективы биоорганической химии и молекулярной биологии / М. Села. М.: Наука, 1986. - С. 287-290.

93. Сепиашвили, Р.И. Иммунореабилитация: определение и современная концепция / Р.И. Сепиашвили // Int. Immunorehabil. 1998. - №10.1. C.5-8.

94. Серов, В.Н. Иммуноглобулинотерапия у беременных с герпесвирусной инфекцией // В.Н. Серов, Б.Л. Гуртовой, В.Л. Тютюнник, З.С. Зайдиева // Вестник акушера гинеколога. 1997. — С. 3-4,42-44.

95. Сизякина, Л.П. Эффективность использования полиоксидония в терапии ВИЧ-инфекции / Л.П. Сизякина, И.Л. Докукина, А.Б. Шемшура // Иммунология. - 2000. - №5. - с. 9 - 10.

96. Сизякина, Л.П. Эффективность иммунокоррегирующей терапии полиоксидонием у детей, прооперированных по поводу врожденных пороков сердца синего типа / Л.П. Сизякина, И.В. Дударев, А.А. Дюжиков // Иммунология. 2002. - №6. - С.356-359.

97. Скрябина, Э.Г. Иммуномодулирующее действие миело- и лейкопептидов на Т-лимфоцитов здоровых (доноров) и больных с тяжелой хирургической инфекцией in vitro / Э.Г. Скрябина, М.Н. Свержева, А.А. Михайлов // Иммунология. 1987. - №4. - с. 93 - 96.

98. Соркина, Д. А. Структурно-функциональные свойства белков / Д. А. Соркина, И. Н. Залевская. Киев: Высш. шк. 1990. - 215с.

99. Степанов, В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков / В.М. Степанов. М.:Высш. шк. 1996. -335с.

100. Скрининг-тест для оценки патогенных свойств ЦИК / Стручков П.В., Константинова Н.А., Лаврентьев В.В. и др. // Лаб. дело. 1989. -№7.-С. 410-413.

101. Суринов, Б.П. Влияние нуклеината натрия на кооперацию и супрессию иммунокомпетентных клеток / Б.П. Суринов, В.Г. Исаева // Иммунология. 1997. - № 4. - С. 53 - 55.

102. Тешукова, А.В. Применение иммуностимулирующего препарата полиоксидония при хроническом бронхите / А.В. Тешукова, Н.М. Старостина, Н.Ю. Соловьев // Тез. докл. II съезд иммунологов России, Сочи.-1999.-С. 224.

103. Тимаков В.Д. Микробиология: Учебник / В.Д. Тимаков, B.C. Левашев, Л.Б. Борисов. М.:Медицина, 1983. -512с.

104. Титов, В.Н. Роль макрофагов в становлении воспаления / В.Н. Титов // Клин. лаб. диагностика. 2003. - №12. - С. 3-10.

105. Труханова, И. Г. Неспецифическая коррекция иммунной системы при синдроме хронической усталости / И. Г. Труханова, А. В. Малыгина // Иммунотерапия и иммунореабилитация. 2004. - Vol. 9. -с. 273.

106. Туркин, В.В. Иммуноферментный анализ церулоплазмина / В.В. Туркин, И.В. Дробот // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1991. - №7. - С. 66-69.110. Турсунов Б.С. и др. 1992

107. Тютюнников, С. В. Применение полиоксидония у больных с синдромом хронической усталости / С. В. Тютюнников, Е. А. Вагайцева // Иммунотерапия и иммунореабилитация. 2004. - Vol. 9. -с. 273.

108. Утешев Б.С., Сергеев А.В., Коростелев С.А. О некоторых вопросах скрининга иммунотропных препаратов. // Иммунология. 1995. - № 5.-С. 14-19.

109. Флайшман, Д. Иммунология / Д. Флайшман, Д. Дейви. М.:Мир. -1989. - Т. 1. — С.313-336.

110. Иммуномодулирующий эффект нуклеината натрия и спленина у больных вирусными и токсическими гепатитами / В.М. Фролов, Н.А. Пересадин, Ю.А. Ененко и др. // Иммунология. 1994. - №6. - С. 65.

111. Иммуномодулятор полиоксидоний в профилактике и лечении хирургической инфекции / Р. М. Хаитов, Т. Л. Щельцына., А. А. Бутаков и др. // Хирургия. 1997. - № 1. - С. 49 - 54.

112. Хаитов, Р. М. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 1 - 13.

113. Хаитов, Р. М. Экологическая иммунология / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин, X. М. Истамов. М., 1995.

114. Хаитов, Р. М. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Клиническая медицина. 1996. - № 8. - С. 7-12.

115. Хаитов, P.M. Оценка иммунной системы человека: современное состояние вопроса, сложности и достижения / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, А.Н. Чередеев // Иммунология. 1998. - № 6. - С. 8 - 10.

116. Хаитов, Р. М. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Иммунология. 2000. - № 5. - С. 4 - 7.

117. Хаитов, Р. М. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Иммунология. 2003. - № 4. - С. 196 - 203.

118. Хьюз, Р. Гликопротеины / Р. Хьюз. М.: Мир, 1985. - 160с.

119. Ширинский, B.C. Проблемы иммуностимулирующей терапии B.C. Ширинский, Е.А. Жук //Иммунология. 1991. - № 3. - С. 7 -10.

120. Ширинский, B.C. Проблемы фармакодинамики и фармакокинетики иммуностимулирующих препаратов / B.C. Ширинский, Е.А. Жук // Иммунология. 1994. - № 6. - С. 27 - 29.

121. Шульженко, А.Е. Клиническая эффективность и безопасность применения полиоксидония в лечении хронической рецидивирующей инфекции, вызванной вирусами простого герпеса / А.Е. Шульженко // Иммунология. 2002. - № 6. - С. 353.

122. Ярилин, А. А. Введение в современную иммунологию / А. А. Ярилин, Н. А. Добротина. Н. Новгород: Изд-во Нижегор. ун-та, 1997а.-238с.

123. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принцип ее функционирования в норме и при паталогии / А.А. Ярилин // Иммунология. 19976. -№5. -С.7- 14.

124. Arnold, L. The indaction of augmented granuloegte adherence by a plasma factor / L. Arnold, D. Zentnec, P. Alan // From the Depatment of Medcine University of Pennsylvania. Philadelphia. - 1974. - 111-114.

125. Belardeli, F. Role of interferons and other cytokines in regulation of the immune respons / F. Belardeli // APMIS. 1995. - Vol. 103, №3. - P. 161-179.

126. Analysis of free intracellular calcium by flow cytometry: multiparameter and pharmacological applications / S.W. Burchiel, B.S. Edwards, F.W. Kuckuck et al. // Methods. 2000. - №21. - P. 221-230.

127. Choo, M. Hydrogen peroxide stimulates macrophage vascular endothelial growth factor release / M. Choo, T. Hunt, M. Hussain // Am. J. Phisiol. Heart Circ. Phisiol. 2001. - V.280. - P. H2357-H2363.

128. Cuttica, R. J. Vasculitis, Kawasaki disease, and pseudovasculitis / R. J. Cuttica // Curr. Opin. Rheumatol. 1997. - № 9(5). - P. 448-457.

129. Comparative antioxidant and cardioprotective effects of ceruloplasmin, superoxide dismutase and albumin / M.J. Dumoulin, R. Chahine, R. Atanasiu et al. // Araieimittel Forsch. -1996. - V. 46. - №9. - P. 855-861.

130. Effect of immunoglobulin therapy on phagocytosis bypolymorphonuclear leucocytes in whole blood of neonates / T. Fujiwara, S. Taniuchi, T. Hattori et al. // Clin. Exp. Immunol. 1997. - 107. - №3. -P. 435-439.

131. Gomi, F. Effect of copper deficiency on the activity levels of ceruloplasmin and superoxide dismutase in tissues of young and old rats / F. Gomi, M. Matsuo // Aging Milano. -1995. -V.7. № 1. - P. 61-66.

132. Hadden, J. W. Immunostimulants / J. W. Hadden // Immunol. Today. -1993.-V. 14.-P. 275-280.

133. Hallivell, E.D. Free radicals, antioxidant and human diseaese: curiosity, course or consequence? / E.D. Hallivell // The lancet. 1994. - V. 344. -№ 8924. - P. 721-724.

134. Hogg, N. Adhesion molecules in cell interactions / N. Hogg, R. C. Landis // Curr. Opin. Immunol. -1993. -V.5. P.383-390.

135. Janssen-Heininger, Y.M. Recent advances towards understanding redox mechanisms in the activation of nuclear factor kB / Y.M. Janssen-Heininger, M.E. Poynter, P.A. Baeuerle // Free radial biology & Medicine. 2000. - V.28. - №9. - P. 1317-1327.

136. Hydrogen peroxide activates IkappaB kinases through phosphorilation of serine residues in the activation loops / H. Kamata, T. Manabe, S. Oka et al. // FEBS Lett. 2002. - V. 519(1-3). - P. 231-237.

137. Kelso, A. Cytokines: principles and prospects / A. Kelso // Immunol. Cell. Biol. 1998. - V. 76. - P. 300-317.

138. Klebanoff S.J. The neutrophil: function and clinical desoders / S.J. Klebanoff, R.A. Clark. Amsterdam: Noth. Holland Publ. - 1978. - 313p.

139. High doses immunoglobulin G attenuate immune aggregate-mediated complement activation by enhancing physiologic cleavage of C3b in C3bn-IgG complexes / H. Lutz, P. Stammler, E. Jelezarova et al. // Blood. -1996. 88. — №1. — P. 184-193.

140. Mehta, Y.S. In-vitro inhibition of antiplatelet autoantibodies by intravenous immunoglobulins and Rh immunoglobulins /Y.S. Mehta, S.S. Badakere // J. Postgrad. Med. 1996. - №42(2). - P. 46-49.

141. Neychev, H. Immunomodulatory action of propolis. II Effact of water solutle fraction influenza infection in mice / H. Neychev, V. Dimov, V. Vilcha //Acfa microbial bulg. 1988. - V.23. - P.58-62.

142. B-cell epitope mapping of the bacterial superantigen staphylococcal enterotoxin B: the dominant epitoperegion recognized by intravenous IgG / J. Nishi, S. Kanekura, S. Takei et al. // J. Immunol. 1997. - 158. - №1. -P. 247-254.

143. Ravi, K.V. Peritonsillar abscess an unusual presentation of Kawasaki disease / K.V. Ravi, J. R. Brooks // J. Laringol. Otol. - 1997. -111(1). - P. 79-74.

144. Primary Immunodeficiency Diseases: Report of WHO scientific Group / F. S. Rosen, R. j. Wedgewood, M. Fibl et al. // Clinical and Experimental Immunology. 1995 (99). - P. 1-25.

145. Roussel, R. Antibody purification, blood separation and plasma fractionation / R. Roussel, J. McCue. Editor Jemes Robinson Harris, New York, Wiley-Uss.Inc. - 1991. P. 307-341.

146. Silva, D.M. Ferritin and ceruloplasmin in oxidative damage: review and recent findings / D.M. Silva, S.D/ Aust // Can. J. Physiol. Pharmacol. -1993. -V. 71. -№ 9. P. 715-720.

147. Springer, T.A. The limphocyt fimcshion assotiated LFA-1, CD-2 and LFA-3 moleculs cell adgesion receptor of the immune system // T.A.

148. Springer, M.L. Dastin, Т.К. Kishimoto // Ann Rev Immunol. 1987. -V.5. - P.223-252.

149. Stiehm, E. R. Human intravenous immunoglobulin in primary and secondary antibody deficiencies / E. R. Stiehm // Pediatr. Infect. Dis. J. -1997.-16(7).-P. 696-707.

150. Werner, G.H. Immunostimulating agents: what next? / G.H. Werner, P. Jolles // Europ. Biochem. 1996. - V. 242. - P. 1-19.

151. Update of the epidemiology of Kawasaki disease in Japan-from the result of 1993-94 nationwide survey / H. Yanagawa, Y. Nakamura, M. Yashiro et al. // J. Epidemiol. 1996. -V.6. - №3. P. 148-157.

152. Zgirski, A. Binding of Си (II) to non-prosthetic sites in ceruloplasmin and bovine serum albumin / A. Zgirski, E. Frieden // J. Inorg. Biochem. -1990. V.39. - №2. - P.137-148.