Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803"

004616291

/Фу

Зорина Анна Алексеевна

Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Бупескосуяйз ер. РСС 6803

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ЛЕИ 2010

Москва-2010

004616291

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Лось Дмитрий Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кокшарова Ольга Алексеевна

доктор биологических наук Трофимова Марина Сергеевна

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «21» декабря 2010 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (499) 977-80-18, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан ноября 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Основными компонентами систем передачи сигналов в клетках эукариот являются серин-треониновые протеинкиназы (СТПК) (Hunter, 1995), тогда как для прокариот долгое время характерными считались исключительно двухкомпонентные системы. Благодаря проектам по определению нуклеотидных последовательностей целых геномов, гомологи СТПК эукариотического типа были обнаружены у множества бактерий (Kennelly, 2002; 2003). Так, в геноме Bacillus subtilis обнаружено 4 гена (Kunst et al., 1997), у Mycobacterium tuberculosis - 11 генов (Wehenkel et at., 2008; Molle and Kremer, 2010), а в геноме Myxococcus xanthus закодировано почти 100 генов протеинкиназ эукариотического типа (Nariya and Inoue, 2005). Изученные СТПК бактерий вовлечены в регуляцию работы ферментов первичного метаболизма, а также контролируют экспрессию некоторых генов.

Среди цианобактерий распространение данного типа ферментов неоднородно. Например, в геноме наиболее изучаемых цианобактерий Anabaena sp. РСС 7120 (Kaneko et al., 2001; Ohmori et al., 2001) и Synechocystis sp. PCC 6803 (Kaneko et al., 1996; 2003) обнаружено 52 и 12 генов СТПК соответственно (Leonard et al., 1998).

К настоящему времени функционально охарактеризованы лишь немногие СТПК. Показано, что гены spkA (Kamei et al., 2001; Panichkin et al., 2006) и spkB (Kamei et al., 2003) кодируют белки, принимающие участие в формировании пилей и контролирующие подвижность клеток Synechocystis. Протеинкиназа SpkC может участвовать в регуляции азотного метаболизма (Galkin et al., 2003), a SpkD по всей видимости вовлечена в регуляцию соотношения метаболитов цикла трикарбоновых кислот в зависимости от количества неорганического углерода в питательной среде (Laurent et al., 2008). Тем не менее, функции большинства СТПК цианобактерий остаются неизученными. Кроме того, сведения о потенциальных субстратах протеинкиназ в клетках этих организмов скудны и разрозненны.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Получить мутантные штаммы Synechocystis дефектные по генам серин-треониновых протеинкиназ и изучить фенотипические проявления мутаций в нормальных условиях и при высокотемпературном стрессе.

2. Изучить динамику транскрипции генов, индуцируемых высокими температурами, в клетках дикого типа и в полученных мутантных штаммах.

3. Изучить влияние высокотемпературного стресса на фосфорилирование in vitro белков, выделенных из клеток Synechocystis.

4. Провести поиск предполагаемого клеточного субстрата серин-треониновых протеинкиназ.

Научная повита. Впервые исследовано участие СТПК цианобактерии Synechocystis в ответе организма на тепловой стресс. Показано изменение экспрессии группы индуцируемых тепловым шоком генов у мутантов по СТПК. Идентифицировано 7 белков - потенциальных субстратов СТПК в клетках Synechocystis. Определены протеинкиназы, отвечающие за фосфорилирование низкомолекулярного белка теплового шока GroES, а также предложена схема взаимодействия исследованных ферментов с уже известными белками, принимающими участие в восприятии и передаче сигналов теплового стресса.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют глубже понять молекулярные механизмы, лежащие в основе стрессовых ответов фотосинтезирующих клеток, и могут быть использованы как для дальнейшего изучения роли СТПК в клетках прокариот, так и уточнения их положения в сигнальных каскадах. Наши работы о роли СТПК в ответах клеток на тепловой стресс вошли в ряд обзорных статей и монографий (Allakhverdiev et al., 2010; Los et al., 2010; Лось, 2010). Они могут быть использованы при чтении курсов лекций по микробиологии, молекулярной биологии, физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены на конференции молодых ученых ИФР РАН (Москва, 2009), на V молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), на Всероссийских научных конференциях «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010) и «Растение и стресс» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включает 15 рисунков, 3 таблицы. Список литературы включает 160 наименований.

Объекты и методы исследования

Штаммы цианобактерии, использованные в работе. Штамм цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 дикого типа GS получен из коллекции культур кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова (Grigorieva and Shestakov, 1982). Штаммы дефектные по генам протеинкиназ spkB-spkL и транскрипционному фактору hrcA полученны методом сайт-направленого мутагенеза с применением генов устойчивости к канамицину (Km), спектиномицину (Sp), хлорамфениколу (Cm) или грамицидину (Gm). Штамм мутантный по гистидинкиназе Hik34 (Suzuki et al., 2005) получен из штамма GT (Williams, 1988).

Конструирование мутаптпых штаммов Synechocystis дефектных по генам СТПК и hrcA. Последовательности индивидуальных генов протеинкиназ амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученные фрагменты ДНК клонировали в вектор pGEM®-T, pGEM®-T Easy (Promega), pT7Blue-T (Novagen), или pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985). В клонированные последовательности вставляли кассеты устойчивости к антибиотикам, транспозон EZ::TN™ <KAN-2> (Epicentre) или pGPS2.1 (NEB). Отбор трансформантов (Williams, 1988) производили на агаризованной среде BG11 с добавлением соответствующего антибиотика: AspkF, AspkH, AspkK - Sp (30 мкг/мл), AspkB, AspkD, AspkG - Km (25 мкг/мл), ДspkA, AspkC, Aspkl, AspkJ, AspkL - Cm (12,5 мкг/мл), AspkE - Gm (10 мкг/мл).

Для получения двойного мутанта по spkH и spkK использовали амплифицированный ген spkK, в который по сайту Neo I был вставлен картридж Km' из плазмиды pUC4KIXX (Pharmacia). Готовой конструкцией трансформировали штамм Synechocystis дефектный по гену spkll.

Для получения мутанта по hrcA соответствующий ген (sill 670) амплифицировали с праймерами 5'-TTGGACTGGAATTCTAAGATG и 5 '-TTAATTTTTGCTCAATGCTT CCG, клонировали в рТ7-В1ие и замещали часть гена (по сайту £со9П с затупленными концами) кассетой Km', полученной из pUC4K.

Молекулярное клонирование и рестрикционнын анализ проводили, используя ферменты фирмы Fermentas (Литва). Выделение плазмид, трансформацию £.. coli и лигирование фрагментов ДНК осуществляли по общепринятым методикам (Sambrook et al., 1989).

Условия культивирования. Интенсивные культуры выращивали в жидкой среде BG11, забуференной 20 мМ HEPES-NaOH (рН 7,5), при 32°С (контрольные условия), постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкЕ/м2/с и аэрации стерильной газо-воздушной смесью, содержащей 1,5-2,0% С02. Клетки выращивали до ОП75о= 0,8-1,0. Сосуды с клетками переносили в ванны с водой, нагретой до 44±1°С, на период от 30 мин до 4 сут. Интенсивность роста клеток определяли спектрофотометрически при 750 нм.

Для исследования ультраструктуры клеток методом электронной микроскопии аликвоты суспензии интенсивной культуры клеток дикого типа GS и мутантных штаммов AspkH и AspkK Synechocystis подвергали тепловому стрессу в течение одних и трех сут. Подготовку препаратов проводили согласно Маркеловой с соавт. (1990) и анализировали при помощи трансмиссионного микроскопа JEM JEOL Х-100 (Япония).

Выделение общей клеточной РНК и позерн-блоттинг проводили по ранее описанной методике (Kiseleva et al., 2000).

Выделение фракции растворимых белков проводили при 4°С. 100 мл интенсивных культур осаждали центрифугированием 10 мин при 5000 g, осадок промывали в 50 мМ Tris-Ci (рН 7,6) с 10 мМ MgCl2, а затем ресуспендировали в

буфере для гомогенизации (50 мМ Tris-Cl pH 7,6, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), 2 мМ ЭГТА, 2 мМ ЫазУ04, 10 мМ NaF, 1мМ бензамидин, 50 мМ ß-глицерофосфат и 250 мМ сахароза) и разрушали прессом Френча (French Pressure Cell Press, SLM, American Instruments Co) при 2,8 мПа. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 16000 g. Супернатант переводили в 20 мМ MES-KOH (pH 6,5) посредством гель-фильтрации на колонках NAP-5 (GE Healthcare). Содержание белка определяли с бицинхониновым реагентом (ВСА Protein Assay, Pierce).

Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным электрофорезом (2DE). Фосфорилирование белков in vitro проводили в реакционной смеси, содержавшей 20 мМ MES-KOH (pH 6,5), 10 мМ MgCl2, 10 мкМ АТФ, 10 мкКи [у-32Р]АТФ. Реакцию инициировали добавлением 20-50 мкг белка и проводили в течение 15 мин при 30°С. Фосфорилированные белки осаждали при -20°С 80%-ным ацетоном в присутствии 15% ТСА и 1% 2-меркаптоэтанола. Осадки, промытые 80%-ным ацетоном, растворяли в буфере, содержавшем 7,5 М мочевины, 2М тиомочевины, 1% Тритон Х-100, 4% CHAPS, 20 мМ ДТТ и 0,2% биолиты pH 3-10 (BioRad). В аналитических целях разделение белков при помощи 2DE осуществляли в цилиндрических гелях по O'Farrell (1975). Для идентификации фосфобелков MALDI-TOF MS продукты реакции фосфорилирования фракционировали в первом направлении на IPG Strips (длина 7 см, диапазон pH 4-7, Bio-Rad) согласно инструкции производителя. Во втором направлении проводили электрофорез по Laemmli (1970). Гели фиксировали в 50% метаноле с 3% фосфорной кислоты, окрашивали коллоидным Кумасси G-250, высушивали и экспонировали с пленкой Biomax MR (Kodak). Вырезанные из 20Е-гелей пятна, соответствующие фосфобелкам, идентифицировали MALDI-TOF MS в центре Постгеномных технологий Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Вестерн блоттниг. После 2DE разделения фосфопротеины переносили на нитроцеллюлозную мембрану (45 мкм, Hybond-C Extra) в Trans-Blot SD Electrophoretic Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad). После авторадиографии мембраны обрабатывали кроличьими антителами против смеси белков GroEL и СрпбО Synechococcus vulcanus (Tanaka et al., 1997). Для визуализации использовали антикроличьи антитела, меченые пероксидазой хрена.

Получение рекомбинаптного белка GroES. Фрагмент, несущий ген groES, амплифицировали из геномной ДНК при помощи ПЦР с праймерами F: 5'-CATATGGCCGCTATTTCC и R: 5'-CTCGAGGGCAACGGAGGC и клонировали в векторе экспрессии pET22b(+) (Novagen) по сайтам Nde I и Xho I. Рекомбинантный белок GroES, слитый с шестью остатками гистидина на С-конце, экспрессировали в штамме BL21(DE3 pLysS) Е. coli и очищали при помощи набора Ni2+-Sepharose Protino® Ni-IDA Kit (Macherey-Nagel) или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (FPLC) на Mono Q (GE Healthcare).

Фосфорилирование GroES in vitro. 5-10 мкг белка, выделенного из клеток дикого типа GS и 11 мутантов (AspkB-L), инкубировали с очищенным GroES (0.04 мг/ мл) в течение 15 мин при 30°С в конечном объеме 25 мкл буфера, содержавшего 20 мМ MES-KOH (рН 6,5), 10 мМ MgCl2, 10 нМ АТР и 74 КБк [у-32Р]АТФ. Продукты реакции разделяли в 18% денатурирующем ПААГ. Окрашенные Кумасси R-250 гели, высушивали и экспонировали с пленкой Biomax MR.

Результаты и их обсуждение

Создание коллекции мутантов по генам СТПК. Для исследования функциональной роли СТПК в условиях теплового стресса на основе неподвижного глюкозо-чувствительного штамма (GS) Synechocystis мы создали библиотеку мутантов дефектных по генам spkB - spkL. Ген spkA в использованном штамме изначально инактивирован вследствие сдвига рамки считывания, поэтому предварительно была нарушена последовательность этого гена в Пастеровском штамме, для которого характерно наличие неповрежденного гена spkA, и показана активность соответствующей протеинкиназы (Panichkin et al., 2006).

Инсерция кассеты устойчивости осуществлялась так, чтобы нарушить последовательность каталитического домена в СТПК и получить функционально неактивный фермент (Рис. 1А). Во всех мутантных штаммах была достигнута полная сегрегация хромосом (Рис. 1Б).

Скрининг коллекции мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации. Для идентификации СТПК - возможных компонентов пути передачи сигнала о тепловом стрессе провели скрининг всей коллекции мутантов (spkB-L) методом нозерн-блот гибридизации (Рис. 2). При гибридизации образцов РНК с зондами, представляющими собой последовательности генов hspA, slr0967, sl!0528, индуцируемых тепловым стрессом, мы обнаружили, что при тепловом шоке только у мутантов AspkH и AspkK наблюдалось ослабление экспрессии по сравнению с диким типом GS.

Эти данные свидетельствуют о влиянии СТПК на экспрессию этой группы генов теплового шока. Более того, при использовании в качестве зонда фрагмента гена sodB отличия в степени экспрессии по сравнению с GS наблюдались только у мутанта по протеинкиназе SpkK. В связи с этим в дальнейшем мы сосредоточились на изучении физиологических характеристик именно этих двух мутантных штаммов.

Изучение физиологических и морфологических характеристик. Для оценки влияния повышенных температур на скорости роста культур дикого типа GS и двух мутантных штаммов AspkH и AspkK Synechocystis измеряли оптическую плотность образцов, находившихся в контрольных и стрессовых условиях в течение 4 сут. Сравнение ростовых кривых, построенных по результатам серии экспериментов, показало, что при 32°С скорости роста мутантов не отличались, тогда как в условиях теплового шока скорость роста и жизнеспособность мутанта AspkK была выше, чем у

дикого типа и у Д¡ркН. Мутант Д$ркК выжил во всех экспериментах, снижение его скорости роста было менее быстрым.

(А)

aphA spkB::Km'

< pheT

<3

<-^cat spkC::Cm

siroeo

\>\ тв>о\»

а <2

aphA | spkDr.Km'

Л

<гп<оМ

si10777

<а аасС spkE::Gmr E>Ot>

aadA ^ | spkF::Spr

c>[

<a

<3

aphA^ | spkG::Kmr

Ot^EZ -,pkG>

'< 1

aadA | spkH::Sp

sl/0006

И

recG >

<H\

spkl::Cm

С muts

cat

О

ррпА

spkl

spkJ::Cm

cat ^ -j spkL::Kmr [ , D>

<sll009f<spkL 1 <Ш7 |

(Б) spkA spkB spkC spkD spkE spkF spkG spkH spkl spkj spkK spkL

Рис. 1. Конструирование библиотеки мутантов по генам СТПК. (А) Схема получения индивидуальных мутантов. (Б) Проверка степени сегрегации мутантных хромосом с помощью ПЦР. WT - клетки дикого типа; spkB-spkL (от В' до L") - мутанты по генам протеинкиназ. ДНК бактериофага X, обработанная Hind III, служила в качестве маркера размера фрагментов ДНК.

Для объяснения различий в выживаемости мутантов ДspkH и AspkK и дикого типа в условиях теплового шока изучали ультраструктуру клеток цианобактерий. На основании электронно-микроскопического исследования можно заключить, что в нормальных условиях клетки обоих мутантных штаммов не отличаются по ультраструктуре от клеток дикого типа. На снимках видны многочисленные тилакоиды, карбоксисомы, область ДНК, многослойная клеточная стенка.

Единственным отличием являлось наличие у мутанта Аф/сЯ включений с низкой электронной плотностью.

Через сутки теплового шока клетки дикого типа и АяркК накапливали значительные количества различных веществ низкой и высокой электронной плотности. У мутанта по гену ¡ркН запасных веществ меньше, клеточное содержимое начало отходить от оболочки, также нарушалось расположение тилакоидов. На третьи сутки стресса количество тилакоидов сократилось у всех исследованных образцов, но у дикого типа и Д¡ркК они сохранили более упорядоченное расположение. Кроме этого, исчезли электронноплотные включения липидной природы и появились многочисленные гранулы гликогена. Фотосинтетический аппарат у мутанта ДяркК выглядел менее поврежденным. В клетках же ДзркН, наоборот, процессы деградации усилились.

Проведенное изучение ультраструктуры клеток дикого типа ЗупесИосуяНз и двух мутантных штаммов дает возможность предположить, что повышенная жизнеспособность мутанта кзркК в условиях стресса связана с наблюдаемыми различиями в накоплении включений на начальных стадиях теплового шока.

Анализ динамики экспрессии генов, индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации. Для изучения

ЬврА

3110528

\Л/Т АвркВ АзркС ЛБркй АзркЕ АзркР \Л/Т АзркВ АэркС Агркй АзркЕ АзркР

32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44

Щ! цр 5Ш

пшп

\Л/Т Азркв АэркН Аэрк! Азрк1. АэркК Ш Азркв АзркН Азрк! АзрЫЛзркК

32 44 32 44 за 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44_ 32 44 32 44 32 44 32 44

гос/В

■ам

з!г0967

ИТ АзркВ АзркС АзркО АзркЕ Азрк1= \Л/Т АзркВ АзркС АзркО АзркЕ ^ркР

32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44

тт

ШТ Азркв АэркН Азрк! ¿ирМ. АвркК

32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44

\ЛГГ Азркв АзркН Азрк! ¿крМ. АвркК

32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44

'ТТТТТГГ

Рис. 2. Результаты скрининга коллекции мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации. В качестве зондов использованы ПЦР-продукты генов, индуцируемых тепловым стрессом (ИзрА, ло^В, $1г0967, 5110528). Электрофореграмма рРНК (окраска бромистым этидием) приведена для подтверждения равномерности нанесения образцов общей клеточной РНК. \¥Т - дикий тип, ДяркВ - ЬяркЬ - мутанты по генам СТПК.

участия протеинкиназ ЭркН и ЭркК в регуляции ответа на тепловой стресс исследовали динамику экспрессии группы стресс-активируемых генов у дикого типа вЭ и у двух мутантов АяркН и АурЖ, отобранных по результатам первичного скрининга. В качестве зондов для гибридизации использовали фрагменты генов теплового шока /крЛ, Ырй, sigB, с1рВ1, ¡ос1В, ¿юЕИ, groES. Исследование выявило отличие кинетики экспрессии у АяркК по сравнению с диким типом и АяркН, а именно: наблюдалось запаздывание во времени максимума экспрессии активируемых повышенной температурой генов (Рис. 3).

Так как у мутанта по гену ¡ркК удлиняется время экспрессии генов, индуцируемых тепловым шоком, следовательно, можно предположить, что протеинкиназа ЭркК регулирует продолжительность транскрипции стрессовых генов и, вероятно, в этом выражается ее участие в ответе цианобактерии ЗупескосузИя на тепловой шок.

Исследование динамики экспрессии стресс-индуцнруемых генов у двойного мутанта АяркН/АяркК. Показанное ранее ослабленние индукции экспрессии ряда генов теплового шока у обоих мутантов по СТПК БркК и ЗркН может свидетельствовать о непосредственном взаимодействии этих протеинкиназ в процессе передачи стрессового сигнала. Для проверки этого предположения мы сконструировали рекомбинантный штамм БупесИосузЧз дефектный по генам зркК (я1г1919) и хркН (5110005). Исследование транскрипции индуцируемых тепловым стрессом генов у мутанта ЬяркН/АяркК показало сходство динамики накопления транскриптов с1рВ и sigB у двойного мутанта и дикого типа (Рис. 3). Однако при этом у двойного мутанта наблюдалась пониженная интенсивность сигнала. Профиль

WT A spkH AspkK AspkHIK

WT AspkH AspkK AspkHIK

groEL2

2 3 4 5 6

..itili Ш" I!."1!! УШ ™"

hspA

groES

■ннм

тгтттш

, «Hi*-2 3 4 5 6 7

s^ft^f ^¡^ t " , sodB

clpB1

я» ЩШгШ<т> -

sigB

1 2 3 4 5 6 7

«to ~

2 3 4 5 6 7

ЙЙЙЙ ЛЙЙЙ jffi&ft Ws&M ftffffffl

_ Mr---—

hlpG

Рис. 3. Нозерн-блот анализ динамики экспрессии генов, индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов по генам AspkH, AspkK и двойного мутанта AspkH/AspkK. Продолжительность теплового стресса: 1 - 0; 2 - 15; 3 - 30; 4 - 60; 5 - 90; 6 - 120; 7-180 мин. Электрофореграмма РНК приведена для подтверждения равномерности нанесения образцов.

экспрессии генов groEL2, groES у двойного мутанта по динамике схож с профилем у мутанта AspkH. Динамика экспрессии генов hspA и htpG сходна: индукция наблюдалась через 15 мин, максимум - через 1 ч после начала температурного воздействия, затем сигнал ослаблялся.

Возможным объяснением наличия сигнала у двойного мутанта в профилях всех исследованных генов и во всех временных точках может быть то, что исследуемые протеинкиназы находятся не в начале сигнального пути.

Фосфорилнрование фракции растворимых белков Synechocystis по сернну н треонину в ответ на высокотемпературное воздействие. Для определения функциональной активности СТПК, мы изучили влияние тепловой обработки на фосфорилирование in vitro растворимых белков, выделенных из контрольных и подвергнутых 30-мин тепловому стрессу клеток. Кратковременная обработка клеток не влияла на состав растворимых белков (Рис. 4 А, Б). Тем не менее, очевидно изменение степени фосфорилирования индивидуальных полипептидов (Рис. 4 В, Г).

4.0 рI 7.0 4.0 рI 7.0

кДа ----* -

160- . с 100- - г А ь

75- 1 ;

50- * •

37— %

25- - . " ..r'iLj ■ '

15-

. *

кДа

150~ R с

100— 6 в 6

50-

37252015-

."*3а/3б "За/Зб

Ч4 • М

* % *

GS 32°С GS 44°С

Рис. 4. Результаты 2DE разделения фракции растворимых белков Synechocystis из клеток дикого типа GS, выращенных при 32°С (А) и после теплового стресса при 44°С в течение 30 мин (Б). А, Б - гели, окрашенные Кумасси G-250; В, Г - соответствующие радиоавтографы.

Так, уровень фосфорилирования белков # 1 и # 2 более чем в два раза возрастал после тепловой обработки. Сигнал фосфорилирования белков # За/Зб снижался в 1,5

раза, а для белка # 4 существенного изменения не обнаружено. Самый высокий уровень конститутивного фосфорилирования проявлял полипептид # 5. В этом случае интенсивность сигнала снижалась в результате обработки. Таким образом, при повышении температуры существенно изменялась интенсивность серин-треонинового фосфорилирования белков. Особенно важно, что обнаруженное изменение степени фосфорилирования индивидуальных полипептидов является результатом функционирования исключительно серин-треониновых, а не гистидиновых протеинкиназ, поскольку гистидиновый тип фосфорилирования невозможно увидеть при использованных нами условиях обработки ПАА-гелей, осаждении продуктов реакции фосфорилирования in vitro в кислой среде, фиксация 20Е-гелей после разделения белков во втором направлении при рН 1.

Наблюдаемые изменения могли быть результатом автофосфорилирования протеинкиназ или свидетельствовать о температурозависимом изменении активности этих ферментов по отношению к субстратам. Для выявления потенциальных субстратов СТПК мы попытались идентифицировать фосфорилированные белки.

Идентификация фосфорилированных белков с помощью MALDI-TOF MS. Для проведения MALDI-TOF MS анализа мы отобрали по 7 белков, которые обнаруживались как в контрольных, так и в подвергнутых стрессу образцах. Эти белки хорошо и с высокой воспроизводимостью разделялись при 2DE, а их количество было достаточно для идентификации. Фосфопротеины, наблюдаемые при 32°С (Рис. 4 В), были идентичны тем, что наблюдались при 44°С (Рис. 4 Г). Это свидетельствует о непосредственном влиянии повышенной температуры на изменения серин-треонинового фосфорилирования.

Идентифицированные фосфопротеины относятся к нескольким функциональным группам: (1) ферменты основного метаболизма (# 1 - метионил-тРНК-синтетаза, # 2 -большая субъединица RuBisCo, # За - 6-фосфоглюконат дегидрогеназа, # 36 - фактор элонгации Tu (TufA) и # 6 - тРНК 82-изопентенил пирофосфат трансфераза); (2) белки общего ответа на стресс (# 4 - белок теплового шока GrpE, # 5 - ко-шаперонин GroES), а также (3) белки с неизвестной функцией (# 7).

О фосфорилировании некоторых белков по серину и треонину, попавших в первую группу, сообщалось ранее (Eymann et al., 2007; Macek et at., 2008). Вполне закономерным является обнаружение среди фосфопротеинов второй группы двух белков теплового шока (# 4 и # 5), которые в контрольных образцах Synechocystis метились in vitro едва ли не наиболее сильно (Рис. 4). Однако после тепловой обработки степень фосфорилирования GrpE (# 4) практически не изменилась, тогда как GroES (# 5) - снизилась. Обнаруженные изменения можно объяснить активацией при стрессе, протеинфосфатаз, различной скоростью синтеза этих белков после действия стресса, либо изменением при тепловой обработке конститутивной активности протеинкиназ.

В качестве предполагаемого субстрата СТПК для дальнейших исследований был выбран 10-кДа шаперонин GroES. Идентификация этого белка удовлетворяла самым жестким критериям: по величине молекулярной массы, значению р/, также во всех MS-анализах белок с # 5 расщеплялся на восемь пептидов, которые покрывали 83% аминокислотной последовательности GroES Synechocystis.

GroES является субстратом фосфорнлнровання in vitro для нротеинкниаз SpkC/F/K. Для того чтобы проверить, может ли GroES быть потенциальным субстратом СТПК, а также установить, какая именно протеинкиназа модифицирует этот белок, при проведении реакции in vitro использовали очищенный до электрофоретической гомогенности рекомбшгантный GroES. По характеру фосфорилирования рекомбинантного белка все мутанты можно объединить следующим образом.

WT AspkB AspkC AspkD AspkE AspkF AspkG AspkH Aspkl AspkJ AspkK AspkL 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 32 44 °C

,A) — - <—GroES

(Б) - • , - -

Рис. S. Фосфорилирование in vitro рекомбинантного GroES протеинклназами из фракции растворимых белков Synechocystis sp. РСС 6803 из клеток дикого типа GS и мутантов по генам СТПК (spkB - spkL), выращенных в нормальных условиях и подвергнутых обработке при 44'С. (А) - авторадиограммы, (Б) - гели, окрашенные Кумасси R-250.

В диком типе GS и у мутанта AspkG уровень фосфорилирования GroES был низким при 32°С, а при 44°С-обработке наблюдалось существенное усиление сигнала (Рис. 5 А).

У мутантов по протеинкиназам SpkB и SpkL при 32°С наблюдалось высокое конститутивное фосфорилирование GroES, тепловой стресс вызывал значительное снижение уровня фосфорилирования.

Мутанты AspkD, AspkE, AspkH, Aspkl и AspkJ при 32°C фосфорилировали субстрат менее интенсивно, чем дикий тип GS и AspkG, а обработка повышенной температурой приводила к еще более сильному снижению фосфорилирования субстрата.

Наиболее интересными из всех оказались мутанты по генам spkC, spkF и spkK, так как в их белковых препаратах уровень фосфорилирования GroES оказался крайне низким при 32°С, а после 30-мин экспозиции при 44°С фосфорилирование GroES in vitro обнаружено не было (Рис.5 А).

Эти факты позволяют заключить, что, во-первых, у Synechocystis sp. РСС 6803 GroES может быть мишенью СТПК. Во-вторых, за фосфорилирование этого субстрата могут отвечать протеинкиназы SpkC, SpkF и/или SpkK.

Сернн-треонпновое фосфорилирование растворимых белков в клетках мутантов ДhrcA и Дhik34: возможное взаимодействие СТПК с гнстидпнкнназой IIik34 и/плн транскрипционным фактором НгсА. Кроме идентификации протеинкиназ, отвечающих за фосфорилирование GroES, весьма интересной задачей представлялось установление характера взаимодействия этих ферментов с уже известными сигнальными системами в клетках Synechocystis sp. РСС 6803.

Показано, что экспрессия ряда генов, кодирующих белки теплового шока, находится под негативным контролем гистидинкиназы Hik34 (Suzuki et at., 2005), a некоторые гены из этой группы (GroESL оперон) также под негативным контролем фактора транскрипции HrcA (S111670) (Nakamoto et al., 2003). Можно предположить, что в клетках Synechocystis sp. РСС 6803 СТПК могут вовлекаться в пути передачи высокотемпературного сигнала. В таком случае по сравнению с диким типом у обоих мутантов в белковых препаратах, полученных из контрольных образцов, серин-треониновое фосфорилирование должно достигать максимального уровня, что согласовывалось бы с представлениями о НгсА и Hik34 как о негативных регуляторах пути передачи высокотемпературного сигнала.

Действительно, при нормальных условиях выращивания общее серин-треониновое фосфорилирование у мутанта ДНгсА было выше, чем в клетках дикого типа GS (Рис. 4 и 6). Наиболее высоко фосфорилированными оказались фосфопептиды с # 1, 2, 4, 6 и 7, а уровень фосфорилирования пептидов # 1, 2 и 6 был даже выше, чем в диком типе GS после тепловой обработки. Если же клетки мутанта подвергались стрессу, то фосфорилирование этих полипептидов усиливалось еще, по крайней мере, в два раза по сравнению с собственным необработанным контролем. Тогда как после обработки степень фосфорилирования полипептида # 4 снижалась, а для фосфопептида # 7 значимых изменений уровня фосфорилирования не обнаружено, то есть его реакция на повышение температуры оказалась сходной с GS.

Все это подтверждает, что НгсА является негативным регулятором, и позволяет предположить, что большинство генов, кодирующих белки, фосфорилируемые по серину и/или треонину, вероятно, находятся под контролем транскрипционного фактора НгсА.

Наиболее существенное отличие мутанта дефектного по НгсА от дикого типа GS заключалось в том, что у мутанта фосфорилированным оказался полипептид, который по молекулярной массе, значению р/, а также по реакции с антителами (Рис. 6 В, Г) был определен как 60-кДа шаперонин GroEL. Важно, что этот полипептид обнаруживался только на авторадиограммах белков, выделенных из контрольных образцов ДНгсА, но не из подвергнутых стрессу. Вместе с тем, этот белок присутствовал во фракциях, полученных как из контрольных, так и из обработанных клеток, что видно по их реакции с антителами против GroEL. Фосфорилирование в условиях in vitro позволяет обнаруживать только de novo включение радиоактивной метки в полипептид, но не дает представление об уже существующем статусе

фосфорилирования белков в момент проведения реакции. В клетках мутанта AhrcA должна наблюдаться конститутивная экспрессия GroEL и при 32°С, и при 44°С. Вероятно, этот белок активно фосфорилируется уже при 32°С, поэтому экспозиция клеток при 44°С в течение 30 мин не приводит к увеличению включения метки.

кДа 4.0 р/ 7.0 4.0 р/ 7.0

150 _

100- А А #6 Б

75- -„». *'

50-

37-

25__

20

15 10 -.

150 _ 100 — _, 75-,В 50 — 37-

■е За/Зб

К.

GrdES _ GroES

0

GroEL

25 _ 20 _

15_

10 —

AhrcA 32°C AhrcA 44°C

Рис. 6. Фосфорилирование in vitro фракции растворимых белков Synechocystis sp. РСС 6803 из клеток мутанта НгсА, выращенных при 32°С (А) и подвергнутых тепловому стрессу при температуре 44°С в течение 30 мин (Б), (В) и (Г) - соответствующие мембраны, обработанные антителами против Hsp60 (GroEL). Позиции, обозначенные пунктирной линией, указывают на местоположение GroEL.

Если модификация GroEL при стрессе протекает в течение нескольких минут, то можно допустить, что дополнительная инкубация (30-60 мин) при 44°С не оказывает влияния на фосфорилирование белка.

Шаперонин GroEL предотвращает неправильное сворачивание белковых молекул и способствует надлежащей укладке полипептидов, образующихся в большом количестве, например, при тепловом стрессе. У Е. coli температурный стресс приводит к обратимому фосфорилированию GroEL (Sherman and Goldberg, 1992; 1994), что является необходимым условием для формирования активной формы

GroESL комплекса. Однако у мутанта Synechocystis по НгсА шаперонин GroEL образуется и, по всей видимости, фосфорилируется конститутивно.

Фосфорилирование GroES (фосфопептид # 5) у hhrcA ниже, чем в диком типе при 32°С. После высокотемпературной обработки в течение 30 мин степень фосфорилирования указанного фосфопептида сравнима с таковой в клетках дикого типа GS после экспозиции при 44°С (Рис. 4 и б). Таким образом, вполне вероятно, что фосфорилирование GroES также протекает конститутивно при нормальных условиях, а снижение степени фосфорилирования при 44°С отражает снижение активности соответствующих СТПК.

Гистидиновая протеинкиназа Hik34 (Slrl285), как и НгсА, является негативным регулятором экспрессии генов теплового шока. Нарушение последовательности гена hik34 приводит к конститутивной экспрессии при нормальной температуре группы генов (groESL, htpG, hspA, dnaK2 и slrl634), индуцируемых у дикого типа при стрессе, это позволяет мутантным клеткам выживать после экспозиции при 48°С в течение 3 ч (Suzuki et al., 2005). Инактивация hrcA влияет на экспрессию только оперона groESL и гена српбО (Singh et al., 2006). Ранее высказывались предположения о существовании возможного взаимодействия между НгсА и Hik34 (Singh etal., 2006), однако экспериментально это не подтверждено.

Мы исследовали профили фосфорилирования белков клеток дикого типа GT и мутанта по Hik34. Важно, что в отличие от всех других мутантов родительским штаммом AHik34 является глюкозо-толерантный штамм GT Synechocystis (Ikeuchi and Tabata, 2001). У GT и GS профили фосфорилирования сходны, хотя и отличаются по уровню фосфорилирования индивидуальных белков.

Тепловой стресс приводил к изменениям в профиле фосфорилирования в клетках Дhik34, которые отличались от изменений, наблюдаемых в клетках дикого типа GS (Рис. 7). Например, не наблюдалось влияния повышенной температуры на фосфорилирование фосфопептидов # 1 и # За/Зб. Хотя фосфорилирование фосфопептидов # 2 и # 6 повышалось, но в меньшей степени, чем у дикого типа GS. У ДШк34 конститутивное фосфорилирование полипептида # 7 оказалось ниже, чем в диком типе GS, однако после температурной обработки был обнаружен рост уровня его фосфорилирования.

В клетках Дhik34, выращенных нормальных условиях, фосфорилирование фосфопептида # 5 (GroES) было ниже, чем в диком типе GS, но выше, чем у ДНгсА. Тепловой стресс в течение 30 мин приводил к уменьшению степени фосфорилирования фосфопептида # 5, хотя и в меньшей степени, чем у обоих штаммов: дикого типа GS и ДНгсА.

Белок GroEL образуется в равных количествах в клетках Ahilc34 и при 32°С, и при 44°С, что подтверждается результатами вестерн-блоттинга (Рис. 7 Д, Е). Однако его фосфорилирования in vitro мы не обнаружили. Возможно, GroEL может быстро и интенсивно фосфорилироваться уже при 32°С. При изучении протеома Synechocystis идентифицировали 5 пятен, соответствовавших GroEL 1, и 3 пятна, соответствовавших GroEL2 (СрпбО) (Slabas et al., 2006). Антитела, использованные в нашей работе, получены против смеси белков GroELl и GroEL2, что, по всей видимости, привело к узнаванию обеих форм шаперонина. Неоспоримым является

7.0 -►

кДа 4.0 р| 7.0 4.0 р| --

СЛ SOOl О СЛ о о 1 III _ А Б * * н ■

37 -

25- »

2015- Ш' • *«>«► :

150 -100 -75 - 50 ~ В 6 ---i/* к 2 * За/Зб -г Г . — • V»

37 ~ ^ 4

25 _ к7

20 -15 - 5 ©С GroES • QfGroe

150 _ 100 ~ 75 - д GroEL [ тш ) ■ Е GroEL

50 ~ i

37 ~~ t,{

25 ■ 20 '

Ahik34 32°С \hik34 44°С

Рнс. 7. Фосфорилирование in vitro фракции растворимых белков Synechocystis sp. РСС6803 из клеток мутанта AHik34, выращенных при 32°С (А) и подвергнутых тепловому стрессу при 44°С в течение 30 мин (Б). В, Г - соответствующие радиоавтографы; Д, Е -соответствующие мембраны, обработанные антителами против Hsp60 (GroEL). Позиции, обозначенные пунктирной линией, указывают на местоположение GroEL.

факт конститутивной экспрессии GroEL в Дhik34 и в ДhrcA, однако относительно его температурозависимого фосфорилирования остаются серьезные сомнения. Сравнение спектров фосфорилирования GroEL в мутантах Дhik34 и в ДhrcA также приводит к предположению, что фосфорилирование GroEL каким-то образом зависит от активности HrcA, но не от активности Hik34. Результаты исследования фосфопротеома Е. coli также не подтверждают наличие фосфорилированной формы GroEL при нормальной для роста температуре (Macek et al., 2008), несмотря на то, что в данной работе проводилось обогащение фракции фосфорилированных белков. Однако присутствие модифицированной подобным образом формы GroES в клетках Е. coli не вызывает сомнения. Поскольку GroES и GroEL кодируются одним опероном как у Е. coli, так и у Synechocystis, то вполне можно ожидать их совместной транскрипции, трансляции и, в конечном итоге, соотношения в клетке 1:1. Различия, наблюдаемые в серин-треониновом фосфорилировании GroES и GroEL, наводят на мысль, что СТПК имеют различное сродство к GroES и GroEL, или эти белки фосфорилируются различными протеинкиназами. В любом случае очевидно, что экспрессия groESL оперона регулируется HrcA и Hik34, однако регуляция фосфорилирования GroEL и GroES осуществляется по-разному с возможным участием HrcA, но не Hik34.

Заключение

Скрининг библиотеки мутантов Synechocystis дефектных по генам СТПК показал, что транскрипция генов, кодирующих белки теплового шока, у штаммов AspkH и AspkK существенно отличается от дикого типа. Различия касаются, в основном, динамики накопления транскриптов, что свидетельствует об участии этих протеинкиназ в регуляции экспрессии генов белков теплового шока. Изучение влияния теплового стресса на транскрипцию генов у двойного мутанта AspkH/AspkK свидетельствуют о наличии каких-то дополнительных участников в пути регуляции ответов клеток на тепловой стресс.

СТПК фосфорилируют несколько белков в оптимальных условиях роста. Тепловой стресс вызывает изменения в интенсивности фосфорилирования этих белков. Низкомолекулярный ко-шаперонин GroES подвергается модификации тремя серин-треониновыми протеинкиназами: SpkC, SpkF и SpkK. Фосфорилирование по остаткам серина и треонина в клетках Synechocystis протекает интенсивно и конститутивно при нормальной температуре роста, хотя эксперименты in vitro с рекомбинантным GroES свидетельствует о возможности активации СТПК при тепловом стрессе.

В клетках дикого типа гистидинкиназа H¡k34 и фактор транскрипции HrcA репрессируют экспрессию оперона groESL при оптимальной температуре роста. Тем не менее, экспериментально подтверждено присутствие и GroES, и GroEL в

экстрактах белков из клеток, выращенных при 32°С. Это указывает на то, что П1к34 и/или НгсА репрессируют транскрипцию не полностью.

Мы предполагаем, что фосфорилироваиие по остаткам серина и треонина, по крайней мере, в случае ОгоЕЗ и ОгоЕЬ, осуществляется конститутивно и зависит только от количества доступного субстрата. Тепловой стресс вызывает индукцию экспрессии оперона groESL, накопление в клетке ОгоЕЬ и ОгоЕЭ и обеспечивает достаточные количества субстрата для СТПК, которые фосфорилируют эти шаперонины, что, согласно принятой в настоящее время схеме, облегчает их олигомеризацию.

Мутации в генах Мк34 и ИгсА выражаются в конститутивной экспрессии ¿гоЕЙ оперона. Указанные белки накапливаются в значительных количествах и подвергаются модификации СТПК. Полученные нами данные о существовании фосфорилированной формы ОгоЕЭ дают основания предполагать, что серин-треониновое фосфорилироваиие этого ко-шаперонина может быть чрезвычайно важным для формирования функционального олигомерного ОгоЕБЬ комплекса.

Выводы:

1. Мутант АчркК по сравнению с диким типом и ДурШ характеризуется повышенной жизнеспособностью в условиях теплового шока

2. Показаны различия в ультраструктуре клеток дикого типа и мутантных штаммов ДхркН и АхркК, свидетельствующие о связи повышенной жизнеспособности мутанта АяркК в условиях стресса с особенностями накопления включений на начальных стадиях теплового шока.

3. У мутантов по серин-треониновым протеинкиназам ЭркК и 8ркН экспрессия генов, индуцируемых тепловым стрессом, снижается.

4. Мутант ЬяркК отличается от дикого типа и ДфШ по кинетике экспрессии генов, активируемых повышенной температурой, в то время как у двойного мутанта АяркН/ДхркКъчт. отличий не обнаружено.

5. Отличий в наборе фосфорилируемых белков у дикого типа и мутантов в оптимальных условиях роста не выявлено, тогда как уровни фосфорилирования индивидуальных полипептидов различались.

6. Идентифицированы белки, подвергающиеся модификации по остаткам серина и/или треонина в условиях теплового стресса.

7. Показано участие серин-треониновых протеинкиназ БркС, БркИ и БркК в фосфорилировании рекомбинантного белка ко-шаперонина ОгоЕБ.

8. Предложена возможная схема участия серин-треониновых протеинкиназ в формировании функционального комплекса ОгоЕЭЬ.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Зорина A.A.. Синетова М.П., Лось Д.А. (2009) Участие серин-треониновой протеинкиназы SpkK в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Бюллетень МОИП. Отдел биологический. 114: 129-130.

2. Prakash J.S.S., Sinetova M., Kupriyanova E., Zorina A.. Suzuki I., Murata N., Los D.A. (2009) DNA supercoiling regulates the stress-inducible expression of genes in the cyanobacterium Synechocystis. Molecular BioSystems 5: 1904-1912.

3. Los D.A., Zorina A.. Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V. (2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors 10: 2386-2415.

4. Zorina A.. Stepanchenko N., Sinetova M., Panichkin V.B., Novikova G.V., Moshkov I.E., Zinchenko V.V., Shestakov S.V., Suzuki I, Murata N„ Los D.A. (2010) Eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases SpkC/F/K are involved in phosphorylation of GroES in the cyanobacterium Synechocystis. Submitted for DNA Research.

5. Зорина A.A.. Синетова М.П. (2008) Роль серин-треониновой протеинкиназы SpkK в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, с. 162.

б- Зорина A.A.. Синетова М.П., Лось Д.А. (2009) Роль серин-треониновых протеинкиназ SpkH и SpkK в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Материалы Всероссийской научной конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», 24-28 августа 2009 г. Иркутск: НЦРВХ ВСНЦСО РАМН, с. 178-181.

7. Зорина A.A.. Синетова М.П., Лось Д.А. (2009) Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Актуальные аспекты современной микробиологии: V молодежная школа-конференция. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 26-27 октября 2009 г.: Тезисы. М.: МАКС Пресс, с. 25-26.

8. Синетова М.П., Миронов К.С., Зорина A.A.. Зинченко В.В., Лось Д.А. (2010) Функциональная геномика цианобактерии: мутагенез регуляторных компонентов, вовлеченных в стрессовые ответы. Тезисы трудов Ш-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности». Москва, 18-21 октября 2010 г. с. 74.

9. Зорина A.A.. Степанченко Н.С., Синетова М.А., Паничкин В.В., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Зинченко В.В., Шестаков C.B., Лось Д.А. (2010) Участие серин-треониновых протеинкиназ в фосфорилировании шаперонина GroES при тепловом стрессе у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва 9-12 ноября 2010 г. с.160-161.

10. Лось Д.А., Зорина A.A.. Синетова М.П., Миронов К.С. (2010) Сенсорные системы цианобактерий. Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс». Москва 9-12 ноября 2010 г. с. 221.

Подписано в печать: 17.11.2010

Заказ № 4560 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зорина, Анна Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Цианобактерии как модельный объект.

Серин-треониновые протеинкиназы цианобактерий.

Структура серин-треониновых протеинкиназ.

Классификация СТПК цианобактерий.

Расположение СТПК в сигнальном каскаде.

Регуляция активности протеинкиназ.

Исследование функций СТПК.

Современные методы исследования протеома.

Системы восприятия и передачи высокотемпературного стрессового сигнала.

Ответ на тепловой стресс.

Шаперонные системы Synechocystis.

Роль фосфорилирования в регуляции активности шаперонных систем.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы, использованные в работе, и условия культивирования.

2.2. Конструирование мутантных штаммов Synechocystis дефектных по генам СТПК и hrcA.

2.3. Штаммы Е. coli, использованпые в работе.

2.4. Трансформация клеток цианобактерий.

2.5. Условия культивирования.

2.6. Измерение параметров роста.

2.7. Исследование ультраструктуры клеток Synechocystis методом электронной микроскопии.

2.8. Выделение общей клеточной РНК.

2.9. Нозерн-блот гибридизация.

2.10. Выделение фракции растворимых белков.

2.11. Фосфорилирование белков in vitro и разделение меченых белков двумерным электрофорезом (2-DE).

2.12. Вестерн блоттинг.

2.13. Получение рекомбинантного белка GroES.

2.14. Фосфорилирование GroES in vitro.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание коллекции мутантов по генам СТПК.

3.2. Скрининг коллекции мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации.

3.3. Изучение параметров роста и морфологических характеристик мутантов AspkH и AspkK, отобранных по результатам первичного скрининга.

3.4. Анализ динамики экспрессии генов, индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов по генам СТПК методом нозерн-блот гибридизации.

3.5. Исследование динамики экспрессии стресс-индуцируемых генов у двойного мутанта AspkH IAspkK.

3.6. Фосфорилирование фракции растворимых белков Synechocystis по серину и треонину в ответ на высокотемпературное воздействие.

3.7. Идентификация фосфорилированных белков при помощи MALDI-TOFMS

3.8. Получение рекомбинантного белка GroES.

3.9. Белок GroES - субстрат фосфорилирования in vitro для протеинкиназ SpkC/F/K.

3.10. Серин-треониновое фосфорилирование растворимых белков в клетках мутантов ДhrcA и Ahik34: возможное взаимодействие серин-треониновых протеинкиназ с транскрипционным фактором НгсА и/или с гистидинкиназой Hik34.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. PСС 6803"

Каждый организм в течение жизни подвергается воздействию огромного количества факторов. «Успешность» его приспособления к изменяющимся условиям окружающей среды зависит от слаженности работы систем восприятия и передачи сигналов, от перестройки внутриклеточных процессов, от эффективности работы шаперонных систем и протеаз.

Ключевым регуляторным механизмом при передаче сигналов, как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, является фосфорилирование белков. Этот процесс катализируется ферментами - протеинкиназами, которые подразделяются на несколько групп в зависимости от их субстратной специфичности: гистидиновые, серин-треониновые и тирозиновые протеинкиназы.

В клетках эукариот основными компонентами систем передачи сигналов являются серин-треониновые протеинкиназы (СТПК), тогда как для прокариот долгое время характерными считались исключительно двухкомпонентные системы восприятия и передачи сигналов, состоящие из сенсорных гистидинкинз и соответствующих им регуляторов ответа.

В настоящее время благодаря проектам по определению нуклеотидных последовательностей целых геномов, гомологи СТПК эукариотического типа были обнаружены у множества бактерий (Kennelly, 2002; 2003). Так, в геноме Bacillus subtilis обнаружено 4 гена (Kunst et al., 1997), у Mycobacterium tuberculosis - 11 генов (Molle & Kremer, 2010), а в геноме Myxococcus xanthus закодировано почти 100 генов протеинкиназ эукариотического типа (Nariya & Inoue, 2005). Изученные СТПК бактерий вовлечены в регуляцию работы ферментов первичного метаболизма, а также контролируют экспрессию некоторых генов.

Среди цианобактерий распространение данного типа ферментов неоднородно. Например, в геноме Anabaena sp. РСС 7120 (Kaneko et al., 2001; Ohmori et al., 2001) и Synechocystis sp. PCC 6803 (Kaneko et al., 1996; 2003) обнаружено, соответственно, 52 и 12 генов, кодирующих СТГПС (Leonard et al., 1998).

К настоящему времени функционально охарактеризованы лишь немногие СТПК. Показано, что гены spkA (Kamei et al., 2001; Panichkin et al., 2006) и spkB (Kamei et al., 2003) кодируют белки, принимающие участие в формировании пилей и контролирующие подвижность клеток Synechocystis. Протеинкиназа SpkC может участвовать в регуляции азотного метаболизма (Галкин с соавт., 2003), a SpkD, по всей видимости, вовлечена в регуляцию соотношения метаболитов цикла трикарбоновых кислот в зависимости от количества неорганического углерода в питательной среде (Laurent et al., 2008). Тем не менее, функции большинства СТПК цианобакггерий остаются неизученными. Кроме того, сведения о потенциальных субстратах протеинкиназ в клетках этих организмов скудны и разрозненны.

В связи с этим исследование участия протеинкиназ эукариотического типа в ответе на тепловой стресс представляет значительный научный интерес.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящей работы было изучение роли серин-треониновых протеинкиназ в регуляции ответа на тепловой стресс цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Получить мутантные штаммы Synechocystis дефектные по генам СТПК и изучить фенотипические проявления мутаций в нормальных условиях и при высокотемпературном стрессе.

2. Изучить динамику транскрипции генов, индуцируемых высокими температурами, в клетках дикого типа и в полученных мутантных штаммах.

3. Изучить влияние высокотемпературного стресса на фосфорилирование in vitro белков, выделенных из клеток Synechocystis.

4. Провести поиск предполагаемых клеточных субстратов СТПК.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Зорина, Анна Алексеевна

выводы

1. Мутант /\spkK по сравнению с диким типом и АяркН характеризуется повышенной жизнеспособностью в условиях теплового шока.

2. Показаны различия в ультраструктуре клеток дикого типа и мутантных штаммов ЬдркН и АзркК, свидетельствующие о связи повышенной жизнеспособности мутанта АчркК в условиях стресса с особенностями накопления включений на начальных стадиях теплового шока.

3. У мутантов по серин-треониновым протеинкиназам БркК и БркН экспрессия генов, индуцируемых тепловым стрессом, снижается.

4. Мутант АъркК отличается от дикого типа и АъркН по кинетике экспрессии генов, активируемых повышенной температурой, в то время как у двойного мутанта АчркН/АчркК этих отличий не обнаружено.

5. Отличий в наборе фосфорилируемых белков у дикого типа и мутантов в оптимальных условиях роста не выявлено, тогда как уровни фосфорилирования индивидуальных полипептидов различались.

6. Идентифицированы белки, подвергающиеся модификации по остаткам серина и/или треонина в условиях теплового стресса.

7. Показано участие серин-треониновых протеинкиназ БркС, 8ркР и 8ркК в фосфорилировании рекомбинантного белка ко-шаперонина ОгоЕ8.

8. Предложена возможная схема участия серин-треониновых протеинкиназ в формировании функционального комплекса ОгоЕ8Ь.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Скрининг библиотеки мутантов Synechocystis дефектных по генам СТПК показал, что транскрипция генов, кодирующих белки теплового шока, у штаммов AspkH и AspkK существенно отличается от дикого типа. Различия касаются, в основном, динамики накопления транскриптов, что свидетельствует об участии этих протеинкиназ в регуляции экспрессии генов белков теплового шока. Изучение влияния теплового стресса на транскрипцию генов у двойного мутанта AspkH/AspkK свидетельствует о наличии каких-то дополнительных участников в пути регуляции ответов клеток на тепловой стресс.

СТПК фосфорилируют несколько белков в оптимальных условиях роста. Тепловой стресс вызывает изменения в интенсивности фосфорилирования этих белков. Нам удалось показать, что низкомолекулярный ко-шаперонин GroES, подобно 60-кДа шаперону GroEL, подвергается фосфорилирустся серин-треониновыми киназами. Мы обнаружили, что серин-треониновые протеинкиназы SpkC, SpkF и SpkK отвечают за фосфорилирование рекомбинантного белка GroES in vitro. Фосфорилирование по остаткам серина и треонина в клетках Synechocystis протекает интенсивно и конститутивно при нормальной температуре роста, хотя эксперименты in vitro с рекомбинантным GroES свидетельствует о возможности активации СТПК при тепловом стрессе.

Основываясь на полученных в нашей работе данных, можно представить последовательность событий, происходящих в клетках Synechocystis, испытывающих кратковременный температурный стресс.

В клетках дикого типа гистидинкиназа Hik34 и фактор транскрипции НгсА репрессируют транскрипцию оперона groESL при оптимальной для роста температуре. Тем не менее, экспериментально подтверждено присутствие и GroES, и GroEL в фосфорилированной форме в экстрактах белков из клеток, выращенных при 32°С. Это указывает на то, что Hik34 и/или НгсА репрессируют транскрипцию не полностью.

Мы предполагаем, что фосфорилирование по остаткам серина и треонина, по крайней мере, в случае ОгоЕЭ и ОгоЕЬ, осуществляется конститутивно и зависит только от количества доступного субстрата. Чем больше вгоЕБ синтезируется в клетках, тем выше наблюдаемая степень фосфорилирования.

Тепловой стресс вызывает индукцию транскрипции оперона groESL, накопление в клетке ОгоЕЬ и ОгоЕБ и обеспечивает достаточные количества субстрата для СТПК, которые фосфорилируют эти шаперонины, что, согласно принятой в настоящее время схеме, облегчает их олигомеризацию.

Мутации в генах Мк34 и ИгсА выражаются в конститутивной экспрессии groESL оперона. Белки ОгоЕЬ и ОгоЕ8 накапливаются в значительных количествах и подвергаются фосфорилированию СТПК, которое не зависит от температуры. Таким образом, полученные нами данные о существовании фосфорилированной формы вгоЕ8 дают основания предполагать, что серин-треониновое фосфорилирование этого ко-шаперонина может быть чрезвычайно важным механизмом формирования функционального олигомерного ОгоЕ комплекса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зорина, Анна Алексеевна, Москва

1. Галкин А.Н., Михеева Л.Е., Шестаков С.В. (2003) Инсерционная инактивация генов, кодирующих серин/треониновые протеинкиназы эукариотического типа у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Микробиология, 71, 64-69.

2. Маркелова А.Г., Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1990) Ультраструктурная локализация РБФК в клетках водорослей. Физиология растений, 37, 907-911.

3. Absalon С., Obuchowski М., Madec Е., Delattre D., Holland I.B., Seror S.J.2009) CpgA, EF-Tu and the stressosome protein YezB are substrates of the Ser/Thr kinase/phosphatase couple, PrkC/PrpC, in Bacillus subtilis. Microbiology SGM, 155, 932-943.

4. Akamine P., Madhusudan, Wu J., Xuong N.-H., Ten Eyck L.F., Taylor S.S.2003) Dynamic features of cAMP-dependent protein kinase revealed by apoenzyme crystal structure. J. Mol. Biol, 327, 159-171.

5. Ashby M.K., Houmard J. (2006) Cyanobacterial two-component proteins: structure, diversity, distribution, and evolution. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 472509.

6. Ayub N.D., Pettinari M.J., Ruiz J.A., Lopez N.I. (2004) A polyhydroxybutyrate-producing Pseudomonas sp. isolated from antarctic environments with high stress resistance. Curr. Microbiol, 49, 170-174.

7. Besant P.G., Attwood P.V (2009) Detection and analysis of protein histidine phosphorylation. Mol Cell Biochem., 329, 93-106.

8. Bhattacharya A., Kurochkin A.V., Yip G.N.B., Zhang Y., Bertelsen E.B., Zuiderweg E.R.P. (2009) Allostery in the Hsp70 chaperones is transduced by subdomain rotations. J. Mol. Biol., 388, 475-490.

9. Bigotti M.G, Clarke A.R, Burston S.G. (2006) The Hsp60 chaperonins from prokaryotes and eukaryotes. Topics in Current Genetics, 16, 251-283.

10. Buchner J. (2010) Bacterial Hsp90 desperately seeking clients. Mol. Microbiol, 76, 540-544.

11. Caspers G.J., Leunissen J.A., de Jong W.W. (1995) The expanding small heat-shock protein family, and structure predictions of the conserved "a-crystallin domain". J. Mol. Evol. 40, 238-248.

12. Chaba R., Raje M., Chakraborti P.K. (2002) Evidence that a eukaryotic-type serine/threonine protein kinase from Mycobacterium tuberculosis regulates morphological changes associated with cell division. Eur. J. Biochem., 269, 10781085.

13. Chao J.D., Papavinasasundaram K.G., Zheng X., Chavez-Steenbock A., Wang

14. X., Lee G.Q., Av-Gay Y. (2010) Convergence of Ser/Thr and two-componentsignaling to coordinate expression of the dormancy regulon in Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem., 285, 29239-29246.

15. Digel I., Kayser P., Artmann G.M. (2008) Molecular processes in biological thermosensation. J. Biophys., 2008, Article ID 602870, 9 pages, 2008. doi: 10.1155/2008/6028702008.

16. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. (2002) Protein folding and degradation in bacteria: To degrade or not to degrade? That is the question. Cell. Mol. Life Sci., 59, 1607-1616.

17. Dutta R., Quin L., Inouye M. (1999) Histidine kinases: diversity of domain organization. Mol. Microbiol., 34, 633-640.

18. Enami M., Ishihama A. (1984) Protein phosphorylation in Escherichia coli and purification of a protein kinase. J. Biol. Chem., 259, 526-533.

19. Eymann C., Becher D., Bernhardt J., Gronau K, Klutzny A., Hecker M. (2007) Dynamics of protein phosphorylation on Ser/Thr/Tyr in Bacillus subtilis Proteomics, 7, 3509-3526.

20. Fabret C., Feher V.A., Hoch J.A. (1999) Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world. J. Bacteriol., 181, 1975-1983.

21. Giese K.C., Basha E., Catague B.Y., Vierling E. (2005) Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102, 18896-18901.

22. Gonzalez L., Phalip V., Zhang C.-C. (2001) Characterization of PknC, a Ser/Thr kinase with broad substrate specificity from the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. Eur. J. Biochem., 268, 1869-1875.

23. Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. (2004) Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics, 4, 3665-3685.

24. Grallert H., Buchner J. (2001) A structural view of the GroE chaperone cycle. J. Struct. Biol, 135, 95-103.

25. Grigorieva G.A., Shestakov S.V. (1982) Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Lett., 13, 367-370.

26. Han G., Zhang C.-C. (2001) On the origin of Ser/Thr kinases in a prokaryote. FEMS Microbiol Lett., 200, 79-84.

27. Hanks S.K. (2003) Genomic analysis of the eukaryotic protein kinase superfamily: a perspective. Genome Biol., 4, 111.

28. Hanks S.K., Hunter T. (1995) Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. J.FASEB, 9, 576596.

29. Hanlon W.A., Inouye M., Inouye S. (1997) Pkn9, a Ser/Thr protein kinase involved in the development of Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol, 23, 459-471.

30. Harris S.F., Shiau A.K., Agard D.A. (2004) The crystal structure of the carboxy-terminal dimerization domain of HtpG, the Escherichia coli Hsp90, reveals a potential substrate binding site. Structure, 12, 1087-1097.

31. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci., 59, 1649-1657.

32. Haslbeck M., Franzmann T., Weinfurtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 842-846.

33. Hermann T., Pfefferle W., Baumann C., Busker E., Schaffer S., Bott M., Sahm H., Dusch N., Kalinowski J., Piihler A., Bendt A.K., Kramer R., Burkovski A.2001) Proteome analysis of Corynebacterium glutamicum. Electrophoresis, 22, 1712-1723.

34. Horwich A.L., Farr G.W., Fenton W.A. (2006) GroEL-GroES-mediated protein folding. Chem. Rev., 106, 1917-1930.

35. Huckauf J., Nomura C., Forchhammer K., Hagemann M. (2000) Stress responses of Synechocystis sp. strain PCC 6803 mutants impaired in genes encoding putative alternative sigma factors. Microbiology SGM, 146, 2877-2889.

36. Ikeuchi M., Tabata S. (2001) Synechocystis sp. PCC 6803 a useful tool in the study of the genetics of cyanobacteria. Photosynth. Res., 70, 73-83.

37. Inaba M., Suzuki I., Szalontai B., Kanesaki Y., Los D.A., Hayashi H., Murata N.2003) Gene-engineered rigidification of membrane lipids enhances the cold inducibility of gene expression in Synechocystis. J. Biol Chem., 278, 12191-12198.

38. Jakob U., Meyer I., Bugl H., Andre S., Bardwell J.C.A., Buchner J. (1995) Structural organisation of prokaryotic and eukaryotic Hsp90. J Biol Chem., 270, 14412-14419.

39. Johnson L.N., Lewis R.J. (2001) Structural basis for control by phosphorylation. Chem Rev, 101, 2209-2242.

40. Johnson L.N., Lowe E.D., Noble M.E.M., Owen D.J. (1998) The structural basis for substrate recognition and control by protein kinases. FEBSLett., 430, 1-11.

41. Johnson L.N., Noble M.E.M., Owen D.J. (1996) Active and inactive Protein Kinases: Structural Basis for Regulaton. Cell. 85, 149-158.

42. Johnson S.A., Hunter T. (2005) Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nature methods, 2, 17-25.

43. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y. (2005) Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates Critical Rev. Microbiol, 31, 55-67.

44. Kamei A., Yoshihara S., Yuasa T., Geng X., Ikeuchi M. (2003) biochemical and functional characterization of a eukaryotic-type protein kinase, SpkB, in the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Curr. Microbiol, 46, 296-301.

45. Kamei A., Yuasa T., Geng X., Ikeuchi M. (2002) Biochemical examination of the potential eukaryotic-type protein kinase genes in the complete genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Res., 9, 71-78.

46. Kamei A., Yuasa T., Orikawa K., Xing Geng X., Ikeuchi M. (2001) A eukaryotic-type protein kinase, SpkA, is required for normal motility of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J! Bacteriol., 183, 1505-1510.

47. Kaneko T., Nakamura Y., Sasamoto S., Watanabe A., Kohara M., Matsumoto M., Shimpo S., Yamada M., Tabata S. (2003)" Structural analysis of four large plasmids harboring in a unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803 DNARes., 10, 221-228.

48. Kennelly P.J. (2002) Protein kinases and protein phosphatases in prokaryotes: a genomic perspective. FEMS Microbiol. Lett., 206, 1-8.

49. Kennelly P.J. (2003) Archaeal protein kinases and protein phosphatases: insights from genomics and biochemistry. J. Biochem., 370, 373-389.

50. Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H.-H., Buchner J. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Nature Biotechnology, 9, 825-829.

51. Kiseleva L.L., Serebriiskaya T.S., Horvath I., Vigh L., Lyukevich A.A., Los D.A.2000) Expression of the gene for the A9 acyl-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J. Mol Microbiol. Biotechnol., 2, 331-338.

52. Klumpp S., Krieglstein J. (2002) Phosphorylation and dephosphorylation of histidine residues in proteins. Eur. J. Biochem., 269, 1067-1071.

53. Koksharova O.A., Wolk C. P. (2002) Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 123-137.

54. Koonin E.V., Mushegian A.R., Galperin M.Y., Walker D.R. (1997) Comparison of archaeal and bacterial genomes: computer analysis of protein sequences predicts novel functions and suggests a chimeric origin for the archaea. Mol. Microbiol., 25, 619-637.

55. Krupa A., Srinivasan N. (2005) Diversity in domain architectures of Ser/Thr kinases and their homologues in prokaryotes. BMC Genomics, 6, 129.

56. Kumar C.M., Khare G., Srikanth C.V., Tyagi A.K., Sardesai A.A., Mande S.C.2009) Facilitated oligomerization of mycobacterial GroEL: evidence for phosphorylation-mediated oligomerization. J. Bacteriol, 191, 6525-6538.

57. Labarre J., Chauvat F., Thuriaux P. (1989) Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol, 171, 3449-3457.

58. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

59. Laurent S., Jang J., Janicki A., Zhang C.-C., Bedu S. (2008) Inactivaton of spkD, encoding a Ser/Thr kinase, affects the pool of the TCA cycle metabolites in Synechocyctis sp. strain PCC 6803. Microbiology SGM, 154, 2161-2167.

60. Lee S., Owen H.A., Prochaska D.J., Barnum S. (2000) HSP16.6 is involved in the development of thermotolerance and thylakoid stability in the unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Curr. Microbiol., 40, 283-287.

61. Lehel C., Los D.A., Wada H., Gyorgyey A., Horvath I., Kovacs E., Murata N., Vigh L. (1993) A second groEL-like gene, organized in a groESL operon is present in the genome of Synechocystis sp. PCC6803. J. Biol. Chem., 268, 1799-1804.

62. Leonard C.J., Aravind L., Koonin E.V. (1998) Novel families of putative protein kinases in bacteria and archaea: evolution of the "eukaryotic" protein kinase superfamily. Genome Res., 8, 1038-1047.

63. Lin W.-J., Walthers D., Connelly J.E., Burnside K., Jewell K.A., Kenney L.J., Rajagopal L. (2009) Threonine phosphorylation prevents promoter DNA binding of the Group B Streptococcus response regulator CovR Mol. Microbiol., 71, 1477-1495.

64. Lin Z., Madan D., Rye H.S. (2008) GroEL stimulates protein folding through forced unfolding. Nature Structural & Molecular Biol., 15, 303-311.

65. Los D.A., Zorina A, Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V.2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors, 10, 23862415.

66. Lux R., Shi W. (2005) A novel bacterial signalling system with a combination of a Ser/Thr kinase and a His/Asp two-component system. Mol. Microbiol., 58, 345-348.

67. Macek B., Gnad F., Soufi B., Kumar C., Olsen J.V., Mijakovic I., Mann M.2008). Phosphoproteome analysis of E. coli reveals evolutionary conservation of bacterial Ser/Thr/Tyr phosphorylation. Mol. Cell Proteomics, 7, 299-307.

68. Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 933 p.

69. Mann M., Ong S.-En, Grenborg M., Steen H., Jensen O.N., Pandey A. (2002) Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. Trends in Biotechnology, 20, 261-268.

70. Mascher T., Helmann J.D., Unden G. (2006) Stimulus perception in bacterial signal-transducing histidine kinases Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 910-938.

71. Mayer M.P., Bukau B. (2005) Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 62, 670-684.

72. Merrill R.A., Strack S. (2007) Protein kinases and phosphatases. In: Molecular Pain. Zhuo M. ed., Chapter 15, Higher Education Press, Beijin, China, p. 187-205.

73. Mizuno T. (1997) Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal transducers in the genome of Escherichia coli. DNA Res., 4, 161-168.

74. Molle V., Kremer L. (2010) Division and cell envelope regulation by Ser/Thr phosphorylation: Mycobacterium shows the way. Mol. Microbiol., 75, 1064-1077.

75. Muñoz -Dorado J., Inouye, S., Inouye M. (1991) A gene encoding a protein serine/threonine kinase is required for normal development of Myxococcus xanthus, a gram-negative bacterium. Cell, 67, 995-1006.

76. Nakamoto H., Honma D. (2006) Interaction of a small heat shock protein with light-harvesting cyanobacterial phycocyanins under stress conditions. FEBS Lett., 580, 3029-3034.

77. Nakamoto H., Suzuki M., Kojima K. (2003). Targeted inactivation of the hrcA repressor gene in cyanobacteria. FEBS Lett., 549, 57-62.

78. Nakamoto H., Vígh L. (2007) The small heat shock proteins and their clients. Cell. Mol. Life ScL, 64, 294-306.

79. Nariya H., Inouye S. (2002) Activation of 6-phosphofructokinase via phosphorylation by Pkn4, a protein Ser/Thr kinase of Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol., 46, 1353-1366.

80. Nariya H., Inouye S. (2003) An effective sporulation of Myxococcus xanthus requires glycogen consumption via Pkn4-activated 6-phosphofructokinase. Mol. Microbiol, 49, 517-528.

81. Nariya H., Inouye S. (2005) Identification of a protein Ser/Thr kinase cascade that regulates essential transcriptional activators in Myxococcus xanthus. Mol. Microbiol, 58, 367-379.

82. Nariya H., Inouye S. (2006) A protein Ser/Thr kinase cascade negatively regulates the DNA-binding activity of MrpC, a smaller form of which may be necessary for the Myxococcus xanthus development. Mol Microbiol, 60, 1205-1217.

83. Neuhoff V., Stamm R., Eibl H. (1985) Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in poly aery 1 amide gels: A systematic analysis. Electrophoresis, 6,427-448.

84. Nitta K, Suzuki N., Honma D., Kaneko Y., Nakamoto H. (2005) Ultrastructural stability under high temperature or intensive light stress conferred by a small heat shock protein in cyanobacteria. FEBS Lett., 579, 1235-1242.

85. Nováková L., Bezouková S., Pompach P., Spidlová P., Sasková L., Weiser J., Branny P. (2010) Identification of Multiple Substrates of the StkP Ser/Thr Protein Kinase in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol., 192, 3629-3638.

86. O'Farrell P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., 250, 4007-4021.

87. Peake P., Winter N., Britton W. (1998) Phosphorylation of Mycobacterium leprae heat-shock 70 protein at threonine 175 alters its substrate binding characteristics. Biochim. Biophys. Acta, 1387, 387-394.

88. Pearl L.H., Prodromou C. (2006) Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu. Rev. Biochem., 75, 271-294.

89. Pérez J., Castañeda-García A., Jenke-Kodama H', Müller R., Muñoz-Dorado

90. J. (2008) Eukaryotic-like protein kinases in the prokaryotes and the myxobacterial kinome. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 105, 15950-15955.

91. Petrickova K. and Petricek M. (2003) Eukaryotic-type protein kinases in Streptomyces coelicolor. variations on a common theme. Microbiology SGM, 149, 1609-1621.

92. Phalip V., Li J.-H., Zhang C.-C. (2001) HstK, a cyanobacterial protein with both a serine/threonine kinase domain and a histidine kinase domain: implication for the mechanism of signal transduction. J. Biochem., 360, 639-644.

93. Prentki P., Binda A., Epstein A. (1991). Plasmid vectors for selecting IS 1-promoted deletions in cloned DNA: sequence analysis of the omega interposon. Gene, 103, 17-23.

94. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H.1997) Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell, 90, 65-75.

95. Rastogia R.P., Sinha R.P. (2009) Biotechnological and industrial significance of cyanobacterial secondary metabolites. Biotechnology Advances, 27, 521-539.

96. Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17, 208-212.

97. Rose R.E. (1988) The nucleotide sequence of pACYC184. Nucl. Acids Res., 16, 35.

98. Saskova L., Novakova L., Basler M., Branny P. (2007) A eukaryotic-type serine/threonine protein kinase StkP is a global regulator of gene expression in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol., 189, 4168-4179.

99. Sato T., Minagawa S., Kojima E., Okamoto N., Nakamoto H. (2010) HtpG, the prokaryotie homologue of Hsp90, stabilizes a phyeobilisome protein in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942. Mol. Microbiol., 76, 576-589.

100. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sei., 21, 289-296.

101. Schmelzle K., White F.M. (2006) Phosphoproteomic approaches to elucidate cellular signaling networks. Curr. Opin. Biotech., 17, 406-414.

102. Schweizer H.D. (1993) Small broad-host-range gentamycin resistance gene cassettes for site-specific insertion and deletion mutagenesis. Biotechniques, 15, 831834.

103. Sharp S., Workman P. (2006) Inhibitors of the HSP90 molecular chaperone: current status. Adv. Cancer Res., 95, 323-348.

104. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1992) Heat shock in Escherichia coli alters the protein-binding properties of the chaperonin groEL by inducing its phosphorylation. Nature, 357, 167-169.

105. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1993) Heat shock of Escherichia coli increases binding of dnaK (the hsp70 homolog) to polypeptides by promoting its phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8648-8652.

106. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1994) Heat shock-induced phosphorylation of GroEL alters its binding and dissociation from unfolded proteins. J. Biol. Chem., 269, 31479-31483.

107. Shi L., Potts M., Kennelly P.J. (1998) The serine, threonine, and/or tyrosine-specific protein kinases and protein phosphatases of prokaryotic organisms: a family portrait. FEMS Microbiology, 22, 229-253.

108. Shiau A.K., Harris S.F., Southworth D.R., Agard D.A. (2006) Structural analysis of E. coli hsp90 reveals dramatic nucleotide-dependent conformational rearrangements. Cell, 127, 329-340.

109. Shults M.D., Janes K.A., Lauffenburger D.A., Imperiali B. (2005) A multiplexed homogeneous fluorescence-based assay for protein kinase activity in cell lysates. Nat. Methods, 2, 277-283.

110. Sigler P.B., Xu Z., Rye H.S., Burston S.G., Fenton W.A., Horwich A.L. (1998) Structure and function in GroEL-mediated protein folding. Annu. Rev. Biochem., 67, 581-608.

111. Singh A.K., Summerfield T.C., Li H., Sherman L.A. (2006) The heat shock response in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 and regulation of gene expression by HrcA and SigB. Arch. Microbiol., 186, 273-286.

112. Slabas A.R., Suzuki I., Murata N., Simon W.J., Hall J.J. (2006) Proteomic analysis of the heat shock response in Synechocystis PCC 6803 and a thermally tolerant knockout strain lacking the histidine kinase 34 gene. Proteomics, 6, 845-864.

113. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. (1971) Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chlorococcales). Bacteriol. Rev., 35, 171-205.

114. Stock J.B., Surette M.G., Levit M., Park P. (1995) Two-component signal transduction systems: structure-function relationships and mechanisms of catalysis. In: Two Component Systems.Hoch J, Silhavy T. (Eds.), Washington, DC: ASM Press, p. 25-51.

115. Studer S., Obrist M., Lentze N., Narberhaus F. (2002) A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial a-heat shock proteins. Eur. J. Biochem., 269, 3578-3586.

116. Suzuki I., Kanesaki Y., Hayashi H., Hall J.J., Simon W.J., Slabas A.R., Murata N. (2005) The histidine kinase Hik34 is involved in thermotolerance by regulating the expression of heat shock genes in Synechocystis. Plant Physiol., 138, 1409-1421.

117. Suzuki I., Simon W.J, Slabas A.R. (2006) The heat shock response of Synechocystis sp. PCC 6803 analysed by transcriptomics and proteomics. J. Exp. Bot., 57, 1573-1578.

118. Tanaka N., Hiyama T., Nakamoto H. (1997) Cloning, characterization and functional analysis of groESL operon from thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Biochim. Biophys. Acta 1343, 335-348.

119. Tanaka N., Nakamoto H. (1999) HtpG is essential for the thermal stress management in cyanobacteria. FEBSLett., 458, 117-123.

120. Thingholm T.E., Jensen O.N., Larsen M.R. (2009) Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics, 9, 1451-1468.

121. Throup J.P., Koretke K.K., Bryant A.P., Ingraham K.A., Chalker A.F., Ge Y., Marra A., Wallis N.G., Brown J.R., Holmes D.J., Rosenberg M., Burnham

122. M.K. (2000) A genomic analysis of two-component signal transduction in Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol., 35, 566-576.

123. Tuominen I., Pollari M., Tyystjarvi E., Tyystjarvi T. (2006) The SigB sigma factor mediates high-temperature responses in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEBS Lett., 580, 319-323.

124. Udo H., Inouye M., Inouye S. (1996) Effects of overexpression of Pkn2, a transmembrane protein serine/ threonine kinase, on development of Myxococcus xanthus. JBacteriol., 178, 6647-6649.

125. Udo H., Lam C.K., Mori S., Inouye M., Inouye S. (2000) Identification of a substrate for Pkn2, a protein Ser/ Thr kinase from Myxococcus xanthus by a novel method for substrate identification. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2, 557-563.

126. Udo H., Munoz-Dorado J., Inouye M., Inouye S. (1995) Myxococcus xanthus, a gram-negative bacterium, contains a transmembrane protein serine/threonine kinase that blocks the secretion of beta-lactamase by phosphorylation. Genes Dev., 9, 972983.

127. Vieira J., Messing J. (1982) The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268.

128. Vigh L., Maresca B., Harwood J.L. (1998) Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? Trends Biochem. Sci., 23, 369374.

129. Walter S., Buchner J. (2002) Molecular chaperones-cellular machines for protein folding. Angew. Chem. Int. Ed., 41, 1098-1113.

130. Wandinger S.K., Richter K., Buchner J. (2008) The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem., 283, 18473-18477.

131. Wang L., Sun Y.-P., Chen W.L., Li J.-H., Zhang C.-C. (2002) Genomic analysis of protein kinases, protein phosphatases and two-component regulatory systems of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. FEMS Microbiol. Lett.,211, 155-165.

132. Wehenkel A., Bellinzoni M., Grana M., Duran R., Villarino A., Fernandez P., Andre-Leroux G., England P., Takiff H., Cervenansky C., Cole S.T., Alzaria

133. P.M. (2008) Mycobacterial Ser/Thr protein kinases and phosphatases: Physiological roles and therapeutic potential. Biochim. Biophys. Acta (BBA) Proteins & Proteomics, 1784, 193-202.

134. Williams, J. G. K. (1988) Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis. 6803. Methods Enzymol. 167, 766-778.

135. Wurgler-Murphy S.M., Saito H. (1997) Two-component signal transducers and MAPK cascades. Trends Biochem. Sci., 22, 172-176.

136. Xu Z., Horwich A. L., Sigler P.B. (1997) The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature, 388, 741-750.

137. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

138. Young J.C., Moarefi I., Hartl F.U. (2001) Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. J. Cell. Biol., 154, 267-273.

139. Zhang C.-C. (1993) A gene encoding a protein related to eukaryotic protein kinases from the filamentous heterocystous cyanobacterium Anabaena PCC 7120. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11840-11844.

140. Zhang C.-C., Gonzalez L., Phalip V. (1998) Survey, analysis and genetic organization of genes encoding eukaryotic-like signaling proteins on a cyanobacterial genome. Nucl. Acids Res. 26, 3619-3625.

141. Zhang C.-C., Libs L. (1998) Cloning and characterization of the pknD gene encoding an eukaryotic-type protein kinase in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol. Gen. Genet., 258, 26-33.

142. Zhang X., Zhao F., Guan X., Yang Y., Liang C., Qin S. (2007) Genome-wide survey of putative Serine/Threonine protein kinases in cyanobacteria. BMC Genomics, 8, 395.

143. Zhao H.Y., Li H.M., Qin L.F., Wang H.H., Chen G.-Q. (2007) Disruption of the polyhydroxyalkanoate synthase gene in Aeromonas hydrophila reduces its survival ability under stress conditions. FEMS Microbiol. Lett., 276, 34-41.