Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль серин/треониновых протеинкиназ в регуляции Ca2+ тока L-типа Ca2+ каналов гладкомышечных клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль серин/треониновых протеинкиназ в регуляции Ca2+ тока L-типа Ca2+ каналов гладкомышечных клеток"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

БЕЛЕВИЧ АНДРІЙ ЕДУАРДОВИЧ

УДК 577.352: 612.73

Роль серин/треонінових протеїнкіназ в регуляції Са:+ струму Ь-типу Са2+ каналів гладеньком’язових клітин

03.00.02

біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією е рукопис.

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології Інституту фізіолгії ім.

О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук

Шуба Михайло Федорович.

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України зав. відділом нервово-м’язової фізіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексіевич Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України зав. відділом біохімії м’язів

кандидат біологічних наук Лук’янець Олена Олександрівна

Інститут фізіології ім. 0.0. Богомольця НАН України старший науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи

Провідна установа: Інститут фізіології Національного університету ім.Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться “ /9 ” сі 5993 р 0 “ /О “ годині на засіданн

спеціалізованої вченої ради Д-01.13.ОІ при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 199^ р

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

Сорокіна-Маріна 3.0.

ВСТУП

Актуальність проблеми

Електрофізіологічні дані свідчать про те, що фосфорилювання може регулювати чи рулювати функції потенціалзалежних Са2+, К+ и Na+ каналів. Згідно з біохімічними даними, ки іоних каналів містять одну чи кілька ділянок, які можуть фосфорилюватися ітеїнкіназами. Найбільша кількість експериментальних даних про модулюючу дію :форилювання була отримана в дослідженнях регуляції активності L-типу Са2+ каналів клітин цевих та скелетних м’язів, гладеньких м’язів судин, нейронів, а також К+ каналів ідіоміоцитів та нейронів. У більшості випадків, фосфорилювання каналів визначається ивністю таких серин/треонінових протеїнкіназ, як: протеїнкіназа С ( ПКС), цАМФ-залежна ітеїнкіназа (ПКА) и цГМФ-залежна протеїнкіназа (ПКГ) (Levitan, 1994).

Іотенціалзалежні Са2+ канали L-типу плазматичної мембрани гладеньком’зових клітин /ІК) є основним шляхом для входу іонів Са2+ в клітину під час деполяризації та генерації енціалу дії. Іони Са2+, які увійшли до клітини, ініціюють вивільнення Са2+ з коплазматичного ретикулуму і беруть участь в активації скорочення міоцитів. Таким чином, іуляція активності L-типу Ca2t каналів є одним із основних механізмів регуляції скорочення деньких м’язів. Окрім цього, іони Са2+ відіграють функцію вторинного посередника трішньоклітинних реакцій, які призводять до активації деяких ферментів /кальмодулінзалежна протеїнкіназа) та іонних каналів (Са2+-активовані К+ и СГ канали, Са2+-ежні неселективні катіонні канали).

La відміну від судинних гладеньких м’язів, питання про участь протеїнкіназ, зокрема ПКА та Г, у регуляції активності L-типу Са2+ каналів міоцитів гладеньких м’язів шлунково-ікового тракту залишається до цього часу недостатньо дослідженим. Враховуючи той факт, стимуляція рецепторів плазматичної мембрани ГМК нейромедіаторами призводить до зміни стивності ПКА, ПКГ та ПКС ( Eglen et al., 1996; McDonald et al., 1994), дослідження участі цих теїнкіназ у регуляції активності L-типу Са2+ каналів має науковий інтерес для зрозуміння овної функції гладеньких м’язів - скорочення, ііета дослідження.

начити участь ПКА, ПКГ і ПКС у регуляції Са2+ струму L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК ііа соїі морської свинки за базальних умов та за умов стимуляції хеморецепторів зматичної мембрани.

Завдання дослідження.

іизначити залежність L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia соїі морської свинки від нутрішньоклітинного метаболізму.

іикористовуючи блокатори протеїнкіназ, визначити внесок ПКА, ПКГ та ПКС в базальний ;а2+ струм L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia соїі морської свинки.

(ослідити вплив активації ПКА, ПКГ та ПКС на Са2+ струм L-типу Са2+ каналів мембрани 'МК taenia соїі морської свинки.

4. Визначити роль ПКА, ПКГ та ПКС в модуляції Са2+ струму L-типу Са2+ кана

хеморецепторами плазматичної мембрани ГМК taenia coli морської свинки.

Наукова новизна роботи.

Показано, що ПКА- та ПКС-залежні процеси фосфорилювання стимулюють активність типу Саг+ каналів ГМК taenia coli морської свинки. Показано, що серин/'треонін протеїнкінази беруть участь у модуляції активністі L-типу Са2+ каналів В-адренорецептора мускариновими та тахікініновими рецепторами плазматичної мембрани ГМК taenia < морської свинки.

Вперше виявлено ТТХ-чутливі Na + канали в ГМК vas deferens щура. Показано, що на відм від L-типу Са2+ каналів, базальна активність ТТХ-чутливих Na + каналів ГМК vas deferens щ; не залежить від внутрішньоклітинного метаболізму.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Отримані результати свідчать про стимулюючу дію ПКА та ПКС на базальний Са2+ струм типу Са2+ каналів, що дозволяє зробити висновок про важливу фізіологічну роль і протеїнкіназ у підтриманні нормальної рухової активності гладеньких м’язів кишечни Наведені результати розкривають деякі аспекти молекулярних механізмів дії медіаторів гладенькі м’язи. В ході роботи було знайдено ТТХ-чутливі Na + канали в ГМК vas deferens щу що може служити для відкриття нового напрямку в фізіологічних та фармакологічі дослідженнях цього об’єкта.

Особистий внесок.

Всі експерименти було виконано особисто автором. У розробці концепції роботи акти] участь брали інші співавтори друкованих робот.

Апробація роботи.

Основні положення роботи доповідались і обговорювались на: ХІІ-ому міжнародне фармакологичному конгресі (Монреаль, Канада, 1994); конгресах фізіологічного товарне Великобританії (Оксфорд, Великобританія, 1995; Дублін, Ірландія, 1997); спільному kohtj фізіологічних товариств Угорщини та Румунії (Сегед, Венгрія; Тимошуари, Румунія, 19! міжнародній конференції з молекулярної та клітинної фізіології ( Ліверпуль, Великобритаї 1997); 41-ому конгресі біофізичного товариства СІНА ( Новий Орлеан, СІНА, 1997); XXXIII міжнародному конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, Россія, 1997). Матерії дисертації опубліковано в п’ятьох статтях наукових журналів та в шести тезах міжнароді конференцій.

Обсяг та структура дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результг дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 237 иайменува Робота викладена на 120 сторінках, ілюстрована 29 малюнками та 3 таблицями.

з.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ ,

Эб’ект досліджень. Дослідження проводили на поодинких гладеньком’язових клітинах taenia морської свинки та vas deferens щура. Для виділення ГМК taenia coli смужку тканини римували у номінально безкальцієвому розчині Кребса, який містив колагеназу (тип XI) 0.2% бичачий сироватковий альбумін 0.3%. Час інкубування тканини з ферментом складав близно 35 хв при 34°С. Оброблена таким чином смужка taenia coli відмивалась від ферменту ільк'а хвилин при кімнатній температурі номінально безкальцієвим розчином. Для отримання іьованих клітин шматочки тканини багаторазово пропускались через пастерівську піпетку в іінально безкальцієвому розчині Кребса .

Іроцедура виділення гладеньком’зових клітин vas deferens щура суттєво не відрізнялась від гденої вище для taenia coli. Зпідимальну частину vas deferens довжиною до І см витримували шінально безкальцієвому розчині Кребса, який містив колагеназу (тип XI) 0.3% и бичачий эватковий альбумін 0.4%. Час ферментативної обробки при 34°С складав приблизно 50 хв. Електричні вимірювання. Для дослідження іонних струмів ізольованих гладеньком’язових ин було застосовано класичну “whole-cell” конфігурацію методу фіксації потенціалу петч-,ш (Hamill et al., 1981) та модифіковану конфігурацію - “whole-cell perforated patch” із эристанням антібіотика амфотеріцину Б (Rae et al., 1991). Після утворення щільного юмного) контакту між стінками піпетки та мембраною клітини (конфігурація “cell-attached”) імували доступ до цитоплазми клітини або руйнуванням ділянки мембрани під піпеткою товхами від’ємного тиску, або перфоруванням цієї ділянки амфотеріцином Б. Використання отеріцину Б дозволяло змінювати внутрішньоклітинний вміст тільки одновалентних катіонів ніонів. Послідовний опір, який було оцінено з амплітуди ємнісного струму, складав менше 10 МОм. Внаслідок цього, компенсація послідовного опіру, звичайно, не проводилась, пенсація ємнісного струму проводилась лише в експериментах на ГМК var deferens щура, осліди проводили при кімнатній температурі (20-24°С). Фіксація потенціалу та вимірювання их струмів здійснювали за допомогою підсилювача ЕРС 7 (НЕКА electronik). Сигнал з іду перетворювача струм-напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу З на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200А (Axon Instruments Inc.) і далі в і’ютер IBM PC/AT. Дані аналізувались за допомогою програми “pCLAMP 5.5”та “Origin

:ини. Номінально безкальцієвий розчин Кребса мав такий склад (мМ): NaCl 135, КС1 6, !І21.2, глюкоза 5, HEPES 10 (pH 7.4, NaOH). Зовнішній розчин звичайно містив (мМ): NaCl CsCl 6, CaCh 2.5, ТЕАС1 5, MgCh 1.2, глюкоза 5, HEPES 10 (pH 7.4, NaOH). Піпетковий ин мав такий склад (мМ): CsCl 140, MgS041, ШгАТФ 1, №2ІТФ 0.2, ЭГТА 0.5, HEPES 10 7.2, CsOH). В дослідах із використанням амфотеріцину Б 1 мг речовини розчиняли в 20 мкл ZO та розводили в піпетковому розчині, який містив CsCl 140, MgS04 1, ЭГТА 0.5, HEPES □ кінцевої концентрації 250 мкг/мл.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Внутрішньоклітинні механізмі! регуляції Са2+ каналів L-типу гладеньком’язових клітнн taei

соїі морскоГ свинки Вплив внутрішньоклітинних нукпеотидів та іоиов Са1* на Іса

Зсув мембранного потенціалу ГМК taenia соїі морскої свинки від -60 мВ до потенціалів -40 +40 мВ викликав появу вхідного Са2+ струму, який мав характеристики Са2+ струму L-типу Сг каналів. Внутрішньоклітинний діаліз міоцитів піпетковим розчином без АТФ та ГТФ призводі до поступового зменшення Іса- Так, на 12 хвилині діалізу амплітуда Іса зменшувалась на 78+8 (п=4) (Рис.1). Додавання АТФ (1 мМ), якийє субстратом багатьох внутрішньоклітинних реакці до піпеткового розчину призводило до стабілізації амплітуди Іс* на протязі перших 10 хвилин

діалізу, за якою слідувало різке зменшені атф+гтф струму. Додавання іншо:

рибонуклеозидтрифосфату, ГТФ (0.2 мІУ

-іп

in-

і А

Рис. 1. Залежність амплітуди Іс« від присутності АТФ та ГТФ в піпетковому розчині.

Залежність амплітуди Ісі від часу діалізу клітин піпетковим розчином без додавання АТФ і ГТФ (в, л=4), із додаванням 1 мМ АТФ (А, п=6) та із додаванням 1 мМ АТФ та 0.2 мМ ГТФ (□, п=-б). Іса викликали деполяризацією мембрани від -60 до 0 мВ. Амплітуду Іса нормували до пікового значення Іс», зареєстрованого на 3 хв діалізу.

до піпеткового розчину разом з АТФ і тільки запобігало зменшенню Іса, але призводило до помітного збільшені струму. На рис.1 представлена залежніс амплітуди Іса від часу діалізу ГМК за умо коли до піпеткового розчину не flOflaeaj АТФ і ГТФ, додавали тільки АТФ, та умовах, коли піпетковий розчин містив : АТФ, так і ГТФ. Отже Іса L-типу Са2+ каналів ГМК taenia соїі морскої свинк суттєво залежить від внутрішньоклітинни реакцій, субстратом яких є АТФ та ГТЗ Слід зазначити, що ці реакції є кальціі залежними. Про це свідчить той факт, щ додавання АТФ і ГТФ до піпетковог розчину не запобігало зменшенню Іса, за

умов, коли піпетковий розчин містив кальцієвий буфер ЕГТА (10 мМ).

Дія активаторів та блокаторів серин/треонінових протеїнкіназ на Іса

Участь серин/треонінових протеїнкіназ у регуляції вихідного (базального) струму Са2+ канал Е-типу досліджували з використанням ряду блокаторів цих протеїнканаз (стауроспорі челеритрин, Н-7 і Н-8). Додавання кожного з цих блокаторів до зовнішнього розчину приводи: до дозазалежного, з повільним розвитком, зменшення амплітуди Іса, яке досягало стаціонарно) рівня за 3-8 хвилин дії блокатора (Рис.2). Слід відзначити, що стауроспорін та Н-7 неселективними блокаторами серин/треонінових протеїнкіназ, таких як ПКС, ПКГ, ПКА, кіна: легких ланцюгів міозину та Са/кальмодулінзалежної протеїнкінази, в той час як челеритрин

*

[і

:татньо селективним блокатором ПКС. Що стосується Н-8 , то цей блокатор більш ективно інгібує активність ПКА та ПКГ. Виходячи з отриманих даних, можна припустити, базальна активність Са2+ каналів L-типу міоцитів taenia соїі морскої свинки

залежить від процесів фосфорилювання. Ці процеси обумовлені дією, принаймні, трьох протеїнкіназ: ПКС, ПКА, ПКГ. Проте

неселективність блокатора ПКА та ПКГ не дозволяє робити однозначний висновок про роль цих протеїнкіназ у регуляції Са2+ каналів. Внаслідок цього, в наступній серії експериментів ми досліджували дію речовин, які активують ці протеїнкінази.

Відомо, що мембранопроникні аналоги цГМФ здатні активувати цГМФ-залежну протеїнкіназу і при цьому, на відміну від цГМФ, не зазнають впливу фосфодіестераз циклічних нуклеотидів та не активують цГМФ-залежну фосфодіестеразу цАМФ (Lincoln & Cornwell, 1993). В наших дослідах додавання до зовнішнього розчину 8-бром-цГМФ, дибутирил-цГМФ, а також нітрогліцерину, який активує синтез цГМФ,

о.оі о.і і

Стауроспорин

(мхМ)

1 10 10 100

Челеритрин Н-7 (мкМ) (мкМ)

0.01 О.і 1

Н-3

(мкМ)

. 2. Дія блокаторів сернн/треонінових протеїнкіназ мплітуду ІСа.

сна колонка відповідає вираженому у відсотках Зуванню амплітуди Іс, вказанною концентрацією катора. Цифри у дужках відповідають кількості іідженних клітин. Іса викликали деполяризацією

брани від -60 до 0 мВ.

ізводило до дозазалежного пригнічення Іса. На рис.З представлено дію 8- бром-цГМФ на Іса-

8-бром-цГМФ 3 мкМ Б 8-бром-цГМФ 300 мкМ

контроль 50 мс

Н контроль

50 пА

ВРЕМЯ (сек)

3. Дія 8-бром-цГМФ на Іс».

> контролі та при дії 3 мкМ (А) і 300 мкМ (Б) 8->і-цГМФ. Іса викликали ступінчатою іляризацією мембрани від -60 до 0 мВ. В, жність дії 300 мкМ 8-бром-цГМФ на амплітуду Іс» часу. Цифри відповідають амплітудам струмів, [ставлених у частині Б

Рис.4. Ефект форсколіну та дб-цАМФ на Іс».

А, Іс, які викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до 0 мВ, в контролі та в присутності 10 мкМ (вгорі) і 300 мкМ (знизу) форсколіну (фор.). Б, Іс«, які викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до +10 мВ, в контролі та в присутності 5 мкМ (вгорі) і 500 мкМ (знизу) дб-цАМФ.

Амплітуда Іса зменшувалась на 11.2+6.8% (п=5) при аплікації 3 мкМ та на 30.2+5.7% (п=8) nj дії 300 мкМ 8-бром-цГМФ. Для активації ПКА було використано мембранопроникні аналої цАМФ (дибутирил-цАМФ, 8-бром-цАМФ), а також форсколін, який, як відомо, виклик; збільшення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ, за рахунок активації аденілатциклаз Додавання до зовнішнього розчину 10 мкМ форсколіну або 5 мкМ дибутирил-цАМФ (ді цАМФ) призводило до збільшення амплітуди Іса відповідно на 18.4±7.3 % (п=3) та на 13.6±5.8 (п-4). Збільшення концентрації форсколіну та дб-цАМФ викликало протилежний зфект, а самі інгібування Іса. Так, аплікація 300 мкМ форсколіну зменшувала амплітуду Іса на 15.7+4.2 (п=4), а 500 мкМ дб-цАМФ блокував пікове значення Іса на 28.1±7.9 % (п=7) (Рис.^ Аналогічним чином впливав на Іса інший мембранопроникний аналог цАМФ - 8-бром-цАМ1 Слід зазначити, що в деяких випадках ефект високих концентрацій 8-бром-цАМФ і дб-цАМ супроводжувався короткочасною активацією Іса, за якою слідувало пригнічення струму.

Дія ГТФуЗ ІШ ІСа.

Як відомо, ГТФ є необхідним для активації G-білків, які, в свою чергу запускають каск; внутрішньоклітинних реакцій, що призводять до стимуляції протеїнкіназ. Для тривалої активаї. G-білків використовують аналоги ГТФ, що не гідролізуються (Bimbaumer et al., 1987). За наші експериментальних умов, додавання такого аналога ГТФ - ГТФ/S - до піпеткового розчш викликало значне збільшення амплітуди Іса. На рис.5 представлена залежність амплітуди Іса в часу діалізу клітини піпетковим розчином, який містив 50 мкМ ГТФ/S. На 15-ій хвилині діалі: амплітуда Іса збільшувалась у середньому на 77.4+11.3 % (п=9) по відношенню до амплітуди Іс зареєстрованого на 3-ій хв після прориву мембрани. В наступних експериментах м досліджували можливу участь протеїнкіназ в ефекті ГТФ/S. За умов класичної “whole- cell”

11.5 Е

і

і

5 І

J1'

J100 пА 100 мс

5

6 s 8я

7 і: Бремя (huh)

П

Н”Ші

с rKDjS

« ГТФ tS -Келертприн

Рис.5. Дія ГТФув на Іс».

Праворуч - залежність амплітуди Іс* від часу діалізу клітини піпетковим розчином, який містив 50 мкМ ГТФ/S. Іс« викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до 0 мВ. Амплітуду Іса нормували до пікового значення Іса, зареєстрованого на 3 хв діалізу. Ліворуч - Іса, зареєстровані на 4-ій і 14-ій хв діалізу

os іо їв :

ВРЕМЯ (лин)

Рис.6. Вплив челеритрину на фоні дй ITOyS.

Залежність амплітуди Іса від часу діалізу кліті піпетковим розчином, який містив rTCtyS (50 мкМ) контролі (О, п=9) та в присутності ЮмкМ челеритриї (•, п=4). Іса викликали ступінчатою деполяризаціє мембрани від -60 до 0 мВ. Амплітуду Іс» нормували і пікового значення Іс«, зареєстрованого на 3 хв діалізу

нфігурацїї, як і в дослідах із використанням амфотеріцину Б, 8-бром-цАМФ (1 мкМ) изводив до збільшення Іса- амплітуда Іса в результаті дії 8-бром-цАМФ (1 мкМ) збільшувалась ередньому на 33.4+8.2 % (п=4). Активуюча дія 8-бром-цАМФ спостерігалась і в тих випадках, пи піпетковий розчин містив rTOyS (50 мкМ) і складала 27.5+6.7 % (п=4), що суттєво не ;різнялось від ефекту речовини за контрольних умов. Внесок ПКС в ефект ГТФуБ було сліджено з використанням специфічного блокатора ПКС, челеритрину. Клітини витримували зозчині, який містив челеритрин (!0 мкМ), як мінімум 10 хв до встановлення конфігурації hole-cell”. За таких умов челеритрин суттєво блокував ефект ГТФуЗ : збільшення амплітуди при дії IT®yS (50 мкМ) в контролі на 15-ій хв діалізу складало 77.4±І 1.3 % (п=9), а в исутності челеритрину збільшення амплітуди струму на 15-ій хв діалізу складало 20.4±0.81 % =3). Ці дані свідчать про те, що ПКС, окрім підтримання базальної активності Са2+ каналів L-ту, може опосередковувати збільшення Іса у відповідь на активацію G-білків.

Дія ізопреналіну на Іса •

Стимуляція В-адренорецепторів плазматичної мембрани ГМК викликає розслаблення майже х типів гладеньких м’язів. Аплікація 1-10 мкМ ізопреналіну, селективного агоніста В-зенорецепторів, в зовнішній розчин викликала збільшення амплітуди Іса, в той час як льшення концентрації ізопреналіну вище 100 мкМ приводило до інгібування Іса. Збільшення плітуди Іса в результаті дії 10 мкМ ізопреналіну складало 24.3±6.2 % (п=4), а зменшення ллітуди Іса при дії 500 мкМ ізопреналіну складало 18.2±4.7 % (п=3). Ці досліди виконувались іикористанням амфотеріцину Б. Обидва ефекти ізопреналіну блокувались пропраналолом (1 М), селективним антагоністом В-адренорецепторів. Враховуючи те, що ефект ізопреналіну творював дію аналогів цАМФ і форсколіну на Іса, а також літературні дані про те, що ювним механізмом дії агоністів іЗ-адренорецепторів є активація Gs- білків, які зв’язані з (ептором, та з наступною стимуляцією аденілатциклазного сигнального каскаду (Levitzki, 8), ми припустили, що ефект ізопреналіну на Са2+ канали обумовлений ПКА-залежними >цесами.

Дія карбахоліну па Іса-

Найбільш поширеною збудливою нервово-м’язовою передачею в кишечнику € жаринова холінергічна передача. В наших дослідах додавання до зовнішнього розчину ністу мускаринових рецепторів карбахоліну (1-100 мкМ) викликало дозозалежне інгібування

Зменшення амплітуди Іса при дії 10 мкМ карбахоліну складало 59.3+11.4 % (п=12) і роводжувалось прискоренням інактивації струму на початку аплікації речовини (Рис.7). Як :азано на рис.7,Б, в міру розвитку ефекту карбахоліну, швидкість інактивації струму тупово поверталась до контрольного значення. Аплікація карбахоліну також призводила до ивації вхідного (при від’ємних значеннях мембранного потенціалу) струму неселективніх іоних каналів, напрямок якого змінювався при потенціалі на мембрані +0.8 +2.3 мВ (п=4). )бахолін в присутності ніфедипину (3 мкМ) не впливав на струм, який було зареєстровано і деполяризації мембрани до 0 мВ. Зміни в Іса та активація катіоного струму, які викликались

дією карбахоліну, блокувались в присутності 1 мкМ атропіну, антагоністу мускаринов рецепторів. Внесок внутрішньоклітинних іонів Са2+ в ефект карбахоліну на Іса досліджувані експериментах, в яких піпетковий розчин містив 10 мМ ВАРТА. За таких умов аплікаї карбахоліну (10 мкМ) викликала значно менше блокування (38.2 ±7.7 %, п=8) Іса. Більше тш хелатування внутрішньоклітинних іонів Са2+ блокувало дію карбахоліну на інактивацію струн Подальші дослідження показали, що як інгібування Іса, так і активація катіонного струму результаті дії карбахоліну пов’язані з активністю G-білків, тому що обидва ефекти блокували 1 мМ ГДФВБ. Внесок цАМФ-, цГМФ-залежних протеїнкіназ і ПКС в ефект карбахоліну на

(І 2

Рис.7 Дія карбахоліну на Іс.

А, ІС. , які викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до 0 мВ в контролі (1), і по мірі розвитку ефекту 10 мкМ карбахоліну (2-4). Б, зміна кінетики інактивації Іс» в результаті дії карбахоліну. Амплітуди струмів в присутності карбахоліну, зображені на частині А, було віднормовано до піку ІСа в контролі. В,, залежність від часу амплітуди Іс* при дії карбахоліну. Експеримент виконували із використанням амфотеріцину Б. .

Рис.8 Дія Н-7 на ефект карбахоліну.

Вгорі - Іс», які викликали ступінчатою деполяризацією від -60 до 0 мВ, в контролі (а), при дії 300 мкМ Н-7 (б) та по мірі розвитку ефекту 10 мкМ карбахоліну на фоні дії 300 мкМ Н-7 (в, г). Внизу - зміна на протязі часу амплітуди Іс» при дії Н-7 (300 мкМ) і додаванні карбахоліну (10 мкМ) на фоні дії Н-7 (300 мкМ).

ІСа досліджували з використанням неселективного блокатора цих протеїнкіназ, Н-7. За уме коли активність протеїнкіназ було заблоковано Н-7 (300 мкМ), додавання карбахоліну (Юмкї в зовнішній розчин викликало спочатку значне прискорення інактивації струму та збільшені амплітуди Іса (36.9±9.6 %, n-З), за яким розвивалось повільне інгібування струму (Рис.8).

Дія нейрокініну А на Іса-

Тахікінінові (НКі, НКг) рецептори плазматичної мембрани ГМК відносятся до груї рецепторів, які беруть участь у збудливій неадренергічній нехолінергичній нерво-м’язов передачі. В багатьох роботах було показано, що активація тахікініновьіх (НКі, НКг) рецептор плазматичної мембрани ГМК супроводжується стимуляцією фосфоліпази С (Guard & Watsc

7 0 nA

91). Є також дані про те, що стимуляція тахікінінових рецепторів може призводити до гивації аденілатциклази (Nakajima et al., 1992). В даній серії експериментів ми досліджували дію зиісту НК2 тахікінінових рецепторів, нсйрокініна А (НКА), за допомогою методу фіксації тенціалу з використанням амфотеріцину Б. Аплікація НКА до зовнішнього розчину кликала дозозалежне інгібування Іса з максимальним ефектом 45.0±5.б % (п=12) для 5 мкМ човини та ЕС50 - 25+19 нМ (за рівнянням Міхаеліса-Ментен) (Рис. 9). Інгібування Іса в зультаті дії НКА (5 мкМ) блокувалось на 80 % селективним антагоністом НКг рецептора 2N10627 (1 мкМ). В присутності 3 мкМ ніфедипину НКА (5 мкМ) не викликав суттєвих змін у зумі , який викликали ступінчатим зсувом мембранного потенціалу від -60 до 0 мВ. Ці дані ідчать про те, що інгібуюча дія НКА на Іса при 0 мВ не обумовлена активацією провідностей

50-

о-

•50

00-

50-

:оо

:so

100

50 -г« і-І 20 X 10' 0-

I І ""І І І“Т‘

Q.005 0.5 so »

|НКА](нМ)

нка ;о им

Рис. 10 Загальний механізм інгібуючої дії НКА та карбахоліну на Іс».

Вгорі, Іс*, викликані ступінчатою деполяризацією від -60 до 0 мВ, в контролі (1), при дії 50 нМ мкМ НКА (2), і додаванні 10 мкМ карбахоліну на фоні дії НКА (3,4). Внизу, зміна в часі амплітуди Іс» при дії НКА (50 нМ) та аплікації карбахоліну (10 мкМ) на фоні дії НКА.

:.9 Інгібуюча дія нейрокініну А на Іса.

зміна в часі амплітуди Іса при дії 5 мкМ [А. На вставці, Іс« отримані в контролі (1) та

і дії 5 мкМ НКА (2, 3). Б, залежність жування Іса від концентрації НКА. Цифри я експериментальних точок позначують ькість досліджених клітин для кожної щентрації НКА.

хідного напрямку. НКА не змінював поріг активації Іс», хоча викликав зсув максимуму ВАХ з 4В до +10 мВ. Також було знайдено, що НКА суттєво збільшує швидкість інактивації Іса. окування серин/треонінових протеїнкіназ за допомогою Н-7 не запобігало інгібуванню Іса и дії НКА. Зменшення амплітуди Іса в результаті дії НКА (5 мкМ) в присутності Н-7 (300 мкМ) іадало 36.8±6.5 % (п=4), що суттєво не відрізнялось від контрольних значень. Проте слід [значити, що в присутності Н-7 не спостерігалось прискорення інактивації струму, яке ібувалось при дії НКА за контрольних умов. Подальші дослідження механізму дії НКА на Іса зуднювались тим фактом, що за умов повного внутрішньоклітинного діалізу (класична [(фігурація) нам не вдалося отримати стабільного відтворення ефекту НКА. Сумуючи дані про

з НКА на Іса, можна припустити, що НКА викликає зміну потенціалзалежних властивостей 2+ каналів через процеси, які залежні від активності протеїнкіназ. Зменшення амплітуди Іса и дії НКА, як і у випадку дії карбахоліну на Іса, не опосередковується серин/треоніновими

протеїнкіназами. На рис. 10 представлені дані, які свідчать про те, що інгібуючі ефекти НКА карбахоліну на амплітуду Іса мають спільний внутрішньоклітинний механізм.

Регуляція потенціалактивованого Na+ струму та Са2+ струму L-типу Са2+ каналів гладеньком’ язових клітин vas deferens щура

В експериментах, виконаних на ГМК vas deferens щура, нами було знайдено, що ступінчаті зсув мембранного потенціалу від -80 до 0 мВ викликав появу вхідного струму, який складавсі швидкого та повільного компонентів. Швидкий компонент вхідного струму було знайдено в % досліджених клітин (в 26 із 37). Повільний компонент ефективно блокувався ніфедипіно іонами Со2+ і повністю зникав у номінально безкальцієвому зовнішньому розчині. На підстг цих властивостей, а також потенціалзалежних характеристик, було зроблено висновок , що

100 пА

Б

0

Зж 0-

ед ГВ -50-

б а -100-

-150-

-200-

-250-

-ЗС0-

-350-

-400-

l(p^J

' І гр і' І ' І

ВРЕМЯ (мин)

18212445485і

повільним компонент вхідного струму ІСа L-типу Са2+ каналів. Швидкі компонент вхідного струму бу: Нифедипин 3 мкМ охарактеризовано як стр> тетродотоксин-чутливих потенціалактивованих Na+ каналів (Ь на підставі наступних критеріїв: 1) стрз зникав у безнатрієвому зовнішньої розчині; 2) струм не проявляв чутливос до заміни Са2+ на Со2+ в зовнішньої розчині; 3) ефективно блокувався

Рис.11 Залежність ІКа та Іс« від внутрішньоіоіггишіого метаболізму.

А, вхідні струми, викликані ступінчатою деполяризацією мембрани від -90 до 0 мВ тривалістю 40 мс. Букви біля кожного струму відповідають буквам в частині Б рисунка. Б, залежність амплітуди швидкого (Ік„ О) та повільного (Іса. •) компонентів вхідного струму від часу діалізу . Амплітуди струмів вимірювались кожні 15с. Вісь часу переривається з 26 до 45 хв від початку діалізу.

тетродотоксином (ТТХ) (Кд - 6.7 hN 4)потенціалзалежні характерне™ струму співпадали з характеристика» класичного Na+ струму ТТХ-чутливі Na+ каналів.

В наступній серії експеримент досліджували залежність Ьіа та Іса ГМК vas deferens щура від внутрішньоклітинного метаболізму. Внутрішньоклітинні діаліз розчином, який не містив АТФ і ГТФ, як і в ГМК, ізольованих із taenia coli морськ свинки, викливав значне зменшення Іса (Рис. 11). Інгібування амплітуди Іса на 12 хв. від почат діалізу складало 81.3+4.6 % (п=4). На відміну від Іса, відсутність АТФ і ГТФ в піпетково( розчині суттєво не впливала на iNa на протязі 50 хв діалізу. Таким чином базальна активніс Na+ каналів, чутливих до тетродотоксину, в ГМК vas deferens щура обумовлена лиі мембранним потенціалом і не залежить від внутрішньоклітинних метаболічних процесів.

и

ОБГОВОРЕННЯ

Регуляція базальної активності L-тнпу Са2+ каналів у ГМК taenia coli морської свинки

Уже в перших дослідженнях, в яких застосовували метод внутрішньоклітинного діалізу, ло помічено поступове зменшення амплітуди Іса L-типу Са2+ каналів збудливих клітин, що іяснювалось можливим “вимиванням” з клітини важливих метаболічних компонентів в процесі злізу. В наших експериментах, внутрішньоклітинний діаліз розчином, який не містив АТФ та ГФ, призводив до суттєвого інгібування Іса вже на 10 хв діалізу, в той час як додавання АТФ і піпеткового розчину стабілізувало амплітуду струму принаймні на протязі перших 10 хв ілізу. Це свідчить про те, що значна частина базальної активності Са2+ каналів L-типу ГМК тіа соїі підтримується метаболічними реакціями. Стабілізуюча дія внутрішньоклітинного ГФ на Іса, очевидно, є загальним феноменом для багатьох типів клітин. Однак різке зменшення і після 10 хв внутрішньоклітинного діалізу розчином, який містив АТФ, свідчить про те, що я підтримання базальної активності Са2+ каналів необхідні також інші внутрішньоклітинні іктори. Як відомо, рівень вторинних посередників у клітині в стані спокою може бути умовлений спонтанною активністю G-білків (Kenakin, 1995). Дійсно, наши дослідження казали, що додавання ГТФ, необхідного для функціонального циклу G-білків, разом із АТФ піпеткового розчину призводило до стабілізації Іса на протязі тривалого проміжку часу від чатку внутрішньоклітинного діалізу.

Три класичні вторинні посередники - цАМФ, цГМФ та іони Са2+ - призводять до гивації відповідних протеїнкіназ, а саме цАМФ-залежної протеїнкінази (ПКА), цГМФ-тежної протеїнкінази (ПКГ), протеїнкінази С (ПКС), Са2+/кальмодулінзалежних протеїнкіназ. окатори цих серин/треонінових протеїнкіназ викликали дозозалежне пригнічення Іса в ГМК ■піа соїі морської свинки. Повільний розвиток ефектів блокаторів дозволив^ припустити, що їх : обумовлена скоріше блокуванням активності протеїнкіназ, ніж неспецифичною дією їх на 2+ канали. Виходячи з біохімічних властивостей використанних нами блокаторів ми ипустили, що дія челеритрину в концентраціях <10 мкМ на Іса опосередковується ібуванням ПКС, в той час як Н-8, у концентраціях < 1 мкМ, викликає зменшення Іса завдяки зкуванню активності ПКА и ПКГ. Що стосується Н-7 і стауроспоріну, то вони у всьому пазоні концентрацій є неспецифічними блокаторами багатьох серин/треоніновьіх зтеїнкіназ. Враховуючи той факт, що речовини, які активують ПКГ (8-бром-цГМФ, рогліцерин, дибутирил-цГМФ), викликали виключно інгібування Іса, можна припустити, що іальна активність L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia соїі морської свинки ,тримується ПКА- та ПКС-залежними процесами фосфорилювання.

Дослідження дії речовин, що активують ПКА (дб-цАМФ, 8-бром-цАМФ, форсколін, преналін) показали, що ці сполуки в залежності від концентрації мають два протилежні жти на Іса L-типу Са2+ каналів мембрани ГМК taenia соїі морської свинки: низькі щентрації збільшують, а більш високі - зменшують струм. Із літературних даних відомо, що МФ може активувати цГМФ-залежну протеїнкіназу (Francis, 1988), а ізопреналін і форсколін

можуть активувати ПКА та ПКГ без зміни внутрішньоклітинної концентрації цГМФ (Jiar 1992). Більше того, було показано, що аналоги цГМФ і донори NO за рахунок активації Са: АТФ-аз саркогшазматичного ретикулума і плазматичної мембрани, та/або за рахуй інгібування Са2+ каналів L-типу, викликають зниження внутрішньоклітинної концентрації Сг (Murad, 1986; Blatter &. Wier, 1994), а ефект зниження внутрішньоклітинної концентрації Са2+ п] дії ізопреналіну та форсколіну в клітинах культури ГМК аорти щура змінювався протилежний, тобто на збільшення концентрації Са2+ за умов, коли експресія ПКГ була знач: пригнічена (Lincoln et al., 1990). Таким чином, можна припустити, що цАМФ, при доси високих концентраціях активує ПКГ і внаслідок цього, викликає пригнічення Іс» L-типу Се каналів.

Необхідно зазначити, что майже всі речовини, що викликають збільшен внутрішньоклітинної концентрації цАМФ, навіть при низьких концентраціях, пригнічую електричну та механічну активність гладеньком’язових смужок (Huizinga et al., 1991). Більї того, було показано, що цАМФ викликає гіперполяризацією гладеньком’язових смужок, я обумовлена активацією К+ каналів, і, тим самим, пригнічує розвиток повільних хвиль генерацію потенціалу дії (Ozaki et al., 1992). Таким чином, дія цАМФ на мембранний потенці безумовно буде маскувати невелике збільшення Іса- Хоча можна припустити, що збільшення в результаті дії цАМФ приводить до підвищення примембранної концентрації Са2+ та, внаслід цього, до збільшення активності кальційзалежних К+ каналів. Проте, цАМФ-залежне зменшен Іса L-типу Са2+ каналів може бути одним із основних механізмів пригнічення механічі активності багатоклітинних препаратів при дії речовин, що викликають збільшен внутрішньоклітинної концентрації цАМФ.

Аналоги ГТФ, що не гідролізуються, можуть активувати ряд G-білків, в тому числі ( Gi, Gq. Активація останніх може призводити відповідно до стимуляції аденілатцикла: інгібування аденілатциклази, стимуляції ПКС. В наших дослідах додавання 50 мкМ ГТФуЗ піпеткового розчину разом із АТФ викликало значне збільшення Іса. Дані про те, що челеритр блокує ефект ГТФуЗ, переконливо доводять участь ПКС-залежного фосфоршповання в проц збільшення Іса ГМК taenia coli морської свинки. Слід зазначити, що специфічні блокатори ПІ викликають пригнічення скорочення гладеньком’язових смужок при стимуляції зв’язаних гетеротримерними G-білками рецепторів плазматичної мембрани (Shimamoto et al., 1993). Так чином можна припустити, що опосередковане ПКС збільшення Іса у відповідь на стимуляці зв’язаних із гетеротримерними G-білками рецепторів плазматичної1 мембрани, є одним механізмів, які лежать в основі агоністіндукованого скорочення гладеньких м’язів.

В наступних експеріментах ми досліджували внесок серин/треонінових протеїнкіна: регуляцію Іса L-типу Са2+ каналів рецепторами плазматичної мембрани, які опосередковуй збудливу нервово-м’язову передачу в кишечнику. Для стимуляції цих рецепторів використовували карбахолін, агоніст мускаринових рецепторів, та нейрокінін А, агоніст Н нейрокінінових рецепторів плазматичної мембрани.

На підставі біохімічних даних відомо, що стимуляція Мг і Мз мускаринових рецепторів, кі є основними підтипами мускаринових рецепторів плазматичної мембрани міоцитів taenia oli, призводить відповідно до гідролізу фосфоінозитидів та інгібування аденілатциклази (Eglen t al., 1996). Утворення інозитолтрифосфату, вивільнення Са2+ із саркоплазматичного етикулума та подальше скорочення гладеньких м’язів є загальноприйнятою та добре вивченою хемою дії агоністів мускариновых рецепторів (Schramm & Grundstein, 1989; Eglen et al., 1996). ому можна припустити, що виявлений нами ефект карбахоліну - зменшення амплітуди Іса, яке упровджується прискоренням інактивіції, відбувається внаслідок так званої “кальційзалежної іактивції” Са2+ каналів (Ganitkevich et al., 1987). Дійсно, додавання ВАРТА до піпеткового озчину значно зменшувало пригнічення Іса при дії карабахоліну та повністю запобігало рискореншо інактивації струму. Домінуючий внесок кальційзалежного інгібування в ефект гоністів мускаринових рецепторів на Іса, очевидно, є загальним феноменом для багатьох ісцеральних гладеньких м’язів (e.g., Wade et al., 1996).

Літературні дані про участь протеїнкіназ, зокрема ПКС, в модулючій дії мускаринових гоністів на Іса ГМК є достатньо суперечливими. В наших дослідах аплікація карбахоліну на оні дії Н-7 призводила до короткочасного початкового збільшення амплітуди Іса, за яким ідбувалось інгібування струму. Ці дані свідчать, по-перше, що інгібування амплітуди Іса арбахоліном не опосередковується серин/треоніновими протеїнкіназами; по-друге, пригнічення ктивності вищезгаданих протеїнкіназ призводить до короткочасного збільшення Іса при гимуляції мускаринових рецепторів. Можна припустити, що стимулюючий ефект карбахоліну, □умовлений прямою дією G-білків на Са2+ канали, який став можливим внаслідок структурних гретворень в каналах при дефосфорилюванні, викликаному пригніченням активності ротеїнкіназ. Відомо, що ПКС стимулює активність неселективних катіонних каналів у ГМК Uin et al., 1997; Oike et al., 1993). Відповідно, пригнічення активності ПКС призводить до ігібування струму неселективних катіонних каналів. В цьому випадку, очевидно, збільшення Іса ри дії карбахоліну є альтернативним механізмом, який сприяє розвитку деполяризації, входу >нів Са2+ досередини клітини та наступному скороченню.

Агоністи нейрокінінових рецепторів плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин, с показано на багатоклітинних препаратах, викликають деполяризацію мембрани, збільшення ішлітуди та тривалості спонтанних потенціалів дії, які супроводуються скороченням м’язових іужок. Як і карбахолін, НКА, агоніст гахікінінових рецепторів, більше селективний до НКг дтипу рецепторів, викликав дозозалежне зменшення Іса ГМК taenia coli морської свинки. Дія КА на амплітуду Іса також супроводжувалась прискоренням інактивації струму. Дослідження зтенціалзалежності ефекту НКА показали, що речовина не змінює потенціали активації, аксимуму та зміни напрямку Іса. Таким чином, прискорення інактивації струму при дії НКА не 5умовлено зміною параметрів ВАХ Іса. Окрім впливу на швидкість інактивації струму, НКА ікож викликав зсув кривої стаціонарної інактивації в напрямку від’ємних потенціалів, одібний ефект на потенціалзалежність L-типу Са2+ каналів спостерігався в ГМК воротної вени

кроля при пригнічуючій дії аналогів циклічних HyKjieoTimiB(Ishikawa et а!., 1993). Дійсне аплікація НКА на фоні дії Н-7 запобігала розвитку ефекту прискорення інактивації струму, в то час як зменшення амплітуди струму не відрізнялось від контрольного інгібування. Таким чиної можна зробити висновок про те, що дія НКА на Іса опосередковуется, як мінімум, двом механізмами: незалежним від ПКА, ПКС та ПКГ зменшенням амплітуди та опосередкованиі дією серин/треонінових протеїнкіназ прискоренням інактивації струму.

Наші подальші дослідження показали, що механізм зменшення амплітуди Іса є спільнш для ефектів НКА та карбахоліну, оскільки, аплікація карбахоліну на фоні дії НКА не викликал подальшої зміни амплітуди Іса- Що стосується фізіологічного значення зменшення Іса при д карбахоліну та НКА, то можна припустити, что цей ефект є механізмом, який обмежує ефек медіаторів збудливої нервово-м’язової передачі на гладенькі м’язи. Більше того, очевидно, це

ефект ОПОСередКОВуЄТЬСЯ СПІЛЬНИМ ДЛЯ збудЛИВИХ МеДІаТОрІВ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИМ MCXaHi3MOV

Подібна ідея була вже запропанована іншими авторами (Beech, 1993; Beech & McHugh, 1996; Unn et al., 1996), але наші дані є першим експериментальним підтвердженням цього припущення.

Залежність Na+ струму та Са2+ струму L-типу Са2+ каналів ГМК vas deferens щура від внутрішньоклітинного метаболізму

Наші електрофізіологічні дослідження вхідного струму ГМК vas deferens щура показала що цей струм проходить через два типи іонних каналів: Са2+ канали L-типу та ТТХ-чутливі Na канали. Слід відзначити, що до сьогодні ТТХ-чутливі Na+ канали були знайдені в ГМК лиш кількох типів гладеньких м’язів. В даній роботі ми провели порівняльне дослідження залежній базальної активності потенціалкерованих Na+ і Са2+ каналів від стану внутрішньоклітинні» метаболізму ГМК .Яків ГМК taenia соїі морської свинки, внутрішньоклітинний діаліз ГМК va deferens щура розчином, який не містив АТФ та ГТФ , призводив до швидкого зміншення Іс Са2+ каналів L-типу. Проте, амплітуда INa не зазнавала ніяких змін на протязі 50 х: внутрішньоклітинного діалізу. На підставі цих даних було зроблено висновок про те, що, по перше, базальна активність L-типу Са2+ каналів ГМК vas deferens щура залежить в і, внутрішньоклітинного метаболізму , а саме, від процесів фосфорилювання. По-друге, активніст: ТТХ-чутливих Na+ каналів цих ГМК визначається, очевидно, лише мембранним потенціалом не знаходиться в прямій залежності від внутрішньоклітинних метаболічних процесів. Наскілью нам відомо, до цього часу нема літературних даних про вплив фосфорилювання на активніст: ТТХ-чутливих Na+ каналів ГМК. В основному роботи, які присвячені цьому питанню, булі виконані на нейронах і кардіоміоцитах. Так, молекулярні дослідження свідчать, що а субодиниця Na+ каналів нейронів мозку щура може фосфорилюватися як ПКА , так і ПКС Високий рівень фосфорилювання Na+ каналів у стані спокою було знайдено в клітинах первинно культури нейронів мозку щура (Rossie & Catterall 1987). Модуляція INa ТТХ-чутливих Na+ каналії нейронів та кардіоміоцитів під впливом ПКА- і ПКС-залежного фосфорилювання булі показано в експериментах із використанням методу “петч-клемп” (Ismailov & Benos, 1995) Можливо, що ТТХ-чутливі Na+ канали мембрани ГМК не є чутливими до протеїнкіназ, або існу

іний регуляторний фактор, що блокує фосфорилювання в стані спокою клітини та зсуває це жування при стимуляції клітини нейромедіаторами.

Слід відзначити, что фізіологічне значення ТТХ-чутливих Na+ каналів у гладеньких зах ще не зовсім з’ясовано. Але той факт, що в області потенціалів спокою деньком’язових клітин значна частина Na+ каналів знаходиться в неінактивованому стані ке свідчити про те, що ці канали здатні брати участь у генерації потенціалу дії.

ВИСНОВКИ

За допомогою методу фіксації потенціалу було показано, що базальна активність Са2+ каналів L-типу ГМК taenia coli морської свинки підтримується дією цАМФ-залежної протеїнкінази (ПКА) та протеїнкінази С (ПКС).

Встановлено, що незначне підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ(<10 мкМ) приводить до опосередкованого ПКА збільшення амплітуди fca L-типу Са2+ каналів. Подальше підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ інгібує Іса L-типу Са2+ каналів ГМК taenia coli морської свинки.

Стимуляція ПКС G-білками викликає, незалежно від активності ПКА, збільшення ІСа L-типу Са2+ каналів ГМК taenia coli морської свинки.

Показано, що агоністи мускаринових і тахікінінових рецепторів шіазматичної мембрани ГМК taenia coli морської свинки викликають пригнічення амплітуди Іса Са2+ каналів L-типу через спільні внутрішньоклітинні механізми, які не залежать від активності серин/треонінових протеїнкіназ.

За умов блокування серин/треонінових протеїнкіназ, активація мускаринових рецепторів приводить до короткочасного збільшення амплітуди Іса L-типу Са2+ каналів ГМК taenia coli морської свинки.

Вперше показано, що потенціалактивований вхідний струм ГМК vas deferens щура переноситься через L-тип Са2+ каналів та ТТХ-чутливі Na+ канали.

Базальна активність ТТХ-чутливих Na+ каналів плазматичної мембрани ГМК vas deferens щура не залежить від процесів фосфорилювання.

5оти, опубліковані за матеріалами дисертації.

Іима А.В., Белевич АЗ., Цугорка А.М., Шуба М.Ф. Угнетающее действие нитроглицерина іа потенциалактивируемый кальциевый ток изолированных гладкомышечных клеток :ишечника II Нейрофизиология.-1994.- Т.26.- N3,- С.64-67.

'agorodnyuk V. P., Belevich А. Е., Maggi С. А., М. F. Shuba I Role of tachykinins in non-idrenergic non-cholineergic excitation in smooth muscle of gastro-intestinal tract.// 'Teurophysiology .- 1995,- V.27.- N5\6.- P.425-433. -

Зима А., Белевич А., Цицюра Я., Шуба М. Действие окиси азота на Са2+- и Са2+-.ктивируемые К+ каналы в гладкомышечных клетках taenia coli морской свинки // Физика <ивого.-1996.-Т.4,- N. 1,- С.67-72.

4. Белевич А.Э., Зима А.В., Хархун М.И., Шуба М.Ф. Механизмы действия карбахолина Са2+ ток L-типа Са2+ каналов в гладкомышечных клетках taenia coli морской свинки // Физи живого,-1997,- т.5.-N2 .-С.61-68.

5. Белевич А.Э., Зима А.В., Хархун М.И., Шуба М.Ф. Роль цАМФ, цГМФ и протеинхиназы С регуляции Са2+ тока L-типа Са2+ каналов электровозбудимой мембраны гладкомышечи клеток // Нейрофизиология.-1998.-т.30,- N 2 .-С.83-90.

Тези доповідей:

1. The Physiological Society Annual Meeting, Oxford, UK, 1995. Belevich A., Zima A. and Shuba 1 Augmentation of potential-activated calcium current by GTPyS-activated G proteins in taenia c smooth muscle cells.

2. The Romanian-Hungarian Physiology Joint-Meeting, Szeged, Hungary, Timosoara, Romania, 195 Shuba M., Bclevich A., Harhun M, Zima A. Protein kinase regulation of calcium channels gastrointestinal smooth muscle cells.

3. The Physiological Society Meeting, Dublin, Ireland, 1997. Belevich A., Zima A. and Shuba M. regulation ofL-type calcium channels in intestinal smooth muscle cells by protein kinases.

4. The Molecular and Cellular Physiology Conference, Liverpool, UK, 1997. Belevich A., Zima . Vladimirova I, Jurkiewicz N, Jurkiwicz A, Shuba M. Tetrodotoxin-sensitive Na2* current in sin& smooth muscle cells isolated from rat vas deferens.

5. 41-st Annual Meeting of Biophysical Society, New-Orleans, USA, 1997. Belevich A., Zima A. Shu

M. Neurokinin A changes voltage-dependent characteristics of L-type calcium channels in taenia c> smooth muscle cells.

6. ХХХШ International Congress of Physiological Sciences, St.Petersburg, 1997. Jurkiewicz A., Belevi A., Hirata H., Jurkiewicz N., Shuba M., Vladimirova I., Zima A. Voltage-gated ionic channels a, contraction activation in rat vas deferens smooth muscle cells.

ЭТАЦИ:

і'влч А.Е. Роль серші/трсонінових протеїнкіназ в регуляції Са2+ струму L-типу Са2+ каналів ієііьком’язоиііх клітин. - Рукопис.

ертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02-зізика. - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1998. а допомогою методу фіксації потенціалу було досліджено внесок серин/треонінових геїнкіназ в регуляцію Са2+ струму L-типу Са2+ каналів (Ic^.l) мембрани поодиноких їеньком’язових клітин (ГМК) taenia coli морської свинки за базальних умов та за умов луляції хеморецепторів плазматичної мембрани. Показано, що базальна активність Са2+ ілів L-типу підтримується дією цАМФ-залежної протеїнкінази (ПКА) та протеїнкінази С !С). Встановлено, що незначне підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ(<10 1) приводить до опосередкованого ПКА збільшення амплітуди Ісах, в той час як подальше іирення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ інгібує Ica,L- Стимуляція ПКС G-білками никає, незалежно від активності ПКА, збільшення амплітуди Іса,ь Також показано, що іісти мускаринових і тахікінінових рецепторів плазматичної мембрани ГМК taenia coli ської свинки викликають пригнічення амплітуди Ica,L через спільні внутрішньоклітинні анізми, які не залежать від активності серин/треонінових протеїнкіназ. Вперше показано, що гнціалактивований вхідний струм ГМК vas deferens щура переноситься через L-тип Са2+ ілів та ТТХ-чутливі Na+ канали. Встановлено, що базальна активність ТТХ-чутливих Na+ алів плазматичної мембрани ГМК vas deferens щура, на відміну від L-типу Са2+ каналів, не :жить від процесів фосфорилювання.

зчові слова: поодинокі гладеньком’язові клітини, L-тип Са2+ каналів, ін/треонінові протеїнкінази, taenia coli, vas deferens, ТТХ-чутливі Na+ канали.

евич А.Э. Роль серин/треошшових протеинкиназ в регуляции Са1+ тока L-типа Са2+ каналов цсомышечных клеток. - Рукопись.

.сертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности Ю.02- биофизика. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1998.

1ри помощи метода фиксации потенциала исследовался вклад серин/треонинових теинкиназ в регуляции Са2+ тока L-типа Са2+ каналов (1са,ь) одиночных гладкомышечных гок (ГМК) taenia coli морской свинки в базальных условиях и при стимуляции орецепторов плазматической мембраны . Показано, что базальная активность Са2+ каналов лпа поддерживается действием цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) и протеинкиназы С :С). Установлено, что незначительное повышение внутриклеточной концентрации У1Ф(<10 мкМ) приводит к опосредованному ПКА увеличению амплитуды Ica.L, в то время дальнейшее повышение внутриклеточной концентрации цАМФ ингибирует 1са,Ь імуляция ПКС G-белками вызывает независимое от активности ПКА увеличение амплитуды .. Также показано, что агонисты мускариновых и тахикининовых рецепторов

плазматической мембраны ГМК taenia coli морской свинки вызывают угнетение амплитуды 1< через общие внутриклеточные механизмы, которые не зависят от активности серин/треонинов протеинкиназ. Впервые показано, что потенциалактивируемый входящий ток ГМК vas defer крысы переносится через L-тип Са2+ каналов и ТТХ-чувствительные Na+ каналы. Установле] что базальная активность ТТХ-чувствительных Na+ каналов плазматической мембраны ГД vas deferens крысы, в отличие от L-типа Са2+ каналов, не зависит от процесс фосфорилирования.

Ключевые слова: одиночные гладкомышечные клетки, L-тип Са2+ каналов, серин/треониновые протеинкиназы, taenia coli, vas deferens, ТТХ-чувствительные Na+ каналы.

Belevych A.E. The role of serine/threonine protein kinases in regulation of L-type Ca2+ channel curr in smooth muscle cells.- Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02 - biophysics - Bogomoletz Institute of Physiology the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

Using patch-damp technique the contribution of ssrine/threonine protein kinases in a regulation of L-V Ca2+ channel current (Ica.t) in single smooth muscle cells (SMC) from guinea pig taenia coli has b( investigated under basal conditions and upon stimulation of plasma membrane chemoreceptors. Basal acti\ of L-type Ca2+ channels was shown to be maintained by cAMP-dependent protein kinase (PKA) and prot kinase С (PKC). It was determined that slight increase in intracellular cAMP concentration (<10 pM ) caui augmentation of Ica,L peak that mediated by PKA. Further increase of intracellular cAMP concentrat resulted in inhibition of Ica,L- G protein-evoked stimulation of PKC increased amplitude of Ica,L through РКА-independent mechanisms. It was also shown that agonists of muscarinic and tachikinin plas membrane receptors of guinea pig taenia coli SMC caused inhibition of Ica,L- amplitude through cornu intracellular mechanisms independent from serine/threonine protein kinases activity. For the first ti evidences were obtained indicating that potential-activated inward current in SMC from rat vas deferens \ carried through both L-type Ca2+ channels and TTX-sensitive Na+ channels. It was determined that, contrast to L-type Ca2+ channels, basal activity of TTX-sensitive Na+ channels of SMC from rat vas deferi did not depend upon phosphorylation processes.

Key words: single smooth muscle cells, L-type Ca2+ channels, serine/threonine protein kinases, taenia о vas deferens, ПХ-sensitive Na+ channels.