Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций

Эйдельман, Юрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций"

На правах рукописи

ЭЙДЕЛЬМАН Юрий Александрович

РОЛЬ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМОСОМ В ОБРАЗОВАНИИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫХ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ

03 00 02 «биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

□03065673

ПУЩИНО 2007

003065673

Работа выталноаа в Институте биохимической физики им Н М. Эмануэля Российской

академии наук

Научный руководитель кандидат физико-математических наук Андреев Сергей Григорьевич

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор Плешанов Павел Георгиевич

доктор биологических наук, профессор Красавин Евгений Александрович

Ведущая организация Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится " 0 " 2007 г в 13 часов 30 минут на засе-

дании диссертационного совета Д 002 093 01 ври Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, адрес 142290, г Пущино Московской обп, ул Институтская, 3, ИТЭБРАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБРАН Автореферат разослан" 5 " 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ -мат наук Панина Н Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Хромосомные аберрации (ХА) считаются одним из наиболее чувствительных индикаторов радиационно-индуцированных генетических изменений. Определение дозовых зависимостей частот хромосомных обменных аберраций (дицентриков, транслокаций) т vitro используется в биодозиметрии для оценок поглощенных доз у людей, пострадавших в результате облучения (ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители загрязненных территорий, космонавты и т д) Хромосомным аберрациям принадлежит, по современным представлениям, важная роль в злокачественной трансформации клеток [UNSCEAR 2000] Это связано с нарушением регуляции экспрессии генов, например, вследствие того, что активные гены в результате перестроек хромосом могут оказаться в репрессированном состоянии, удалены от ре-гуляторных участков и/или попасть в гетерохроматиновую область хромосом ХА могут быть использованы в качестве доклинического маркера канцерогенного риска для выявления онкологических заболеваний

Определение частот ХА в большинстве случаев производится методом FISH для отдельных хромосом, а затем частоты пересчитываются на геном При пересчете частот ХА с одной хромосомы на геном предполагается, что вероятность участия хромосом в обменных перестройках пропорциональна количественному содержанию в них ДНК. К настоящему времени накопилось достаточно данных, не согласующихся с этим предположением, что указывает на необходимость исследования механизмов образования ХА, в том числе для объяснения причин неслучайного участия хромосом в обменных перестройках

Внедрение в 2001 году метода одновременного флюоресцентного окрашивания всех хромосом in situ (mFISH) позволило обнаружить, что частоты сложных (комплексных) ХА намного выше, чем предполагалось ранее Объяснения этому нет до сих пор, поскольку неясно, как образуются комплексные ХА, т.е неизвестны механизмы их образования

Механизмы образования ХА различаются (*) видом первичного повреждения (разрыв хроматидной нити - теория разрывов и воссоединений, или повреждение неразрывного типа - обменная теория), (**) образуются ли обмены между участками хромосом, находящимися в контакте в момент

облучения (механизм «предсуществовавшего контакта», «contact-first») или поврежденные участки хромосом приходят в контакт после облучения («кинетический механизм»). По современным представлениям, основным повреждением ДНК, ведущим к ХА, являются двойные разрывы (ДР) ДНК, и аберрации образуются вследствие ошибочной репарации ДР. В любом из механизмов для образования обменных аберраций требуются контакты поврежденных участков хромосом (либо в момент облучения, либо со временем после него) Поэтому одной из важнейших проблем при изучении ХА является проблема внутри- и межхромосомных контактов Это приводит к необходимости анализа контактов участков хромосом, в которых определяющую роль играет структура и динамика хромосом в интерфазном ядре Учет структуры и динамики хромосом на основе всех существующих на сегодняшний день моделей образования ХА принципиально невозможен

О том, что крупномасштабная структура хромосом (т.е. не на уровне ДНК и фибриллы хроматина, но на высших уровнях организации хроматина в хромосомах и упаковки хромосом в интерфазном ядре) влияет на образование ХА, свидетельствует ряд фактов Существующая на сегодняшний день модель случайных взаимодействий повреждений, основанная на предположении о том, что вероятность участия повреждения в обмене не зависит от того, где находится это повреждение (т е без учета структуры хромосом), предсказывает в 7 4 раза меньше межплечевых внутрихромосомных обменных аберраций в хромосоме 1 лимфоцитов человека, чем было обнаружено в эксперименте [Boei et al 98] (рентгеновское излучение в дозе 3 Гр) Соотношение между частотами ацентрических фрагментов и центрических колец составляет 5-12 (в зависимости от типов клеток и качества излучения), что существенно выше, чем предсказывает модель случайных взаимодействий (около 2.5) Распределение точек (мишеней), участвующих в обменных аберрациях (breakpoints), неслучайно по длине хромосомы, R-участки хромосом (генно-богатые) участвуют в обменах чаще, чем G-участки (генно-бедные) Частота образования дицентриков при у-облучении лимфоцитов в Gi-фазе выше, чем в G0, где хроматин более конденсирован

Цель и задачи исследования

Цель работы изучить зависимость типов и частот хромосомных аберраций, индуцированных ионизирующей радиацией, от структурной органи-

зации интерфазных хромосом путем развития методов биофизического моделирования

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи 1 Разработать методы моделирования радиационно-индуцированных хромосомных аберраций, учитывающие структурную организацию хромосом (внутри- и межхромосомные контакты) в интерфазном ядре 2. Разработать биофизическую модель образования комплексных ХА

3 Выяснить влияние структурной организации интерфазных хромосом на количественные характеристики ХА типы и частоты ХА, форма дозовых кривых, неслучайный характер распределения повреждений по длине хромосом.

4 Разработать методы, позволяющие воспроизводить в компьютерных экспериментах основные свойства экспериментальных систем исследования ХА (например, наблюдение фрагментов, размер которых превышает пороговый, задержка между облучением и подсчетом ХА), что позволит корректно сопоставлять расчетные и экспериментальные данные

Научная новизна

Разработаны методы биофизического моделирования образования хромосомных обменных аберраций под действием радиации. Впервые учтена роль крупномасштабной структуры и динамики хромосом в интерфазном ядре

Использование информации о структуре хромосом и хромосомных контактах показало, что параметры структуры хромосом (степень конденсации хромосом и пространственная близость хромосомных плеч), а также степень подвижности хромосомных субъединиц являются факторами, оказывающими влияние на частоту образования ХА и форму дозовых кривых как для плотноионизирующего (тяжелые заряженные частицы), так и для редкоионизирующего (фотоны) излучения

Впервые показано, что превышение числа комплексных обменов над простыми, наблюдаемое в эксперименте методом тпИБН (дифференциальное флюоресцентное мечение всех хромосом в ядре), может быть обусловлено наличием одновременно двух механизмов образования ХА: в момент облучения по местам контактов повреждений на поверхности хромосомных

территорий (механизм «предсуществовавшего контакта») и со временем после облучения («кинетический механизм»)

Впервые теоретически показано, что клетки с ХА, индуцированными редкоионизирующим излучением, могут достигать первого митоза раньше, чем клетки без ХА, а также что частота ХА в метафазных клетках первого митоза (лимфоциты человека) практически не зависит от временного интервала между облучением и подсчетом ХА Оба этих результата согласуются с экспериментальными данными

С помощью разработанных теоретических методов показано, что один из наиболее точных экспериментальных методов исследования внут-рихромосомных аберраций - индивидуальное окрашивание плеч хромосом (CAP-FISH) -приводит к систематическим погрешностям при определении частот ХА. Выход комплексных внутрихромосомных обменов с помощью этого метода недооценивается (при малых дозах - до 10 раз по сравнению с числом образовавшихся комплексных обменов), выход простых переоценивается (до 1 5 раз)

Практическая значимость

Созданные методы дают возможность проводить компьютерные эксперименты по определению типов и частот ХА, воспроизводящие основные особенности реальных экспериментальных методов Это позволяет корректно интерпретировать экспериментальные данные, полученные с помощью метода FISH (в т ч метода многоцветного FISH с окрашиванием всех хромосом, mFISH, и с окрашиванием всех полос (бендов) одной хромосомы, тВАЖ>), прогнозировать типы и частоты ХА в области малых доз и получать количественную информацию о ХА, недоступную прямым экспериментальным измерениям Расчеты зависимостей доза-эффект на основании разработанных методов могут быть использованы при определении поглощенной дозы в биодозимехрии, а также при прогнозировании результатов облучения в сложных условиях- радиационные аварии, космические полеты и т д Применение разработанных методов для расчета выхода специфических аберраций, ассоциируемых с различными типами раков, позволит прогнозировать радиационные риски этих заболеваний

Положения, выносимые на защиту

1 Вклад механизмов «предсуществовавшего контакта» и «кинетического» в формирование ХА зависит от степени компактизации интерфазных хромосом

2 Структура интерфазных хромосом определяет форму дозовых зависимостей частот простых внутрихромосомных аберраций, индуцированных рентгеновским излучением дозовые кривые квадратичны для деконденсированных структур (полимерный клубок) и сигмоидны для конденсированных (глобула)

3 Для плотноионизирующего излучения (a-частиц) форма дозовых кривых частот простых внутрихромосомных аберраций также зависит от структуры хромосом дозовые кривые линейно-квадратичны для деконденсированных структур и линейны для конденсированных

4 Крупномасштабная структура интерфазных хромосом (степень конденсации, взаимное расположение плеч) является фактором, определяющим наблюдаемое гетерогенное распределение участков, по которым образуются внутрихромосомные аберрации

5 Для корректного сравнения расчетных и экспериментальных данных созданы методы «виртуального эксперимента», позволяющие рассчитывать типы и частоты ХА с учетом особенностей экспериментальных методик: однородное окрашивание хромосом или хромосомных плеч, конечное разрешение метода FISH, временная задержка между облучением клеток и наблюдением ХА

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях, школа-конференция «Горизонты Физико-Химической Биологии», Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г, 30th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, Warsaw, Poland, August 27-31,2000, International conference "Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution" dedicated to centenary of N W Timofeeff-Ressovsky, Dubna, September 6 - 9, 2000, 13th Symposium on Microdosimetry, Stresa (Lago Maggiore), Italy, May 27 - June 1, 2001, IV съезд по радиационным исследованиям, Москва, 20 - 24 ноября 2001, International Workshop "New Models

and Nuclear Methods m Biophysics and Biochermstry", Dubna, 24 - 25 January, 2002, П Международный симпозиум "Механизмы действия сверхмалых доз". Москва, декабрь 2002 г; COSPAR colloquium "Radiation safety of manned Mars mission", Дубна, 26 сентября - 1 октября 2003 г, 33rd Arnual meeting of European Society for Radiation Biology, Budapest, Hungary, August 25-28, 2004, конференция «Фундаментальные науки - медицине», 2-3 декабря 2004, семинар «Биофизика онкологических процессов», Санкт-Петербург, 7-8 декабря 2004, 14Л Symposium on Microdosimetry, Vemce, Italy, November 12-18, 2005, конференция «Фундаментальные науки - медицине», 14-15 декабря 2005, V съезд по радиационным исследованиям, Москва, 10-14 апреля 2006

По материалам диссертации опубликовано 10 статей и 17 тезисов на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитированной литературы (102 наименования), изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 33 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обосновывается актуальность темы исследования, а также приводится современное состояние проблемы исследования механизмов образования радиационно-индуцированных ХА Проведен сравнительный анализ существующих теоретических и экспериментальных методов исследования ХА и определены области, в которых эти методы неприменимы и/или неинформативны

В 1 главе описываются разработанные нами теоретические методы исследования ХА с учетом внутри- и межхромосомных контактов в интерфазном ядре.

Общая блок-схема исследования приведена на рис 1 На первой стадии были смоделированы различные структуры интерфазных хромосом, отличающиеся друг от друга степенью компактизации, взаимным расположе-

нием плеч и/или другими параметрами Затем, наложив на полученные структуры хромосом треки заряженных частиц, мы определяли число и расположение двунитевых разрывов ДНК, индуцированных облучением Далее моделировались взаимодействия поврежденных субъединиц хромосомы, приводящие к образованию обменных аберраций И, наконец, расчетные данные корректировались с учетом особенностей экспериментальных методов, это необходимо для сравнения теоретических и экспериментальных данных Поскольку исследуемые в данной работе процессы (взаимодействие излучения с ДНК, образование и репарация повреждений; взаимодействие повреждений, приводящее к образованию ХА, и т.д) носят стохастический характер, моделирование было выполнено с помощью метода Монте-Карло Стохастическая структура трека генерировалась с помощью программы БеТгаск [Питкевич и Дуба, 81], все остальные стадии исследования выполнялись с помощью разработанного нами оригинального программного обеспечения

определениечисла ираспшшеш» контактов поврежденных субъединщ сразу после облучения

моделирование репарации др днк со временем после овяученкз

определение числа и расгюдаения контактов поврезденныхсувьединщ в зависимости ог времени после получения

Растет тчгави частот аберраций образовавшихся по мевнйму

«1редсуи£ствэваешего контакта»

Расч#гтипов и чаетатаберраций, образовавшихся по винепмескому механизму

«Виртуальный детектор» керрещия дажых с учетом особенностей экспериментальны* методов - порог детещии юроток фрагментов - нгаетеюируемооь обменов в пределах однородна окрашенных участков хромосом _- задержка кгеточногацикпэ между моментами обяучешя и иааяйздения_

Рис 1 Общая блок-схема компьютерного эксперимента.

1 1. Моделирование структур интерфазных хромосом Число и расположение контактов хромосомных субъединиц (необходимых для их последующего взаимодействия и образования ХА) внутри отдельных хромосом и между хромосомами определялись в ходе физического моделирования структур отдельных хромосом или хромосом в составе кле-

точного ядра Структуры хромосом были получены ранее с помощью динамического варианта метода Монте-Карло, описанного в [Андреев и Эй-дельман, 1999] Интерфазные хромосомы моделировались как свободно-сочлененные полимерные цепи. Элементы цепей (хромосомные субъединицы) представляли собой розеткообразные структуры, образованные петлями ЗОнм фибриллы хроматина, основания которых расположены на ядерном матриксе. Содержание ДНК в субъединице составляет 1-3 миллиона пар оснований (мпо), что соответствует размерам наименьших бендов метафазных хромосом Крупномасштабная структура хромосом формировалась за счет взаимодействия элементов цепей между собой притяжения на больших расстояниях (г>4 й - гидродинамический диаметр субьединицы) и отталкивания на малых (г<<1, исключенный объем) Энергия взаимодействия г и у элементов хромосомы представляет собой степенную функцию расстояния между ними,

Коэффициенты кцп обобщенно учитывают мультиполярные взаимодействия различных белков с ДНК хромосом, внутриядерную среду (ионную силу, рН), прикрепление элементов хромосомы к ядерному матриксу, ламине, и т д В общем случае эти коэффициенты индивидуальны для каждой пары элементов (г, у) Для получения крупномасштабных структур хромосом 1 и 6 человека, количественные и качественные характеристики которых согласуются с экспериментальными данными, были подобраны наборы коэффициентов, отличающиеся для пар элементов, расположенных в одном хромосомном плече, либо в различных плечах, либо в одном из плеч и в прицентромерной области хромосомы При моделировании упаковки хромосом в интерфазном ядре лимфоцита человека набор коэффициентов зависел также от того, в одной хромосоме расположена пара элементов (г, у) или в разных Примеры полученных конденсированных и деконденсиро-ванных структур приведены на рис.2, А-В Здесь и далее следует учитывать, что термин «конденсированная структура», применяющийся в данной работе, означает полимерную глобулу — структуру, конденсированную по сравнению с полимерным клубком, в то же время по сравнению со структурами метафазных хромосом они являются деконденсированными

На основе вышеописанного метода определялось 4Б (пространственно-временное) расположение каждой хромосомной субьединицы в хромо-

соме (или, в случае ядра, во всех хромосомах). После этого для каждой хромосомной субъединицы и для каждого момента времени определялось число контактов этой субъединицы с каждой из остальных. Пример зависимости числа контактов между i и / субъединицами хромосомы 6 от номера j (для одного момента времени и при фиксированном £) приведен на рис,2, Г. Далее tía основе этой информации для каждой пары поврежденных еубъе-диниц вычислялась вероятность их контакта в зависимости от времени.

А Б В

О 10 | 2П 30 40 Í0 «а

' * Расположение элемента

Рис,2, Моделирование крупномасштабно" структуры интерфазных хромосом. А; конденсированная (глобулярная) структура хромосомы 6 человека с пространственно раз делен] ¡ымн плечами. Б: одна из глобулярных структур хромосомы I человека. В: деком ден сир ованпая структура (полимерный клубок). Г: зависимость числа контактов между I и} субъсдилицами хромосомы б от номера} при 1=14 в момент времени 1=0 (при облучении). Использована структура хромосомы 6, приведенная на панели А. Контакты с соседними по цепи субъединицами, а также с субъединицами прицетромерной области не показаны.

1 2 Моделирование индукции двунитевых разрывов ДНК

При моделировании повреждения хромосом плотноионизирующей радиацией стохастические структуры треков заряженных частиц (координаты точек энерговыделения) накладывались на структуру хромосомы (координаты всех нуклеотидов) и определялась величина удельной поглощенной энергии z в каждом нуклеотиде Вероятность образования ДР ДНК в каждом участке ДНК определялась в зависимости от величины z в каждом нуклеотиде этого участка При моделировании повреждения хромосом редкои-онизирующей радиацией (рентгеновское излучение) использовалось общепризнанное предположение о случайном и равномерном распределении ДР ДНК по длине хромосом Эффективность образования ДР ДНК для рентгеновского излучения бралась из экспериментальных данных [Newman et al, 1997]

1 3 Моделирование образования ХА

Субъединица хромосомы, содержащая один или более ДР ДНК (кластер ДР), определяется как «поврежденная» и может принимать участие в образовании ХА При расчетах взаимодействий поврежденных субъединиц, приводящих к образованию ХА, используются следующие предположения а) наличие ДР ДНК не приводит к физическому разрыву хроматидной нити (вследствие ДНК-белковых взаимодействий, формирующих нуклеосомы и фибриллу хроматина), б) ХА обменного типа образуется вследствие одного или нескольких парных взаимодействий поврежденных субъединиц, в) две поврежденные субъединицы могут взаимодействовать с вероятностью Р, если они либо находятся в пространственной близости (контакт) в момент облучения (образование ХА по механизму «предсуществовавшего контакта»), либо приходят в контакт после облучения вследствие диффузии («кинетический механизм»)

Параллельно с процессом взаимодействия поврежденных субъединиц с образованием ХА происходит процесс репарации В рамках данной работы применена упрощенная модель репарации ДНК Согласно этой модели каждый ДР ДНК элиминируется с постоянной скоростью независимо от остальных ДР Эксперименты [Stenerlow et al, 2000] демонстрируют более сложную кинетику элиминации ДР, но использованная модель дает расхождение с экспериментом только на больших временах, при которых общее число ДР мало (по сравнению с исходным), и потому эти времена не дают существенного вклада в образование ХА

Взаимодействие, двух поврежденных, субъединиц приводит к образованию простой обменной аберрации Каждое взаимодействие может приводить к двум различным аберрациям симметричной (инверсия в случае внутрихромосомного взаимодействия, транслокация в случае межхромосомного) и асимметричной (кольцо и дицентрик, соответственно) Симметричное и асимметричное взаимодействия предполагаются равновероятными Внутрихромосомные обмены делятся на внутриплечевые и межплечевые, в зависимости от того, в одном или разных плечах хромосомы находились взаимодействующие субъединицы

Взаимодействие большего числа поврежденных субъединиц приводит к образованию комплексной (сложной) обменной аберрации Внутрихромосомные комплексные обмены классифицировались в соответствии с номенклатурой S&S [Savage 1997], если число взаимодействующих повреждений не превышало четырех. Для большего числа повреждений, взаимодействующих в пределах одной хромосомы, эта номенклатура неприменима, поэтому такие обмены классифицировались просто как «комплексные» Для межхромосомных обменов детальная классификация комплексных аберраций не проводилась.

1 4 Коррекция расчетных данных с учетом особенностей экспериментальных методов исследования ХА.

Для корректного сравнения расчетных данных с экспериментальными [Boei et al, 1998, Loucas and Comforth, 2001, Anderson et al, 2002] при расчете воспроизводились основные элементы экспериментальных методик CAP-FISH и mFISH при расчетах ХА в индивидуальных хромосомах «метились» разными цветами оба плеча и центромер, в клеточном ядре - все 23 пары хромосом. Учитывалось также, что часть комплексных аберраций вследствие особенностей экспериментальных методик (конечное разрешение микроскопии, невозможность детектировать инверсии внутри однородно окрашенной хромосомы или хромосомного плеча) могут быть классифицированы в эксперименте как простые, либо не детектироваться вообще В расчете комплексные аберрации, видимые в эксперименте как простые, классифицируются в отдельную группу, псевдопростые.

В большинстве экспериментов облучение клеток производится в интерфазе (Go/Gi), в то время как ХА детектируются в метафазе первого митоза спустя определенное время после облучения (как правило, 48 часов) При интерпретации экспериментальных данных обычно предполагается, что

частота ХА, наблюдаемых в метафазе 1 деления через 48 часов, равна частоте ХА при образовании в интерфазе Однако в общем случае эти частоты не равны, т к задержка клеточного цикла и клеточная гибель, индуцированные облучением, влияют на вероятности нахождения аберрантных и неаберрантных клеток в митозе в разное время Задержка сдвигает первый митоз на более позднее время, а гибель уменьшает вероятность прихода клетки в митоз в любое время В данной работе предложен метод, позволяющий устанавливать связь между частотой аберраций в интерфазе и наблюдаемой частотой аберраций первого митоза при любом единичном времени фиксации Метод основан на численном моделировании кинетики прохождения клеточного цикла как в норме, так и после облучения. При моделировании использовались следующие предположения а) продолжительность каждой фазы клеточного цикла (О0/Оь Б, С2, М) является стохастической величиной, б) наиболее существенным фактором, обусловливающим задержку клеточного цикла, являются радиационно-индуцированные ДР ДНК, задержка в контрольных точках фаз в] и вг необходима для репарации ДР, в случае, когда часть ДР осталась неотрепарированной, клетка гибнет Начальным условием является синхронизация всех клеток в Сд/в) Вид распределения, среднее значение и дисперсия продолжительности каждой фазы для необлученной популяции устанавливаются эмпирически На основе этого для каждой аберрантной и неаберрангной клетки рассчитывается время ее прихода в первый, второй и т д митозы Параметры клеточного цикла определяются путем сопоставления расчетных и экспериментальных данных по доле первых, вторых и более поздних митозов (по отношению к общему числу митозов) в зависимости от времени и дозы.

Во 2 главе проводится численное исследование влияния крупномасштабной структуры хромосом на типы и частоты внутрихромосом-ных ХА с учетом различных механизмов образования внутрихромо-сомных обменных аберраций. Основные задачи, решаемые в этой главе: определение преобладающих механизмов образования ХА, а также определение формы дозовых кривых частоты ХА в зависимости от параметров структуры хромосомы, разработка подхода к воссозданию структуры хромосомы на основе экспериментальных данных по ХА

На рис 3 приведены расчетные дозовые зависимости выхода аберраций двух типов - простых ацентрических колец (А, Б) и комплексных абер-

раций (В, Г), индуцированных рентгеновским излучением На каждом графике приведены кривые для конденсированной и деконденсированной структуры хромосомы 6 человека При расчете частот ХА сразу после облучения учитывались только обмены, образовавшиеся по механизму «пред-существовавшего контакта», при расчете через 6 часов после облучения (когда репарация повреждений практически полностью завершена) учитывались обмены, образовавшиеся по обоим исследованным механизмам, «предсуществовавшего контакта» и по кинетическому механизму Из графиков видно, что в конденсированной хромосоме через 6 часов после облучения рост частоты аберраций незначителен (10-20%), см рис 3, А1 и БЗ, а также В1 и ГЗ То как простые, так и комплексные аберрации образуются преимущественно по механизму «предсуществовавшего контакта» В то же время в деконденсированной хромосоме число аберраций существенно (в 16-3 раза) увеличивается со временем (рис 3, А2 и Б4, а также В2 и Г4), те в деконденсированной хромосоме, в отличие от конденсированной, преобладает кинетический механизм. Это различие, по-видимому, вызвано тем, что вероятность прихода в контакт двух повреждений, не находившихся в контакте в момент облучения, выше для деконденсированной структуры, чем для конденсированной, вследствие более высокой подвижности субъединиц деконденсированной хромосомы Частоты ХА в конденсированных хромосомах существенно выше, чем в деконденсированных, как сразу после облучения (см. кривые Al, Bl, А2 и В2), так и через 6 часов (кривые БЗ, ГЗ, Б4 и Г4) Это связано с бблыпим количеством внутрихро-мосомных контактов в конденсированной хромосоме Из графиков А и Б видно, что степень конденсации хромосомы влияет на форму дозовых кривых выхода простых аберраций, индуцированных рентгеновским излучением. Для деконденсированной хромосомы дозовые кривые квадратичны, в соответствии с предсказаниями теории дуального действия [Kellerer and Rossi, 1972] Для конденсированной хромосомы дозовые кривые имеют сигмоидную форму По-видимому, замедление роста числа простых обменов при дозах 3 Гр и выше связано с вовлечением большого числа повреждений в образование комплексных обменов

Рис 3 Дозовью зависимости частоты внутрихромосомных обменных аберраций, индуцированных рентгеновским излучением в хромосоме 6 человека А, Б - простые ацен-тричесюв кольца, В, Г - комплексные обмены А. В - сразу после облучения, Б, Г - через 6 часов после облучения 1,3 — конденсированная структура хромосомы б, 2, 4 - де-конденсированная

На рис 4 приведены расчетные дозовые кривые для простых ацентрических колец (А) и внутрихромосомных комплексных обменов (Б), индуцированных рентгеновским излучением в хромосоме 6, находящейся в конденсированном состоянии Расчеты (так же как и большинство последующих расчетов для конденсированных хромосом) проведены по механизму «предсуществовавшего контакта», поскольку кинетический механизм вносит в образование ХА незначительный вклад Результаты расчетов частот истинных простых обменов (ХА, образовавшихся вследствие взаимодействия двух повреждений) и комплексных обменов приведены в сравнении с результатами компьютерного эксперимента, в котором частоты ХА определялись с учетом ограничений экспериментального метода флюоресцентного окрашивания обоих плеч и центромера хромосомы (CAP-FISH). Кривая 1 представляет собой дозовую зависимость частоты истинных простых обме-

нов Кривая 2 представляет собой дозовую зависимость частоты кажущихся простых обменов, т е обменов, которые классифицируются как простые в «виртуальном эксперименте» Разницу между кривыми 1 и 2 составляют псевдопростые обмены, те комплексные обмены, классифицируемые в эксперименте как простые На кривой 3 изображена дозовая зависимость частоты всех комплексных внутрихромосомных обменов, на кривой 4 - видимых в эксперименте комплексов Переоценка числа простых обменов в эксперименте имеет место преимущественно при больших дозах (44% при Б=3 5 Гр). Это связано с тем, что при малых дозах (до 1 Гр) частота образования комплексных аберраций существенно (более чем в 10 раз) ниже, чем простых Соответственно, частота комплексных аберраций, наблюдаемых как простые, еще ниже При больших дозах частоты простых и комплексных обменов близки, поэтому и частоты псевдопростых обменов также не пренебрежимо малы по сравнению с истинно простыми. Напротив, разница между всеми комплексами и видимыми комплексами существенна при малых дозах (десятикратна при Б=0 5 Гр) Это связано с тем, что при малых дозах большинство комплексных обменов образуется в результате взаимодействия 4 повреждений, а при больших - в основном, в результате взаимодействия 6 и большего числа повреждений Т е. при больших дозах комплексные аберрации более сложные, поэтому они чаще распознаются экспериментальным методом как комплексные.

Рис 4 Расчетные частоты внутрихромосомных обменов, истинные и экспериментально видимые А - ацентрические кольца. 1 - истинно простые, 2 - «кажущиеся простые» Б -комплексные обмены 3 - все образовавшиеся, 4 - видимые

Результаты компьютерных экспериментов по выявлению роли структуры хромосом в образовании ХА, индуцированных а-частицами, приведены на рис 5 Степень конденсации хромосом существенно влияет на форму дозовых кривых для «кажущихся простых» обменов, а также на частоты всех типов обменов. Дозовые зависимости частот как ацентрических, так и центрических колец для обоих типов структуры хромосомы были фитиро-ваны линейно-квадратичной зависимостью

/{П) = а0+Р02 (1) предсказываемой теорией дуального действия, и были определены значения линейной и квадратичной компонент, аир Найденные значения приведены в таблице 1 Для деконденсированной структуры значения аир одного порядка, и дозовые кривые носят отчетливо выраженный линейно-квадратичный характер (рис 5, А2 и Б2). Для конденсированной структуры значения а в 5-10 раз превосходят значения р, вследствие чего в рассматриваемом диапазоне доз дозовые кривые линейны. Значения р близки для обеих структур, значения а для конденсированной структуры выше, чем для деконденсированной, в 4-6 раз Различие значений а объясняется тем, что в конденсированной хромосоме а-частица повреждает в среднем больше субъединиц, чем в деконденсированной, причем эти поврежденные субъединицы находятся в пространственной близости друг от друга и могут взаимодействовать с большой вероятностью

Рис 5 Расчетные частоты «кажущихся простых» и видимых комплексных внутрихромо-сомных обменов, индуцированных а-излучением в хромосоме 6 человека А - «кажущиеся простые» ацентрические кольца, Б - «кажущиеся простые» центрические кольца, В - видимые комплексные обмены 1 - конденсированная структура хромосомы 6 2-деконденсированная (полимерный клубок)

Таблица 1 Значения аир, определенные для дозовых зависимостей частот «кажущихся

простых» внутрихромосомных обменов в зависимости от струк!уры хромосомы

Ацентрические кольца Центрические кольца

конденсированная деконденсированная конденсированная деконденсированная

а,Гр-' 0 037±0 001 0 0060±0 0002 0 003±0 001 0 0008±0 0001

Р,Гр"2 0 0029±0 0004 0 0035±0 0002 0 0007±0 0004 0 0012±0 0001

Рис 6 Расчетные распределения участков образования внутрихромосомных обменов в зависимости от структуры хромосомы 6 1 - гомогенная глобула, 2 - гетерогенная глобула, 3 - деконденсированная структура (клубок)

Сопоставление частот простых и комплексных обменов (как истинных, так и наблюдаемых в эксперименте) доя а-частиц и рентгеновского излучения позволяет определить относительную биологическую эффективность (ОБЭ) образования этих типов ХА для разных структур хромосомы. Расчеты показывают, что ОБЭ от степени конденсации хромосомы зависит слабо, но в то же время от типа аберрации - сильно Для простых обменов ОБЭ варьирует в диапазоне 10-13, для комплексных она превосходит 150 Высокие значения ОБЭ обусловлены тем, что трек а-частицы часто повреждает субъединицы, уже находящиеся в контакте Известно, что рентгеновское излучение индуцирует повреждения независимо друг от друга (не-скоррелированно), поэтому поврежденные субъединицы находятся в контакте с гораздо меньшей (по сравнению с а-частицами) вероятностью Поскольку для образования простого обмена требуется нахождение в контакте двух повреждений, а дня комплексного - не меньше четырех, то ОБЭ для комплексных обменов оказывается существенно выше, чем для простых

На рис 6 приведены результаты исследования влияния структуры интерфазной хромосомы на распределение участков образования внутрихро-мосомных обменов (breakpoints, брекпойнтов). Распределение числа брек-пойнтов, образованных рентгеновским излучением в дозе 1 Гр, по длине хромосомы приведено для трех структур хромосомы 6 сферической конденсированной структуры (гомогенная глобула), структуры с пространственно разделенными конденсированными плечами (гетерогенная глобула), деконденсированной структуры (клубок) Деконденсированная хромосома характеризуется равномерным распределением брекпойнтов (рис 6, кривая 3) Распределение брекпойнтов в гомогенной глобуле близко к равномерному, но субъединицы, расположенные в середине полимерной цепи, вовлекаются в обмены чаще (до 20%), чем остальные (рис б, кривая 1) По-видимому, в использованных для расчетов глобулярных структурах средняя часть полимерной цепи оказывается внутри хромосомной территории чаще, чем ее концы, вследствие чего плотность контактов для субъединиц средней части цепи выше В хромосоме 6 в состоянии гетерогенной глобулы распределение брекпойнтов по длине хромосомы неравномерно (рис 6, кривая 2) Пик обусловлен перекрытием плеч в прицентромерной области, что приводит к большому числу межплечевых контактов

Рис 7 Частоты центрических колец как функция структуры хромосомы 1 А, 1 и Б, 1 -экспериментальные данные на лимфоцитах человека А, 2-3 и Б, 2-4 - расчет А - декон-денсированные структуры 2 - идеальный (Гауссов) клубок 3 - реальный клубок с исключенным объемом Б - конденсированные структуры 2-е сильно перекрывающимися плечами 3-е умеренно перекрывающимися плечами 4-е пространственно разделенными плечами

Рис. в. Предсказашс выхода истинно Гфосшх центрических колеи на основе 'экспериментальных данных. 1 - «кажущиеся простые« ЦК. теории, 2 - истинно простые ЦК, теория. 3 - «кажущиеся простые» ЦК, эксперимент. 4 - истинно простые ЦК, теоретическая оценка па основе экспериментальных данных.

Было проведено исследование влияния степени конденсации и взаимного расположения плеч хромосомы 1 лимфоцитов человека на выход «кажущихся простых» центрических колец. На рис.7 приведены расчетные данные для деконденсированных (А) и конденсированных (Б) структур в сравнении с экспериментальными [Вое1 ел а\, 1998]. Из графиков видно, что пространственная организация хромосомы влияет на форму дозовых кривых и частоту аберраций. Частоты аберраций, рассчитанные как для идеального, так и для реального клубков, ниже, чем экспериментально измеренные (рис.7, А). Конденсированная структура хромосомы 1 с пространственно разделенными плечами (степень перекрытия плеч 9.4% по отношению к объему территории хромосомы (} также приводит к недооценке числа аберраций (Б, кривая 4). Структура с умеренно перекрывающимися плечами (16.7%) предсказывает частоты центрических колец, которые хорошо согласуются с экспериментальными при дозах меньше I Гр и превышают экспериментальные при более высоких дозах (Б, кривая 3). Для структуры с сильно перекрывающимися плечами (29.2%) центрические кольца образуются намного чаще, чем наблюдается в эксперименте (Б, кривая 2). Результаты были получены для индивидуальной хроиосолгы ] и не учитывают вовлечения части повреждений в образование межхромосомных обменов. Ко-

личественный учет этого обстоятельства приводит к снижению дозовых кривых (по сравнению с представленными результатами) преимущественно при больших дозах (10-30% при D>2 Гр). Т.о. можно сделать вывод, что хромосома 1 лимфоцитов человека имеет конденсированную структуру с умеренным перекрытием плеч

Особенности экспериментального метода детектирования аберраций FISH (конечное разрешение, окрашивание отдельных хромосом/плеч) приводят к тому, что часть информации об аберрациях не может быть извлечена из экспериментальных данных непосредственно К такой т н «скрытой информации» относятся, например, частоты истинных простых обменов, а также частоты всех комплексных обменов, включая псевдопростые В данной работе предлагается метод, позволяющий восстановить скрытую информацию об аберрациях На рис 8,3 приведена экспериментальная дозовая зависимость [Boei et dl, 1998] частоты «кажущихся простых» центрических колец, индуцированных рентгеновским излучением в хромосоме 1 лимфоцитов человека Для того, чтобы определить количество истинных простых центрических колец среди экспериментально обнаруженных «кажущихся простых», необходимо знать долю псевдопростых обменов по отношению к истинно простым Для структуры хромосомы 1 с умеренно перекрывающимися плечами были рассчитаны дозовые зависимости частот как «кажущихся простых», так и истинно простых обменов (рис.8, кривые 1 и 2 соответственно) Рассчитав для этой структуры долю псевдопростых обменов по отношению к «кажущимся простым», мы с помощью этого соотношения корректируем экспериментальную дозовую кривую для «кажущихся простых» центрических колец и получаем дозовую кривую для истинно простых (рис.8, кривая 4) Этот метод учитывает структуру интерфазной хромосомы и внутрихромосомные контакты, в отличие от ранее созданного метода [Simpson and Savage, 1996], основанного на предположении о случайном взаимодействии повреждений

В 3 главе приведены результаты теоретических исследований механизмов образования межхромосомных обменов в лимфоцитах человека под действием редко- и плотноионизирующего излучения, а также анализ имеющихся экспериментальных данных, полученных методом флюоресцентного окрашивания всех хромосом (mFISH) В отличие от компьютерных экспериментов на отдельных хромосомах, точный учет динами-

ки хромосомных субъединиц для целого ядра является слишком времеем-ким, поэтому динамика хромосом после облучения учитывалась приближенно Движение поврежденных субъединиц приводит к тому, что субъединицы, не находившиеся в контакте в момент облучения, с некоторой вероятностью придут в контакт после облучения Это можно приближенно описать, введя эффективный радиус взаимодействия, превышающий реальный (т е определенный путем моделирования тонкой структуры и динамики субъединиц) Моделирование образования ХА на отдельных хромосомах с учетом репарации показало, что динамика интерфазной хромосомы приводит к увеличению числа аберраций со временем, эквивалентному увеличению вследствие эффективного радиуса взаимодействия, равного 1.6d (без учета динамики радиус взаимодействия равен 1 5d) Дозовые зависимости числа простых и комплексных межхромосомных обменов, расчетные в сравнении с экспериментальными [Loucas and Cornforth, 2001], полученными методом mFISH, приведены на рис.9. Расчет проведен при вероятности взаимодействия Р=0 14 Из графика видно, что расчет недооценивает число комплексных аберраций Вероятность взаимодействия является единственным подгоночным параметром модели Использование более высокого значения Р позволяет удовлетворительно описать дозовую кривую для комплексных обменов, но приводит к существенному искажению формы кривой для простых, а также к значительному (до двух раз) превышению общего числа аберраций над экспериментальными значениями

Рис 9 Выход межхромосомных обменов, индуцированных рентгеновским излучением в лимфоцитах человека 1, 2 - эксперимент [Loucas and Cornforth, 2001], 3, 4 - расчет (Р=0 14) 1,3- простые обмены, 2,4 - комплексные

D Гр

Эксперимент по исследованию межхромосомных аберраций, индуцированных а-частицами в лимфоцитах человека [Anderson et al, 2002], методом mFISH показал, что при дозе 0.5 Гр число комплексных обменов намного превышает число простых (рис 10, Д) Созданный нами метод позволил впервые оценить степень сложности межхромосомных обменов, индуцированных плотноионизирующим излучением, по двум критериям — доля комплексов по отношению к общему числу ХА и число хромосом в составе комплексной аберрации Расчеты, проведенные с учетом различных механизмов образования ХА при различных наборах параметров (см подпись к рис 10), недооценивают долю комплексных обменов (рис 10, А-Г) Учет образования ХА как по механизму «предсуществовавшего контакта», так и по кинетическому механизму, в случае низкой эффективности репарации повреждений, индуцированных плотноионизирующей радиацией, позволяет получить результат, качественно согласующийся с экспериментальными данными (рис.10, Г) На рис 11 представлена расчетная и экспериментальная [Anderson et al, 2002] оценка степени сложности ХА по другому критерию - распределению числа хромосом, входящих в состав комплексной аберрации. Теория переоценивает число комплексных обменов, состоящих из двух хромосом, и недооценивает число обменов, включающих в себя 5 и более хромосом Учет обоих рассмотренных механизмов образования ХА и изменение параметров расчета (эффективность репарации, вероятность взаимодействия) не приводят к существенному изменению теоретического распределения. Т.о по критерию числа хромосом в составе комплексного обмена также имеет место недооценка степени сложности аберраций, индуцированных а-частицами.

Поскольку расчеты проводились на ядре с максимально плотной упаковкой хромосом, тес максимально возможным количеством межхромосомных контактов, систематическая недооценка сложности аберраций по разным критериям и под действием разного типа излучения указывает на возможное существование другого механизма образования комплексов Предположительно этот механизм основан на конформационных переходах структуры хромосом в ответ на облучение, например, движении поврежденных участков к центрам репарации, где и происходит их взаимодействие с образованием ХА

А Б В Г Д

Рис. 10. Отношение числа простых и комплексных обменов к общему числу аберраций Лимфоциты чело иска, альфа-частицы (ЛПЭ 115 кэВ/|ш), D=0.5 Гр. А-Г- расчеты: А -механизм «предсуществовавшего контакта». Р-1; Б - механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=1. В механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=0.14; Г - механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, неэффективная репарация, Р=1; Д -эксперимент [Anderson ei а!, 2002] Слева - простые, справа - комплексные обмены.

Рис.11. Распределение числа хромосом, входящих в состав комплексной аберрации. Лимфоциты человека, альфа-частицы (ЛПЭ 115 кэВ/^м), 0=0,5 Гр. 1 - расчет, механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=1; 2 -эксперимент [АЫегеоп е! п1, 2002].

В 4 глапе исследуется роль радийционно-нндуцпрованной задержки клеточного цикла и клеточной гибели как важного фактора, влияющего на частоты ХА, наблюдаемые в эксперименте. Решается задача установления количественной связи между частотами ХА, наблюдаемыми в ме-тафазе спустя определенное время после облучения, частотами ХА непосредственно после их образования в интерфазе и характеристиками митоти-ческого цикла облученных клеток.

Параметры клеточного цикла лимфоцитов человека в отсутствие облучения были определены путем фитирования экспериментальных данных [Ес1е1тап еГ а1, 2006] по кинетике прохождения популяцией лимфоцитов первого, второго и более поздних митозов (рис.12. Л). Результаты расчетов количественно согласуются с экспериментальными данными. Некоторое расхождение наблюдается лишь для времени 45-50 часов, но оно находится в пределах междонорных вариаций (экспериментальные данные получены для одного донора). Расчеты показывают, что такая кинетика прохождения митозов имеет место только в случае, когда дисперсии длительностей фаз клеточного цикла велики и начальная синхронность популяции быстро пропадает. С помощью тех же экспериментальных данных, но для облученных рентгеновским излучением лимфоцитов, определены величины задержки клеточного цикла, вызванные облучением. Расчетные данные в сравнении с экспериментальными для доз 1, 2 и 4 Гр приведены на рис. 12, Б

Рис 12. Зависимость от времени доли первых, вторых и третьих митозов (но отношению к общему числу м ито ги чес к их клеток) в популяции лимфоцитов человека. Л П=0, Б - Гр, В 0=2 Гр, Г - 0=4 Гр. Расчет: 1 первые митозы, 2 - вторые. 3 третьи и более поздние. Эксперименты; 4, 7 - первые митозьг, 5, Я — вторые, 6, 9 третьи и более поздние, 4-6 - [ЕкЗе1тап & а!, 2006], 7-9- [НоЫтап а а1, 2002].

- Г.

Время часы Время, часы Время часы

Рис 13 Расчетная и экспериментальная зависимости частот наблюдаемых межхромосомных аберраций первого митоза от времени наблюдения А - расчет, простые ХА Б - расчет, комплексные ХА В - эксперимент [ЕкЫтап ел а1, 2006], дицентрики Дозы 1 -0б Гр, 2-1 Гр, 3 -2 Гр, 4-3 Гр, 5-4 Гр

Определенные параметры клеточного цикла в контроле и после облучения позволили предсказать временную зависимость частот простых и комплексных ХА в клетках первого митоза Расчетные частоты ХА в зависимости от времени фиксации представлены на рис 13, А, Б Из графиков видно, что частоты аберраций зависят от времени фиксации слабо Экспериментальные данные [ЕкМтап е* а1, 2006] также показывают при различных дозах слабую зависимость либо отсутствие зависимости частоты аберраций первого митоза от времени (рис.13, В)

Результаты компьютерных экспериментов согласуются с данными по кинетике прохождения митозов необлученными лимфоцитами человека (рис.12, А) в случае высоких дисперсий продолжительности фаз клеточного цикла и, следовательно, быстрой десинхронизации популяции лимфоцитов. Это приводит к большой вариации времени вступления клеток в первый митоз (Тм)), от 30 до более чем 90 часов, среднее <ТМ1>=45 часов То же самое наблюдается и после облучения, но <ТМ1> вследствие задержки клеточного цикла выше Время задержки клеточного цикла (^ц) в данной модели является функцией числа ДР ДНК При рентгеновском облучении в рассматриваемом диапазоне доз флуктуации числа ДР малы Следовательно, малы и флуктуации ^ц Например, при Б=1 Гр расчетное среднее время задержки <^„>=3 5 ч, озц=0 5 ч Таким образом, клетки с «бблыыим» числом ДР задерживаются на <1зц>+0зц=4 часа, а клетки с «меньшим» числом ДР -на <1зц>-а3ц=3 часа Т о для клеток с «большим» числом ДР величина Тмх варьируется приближенно от 34 до 94 часов, а для клеток с «меньшим» чис-

лом ДР - от 33 до 93 часов Сравнивая эти диапазоны с диапазоном ТМ1 в контроле (30-90 ч), можно сделать вывод, что естественная стохастика Тм[ в популяции лимфоцитов человека (т.е естественная десинхронизация популяции) маскирует радиационно-индуцированную. ТмЬ а следовательно, и вероятность прихода клетки в первый митоз в момент 1 зависит от числа ДР ДНК в данной клетке очень слабо. Поскольку ДР являются первичным повреждением при формировании ХА, вероятность прихода клетки в первый митоз и от числа аберраций практически не зависит Отсюда вытекает равенство наблюдаемых частот ХА в клетках первого митоза в разные моменты времени и истинных частот ХА в интерфазе Таким образом, слабая зависимость частоты аберраций первого митоза от времени фиксации обусловлена двумя факторами а) быстрой десинхронизацией популяции лимфоцитов, не связанной с облучением; б) особенностями рентгеновского облучения Для популяций клеток, поддерживающих высокую синхронность, и/или для плотноионизирующего излучения эффект увеличения наблюдаемых частот ХА в клетках первого митоза со временем вполне возможен

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 Впервые разработаны методы расчета, позволяющие предсказывать основные наблюдаемые характеристики радиационно-индуцированных хромосомных аберраций (типы, дозовые зависимости и др) путем получения и использования количественной информации о контактах между структурными элементами хромосом в ядре на основе учета структуры и динамики интерфазных хромосом 2. Показано, что в конденсированных (глобулярных) хромосомах или областях хромосом ХА формируются преимущественно по механизму «предсуществовавшего контакта» (обмены между поврежденными участками, находившимися в контакте в момент облучения), в то время как в деконденсированных лимитирующим фактором является движение повреждений после облучения («кинетический механизм») 3 Исследованы два различных механизма образования межхромосомных аберраций «предсуществовавшего контакта» и «кинетический механизм» Показано, что оба механизма не обеспечивают наблюдаемого (тШБН) высокого соотношения числа комплексных и простых обменов

Предложена гипотеза о новом механизме образования аберраций, основанном на конформационных перестройках структуры хроматина

4 Обнаружено, что крупномасштабная структура хромосом влияет на форму дозовых зависимостей частот простых внутрихромосомных аберраций В конденсированных хромосомах дозовые кривые линейны для a-частиц и сигмоидны для рентгеновского излучения В деконден-сированных хромосомах дозовые кривые линейно-квадратичны для а-частиц и квадратичны для рентгеновского излучения

5 Показано, что распределение участков, по которым образуются радиа-ционно-индуцированные внутрихромосомные аберрации, по длине хромосомы зависит от структуры хромосом Для деконденсированных хромосом места внутрихромосомных обменов распределены равномерно по длине хромосомы, а для конденсированных - неравномерно

6 Показано, что внутрихромосомные комплексные ХА должны образовываться намного чаще (до 10 раз при малых дозах), чем наблюдается в эксперименте методом CAP-FISH (с индивидуальным окрашиванием плеч хромосом) Разницу составляют, главным образом, внутриплече-вые комплексы, которые вследствие однородной окраски плеча в эксперименте не детектируются или детектируются как простые

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Андреев С Г, Эйдельман Ю А "Глобулярная модель интерфазной хромосомы и внутрихромосомные обменные аберрации", Радиационная Биология Радиоэкология 1999, т 39, стр 10-20.

2 Andreev S G, Exdelman Yu A "Efficiency of Intrachange Formation at Low Doses is Determined Ъу Condensation State of Interphase Chromosomes", m Low Doses of Radiation are They Dangerous? ed by E В Burlakova, NovaS-cience Publishers, Inc , New York, 2000

3 Андреев С.Г., Эйдельман Ю А "Пути обменных взаимодействий хромосомных повреждений, приводящих к внутрихромосомным аберрациям, зависят от структуры интерфазной хромосомы", Радиационная Биология Радиоэкология 2001 т.41, стр 469-474

4 Andreev S G, Eidelman YuA "Intrachromosomal Exchange Aberrations Predicted on the Basis of Globular Interphase Chromosome Model", Radiation Protection Dosimetry, v 99 (2002), pp 193-196.

5 Eidelman Yu A, Andreev S G "Biophysical Study of Globular Organization of Interphase Chromosomes", Radiation Protection Dosimetry, v 99 (2002), pp 217-218

6 Khvostunov I.K., Andreev S G, Eidelman Yu A "Biophysical Analysis of Radiation Induced Initial DNA Fragmentation", Radiation Protection Dosimetry, v 99 (2002), pp.151-152.

7 Андреев С Г, Эйдельман Ю А, Хвостунов И К, Сальников И В., Талызина ТА Радиационные повреждения генетических структур клетки Экспериментальные данные и результаты молекулярного моделирования В кн. Лекции школы по радиобиологии в Галактике, под ред А С Саенко, Обнинск 2003 г 7-39

8 Андреев С.Г., Эйдельман Ю.А., Хвостунов И К., Сальников И В, Талызина ТА Биофизическое моделирование радиационных повреждений генетических структур клетки Радиационная Биология Радиоэкология, 2005, т 45, №5, сгр 549-560

9 Андреев С Г, Эйдельман Ю А, Талызина Т А Структурная организация хромосом и радиационно-нидуцированные межхромосомные аберрации Радиационная Биология Радиоэкология, 2006, т 46, №1, сгр 16-19.

10 Eidelman Yu А, Ritter S., Nasonova E., Lee R, Talyzma T A., Andreev S G. Prediction of dose response for radiation induced exchange aberrations taking cell cycle delays mto account Radiat Prot Dosim 2006, v 122, №1-4, pp 185-187

11 Andreev S G, Eidelman Yu A, Talyzma T.A "Globular Structure of Interphase Chromosome and Alpha Particles Induced Intrachanges", in: "European Radiation Research 2000 3(fh Annual Meeting of European Society for Radiation Biology Warsaw, Poland 2fh-31st August 2000 Abstracts"

12 Eidelman Yu A, Talyzma T A, Andreev S G. "Formation of Low-LET Radiation Induced Intrachromosome Exchanges May Depend on Large-Scale Chromosome Structure", m "European Radiation Research 2000 3(f Annual Meeting of European Society for Radiation Biology Warsaw, Poland 2?h-31st August 2000 Abstracts"

13 Andreev S G, Eidelman Yu.A., Talyzma T.A "Globular Structure of Interphase Chromosome and Radiation Induced Intrachanges", m "Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution Abstracts", Dubna, 2000, p 57

14 Andreev S G, Eidelman Yu A "Globular Chromatin Organization m the Interphase Chromosome Territories", in "Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution AbstractsDubna, 2000, p 212

15.Eidelman Yu A., Andreev S G "Biophysical study of globular organization of interphase chromosomes" In "13th symposium on microdosimetry An interdisciplinary meeting on radiation quality, molecular mechanisms, cellular effects and health consequence of low level ionizing radiation May 27 - June 1, 2001", PF10

16 Andreev S G, Eidelman Yu A. "Intrachromosomal exchange aberrations predicted on the basis of globular interphase chromosome model". In "13th symposium on microdosimetry An interdisciplinary meeting on radiation quality, molecular mechanisms, cellular effects and health consequence of low level ionizing radiation May 27- June 1, 2001".

17 Хвостунов И К, Эйдельман Ю А, Андреев С Г «Биофизический анализ образования фрагментов ДНК под действием тяжелых ионов», в кн «IV съезд по радиационным исследованиям, Москва, 20-24 ноября 2001 г Тезисы докладов», т 3, стр. 776

18 Эйдельман Ю А, Андреев С Г «Количественный анализ индукции комплексных внутрихромосомных аберраций», в кн.. «IV съезд по радиационным исследованиям, Москва, 20-24 ноября 2001 г Тезисы докладов», т 3,стр 777

19 Эйдельман Ю А, Талызина Т А, Андреев С Г «Роль структурной организации интерфазных хромосом в образовании внутрихромосомных обменных аберраций», в кн . «IV съезд по радиационным исследованиям, Москва, 20-24 ноября 2001 г Тезисы докладов», т 3, стр 778

20 Andreev S G, Eidelman Yu А, Talyzina Т A "4D Nuclear Organization and Radiation Induced Chromosome Aberrations Quantitative Relationships", m. "European Radiarion Research 2004 The 33rd Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, Budapest, Hungary, August 25-28, 2004", p45

21 Андреев С Г, Эйдельман Ю А и др «Новая методология прогнозирования канцерогенных эффектов ионизирующей радиации на основе количественной информации о механизмах формирования повреждений генома», в кн . «Фундаментальные науки — медицине, конференция 2-3 декабря 2004 года Тезисы докладов», Москва, 2004, стр.205

22 Андреев С Г., Эйдельман Ю А. «Биофизическое моделирование канцерогенеза», в кн «Междисциплинарный семинар «Биофиизка онкологических процессов», Санкт-Петербург, 7-8 декабря 2004», С -Петербург, 2004, стр.6

23 Andreev S G, Eidelman Y А , Khvostunov I.K, Salmkov I.V Mechanistic modelling of genetic and epigenetic events m radiation carcinogenesis. In "14th international symposium on microdosimetry An interdisciplinary meeting on ionizing radiation quality, molecular mechanisms, cellular effects, and their consequences for low level risk assessment and radiation therapy November 13-18, 2005, Venezia, Italy"

24 Eidelman Yu A., Ritter S, Nasonova E, Lee R, Talyzma T A, Andreev S.G Prediction of Dose Response for Radiation Induced Exchange Aberrations taking Cell Cycle Delays into account In "14th international symposium on microdosimetry An interdisciplinary meeting on ionizing radiation quality, molecular mechanisms, cellular effects, and their consequences for low level risk assessment and radiation therapy November 13-18, 2005, Venezia, Italy", P A6

25 Андреев С Г., Эйдельман Ю А, Сальников И В, Алещенко А В, Семенова Л П., Борисова Л Р , Хвостунов И. К, Красавин Е. А , Говорун Р Д, Кошлань И В, Кошлань Н. А «Новая методология прогнозирования канцерогенных эффектов ионизирующей радиации на основе количественной информации о механизмах формирования повреждений генома», в кн «Фундаментальные науки — медицине, конференция 2-3 декабря 2004 года Тезисы докладов», Москва, 2005, стр 183

26.Эйдельман Ю А, Ритгер С., Насонова Е, Ли Р., Талызина Т А, Андреев С Г. «Предсказание частот радиационно-индуцированных хромосомных аберраций с учетом задержки клеточного цикла», в кн «V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), Москва, 10-14 апреля 2006 г Тезисы докладов'», т.З, стр 78

27.Сальников И В, Эйдельман Ю.А., Андреев С.Г. «Биофизическое моделирование репарации ДР ДНК под действием плотноионизирующей радиации», в кн. «V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), Москва, 10-14 апреля 2006 г Тезисы докладов», т 3, стр 70-71

Подписано в печать 21 08 2007 г Исполнено 22 08 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 636 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 www autoreferat.ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций"

Хромосомные аберрации (ХА) считаются одним из наиболее чувствительных индикаторов радиационно-индуцированных генетических изменений. Определение дозовых зависимостей частот хромосомных обменных аберраций (дицентриков, транслокаций) in vitro используется в биодозиметрии для оценок поглощенных доз у людей, пострадавших в результате облучения (ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители загрязненных территорий, космонавты и т.д.) [1,2,3]. Хромосомным аберрациям принадлежит, по современным представлениям, важная роль в злокачественной трансформации клеток [4]. Это связано с нарушением регуляции экспрессии генов, например, вследствие того, что активные гены в результате перестроек хромосом могут оказаться в репрессированном состоянии, удалены от регуляторных участков и/или попасть в гетерохроматиновую область хромосом. ХА могут быть использованы в качестве доклинического маркера канцерогенного риска для выявления онкологических заболеваний.

Определение частот ХА в большинстве случаев производится методом FISH для отдельных хромосом, а затем частоты пересчитываются на геном [5]. При пересчете частот ХА с одной хромосомы на геном предполагается, что вероятность участия хромосом в обменных перестройках пропорциональна количественному содержанию в них ДНК. К настоящему времени накопилось достаточно данных, не согласующихся с этим предположением, что указывает на необходимость исследования механизмов образования ХА, в том числе для объяснения причин неслучайного участия хромосом в обменных перестройках.

Механизмы образования ХА являлись объектом исследования с самого начала развития радиационной цитогенетики. В 1929 году Серебровским была выдвинута гипотеза о механизме образования аберраций «предсуществовавшего контакта» (contact-first) [6]. Согласно этой гипотезе, необходимым условием образования аберрации с участием двух хромосом является контакт этих хромосом в момент облучения. В 1931 году Стэдлером была предложена противоположная концепция, согласно которой сначала под действием радиации образуются разрывы хромосом, а после этого они приходят в контакт и образуют аберрацию (breakage-first)

7].

Эксперименты, выполненные на традесканции в конце 30-х - начале 40-х годов [8,9,10], послужили базисом для создания теории разрывов и воссоединений (Breakage and Reunion). Математический аппарат был создан Ли [11]. Согласно теории разрывов и воссоединений, первичным эффектом действия радиации является разрыв хроматиды (т.н. «первичный разрыв») с образованием свободных концов, которые могут свободно мигрировать в пространстве ядра. Далее возможны три варианта. 1) Концы воссоединяются, образуя неповрежденную хромосому. 2) Если на некотором расстоянии от данного первичного разрыва образовался второй, образовавшиеся свободные концы могут свободно взаимодействовать, образовывая ХА. 3) Часть первичных разрывов могут не восстановиться и не взаимодействовать с другими. Хромосома остается разорванной; при подсчете аберраций в метафазе оставшийся ацентрический фрагмент виден как терминальная делеция.

Первым вариантом теории разрывов и воссоединений является модель «случайных разрывов и воссоединений» (Random Breakage and Reunion) [11]. Согласно этой модели, разрывы распределены случайно по длине хромосомы, и взаимодействие любых двух свободных концов равновероятно, независимо от расстояния между ними в момент их образования и других факторов. На основе модели случайных разрывов и воссоединений была разработана система CAB, позволяющая предсказывать типы и частоты межхромосомных [12] и внутрихромосомных [13] аберраций в зависимости от числа поврежденных хромосом, хромосомных плеч и числа разрывов на этих хромосомах (аббревиатура CAB означает Chromosomes/Arms/Breaks). Количественные предсказания системы CAB основаны а) на равновероятности всех взаимодействий (как правильных, так и неправильных); б) на пренебрежении вероятностью невзаимодействия двух или большего числа разрывов, т.е. образованием неполных обменов.

Альтернатива теории разрывов и воссоединений, «обменная теория» (Exchange theory), была предложена в 1955 году Ревеллом [14]. В основе обменной теории Ревелла лежат следующие постулаты. 1) Первичным эффектом ионизирующей радиации является не разрыв хроматиды, а нестабильное повреждение (природа которого была не определена) с ограниченным временем жизни. Если поблизости отсутствуют другие повреждения, то данное повреждение исчезнет. При этом никогда не образуются разрывы, наблюдаемые как терминальные делеции. 2) Если, прежде чем исчезнуть со временем, два повреждения окажутся поблизости друг от друга, они могут вступить в обмен, в результате которого образуется аберрация. Взаимодействия повреждений в обменной теории строго парные. 3) Обмен может произойти не до конца, вследствие чего образуется неполная аберрация. Такие аберрации, как правило, наблюдаются как терминальные делеции.

Обобщенной теорией, позволяющей объяснить многие биологические эффекты радиации, в том числе ХА, является теория дуального действия радиации [15]. Согласно этой теории, эффект обусловлен взаимодействием двух первичных повреждений, образованных в чувствительном объеме. Теория не конкретизирует ни природы повреждений, ни что собой представляет чувствительный объем; предполагается, что повреждения образуются с вероятностью, пропорциональной энерговыделению в объеме, и взаимодействуют случайным образом, т.е. вероятность взаимодействия пропорциональна квадрату величины энерговыделения. На основе этих предположений была выведена линейно-квадратичная зависимость эффекта от дозы, причем линейная компонента определяется взаимодействием повреждений, образованных одним треком, а квадратичная - разными треками. Теория дуального действия не противоречит ни теории разрывов и воссоединений, ни обменной; она обеспечивает математический формализм, позволяющий описывать дозовые зависимости частот ХА на базе как одной, так и другой теории, в предположении о случайности взаимодействий.

При создании теории разрывов и воссоединений и обменной теории не было известно, что собой представляют первичные повреждения. В дальнейшем было предположено (и на сегодняшний день является общепризнанным), что основным повреждением ДНК, ведущим к образованию ХА, являются двунитевые разрывы (ДР) ДНК, и аберрации образуются вследствие ошибочной репарации ДР [16,17,18]. Чедвик и Линхаутс [19] предположили, что для образования обмена необходим лишь один ДР ДНК (чем их теория принципиально отличается от двух предыдущих, согласно которым повреждений обязательно должно быть как минимум два). Этот ДР репарируется на неповрежденной матрице, обладающей микрогомологией с поврежденным участком, по механизму рекомбинации, предложенному Резником [20]. В процессе репарации на неповрежденной матрице образуется т.н. энзиматический ДР; затем в случае ошибочной репарации эти два ДР взаимодействуют с образованием ХА. Эта теория (получившая название «молекулярная теория») позволяет объяснить некоторые факты, не укладывающиеся в рамки теории разрывов и воссоединений и обменной теории, в частности линейную форму дозовых кривых простых ХА, образующихся при действии сверхмягких рентгеновских лучей [21]. Согласно теории дуального 5 новских лучей [21]. Согласно теории дуального действия, линейная форма дозовых кривых объясняется преобладанием внутритрековых взаимодействий повреждений над межтрековыми; однако треки сверхмягких рентгеновских лучей в ткани имеют длину порядка 7 нм, и вероятность образования более чем одного ДР одним треком представляется незначительной.

В то же время молекулярная теория имеет ряд недостатков. Согласно ей, все простые ХА (т.е. образованные одним взаимодействием, одним ДР ДНК) должны образовываться с частотой, пропорциональной дозе, что не всегда верно (например, [22]). Кроме того, репарация по механизму гомологичной рекомбинации, необходимая, согласно молекулярной теории, для образования ХА, в клетках эукариот происходит преимущественно в G2 фазе клеточного цикла [23]. В Go/Gi фазе, где и образуются ХА, преобладает репарация по механизму негомологичного воссоединения концов (Non-Homologous End Joining, NHEJ), которая, по современным представлениям, не требует наличия неповрежденной матрицы для репарации [23,24].

Основываясь на том, что, согласно наблюдениям, ХА образуются в транскрипционно-активных областях хроматина чаще, чем в транскрип-ционно-неактивных [25,26,27], Рэдфорд предложил механизм образования ХА, ассоциированный с транскрипцией [28]. Он предположил, что ДНК-топоизомераза I, входящая в состав транскрипционной фабрики, задерживает ДР на центре транскрипции [29], после чего комплекс ДНК-топоизомеразы I с ДР взаимодействует с участком неповрежденной молекулы ДНК, находящейся на том же центре.

К сожалению, эта модель оставляет неясным вопрос, как происходит образование ХА в транскрипционно-неактивном хроматине. Кроме того, хотя в модели постулируется взаимодействие поврежденного участка ДНК с неповрежденным, взаимодействие двух поврежденных участков в рамках предложенного механизма также возможно.

Развитие представлений о механизмах образования ХА тесно связано с развитием экспериментальных методов исследования ХА. До конца 80-х годов XX века основным методом изучения ХА являлось однородное окрашивание хромосом плюс фиксация метафаз с помощью колхицина спустя определенное время после облучения. Этот метод позволяет наблюдать лишь некоторые типы ХА: дицентрики (а также мультицентри-ки), кольца, ацентрические фрагменты. Другие типы простых (инверсии, транслокации) и комплексных (инсерции и др.) ХА с помощью этого метода не видны. Кроме того, поскольку все хромосомы окрашиваются одним цветом, нельзя различать ХА, образованные более чем двумя хромосомами (за исключением трицентриков) и, соответственно, исследовать относительное вовлечение тех или иных хромосом в образование ХА. Как следствие этого ограничения, все теории образования ХА, существовавшие в то время (теория разрывов и воссоединений, обменная теория, теория дуального действия), подразумевали взаимодействие двух повреждений при образовании аберрации и не рассматривали возможность более сложных взаимодействий.

Несмотря на низкую информативность окрашивания хромосом с помощью Giemsa, в исследованиях, не требующих детальной информации о типах и частотах ХА, этот метод часто применяется до сих пор. Так, для исследования зависимости частот ХА от временного интервала между облучением и подсчетом ХА в настоящее время используется методика FPG (fluorescence plus Giemsa) с одновременным мечением хромосом бромде-зоксиуридином (BrdU) [30].

В 80-х годах был разработан метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), позволяющий метить флюоресцентным красителем отдельные хромосомы или участки хромосом [31]. Появление метода FISH позволило наблюдать аберрации, которые невозможно было детектировать ранее: транслокации, а также сложные (комплексные) ХА с участием меченой хромосомы. Именно с появлением метода FISH были сформированы представления о комплексных аберрациях [32,33] и впервые поставлен вопрос о механизмах их образования.

Стандартный метод FISH с окрашиванием отдельных хромосом, однако, давал ряд неопределенностей. Во-первых, он позволял наблюдать ХА только с участием меченых хромосом, причем только межхромосомные. Во-вторых, в случае комплексной ХА не было однозначного соответствия между типом аберрации и ее экспериментально наблюдаемым проявлением. Так, в работе [12] было продемонстрировано, что одна и та же ХА с участием трех хромосом может выглядеть в эксперименте по-разному в зависимости от того, какая из этих трех хромосом была окрашена; в свою очередь, одна и та же экспериментальная картина может соответствовать разным типам ХА.

Отчасти эти неопределенности были сняты с появлением в 2001 году метода FISH с одновременным окрашиванием всех хромосом (mFISH) [34]. Поскольку все пары хромосом окрашены в индивидуальные цвета, проблема различного визуального представления одних и тех же аберраций была в значительной мере снята (не полностью, т.к. гомологичные хромосомы по-прежнему окрашены одинаково). В то же время неопределенность, связанная с тем, что одна и та же экспериментально наблюдаемая картина может быть вызвана различными типами ХА, по-прежнему осталась, что было продемонстрировано в работах [34,35].

Все вышеприведенные методы не позволяют детектировать существенную часть внутрихромосомных аберраций - инверсии, комплексные аберрации. Первый (и до недавнего времени - наиболее точный) метод, нацеленный на детекцию внктрихромосомных перестроек - разработанный в 1996 году метод CAP-FISH (Chromosome Arm Painting FISH) [36]. В этом методе осуществляется дифференциальное окрашивание обоих плеч и одной хромосомы и центромеров всех хромосом. Метод CAP-FISH позволяет детектировать межплечевые внутрихромосомные перестройки (как простые, так и комплексные) и благодаря этому получать значительно больше информации о внутрихромосомных аберрациях, чем предыдущие методы. В то же время внутриплечевые перестройки (инверсии) детектировать этим методом по-прежнему невозможно.

Наиболее современным методом детекции внутрихромосомных аберраций является метод mBAND [37]. В этом методе осуществляется дифференциальное окрашивание всех бендов (полос) индивидуальной хромосомы, что позволяет не только детектировать все внутрихромосомные перестройки (за исключением самых маленьких, в пределах одного бенда), но и с большой точностью определять, по каким участкам хромосом эти перестройки произошли. К сожалению, в настоящее время этот метод не получил распространения в силу дороговизны.

Появление новых методов экспериментального исследования ХА приводит к получению информации, недоступной ранее. Это, в свою очередь, часто приводит к необходимости пересмотра существовавших представлений о механизмах образования ХА. В частности, внедрение метода mFISH позволило обнаружить, что частоты комплексных ХА намного выше, чем предполагалось ранее [22]. Все существовавшие на тот момент теории образования ХА не могут объяснить столь высокие частоты и сложность межхромосомных комплексных обменов. Следовательно, необходимо предложить новый механизм образования ХА (как простых, так и комплексных), позволяющий объяснить весь комплекс имеющихся данных.

Независимо от того, какая из теорий образования ХА верна, для образования обменных аберраций требуются контакты поврежденных участков хромосом (или поврежденного с неповрежденным) либо в момент облучения, либо со временем после него. Поэтому одной из важнейших проблем при изучении ХА является проблема внутри- и межхромосомных контактов. Это приводит к необходимости учета структуры и динамики хромосом в интерфазном ядре, что было принципиально невозможно на основе всех существующих на сегодняшний день моделей образования ХА.

О важной роли крупномасштабной структуры хромосом и их упаковки в интерфазном ядре при образовании ХА свидетельствует ряд фактов. Межплечевые внутрихромосомные обменные аберрации в хромосоме 1 лимфоцитов человека образуются в 7.4 раза чаще (рентгеновское излучение в дозе 3 Гр), чем предполагается на основе случайных взаимодействий повреждений (в модели случайных взаимодействий вероятность участия повреждения в обмене не зависит от того, где находится это повреждение, т.е. без учета структуры хромосом) [38]. Соотношение между частотами ацентрических фрагментов и центрических колец составляет 5-12 (в зависимости от типов клеток и качества излучения), что существенно выше, чем предсказывает модель случайных взаимодействий (около 2.5) [39]. Распределение точек (мишеней), участвующих в обменных аберрациях (breakpoints), неслучайно по длине хромосомы; R-бенды хромосом (богатые генами) участвуют в обменах чаще, чем G-бенды (содержащие мало генов) [25,26,27]. Частота образования дицентриков при у-облучении лимфоцитов в Gi-фазе выше, чем в Go, где хроматин более конденсирован [26].

В 90-х годах было предположено, что роль структуры хромосомы в образовании ХА сводится к т.н. «эффекту близости» (proximity effect). Суть эффекта близости заключается в том, что повреждения (в терминах обменной теории) или свободные концы (в терминах теории разрывов и воссоединений), образовавшиеся поблизости друг от друга, должны взаимодействовать с большей вероятностью, чем образовавшиеся на большом расстоянии [40]. В работах [39,41] влияние эффекта близости на выход внутрихромосомных аберраций было вычислено на базе теории разрывов и воссоединений для хромосом, имеющих структуру идеального гауссова клубка. Было показано, что учет эффекта близости приводит к увеличению соотношения частот ацентрических фрагментов и центрических колец с 2.5 (рассчитанного для случайных взаимодействий) до примерно 33.5, что, однако, по-прежнему меньше экспериментально наблюдаемых величин. Есть и другие факты, ставящие под сомнение применимость представлений об интерфазной хромосоме как о полимерном клубке. Так, экспериментально было показано, что хромосомные территории в интерфазном ядре практически не перекрываются [42]. Деконденсированное состояние интерфазных хромосом (состояние клубка) приводит либо к сильно перекрывающимся хромосомным территориям, либо к очень большим размерам клеточных ядер.

В 80-х годах было сформировано представление о физических принципах организации интерфазной хромосомы в виде полимерной глобулы [43,44,45]. Позже было показано, что концепция глобулярной структуры интерфазных хромосом согласуется с рядом экспериментальных данных, полученных с помощью лазерной конфокальной микроскопии, как качественных (морфология хромосом), так и количественных (распределение расстояний между флюоресцентными зондами на хромосоме) [46].

Данная работа представляет собой первую попытку исследовать влияние крупномасштабной структуры интерфазных хромосом на образование ХА с использованием информации о структуре (в частности о внутри- и межхромосомных контактах), полученной методами статистической физики полимеров. Для этого необходимо в первую очередь разработать методы биофизического моделирования образования ХА, позволяющие проводить компьютерные эксперименты по измерению количественных характеристик ХА для различных структур хромосом и различных механизмов образования ХА, воспроизводя различные экспериментальные методы детекции ХА (в первую очередь CAP-FISH, mFISH).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Эйдельман, Юрий Александрович

Основные результаты работы

1. Впервые разработаны методы расчета, позволяющие предсказывать основные наблюдаемые характеристики радиационно-индуцированных хромосомных аберраций (типы, дозовые зависимости и др.) путем получения и использования количественной информации о контактах между структурными элементами хромосом в ядре на основе учета структуры и динамики интерфазных хромосом.

2. Показано, что в конденсированных (глобулярных) хромосомах или областях хромосом ХА формируются преимущественно по механизму «предсуществовавшего контакта» (обмены между поврежденными участками, находившимися в контакте в момент облучения), в то время как в деконденсированных лимитирующим фактором является движение повреждений после облучения («кинетический механизм»).

3. Исследованы два различных механизма образования межхромосомных аберраций: «предсуществовавшего контакта» и «кинетический механизм». Показано, что оба механизма не обеспечивают наблюдаемого (п-ЛБН) высокого соотношения числа комплексных и простых обменов. Предложена гипотеза о новом механизме образования аберраций, основанном на конформационных перестройках структуры хроматина.

4. Обнаружено, что крупномасштабная структура хромосом влияет на форму дозовых зависимостей частот простых внутрихромосомных аберраций. В конденсированных хромосомах дозовые кривые линейны для а-частиц и сигмоидны для рентгеновского излучения. В деконденсированных хромосомах дозовые кривые линейно-квадратичны для а-частиц и квадратичны для рентгеновского излучения.

5. Показано, что распределение участков, по которым образуются радиационно-индуцированные внутрихромосомные аберрации, по длине хромосомы зависит от структуры хромосом. Для деконденсированных хромосом места внутрихромосомных обменов распределены

96 хромосом места внутрихромосомных обменов распределены равномерно по длине хромосомы, а для конденсированных - неравномерно.

6. Показано, что внутрихромосомные комплексные ХА должны образовываться намного чаще (до 10 раз при малых дозах), чем наблюдается в эксперименте методом CAP-FISH (с индивидуальным окрашиванием плеч хромосом). Разницу составляют, главным образом, внутриплече-вые комплексы, которые вследствие однородной окраски плеча в эксперименте не детектируются или детектируются как простые.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Эйдельман, Юрий Александрович, Пущино

1. D.C.Lloyd and A.A.Edwards. Biological dosimetry after radiation accidents. In: Chromosome aberrations: basic and applied aspects, ed. by G.Obe and A.T.Natarajan. Berlin: Springer, 1989, pp.212-223.

2. M.Durante et al. A simple method for simultaneous interphase-metaphase chromosome analysis in biodosimetry. Int. J. Radiat. Biol. 1998, v.74, pp.457462.

3. M.P.Hande et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am. J. Hum. Genet. 2003, v.72, pp.1162-1170.

4. UNSCEAR Report: Sources and effects of ionizing radiation, Annex G. pp.73-176 (2000).

5. J.N.Lucas et al. Rapid human chromosome analysis using fluorescence in situ hybridisation. Int. J. Radiat. Biol. 1989, v.56, pp.35-44.

6. A.S.Serebrovsky. A general scheme for the origin of mutations. Am. Nat. 1929, v.53, pp.374-378.

7. L.J.Stadler. The experimental modifications of heredity in crop plants. Sci. Agric. 1931, v. 11, pp.557-572.

8. K.Sax. Chromosome aberrations induced by X-rays. Genetics 1938, v.23, pp.494-516.

9. K.Sax. An analysis of X-ray induced chromosomal aberrations in Trades-cantia. Genetics 1940, v.25, pp.41-68.

10. K.Sax. Types and frequencies of chromosomal aberrations induced by X-rays. Cold Spr. Harb. Symp. Quant. Biol. 1941, v.9, pp.93-101.

11. D.E.Lea. Actions of radiations on living cells, 1st edn., Cambridge Univ. Press, 1946.

12. J.RK.Savage and P.J.Simpson. FISH painting patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 1994, v.312, pp.51-60.

13. J.R.K.Savage. A note on inter-arm intrachange patterns resulting from dualarm fish painting. Mutat. Res. 1997, v.373,pp.265-269.

14. S.H.Revell. A new hypothesis for "chromatid" changes, in: Proc. Radiobi-ology Symposium, 1954, ed. by Z.M.Bacq, P.Alexander. Liege, Butterworth, London, 1955, pp.243-253.

15. A.M.Kellerer and H.H.Rossi. Current topics in radiation research quarterly 1972, v.8, pp.85-108.

16. G.Obe et al. DNA double-strand breaks induced by sparsely ionizing radiation and endonucleases as critical lesions for cell death, chromosomal aberrations, mutations and oncogenic transformation. Mutagenesis 1992, v.7, pp.3-12.

17. A.T.Natarajan. Mechanisms for induction of mutations and chromosome alterations. Environ. Health Perspect. 1993, v. 101, suppl.3, pp.225-229.

18. P.E.Bryant. DNA damage, repair and chromosomal damage. Int J Radiat Biol. 1997, v.7 l,pp.675-80.

19. K.H.Chadwick and H.P.Leenhouts. The rejoining of DNA double-strand breaks and a model for the formation of chromosomal rearrangements. Int. J. Radiat. Biol. 1978, v.33, pp.517-529.

20. M.A.Resnick. The repair of double-strand breaks in DNA: a model involving recombination. J. Theor. Biol. 1976, v.59, pp.97-106.

21. J.Thacker et al. The induction of chromosome exchange aberrations by carbon ultrasoft X-rays in V79 hamster cells. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 1986, v.49, pp.645-56.

22. B.D.Loucas, M.N.Cornforth. Complex chromosome exchanges induced by gamma rays in human lymphocytes: an mFISH study. Radiat. Res. 2001, v. 155, pp.660-671.

23. P.Pfeiffer et al. Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations. Mutagenesis 2000, v. 15, pp.289302.

24. D.B.Roth et al. Mechanisms of nonhomologous recombination in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 1985, v.5, pp.2599-2607.

25. P.Slijepcevic and A.T.Natarajan. Distribution of X-ray-induced G2 chromatid damage among Chinese hamster chromosomes: influence of chromatin conformation. Mutat. Res. 1994, v.323, pp.113-119.

26. A.T.Natarajan et al. Mechanisms of induction of chromosomal aberrations and their detection by fluorescence in situ hybridization. Mutat. Res. 1996, v.372, pp.247-258.

27. W.Martinez-Lopez et al. Intrachromosomal visualization of aberration breakpoints induced by neutrons and gamma rays in Chinese hamster ovary cells. Radiat. Res. 1998, v. 150, pp.585-592.

28. P.Perry and S.Wolff. New Giemsa method for the differential staining of sister chromatids. Nature 1974, v.251, pp. 156-158.

29. D.Pinkel et al. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, v.89, pp.29342938.

30. J.M.Brown and M.S.Kovacs. Visualisation of non-reciprocal chromosome exchanges in irradiated human fibroblasts by fluorescent in situ hybridization. Radiat. Res. 1993, v. 136, pp.71-76.

31. P.J.Simpsom and J.R.K.Savage. Identification of X-ray-induced complex aberrations using fluorescence in situ hybridization: a comparison at two doses. Int. J. Radiat. Biol. 1994, v. 66, pp.629-632.

32. M.N.Cornforth. Analyzing radiation-induced complex chromosome rearrangements by combinatorial painting. Radiat. Res. 2001, v.155, pp.643-659.

33. R.M.Anderson et al. M-FISH analysis shows that complex chromosome aberrations induced by a-particle tracks are cumulative products of localized rearrangements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, v.99, pp.12167-12172.

34. A.T.Natarajan et al. Frequencies of X-ray induced pericentric inversions and centric rings in human blood lymphocytes detected by FISH using chromosome arm specific DNA libraries. Mutat Res. 1996, v.372, pp. 1-7.

35. Chudoba et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes. Cytogenet. Cell Genet. 1999, v.84, pp. 156-160.

36. J.J.W.A.Boei et al. Dose-response curves for X-ray induced interchanges and interarm intrachanges in human lymphocytes using arm-specific probes for chromosome 1. Mutat. Res. 1998, v.404, pp.45-53.

37. R.K.Sachs et al. Intra-arm and interarm chromosome intrachanges: tools for probing the geometry and dynamics of chromatin. Radiat. Res. 1997, v. 148, pp.330-340.

38. J.R.K.Savage. Insight into sights. Mutat. Res. 1996, v.366, pp.81-95.

39. H.Wu et al. Centric rings, acentric rings and excess acentric fragments based on a random-walk interphase chromosome model. Int. J. Radiat. Biol. 1997, v.71, pp.487-496.

40. C.Cremer et al. Nuclear architecture and the induction of chromosomal aberrations. Mutat. Res. 1996, v.366, pp.97-116.

41. С.Г.Андреев и Д.М.Спитковский. Биофизические модели самоорганизации пространственной структуры хроматина. Докл. АН СССР 1983, т.269, с.1500-1502.

42. С.Г.Андреев, Д.М.Спитковский, Т.А.Талызина. Микродозиметрия. Д.: ЛИЯФ, 1986. с.109-142.

43. С.Г.Андреев, Д.М.Спитковский, Т.А.Талызина. Матер. 5-го Всесоюз. совещ. по микродозиметрии. Усть-Нарва, 5-12 марта 1986 г. Т.2. Обзорно-проблемные доклады. М.,1987. с.4-60.

44. С.Г.Андреев и Ю.А.Эйдельман. Глобулярная модель интерфазной хромосомы и внутрихромосомные обменные аберрации. Радиац. Биол. Радиоэкол. 1999, т.39, с. 10-20.

45. V.Yu.Chepel et al. 3-D Computer Modeling of Chromatin Fibers for Radiation Damage Simulation. Radiat. Prot. Dosim. 1994, v.52, pp.259-263.

46. Yu.A.Eidelman and S.G.Andreev. Biophysical study of globular organisation of interphase chromosomes. Radiat. Prot. Dosim. 2002, v.99, pp.217-218.

47. N.E.Morton. Parameters of the human genome. Proc. Natl. Acad. Sxi. USA 1991, v.88, pp.7474-7476.

48. N.Metropolis et al. Equation of state calculations by fast computing machines. J. Chem. Phys. 1953, v.21, pp. 1087-1092.

49. H.Bornfleth et al. Quantitative motion analysis of subchromosomal foci in living cells using four-dimensional microscopy. Biophys. J. 1999, v.11, pp.2871-2886.

50. S.G.Andreev and Yu.A.Eidelman. Intrachromosomal exchange aberrations predicted on the basis of globular interphase chromosome model. Radiat. Prot. Dosim. 2002, v.99, pp. 193-196.

51. S.Dietzel et al. Separate and variably shaped chromosome arm domains are disclosed by chromosome arm painting in human cell nuclei. Chromosome res. 1998, v.6, pp.25-33.

52. C.Munkel et al. Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment. J. Mol. Biol. 1999, v.285, pp.l053-1065.

53. G.Van den Engh et al. Estimating genomic distance from DNA sequence location in cell nuclei by a random walk model. Science 1992, v.257, pp. 14101412.

54. RXSachs et al. A random-walk/giant-loop model for interphase chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, v.92, pp.2710-2714.

55. H.Yokota et al. Evidence for the organization of chromatin in megabase pair-sized loops arranged along a random walk path in the human G0/G1 interphase nucleus. J. Cell Biol. 1995, v.130, pp.1239-1249.

56. W.R.Holley et al. A model for interphase chromosomes and evaluation of radiation-induced aberrations. Radiat Res. 2002, v. 158, pp.568-580.

57. S.Boyle et al. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol. Genet. 2001, v.10, pp.211-219.

58. M.Napolitano et al. Inactivation of СЗН 10T1/2 cells by monoenergetic high LET a-particles. Int. J. Radiat. Biol 1992, v.61, pp.813-820.

59. В.А.Питкевич и В.В.Дуба. Радиобиология 1981, т.21, с.829-835.

60. H.C.Newman et al. The role of higher-order chromatin structure in the yield and distribution of DNA double-strand breaks in cells irradiated with X-rays or alpha-particles. IntJ. Radiat. Biol. 2000, v.76, pp.1085-1093.

61. B.Stenerlow et al. Rejoining of DNA double-strand breaks induced by accelerated nitrogen ions. Int. J. Radiat. Biol. 1996, v.70, pp.413-420.

62. B.Stenerlow et al. Rejoining of DNA fragments produced by radiations of different linear energy transfer. IntJ. Radiat. Biol. 2000, v.76, pp.549-557.

63. H.C.Newman et al. DNA double-strand break distributions in X-ray and alpha-particle irradiated V79 cells: evidence for non-random breakage. Int. J. Radiat. Biol. 1997, v.71, pp.347-363.

64. E.Hoglund et al. DNA damage induced by radiation of different linear energy transfer: initial fragmentation. IntJ. Radiat. Biol. 2000, v.76, pp.539-547.

65. J.R.K.Savage. A brief survey of aberration origin theories. Mutat. Res. 1998, v.404, pp. 139-147.

66. D.Pang et al. Ku proteins join DNA fragments as shown by atomic force microscopy. Cancer Res. 1997, v.57, pp.1412-1415.

67. M.Pinto et al. Evidence for complexity at the nanometer scale of radiation-Induced DNA DSBs as a determinant of rejoining kinetics. Radiat. Res. 2005, v.164, pp.73-85.

68. M.N.Cornforth and J.S.Bedford. A quantitative comparison of potentially lethal damage repair and the rejoining of interphase chromosome breaks in low passage normal human fibroblasts. Radiat. Res. 1987, v.l 11, pp.385-405.

69. Y.Kodama et al. Estimation of minimal size of translocated chromosome segments detectable by fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol. 1997, v.71, pp.35-39.

70. F.Darroudi et al. Kinetics of the formation on chromosome aberrations in X-irradiated human lymphocytes, using PCC and FISH. Mutat. Res. 1998, v.404, pp.55-65.

71. С.Г.Андреев и Ю.А.Эйдельман. Пути обменных взаимодействий хромосомных повреждений, приводящих к внутрихромосомным аберрациям, зависят от структуры интерфазных хромосом. Радиац. Биол. Радиоэкол. 2001, т.41, с.469-474.

72. В.И.Иванов и В.Н.Лысцов. Основы микродозиметрии. М.: Атомиздат, 1979.

73. R.Greinert et al. Chromosome aberrations induced in human lymphocytes by 3.45 MeV alpha particles analyzed by premature chromosome condensation. Radiat. Res. 1999, v. 152, pp.412-420.

74. R.Lee et al. Chromosome aberration yields and apoptosis in human lymphocytes irradiated with Fe-ions of different LET. Adv. Space Res. 2005, v.35, pp.268-275.

75. Ю.Б.Кудряшов. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.: Физматлит, 2004.

76. P.J.Simpson and J.R.K.Savage. Estimating the true frequency of X-ray-induced complex chromosome exchanges using fluorescence in situ hybridization. IntJ. Radiat. Biol. 1995, v.67, pp.37-45.

77. P.J.Simpson and J.R.K.Savage. Dose-response curves for simple and complex chromosome aberrations induced by X-rays and detected using fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol. 1996, v.69, pp.429-436.

78. S.G.Andreev and D.M.Spitkovsky. Cooperative chromatin rearrangements at low doses, in: Proceedings of 5th USSR Conference on Microdosimetry. M., МИФИ, 1987, t.2, c.240-262.

79. С.Г.Андреев, Ю.А.Эйдельман, Т.А.Талызина. Структурная организация хромосом и радиационно-индуцированные межхромосомные аберрации. Радиац. Биол. Радиоэкол. 2006, т.46, стр. 16-19.

80. P.R.Cook. The organization of replication and transcription. Science 1999, v.284, pp. 1790-1795.

81. J.A.Aten et al. Dynamics of DNA double-strand breaks revealed by clustering of damaged chromosome domains. Science 2004, v.303, pp.92-95.

82. L.R.Ferguson et al. Environ. Mol. Mutagen. 1996, v.27, pp.255-262.

83. J.D.Tucker and J.R.Senft. Analysis of naturally occurring and radiation-induced breakpoint locations in human chromosomes 1, 2 and 4. Radiai Res. 1994, v.140, pp.31-36.

84. S.Knehr et al. Chromosome analysis by fluorescence in situ hybridization: Further indications for a non-DNA-proportional involvement of single chromosomes in radiation-induced structural aberrations. Int. J. Radiat. Biol. 1996, v.70, pp.385-392.

85. J.J.W.A.Boei et al. Differential involvement of chromosomes 1 and 4 in the formation of chromosomal aberrations in human lymphocytes after X-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 1997, v.72, pp. 139-145.

86. M.Durante et al. Karyotypes of human lymphocytes exposed to high-energy iron ions. Radiat. Res. 2002, v.158, pp.581-590.

87. C.Weierich et al. Three-dimensional arrangements of centromeres and telomeres in nuclei of human and murine lymphocytes. Chromosome Res. 2003, v.l 1, pp.485-502.

88. M.Cremer et al. Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells. Chromosome Res. 2001, v.9, pp.541-567.

89. M.Scholz et al. Analysis of chromosome damage based on the time course of aberrations. Int. J. Radiat. Biol. 1998, v.74, pp.325-331.

90. S.Ritter et al. Comparison of chromosomal damage induced by X-rays and Ar-ions with an LET of 1840 keV/mm in G, V79 cells. Int. J. Radiat. Biol. 1996, v.69, pp. 155-166.

91. E.Nasonova et al. Cell cycle arrest and aberration yield in normal human fibroblasts. I. Effects of X-rays and 195 MeVu"1 C ions. Int. J. Radiat. Biol. 2004, v.80, pp.621-634.

92. Yu.A.Eidelman et al. Prediction of dose response for radiation induced exchange aberrations taking cell cycle delays into account. Radiat. Prot. Dosim. 2006, v.l 22, №1-4, pp. 185-187.

93. G.R.Hoffmann et al. Higher frequency of chromosome aberrations in late-arising first-division metaphases than in early-arising metaphases after exposure of human lymphocytes to X-rays in G0. Int. J. Radiat. Biol. 2002, v.78, pp.765-772.

94. С.Г.Андреев и др. Биофизическое моделирование радиационных повреждений генетических структур клетки. Радиац. Биол. Радиоэкол. 2005, т.45, с.549-560.

95. J.J.W.A.Boei et al. Detection of chromosomal aberrations by fluorescence in situ hybridization in the first three postirradiation divisions of human lymphocytes. Mutat. Res. 1996, v.349, pp. 127-135.

96. S.Ritter et al. Relationship between aberration yield and mitotic delay in human lymphocytes exposed to 200 Me Vu"1 Fe ions or X-rays. J. Radiat. Res. 2002, v.43 (suppl.), PP.S175-S179.

97. M.Scholz et al. Cell cycle delays induced by heavy ion irradiation of synchronous mammalian cells. Int. J. Radiat. Biol. 1994, v.66, pp.59-75.

Информация о работе

Эйдельман, Юрий Александрович
кандидата физико-математических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы