Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль систем репарации и структуры хроматина эукариотической клетки в интеграции ретровирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Таганов, Константин Дмитриевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Повреждение эукариотической ДНК при интеграции ретровирусов.

2.2. Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках эукариот.

2.3. Семейство Р13К-подобных киназ.

2.4. Формирование клеточного ответа на повреждения ДНК.

2.5. Клеточные белки и интеграция ретровирусов.

2.6. Хроматин и интеграция ретровирусов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Анализ нуклеотидной последовательности участков между ДНК провируса и клетки-хозяина в NHEJ(+) и NHEJ(-) клетках.

4.2. Рапарация промежуточного комплекса интеграции в реакции in vitro.

4.3. Влияние ингибиторов семейства Р13К-киназ на процесс репарации in vitro.

4.4. Влияние структуры хроматина на интеграцию ретровирусной ДНК in vitro.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль систем репарации и структуры хроматина эукариотической клетки в интеграции ретровирусов"

Открытие РНК-содержащих вирусов, или ретровирусов изменило представления о путях реализации генетической информации. Генетический материал ретровирусов представлен двумя копиями одноцепочечных линейных молекул РНК, размер которых находится в пределах 7-12 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Характерная особенность семейства ретровирусов - это способ репликации, который включает в себя жизненно необходимые этапы обратной транскрипции молекул РНК в линейную двухцепочечную ДНК, а также последующую интеграцию этой ДНК в геном клетки хозяина. Интеграция является жизненно важным процессом для ретровирусов. После интеграции вирусный геном становится неотъемлемой частью хромосомной ДНК клетки, а вирус превращается в провирус. Инфицированные клетки могут производить вирусные РНК и белки на протяжении всей жизни, а их дочерние клетки наследуют это свойство. Необходимо отметить, что процесс интеграции является потенциально мутагенным для инфицированных клеток, поскольку в зависимости от локализации сайта интеграции могут быть внесены те или иные нарушения в нормальный клеточный метаболизм.В жизненном цикле ретровирусов задействовано большое число систем метаболизма клетки-хозяина. В качестве затравки при синтезе минус цепи ДНК ретровируса в реакции обратной транскрипции используется клеточная тРНКпро или тРНКлиз в случае ВИЧ, после чего формируется преинтеграционный комплекс (ПК) значительных размеров, включающий как вирусные, так и клеточные белки, который взаимодействует с ядерной мембраной, а позже с хромосомой клетки-хозяина. Строение регуляторных элементов генома провируса таково, что транскрипция и последующая трансляция, обеспечивающие синтез вирусных белков, также осуществляются системами клетки-хозяина. В настоящее время многие аспекты участия клеточных систем в ретровирусном жизненном цикле изучены недостаточно.Данная работа посвящена изучению роли систем репарации клетки-хозяина и структуры ее хроматина в процессе интеграции ретровирусов.Обнаружено, что клетки, имеющие дефекты в системе репарации, основанной на негомологичном соединении концов молекул ДНК (nonhomologous end-joining, NHEJ), гиперчувствительны к повреждениям ДНК. Интеграция ретровирусов воспринимается клеткой как повреждение ДНК, в ответ на которое в клетках с дефектами в NHEJ-пути репарации запускаются процессы программируемой смерти, или апоптоза. Было показано, что некоторое количество клеток с дефектами в NHEJ-пути выживает после ретровирусной инфекции благодаря альтернативному пути репарации.Другим важным клеточным фактором, влияющим на процесс интеграции ретровирусов, является структура хроматина эукариотической ДНК. Обнаружено, что она определяет как выбор сайта интеграции, так и последующие репарационные процессы, и влияет на уровень экспрессии провируса.Диссертационная работа посвящена исследованию механизмов ретровирусной интеграции - процесса, представляющего значительный интерес не только для фундаментальной науки, но и с точки зрения ее прикладных аспектов. Действительно, интеграция ретровируса - это необходимый этап его жизненного цикла и поэтому является подходящей мишенью для антивирусных лекарственных препаратов, поиск которых так необходим для борьбы с синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) вызываемым вирусом иммунодефицита человека (HIV - human immunodeficiency virus).Кроме того, ретровирусы широко используются как векторы при генной терапии, и знание механизмов их интеграции может дать возможность повысить эффективность и безопасность этого терапевтического метода. Кроме того, реакция интеграции - это ценная модель для изучения важного процесса, происходящего в эукариотических клетках, а именно перегруппировки генетического материала. Наконец, благодаря участию клеточных белков в ретровирусной интеграции, изучение последней дает уникальную возможность для изучения молекулярной биологии клетки.Целью настоящей работы было исследование роли систем репарации по NHEJ- и SSAпутям, а также формирования неслучайного профиля интеграции ретровирусов, определяемого влиянием структуры хроматина эукариотической клетки. В связи с этим в работе ставились следующие экспериментальные задачи: 1. Определить нуклеотидную последовательность "спейсорных" участков между ДНК провируса и ДНК клетки-хозяина в контрольных NHEJ(+) и дефектных NHEJ(-) линиях клеток. Проанализировать в этих линиях присутствие и длину повторов ДНК клетки-хозяина, фланкирующих провирус, а также целостность вирусной ДНК.

2. Создать экспериментальную систему in vitro для изучения репарации промежуточного комплекса интеграции, зависящую от присутствия белкового экстракта из клеток HeLa, с помощью которой можно изучать участие белков клетки хозяина, а в частности NHEJ-пути, в заключительном этапе интеграции ретровирусов.3. Создать систему интегации минивирусной ДНК в хроматин in vitro и с ее помощью изучить влияние структуры хроматина ДНК-мишени и присутствие транскрипционных факторов HNF3 и GATA4 на распределение "горячих точек" интеграции.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Таганов, Константин Дмитриевич

1. Определена нуклеотидная последовательность участков интеграции вируса саркомы кур (АЗУ) в ДНК трех линий клеток млекопитающих, компетентных по репарации (МНЕ1(+)

клетки) и четырех линий с дефектами системы незаконной рекомбинации (МНЕ1(-)

клетки), отобранных по экспрессии трансдуцированного в составе ретровируса гена устойчивости к 0418. В то время как в полученных 14 клонах МНЕ1(-) клеток, содержащих единичные провирусы в различных положениях ДНК, наблюдали, как и в КНЕ1(+) клетках, стандартные 6-нуклеотидные повторы, для пяти провирусов в МНЕ1(-) клетках обнаружили 5-нуклеотидные повторы. Эти данные могут свидетельствовать о вовлечении белков МНЕТ-системы в процесс ретровирусной интеграции на стадиях, предшествующих собственно репарации. Полной потери повторов ДНК клетки хозяина не наблюдали.2. Определены нуклеотидные последовательности концевых фрагментов ДНК провирусов ASV, интегрированных в ДНКМНЕ1(-) линий клеток. Ни в одном из 19 анализированных клонов не наблюдали потери концевых фрагментов ДНК провируса. Эти данные наряду с присутствием повторов ДНК клетки-хозяина исключают участие в ретровирусной интеграции пути репарации ДНК, основанного на спаривании однонитевых участков или отжиге комплементарных цепей (SSA-пути).3. Создана система репарации in vitro промежуточного комплекса интеграции, зависящая от присутствия белкового экстракта из клеток HeLa. В присутствии ингибиторов киназ семейства PI3K: вортманина и LY294002 наблюдали подавление репарации (I50 0.7 мМ и

0.8 мМ, соответственно), что свидетельствует о по крайней мере частичном вовлечении NHEJ-пути репарации в реакцию in vitro.4. Применительно к ASV модифицирован полуколичественный метод выявления интеграции ретровируса в ДНК клеток HeLa, основанный на ПЦР с использованием одного праймера на высокоповторяющиеся в геноме Alu-повторы, а другого - на концевые повторы провируса (Alu-ПЦР). С его помощью определили, что кофеин - ингибитор киназ ATR и A T M , подавляет интеграцию ретровирусов (I50 1.5 мМ). Этот эффект также наблюдали в системе репарации in vitro промежуточного комплекса интеграции, зависящей от присутствия белкового экстракта из клеток HeLa (I50 0.5 мМ). Поскольку известно, что эффективность ретровирусной интеграции в АТМ(-) клетках остается нормальной, эти опыты могут свидетельствовать об участии киназы A T R в процессе интеграции ретровирусов.5. Создана система интегации in vitro минивирусной ДНК в хроматин, позволяющая наблюдать возникновение "горячих точек" интеграции при сборке нуклеосом на ДНКмишени с периодичностью шагом длиной 10 п.н.. Наблюдали понижение эффективности реакции интеграции in vitro при компактизации хроматина с помощью гистона HI .Добавление очищенных транскрипционных факторов HNF3, GATA4 или обоих вместе приводит к значительным изменениям в распределение "горячих точек" интеграции, причем эффект при их совместном добавлении не аддитивен. Полученные данные свидетельствуют о значении структуры хроматина для процесса интеграции ретровирусов.БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям проф. д.б.н.Ольге Олеговне Фаворовой за внимательное руководство и критицизм и проф. Анну-Марию Скалка за предоставленную возможность выполнения работы в ее лаборатории и поддержку; Рене Даниелу и Ричарду Кацу за уроки научного мышления, интерес к работе и ценные советы; коллективу лаборатории, Марку Андраке, Джерджу Меркелу, Патрисии Роат и Ким Боланд, за помощь в проведении экспериментов; проф. Кену Зарету за помощь в обсуадении полученных результатов.Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой и проф. Эрике Големис за организацию программы сотрудничества между Россиийским государственным медицинским университетом и Фокс-Чейзовским онкологическим центром.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Таганов, Константин Дмитриевич, Москва

1. Aiyar, А., Р. Hindmarsh, А. М. Skalka, and J. Leis. 1996. Concerted integration of linearretroviral DNA by the avian sarcoma virus integrase in vitro: dependence on both long terminal repeat termini. J Virol 70:3571-80.

2. Ajimura, M . , S. H. Leem, and H. Ogawa. 1993. Identification of new genes required formeiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 133:51-66.

3. Anderson, C. W., and S. P. Lees-Miller. 1992. The nuclear serine/threonine protein kinaseDNA-PK. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2:283-314.

4. Bai, Y . , and L. S. Symington. 1996. A Rad52 homolog is required for RAD51-independentmitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 10:2025-37.

5. Bannister, A, J., T. M . Gottlieb, T. Kouzarides, and S. P. Jackson. 1993. c-Jun isphosphorylated by the DNA-dependent protein kinase in vitro; definition of the minimal kinase recognition motif. Nucleic Acids Res 21:1289-95.

6. Baumann, P., and S. C. West. 1998. DNA end-joining catalyzed by human cell-free extracts.Proc Natl Acad Sci U S A 95:14066-70.

7. Baumann, P., and S. C. West. 1998. Role of the human RAD51 protein in homologousrecombination and double- stranded-break repair. Trends Biochem Sci 23:247-51.

9. Bertuch, A. , and V . Lundblad. 1998. Telomeres and double-strand breaks: trying to makeends meet. Trends Cell Biol 8:339-42.

10. Blasina, A. , I. V. de Weyer, M . C. Laus, W. H. Luyten, A. E. Parker, and C. H. McGowan.1999. A human homologue of the checkpoint kinase Cdsl directly inhibits Cdc25 phosphatase. Curr Biol 9:1-10.

11. Bosma, G. C , R, P. Custer, and M . J. Bosma. 1983. A severe combined immunodeficiencymutation in the mouse. Nature 301:527-30.

12. Brin, E., J. Y i , A . M . Skalka, and J. Leis. 2000. Modeling the late steps in HIV-1 retroviralintegrase-catalyzed DNA integration. J Biol Chem 275:39287-95.

13. Brown, E. J., and D. Baltimore. 2000. ATR disruption leads to chromosomal fragmentationand early embryonic lethality. Genes Dev 14:397-402.

14. Brown, P. O., B. Bowerman, H. E. Varmus, and J. M . Bishop. 1989. Retroviral integration:structure of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc Natl Acad Sci U S A 86:2525-9.

15. Brunborg, G., and D. H. Williamson. 1978. The relevance of the nuclear division cycle toradiosensitivity in yeast. Mol Gen Genet 162:277-86.

17. Burma, S., B. P. Chen, M . Murphy, A . Kurimasa, and D. J. Chen. 2001. A T MPhosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem 276:424627.

18. Busse, P. M . , S. K. Bose, R. W. Jones, and L. J. Tolmach. 1978. The action of caffeine on Xirradiated HeLa cells. III. Enhancement of X-ray-induced killing during G2 arrest. Radiât Res 76:292-307.

19. Carty, M . P., M . Zernik-Kobak, S. McGrath, and K. Dixon. 1994. U V Hght-induced DNAsynthesis arrest in HeLa cells is associated with changes in phosphorylation of human singlestranded DNA-binding protein. Embo J 13:2114-23.

21. Chow, S. A. , K. A. Vincent, V. Elhson, and P. O. Brown. 1992. Reversal of integration andDNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus. Science 255:723-6.

22. Cirillo, L. A., F. R. Lin, I. Cuesta, D. Friedman, M . Jamik, and K. S. Zaret. 2002. Opening ofCompacted Chromatin by Early Developmental Transcription Factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Mol Cell 9:279-89.

23. Clarke, A . R., C. A. Purdie, D. J. Harrison, R. G. Morris, C. C. Bird, M . L. Hooper, and A.H. Wyllie. 1993. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nature 362:849-52.

24. Coffin J.M., S. H. H. , H.E. Varmus. 1997. Retroviruses. Cold Spring Harbor LaboratoryPress.

25. Cortez, D., Y. Wang, J. Qin, and S. J. Elledge. 1999. Requirement of ATM-dependentphosphorylation of brcal in the DNA damage response to double-strand breaks. Science 286:1162-6.

27. Craigie, R. 1995. Resolving a resolvase. Nat Struct Biol 2:607-9.

28. Craigie, R., T. Fujiwara, and F. Bushman. 1990. The IN protein of Moloney murine leukemiavirus processes the viral DNA ends and accomplishes their integration in vitro. Cell 62:829-37.

29. Craigie, R., and K. Mizuuchi. 1985. Mechanism of transposition of bacteriophage Mu:structure of a transposition intermediate. Cell 41:867-76.

30. Critchlow, S. E., and S. P. Jackson. 1998. D N A end-joining: from yeast to man. TrendsBiochem Sci 23:394-8.

31. Daniel, R., R. A . Katz, G. Merkel, J. C. Hittle, T. J. Yen, and A. M . Skalka. 2001.Wortmannin potentiates integrase-mediated killing of lymphocytes and reduces the efficiency of stable transduction by retroviruses. Mol Cell Biol 21:1164-72.

32. Daniel, R., R. A. Katz, and A. M . Skalka. 1999. A role for DNA-PK in retroviral DNAintegration. Science 284:644-7.

33. Daniel, R., S. Litwin, R. A. Katz, and A. M . Skalka. 2001. Computational analysis ofretrovirus-induced scid cell death. J Virol 75:3121-8.

34. Dhar, R., W. L. McClements, L. W. Enquist, and G. F. Vande Woude. 1980. Nucleotidesequences of integrated Moloney sarcoma provirus long terminal repeats and their host and viral junctions. Proc Natl Acad Sci U S A 77:3937-41.

35. Dorshkind, K., G. M . Keller, R. A . Phillips, R. G. Miller, G. C. Bosma, M . O'Toole, and M .J. Bosma. 1984. Functional status of cells from lymphoid and myeloid tissues in mice with severe combined immunodeficiency disease. J Immunol 132:1804-8.

36. Downs, J. A. , N . F. Lowndes, and S. P. Jackson. 2000. A role for Saccharomyces cerevisiaehistone H2A in DNA repair. Nature 408:1001-4.

37. Durocher, D., and S. P. Jackson. 2001. DNA-PK, A T M and ATR as sensors of DNAdamage: variations on a theme? Curr Opin Cell Biol 13:225-31.

38. EUedge, S. J. 1996. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science 274:166472,

39. Engelman, A., K. Mizuuchi, and R. Craigie. 1991. HIV-1 DNA integration: mechanism ofviral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell 67:1211-21.

40. Essers, J., H. van Steeg, J. de Wit, S. M . Swagemakers, M . Vermeij, J. H. Hoeijmakers, andR. Kanaar. 2000. Homologous and non-homologous recombination differentially affect DNA damage repair in mice. Embo J 19:1703-10.

41. Famet, C. M . , and W. A. Haseltine. 1991. Determination of viral proteins present in thehuman immunodeficiency virus type 1 preintegration complex. J Virol 65:1910-5.

42. Famet, C. M . , and W. A. Haseltine. 1990. Integration of human immunodeficiency virus type

43. DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 87:4164-8.

44. Fitzgerald, M . L., and D. P. Grandgenett. 1994. Retroviral integration: in vitro host siteselection by avian integrase. J Virol 68:4314-21.

45. Flint S J, E . L., Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of virolog:molecular biology. Pathogenesis, and contorl. A S M Press, Washington D.C.

46. Fujiwara, T., and R. Craigie. 1989, Integration of mini-retroviral DNA: a cell-free reactionfor biochemical analysis of retroviral integration. Proc Natl Acad Sci U S A 86:3065-9.

47. Fujiwara, T., and K. Mizuuchi. 1988. Retroviral DNA integration: structure of an integrationintermediate. Cell 54:497-504.

48. Gaillard, P. H., E. M . Martini, P. D. Kaufman, B. Stillman, E. Moustacchi, and G. Almouzni.1996. Chromatin assembly coupled to DNA repair: a new role for chromatin assembly factor I. Cell 86:887-96.

49. Gallay, P., S. Swingler, J. Song, F. Bushman, and D. Trono. 1995. HIV nuclear import isgoverned by the phosphotyrosine-mediated binding of matrix to the core domain of integrase. Cell 83:569-76.

50. Game, J. C. 2000. The Saccharomyces repair genes at the end of the century. Mutat Res451:277-93.

52. Gately, D. P., J. C. Hittle, G. K. Chan, and T. J. Yen. 1998. Characterization of A T Mexpression, localization, and associated DNA-dependent protein kinase activity. Mol Biol Cell 9:2361-74.

53. Gerton, J. L., D. Herschlag, and P. O. Brown. 1999. Stereospecificity of reactions catalyzedby HIV-1 integrase. J Biol Chem 274:33480-7.

54. GottUeb, T. M. , and S. P. Jackson. 1993. The DNA-dependent protein kinase: requirementfor DNA ends and association with Ku antigen. Cell 72:131-42.

55. Grunstein, M . 1990. Nucleosomes: regulators of transcription. Trends Genet 6:395-400.

56. Haber, J. E. 1999. DNA repair. Gatekeepers of recombination. Nature 398:665, 667.

57. Haber, J. E. 1998. The many interfaces of Mrel 1. Cell 95:583-6.

58. Hall, J. M . , M . K. Lee, B. Newman, J. E. Morrow, L. A. Anderson, B. Huey, and M . C. King.1990. Linkage of early-onset famiUal breast cancer to chromosome I7q21. Science 250:1684-9.

59. Hall-Jackson, C. A. , D. A . Cross, N . Mortice, and C. Smythe. 1999. ATR is a caffeinesensitive, DNA-activated protein kinase with a substrate specificity distinct from DNA-PK. Oncogene 18:6707-13.

60. Hammarsten, O., and G. Chu. 1998. DNA-dependent protein kinase: DNA binding andactivation in the absence of Ku. Proc Natl Acad Sci U S A 95:525-30.

62. Hanakahi, L. A. , M . Bartlet-Jones, C. Chappell, D. Pappin, and S. C. West. 2000. Binding ofinositol phosphate to DNA-PK and stimulation of double- strand break repair. Cell 102:721-9.

63. Hansen, M . S., and F. D. Bushman. 1997. Human immunodeficiency virus type 2preintegration complexes: activities in vitro and response to inhibitors. J Virol 71:3351-6.

64. Hartwell, L. H., and T. A . Weinert. 1989. Checkpoints: controls that ensure the order of cellcycle events. Science 246:629-34.

65. Hartzog, G. A. , and F. Winston. 1997. Nucleosomes and transcription: recent lessons fromgenetics. Curr Opin Genet Dev 7:192-8.

66. Herrmann, G., T. Lindahl, and P. Schar. 1998. Saccharomyces cerevisiae L IF l : a functioninvolved in DNA double-strand break repair related to mammalian XRCC4. Embo J 17:4188-98.

67. Hindmarsh, P., M . Johnson, R. Reeves, and J. Leis. 2001. Base-pair substitutions in aviansarcoma virus U5 and U3 long terminal repeat sequences alter the process of DNA integration in vitro. J yirol 75:1132-41.

68. Hirao, A., Y . Y . Kong, S. Matsuoka, A . Wakeham, J. Ruland, H. Yoshida, D. Liu, S. J.Elledge, and T. W. Mak. 2000. DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2. Science 287:1824-7.

69. Ho, K. S., and R. K. Mortimer. 1973. Induction of dominant lethality by x-rays inradiosensitive strain of yeast. Mutat Res 20:45-51.

70. Horton, R., S. R. Mumm, and D. P. Grandgenett. 1991. Phosphorylation of the avianretrovirus integration protein and proteolytic processing of its carboxyl terminus. J Virol 65:1141-8.

71. Hughes, S. H., A. Mutschler, J. M . Bishop, and H. E. Varmus. 1981. A Rous sarcoma virusprovirus is flanked by short direct repeats of a cellular DNA sequence present in only one copy prior to integration. Proc Natl Acad Sci U S A 78:4299-303.

72. Iftode, C , Y . Daniely, and J. A. Borowiec. 1999. RepHcation protein A (RPA): theeukaryotic SSB. Crit Rev Biochem Mol Biol 34:141-80.

73. Ivanov, E. L., V. G. Korolev, and F. Fabre. 1992. XRS2, a DNA repair gene ofSaccharomyces cerevisiae, is needed for meiotic recombination. Genetics 132:651-64.

74. Ivanov, E. L., N . Sugawara, J. Fishman-Lobell, and J. E. Haber. 1996. Genetic requirementsfor the single-strand annealing pathway of double- strand break repair in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 142:693-704.

75. Jeggo, P. A. , A. M . Carr, and A. R. Lehmann. 1998. Splitting the A T M : distinct repair andcheckpoint defects in ataxia- telangiectasia. Trends Genet 14:312-6.

76. Jeggo, P. A., A. M . Carr, and A. R. Lehmann. 1998. Splitting the A T M : distinct repair andcheckpoint defects in ataxia-telangiectasia. Trends Genet 14:312-6.

77. Jenuwein, T., and C. D. Allis. 2001. Translating the histone code. Science 293:1074-80.

78. Jordan, A., P. Defechereux, and E. Verdin. 2001. The site of HIV-1 integration in the humangenome determines basal transcriptional activity and response to Tat transactivation. Embo J 20:1726-38.

79. Kalpana, G. V., S. Marmon, W. Wang, G. R. Crabtree, and S. P. Goff. 1994. Binding andstimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5. Science 266:2002-6.

80. Kanaar, R., J. H. Hoeijmakers, and D. C. van Gent. 1998. Molecular mechanisms of DNAdouble strand break repair. Trends Cell Biol 8:483-9.

81. Katz, R. A., G. Merkel, J. Kulkosky, J. Leis, and A. M . Skalka. 1990. The avian retroviral INprotein is both necessary and sufficient for integrative recombination in vitro. Cell 63:87-95.

82. Katz, R. A., and A. M . Skalka. 1994. The retroviral enzymes. Annu Rev Biochem 63:133-73.

84. Kim, S. T., D. S. Lim, C. E. Canman, and M . B . Kastan. 1999. Substrate specificities andidentification of putative substrates of A T M kinase family members. J Biol Chem 274:37538-43.

85. Kim, U . J., M . Han, P. Kayne, and M . Gmnstein. 1988. Effects of histone H4 depletion onthe cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. Embo J 7:2211-9.

87. Kwon, H., A. N . Imbalzano, P. A. Khavari, R. E. Kingston, and M . R. Green. 1994.Nucleosome dismption and enhancement of activator binding by a human SWl/SNF complex. Nature 370:477-81.

88. Lakin, N . D., B. C. Hann, and S. P. Jackson. 1999. The ataxia-telangiectasia related proteinATR mediates DNA-dependent phosphorylation of p53. Oncogene 18:3989-95.

89. Lamer, J. M. , H . Lee, and J. L, Hamlin. 1994. Radiation effects on D N A synthesis in adefined chromosomal replicón. Mol Cell Biol 14:1901-8.

90. Leclercq, I., F. Mortreux, M . Cavrois, A. Leroy, A. Gessain, S. Wain-Hobson, and E. Wattel.2000. Host sequences flanking the human T-cell leukemia virus type 1 provirus in vivo. J Virol 74:2305-12.

91. Lee, M . S., and R. Craigie. 1998. A previously unidentified host protein protects retroviralDNA from autointegration. Proc Natl Acad Sci U S A 95:1528-33.

92. Lee, M . S., and R. Craigie. 1994. Protection of retroviral DNA from autointegration:involvement of a cellular factor. Proc Natl Acad Sci U S A 91:9823-7.

93. Lee, S. E., R. A . Mitchell, A . Cheng, and E. A. Hendrickson. 1997. Evidence for DNA-PKdependent and -independent DNA double-strand break repair pathways in mammalian cells as a function of the cell cycle. Mol Ceh Biol 17:1425-33.

94. Lees-Miller, S. P., R. Godbout, D. W. Chan, M . Weinfeld, R. S. Day, 3rd, G. M . Barron, andJ. AUalunis-Tumer. 1995. Absence of p350 subunit of DNA-activated protein kinase from a radiosensitive human cell line. Science 267:1183-5.

95. L i , L., C. M . Famet, W. F. Anderson, and F. D. Bushman. 1998. Modulation of activity ofMoloney murine leukemia virus preintegration complexes by host factors in vitro. J Virol 72:212531.

96. L i , L., J. M . Olvera, K. E. Yoder, R. S. Mitchell, S. L. Butler, M . Lieber, S. L. Martin, and F.D. Bushman. 2001. Role of the non-homologous DNA end joining pathway in the early steps of retroviral infection. Embo J 20:3272-81.

97. L i , Z., T. Otevrel, Y . Gao, H. L. Cheng, B. Seed, T. D. Stamato, G. E. Taccioli, and F. W.Ah. 1995. The XRCC4 gene encodes a novel protein involved in DNA double-strand break repair and V(D)J recombination. Cell 83:1079-89.

98. Liang, F., M . Han, P. J. Romanienko, and M . Jasin. 1998. Homology-directed repair is amajor double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95:5172-7.

99. Lim, D. S., S. T. Kim, B. Xu, R. S. Maser, J. Lin, J. H. Petrini, and M . B. Kastan. 2000.A T M phosphorylates p95/nbsl in an S-phase checkpoint pathway. Nature 404:613-7.

100. Liu, V . F., and D. T. Weaver. 1993. The ionizing radiation-induced replication protein Aphosphorylation response differs between ataxia telangiectasia and normal human cells. Mol Cell Biol 13:7222-31.

102. Loidl, P. 1994. Histone acetylation: facts and questions. Chromosoma 103:441-9.

103. Lorch, Y. , J. W. LaPointe, and R. D. Komberg. 1987. Nucleosomes inhibit the initiation oftranscription but allow chain elongation with the displacement of histones. Cell 49:203-10.

104. Lowe, S. W., E. M . Schmitt, S. W. Smith, B. A . Osborne, and T. Jacks. 1993. p53 is requiredfor radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 362:847-9.

105. Luger, K., A . W. Mader, R. K. Richmond, D. F. Sargent, and T. J. Richmond. 1997. Crystalstructure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389:251-60.

106. Majors, J. E., and H. E. Varmus. 1981. Nucleotide sequences at host-pro viral junctions formouse mammary tumour virus. Nature 289:253-8.

107. Matsuoka, S., M . Huang, and S. J. Elledge. 1998. Linkage of A T M to cell cycle regulation bythe Chk2 protein kinase. Science 282:1893-7.

108. McPherson, C. E., E. Y . Shim, D. S. Friedman, and K. S. Zaret. 1993. An active tissuespecific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell 75:387-98.

109. Megee, P. C , B. A. Morgan, and M . M . Smith. 1995. Histone H4 and the maintenance ofgenome integrity. Genes Dev 9:1716-27.

110. Meiering, C. D., and M . L. Linial. 2001. Historical perspective of foamy virus epidemiologyand infection. Clin Microbiol Rev 14:165-76.

111. Miller, M . D., C. M . Famet, and F. D. Bushman. 1997. Human immunodeficiency virus type1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J Virol 71:5382-90.

112. Mizuuchi, K. 1992. Polynucleotidyl transfer reactions in transpositional DNA recombination.J Biol Chem 267:21273-6.

113. Moreau, K., C. Tome-Celer, C. Faure, G. Verdier, and C. Ronfort. 2000. In vivo retroviralintegration: fidelity to size of the host DNA duplication might Be reduced when integration occurs near sequences homologous to LTR ends. Virology 278:133-6.

114. Morgan, D. O. 1995. Principles of CDKregulation. Nature 374:131-4.

115. Morgan, S. E., and M . B. Kastan. 1997. Dissociation of radiation-induced phosphorylation ofrephcation protein A from the S-phase checkpoint. Cancer Res 57:3386-9.

116. MuUer, H. P., and H. E. Varmus. 1994. DNA bending creates favored sites for retroviralintegration: an explanation for preferred insertion sites in nucleosomes, Embo J 13:4704-14.

117. Murray, A . W. 1992. Creative blocks: cell-cycle checkpoints and feedback controls. Nature359:599-604.

118. Naito, T., A. Matsuura, and F. Ishikawa. 1998. Circular chromosome formation in a fissionyeast mutant defective in two A T M homologues. Nat Genet 20:203-6.

119. Nurse, P. 1997. Checkpoint pathways come of age. Cell 91:865-7.

120. Olive, P. L. 1998. The role of DNA single- and double-sti-and breaks in cell killing byionizing radiation. Radiât Res 150:842-51.

121. Paillard, S., and F. Strauss. 1991. Analysis of the mechanism of interaction of simian Kuprotein with DNA. Nucleic Acids Res 19:5619-24.

122. Painter, R. B., and B. R. Young. 1980. Radio sensitivity in ataxia-telangiectasia: a newexplanation. Proc Nati Acad Sei U S A 77:7315-7.

123. Pâques, P., and J. E. Haber. 1999. Multiple pathways of recombination induced by doublestrand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63:349-404.

124. PauU, T. T., and M . Gellert. 1998. The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitatesrepair of DNA double-strand breaks. Mol Cell 1:969-79.

125. Paull, T. T., E. P. Rogakou, V. Yamazaki, C. U . Kirchgessner, M . Gellert, and W. M .Bonner. 2000. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. CurrBiol 10:886-95.

126. Pruss, D., P. D. Bushman, and A. P. Wolffe. 1994. Human immunodeficiency virus integrasedirects integration to sites of severe DNA distortion within the nucleosome core. Proc Natl Acad Sci USA91:5913-7.

127. Pryciak, P. M . , A. Sil, and H. E. Varmus. 1992. Retroviral integration into minichromosomesin vitro. Embo J 11:291-303.

128. Pryciak, P. M . , and H. E. Varmus. 1992. Nucleosomes, DNA-binding proteins, and DNAsequence modulate retroviral integration target site selection. Cell 69:769-80.

129. Resnick, M . A., and P. Martin. 1976, The repair of double-strand breaks in the nuclear DNAof Saccharomyces cerevisiae and its genetic control. Mol Gen Genet 143:119-29.

130. Rice, J. C , and C. D. AUis. 2001. Code of silence. Nature 414:258-61.

131. Rice, P., R. Craigie, and D. R. Davies. 1996. Retroviral integrases and their cousins. CurrOpin Struct Biol 6:76-83.

133. Roe, T., S. A . Chow, and P. O. Brown. 1997. 3'-end processing and kinetics of 5'-end joiningduring retroviral integration in vivo. J Virol 71:1334-40.

134. Rogakou, E. P., C. Boon, C. Redon, and W. M . Bonner. 1999. Megabase chromatin domainsinvolved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol 146:905-16.

135. Rogakou, E. P., D. R. Pilch, A . H. Orr, V. S. Ivanova, and W. M . Bonner. 1998. D N Adouble-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273:5858-68.

136. Rohdewohld, H., H. Weiher, W. Reik, R. Jaenisch, and M . Breindl. 1987. Retrovirusintegration and chromatin structure: Moloney miurine leukemia pro viral integration sites map near DNase I-hypersensitive sites. J Virol 61:336-43.

137. Roth, D. B., and J. H. Wilson. 1985. Relative rates of homologous and nonhomologousrecombination in transfected DNA. Proc Natl Acad Sei U S A 82:3355-9.

138. Sambrook J, F. E., Maniatis T. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY.

140. Sarkaria, J. N . , R. S. Tibbetts, E. C. Busby, A. P. Kennedy, D. E. Hill , and R. T. Abraham.1998. Inhibition of phosphoinositide 3-kinase related kinases by the radiosensitizing agent wortmannin. Cancer Res 58:4375-82.

141. Schar, P., G. Herrmann, G. Daly, and T. Lindahl. 1997. A newly identified DNA ligase ofSaccharomyces cerevisiae involved in RAD52-independent repair of DNA double-strand breaks. Genes Dev 11:1912-24.

142. Scherdin, U . , K. Rhodes, and M . Breindl. 1990. Transcriptionally active genome regions arepreferred targets for retrovirus integration. J Virol 64:907-12.

143. Schlegel, R., and A. B. Pardee. 1986. Caffeine-induced uncoupling of mitosis from thecompletion of DNA rephcation in mammalian cells. Science 232:1264-6.

145. Shapiro, J. A. 1979. Molecular model for the transposition and replication of bacteriophageMu and other transposable elements. Proc Natl Acad Sei U S A 76:1933-7.

146. Shiloh, Y . 2001. A T M and ATR: networking cellular responses to DNA damage. Curr OpinGenet Dev 11:71-7.

147. Shim, E. Y. , C. Woodcock, and K. S. Zaret. 1998. Nucleosome positioning by the wingedhelix transcription factor HNF3. Genes Dev 12:5-10.

148. Shimotohno, K., S. Mizutani, and H. M . Temin. 1980. Sequence of retrovirus provirusresembles that of bacterial transposable elements. Nature 285:550-4.

149. Shinohara, A. , and T. Ogawa. 1995. Homologous recombination and the roles of doublestrand breaks. Trends Biochem Sci 20:387-91.

150. Singleton, B. K., A. Priestley, H. Steingrimsdottir, D. Gell, T. Blunt, S. P. Jackson, A . R.1.hmann, and P. A. Jeggo. 1997. Molecular and biochemical characterization of xrs mutants defective in Ku80. Mol Cell Biol 17:1264-73.

151. Smerdon, M . J., and A. Conconi. 1999. Modulation of DNA damage and DNA repair inchromatin. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 62:227-55.

153. Smith, G. C , and S. P. Jackson. 1999. The DNA-dependent protein kinase. Genes Dev13:916-34.

154. Strahl, B. D., and C. D. AUis. 2000. The language of covalent histone modifications. Nature403:41-5.

155. Suzuki, K. , S. Kodama, and M . Watanabe. 1999. Recruitment of A T M protein to doublestrand DNA irradiated with ionizing radiation. J Biol Chem 274:25571-5.

156. Tan, T. L., J. Essers, E. Citterio, S. M . Swagemakers, J. de Wit, F. E. Benson, J. H.Hoeijmakers, and R. Kanaar. 1999. Mouse Rad54 affects DNA conformation and DNA-damageinducedRad51 foci formation. CurrBiol 9:325-8.

157. Teo, S. H., and S. P. Jackson. 1997. Identification of Saccharomyces cerevisiae DNA hgase1.: involvement in DNA double-strand break repair, Embo J 16:4788-95.

158. Teo, S. H., and S. P. Jackson. 2000. Liflp targets the DNA ligase Lig4p to sites of DNAdouble-strand breaks. CurrBiol 10:165-8.

159. Thacker, J. 1999. A surfeit of RAD51-like genes? Trends Genet 15:166-8.

160. Thompson, L. H., and P. A. Jeggo. 1995. Nomenclature of human genes involved in ionizingradiation sensitivity. MutatRes 337:131-4.

161. Tibbetts, R. S., D. Cortez, K. M . Brumbaugh, R. Scully, D. Livingston, S. J. Elledge, and R.T. Abraham. 2000. Functional interactions between B R C A l and the checkpoint kinase ATR during genotoxic stress. Genes Dev 14:2989-3002.

162. Triglia, T., M . G. Peterson, and D. J. Kemp. 1988. A procedure for in vitro amplification ofDNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res 16:8186.

164. Verdin, E. 1991. DNase I-hypersensitive sites are associated with both long terminal repeatsand with the intragenic enhancer of integrated human immunodeficiency virus type 1. J Virol 65:6790-9.

165. Verdin, E., P. Paras, Jr., and C. Van Lint. 1993. Chromatin disruption in the promoter ofhuman immimodeficiency virus type 1 during transcriptional activation. Embo J 12:3249-59.

166. Verreault, A , , P. D. Kaufman, R. Kobayashi, and B. Stillman. 1996. Nucleosome assemblyby a complex of CAF-1 and acetylated histones H3/H4. Cell 87:95-104.

167. Wang, H., J. Guan, A. R. Perrauh, Y. Wang, and G. Ihakis. 2001. Replication Protein A2Phosphorylation after DNA Damage by the Coordinated Action of Ataxia Telangiectasia-Mutated and DNA-dependent Protein Kinase. Cancer Res 61:8554-63.

168. Ward, I. M . , and J. Chen. 2001. Histone H2AX Is Phosphorylated in an ATR-dependentManner in Response to Replicational Stress. J Biol Chem 276:47759-47762.

169. West, R. B., M . Yaneva, and M . R. Lieber. 1998. Productive and nonproductive complexesof Ku and DNA-dependent protein kinase at DNA termini. Mol Cell Biol 18:5908-20.

170. Wilson, T. E., U . Grawunder, and M . R. Lieber. 1997. Yeast DNA ligase IV mediates nonhomologous DNA end joining. Nature 388:495-8.

171. Wold, M . S. 1997. Replication protein A : a heterotrimeric, single-stranded DNA-bindingprotein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem 66:61-92.

172. Wolffe, A. 1998. Chromatin: structure and function. Academic press, London.

173. Wood, R. D. 1996. DNA repair in eukaryotes. Annu Rev Biochem 65:135-67.

174. Wooster, R., G. BigneU, J. Lancaster, S. Swift, S. Seal, J. Mangion, N . Collins, S. Gregory,C. Gumbs, and G. Micklem. 1995. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nahire 378:789-92.

175. Xu, Y. , and D. Baltimore. 1996. Dual roles of A T M in the cellular response to radiation andin cell growth control. Genes Dev 10:2401-10.

176. Yoder, K. E., and F. D. Bushman. 2000. Repair of gaps in retroviral D N A integrationintermediates. J Virol 74:11191-200.

177. Young, В. R., and R. B. Painter. 1989. Radioresistant DNA synthesis and human geneticdiseases. Hum Genet 82:113-7.

178. Zhang, H., G. Tombline, and B. L. Weber. 1998. B R C A l , BRCA2, and DNA damageresponse: collision or collusion? Cell 92:433-6.

179. Агол В.И. Разнообразие вирусов. 1997. Соросовский образовательный журнал.№4.С. 11-16.

180. Зеленин А.В., Кайгородов В.А., Прасолов В.С.Генная терапия сегодня и завтра. 1998.Молекулярная биология. 32(2). 219-28

181. Прасолов B.C., Иванов Д.С. Ретровирусные векторы в генной терапии. 2000. Вопросымедицинской химии. 46(3). 207-25

182. Глазер В.М. Гомологичная генетическая рекомбинация. 1998. Соросовскийобразовательный журнал. №7. 13-21.