Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов

Комарова, Елена Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов"

На правах рукописи

004600091

КОМАРОВА Елена Юрьевна

Роль шаперона Нвр70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ДПР 2010

Санкт-Петербург 2010

004600091

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ирина Владимировна Гужова Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Валерий Анатольевич Поспелов

Институт цитологии РАН,

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков Государственное учреждение Институт экспериментальной медицины РАМН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «23» апреля 2010 года в 15 часов на заседании

Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

Сайт института: http://www.cvtspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: се11Ыо@таН. cvtspb.rssi.ru

Факс института: (812)297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института цитологии РАН

Автореферат разослан « » марта 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.В.Каминская

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение процессов инициации и прогрессии злокачественных новообразований является одной из важнейших задач современной клеточной биологии и медицины. Известно, что огромное разнообразие опухолевых клеток объединяет их повышенная способность к пролиферации. Эта способность обычно складывается из двух компонентов: из увеличенной способности к росту в конкретных условиях (уменьшенной потребности в ростовых факторах, сниженной зависимости от прикрепления и т.п.) и из способности расти неопределенно долгое время (клеточное бессмертие, иммортализация, способность к бесконечно долгой пролиферации).

В настоящее время онкологи применяют три основных, классических или традиционных метода лечения онкологических заболеваний: хирургический, лучевой и лекарственный (химиотерапия, гормонотерапия). Современная медицина, используя последние достижения науки, продолжает развивать наиболее значимые направления в лечении: гипертермия, пшергликемия, торможение роста опухоли, облегчение доставки лекарств, воздействие на мембраны опухолевых клеток. Существуют также экспериментальные методы, которые показали свою достаточную эффективность и готовы выйти из области научных исследований в широкую клиническую практику: аутопересадка красного костного мозга в сочетании с большими дозами цитостатиков, генная терапия, электрохимиотерапия, фокусированный ультразвук высоких энергий (выжигающая терапия опухолей), применение противоопухолевых вакцин. Разрабатываются и другие методы, которые находятся либо в начальной стадии изучения, либо эффективны лишь при лечении отдельных видов опухолей.

Целью противоопухолевой терапии является уничтожение раковых клеток без ущерба для окружающих нормальных тканей; поэтому большинство химиотерапевтических препаратов задумано так, чтобы остановить пролиферацию опухолевых клеток и запустить процесс программируемой клеточной смерти (апоптоз).

происхождения - лимфомы Беркитта, рака легкого и рака молочной железы (Amati et al., 2001). Белки семейства Мус являются транскрипционными факторами, и неизвестна ни одна мутация онкогенных представителей этого семейства (v-myc, с-myc, N-myc и L-mye), которая бы инактивировала проапоптотическую функцию, не затронув их способность стимулировать пролиферацию. Было сделано предположение, что Мус влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий, тем самым предрасполагая клетки к митохондриальному пути реализации апоптоза (Juin et al., 1999).

В процессе канцерогенеза опухолевые клетки вырабатывают собственные защитные системы, вследствие чего они значительно отличаются от нормальных клеток организма, в том числе и по способности вступать в апоптоз. Одна из защитных систем основана на шапероне Hsp70. Этот белок обладает двумя очень важными свойствами: шаперонной активностью и способностью защищать клетки от разнообразных неблагоприятных факторов. Шаперонная активность - это способность белка связываться с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами, транспортировать их через сеть внутриклеточных мембран и экспонировать их белок-модифицирующим системам (Morimoto et al., 1997). Данные огромного числа экспериментов in vitro и in vivo убедительно свидетельствуют о том, что Hsp70 представляет собой наиболее эффективную и консервативную защитную систему клеток и целого организма (Jäättelä, 1999; Маргулис, Гужова, 2009).

Высокий уровень экспрессии Hsp70, обнаруженный в опухолевых клетках, по-видимому, является препятствием для противоопухолевой терапии, и свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для больного при некоторых видах новообразований (Ciocca et al., 1993; Ricaniadis et al., 2001). Ранее было установлено, что Hsp70 спасает раковые клетки от действия многих факторов, вызывающих апоптоз, включая такие, как TNF-a, стауроспорин, жесткий тепловой стресс и многие другие. (Samali, Orrenius, 1998; Гужова и др., 2000). Более того, Hsp70 может тормозить процесс апоптоза на различных его фазах. Наиболее убедительное доказательство противоапоптозного действия Hsp70 было представлено в экспериментах на карциноме молочной железы МСН-7, в которых в клетки вводили анти-смысловую mRNA к Hsp70, в результате чего они погибали путем апоптоза,(Nylandsted et al., 2000). Несмотря на интенсивные исследования, механизм защитной функции Hsp70 остается неясным. Однако большинство данных свидетельствует о превалирующей роли Hsp70 в ингибировании митохондриального пути апоптоза (Beere, Green, 2001). Исходя из вышеизложенных фактов, можно предположить, что Hsp70 также способен к кооперации с Мус в процессе канцерогенеза.

Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении функции шаперона Hsp70 на клеточном и молекулярных уровнях в процессе апоптоза,

стимулированном действием противоопухолевых препаратов, в раковых клетках с нормальной и повышенной экспрессией протоонкогена Мус. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выяснить, может ли повышенная экспрессия Нзр70 подавлять действие противоопухолевых препаратов, направленное на индукцию апоптоза в популяции опухолевых клеток.

2. Сравнить обусловленную Нэр70 устойчивость опухолевых клеток с нормальной и повышенной экспрессией Мус к действшо противоопухолевых препаратов.

3. Используя модель на основе клеток 11-937, выяснить механизм подавления Нзр70 апоптоза, управляемого \-Мус.

4. Выяснить, способен ли Нзр70 изменять кинетику активации эффекторных каспаз в клетках миелоидной лейкемии человека.

5. Проверить возможность взаимодействия Шр70 с эффекторными каспазами в ходе апоптоза клеток миелоидной лейкемии человека, индуцированного противоопухолевыми препаратами.

Научная новизна работы. Впервые показано, что чувствительность опухолевых клеток к апоптозу, вызванная повышенной экспрессией протоонкогена Мус, подавляется НБр70 в большей степени, чем в клетках с регулярной экспрессией онкогена. Найдены новые мишени для защитного действия Нзр70 в процессе апоптоза - эффекторные каспазы 3 и 7.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе показано, что повышенная экспрессия Н5р70, характерная для опухолевых клеток, делает их нечувствительными к действию противоопухолевых препаратов. Показан механизм, с помощью которого осуществляется защитная функция Н$р70. Несмотря на то, что работа имеет фундаментальную направленность, полученные данные позволяют рекомендовать практикующим онкологам включать признак «содержание Н5р70» в набор диагностических факторов и учитывать в выработке противоопухолевой стратегии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. НБр70 обладает сильным антиапоптотическим эффектом при действии на раковые клетки противоопухолевыми препаратами.

2. Защитный эффект Нвр70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессии протоонкогена Мус.

3. Противоапоптозное действие Нзр70 осуществляется ниже по течению, чем выброс цитохрома с из митохондрий.

4. Каспаза 3 и каспаза 7 - новые мишени для осуществления противоапоптозной функции Н5р70.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов. Материалы диссертации представлены на 13-м Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-

Петербург, 1999), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), 4-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001), 1-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Копенгаген, Дания, 2001), 2-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Санкт-Петербург, 2002), 2-м Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Украина, 2003), 1-м Всемирном конгрессе по раку «От фундаментальной науки к терапии рака» (Шанхай, Китай, 2008), 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 4-м Международном симпозиуме «Белки теплового шока в биологии и медицине» (Лаборатория морской биологии, Вудс Хол, США, 2008) и обсуждались на научных семинарах Лаборатории защитных механизмов клетки и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 ссылок. Иллюстративный материал представлен 15 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные линии. В работе были использованы культуры клеток миелоидной лейкемии человека U-937, U-937-v-myc и клетки крысиных фибробластов RatlMycER, любезно предоставленные профессором Л.-Г. Ларссоном (Karolinska Institute, Швеция). Клетки линий U-937, U-937-v-myc культивировали на питательной среде RPMI 1640 ("Биолот", Россия) с добавлением L-глутамина в концентрации 2 мМ, 50 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной сыворотки («ПанЭко», Россия). Клетки линий RatlMycER (несущие генетическую конструкцию, которая содержит ген белка с-Мус, сшитый с геном эстрогенового рецептора, чья экспрессия регулируется 4-гидрокси-тамоксифеном (ОНТ), культивировались на питательной среде DMEM ("Биолот", Россия) с добавлением L-глутамина в концентрации 2 мМ, 50 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной сыворотки («ПанЭко», Россия) и 5 мкг/мл пуромицина. Постоянный логарифмический рост клеток поддерживался их пересевом каждые 2-3 сут (клеток линии RatlMycER - после предварительной трипсинизации смесью растворов Версена и трипсина ("Биолот", Россия)). За 1 сут до опыта клетки высевали на новую среду. Клеточный рост оценивали в камере Ньюбауэра-Беркитга методом исключения красителя трипанового синего.

Тепловое воздействие и индукция синтеза Hsp70. Чтобы вызвать накопление Hsp70, клетки U-937, U-937-v-myc и RatlMycER подвергали

нелетальному тепловому шоку в течение 30 мин в водяном термостате при температуре 43 °С. После теплового воздействия, клетки культивировали при 37 °С в течение 6 ч, затем анализировали в них содержание белков теплового шока с помощью метода иммуноблоттипга и с использованием специфичных к Hsp70 антител.

Трансфекция клеток. Для трансфекции клеток использовали сконструированную О.Демидовым плазмиду pIRES, содержащую вставку Hsp70, плазмиду pZem и индуцируемую плазмиду pZ-Hsp70, имеющую ген устойчивости к геницитину (G418), полученную от д-ра М.Яатгела (Cancer Institute, Дания). Трансфекцию клеток линий U-937, U-937-v-myc плазмидой pcDNA3Hsp70 и RatlMycER, индуцируемой плазмидой pZ-Hsp70 и pZem (в соотношении 1:10), осуществляли по протоколу фирмы «GibcoBRL» с помощью реагента DMRIE-C. Для получения постоянных линий клетки культивировали в присутствии 500 мкг/мл G418 в течение 14 сут. Островки роста трансфицированных клеток RatlMycER, с высокой вероятностью представляющие собой клоны, разделяли и культивировали раздельно. Для U-937 и U-937-v-myc использовали в дальнейшем клоны с наиболее высоким уровнем синтеза Hsp70 в трансфицированных клетках. Содержание Hsp70 в клетках определяли с помощью метода иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного анализа.

Анализ ядерной локализации MycER после индукции ОНТ. Клетки RatlMycER индуцировали 20 нМ ОНТ в течение 2 ч, промывали ФСБ и выделяли ядерную фракцию с помощью рутинных процедур (Dignam et al., 1983). Детекцию Мус проводили с помощью иммуноблоттинга.

Индукция и оценка апоптоза. Апоптоз активировали введением в культуральную среду этопозида (ЕТО) в концентрации 6 мкг/мл или 20 мкг/мл, адриамицина (ADR) в концентрации 20 мкМ, камптотецина (CAMP) (Sigma, США) в концентрации 5 мкМ или 40 мкМ или бутирата натрия (SB) в концентрации 20 или 40 мМ. Количество апоптозных клеток и жизнеспособность клеточной популяции оценивали с помощью окраски DAPI на фиксированных 4%-ным формальдегидом клетках или акридинового оранжевого и этидиум бромида на живых клетках, а также с помощью теста МТТ.

Анализ кинетики каспазной активности. Клетки индуцировали в апоптоз 20 мкМ ADR или 6 мкг/мл ЕТО; через 15 мин, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24 и 30 ч клетки собирали, трижды промывали в 10 мл холодного ФСБ, центрифугировали при 200 g в течение 5 мин и лизировали в буфере RIPA (20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.5% Тритон Х-100, 2мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ, 1мМ ФМСФ). После электрофоретического разделения в трис-глициновой системе белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin et al., 1979). Иммунодетекцию проводили по общепринятой схеме (Towbin, Gordon, 1984) с использованием моноклональных или поликлональных антител к исследуемым белкам, коньюгированных с

пероксидазой xpeiia вторичных антител и реакцией усиленной хемилюминесценции. Для контроля равного количества белка в пробах проводили окрашивание антителами против глицеральдегидфосфатдегидрогеназы. Для торможения апоптоза использовали ингибиторы каспазы 3 и 7 (DEVD), каспазы 8 (IEVD) и каспазы 9 (LEDH) («Calbiochem», США), которые вводили в культуральную среду в концентрации 5 мкМ за 1 ч до индукции апоптоза. Количество апоптозных клеток подсчитывали после 6 ч индукции с помощью методов, описанных выше.

Антитела. В' работе были использованы первичные антитела против следующих белков: глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (abeam, Великобритания), каспаза 3, каспаза 7, каспаза 8, каспаза 9, цитохром с (все - дар Ю.А. Лазебника, Cold Spring Harbor Laboratory), поли(АДФ-рибозил)полимераза («Novus Biologicals», Англия), Мус (поликлональные, IG-13 - дар Л.-Г. Ларссона (Karolinska Institute, Швеция)), Hsp70 (моноклональные, клон ЗВ5 и клон 2Н9, полученные в лаборатории).

Анализ транслокаций цитохрома с. Для определения выхода цитохрома с из митохондрий проводили анализ цитозольной фракции методом иммуноблоттинга по М.Яатгела с соавторами с небольшими модификациями (Jäättelä, et al., 1998). Для этого контрольные и стимулированные к апоптозу клетки (0,5x106 клеток на каждую временную точку) промывали три раза холодным ФСБ и один раз буфером для цитозольной фракции следующего состава: 250 мМ сахароза, 20 мМ Трис- HCl, 10 мМ KCl, 1.5 мМ MgC12,1 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, pH 7.5. К полученным осадкам добавляли 300 мкл указанного буфера и 3 мкл смеси ингибиторов протеаз (Sigma, США) и оставляли на льду на 30 мин, перемешивая каждые 5 мин. Далее клетки лизировали 40-кратным пропусканием смеси через иглу и центрифугировали дважды при 800 g 10 мин и один раз при 14000 g 20 мин. В полученных супернатантах белок осаждали ацетоном, готовили пробы, проводили ДСН-ПААГ электрофорез в 17%-ном разделяющем геле и иммуноблоттинг с использованием мышиных моноклональных антител к цитохрому с. Кроме того, мембраны были повторно проявлены с использованием антител к глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (Sigma, США).

Коиммунопреципитация и лиганд-блоттинг. Для коиммунопреципитации использовали клеточные лизаты, приготовленные с применением TBS буфера для иммунопреципитации (20 мМ Трис- HCl, 10 мМ KCl, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, pH 7.5, смесь ингибиторов протеаз). Объем аликвот, содержащих 500 мкг общего белка,' доводили до 1000 мкл TBS и в течение 1 ч при 4 °С инкубировали с антителами к каспазе 3, к каспазе 7 или Hsp70 на роторной качалке, после чего к лизатам добавляли 20 мкл Белок А - Сефарозы или Белок G -Сефарозы, соответственно, и инкубировали 16 ч при 4 °С при постоянном

покачивании. Затем гель осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин, а супернатант (при необходимости) отбирали для приготовления электрофорезных проб, после чего два раза отмывали гель лизирующим буфером и три раза — TBS. Гель использовали для приготовления электрофорезных проб: к осадку добавляли четырехкратный буфер для образцов электрофореза и далее проводили определение Hsp70 и каспазы 3 и 7 с помощью метода иммуноблотгинга. Для контроля за неспецифическим связыванием готовили пробы из лизатов, проинкубированных с иммуноглобулинами сыворотки неиммунной мыши и Белок G - Сефарозой или иммуноглобулинами сыворотки неиммунного кролика и Белок-А - Сефарозой. Для лиганд-блоттинга использовали клеточные лизаты, приготовленные на буфере для иммунопреципитации. Объем аликвот, содержащих 500 мкг общего белка, доводили до 500 мкл буфером для иммунопреципитации и в течение 1 ч инкубировали с антителами к каспазе 3 или 7 при 4 °С на роторном смесителе, после чего к лизатам добавляли 20 мкл Белок А - Сефарозы и инкубировали 16 ч при 4 °С при постоянном покачивании. Затем гель троекратно промывали буфером для иммунопреципитации. Готовили пробы по стандартному протоколу, описанному выше, и осуществляли ДСН-ПААГ электрофорез в 15%-ном разделяющем геле и перенос белков на нитроцеллюлозу. После инактивации сайтов неспецифического связывания мембрану инкубировали с препаратом бычьего Hsp70/Hsc70 с конечной концентрацией 10 мкг/мл в течение 6 ч. Мембрану троекратно промывали ФСБ/0,1% Твин-20 и проводили детекцию связавшегося Hsp70 при помощи моноклональных антител ЗВ5. Чтобы определить позицию каспазы 3 и 7 на блоте, вносили в тот же гель по 50 мкг клеточного лизата, затем переносили на нитроцеллюлозный фильтр и выявляли, используя соответствующие каспазам антитела.

Методы статистического анализа. Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью программ Origin 7.0 и Statistica 6.0. Использовали двусторонний t-критерий Стьюдента (Р < 0.05). Полученные значения представлены в виде - среднего значения + стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Тепловой шок снижает чувствительность опухолевых клеток с высоким содержанием Мус к действию противоопухолевых препаратов. Чтобы понять, может ли тепловой шок защитить клетки с повышенной экспрессией Мус от действия факторов, индуцирующих апоптоз, на первом этапе мы использовали клетки миелоидной лейкемии U-937-v-myc и родительские клетки U-937. Вирусный белок v-Myc, который, по литературным данным, более активен, чем его клеточный аналог с-Мус (Larsson et al., 1988), в электрофорезном геле движется немного быстрее (рис. 1а). Контрольные клетки и клетки, предварительно подвергнутые мягкому тепловому шоку (43 °С, 30 мин), инкубировали с 20 мкг/мл

ADR в течение 18 ч. Количество клеток, в которых наблюдались ядра с фрагментированным хроматином, было значительно выше у клеток с повышенной экспрессией v-Myc, чем в клетках родительской линии (рис. 16). Тепловой шок, проведенный перед добавлением ADR, понизил количество апоптозных клеток в обеих клеточных линиях, однако у U-937-v-myc защитный эффект был выражен значительно сильнее, чем в клетках U-937. В родительской популяции снижение составило 22,1%, а у клеток U-937-v-myc число апоптозных клеток понизилось на 54,8%. Количество Hsp70, накопленное клетками после теплового шока, увеличивалось в обеих клеточных линиях в 8-10 раз уже через 3 ч и немного снижалось к 24 ч (рис. 1в).

Время поспе ТШ,ч

с 3 6 3d

Se . -Щшш HS07Q

Э >

Рис. 1. Тепловой шок подавляет процесс апоптоза,

сенсибилизированный v-Myc в клетках U-937.

а - анализ экспрессии Мус в родительских клетках U-937 и U-937-v -туе; б - клетки U-937 и U-937-v-myc были подвергнуты кондиционирующему тепловому шоку (43 °С, 30 мин) и через 3 ч индуцированы к апоптозу с помощью ADR (18 ч). Показана доля клеток с фрагментированными ядрами; в -иммуноблотгинг клеток U-937 и U-937-v-тус через 3, 6 и 24 ч после теплового шока.

Для того чтобы добиться регулируемой экспрессии гена Мус, мы использовали клетки крысиных фибробластов RatlMycER, трансфицированные конструкцией, которая содержала ген химерного белка с-Мус/эстрогеновый рецептор (МусЁЯ), экспрессия которого индуцируется с помощью 4-гидрокси-тамоксифена (ОНТ) (Ейеге et а1., 1989). Рис. 2а подтверждает перемещение белка MycER из цитоплазмы в ядро при действии ОНТ. Активация МусЕЯ перед добавлением противоопухолевого препарата этопозида (ЕТО) повышает чувствительность клеток к апоптозу дозазависимым образом (рис. 26).

Когда клетки RatlMycER активировали 25 нМ ОНТ (2 ч), подвергли тепловому шоку (44 °С, 30 мин) и через 3 ч индуцировали апоптоз с помощью ЕТО, подавление процесса апоптоза в активированных ОНТ клетках было выражено значительно сильнее (рис. За), количество апоптозных клеток понизилось примерно в 3 раза. Тепловой шок повышал уровень Нзр70 ожидаемым образом (рис. 36).

Рис. 2. Индуцируемая тамоксифеном (ОНТ) транслокация \lycER в ядро делает клетки каЙМусЕИ более чувствительными к апоптозу, вызванному этопозидом.

а - клетки 11аи МусЕК обрабатывали ОНТ, через 2 ч выделяли ядерную фракцию и подвергали иммуноблоттингу с пан-антителами к Мус; б - клетки ^аИМусЕЯ обрабатывали ОНТ в указанных концентрациях и через 2 ч добавляли ЕТО. Через 18 ч подсчитывали долю апоптозных клеток.

& ч-

Rati MycER: ООО

ООО

г N « « f

U-937 О

с 5

■ HspTO

-ОНТ

-юнт

Рис. 3. Тепловой шок отменяет вызванную тамоксифеном сенсибилизацию клеток RatlMycER к апоптозу.

а - клетки RatlER подвергли кондиционирующему тепловому шоку, через 24 ч стимулировали активацию MycER с помощью ОНТ (50 нМ) и через 2 ч добавили ЕТО: б - иммуноблоттинг RatlMycER после теплового шока при указанных температурах.

Таким образом, тепловой шок, вызывающий повышение уровня Hsp70 в двух клеточных линиях разного гистогенеза, снижал чувствительность клеток к апоптозу, обусловленному высоким содержанием v-Myc.

Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов. Поскольку защитный эффект при тепловом прекондиционировании может быть вызван действием других шаперонов (Hsp27, Hsp90), чья экспрессия тоже возрастает в ответ на тепловой шок, мы создали постоянную клеточную линию RatlMycERHsp70 с помощью интеграции гена Hsp70 под контролем металлотионеинового промотора. Как показано на рис.

с 88 £ i

с Я 8 § I e us

• - да ^»Hsp?Q

4a, сульфат цинка вызывает индукцию Hsp70 дозазависимым образом. Введение ZnS04 в среду даже в высоких концентрациях приводит лишь к слабому увеличению содержания эндогенного

("крысиного") Hsp70 (в сравнении с количеством Hsp70 в клетках RatlMycER, подвергнутых тепловой обработке). Таким образом, мы могли пренебречь влиянием эндогенного Hsp70 на уровень апоптоза клеток RatlMycER и RatMycERHsp70 даже при использовании высоких концентраций сульфата цинка. Для индукции синтеза Hsp70 использовали ZnS04 в концентрации 50 и 100 мкМ.

Были использованы несколько комбинаций предобработок ОНТ для того, чтобы воссоздать

последовательное включение Мус и Hsp70 в процесс апоптоза (рис. 46). Предварительная индукция

экспрессии Hsp70 сульфатом цинка снижала уровень апоптоза в клетках RatlMycERHsp70 при действии всех трех лекарств. Как и следовало ожидать, активация MycER повышала чувствительность клеток

RatlMycERHsp70 к последующей обработке лекарствами; значительные различия между показателями

апоптоза клеток с активным и неактивным MycER наблюдались в случае обработки клеток этопозидом и камптотецином.

В другой модельной клеточной системе клеткам U-937 и U-937-v-myc ген Hsp70 человека был введен под контролем цитомегаловирусного промотора, и полученные клоны, которые были использованы в работе, получили название U8 и М5 соответственно. Постоянно высокий уровень синтеза Hsp70 в клетках этих клонов был подтвержден с помощью метода иммуноблоттинга (рис 5а). Мы оценили чувствительность всех четырех линий к ЕТО и CAMP в указанных на рис.

Rati MycER-Hsp70 Rat 1 MycER

Рис. 4. Дробное повышение Hsp70 в клетках RatlMycER-Hsp70 приводит к дозазависимому понижению числа апоптозных клеток при действии противоопухолевыми препаратами ЕТО и CAMP.

а - клетки RatlMycER трансфицировали плазмидой, содержащей ген Hsp70 под индуцибельным металотионеиновым промотором. Экспрессию Hsp70 вызывали ZnSCU в указанных концентрациях. Показан иммуноблот индуцированных ZnS04 родительских клеток RatlMycER и трансфицированных RatlMycER-Hsp70; б - клетки RatlMycER-Hsp70 были " обработаны ZnS04 и(или) ОНТ в указанных концентрациях в течение 24 ч и стимулированы к апоптозу

противоопухолевыми препаратами ЕТО и CAMP, количество апоптозных клеток оценивали через б ч

56 концентрациях, используя окрашивание DAPI. Результаты подсчета фрагментированных и конденсированных ядер показали, что наибольшую способность ингибировать апоптоз, вызванный ЕТО и CAMP, Hsp70 демонстрирует в клетках клона М5.

£ о

<ä 60

Hsp70

S 40

ь с о

га 20

к g

I . ш

, - _ СО г- о ю

сор d го >• 2

АО

о>£ Э >

r-v. со г^-о ю

S™ э Se 5

Э<5 Di

Контроль

ЕТО

Г4^ __ со N. о ю

SP => Sf 2

CAMP

Рис. 5. Повышенная экспрессия Hsp70 делает клетки М5 более резистентными к действию противоопухолевых препаратов.

а - иммуноблоттинг клеток клонов U8 и М5 и родительских линий U-937 и U-937-v-myc; б - количество апоптозных клеток после воздействия противоопухолевыми препаратами ЕТО и CAMP.

В целом, результаты дали нам право утверждать, что эктопический Hsp70 обладает сильными защитными свойствами в клетках, экспрессирующих v-myc (клон М5), тогда как в клетках клона U8 он подавляет апоптоз в меньшей степени.

Молекулярные механизмы подавления Мус-опосредованного апоптоза.

Следующей задачей нашего исследования было выяснить механизмы влияния Мус и Hsp70 на апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов. Клетки миелоидной лейкемии U-937 и U-937-v-myc были выбраны нами для исследования молекулярных механизмов, поскольку апоптоз, вызванный действием противоопухолевыми препаратами, протекает в них со всеми классическими атрибутами. ЕТО, ADR и CAMP вызывали фрагментацию ядер, которую наблюдали в клетках, окрашенных акридиновым оранжевым или DAPI (рис.6а).

Контроль ADR, 18 ч

Щф р§ 116kDa

* ' Шк

ч 34 Юа + 32kDa

*19ЮА procasp-3

29ЮА

17ЮА

Рис. 6. Апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов, в клетках U-937 сопровождается типичными проявлениями: фрагментацией ядра, олигонуклеосомной диссоциацией ДНК и активацией каспаз.

а - микрофотография клеток U-937 после 18-часовой инкубации с ADR; б - олигосомная фрагментация («лесенка») ДНК; в - иммуноблоттинг экстрактов, полученных из контрольных (С) клеток и из клеток, которые были обработаны ADR или ЕТО с антителами к каспазе 3 и 7 и их субстрату, белку PARP.

Олигосомная фрагментация хроматина подтверждалась с помощью электрофореза ДНК (рис. 66). Наконец, процесс апоптоза проходит с активацией

двух эффекторных каспаз: 3 и 7 (рис. 6в). Вместе взятые эти данные подтверждают, что и ЕТО, и ADR индуцируют агтоптоз, который сопровождается типичными проявлениями: фрагментацией ядра, олигонуклеосомной диссоциацией ДНК и активацией каспаз.

Процесс апоптоза, индуцированный v-Myc, специфически подавляется ингибитором каспазы 9. Чтобы проанализировать роль каспаз, мы использовали специфические ингибиторы DEVD-FMK, IEID-FMK и LEHD-FMK, подавляющие активности каспазы 3/7, 8 и 9 соответственно. Ингибиторы каспазы 3/7 и 8 понижали число апоптозных клеток у клеток U-937 и U-937-v-myc с одинаковой эффективностью. Однако ингибитор каспазы 9, не повлиявший на уровень апоптоза в клетках родительской линии, значительно подавил его уровень в клетках U-937-v-myc (рис. 7). Это означает, что Мус запускает апоптозный каскад через

митохондриальный путь при вовлечении в процесс каспазы 9.

Hsp70 регулирует активность эффекторных каспаз, но не влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий. Следующий вопрос, на который мы попытались ответить, какой механизм использует шаперон Hsp70, чтобы защитить клетки от Мус-опосредованного апоптоза? Данные, которые можно найти в литературе, противоречивы; согласно сведениям разных авторов действие шаперона может осуществляться ниже или выше митохондрии (Beere et al., 2000; Saleh et al., 2000; Steel et al., 2004; Clemons et al.. 2005;). Первое, на чем мы сосредоточили наше внимание, был выход цитохрома с в цитозоль в клетках U-937 и U-937-v-myc и их клонах с постоянно высокой экспрессией Hsp70 - U8 и М5. На рис. 8 показана кинетика высвобождения цитохрома с после индукции клеток к апоптозу с помощью 6 мкг/мл ЕТО. Повышение уровня содержания Hsp70 в клетках не влияет на выход цитохрома с. Кинетика, показанная для клеток U-937 и U8, одинакова, так же, как и для клеток U-937-v-myc и М5, однако в клетках с повышенным содержанием v-Myc цитохром с появлялся в цитозоле через 3 ч после индукции апоптоза, а в клетках U-937 и U8 его выход задерживался до 18 ч.

S 30!

S20I 5 !

о-

li.ll.lil

q Т . "¡сз icaics nici" - ic3 icso nic О _ЕГО__ЕТО

4 U-937 U-937-v-myc

Рис. 7. Апоптоз, стимулированный V-Мус, специфически подавляется ингибитором каспазы 9. Ингибиторы каспаз ЭЕУП (каспаза 3 и 7), 1ЕУО (каспаза 8) и ЬЕНЮ (каспаза 9) добавляли к клеткам за 1 ч до внесения ЕТО.

ЕЮ

С 3 6 18 24

| | ' ««►>"■»-Ч-СуЬс

СуЮ вАРОН

-САРЭН

-СуЬс ■^-САРРН

Рис. 8. №р70 не подавляет высвобождение цитохрома с из митохондрий в клетках и-937.

Иммуноблоттинг белков цитозольной фракции проводили последовательно с антителами против цитохрома с и против глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (бАРЬИ) для подтверждения равномерной нагрузки общего белка на дорожку.

На следующем этапе с помощью иммуноблоттинга мы проанализировали активацию каспазы 3, 7, 8, и 9 в клетках, экспрессирующих Нвр70 на высоком уровне, и8 и М5, и клетках родительских линий. 11-937 и и-937-у-тус. На рис. 9 показано, что динамика протеолиза каспазы 8 у всех клеточных линий идентична, протеолиз начинается одновременно, через 3 ч после индукции ЕЮ. Однако активация каспазы 9 у клеток клона М5 начинается значительно раньше по сравнению с клетками Ц-937. Зона белка с молекулярным весом 35 кДа, соответствующая активной каспазе 9, появляется в клетках И-937-у-тус уже через 3 ч, в то время как у клеток 11-937 - только через 6 ч, т.е. раньше, чем происходит высвобождение цитохрома с.

Это означает, что у клеток с регулярной экспрессией Мус, и-937, в реализации апоптоза митохондриальный путь не является основным, т.е. по-видимому, апоптозный каскад в этих клетках развивается преимущественно по прямому пути, благодаря активации каспазой 8 эффекторных каспаз. У клеток М5 зона белка, соответствующая активной каспазе 9, в исследуемый временной промежуток выявлена не была. Интересно, что, несмотря на то, что повышение уровня содержания Нзр70 не повлияло на выход цитохрома с, протеолиз каспазы 9 был значительно подавлен в клетках М5. Каспаза 3 активируется через 18 ч после индукции в клетках и-937, что подтверждает появление активной каспазы с молекулярным весом 20 кДа (р20), в то время как в клетках и-937-у-шус р20 появляется уже через 3 ч после индукции. В клетках М5 активный фрагмент каспазы 3 в исследованный промежуток времени не появился. Каспаза 7 в клетках 11-937 активируется через 6 ч после индукции, в клетках и-937-У-тус - через 1 ч, а в клетках М5 в течение 18 ч она остается не активной.

U-937-GTB U-937-v-myc MS ETO ETO ETO

С 136 18C1 36 18 C1 36 18

:фр55/53 *=p43/41

Casp-7

Рис, 9. Эктопическая экспрессия гена Hsp70 подавляет и (или) задерживает активацию каспазы 3, 7,9, но не влияет на активацию каспазы 8.

Клетки U-937, U-937-v-myc и М5 индуцировали к апоптозу с помощью ЕТО в указанные промежутки времени и анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами к каспазе В, 9, 3 и 7.

Эти данные заставляют нас предположить, что Hsp70 не влияет на выход цитохрома с из митохондрий или активацию инициаторной каспазы 8, но подавляет протеолиз каспазы 3, 7 и 9 в клетках U-937 с высокой экспрессией v-Мус.

Hsp70 физически взаимодействует с каспазой 3 и с каспазой 7, Мы

предположили, что запаздывание протеолиза эффекторных каспаз у клеток с повышенной экспрессией Hsp70 связано с тем, что шаперон образует комплексы с этими ферментами. Чтобы проверить это предположение, мы использовали метод иммунопреципитации. Моноклональные антитела к Hsp70 (Клон 2Н9) были пришиты к гелю циан-бромированной сефарозы. В реципрокной системе применяли антитела к каспазе 3 и 7, которые осаждали с помощью Protein G-сефарозы. Лизаты контрольных и стимулированных к апоптозу клеток U8 пропускали через колонку 2Н9, и белки, связавшиеся с гелем, анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами к каспазе 3 и 7. Иммунопреципитацию в реципрокной системе проводили с антителами против эффекторных каспаз и связавшиеся с ними белки анализировали с помощью антител к Hsp70 (рис. 10а).

Для того чтобы доказать, что каспазы специфически связываются с Hsp70, а не с гелем циан-бромированной сефарозы. мы использовали лизат клеток миеломы мыши NS0/1, которые, как известно, не экспрессируют Hsp70 (Aujame and Firko, 1988), в результате чего становятся чувствительными к условиям культивирования. Сывороточное голодание при отсутствии смены культуральной среды в течение 3

сут приводит к тому, что примерно 50% клеточной популяции погибает по механизму апоптоза. Такие клетки использовали для иммунопреципитацик с помощью сефарозы-2Н9, но белковых зон, соответствующих каспазе 3 или 7, выявлено не было (рис, 106), что подтверждает наше предположение о том, что обе каспазы взаимодействуют именно с Hsp70. Следует заметить, что в клетках U8, индуцированных к апоптозу с помощью ADR, Hsp70 был связан с прокаспазой 3 (32 кДа) и с прокаспазой 7 (34 кДа) и с ее компонентом 32 кДа, т.е. молекулой фермента, потерявшей продомен. Были выявлены также формы активной каспазы 17 кДа (для каспазы 3) и 19 кДа (для каспазы 7). В реципрокной иммунопреципитации было обнаружено взаимодействие обеих каспаз с Hsp70 (рис. 10а).

Иммунопрецип. Супернатэнт а Иммунопреципитат Супернатэнт

IP анти-касп-71 '9G анти-касп-7| 19° анти-касп-З |1дб анти-каст-з| 1вв

Индукция К А А К А А К А А К А А

т j

fWB

aHTH-Hsp70 AT

IP a-Hsp70|lgG a-Hsp70| IgG

Индукция К А А К А А

-Hsp70

прокасп-7

■■■утШ*- 32kDa 7kDa

| анти-каспаза-7 AT |

• Hsp70

aHTM-Hsp70 AT |

a-Hsp701 IgG a-Hsp7o| igG

К А А К А А

- - •

прокасп-3

анти-каспаза-3 AT

)P:Hsd70 WB:amn-Kacn-7

Иммунопреципитат Супернатэнт

к st к st

51 .-»- прокасп-7

¡вьё ¡As* 32kDa

iP:Hsp70 WB:анти-касп-З

Иммунопреципитат Сулернатант

к ST к ST

-прокасп-3

Рис. 10. Hsp70 связывается с каспазой 3 и с каспазой 7 в клетках U-937-Hsp70 (U8).

а - реципрокная иммуиопреципитация. Наверху - иммунопреципитация лизата клеток U8 с антителами против каспазы, иммуноблоттинг с антителами против Hsp70, внизу -иммунопреципитация с антителами против Hsp70, иммуноблоттинг - с антителами против каспазы 7 и 3; б - иммунопреципитация лизата клеток NS0/1, не синтезирующих Hsp70, с антителами против шаперона, иммуноблоттинг - с антителами против каспазы 7 иЗ.

Для того чтобы показать, что обе каспазы формируют с Hsp70 прямой межмолекулярный комплекс, мы использовали лиганд-блоттинг (Far-Western assay). Экстракты контрольных клеток U8 использовали для иммунопреципитации

с антителами против каспазы 3 и 7, как описано выше, и после электрофореза и переноса белков иммунопреципитата на нитроцеллюлозную мембрану последнюю инкубировали с препаратом Нзр70, выделенным из мышцы быка. После тщательной отмывки часть мембраны инкубировали с антителами 2Н9 (рис. 11), другая часть мембраны с преципитированными каспазами также инкубировали с теми же антителами, но предварительной инкубации с Шр70 не проводили. Позицию белковых зон, соответствующих обеим эффекторным каспазам, подтверждали с помощью иммуноблоттинга с каспазой 3 и 7 полных клеточных лизатов клеток Ш. Результаты этих опытов с очищенными белками показали, что Нзр70 непосредственно связывается с каспазой 3 и 7 как в контрольных клетках Ш. так и в стимулированных к апоптозу.

IP: анти-касп-7 Кл. лизат IP: анти-касп-3 Кл .лизат

Hsp70 + 1 - + - -

Индук К А 1 к А К А К А К А К А

-• ~ »III, *-лрокасл-7

шЕЕк *"32kDa S£L •- ■

WB: анти-Й$р70 Ат анти-касп-7 I aHTH-Hsp70 AT анти-касп-3

Рис. 11. Hsp70 и каспаза 3 и 7 непосредственно связываются друг с другом.

Представлены данные лиганд-блоттинга (Far-Western assay). См. объяснения в тексте.

ОБСУЖДЕНИЕ

Генетические изменения клеток прогрессирующих опухолей, которые с одной стороны приводят к неограниченной пролиферации, а с другой - делают клетки более чувствительными к апоптозу, характерны для таких онкогенов, как Мус и Е1А (Green, Evan. 2002; Nilsson, Cleveland, 2003). В этой работе нам удалось показать, что Hsp70, который вовлечен в процесс опухолевого роста, подавляет апоптоз, сенсибилизированный Мус.

Наши результаты демонстрируют, что повышенная экспрессия Мус делает опухолевые клетки U-937 и Rati более чувствительными к действию противоопухолевых препаратов, таких как адриамицин (ADR), этопозид (ETО) и камптотецин (CAMP), эти результаты подтверждают более ранние работы (Hoffman, Liebermann, 1998). Изучая возможную роль шаперона Hsp70 в этом процессе, нам удалось показать, что повышенная экспрессия шаперона подавляет развитие апоптоза, вызванного действием противоопухолевых препаратов в обеих клеточных линиях. Удивительно, но, процесс подавления апоптоза в клетках, подвергнутых тепловому прекондиционированию, был наиболее выражен в клетках обеих линий с высоким содержанием Мус. Более того, нам удалось показать, что при дробном повышении активности Мус в клетках RatlMycER, с одной стороны, и экспрессии Hsp70 - с другой, уменьшение количества

апоптозных клеток в ответ на действие ЕЮ и CAMP носит дозазависимый характер. На основании этих данных мы сделали вывод о существенном вмешательстве Hsp70 в сигнальные пути апоптоза, сенсибилизированном повышенной экспрессией Мус.

Что является мишенями для Hsp70 и Мус в этом процессе? Наши результаты показывают, что в процессе апоптоза в клетках U-937, вызванного действием ЕТО, происходит активация «верхней» каспазы 8 и эффекгорной каспазы 9, 3 и 7 и происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий. Активация каспазы 8 происходит независимо от уровня экспрессии Мус или Hsp70, но на более нижних ступенях каскада можно заметить существенную разницу, обусловленную повышенной экспрессией Мус и (или) Hsp70. Существенно, что протеолиз каспазы 9 коррелирует с повышенной экспрессией Мус. Специфический ингибитор каспазы 9 не подавлял развитие апоптоза в клетках U-937, однако был эффективен в клетках U-937-v-myc, что подчеркивает селективную роль каспазы 9 в процессе апоптоза, индуцированного ЕТО в клетках с повышенной экспрессией Мус. Анализ кинетики протеолиза каспаз и выхода цитохрома с из митохондрий показал, что в клетках с регулярной экспрессией Мус протеолиз каспаз запускается значительно раньше, чем выход цитохрома с, что говорит о том, что в этих клетках задействован прямой путь апоптоза, в то время как в клетках U-937-v-myc более существенную роль играет митохондриальный путь, что соответствует ранее опубликованным работам (Juin et al., 1999).

В литературе не прекращается дискуссия о том, на каких этапах апоптозного каскада играет роль Hsp70. Две группы исследователей (Beere et al., 2000; Saleh et al.', 2000) одновременно предположили, что Hsp70 связывает APAF-1, препятствуя его олигомеризации и последующей активации каспазы 9. Другая группа ученых (Li et al., 2000) утверждала, что Hsp70 подавляет апоптоз ниже по течению, чем высвобождение цитохрома с, но выше, чем протеолиз каспазы 3. С другой стороны, несколько групп исследователей сообщали о том, что Hsp70 подавляет процесс апоптоза на домитохондриальных этапах, (Steel et al., 2004; Mosser et al., 2000; Stankiewitch et al., 2005), подавляя выход цитохрома с, прямо или косвенно понижая олигомеризацию или транслокацию белка Вах к митохондрии (Gotoh et al., 2004; Stankiewitch et al., 2005). Мы не наблюдали изменения динамики выхода цитохрома с в клетках с повышенной экспрессией Hsp70; напротив, нам удалось показать прямое взаимодействие шаперона и эффекторной каспазы 3 и 7, и таким образом, наши данные подтверждают первую из представленных гипотез. Однако нельзя отрицать роль шаперона на более ранних этапах каскада в других клеточных системах при использовании иных индукторов апоптоза.

Мы показали, что апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов и сенсибилизированный Мус, подавляется Hsp70. Селективное подавление синтеза и (или) функции Hsp70 в опухолевых клетках может позволить

Мус реализовать свой проапотозный потенциал, предполагая, что Hsp70 является

адекватной мишенью для противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Hsp70 обладает сильным противоапоптотическим эффектом при действии на раковые клетки противоопухолевыми препаратами - адриамицином, этопозидом и камптотецином.

2. Защитный эффект Hsp70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессией протоонкогена Мус. В клетках крысиных фибробластов RatlMycERHsp70, в которых можно дробно повышать экспрессию Hsp70, защитный эффект шаперона носит дозазависимый характер.

3. В клетках U-937 с постоянной экспрессией Мус апоптоз протекает преимущественно по прямому пути от каспазы 8 к эффекторным каспазам, в то время как в клетках с повышенной экспрессией Мус основным путем апоптоза является митохондриальный с вовлечением активации каспазы 9.

4. Антиапоптозное действие Hsp70 в клетках U-937 как с повышенной, так и с постоянной экспрессией протоонкогена Мус осуществляется после выброса цитохрома с из митохондрий.

5. Каспаза 3 и каспаза 7 - новые мишени для осуществления антиапоптозной функции Hsp70.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комарова ЕЛО., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2004. Роль шаперона Hsp70 в реакции клеток лейкемии человека на противоопухолевые препараты. Цитология. 46: 550-556.

2. Komarova E.Yu., Afanasyeva Е.А., Bulatova MM., Cheetham M.E., Margulis В.A., Guzhova I. V. 2004. Downstream caspases are novel targets for the antiapoptotic activity of the molecular chaperone Hsp70. Cell Stress and Chaperones. 9 (3): 265275.

3. Afanasyeva E.A., Komarova E. Yu., Larsson L.-G., Bahram F., Margulis B.A., Guzhova I. V. 2007. Drug-induced Мус-mediated apoptosis of cancer cells is inhibited by stress protein Hsp70. Int. I Cancer 121 (12): 2615-2621.

Тезисы сообщений на конференциях

4. Комарова Е.Ю., Демидов О.Н., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2000. Влияние конститутивной экспрессии онкогена v-myc в клетках миелоидной лейкемии человека на реализацию апоптического сигнала в этих клетках. Цитология. 42: 286.

5. Комарова ЕJO., Гужова И.В., Маргулис Б.А.2001. Роль БТШ70 в реакции

клеток миелоидной лейкемии человека на противоопухолевые препараты. Материалы 4-й Всероссийской медико-биологической Конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, с. 136.

6. Гужова И.В., Комарова Е.Ю., Афанасьева Е.А., Маргулис Б.А. 2003. Противоопухолевая терапия и клеточная функция основного белка стресса Hsp70. Материалы 2-го Международного симпозиума «Стресс и экстремальные состояния», Кара-Даг, Украина, с. 175.

7. Margulis В.А., Afanasyeva Е.А., Komarova Е.Г., Larsson L.-G., Guzhova I. V. 2008. Anti-apoptotic activity of Hsp70 stress protein in leukemia cells. BIT Life Sciences' Abstracts of 1st Annual World Cancer Congress-2008. From Basic Research to Therapeutics, Shanghai, China, p. 84.

8. Гужова КВ., Комарова Е.Ю. 2008. Антагонизм между белками Hsp70 и Мус в регуляции процесса апоптоза в раковых клетках. Материалы 4-го Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, с. 182.

9. Margulis В.А., Afanasyeva Е.А., Komarova Е. Yu^ Larsson L.-G., Guzhova I. V. 2008. The antagonism between Hsp70 and Мус in the performing of apoptosis program in U-937 leukemia cells. Abstracts of IVth International Symposium on Heat Shock Proteins in Biology & Medicine, USA. p. 37.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Гужова КВ., Маргулис Б.А. 2000. Цитология. 42: 647-652. Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2009. Цитология. 51: 219-228. AmatiB., FrankS.R., Donjerkovic D., TaubertS. 2001. Biochim. Biophys. Acta.

1471: 135-145. Aujame L., Firko H. 1988. Mol. Cell Biol. 8:5486-5494. Beere H.M., WolfB.B., Caint K„ MosserD.D., MahboubiA., KuwanaT., Tailor P.,

Morimoto R.I., Cohen G.M., Green D.R. 2000. Nat Cell Biol. 2: 469-475. Beere H.M, Green D.R. 2001. Trends. Cell Biol. U: 6-10.

Ciocca D.R, Clark G.M., TandonA.K., FuquaS.A., Welch W.J., McGuire W.L. 1993. J.

Natl. Cancer Inst. 85:570-574. Clemens N.J., BuzzardK„ Steel R„ Anderson RL. 2005. J. Biol. Chem. 280: 9005-9012. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. 1983. Nucleic Acids Res. 11: 1475-1489.' EilersM., PicardD., Yamamoto K.R., Bishop J.M. 1989. Nature. 340: 66-68. Gotoh Т., Terada K„ Oyadomari S„ Mori M. 2004. Cell Death Differ. 11: 390-402. Green D.R., Evan G.I. 2002. Cancer Cell. 1:19-30. Hoffman В., Lieberman D.A. 1998. Oncogene. 17: 3351-3357. Jaattcld A/., WissingD., Kokholm K., Kuallunki Т., EgebladM. 1998. EMBO J. 17:

6124-6134. Jaatteld M. 1999. Ann. Med. 31:261-271.

JuinP., Hueber A.O., Little-wood T., Evan G. 1999. Genes Dev. 13: 1367-1381. LarssonL., IvhedL, GidlungM., Petterson U„ Vennstrom B., Nilsson K 1988. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2638-2642. Li C.Y., Lee J.S., Ko Y.G., Kim J.I., Seo J.S. 2000. J. Biol. Chem. 275: 25665-25671. Morimoto R.I., Kline M.P., BimstonD.N., CotloJ.J. 1997. Essays Biochem. 32: 17-29. Mosser D.D., CaronA.W., BourgetL., MeriinA.B., Sherman M.Y., Morimoto R.I., Massie B.

2000. Mol. Cell Biol. 20: 7146-7159. Nilsson J. A., Cleveland J. L. 2003. Oncogene. 22: 9007-9021. NylandstedJ., Rohde M„ BrandK, Bastholm L„ EllingF., JddtlelaM. 2000. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA. 97: 7871-7876. Reed J. C. 2003. Cancer Cell. 3:17-22.

Ricaniadis N., Kataki A., Agnantis N., Androulakis G., Karakousis C.P. 2001. Eur. J.

Surg. Oncol. 27: 88-93. Saleh A., Srinimsula S.M., Balkir L„ Robbins P.D., Alnemri E.S. 2000. Nature Cell Biol. 2: 476-483.

SamaliA., OrreniusS. 1998. Cell Stress Chaper. 3: 228-236.

Stankiewitch A.R.,Lachapelle G„ Foo C.P., Radicioni S.M., Mosser D.D. 2005 J. Biol.

Chem. 280: 38729-38739. Steel R., Doherty J.P., Buzzard K„ demons N.. Hawkins C.J, Anderson R.L. 2004. J.

Biol. Chem. 279: 51490-51499. Tov/bin H., Staeheln T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from

poiyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 7: 4350-4354.

Towbin H., Gordon J., 1984. J. Immunol. Methods. 72: 313-340.

Подписано в печать 18.03.2010. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/0318. П. л. 1.5. Уч.-изд. л, 1,5. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комарова, Елена Юрьевна

СОДЕРЖАНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 8 2.1. Апоптоз.

2.1.1. Основные морфологические черты апоптоза.

2.1.2. Биохимические механизмы апоптотической гибели.

2.1.3. Активация и регуляция каспазного каскада. 17 2.2 Участие онкобелка Мус в регуляции апоптоза.

2.3. Защитные системы опухолевых клеток.

2.4. Белки теплового шока.

2.4.1. Белки теплового шока и их классификация.

2.4.2. Семейство белков Hsp70 и его функции.

2.4.3. Роль Hsp70 в процессе апоптоза.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клеточные линии и их культивирование.

3.2. Тепловое воздействие и индукция синтеза Hsp70.

3.3. Трансфекция клеток.

3.4. Анализ ядерной локализации MycER после индукции ОНТ.

3.5. Индукция и оценка апоптоза.

3.6. Анализ кинетики каспазной активности.

3.7. Антитела.

3.8. Анализ фрагментации клеточной ДНК.

3.9. Анализ транслокации цитохрома

3.10. Коиммунопреципитация и лиганд-блоттинг.

3.11. Выделение и очистка белков теплового шока семейства 70 кДа.

3.12. Статистическая обработка.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ. 57 4.1. Тепловой шок снижает чувствительность опухолевых клеток с высоким содержанием Мус к действию противоопухолевых препаратов.

4.2. Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией

Мус к действию противоопухолевых препаратов.

4.3. Молекулярные механизмы подавления Мус-опосредованного апоптоза.

4.4. Процесс апоптоза, инициированный v-Myc, специфически подавляется ингибитором каспазы 9.

4.5. Hsp70 регулирует активность эффекторных каспаз, но не влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий.

4.6. Hsp70 физически взаимодействует с каспазой 3 и каспазой 7.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов"

Изучение процессов инициации и прогрессии злокачественных новообразований является одной из важнейших задач современной клеточной биологии и медицины. Известно, что огромное разнообразие опухолевых клеток объединяет их повышенная способность к пролиферации. Эта способность обычно складывается из двух компонентов: из увеличенной способности к росту в конкретных условиях (уменьшенной потребности в ростовых факторах, сниженной зависимости от прикрепления и т.п.) и из способности расти неопределенно долгое время (клеточное бессмертие, иммортализация, способность к бесконечно долгой пролиферации).

В настоящее время онкологи применяют три основных, классических или традиционных метода лечения онкологических заболеваний: хирургический, лучевой и лекарственный (химиотерапия, гормонотерапия). Современная медицина, используя последние достижения науки, продолжает развивать наиболее значимые направления в лечении: гипертермия, гипергликемия, торможение роста опухоли, облегчение доставки лекарств, воздействие на мембраны опухолевых клеток. Существуют также экспериментальные методы, которые показали свою достаточную эффективность и готовы выйти из области научных исследований в широкую клиническую практику: аутопересадка красного костного мозга в сочетании с большими дозами цитостатиков, генная терапия, электрохимиотерапия, фокусированный ультразвук высоких энергий (выжигающая терапия опухолей), применение противоопухолевых вакцин. Разрабатываются и другие методы, которые находятся либо в начальной стадии изучения, либо эффективны лишь при лечении отдельных видов опухолей.

Для многих спонтанных опухолей имеются серьезные доказательства вовлеченности определенных клеточных генов, и, прежде всего онкогенов, генов-супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла в процесс канцерогенеза, но для подавляющего большинства опухолей молекулярные механизмы запуска "онкогенной" программы клетки остаются неизвестными. Интересно, что многие протоонкогены, в частности протоонкогены семейства Мус, запускающие клеточную пролиферацию, одновременно предрасполагают клетки к апоптозу (Reed, 2003). Генетические изменения протоонкогена Мус, ведущие к его нерегулируемой экспрессии, характерны для множества опухолей различного происхождения - лимфомы Беркитта, рака легкого и рака молочной железы (Amati et al., 2001). Белки семейства Мус являются транскрипционными факторами, и неизвестна ни одна мутация онкогенных представителей этого семейства (v-myc, c-myc, N-myc и L-myc), которая бы инактивировала проапоптотическую функцию, не затронув их способность стимулировать пролиферацию. Было сделано предположение, что Мус влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий, тем самым, предрасполагая клетки к митохондриальному пути реализации апоптоза (Juin et al., 1999).

В процессе канцерогенеза опухолевые клетки вырабатывают собственные защитные системы, вследствие чего они значительно отличаются от нормальных клеток организма, в том числе и по способности вступать в апоптоз. Одна из защитных систем основана на шапероне Hsp70. Этот белок обладает двумя очень важными свойствами: шаперонной активностью и способностью защищать клетки от разнообразных неблагоприятных факторов. Шаперонная активность — это способность белка связываться с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами, транспортировать их через сеть внутриклеточных мембран и экспонировать их белок-модифицирующим системам (Morimoto et al., 1997). Данные огромного числа экспериментов in vitro и in vivo убедительно свидетельствуют о том, что Hsp70 представляет собой наиболее эффективную и консервативную защитную систему клеток и целого организма (Jaattela, 1999; Маргулис, Гужова, 2009).

Высокий уровень экспрессии Hsp70, обнаруженный в опухолевых клетках, по-видимому, является препятствием для противоопухолевой терапии, и свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для больного при некоторых видах новообразований (Ciocca et al., 1993; Ricaniadis et al., 2001). Ранее было установлено, что Hsp70 спасает раковые клетки от действия многих факторов, вызывающих апоптоз, включая такие, как TNF-a, стауроспорин, жесткий тепловой стресс и многие другие. (Samali, Orrenius, 1998; Гужова и др., 2000). Более того, Hsp70 может тормозить процесс апоптоза на различных его фазах. Наиболее убедительное доказательство противоапоптозного действия Hsp70 было представлено в экспериментах на карциноме молочной железы МСН-7, в которых в клетки вводили анти-смысловую mRNA к Hsp70, в результате чего они погибали путем апоптоза (Nylandsted et al., 2000). Несмотря на интенсивные исследования, механизм защитной функции Hsp70 остается неясным. Однако большинство данных свидетельствует о превалирующей роли Hsp70 в ингибировании митохондриального пути апоптоза (Beere, Green, 2001). Исходя из вышеизложенных фактов, можно предположить, что Hsp70 также способен к кооперации с Мус в процессе канцерогенеза.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение функции шаперона Hsp70 на клеточном и молекулярном уровнях в процессе апоптоза, стимулированном действием противоопухолевых препаратов, в опухолевых клетках с нормальной и повышенной экспрессией протоонкогена Мус.

В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Выяснить, может ли повышенная экспрессия Hsp70 подавлять действие противоопухолевых препаратов, направленное на индукцию апоптоза в популяции опухолевых клеток.

2. Сравнить обусловленную Hsp70 устойчивость опухолевых клеток с нормальной и повышенной экспрессией Мус к действию противоопухолевых препаратов

3. Используя модель на основе клеток U937, выяснить механизм подавления Hsp70 апоптоза, управляемого v-Myc.

4. Выяснить, способен ли Hsp70 изменять кинетику активации эффекторных каспаз в клетках миелоидной лейкемии человека.

5. Проверить возможность взаимодействия Hsp70 с эффекторными каспазами в ходе апоптоза клеток миелоидной лейкемии человека, индуцированного противоопухолевыми препаратами.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Апоптоз.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Комарова, Елена Юрьевна

6. выводы.

2. Защитный эффект Hsp70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессии протоонкогена Мус. В клетках крысиных фибробластов RatlMycERHsp70, в которых можно дробно повышать экспрессию Hsp70, защитный эффект шаперона носит дозазависимый характер.

4.Антиапоптозное действие Hsp70 в клетках U-937 как с повышенной, так и с постоянной экспрессией протоонкогена Мус осуществляется после выброса цитохрома с из митохондрий.

5. Каспаза 3 и каспаза 7 - новые мишени для осуществления антиапоптозной функции Hsp70.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комарова, Елена Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Гужова И.В., Ласунская Е.Б., Нильссон К., Дариева З.А., Маргулис Б.А. 2000. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937. Цитология. 42(7): 653-658.

2. Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2000. Индукция и накопление БТ1Н70 приводят к формированию его комплексов с другими клеточными белками. Цитология. 42(7): 647652.

3. Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4): 323-342.

4. Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2009. Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс. Цитология. 51(3): 219-228.

5. Новоселов С.С., Вербова М.В., Васильева Е.В. , Воробьева Н.К., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2004. Анализ экспрессии белков-шаперонов Hsp70 и Hdjl в опухолевых клетках человека. Вопросы онкологии. 50: 174-178.

6. Певшщкий Л.А. 1996. Программированная гибель клеток и апоптоз: значение для развития и функционирования иммунной системы. Вестн. Акад. Мед. Наук. 6: 43-50.

7. Adrain С., Martin S.J. 2001. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas. Trends. Biochem. Sci. 26: 390-396.

8. Alnemri E.S., Livingston D.J., Nicholson D. W., Salvesen G. Thornberry N.A., Wong W.W., Yuan.I 1996. Human ICE/CED-3 protease nomenclature . Cell. 87: 171-77.

9. Amanullah A., Liebermann D.A., Hoffman B. 2002. Deregulated c-Myc prematurely recruits both Type I and Type II CD95/Fas apoptotic pathways associated with terminal myeloid differentiation. Oncogene. 21: 1600 — 1610.

10. Amati В., Frank S.R., Donjerkovic D., Taubert S. 2001. Function of the c-Myc oncoprotein in chromatin remodeling and transcription. Biochim. Biophys. Acta. 1471: 135145.

11. Arango D., Mariadason J.M., Wilson A. J., Yang W., Corner G.A., Nicholas C., Aranes M.J., Augenlicht L.H. 2003. c-Myc overexpression sensitizes colon cancer cells to camptothecin-induced apoptosis. Br. J. Cancer. 89: 1757 1765.

12. Aravind /., Dixit V.M., Koonin E.V. 1999. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. TIBS. 24: 47-53.

13. Ashkenazi A., Herbst R.S. 2008. To kill a tumor cell: the potential of proapoptotic receptor agonists. J.Clin. Invest. 118: 1979-1990.

14. Aujame L., Firko H. 1988. The major inducible heat shock protein hsp68 is not required for acquisition of thermal resistance in mouse plasmacytoma cell lines. Mol. Cell Biol. 8:5486-5494.

15. Baker S.J., Reddy E.P. 1998. Modulation of life and death by the TNF receptor super!amily. Oncogene. 17: 3261-3270.

16. Barnett Т., Altschuler M., McDaniel C.N., Mascarenhas J. P. 1980. Heat shock induced proteins in plant cells. Dev. Genetics. 1: 331-344.

17. Barr R.K., Bogoyevitch M.A. 2001. The c-Jun N-terminal protein kinase family of mitogen-activated protein kinases (JNK MAPKs). Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 1047-1063.

18. Beere H.M., Green D.R. 2001. Stress management heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. Trends.Cell Biol. 11: 6-10.

19. Bellamy C.O.C., Malcomison R.D.G., Harrison D.J., Wyllie A.H. 1995. Cell death in health desease: the biology and regulation of apoptosis. Sem. Cancer Biol. 6: 3-16.

20. Bensaude O., Pinto M., Dubuis M.F., Nguyen V.T., Morange M. 1991. Protein denaturation during heat shock and related stress. Heat shock proteins. Berlin Springer-Verlag. 89-99.

21. Blachere N.E., Udono H., Janetzki S., Li Z., Heike M., Srivastava P.K. 1993. Heat shock protein vaccines against cancer. J. Immunother. Emphasis. Tumor. Immunol. 14(4): 352-356.

22. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D. 1996. Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APOl- and TNF receptor-induced cell death. Cell. 85: 803-815.

23. Borner C., Monney L. 1999. Apoptosis without caspase: an inefficient molecular guillotine. Cell Death Diff. 6: 497-507.

24. Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248254.

25. Buchberger A., Schroder H., Buttner M., Valencia A., Bukau B. 1994. A conserved loop in the ATPase domain of the DnaK chaperone is essential for stable binding of GrpE. Structural. Biology. 1: 95-101.

26. Castedo M., Perfettinni J.-L., Roumier Т., Andreau K., Medema R., Kroemer G. 2004. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene. 23: 2825 2837.

27. Chaudhary P.M., Eby M., Jasmin A. 1997. Death receptor 5, a new member of the TNFR family, and DR4 induce FADD-dependent apoptosis and activate the NF-кВ pathway. Immunity. 7: 821-830.

28. Chirico W.J., Waters M.G., Blobel G. 1988. 70K heat shock related protein stimulate protein translocation into microsomes. Nature. 333: 805-810.

29. Ciocca D.R., Clark G.M., Tandon A. K., Fuqua S.A., Welch W.J., McGuire W.L. 1993. Heat shock protein hsp70 in patients with axillary lymph node-negative breast cancer: prognostic implications. Natl. Cancer Inst. 85(7): 570-774.

30. Ciocca D.R., Clark G.M., Tandon A.K., Fuqua S.A., Welch W.J., McGuire W.L. 1993. Biological and clinical implications of heat shock protein 27,000 (Hsp27): a review. J. Natl. Cancer Inst. 85: 570-574.

31. Clemons N.J., Buzzard K., Steel R., Anderson R.L. 2005. Hsp72 inhibits Fas-mediated apoptosis upstream of the mitochondria in type II cells. J. Biol. Chem. 280: 9005-9012.

32. Cohen G.M., Sun X.-M., Showden R.T., Dinsdale D„ Skilleter D.N. 1992. Key morphological features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem. 286: 331-334.

33. Coultas L„ Strasser A. 2003. The role of the Bcl-2 proteins un cancer. Semin. Cancer Biol. 13: 115-123.

34. Davie J.R. 1998. Covalent modification of histones: expression from chromatin templates. Curr. Opin. Genet. Dev. 8: 173-178.

35. Desagher S., Martinou J.C. 2000. Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol. 10(9): 369-377.

36. Dignam J., Lebovitz R., Roeder R. 1983. Accurate transcription initiation by RNA-polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucl.Acids Res. 5: 14751489.

37. Dragovich Т., Rudin C.M, Thompson C.B. 1998. Signal transduction pathways that regulate cell survival and cell death. Oncogene. 17: 3207-3213.

38. Dubois M.F., Hovanessian A.G., Bensaude O. 1991. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferone induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266: 9707-9711.

39. Dworniczak В., Mirault M.-E. 1987. Structure and expression of a human gene coding for a 71 kd heat shock "cognate" protein. Nucl. Acid Res. 15: 5181-5197.

40. Eilers M., Picard D., Yamamoto K.R., Bishop J.M. 1989. Chimaeras of myc oncoprotein and steroid receptors cause hormone-dependent transformation of cells. Nature. 340: 66-68.

41. Ellis R.J. 1987. Proteins as molecular chaperones. Nature. 328: 378-379.

42. Evan G., Littlewood T. 1998. A matter of life and cell death. Science. 281(5381): 1317-1322.

43. Fearnhead И.О., Rodrigues J., Govek E.E., Guo W., Kobayashi R., Hannon G., Lazebnik Y.A. 1998. Oncogene-dependent apoptosis is mediated by caspase-9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 13664-13669.

44. Fehrenbacher N., Gyrd-Hansen M., Poulsen В., Felbor U., Kallunki Т., Boes M., Weber E., Leist M., Jaattela M. 2004. Sensitization to the lysosomal death pathway upon immortalization and transformation. Cancer Res. 64(15): 5301-5310.

45. Fest Т., Mougey V., Dalstein V., Hagerty M„ Milette D., Silva S„ Mai S. 2002. c-Myc overexpression in Ba/F3 cells simultaneously elicits genomic instability and apoptosis. Oncogene. 21: 2981 2990.

46. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D.B. 1990. Three- dimentional structure of the ATP-ase fragment of a 70k heat-shock cognate protein. Nature. 346: 623-628.

47. Flechtner J.B., Cohane K.P., Mehta S., Slusarewicz P., Leonard A.K., Barber B.H., Levey D.L., Andjelic S. 2006. High-affinity interactions between peptides and heat shock protein 70 augment CD8+ T lymphocyte immune responses. J. Immunol. 177: 1017-1027.

48. Frydman J., Honfeld J. 1997. Chaperones get in touch: the Hip-Hop connection. Trends Biocem. Sci. 22: 87-92.

49. Fulda S„ Debatin KM. 2006. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy. Oncogene. 25: 4798-4811.

50. Fulda S., Lutz JK. Schwab M, Debatin K.-M. 1999. MycN sensitizes neuroblastoma cells for drug-induced apoptosis. Oncogene. 18: 1479 1486.

51. Gabai V.L., Meriin А.В., Mosser D.D. 1997. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J. Biol. Chem. 272: 18033-18037.

52. Gartel A.L., Shchors K. 2003. Mechanisms of c-myc mediated transcriptional repression of growth arrest genes. Exp. Cell. Res. 283: 17-21.

53. Gastpar R., Gross C., Rossbacher L., Ellwart J., Riegger J., Multhoff G. 2004. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J. Immunol. 172: 972-980.

54. Ghobrial I.M., Witzig Т.Е., Adjei A.A. 2005. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J. Clin. 55(3): 178-194.

55. Gotoh Т. Terada K., Oyadomari S., Mori M. 2004. Hsp70-DnaJ chaperone pair prevents nitric oxide- and CHOP-induced apoptosis by inhibiting translocation of Bax to mitochondria. Cell Death Differ. 11: 390-402.

56. Green D.R., Evan G.I. 2002. A matter of life and death. Cancer Cell. 2: 19-29.

57. Green D.R., ReedJ.C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science. 281: 1309-1312.

58. Guzhova I. V., Darieva Z.A., Rocha Melo A., Margulis B.A. 1997. Major stress protein 70kDa and subunits of NF-kB regulatory complex are associated in human T-lymphoma cells. Cell Stress Chap. 2: 132-139.

59. Heads R.J., Latchman D.S., Yellon D.M. 1994. Stable high level expression of a transfected human HSP70 gene protects a heart-derived muscle cell line against thermal stress. J. Mol. Cell. Cardiol. 26: 695-699.

60. Hengartner M.O., Horvitz H.R. 1994. C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2. Cell. 76: 665-676.

61. Hoffman В., Lieberman D.A. 1998. The protooncogene c-myc and apoptosis. Oncogene. 17: 3351-3357.

62. Hogarty M.D. 2003. The requirement for evasion of programmed cell death in neuroblastomas with MYCN amplification. Cancer Lett. 197: 173 179.

63. Hohfeld J., Jentsch S. 1997. GrpE-like regulation of the hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1. EMBO J. 16: 6209-6216.

64. Hsu H., Huang J., Shu H.B. 1996. TNF-dependent recruitment of the protein kinase RIP to the TNFreceptor-1 signaling complex. Immunity. 4: 387-396.

65. Huang P., Oliff A. 2001. Signaling pathways in apoptosis as potential targets for cancer therapy. Trends Cell Biol. 11: 343-348.

66. Huang C., Yu Я, Wang Q., Ma W„ Xia D., Yi P., Zhang L., Cao X 2004. Potent antitumor effect elicited by superantigen-1 inked tumor cells transduced with heat shock protein 70 gene. Cancer Sci. 95: 160-167.

67. Hunt C., Morimoto R.I. 1985. Concerved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Ac. Sci. USA. 82: 6455-6459.

68. Jaattela M. 1999. Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp. Cell Res. 248(1): 30-43.

69. Jaattela M., Wissing D., Kokholm K. 1998. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases. EMBO J. 17: 6124-6134.

70. Jiang M.-R., Li Y.-C., Yang Y., Wu J.-R. 2003. c-Myc degradation induced by DNA damage results in apoptosis of CHO cells . Oncogene. 22: 3252 3259.

71. Joza N., Kroemer G., Penninger M. 2002. Genetic analysis of the mammalian cell death machinery. Trends Genet. 18: 142-150.

72. Juin P., Hueber A.O., Littlewood Т., Evan G. 1999. c-Myc-induced sensitization to apoptosis is mediated through cytochrome с release. Genes Dev. 13: 1367-1381.

73. Juin P., Hunt A., Littlewood Т., Griffiths В., Swigart L.B., Korsmeyer S., Evan G. 2002. c-Myc functionally cooperates with Bax to induce apoptosis. Mol. Cell Biol. 22: 6158 -6169.

74. Kampinga H.H. 2006. Chaperones in preventing protein denaturation in living cells and protecting against cellular stress. Handb. Exp. Pharmacol. 172: 1-42.

75. Kampinga H.H., Brunsting J.F., Konings A.W.T. 1992. Acquisition of thermotolerance induced by heat and arsenite in HeLa S3 cells: multiple pathways to induce tolerance? J. Cell Physiol. 150: 406-415.

76. Kelley P.M., Schlesinger M.J. 1982. The effect of amino acid analogues and heat shock on gene expression in chicken fibroblasts. Cell. 15: 1277-1286.

77. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Brit. J. Cancer. 26: 239-257.

78. Kislin K.L., Marron M.T., Li G., Graner M.W., Katsanis E. 2007. Chaperone-rich cell lysate embedded with BCR-ABL peptide demonstrates enhanced anti-tumor activity against a murine BCR-ABL positive leukemia. FASEB J. 21: 2173-2184.

79. Klefstrom J., Verschuren E.W., Evan G. 2002. c-Myc augments the apoptotic activity of cytosolic death receptor signaling proteins by engaging the mitochondrial apoptotic pathway. J. Biol. Chem. 277(45): 43224-43232.

80. Klein S.D., Brune B. 2002. Heat shock protein attenuates nitric oxide-induced apoptosis inRAW macrophages by preventing cytochrome с release. Biochem. J. 362: 635641.

81. Kochevar D.T., Aucoin M.M., Cooper J. 1991. Mammalian heat shock proteins: an overview with a systems perspective. Toxicology Letters. 56: 243-267.

82. Kost S.L., Smith D.E, Sullivan W.P., Welch W.J., Toft D.O. 1989. Binding of heat shock proteins to the avian progesteron receptor. Mol. Cell Biol. 9: 3829-3838.

83. Kumar S., Colussi P.A. 1999. Prodomains-adaptors-oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis . TIBS. 24: 1-4.

84. C.Y., Lee J.S., Ко Y.G., Kim J.I., Seo J.S. 2000. Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome с release and upstream of caspase-3 activation. J. Biol. Chem. 275: 25665-25671.

85. Maclean КН., Keller U.B., Rodrigues-Galindo C., Nilsson J.A., Cleveland J.L. 2003. c-Myc augments gamma irradiation-induced apoptosis by suppressing Bc1-Xl. Mol. Cell. Biol. 23: 4256-4270.

86. Ma kin G., Hickman J.A. 2000. Apoptosis and cancer chemotherapy. Cell Tissue Res. 301: 143-152.

87. McAllister L, Finkelstein D.B. 1980. Heat shock response and thermal resistance in Yeast. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93: 819-824.

88. Meriin A.B., Gabai V.L. 1998. Proteasome inhibitors activate stress kinases and induce Hsp72. Diverse effects on apoptosis. J. Biol. Chem. 273: 6373-6379.

89. Mestril R., Dillmann W.H. 1995. Heat shock proteins and protection against myocardial ischemia. J. Mol. Cell Cardiol. 27: 45-52.

90. Mitchell K.O., Ricci S„ Myashita Т., Dicker D., Jin Z., Reed J., El-Deiry W.S. 2000. Bax is a transcriptional target and mediator of c-Myc-induced apoptosis. Cancer Res. 60: 6318-6325.

91. Moreno de Alboran I., Baena E., Martinez-A. C. 2004. c-Myc-deficient В lymphocytes are resistant to spontaneous and induced cell death . Cell Death Diff. 11: 61-68.

92. Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. 1997. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 32: 17-29.

93. Morrish F., Giedi C, Hockenbery D. 2003. c-MYC apoptotic function is mediated by NRF-1 target genes. Genes Dev. 17(2): 240-255.

94. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L. 1997. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17: 5317-5327.

95. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Meriin A.B., Sherman M.Y., Morimoto R.I., Massxe B. 2000. The chaperone function of hsp70 is required for protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell Biol. 20: 7146-7159.

96. Mailer P., Hrstka R., Coomber D„ Lane D.P., VojtesekB. 2008. Chaperone-dependent stabilization and degradation of p53 mutants. Oncogene. 27: 3371-3383.

97. Nagata S., Golshtein P. 1995. The Fas death factor. Science. 267: 1449-1456.

98. Nikiforov M.A., Popov N., Kotenko ./., Henriksson M„ Cole M.D. 2003. The Mad and Мус domains are fiintionally equivalent. J. Biol. Chem. 278: 11094-11099.

99. Nilsson J.A., Cleveland J.L. 2003. Мус pathways provoking cell suicide and cancer. Oncogene. 22: 9007 9021.

100. Pandey P., Farber R., Nakazawa A. 2000. Hsp27 functions as a negative regulator of cytochrome c-dependent activation of procaspase-3. Oncogene. 19: 1975-1981.

101. Park H.S., Lee J.S., Huh S., Seo J., Choi E. 2001. Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of c-Jun N-terminal kinase . EMBO J. 20: 446-456.

102. Pelengaris S., Khan M. 2003. The many faces of c-Myc. Arch. Biochem. Biophys. 416: 129-136.

103. Pelham H.R.B. 1986. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell. 46: 956-961.

104. Perreault J., Lemieux R. 1993. Rapid apoptotic cell death of B-cell hybridomas in absence of gene expression. J. Cell Physiol. 156: 286-293.

105. Piura В., Rabinovich A. Yavelsky V., Wolfson M. 2002. Heat shock proteins and malignancies of the female genital tract. Harefuah. 141: 969-1010.

106. Polla B.S., Kantengwa S. 1996. Mitochondria are selective targets for the protective effects of heat shock against oxidative injury. PNAS. 93: 6458-6463.

107. Prendergast G.C. 1999. Mechanisms of apoptosis by c-Myc. Oncogene. 18: 29672987.

108. Rashmi R., Kumar S., Karunagaran D. 2004. Ectopic expression of HSP70 confers resistance, and silencing its expression sensitizes human colon cancer cells to curcumin-induced apoptosis. Carcinogenesis. 25: 179-187.

109. Ravagnan L., Gurbuxani S„ Susin S.A., Maisse C., Datigas E., Zamzami N., Мак Т. Jaattela M., Penninger J.M., Garrido C. Kroemer G. 2001. Heat-shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor. Nature Cell. 3: 839-843.

110. Reed J. C. 2003. Apoptosis-targeted therapies for cancer. Cancer Cell. 3: 17-22.

111. Reed J.C. 2006. Drug insight: cancer therapy strategies based on restoration of endogenous cell death mechanisms. NatClin. Pract. Oncol. 3: 388-398.

112. Ricaniadis Л7!, Kataki A., Agnantis N. Androulakis G., Karakousis C.P. 2001. Long-term prognostic significance of HSP-70, c-myc and HLA-DR expression in patients with malignant melanoma. Eur. J. Surg. Oncol. 27(1): 88-93.

113. Ritossa F. 1962. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila melanogaster. Experientia. 18: 671-573.

114. Ruchalski К, Mao H., Li Z., Wang Z., Gillers S., Wang Y„ Mosser D.D., Gabai .V, Schwartz J.H., Borkan S.C. 2006. Distinct hsp70 domains mediate apoptosis-inducing factor release and nuclear accumulation. J. Biol. Chem. 281: 7873-7880.

115. Ruiz-Vela A., A/bar J.P., Martinez C.A. 2001. Apaf-1 localization is modulated indirectly by Bcl-2 expression. FEBS Lett. 501: 79-83.

116. Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri E.S. 2000. Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp70. Nat. Cell Biol. 2: 476-483.

117. Samali A., Cai J., Zhivotovsky В., Jones D.P., Orrenius S. 1999. Presence of a pre-apoptotic complex of pro-caspase-3, Hsp60 and HsplO in the mitochondrial fraction of Jurkat cells. EMBO J. 18(8): 2040-2048.

118. Samali A., Holmberg СЛ., Sistonen L„ Orrenius S. 1999. Thermo tolerance and cell death are distinct cellular responses to stress: dependence on heat shock protein. FEBS Letters. 461: 306-310.

119. Samali A., Orrenius S. 1998. Heat shock proteins: regulators of stress response and apoptosis. Cell Stress Chaperones. 3(4): 228-236.

120. Sanders E.J., Wride M.A. 1995. Programmed cell death in development.Int. Rev. Cytol. 163: 105-173.

121. Salon A., Taira Т., Iguchi- Ariga S., Ariga II. 2001. A novel transrepression pathway of c-Myc. J. Biol. Chem. 276: 46562-46567.

122. Scherer L.C., Dalman F.S., Massa E., Mechinchi S., Pratt W.B. 1990. Structural and functional reconstitution of the glucocorticoid receptor-hsp90 complex . J. Biol. Chem. 265: 21397-21400.

123. Schneider P., Thome M, Burns K. 1997. TRAIL Receptors 1 (DR4) and 2 (DR5) signal FADD-dependent apoptosis and activate NF-кВ. Immunity. 7: 831-836.

124. Simpson N.H., Milner A.N., Al-Rubeai M. 1997. Prevention of hybridoma cell death by bcl-2 during sub-optimal culture conditions. Biotechnol. Bioeng. 54: 1-16.

125. Soucek L., Nasi S., Evan G.I. 2004. Omomyc expression in skin prevents Myc-induced papillomatosis. Cell Death Dif. 33: 1-8.

126. Soucie E.L., Annis M.G., Sedivy J., Filmus J., Leber В., Andrews D.W., Penn L.Z. 2001. Мус potentiates apoptosis by stimulating Bax activity at the mitochondria. Mol. Cell. Biol. 21:4725-4736.

127. Sriram M., Osipiuk J., Freeman В., Morimoto R., Jochimiak A. 1997. Human Hsp70 molecular chaperone binds two calcium ions within the ATPase domain. Structure. 5: 403414.

128. Stankiewicz A.R., Lachapelle G., Foo C.P., Radicioni S.M., Mosser D.D. 2005. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation. J. Biol. Chem. 280: 38729-38739.

129. Steel R., Doherty J.P., Buzzard K., Clemons N., Hawkins C.J., Anderson R.L. 2004. Hsp72 inhibits apoptosis upstream of the mitochondria and not through interactions with Apaf-1. J. Biol. Chem. 279: 51490-51499.

130. Stennicke H.R., Ryan C.A., Salvesen G.S. 2002. Reprieval from execution: the molecular basis of caspase inhibition. Trends Biochem. Sci. 27(2): 94-101.

131. Stevenson M.A., Calderwood S.K. 1990. Members of the 70-kilodalton heat shock protein family contain highly conserved calmodulin-binding domain. Mol. Cell Biol. 10: 1234-1238.

132. Slomberg P.W. 1991. Control cell lineage and cell fate during nematode development. Cuit. Top. Dev. Biol. 25: 177-225.

133. Sun Y., Ouyang Y.B., Xu L., Chow A.M., Anderson R., Hecker J.G., GiffardR.G. 2006. The carboxyl-terminal domain of inducible Hsp70 protects from ischemic injury in vivo and in vitro. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26: 937-950.

134. Syrigos K.N., Harrington K.J., Karayiannakis A.J., Sekara E., Chatziyianni E., Syrigou E.I., and Waxman J. 2003. Clinical significance of heat shock protein-70 expression in bladder cancer. Urology. 61: 677-680.

135. Tavaria M., Gabriele Т., Kola /., Anderson R.L. 1996. A hitchhiker's guide to the human HSP70 family. Cell Stress Chap. 1(1): 23-28.

136. Thornberry N.A., Lazebnik Y. 1998. Caspases: enemies within. Science. 281(5381): 1312-1316.

137. Tissieres A., Mitchell H.K, Tracy U.M. 1974. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melongaster. J. Mol. Biol. 84: 389-398.

138. Towbin H., Staeheln Т., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 7: 4350-4354.

139. Towbin H, Gordon J. 1984. Immunoblotting and dot immunobinding--current status and outlook. J. Immunol. Methods. 72(2): 313-340.

140. Vaux D.L. 1999. Caspases and apoptosis biology and terminology. Cell Death Diff. 6: 493-494.

141. Vaux D.L., Strasser A. 1996. The molecular biology of apoptosis. PNAS USA. 93: 2239-2244.

142. Vermeulen K., Van Bockstaele D.R., Berneman Z.N. 2005. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer. Ann. Hematol. 84(10): 627-39.

143. Vol loch V, Gabai V.L., Rits S., Sherman M.Y. 1999. ATPase activity of the heat shock protein is dispensable for its effects on dephosphorilation of stress kinase JNK and on heat-induced apoptosis. FEBS Lett. 461: 73-76.

144. Volloch V., Gabai V.L. Rits S. Force Т., Sherman M.Y. 2000. HSP72 can protect cells from heat-induced apoptosis by accelerating the inactivation of stress kinase JNK. Cell Stress & Chap. 5(2): 139-147.

145. Vousden K.H., LuX., 2002. Live or let die: cell's response to p53. Nat. Rev. Cancer. 2: 594-604.

146. Welch W.J. 1990. The mammalian stress response: Cell physiology and biochemistry of stress proteins. Stress proteins in biology and medicine. New York CSH Press, p. 223-278.

147. Welch W.J., Feramisco J.R. 1985. Rapid purification of mammalian 70-kDa stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol. Cell Biol. 5: 1229-1237.

148. Wu Y., Mehew J.A., Heckman C.A., Arcinas M., Boxer L.M. 2001. Negative regulation of bcl-2 expression by p53 in hemapoetric cells. Oncogene. 20: 240-251.

149. Xanthoudakis S., Roy S., Rasper D., Hennessey Т., Aubin Y., Cassady R., Tawa Т., Ruel R., Rosen A., Nicholson D.W. 1999. Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis. EMBO J. 18: 2049-2056.

150. Xia Z, Dickens M., Raingeaud J. 1995. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science. 270: 1326-1331.

151. Yamamori Т., Ito K., Nakamura Y, Yura T. 1978. Transient regulation of protein synthesis in Escherichia coli upon shift-up of growth temperature. J. Bacteriol. 134: 11331140.

152. Yost H.J., Lindquist S. 1991. Heat shock proteins affect RNA processing during heat shock response. Mol. Cell Biol. 11: 1062-1068.

153. Zornig A., Hueber A.O., Baum W., Evan G. 2001. Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1551: 1-37.

Информация о работе

Комарова, Елена Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Мус на действие противоопухолевых препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы