Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis

Лобанов, Константин Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis"

На правах рукописи

ЛОБАНОВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

РОЛЬ СЕНСОРНЫХ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА У BACILLUS SUBTILIS

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

Москва 2011

4854765

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика»

Миронов Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ЗАО «АГРИ»

Лившиц Виталий Аркадьевич

кандидат биологических наук ФГУП ГосНИИгенетика

Манухов Илья Владимирович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится « {{_ » С illdtpJ! 2011 года на

заседании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат диссертации разослан « » 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук /Ш^, Т.Л.Воюшина

Ь,-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Настоящая работа посвящена изучению роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis. Изучение генетической регуляции пуринового метаболизма направлено на обнаружение молекулярных механизмов, открывающих новые возможности управления генетическими и метаболическими процессами организмов. Конечные продукты (AMP и GMP), а также их предшественники и производные, являются не только компонентами нуклеиновых кислот и энергетическими переносчиками, но и выполняют не менее важные функции глобальных регуляторов общего метаболизма. Традиционные способы производства пуринов основаны на их микробиологическом синтезе, который осуществляется генетически модифицированными штаммами - продуцентами. Создание нового поколения высокопродуктивных штаммов требует углубленного понимания процессов генетической регуляции пуринового метаболизма, что является одной из задач настоящего исследования. Объектом исследования избран Bacillus subtilis, микроорганизм, который традиционно служит не только моделью для выявления новых механизмов регуляции биосинтеза пуринов, но и основой для конструирования промышленных продуцентов.

Пуриновый оперон В. subtilis purEKBCSQLFMNHD (далее - /шг-onepoii) кодирует ферменты синтеза de novo инозинмонофосфата, общего предшественника пуриновых нуклеотидов AMP и GMP. Известно, что гены пуринового метаболизма у В. subtilis подвержены множественной регуляции на уровне инициации и терминации транскрипции. В случае двух оперонов: риг-оперона и xpt-pbuX, кодирующего синтез ксантинфосфорибозилтрансферазы, показано, что их экспрессия регулируется как на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, так и на уровне терминации транскрипции. На модели этих оперонов был обнаружен необычный метаболит-зависимый механизм атгенуации транскрипции: при добавлении в ростовую среду оснований гипоксантина и гуанина их транскрипция терминируется перед первыми структурными генами, тогда как в их отсутствии транскрибируется полный оперон. Как выяснилось позднее, влияние пуринов на процесс терминации транскрипции осуществляется посредством нового механизма регуляции активности генов с участием так называемых сенсорных РНК, который был впервые обнаружен в лаборатории биохимической генетики ФГУП ГосНИИгенетика на модели рибофлавинового и тиаминового оперонов у В. subtilis. Такие сенсорные РНК, расположенные в лидерной области мРНК бактериальных оперонов, получили наименование «рибопереключателей» (riboswitch), так как в результате прямого взаимодействия со специфическим метаболитом они способны модулировать экспрессию прилегающих генов, включая или выключая их экспрессию на уровне терминации транскрипции или инициации трансляции.

К настоящему моменту выяснилось, что лидерные области ряда генов пуринового метаболизма у В. subtilis, включая риг-оперон, xpt-рЬиХ-оперон и ген pbuE, кодирующий трансмембранный белок, ответственный за транспорт пуринов из клетки, содержат

консервативную последовательность, получившую наименование G-бокс, которая способна выступать в качестве сенсора пуриновых оснований, а также расположенный за ней классический Rho-независимый терминатор транскрипции. В то же время, детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области рыг-оперона В. subtilis, позволяющего выяснить роль кодируемой этой областью сенсорной РНК в регуляции экспрессии рыг-оперона, не проводилось. Кроме того, оставалась неясной роль внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции, расположенного в межгенном участке purF-ригМ риг-оперона, в координации синтеза предшественников пуриновых нуклеотидов.

Изучение механизмов регуляции риг-оперона и других генов, вовлеченных в метаболизм пуринов, имеет и важный практический аспект, поскольку некоторые промежуточные соединения, образующиеся в процессе биосинтеза пуринов, обладают рядом чрезвычайно важных положительных качеств. В частности, 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно - AICAR (также известный как акадезин), который образуется в процессе биосинтеза пуринов de novo у В. subtilis, является активатором аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (АМРК), которая, в свою очередь, является глобальным регулятором метаболических процессов, обеспечивающих энергетический статус эукариотических организмов. В настоящее время проводится ряд клинических исследований препаратов на основе акадезина, результаты которых дают обнадеживающие положительные данные, в области борьбы с хронической лимфоцитарной лейкемией В-клеток, лечения метаболического синдрома и кардиохирургии. В связи с этим, получение высокоактивного штамма-продуцента AICAR на основе генетически модифицированных бактерий с измененной регуляцией генов пуринового метаболизма представляется весьма актуальной практической задачей для разработки процесса дешевого микробиологического синтеза AICAR.

Цель н задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение механизма регуляции метаболизма и транспорта пуринов у В. subtilis с участием сенсорных РНК и создание на этой основе штамма-продуцента AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.

В процессе работы были решены следующие задачи:

1. Проведение детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области риг-оперона В. subtilis и выявление регуляторных элементов, участвующих в контроле экспрессии этого оперона

2. Изучение структурно-функциональной организации лидерной области гена pbuE В. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Выявление эффекторов, влияющих на экспрессию гена pbuE.

3. Создание штамма-продуцента, накапливающего AICAR в культуральной жидкости в концентрациях, достаточных для дальнейшего промышленного производства.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области /зыг-оперона В. subtilis, впервые показано, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксаитином. Впервые показано, что уровень экспрессии четырех дистальных генов рмг-оперона (purMNHD) подавляется более чем в 2 раза в результате действия Rho-независимого терминатора транскрипции расположенного в межгенном участке purF-purM.

На основании мутационного анализа лидерной области гена pbuE В. subtilis, впервые показано, что присутствие в консервативной области лидера (A-бокс) двух нуклеотидных замен 70U—>С и A100->G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК ш vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин.

Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутшггаых вариантов лидерной области /wr-оперона В. subtilis и лидерной области гена pbuE В. subtilis с нуклеотидными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области, а также дня конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов.

Сконструирован высокоактивный штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости. Полученный штамм может послужить основой для промышленного микробиологического синтеза AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.

Аппобапия работы

Материалы диссертации докладывались на международной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» (Бреслеровские чтения II), (Санкт-Петербург, 7-8 ноября 2006 г.), Международной школе-конференции по генетике микроорганизмов и биотехнологии, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика (Москва-Пущино, 20 -24 октября 2008 г), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2127 июня 2009 г.).

Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 23 мая 2011 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, из них три печатные работы в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Структура работы

Диссертация изложена на страницах печатного текста, включая рисунков и 5_ таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение регуляторных элементов, контролирующих экспрессию пуринового оперона Bacillus subtilis

Схема структурной организации pur-оперона и его регуляции представлена на рис. 1. Данный раздел посвящен мутационному анализу лидерной области риг-оперона В. subtilis и выяснению роли пуриновых оснований в регуляции экспрессии оперона in vivo и in vitro с участием белка-репрессора PurR и терминатора транскрипции, расположенного в лидерной области оперона. А так же изучению влияния внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции, находящегося в межгенном участке purF-purM, на экспрессию дистальных генов риг-оперона.

Рисунок 1. Схема структурной организации риг-оперона и его регуляции.

В верхней части рисунка показано относительное расположение 12 сцепленных структурных генов, образующих риг-оперои и не сцепленный с ними ген ригЯ, кодирующий белок-репрессор риг-оперона. В нижней части рисунка представлена лидерная область риг-оперона с указанием сайтов связывания белка-репрессора РигЯ, сайта связывания РНК-полимеразы ( -35 - - 10), старта транскрипции (+1), терминатора транскрипции (в виде шпилечной структуры) и сайта связывания рибосом (ЗБ).

1.1. Клонирование лидерной области риг-оперона и ее компьютерный анализ

С использованием специфических праймеров, фланкирующих лидерную область риг-оперона, проведена ПЦР амплификация соответствующего фрагмента хромосомы В. яиЬИШ. Полученный фрагмент, содержащий лидерную область /шг-оперона, был клонирован с использованием рестриктаз ЕсоШ и ВатШ в полилинкерную последовательность вектора рОС268. Секвенирование клонированного фрагмента риг-оперона подтвердило его интактность. На рис. 2 представлена нуклеотидная последовательность мРНК, кодируемая лидерной областью гена /шг-оперона

Р1 Р2 ру рз рз< рГ

хрс 5 ■ -аашаюаоюсяам^

т! . -40

рихЕ 5■ -шш^иаДШ^уИ^Ьта ^ Ч а п -.

Рисунок 2. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерных областей мРНК генов

и ригЕ В. ¡иЫШй.

Выделены три потенциальные шпилечные структуры (Р1/РГ, Р2/Р2' и РЗ/РЗ'). Гомологичные основания подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены основания, в которых были получены

мутации, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена начиная со стартов транскрипции генов хр1 и ригЕ.

Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной области риг-оперона с последовательностями лидерных областей хр1-рЬиХ-опс<рот В. шЬйШ (рис. 2) выявляет высокий уровень гомологии, особенно в районе так называемого О-бокса (нуклеотиды от +15 до +90, консервативные нуклеотиды подчеркнуты). Более того, лидерная область содержит три пары антипараллельных последовательностей, которые способны формировать потенциальные шпилечные структуры: Р1/Р1', Р2/Р2' и РЗ/РЗ'. Расположение этих потенциальных шпилек практически полностью совпадает с таковым в лидерных областях хр/-р6иХ-оперона В. ¡иЫШв. Потенциальные вторичные структуры мРНК, формирующиеся в процессе транскрипции, могут быть смоделированы с помощью алгоритма Цукера-Тернера, который основан на минимизации свободной энергии в процессе фолдинга РНК.

Модель двух наиболее вероятных альтернативных вторичных структур лидерной мРНК риг-оперона представлена на рис. 3.

Рисунок 3. Модель вторичной структуры лидерной области риг-оперона В. subtilis (G-бокс).

Основания, в которых были получены мутации выделены рамками, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Три потенциальные шпилечные структуры указаны как PI/PI', Р2/Р2' и РЗ/РЗ'. Серым цветом выделены области, взаимодействие которых приводит к образованию альтернативной структуры - антитерминатора транскрипции. Штрихпунктирной рамкой выделена область с 44 по 54 нуклеотид.

Одна из конфигураций (по аналогии с xpt-рЬиХ-оперотм - в присутствии пуриновых оснований) может формироваться за счет комплементарного взаимодействия последовательностей PI и РГ и последовательностей Т и Т\ образующих терминатор транскрипции (рис. 3). Образование альтернативной конфигурации (в отсутствие пуринов) может происходить за счет формирования шпильки РГ:Т (соответствующие комплементарные нуклеотиды выделены серым цветом на рис. 3). В соответствии с моделью, представленной на рис. 3, формирование антитерминатора (шпилька Р1':Т) приводит к разрушению терминирующей шпильки Т:Г и обеспечивает сквозную транскрипцию риг-оперона. Для проверки модели регуляции риг-оперона, приведенной на рис. 3 и основанной на изменении конформации сенсорной РНК, проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области риг-оперона

терминатор

1.2. Сайт-направленный мутагенез лидерной области />нг-оперона.

Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные замены в участках лидерной РНК, которые предположительно влияют на формирование ее вторичной структуры или на связывание сенсорной РНК с эффекторами. Расположение всех полученных мутаций в лидерной областириг-оперона показано на рис. 2 и 3.

Как показано на этих рисунках, мутанты АМ612-М1 (A44->G), АМ612-М2 (Т47->С), АМ612-МЗ (Т48—>С), АМ612-М4 (Т51->С) и АМ612-М5 (С53^Т) содержат нуклеотидные замены в области лидера, расположенной между шпильками Р2/Р2' и РЗ/РЗ', а мутант АМ612-М6 (С76-»Т) - между шпильками РЗ/РЗ' и Р1/РГ. Кроме того, получен делеционный мутант АМ612-М7 Д(44-54), который содержит делецию всего спейсерного участка между шпильками Р2/Р2' и РЗ/РЗ', а также мутант АМ612-М8, содержащий три нуклеотидные замены (Т22—»G, А23-»Т, А24—>С), которые увеличивают область спаривания в шпильке Р1/РГ (рис. 3). Все полученные мутации клонированы в составе экспрессионного вектора pDG268 с целью последующего изучения эффекта этих мутаций на уровень экспрессии ригЕ.

1.3. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов purE-lacZ в клетках В. subtilis.

Для изучения механизма регуляции />мг-оперона были проведены эксперименты по определению активности ß-галактозидазы у штаммов В. subtilis, содержащих интегрированные в хромосому транскрипционные фьюзы purE-lacZ. Прежде всего, мы сравнили экспрессию /шг-оперона в штамме пуринового ауксотрофа Mu8u5u6 (purF), содержащего регуляторный локус purR дикого типа, и изогенного штамма АМ521 с нарушенным синтезом penpeccopa PurR (purF purRr.neo) в различных физиологических условиях: в присутствии экзогенных пуриновых оснований гуанина, гипоксантина и аденина и в их отсутствии. Результаты этих опытов представлены на диаграммах рис. 4.

ОНур ■ О

ИА

pu'F purF purR::neo

Рисунок 4. Сравнение экспрессии транскрипционных фьюзов purE-lacZ в штаммах В. subtilis purF и purF purRr.neo.

Аббревеатура: Нур - гипоксантин, G - гуанин, А - аденин.

Как следует из данных диаграмм, экспрессия фьюза purE-lacZ в штамме purF характеризуется чувствительностью к добавлению всех трех пуриновых оснований, тогда как в клетках штамма purF purRr.neo аденин не оказывает подавляющего действия на экспрессию риг-оперона. Из этого следует, что аденин является эффектором регуляции,

которая осуществляется белком-репрессором РигЯ на уровне инициации транскрипции, тогда как действие гуанина и гипоксантина реализуется скорее всего на уровне терминации транскрипции. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали штамм ригр ригК::пео.

На рис. 5 представлены результаты определения активности р-галактозидазы у штамма ригР ригК::пео, содержащего в составе хромосомы транскрипционные фыозы лидераригЕ дикого типа и его мутантные варианты, описанные в предыдущем разделе.

2 900

\ЛГТ М1 М2 МЗ М4 М5 Мб М7 М8 Рисунок 5. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидерной области рыг-оперона дикого типа и его мутантных вариантов.

Условные обозначения: М1 - АМ612-М1 (А44-Ю); М2 - АМ612-М2 (Т47^С); МЗ - АМ612-МЗ (Т48-С); М4 - АМ612-М4 (Т51-»С); М5 - АМ612-М5 (С53^Т); Мб - АМ612-М6, (С76-»Т); М7 - АМ612-М7,' Д(44-54); М8-АМ612-М8, (Т22->0, А23-»Т, А24->С).

Как следует из рис. 5, по фенотипическому проявлению мутанты, содержащие замены в области лидера, расположенной между шпильками Р2/Р2' и РЗ/РЗ' могут быть разделены на два класса. У мутантов первого класса АМ612-М1 (А44-Ю), АМ612-МЗ (Х48—>С) и АМ612-М5 (С53-+Т), наблюдается некоторое снижение базального уровня экспрессии реперного гена ЬЯ по сравнению с транскрипционным фьюзом, содержащим лидерную область дикого типа, причем добавление пуриновых оснований приводит к заметному снижению уровня экспрессии |3-галактозидазы у мутантов, хотя и в меньшей степени, чем у контрольного варианта дикого типа. Мутанты второго класса АМ612-М2 (Т47->С) и АМ612-М4 (Т51->С) также обнаруживают небольшое снижение базального уровня экспрессии (3-галактозидазы, однако, в отличие от мутантов первого класса, этот уровень практически не снижается при добавлении пуриновых оснований. Эти данные указывают на важную роль спейсерной области между шпильками Р2/Р2' и РЗ/РЗ' в узнавании и связывании пуриновых оснований, которые служат негативными эффекторами регуляции риг-оперона. С этим согласуется поведение мутанта АМ612-М7, содержащего делецию всей спейсерной области между шпильками Р2/Р2' и РЗ/РЗ', который обнаруживает полностью дерепрессированный уровень экспрессии риг-оперона (рис. 5).

Любопытно, что к такому же эффекту полной нечувствительности к негативному действию пуриновых оснований приводит нуклеотидная замена С76-»Т в спейсерной области между шпильками РЗ/РЗ' и Р1/РГ, содержащаяся в мутанте АМ612-М6, что свидетельствует о ключевой роли цитозина в положении 76 в узнавании пуриновых

эффекторов. В то же время, мутант АМ612-М8, содержащий нуклеотидные замены, которые увеличивают область спаривания в шпильке Р1/РГ, напротив, характеризуется резким снижением активности по сравнению с диким типом, причем и в этом случае экзогенные основания практически перестают оказывать репрессирующее действие на экспрессию риг-оперона. На основании данных рис. 5 можно заключить, что негативное действие эффекторов - гуанина и гипоксантина - реализуется за счет их взаимодействия с участками лидера, расположенными между шпильками Р1/РГ-Р2/Р2', Р2/Р2'-РЗ/РЗ' и РЗ/РЗ'-Р1/РГ. Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты in vitro.

1.4. Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНКрит-оперона.

Согласно модели рибопереключателей, низкомолекулярные эффекторы - пуриновые основания должны непосредственно связываться с лидерной РНК в процессе ее транскрипции и обусловливать терминацию путем стабилизации структуры G-бокса в конформации анти-антитерминатора. В отсутствие эффектора-пурина будет формироваться структура антитерминатора и терминация должна супрессироваться. Для проверки этого механизма была реконструирована система атгенюации транскрипции in vitro, в состав которой входит препарат холофермента РНК-полимеразы Е. coli и полученные с помощью ПЦР матрицы ригЕ- лидерной области, включающие интактный промотор. После формирования инициирующего комплекса, содержащего [32Р] меченую по З'-концу лидерную РНК, проводилась достройка РНК до конца матрицы в присутствии или отсутствии аденина, гуанина и гипоксантина. Изменения в эффективности терминации в ответ на добавление каждого из пуринов оценивались с помощью гель электрофореза путем расчета соотношения между полноразмерными и укороченными транскриптами Серия матриц, содержащих мутации, охарактеризованные in vivo в предыдущем разделе, также была проверена в аналогичных in vitro экспериментах (рис. 6).

Матрица Эффектор С (мм) Wl - А Н G 1000 10 100 10 1 М2 - G М4 ■ G Мб - G М7 G М8 - G

. ----. й! — rn-'i': „ . s!::#: ii

•■»т 16 18 40 50 60 60 23 50 1S 20 16 18 25 25 50 50 1

Рисунок 6. Эффект пуриновых оснований на транскрипцию лидерной области риг-оперона

Условные обозначения матриц: - АМ612, дикий тип; М2 - АМ612-М2, (Т47->С); М4 - АМ612-М4, (Т51—>С); Мб - АМ612-М6, (С7б^Т); М7 - АМ612-М7, Д(44-54); М8 - АМ612-М8 (Т22^С А23—*Т, А24->С).

Как следует из электрофореграмм, представленных на рис. 6, при использовании в качестве матрицы лидерной ДНК дикого типа примерно 16% ригЕ РНК терминирует на терминаторе в отсутствии эффекторов. Добавление аденина никак не сказывается на

распределении транскриптов, тогда как в присутствии высоких концентраций гипоксантина (100 мкМ) терминируется примерно 50% РНК, а гуанина - до 60% даже при низкой концентрации (1 мкМ) этого основания. В соответствии с данными, полученными in vivo, мутантные варианты матриц (М2, М4, Мб и М7) характеризуются сниженным уровнем терминации независимо от присутствия или отсутствия гуанина. Что касается мугшгшой матрицы М8, то для нее характерно существенное увеличение уровня терминации (до 50%), которое наблюдается в случае матрицы дикого типа при добавлении в транскрипционную

смесь гипоксантина или гуанина.

Таким образом, результаты экспериментов ш vitro свидетельствуют о том, что пуриновые основания гуанин и, в меньшей степени, гипоксантин напрямую связываются с лидерной РНК риг-оперона и способствуют более эффективной терминации транскрипции.

1.5. Синергидный эффект мутации в регуляторном локусе purR и делеции терминатора транскрипции в лидерной области на экспрессию риг-оперона.

Для того чтобы оценить относительный вклад негативной регуляции под контролем белка-репрессора PurR, действующей на уровне инициации транскрипции, и регуляции с участием сенсоной РНК на уровне терминации транскрипции, была сконструирована серия изогенных штаммов В. subtilis, содержащих транскрипционные фьюзы в гене ригН: в геноме штамма дикого типа (штамм АМ733), на фоне инсерции purR::neo (АМ754), делеции терминатора транскрипции purEATL (АМ747) и у штамма АМ769, сочетающего комбинацию этих мутаций. У полученных штаммов определяли активность Р-галактозидазы при выращивании бактерий в условиях экспоненциального роста культур (Таблица 1).

Таблица 1.

Активность Р-галактозидазы в экстрактах штаммов В. subtilis

Штамм Генотип Активность Р-галактозидазы Уровень дерепрессии

АМ733 ригН:: (pMutin2purH '-lacZ) 15±2 1

АМ747 purH::(pMutin2purH'-lacZ) ATL 135±10 9

АМ754 purH::(pMutin2purH'-lacZ) purR::neo 260±18 17

АМ769 ourH:: (pMutin2purH '-lacZ) A TL purR: :neo 3200±130 210

Как следует из данных табл.1, на фоне делеции терминаторной шпильки лидерной области риг-оперона наблюдается 9-кратное увеличение активности Р-галактозидазы у штамма АМ747, содержащего гибридный оперон ригН'-1ас2. При внесении инсерции ригКг.пео, блокирующей синтез белка-репрессора РигЯ экспрессия реперного гена увеличивается в 17 раз по сравнению со штаммом дикого типа АМ733. Интересно отметить, что на фоне обеих мутаций наблюдается ярко выраженный синергидный эффект: уровень экспрессии гибридного оперона ригН'-1ае2 увеличивается драматически (в 210 раз), что существенно превышает сумму эффектов этих мутаций в отдельности. Таким образом, максимальный уровень дерепрессии риг-оперона обеспечивается только при одновременном устранении негативной регуляции под действием белка РиЛ и удалении терминатора транскрипции в лидерной области оперона.

1.6. Изучение влияния внутреннего Шю-иезависимого терминатора транскрипции на экспрессию дистальных генов риг-оперона.

Анализ нуклеотидной последовательности генов рцг-оперона позволяет выявить наличие потенциального Шю-независимого терминатора транскрипции, локализованного между генами ригР и ригМ (ТР.М) (рис. 1), однако какие-либо данные о функциональной значимости этого терминатора транскрипции в литературе отсутствуют. Поэтому мы предприняли получение прецезионной делеции (4ТР.М) полностью удаляющей терминатор транскрипции в межгенном участке ригР-ригМ рнг-оперона в составе хромосомы штамма В. зиЬШз Ми8и5иб. Для изучения влияния делеции ДТР.М на экспрессию дистальных генов риг-оперона были сконструированы транскрипционные фьюзы последнего гена ригО с реперным геном 1ас2. Аналогичным образом была сконструирована изогенная пара штаммов, содержащая описанную выше делецию ДТ/ в лидерной области риг-оперона. У полученных изогенных штаммов определяли активность Р-галактозидазы на различных стадиях роста бактериальных культур (Таблица 2).

Таблица 2.

Активность р-галактозидазы в бесклеточных экстрактах штаммов, содержащих транскрипционные фьюзы ригй-1ас2.

Генотип Активность ß-галактозидазы*

2.5 ч 6ч 24 ч

Дикий тип 160±15 (1) 254±28 (1) 73±10 (1)

ДТ F.H 220±20 (1.4) 516±60 (2) 224±25 (3)

ДТЛ 1596±120 (1) 1890±130 (1) 1202±120 (1)

ДТд ДТ F-M 2289±160 (1.4) 3246±200 (1.7) 2925±200 (2.4)

*В скобках приведена кратность увеличения активности фермента у штаммов, содержащих делецию ДТ FM относительно штаммов дикого типа.

Как следует из данных, представленных в таблице 2, удаление терминатора транскрипции TF.M приводит к одинаковому примерно 1,5-кратному усилению экспрессии дистального гена purD у бактерий, находящихся в логарифмической стадии роста как у штамма, содержащего лидерную область риг-оперона дикого типа, так и у штамма с делецией ДТ£. На стационарной стадии роста позитивный эффект удаления терминатора ДТ F-м на экспрессию дистального гена purD проявляется еще сильней, что выражается в 2,5-3-х кратном повышении уровня активности ß-галакгозидазы у соответствующих штаммов (Табл. 2).

2. Особенности структурно-функциональной организации лидерной области гена pbaE Bacillus subtilis и его регуляции.

Ген pbuE В. subtilis кодирует синтез трансмембранного белка, ответственного за транспорт из клетки пуриновых оснований и локализуется на 53.50° хромосомной карты. Первоначально было показано, что экспрессия гена pbuE возрастает при добавлении в среду пуриновых оснований, в частности, гуанина и гипоксантина, однако механизм этой регуляции оставался неясным.

Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной мРНК генов хр! и рЬиЕ обнаруживает большую гомологию (рис. 7), особенно в участках, расположенных между шпильками и выявляет возможность формирования трех потенциальных шпилечных структур (Р1/РГ, Р2/Р2' и РЗ/РЗ') - рис. 8.

xpt

Р2* РЗ РЗ' РГ

-<¡0 . -so

Рисунок 7. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерных областей мРНК генов

xpt и pbuEB. subtilis.

Выделены три потенциальные шпилечные структуры (Р1/РГ, Р2/Р2' и РЗ/РЗ'). Гомологичные основания подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены основания, в которых были получены мутации, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена, начиная со стартов транскрипции генов xptnpbuE.

QUCu U А сО„ 40О ___ С Р' АСС

и AACUffiil I_I GUCCU. .А

AAU р2 ,А А , *АА

UA- и

U-A U-0

P1 G - С и - А

U - А Q-C

и - А 80-U - А 5'ррр AGCUAUUAUCAC

AAU^U UUUUtUGUAÄUCAGOAUUUUUUUU—1>

«g<*uuugagg'

UAAU

«ouGU4

P2 A. 20 aUA-u-P1G-u-

5'ppp AGCUAUUAUCAC *

UAU U.G U-A 80. G-С uU'Au UA-uU A-U A-U A-U

100

u"CAGGAUUUUUUUU

Рисунок 8. Модель вторичной структуры А-бокса гена рЬиЕ В. зиЫШз.

А. Конфигурация А-бокса в присутствии эффектора - аденина. Терминирующая шпилька разрушена, происходит сквозная транскрипция структурного ттлрЬиЕ.

Б. Формирование терминирующей шпильки в А-боксе в отсутствии аденина. Транскрипция структурного гена рЬиЕ заблокирована. Рамками выделены основания, в которых были получены мутации.

Более того, выяснилось, что лидерная мРНК гена рЬиЕ также выполняет сенсорную функцию, но, в отличие от в-бокса гена хр1, эффектором этой мРНК служит не гуанин или

гипоксантин, а аденин, поэтому аптамерный участок лидерной мРНК гена pbuE получил наименование А-бокеа. Другая интересная особенность A-бокса состоит в том, что в присутствии аденина наблюдается не репрессия, а активация транскрипции генаpbuE. Таким образом, если в случае гена хр! добавление экзогенных гуанина и гипоксаптина стабилизирует терминирующую шпильку, то в случае гена рЪчЕ присутствие аденина приводит к такому изменению конформации лидерной области, при которой структура терминатора транскрипции разрушается и обеспечивается сквозная транскрипция структурной части гена. Любопытно, что в областях лидерной мРНК, расположенных между шпильками, нуклеотидные последовательности гуанин-регулируемой xpt мРНК и аденин-регулируемой pbuE мРНК обнаруживаются всего три различия. Примечательно, что одна из замен расположена между шпильками РЗ/РЗ' и Р1/Р1': это основание 75С в гуанин-регулируемой xpt мРНК (G-бокс) и основание 70U в аденин-регулируемой мРНК гена pbuE (А-бокс) - рис. 8. Было высказано предположение, что именно это различие определяет специфичность связывания соответствующих апгамеров с метаболитами-эффекторами, так как гуанин и гипоксантин может спариваться с основанием 75С в G-боксе, тогда как аденин - с основанием 70U в A-боксе в результате классического Уотсон-Криковского взаимодействия. Это предположение подтверждается данными in vitro, согласно которым, константа связывания аденина с мутантным A-боксом резко снижается, а гуанина, напротив, повышается, а также результатами опубликованного рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры A-бокса гена pbuE В. subtilis. Однако, на фенотипическом уровне изменение специфичности A-бокса не проявлялось: введение нуклеотидной замены 70U->C в A-бокс приводило к конститутивной, не регулируемой пуринами экспрессии гена pbuE. Таким образом, механизм функционирования A-бокса in vivo, в частности, вопрос о корреляции между его сенсорными свойствами и способностью модулировать экспрессию тетрЬиЕ, требует дальнейших исследований.

Настоящий раздел посвящен мутационному анализу лидерной области гена pbuE В. subtilis с целью выяснения роли отдельных нуклеотидов в определении специфичности сенсорной мРНК гена pbuE в отношении связывания эффекторов - пуриновых оснований, а также изучения влияния полученных мутаций на экспрессию гена pbuE.

2.1. Определение старта транскрипции гена pbuE

Прежде чем приступить к мутационному анализу лидерной области гена pbuE, необходимо было более точно определить старт транскрипции, так как по литературным его локализация установлена лишь приблизительно. Локализацию сайта инициации транскрипции определяли методом «достройки праймера». Как следует из рис. 9, транскрипция гена pbuE инициируется с нуклеотвда А в положении +1 , а не с нуклеотида А в положении +8 (рис. 7), как это предполагалось ранее.

CT AG J \

A A A

м т

' * A* G

5« С

l# x

# A

T T

A T

С A i С

Рисунок 9. Определение сайта инициации транскрипции методом «достройки праймера» с использованием Р32-меченного праймера Y7.

Стрелкой указан основной транскрипт, образующийся в реакции удлинения праймера.

3.2.2. Влияние пуриновых производных на экспрессию генаpbuE.

Согласно литературным данным, наиболее активным метаболитом-эффектором сенсорной РНК гена pbuE является аналог аденина 2,6-диаминопурин с константой диссоциации 10 нмоль (против 300 нмоль для аденина). Гуанин обнаруживает значительно более низкую константу связывания с А-боксом (порядка 30 мкмоль), а гипоксантин, ксантин и другие аналоги пуриновых оснований вообще не проявляют свойства эффекторов в отношении этой сенсорной РНК. Важно подчеркнуть, что все данные по изучению взаимодействия пуриновых производных с А-боксом были получены в системе in vitro. В связи с этим интересно было изучить влияние потенциальных эффекторов А-бокса на экспрессию гена pbuE в живых клетках. С этой целью были получены транскрипционные фьюзы гена pbuE с реперным геном lacZ с их последующей интеграцией в хромосомный локус атуЕ штамма В. subtilis Mu8u5u6. У полученных штаммов определяли активность |3-галактозидазы в присутствии различных пуриновых производных (рис. 10).

Рисунок 10. Эффект пуриновых оснований и их аналогов на экспрессию гена рЬиЕВ. ¡иЬНШ Условные обозначения: БАР- 2,6-Диаминопурин; Ас1е - Аденин; Нх - Гипоксантин; А1СА11 - 5-Аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид.; А1СА -5-Аминоимидазол-4-карбоксамид; СИ. -Гуанозин; АИ - Аденозин; Ж - Инозин.

Как следует из рис. 10 наиболее выраженный активирующий эффект на экспрессию гена pbuE В. subtilis оказывают 2,6-диаминопурин и аденин (примерно 10-кратное повышение активности по сравнению с базальным уровнем). Добавление аденозина приводит к 5-кратному увеличению экспрессии гена pbuE. Весьма вероятно, что стимулирующее действие аденозина обусловлено его внутриклеточным фосфоролизом до аденина, который является истинным эффектором А-бокса. Еще менее выражен стимулирующий эффект на экспрессию гена pbuE гуанозина, тогда как добавление гипоксантина, инозина или нефосфорилированного предшественника IMP - 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозида (AICAR) вообще никак не сказывается на экспрессии транскрипционного фьюза pbuE-lacZ. Весьма примечателен тот факт, что в отличие от AICAR, его нерибозилированная форма - основание 5-аминоимидазол-4-карбоксамид (AICA) обнаруживает свойства эффектора А-бокса и обусловливает 2,5-кратное увеличение экспрессии гена pbuE. Из этого следует, что, несмотря на то, что AICA представляет собой разомкнутую структуру пуринового кольца, присутствие в его составе дополнительной аминогруппы, видимо, делает его похожим на аденин и обеспечивает возможность связывания с сенсорной РНК.

2.3. Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE

Для выяснения функциональной роли отдельных нуклеотидов лидерной области мРНК гена pbuE был проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE. Нуклеотидные замены были получены в сайтах, расположенных в основании шпилек Р2/Р2' (замены 21С-Ю, 22C-*G) и РЗ/РЗ' (замены 50C->G, 51A-»U) - рис. 8. Кроме того, была получена мутация 70U->C, которая, по имеющимся данным, должна влиять на специфичность связывания А-бокса с аденином в качестве положительного эффектора транскрипции. Следует отметить, что эта нуклеотидная замена, по всей видимости, должна одновременно нарушать спаривание нуклеотидов в основании шпильки, формирующей терминатор транскрипции, и, тем самым, влиять на уровень экспрессии гена pbuE (рис. 8). Поэтому была получена компенсирующая нуклеотидная замена 100А-Ю, которая должна восстанавливать шпилечную структуру терминатора. Полученные мутантные варианты клонировали в составе вектора pDG268 для конструирования транскрипционных фьюзов pbuE-lacZ, а затем интегрировали в хромосомный локус атуЕ штамма В. subtilis Mu8u5u6, как описано в работе.

2.4. Характеристика мутантов, содержащих замены в лидерной области гена pbuE.

У отобранных рекомбинантов, содержащих инсерции транскрипционных фьюзов лидерной области гена pbuE дикого типа и его мутантных вариантов, определяли активность р-галактозидазы в различных физиологических условиях. Результаты этих опытов представлены на рис. 11.

t 200

го

I ISO

8 11)0 31

| so

—

1 11 | rJ

■ A

□ G

□ H

Рисунок 11. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидера pbuE дикого типа и его

мутантных вариантов.

Ночные культуры штамма В. subtUis Mu8u5u6, содержащие в составе хромосомы транскрипционные фьюзы pbuE-lacZ разводились в 50 раз в свежей среде Спицайзена и растили при 37°С до OD600=0.2, затем в соответствующие пробы добавляли пуриновые основания: аденин (А), гуанин (G) и гипоксантин (Н) в концентрации 1мМ и растили еще 2 часа перед определением активности ß-галактозидазы. Активность ß-галактозидазы выражена в единицах Миллера. Приведенные значения активности - средние из 4 независимых определений.

Как следует из данных, представленных на рис. 11, базальный уровень экспрессии транскрипционного фьюза лидера генаpbuE дикого типа с реперным геном lacZ очень низок и активируется более чем в 100 раз при добавлении аденина в среду для роста. Добавление гуанина приводит примерно к 10-кратному увеличению экспрессии pbuE-lacZ, тогда как гипоксантин на экспрессию этой конструкции практически не влияет. У мутантов, содержащих нуклеотидные замены 21C-»G, 22С-Ю (мутант pbuE-Ml) и 50С-Ю, 51А—>U (мутант pbuE-ЪЮ.) наблюдается низкий уровень экспрессии pbuE-lacZ, который не увеличивается при добавлении пуриновых оснований. Из этого следует, что частичное разрушение шпилечных структур Р2/Р2' и РЗ/РЗ' полностью инактивирует сенсорные свойства лидерной РНК в отношении пуринов. Этот результат подтверждает модель трехмерной структуры А-бокса, согласно которой формированию домена, ответственного за связывание аденина предшествует взаимодействие шпилечных структур Р2/Р2' и РЗ/РЗ'.

Присутствие в лидерной области нуклеотидной замены U70—»C (мутант pbuE-МЗ) приводит к конститутивной экспрессии pbuE, причем добавление пуринов уже практически не сказывается на уровне активности мутантного фьюза (рис. 11), что подтверждает данные работы. Как уже отмечалось выше, конститутивная экспрессия этого мутанта, вероятней всего, обусловлена частичным разрушением терминирующей шпильки.

Особый интерес представляет результат внесения на фоне мутации U70—>С дополнительной замены А100—>G (мутант pbuE-М5) в левом плече терминатора транскрипции (рис. 8). Как следует из рис. 11, именно у двойного мутанта наблюдается изменение специфичности связывания А-бокса с пуриновыми основаниями - вместо аденина

(у дикого типа) активатором экспрессии становится гуанин. Таким образом, специфичность связывания сенсорной РНК pbuE с аденином действительно определяется присутствием основания U в положении 70, и, вероятней всего, обусловлена предсказанным Уотсон-Криковским взаимодействием эффектора аденина с урацилом в А-боксе. Замена U70—>С нарушает это взаимодействие и меняет специфичность узнавания сенсорной РНК метаболита-эффектора, но фенотипическое проявление изменения специфичности сенсорной РНК pbuE наблюдается только на фоне дополнительной нуклеотидной замены А100—Ю, которая восстанавливает шпилечную структуру терминатора транскрипции (рис. 8).

3. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR (акадезина) - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.

Как уже отмечалось выше риг-оперон В. subtilis кодирует ферменты синтеза IMP -главного промежуточного соединения при биосинтезе пуриновых нуклеотидов. В результате реакции на восьмом этапе пути биосинтеза пуринов (рис. 12) образуется 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно - АИКАР (AICAR), который так же известен под названием «акадезин» (acadesine). Впоследствии выяснилось, что это соединение обладает высочайшим потенциалом для терапии различных социально-значимых заболеваний. Соответственно создание штамма-продуцента, обеспечивающего накопление AICAR в культуральной жидкости (КЖ), в концентрации достаточной для дальнейшего производства лекарственной субстанции, является интересной и весьма актуальной задачей.

Целью этого раздела является получение штамма-продуцента AICAR путем направленной реконструкции пуринового метаболизма у В. subtilis.

На первом этапе работы по получению штамма-продуцента AICAR необходимо было обеспечить максимальную экспрессию генов /?иг-оперона путем устранения его негативной регуляции под действием белка-репрессора PurR и терминатора транскрипции в лидерной области оперона. После этого в геноме полученного штамма была получена делеция гена ригН, кодирующего синтез фермента AICAR трансформилазы/IMP циклогидролазы. Инактивация этого фермента должна обеспечивать внутриклеточное накопление AICAR (рис. 12).

R-5-P — - PRPP IMP

\т

PRA FAICAR

GAR AICAR-P-

| portV I ригв

FGAR SAICAR

putQL f putC

Рисунок 12. Схема биосинтеза AICAR. 16

Аббревеатура: R-5-P - рибозо-5'-фосфат, PRPP - 5'-фосфорибозил-1-пирофосфат, PRA - 5'-фосфорибозиламин, GAR - 5'-фосфорибозилглицинамид, FGAR - 5'-фосфорибозил-Ы-формилглицинамид, FGAM - 5'-фосфорибозил-М-формилглицинамид, AIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол, CAIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат, SAICAR - 5'-фосфорибозил-4(Ы-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол, AICAR-P - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол, FAICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол, IMP - инозин-5'-монофосфат, AICAR - 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид.

На следующем этапе работы необходимо было увеличить пул основного предшественника синтеза пуринов de novo - PRPP. Синтез PRPP осуществляется из рибозо-5-фосфата под контролем фермента PRPP-синтазы, кодируемой геном prs. Активность этого фермента подвержена аллостерической регуляции с участием пуриновых нуклеотидов. Структурно-функциональная организация PRPP-синтазы, более детально изучена у бактерий Е. coli, у которых получен мутантный вариант этого фермента со снятой аллостерической регуляцией. Учитывая эти данные, был проведен сайт-направленный мутагенез гена prs Е. coli для получения мутантного фермента со снятым ретроингибированием пуриновыми нуклеотидами с целью его последующего переноса в клетки В. subtilis.

Еще одним препятствием для усиления продукции AICAR является наличие аллостерической регуляции у первого фермента собственно пуринового биосинтеза -глютaмин-PRPP-aминoтpaнcфepaзьr, кодируемой геном purF. Известно, что глютамин-PRPP-аминотрансфераза из Е. coli, в отличие от соответствующего фермента В. sublilis, не подвержена инактивации в стационарной стадии роста бактерий. Кроме того, у Е. coli описан мутантный вариант этого фермента, устойчивый к ингибированию пуриновыми нуклеотидами. Поэтому и в этом случае было решено использовать модифицированный с помощью сайт-направленного мутагенеза фермент глютамин-РРРР-аминотрансферазы из Е. coli с целью его последующего переноса в клетки В. subtilis. Для обеспечения оптимальной экспрессии клонированных из Е. coli модифицированных генов prs и purF в клетках В. sublilis на основе плазмиды pDG268 был сконструирован экспрессионный интегративный вектор, содержащий сильный промотор гена rpsF, кодирующего синтез рибосомного белка S6. Наконец, на последнем этапе работы после клонирования генов prs и purF под контролем промотора гена rpsF в составе полученного вектора, была проведена его интеграция в хромосому штамма-продуцента AICAR В. subtilis. В итоге работы получен штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в КЖ.

3.1. Определение продуктивности штаммов в отношении накопления AICAR

Для оценки продуктивности полученных в ходе работы штаммов в отношении накопления AICAR проводились опыты по ферментации. Результаты этих опытов суммированы на рис. 13.

Как следует из данных, представленных на рис. 13, исходный штамм АМ732 практически совсем не накапливает AICAR. Только после внесения в геном этого штамма делеции теяаригН (штамм АМ793) наблюдается незначительное (<1 г/л) накопление AICAR

в КЖ. Внесение мутаций purRr.neo и ATL (штамм АМ778), обеспечивающих полную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов, приводит к существенному увеличению накопления AICAR до 4-5 г/л.

Штамм Накопление AICAR в КЖ (г\л)

АМ732 (дикий тип) <0.0001

АМ793 JpnrH 0.5-0.8 1

АМ778 purR::veo ATl ЛритН 4-5 1

АД-IS 11 pwR::moATLApwHawrE::[PmF-prsz] 7-S

AMS13 purR::neo¿TiApurHamvE::{P^>-piirFi] 9-10 1

AMS15 purRr.nto ATl ApurHamE::[Pmf-prsE-pmF£\ 11-13

Рисунок 13. Схема конструирования штаммов-продуцентов с указанием их продуктивности в отношении накопления AICAR

Дальнейшее почти двухкратное увеличение продуктивности наблюдается у штаммов АМ811 и АМ813, в клетках которых экспрессируется один из мутантных десенсибилизированных белков Е. coli - PRPP-синтаза (ген prs) или глютамин-PRPP-аминотрансфераза (ген purF), соответственно.

Максимальное накопление AICAR до 11-13 г/л обнаруживается у штамма АМ815, характеризующегося полной дерепрессией ферментов биосинтеза пуринов и одновременно содержащего модифицированные гены prst и pur Fe под контролем промотора PrpSF-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Главным итогом настоящей работы является установление важной роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма.

Результаты мутационного анализа структурно-функциональной организации лидерной области риг-оперона и данные in vitro позволяют сделать заключение о том, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффектороми гуанином и гипоксантином, как это было показано ранее на модели xpt-pbuX-оперона В. subtilis. Полученные экспериментальные данные подтверждают модель регуляции риг-оперона, приведенную на рис. 3, согласно которой, связывание пуриновых оснований стабилизирует шпилечную структуру Р:Р' и, тем самым, способствует образованию шпильки Т:Т', формирующей типичный Rho-независимый терминатор транскрипции. Интересно отметить, что, несмотря

на некоторые различия в нуклеотидном составе О-бокса пуриновых сенсорных РНК риг- и дгр/-р6«Л_-оперонов В. 5иЬШи, в качестве наиболее эффективного метаболита-эффектора в обоих случаях выступает гуанин, а не гипоксантин. Общий план расположения нуклеотидных мотивов, формирующих альтернативные шпилечные структуры в процессе фолдинга сенсорных РНК этих оперонов, также обнаруживает большое сходство. Кроме того, полученные нами данные хорошо согласуются с результатами рентгенострукгурного анализа О-бокса хрГ-рбиХ-оперона В. шЫШя, в соответствии с которыми метаболит-связывающий «карман» О-бокса формируется за счет водородных связей гуанина с нуклеотидами Ш2, и47, Ш1 и С74 (рис. 14).

Взаимодействие гуанина (обозн. голубым) с «карманом» из консервативных пиримидиновых остатков (обозн. зеленым). Лиганд взаимодействует с РНК в основном через водородные связи (обозн. черным пунктиром) между пиримидинами 51 и 74.

Полученные нами нуклеотидные замены именно в этих положениях лидерной РНК риг-оперона U47-»C (мутант АМ612-М2) и U51-»C (мутант АМ612-М4) сопровождались практически полной потерей чувствительности к гуанину как в опытах in vivo (рис. 5), так и in vitro (рис. 6). В то же время расположенные рядом нуклеотидные замены А44—>G, Т48—>С и С53—>Т не приводили к существенному изменению регуляции риг-оперона.

Еще более выраженный гуанин-независимый фенотип обнаруживал мутант АМ612-М6, содержащий замену С76—>U. По своей функциональной значимости этот цитозин в положении 76 риг-оперона, по-видимому, идентичен цитозину в положении 74 xpt-pbuX-оперона (рис. 14), которому приписывают ключевую роль в распознавании и связывании соответствующей сенсорной РНК с метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксантином. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что изученная нами лидерная область рмг-оперона, несмотря на некоторые различия в первичной структуре, по своей структурно-функциональной организации и специфичности связывания с метаболитами-эффекторами мало отличается от детально исследованной сенсорной РНК, кодируемой xpt-рбиХ-опероном.

При выяснении вопроса об относительной роли регуляции рыг-оперона, действующей на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, и контроля его экспрессии на уровне терминации транскрипции посредством сенсорной РНК, мы показали,

Рисунок 14. Взаимодействие гуанина с метаболит-связывающим «карманом» G-6oKcaí-/)/-p¿íii'-onepoHa В. subtilis

что их взаимодействие носит сложный характер и, по всей вероятности, определяется соотношением внутриклеточных пулов адениновых и гуаниновых нуклеотидов. В наших опытах при устранении РшИ-регуляции мы наблюдали примерно 17-кратное усиление экспрессии риг-оперона. В то же время, удаление терминатора транскрипции в лидерной области риг-оперона приводило к 9-кратному увеличению уровня его экспрессии, что свидетельствует о важной роли пула гуаниновых производных в регуляции. Однако удаление обоих регуляторных элементов вызывало ярко выраженный синергидный эффект: экспрессия оперона возрастала более чем в 200 раз. Эта данные свидетельствуют, с одной стороны, о мощном биосинтетическом потенциале рнг-оперона, а с другой - о наличии в клетках дикого типа строгого баланса между пулами нуклеотидов, обеспечивающего гибкую регуляции экспрессии рмг-оперона.

Наконец, сама по себе структурная организация /шг-оперона также требует специального обсуждения. Даже при беглом анализе структуры этого оперона обращает на себя внимание то обстоятельство, что структурный ген ригЕ, ответственный за первую стадию биосинтеза пуринов расположен примерно в середине оперона, тогда как ген ригй, контролирующий следующую стадию биосинтеза занимает самое дистальное положение. Более того, между этими генами располагается внутренний Юю-независимый терминатор транскрипции (Т г-м), присутствие которого должно еще больше усиливать дисбаланс в уровне синтеза первого и второго ферментов биосинтеза пуринов. Действительно, мы получили экспериментальное подтверждение, что удаление этого терминатора приводит к существенному усилению экспрессии дистального генаригй.

Что касается изучения роли сенсорной РНК в регуляции гена рЬиЕ В. .чиЫИ'и, то проведенный нами мутационный анализ лидерной области этого гена подтверждает описанную в литературе трехмерную модель структурно-функциональной организации А-бокса. Не вызывает сомнения, что связывание пуриновых оснований с сенсорной РНК приводит к ее конформационному переходу из одного альтернативного состояния (терминатор) в другое (антитерминатор). Вместе с тем, динамика этого перехода и реализация изменения конформации сенсорной РНК на уровне экспрессии гена рЬиЕ остается не до конца понятной. В работе, посвященной изучению кинетических характеристик комплекса РНК А-бокса с аденином, показано, что на процесс разрушения терминатора и формирования антитерминирующей структуры под действием аденина влияют такие параметры, как концентрация нуклеозидгрифосфатов, скорость элонгации РНК-полимеразы, наличие транскрипционных пауз в структуре А-бокса, а также, возможно, присутствие белков, модулирующих процесс элонгации транскрипции. Вероятно, с этой множественностью регуляции экспрессии гена рЬиЕ связаны некоторые различия

полученных нами результатов с опубликованными данными. Так, например, по литературным данным, константа связывания гуанина с РНК A-бокса почти на три порядка ниже, чем у аденина и, в соответствии с этим, не наблюдается усиление экспрессии гена pbuE in vivo в присутствии гуанина. В то же время, в наших опытах экзогенный гуанин вызывал достаточно выраженное (10-кратное) усиление экспрессии конструкции pbuE-lacZ, содержащей A-бокс дикого типа (рис. 11), что, впрочем, согласуется с данными других работ.

Наконец, на последнем этапе работы в результате проведенных исследований на основе бактерий В. subtilis получен штамм-продуцент AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. Стратегия получения штамма-продуцента AICAR основана на направленной реконструкции пуринового метаболизма В. subtilis. Следует отметить, что примерно такая же стратегия уже применялась для создания штаммов-продуцентов инозина на модели В. subtilis.

На первом этапе работы в геном бактерий была внесена инсерция в гене purR, кодирующем синтез белка-репрессора риг-оперона и получена делеция терминатора транскрипции в лидерной области рн/--оперона, что обеспечило максимальную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов de novo. По имеющися данным в литературе, присутствие такого рода мутаций в геноме В. subtilis обеспечивало накопление инозина в культуральной жидкости до 6 г/л. Затем в геноме бактерий была получена делеция генаригН, кодирующего синтез фермента AICAR трансформилазы/IMP циклогидролазы. Инактивация этого фермента нарушает реакцию превращения AICAR в IMP и приводила к его накоплению в клетке до 4-5 г/л, что примерно соответствует уровню накопления инозина, описываемому в литературе.

На следующем этапе работы мы применили полностью оригинальный подход, основанный на введении в клетки бацилл модифицированных гетерологичных генов пуринового биосинтеза из Е. coli. При этом предварительно был проведен сайт-направленный мутагенез генов prs и purF Е. coli, кодирующих ключевые ферменты синтеза предшественников пуринов с целью получения их мутантных вариантов со снятым ретроингибированием пуриновыми нуклеотидами. Наконец, на последнем этапе работы была осуществлена интеграция модифицированных генов prs и purF Е. coli в хромосому В. subtilis под контролем сильного промотора, обеспечивающего высокий уровень их экспрессии в клетках В. subtilis. В итоге работы получен штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в КЖ.

В заключение, следует отметить, что совсем недавно появилось сообщение о том, что AICAR успешно прошел вторую стадию клинических испытаний в качестве

противоракового препарата. Показан положительный эффект А1САК при лечении пациентов, страдающих хронической лимфоцитарной лейкемией, множественной миеломой и лимфомой из клеток мантийной зоны. Сконструированный в настоящей работе штамм-продуцент АЮАЯ может послужить основой для разработки промышленного микробиологического производства этого соединения.

Выводы:

1. Выявлена роль двух Rho-незавнснмых терминаторов транскрипции, один из которых расположен в лидерной области, а второй - в межгенном участке purF-purM, в регуляции экспрессии риг-оперона. Установлено, что максимальная экспрессия риг-оперона достигается при делетировании обоих терминаторов транскрипции и регуляторного гена purR.

2. Методом сайт-направленного мутагенеза изучена структурно-функциональная организация лидерной области pw-оперона В. subtilis. Установлено, что помимо негативного контроля с участием белка-репрессора PurR, регуляция экспрессии этого оперона осуществляется на уровне терминации транскрипции с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффектороми гуанином и гипоксантином.

3. Проведен мутационный анализ лидерной области гена pbtiE В. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Установлено, что лидерная область гена pbuE кодирует специфическую сенсорную РНК. Показано, что главными низкомолекулярными эффекторами этой сенсорной РНК являются пуриновые основания аденин и диаминопурин, добавление которых в среду приводит к усилению экспрессии гена pbuE.

4. Показано, что присутствие в консервативной области лидерной РНК гена pbuE (А-бокс) двух нуклеотидных замен 70U-»C и Al 00-Ю приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин. Подтверждена трехмерная модель структурно-функциональной организации A-бокса гена pbuE В. subtilis.

5. Проведена реконструкция пуринового метаболизма у штамма В. subtilis, направленная

на сверхпродукцию AICAR клетками бактерий. Полученный в результате проведенных генетических манипуляций штамм В. subtilis накапливает 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю. и др. Мутации, приводящие к изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геном pbuE Bacillus sublilis. // Генетика. 2007. Т. 43. №6. С. 859-864.

2. Миронов A.C. и Лобанов К.В. (2007) Сенсорные РНК и их роль в регуляции экспрессии генов. В кн. Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня (Бреслеровские чтения II), ред. В.А. Ланцов, изд. ПИЯФ РАН (Гатчина.Санкт-Петербург), стр.278-298.

3. Миронов A.C., Прошкин С.А., Лобанов К. В., Лосева С.А. «Регуляторные РНК прокариот». Материалы пятого съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров Москва, 21-27 июня 2009 г., С.34.

4. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю. и др. Мутационный анализ лидерной области пуринового оперона Bacillus sublilis //Генетика. 2011. Т.47. №7. С. 890-899.

5. Лобанов КВ., Эрраис Лопес Л., Королькова Н.В. и др. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR -нового препарата широкого терапевтического применения // Acta Naturae. 2011. Т.З. №2(9). С. 83-93.

Подписано в печать:

01.09.2011

Заказ № 5828 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лобанов, Константин Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Пуриновый метаболизм у Bacillus subtilis и его регуляция. стр.

1.1.1. Синтез пуриновых нуклеотидов de novo. стр.

1.1.2. Ферменты, участвующие в процессе биосинтеза IMP de novo. стр.

1.1.3. Генетический контроль биосинтеза пуринов у В. subtilis. стр.

1.1.4. Регуляция экспрессии генов пуринового метаболизма у В. subtilis. стр.

1.2. Регуляция экспрессии генов с участием сенсорных РНК. стр.

1.2.1. Структурная организация сенсорных РНК. стр.

1.2.2. Механизмы регуляции экспрессии генов с участием сенсорных РНК. стр.

1.2.3. Классификация сенсорных РНК. стр.

1.2.4. Пуриновые сенсорные РНК. стр.

1.2.4.1. Структура аптамерного домена пуриновых сенсорных РНК. стр.

1.2.4.2. Гуаниновая и адениновая сенсорная РНК: похожие аптамеры, но различные лиганды. стр.

1.2.4.3. Разновидности 2 ’-дезоксигуанозин-специфичных сенсорных

I РНК. стр.

1.2.4.4. PreQi (7-аминометил-7-дезазагуанин) сенсорные РНК. стр.

1.2.4.5. Комплексные функции и применение пуриновых сенсорных РНК. стр.

1.2.4.5.1. Тандемное действие гуанинового аптамера и элемента ykkC. стр.

1.2.4.5.2. Кинетические и термодинамические аспекты функционирования сенсорных РНК. стр.

1.2.4.5.3. Гуаниновые сенсорные РНК как потенциальные антибактериальные мишени. стр.

1.3. AICAR как ре1улятор клеточного метаболизма. стр.

1.3.1. Метаболическая регуляция с участием AICAR в клетках животных. стр.

1.3.2. Роль AICAR в метаболизме бактерий. стр.

1.3.3. Участие AICAR в регуляции метаболизма дрожжей. стр.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. стр.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды. стр.

2.2. Среды и условия культивирования. стр.

2.3. Выделение ДНК В. subtilis. стр.

2.4. Манипуляции с плазмидной ДНК. стр.

2.5. Препараты ферментов. стр.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). стр.

2.7. Выделение и очистка продуктов ПЦР.). стр.

2.8. Сайт-направленный мутагенез. стр.

2.9. Получение мутаций в лидерной области риг-оперона. стр.

2.10. Конструирование транскрипционных фъюзов purE-lacZ. стр.

2.11. Конструирование транскрипционных фъюзовpurH-lacZ. стр.

2.12. Получение делеции терминатора транскрипции в лидерной области гг/г-оперона. стр.

2.13. Транскрипция in vitro. стр.

2.14. Определение активности /3-галактозидазы. стр.

2.15. Условия ферментации. стр.

2.16. Определение концентрации AICAR в культуральной жидкости. стр.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ. стр.

3.1. Изучение регуляторных элементов, контролирующих экспрессию пуринового оперона Bacillus subtilis. стр.

3.1.1. Клонирование лидерной области риг-оперона и ее компьютерный анализ. стр.

3.1.2. Сайт-направленный мутагенез лидерной области риг-оперона. стр.

3.1.3. Изучение экспрессии транскрипционных фъюзов purE-lacZe клетках В. subtilis. стр.

3.1.4. Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК риг-оперона. стр.

3.1.5. Синергидный эффект мутации в регуляторном локусе purR и делеции терминатора транскрипции в лидерной области на экспрессию риг-оперона. стр.

3.1.6. Изучение влияния внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции на экспрессию дистальных генов риг-оперона. стр.

3.2. Особенности структурно-функциональной организации лидерной области гена pbuE Bacillus subtilis и его регуляции. стр.

3.2.1. Определение старта транскрипции гена pbuE. стр.

3.2.2. Влияние пуриновых производных на экспрессию гена pbuE. стр.

3.2.3. Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE. стр.

3.2.4. Характеристика мутантов, содержащих замены в лидерной области гена pbuE. стр.

3.3. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR (акадезина) — перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. стр.

3.3.1. Усиление экспрессии риг-оперона В. subtilis. стр.

3.3.2. Получение делеции гена ригН в составе хромосомы В. subtilis. стр.

3.3.3. Конструирование интегративного экспрессионного вектора на основе плазмиды pDG268. стр.

3.3.4. Сайт-направленный мутагенез гена prs Е. coli (prs%). стр.

3.3.5. Сайт-направленный мутагенез гена purF Е. coli (purF^). стр.

3.3.6. Определение продуктивности штаммов в отношении накопления

AICAR. стр.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. стр.

ВЫВОДЫ. стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis"

Актуальность темы

Настоящая работа посвящена изучению роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis. Изучение генетической регуляции пуринового метаболизма направлено на обнаружение молекулярных механизмов, открывающих новые возможности управления генетическими и метаболическими процессами организмов. Конечные продукты - аденозинмонофосфат и гуанозинмонофосфат (АМР и GMP), а также их предшественники и производные, являются не только компонентами нуклеиновых кислот и энергетическими переносчиками, но и выполняют не менее важные функции глобальных регуляторов общего метаболизма. Традиционные способы производства пуринов основаны на их микробиологическом синтезе, который осуществляется генетически модифицированными штаммами — продуцентами. Создание нового поколения высокопродуктивных штаммов требует углубленного понимания процессов генетической регуляции пуринового метаболизма, что является одной из задач настоящего исследования. Объектом исследования избран Bacillus subtilis, микроорганизм, который традиционно служит не только моделью для выявления новых механизмов регуляции биосинтеза пуринов, но и основой для конструирования промышленных продуцентов.

Пуриновый оперон В. subtilis purEKBCSOLFMNHD (далее - риг-оперон) кодирует ферменты синтеза de novo инозинмонофосфата (IMP), общего предшественника пуриновых нуклеотидов АМР и GMP. Известно, что гены пуринового метаболизма у В. subtilis подвержены множественной регуляции на уровне инициации и терминации транскрипции. В случае двух оперонов: риг- оперона и xpt-pbuX, кодирующего синтез ксантинфосфорибозилтрансферазы, показано, что их экспрессия регулируется как на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, так и на уровне терминации транскрипции. На модели этих оперонов был обнаружен необычный метаболит-зависимый механизм аттенуации транскрипции: при добавлении в ростовую среду оснований гипоксантина и гуанина их транскрипция терминируется перед первыми структурными генами, тогда как в их отсутствии транскрибируется полный оперон. Как выяснилось позднее, влияние пуринов, на процесс терминации транскрипции осуществляется посредством нового механизма регуляции активности генов с участием так называемых сенсорных РНК, который был впервые обнаружен в лаборатории биохимической генетики ФГУП ГосНИИгенетика на модели рибофлавинового и тиаминового оперонов у В. знЫШб. Такие сенсорные РНК, расположенные в лидерной области мРНК бактериальных оперонов, получили наименование «рибопереключателей» (пЬоэхуйсЬ), так как в результате прямого взаимодействия со специфическим метаболитом они способны модулировать экспрессию прилегающих генов, включая или выключая их экспрессию на уровне терминации транскрипции или инициации трансляции. •

К настоящему моменту выяснилось, что лидерные области ряда генов пуринового метаболизма у В. БиЪИШ, включая рмг-оперон, хр^рЬиХ-оперон и ген рЬиЕ, кодирующий трансмембранный белок, ответственный за транспорт, пуринов из клетки, содержат консервативную последовательность, получившую наименование О-бокс, которая способна выступать в качестве сенсора пуриновых оснований, а также расположенный- за ней классический Шю-независимый терминатор транскрипции. В' то же время, детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области риг-оперона В. 8иЬИИя, позволяющего выяснить роль кодируемой этой областью сенсорной РНК в регуляции экспрессии риг-оперона, не проводилось. Кроме того, оставалась неясной роль внутреннего Ию-независимого терминатора транскрипции, расположенного в межгенном участке ригР-ригМ /?мг-оперона, в координации синтеза предшественников пуриновых нуклеотидов.

Изучение механизмов регуляции риг- оперона и других генов, вовлеченных в метаболизм пуринов, имеет и важный практический аспект, поскольку некоторые промежуточные соединения, образующиеся в процессе биосинтеза пуринов, обладают рядом чрезвычайно важных положительных качеств. В частности, 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно - AICAR (также известный как акадезин), который образуется в процессе биосинтеза пуринов de novo у В. subtilis, является активатором аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (АМРК), которая, в свою очередь, является глобальным регулятором метаболических процессов, обеспечивающих энергетический статус эукариотических организмов. В настоящее время проводится ряд клинических исследований препаратов на основе акадезина, результаты которых дают обнадеживающие положительные данные, в области борьбы с.хронической лимфоцитарной лейкемией В-клеток, лечения метаболического синдрома и кардиохирургии. В связи с этим, получение высокоактивного штамма-продуцента AICAR на основе генетически модифицированных бактерий с измененной регуляцией генов пуринового метаболизма представляется весьма актуальной практической задачей для разработки процесса дешевого микробиологического синтеза AICAR.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение механизма регуляции метаболизма и транспорта пуринов у В. subtilis с участием* сенсорных РНК и создание на этой основе штамма-продуцента AICAR - перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.

В процессе работы были решены следующие задачи:

1. Проведение детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области /?мг-оперона В. subtilis и выявление регуляторных элементов, участвующих в контроле экспрессии этого оперона.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате детального» анализа структурно-функциональной организации лидерной области /змг-оперона В. subtilis, впервые показано, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксантином. Впервые показано, что уровень экспрессии четырех дистальных генов pwr-оперона (purMNHD) подавляется более чем в 2 раза в результате действия Rho-независимого терминатора транскрипции расположенного в межгенном участке purF-purM.

На основании мутационного анализа лидерной области гена pbuE В. subtilis, впервые показано, что присутствие в консервативной области лидера (A-бокс) двух нуклеотидных замен 70U—»С и А100—»G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин.

Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутантных вариантов лидерной области риг-оперона В. subtilis и лидерной области гена pbuE В. subtilis с нуклеотидными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области, а также для конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов.

Сконструирован высокоактивный штамм-продуцент, накапливающий 1113 г/л AICAR в культуральной жидкости. Полученный штамм может послужить основой для промышленного микробиологического синтеза AICAR — перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Лобанов, Константин Владимирович

ВЫВОДЫ:

1. Выявлена роль двух Rho-независимых терминаторов транскрипции, один из которых расположен в лидерной области, а второй - в межгенном участке purF-purM, в регуляции экспрессии рмг-оперона. Установлено, что максимальная экспрессия /?«г-оперона достигается при делетировании обоих терминаторов транскрипции и регуляторного гена purR.

2. Методом сайт-направленного мутагенеза изучена структурнофункциональная, организация лидерной области риг-оперона В. subtilis. Установлено, что помимо негативного контроля с участием белка-репрессора PurR, регуляция экспрессии этого оперона осуществляется на уровне терминации транскрипции с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими' метаболитами-эффектороми гуанином и гипоксантином.

3. Проведен мутационный анализ лидерной области гена pbuE В. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Установлено, что лидерная область гена pbuE кодирует специфическую сенсорную РНК. Показано, что главными низкомолекулярными эффекторами, этой сенсорной РНК являются пуриновые основания* аденин и диаминопурин, добавление которых в среду приводит к усилению -экспрессии гена pbuE.

4. Показано, что присутствие в консервативной области лидерной РНК гена pbuE (A-бокс) двух нуклеотидных замен 70U—»С и А100—*G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин. Подтверждена трехмерная модель структурно-функциональной организации A-бокса гена pbuE В. subtilis.

5. Проведена реконструкция пуринового метаболизма у штамма В. subtilis, направленная на сверхпродукцию AICAR клетками бактерий.

Полученный в результате проведенных генетических манипуляций штамм В. быЫШб накапливает 11-13 г/л АІСАН в культуральной жидкости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобанов, Константин Владимирович, Москва

1. Buchanan, J.M., Ohnoki, S. and Hong, B. S. 2-Formamido-N-ribosylacetamide 5'-phosphate: 1-glutamine amido-ligase (adenosine diphosphate) // Methods Enzymol. 1978. V.51. PP. 193-201.

2. Messenger, L. J., and Zalkin, H. Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia coli. Purification and properties // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. PP. 3382-3392.

3. Zhou, G., Smith, J. L. and Zalkin, H. Binding of purine nucleotides to two regulatory sites results in synergistic feedback inhibition of glutamine 5-phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. PP. 6784-6789.

4. Krahn, J. M., Kim, J. H., Bums, M*. R., Parry, R. J., Zalkin, H. and Smith, J. L. Coupled formation of an amidotransferase interdomain ammonia channel and a phosphoribosyltransferase active site // Biochemistry. 1997. V. 36. PP. 11061— 11068.

5. Muchmore, C. R., Krahn, J. M., Kim, J. H. Zalkin, H. and Smith., J. L. Crystal structure of glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia coli II Protein Sci. 1998. V.7. PP. 39—51.

6. Zalkin, H., Ebbole, D. Cloning and characterization of a 12-gene cluster from Bacillus subtilis encoding nine enzymes for de novo purine nucleotide synthesis // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. PP. 8274-8287.

7. Gendron, N., Breton, R., Champagne, N., and Lapointe, J. Adenylosuccinate lyase of Bacillus subtilis regulates the activity of the glutamyl-tRNA synthetase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. V. 89. PP. 5389-5392.

8. Gots, J. S., Dalai, F. R., and Shumas, S. R. Genetic separation of the inosinic acid cyclohydrolase-transformylase complex of Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1969. V. 99. PP. 441-449.

9. Aiba, A., and Mizobuchi, K. Nucleotide sequence analysis of genes purH and purD involved in the de novo purine nucleotide biosynthesis of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. PP. 21239-21246.

10. Flannigan, K. A., Hennigan, S. H., Vogelbacker, H. H., Gots, J. S., and Smith, J. M. Purine biosynthesis in Escherichia coli K12: structure and DNA sequence studies of the purHD locus // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. PP. 381—392.

11. Greasley, S. E., Horton, P., Ramcharan, J., Beardsley, G. P., Benkovic, S. J. and Wilson, I. A. Crystal structure of a bifunctional transformylase and cyclohydrolase enzyme in purine biosynthesis // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. PP. 402-406.

12. Wolan, D. W., Cheong, C. G., Greasley, S. E., and Wilson, I. A. Structural insights into the human and avian IMP cyclohydrolase mechanism via crystal structures with the bound XMP inhibitor // Biochemistry 2004.43:1171—1183.

13. Axelrod, H. L., McMullan, D., Krishna, S. S., Miller, M. D., et.al. Crystal structure of AICAR transformylase IMP cyclohydrolase (TM1249) from Thermotoga maritima at 1.88 A resolution.// Proteins. 2008. V. 71. PP. 1042—1049.

14. Kunst, F., Ogasawara, N., Moszer, I. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis //Nature. 1997. V. 390. PP.249-256.

15. Saxild, H. H., and Nygaard, P. Gene-enzyme relationships of the purine biosynthetic pathway in Bacillus subtilis II Mol. Gen. Genet. 1988. V.211. PP. 160—167.

16. Vollmer, S. J., Switzer, R. L. Hermodson, M. A. and Zalkin, H. The glutamine-utilizing site of Bacillus subtilis glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. PP. 10582-10585.

17. Oppenheim, D., and Yanofsky, C. Translational coupling during expression of the tryptophan operon of Escherichia coli II Genetics. 1980. V. 95. PP. 785-795.

18. Petersen, C. Long range translational coupling in the rplJL-rpoBC operon of Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1989. V. 206. PP. 323-332.

19. Zalkin, H., and Ebbole, D. J. Organization and regulation of genes encoding biosynthetic enzymes in Bacillus subtilis II J. Biol. Chem. 1988. V. 263. PP. 15951598.

20. Miyagawa, K., Kimura, H., Nakahama, K., Kikuchi, M., Doi, M., Akiyama,

21. S. and Nakao, Y. Cloning of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene and its application to increased production of guanosine // Nature Biotechnology. 1986. V.4. PP. 225 228.

22. Kanzaki, N.L., and Miyagawa , K. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene //Nucleic Acids Res. 1990.V.18. P. 6710.

23. Mantsala, P., Zalkin, H. Cloning and sequence of Bacillus subtilis pur A and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J Bacteriol. 1992. V. 174(6). PP. 1883-1890.

24. Ebbole, D. J., and Zalkin, H. Interaction of a putative repressor protein with an extended control region of the Bacillus subtilis pur operon // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. PP. 3553-3561.

25. Weng, М., Nagy, P. L. and Zalkin, H. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. PP. 7455-7459.

26. Ogasawara, N., Nakai, S., and Yoshikawa, H. Systematic sequencing of the 180 kilobase region of the Bacillus subtilis chromosome containing the replication origin//DNA Res. 1994. V. l.PP. 1-14.

27. Ebbole, D. J., and Zalkin, H. Bacillus subtilis pur operon expression and regulation //J. Bacteriol. 1989. V. 171. PP. 2136-2141.

28. Shin, B. S., Stein, A. and Zalkin, H. Interaction of Bacillus subtilis purine repressor with DNA// J.' Bacteriol. 1997. V. 179. PP. 7394-7402.

29. Weng, М., and Zalkin, H. Mutations in the Bacillus subtilis purine repressor that perturb PRPP effector function in vitro and in vivo II Curr. Microbiol. 2000. V. 41. PP. 56-59.

30. Kilstrup, M. and Martinussen, J. A transcriptional activator, homologous to the Bacillus subtilis PurR repressor, is required for expression of purine biosynthetic genes in Lactococcus lactis I I J. Bacteriol. 1998. V. 180. PP: 3907— 3916.

31. Nygaard, P. Purine and pyrimidine salvage pathways, p. 359-378. In A. L. Sonenstein, J. A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. ASM Press, Washington D.C. 1993.

32. Amvig,.K., Hove-Jensen, B., and Switzer, R: L. Purification and properties ofphosphoribosyl-diphosphate synthetase from Bacillus subtilis. II Eur. J. Biochem. 1990: V. 192. PP. 195-200.

33. Sinha, S. C., and Smith, J. L. The PRT protein family // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. PP. 733-739.

34. Sinha, S., Krahn, J. М., Shin, B. S., Tomchick, D. R., Zalkin, H. and Smith, J. L. The purine repressor of Bacillus subtilis'. a novel combination of domains adapted for transcription regulation // J. Bacteriol. 2003. V. 185. PP. 4087-4098.

35. Jinsong XUAN, Zalkin Howard & WENG Manli. Mutations in PurBoxl of the Bacillus subtilis pur operon control site affect adenine-regulated expression in vivo II Science in China Ser. С Life Sciences. 2005. V.48. No.2. PP. 133—138.

36. Вега, A. K., Zhu, J., Zalkin, H., Smith, J. L., Functional dissection of the Bacillus subtilis purine operator site // J. Bacteriol., 2003. V. 185(14). PP. 4099— 4109.

37. Browning, D.T. & Busby, S.J. The regulation of bacterial transcription initiation // Nat.Rev. Microbiol. 2004. V.2. PP. 57-65.

38. Yanofsky, C. Attenuation in the control of expression of bacterial operons // Nature. 1981. V. 289. PP. 751-758.

39. Babitzke, P. TRAP, the trp RNA-binding attenuation protein of Bacillus subtilis, is a multisubunit complex that appears to recognize G/UAG repeats in the trpEDCFBA and trpG transcripts // J. Biol. Chem. 1994 V. 269. PP. 16597-16604.

40. Gollnick, P. & Babitzke, P. Posttranscription initiation control of tryptophan metabolism in Bacillus subtilis by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP), anti-TRAP, and RNA structure // J. Bacteriol. 2001. V. 183. PP. 5795-58024.

41. Rutberg, B. Antitermination of transcription of catabolic operons // Mol. Microbiol. 1997 V. 23. PP. 413-421.

42. Grundy, F. & Henkin, T.M. Regulation of gene expression by effectors thatbind to RNA // Curr. Opin. Microbiol. 2004 V. 7. PP. 126-131.

43. Hannon, GJ. RNA interference // Nature 2002 V. 418. PP. 244-251.

44. Gold., L., Polisky, D:, Uhlenbeck, O. & Yarus, M. Diversity ofoligonucleotide functions // Annu. Rev. Biochem. 1995 V. 64. PP. 763-797.

45. Kruger, K., Grabowsri, P.J., Zang, A.J., Sands, J'., Gottschling, D.E. & Cech, T.H. Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal* RNA intervening sequence of Tetrahymena // Cell. 1982 V. 31. PP. 147-157.

46. Ellington, A.D. & Szostak, J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990 V. 346. PP. 818-822.

47. Mironov, A. S., Gusarov, I., Rafikov, R. et al. Sensing small molecules by nascent RNA: a mechanism to control transcription in bacteria // Cell. 2002. V. 111. PP. 747-756.

48. Winkler, W., Nahvi, A., Breaker, R.R. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression // Nature. 2002. V. 419. PP. 952-956.

49. Serganov, A., Patel, DJ. Ribozymes, riboswitches and beyond: regulation of gene expression without proteins //Nat Rev Genet. 2007 V. 8. PP. 776-790.

50. Cromie, M.J., Shi, Y., Latifi, T., Groisman, E.A. An RNA sensor for intracellular Mg2+// Cell. 2006. V.125: PP. 71-84.

51. Dann, C.E., 3rd.,Wakeman, C.A., Sieling, C.L., Baker, S.C., Imov, I., et al. Structure and mechanism of a metal-sensing regulatory RNA// Cell. 2007. V. 130. PP. 878-892.

52. Morita, M.T., Tanaka, Y., Kodama, T.S., Kyogoku, Y., Yanagi, H., et al. Translational induction of heat shock transcription factor sigma32: evidence for a built-in RNA thermosensor // Genes Dev. 1999. V. 13. PP. 655-665.

53. Morita, M., Kanemori, M., Yanagi, H., Yura, T. Heat-induced synthesis of sigma32 in Escherichia coli: structural and functional dissection of rpoH mRNA secondary structure // J Bacteriol. 1999. V. 181. PP. 401-410.

54. Waters, L.S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria // Cell. 2009. V. 136. PP. 615-628.

55. Serganov, A. The long and the short of riboswitches // Curr Opin Struct Biol. 2009. V. 19. PP. 251-259.

56. Dambach, M.D., Winkler, W.C. Expanding roles for metabolite-sensing regulatory RNAs // Curr Opin Microbiol. 2009. V. 12. PP. 161-169.

57. Henkin, T.M. Riboswitch RNAs: using RNA to sense cellular metabolism // Genes Dev. 2008. V. 22. PP. 3383-3390.

58. Henkin, T.M. RNA-dependent RNA switches in bacteria // Methods Mol Biol. 2009. V. 540. PP. 207-214.

59. Grundy, F.J., Henkin, T.M. tRNA as a positive regulator of transcription antitermination in Bacillus subtilis II Cell. 1993. V. 74. PP. 475-482.

60. Loh, E., Dussurget, O., Gripenland, J., Vaitkevicius, K., Tiensuu, T., et al. A trans-acting riboswitch controls expression of the virulence regulator PrfA in Listeria monocytogenes // Cell. 2009. V. 139. PP. 770-779.

61. Winkler, W.C., Breaker, R. Genetic control by metabolite-binding riboswitches // Chembiochem. 2003. V.4. PP. 1024—1032.

62. Garst, A.D., Edwards, A.L., Batey, R.T. Riboswitches: structures and mechanisms // Cold Spring Harb Perspect Biol. 201 l;3:a003533

63. Barrick, J.E., Breaker, R.R. The distributions, mechanisms, and structures of metabolite-binding riboswitches // Genome Biol. 2007.V.8. R239.

64. Gusarov, I., Nudler, E. The mechanism of intrinsic transcription termination // Mol Cell. 1999. V. 3. PP: 495-504.

65. Yamell, W.S., Roberts, J.W. Mechanism of intrinsic transcription termination and antitermination // Science. 1999. V. 284. PP. 611-615.

66. Skordalakes, E., Berger, J.M. Structure of the Rho transcription terminator: Mechanism of mRNA recognition and helicase loading // Cell. 2003. V. 114. PP. 135-146.

67. Sudarsan, N., Barrick, J.E., Breaker, R.R. Metabolite-binding RNA domains are present in the genes of eukaryotes // RNA. 2003 ; V.9. PP. 644-647.

68. Kubodera, T., et al. Thiamine-regulated gene expression of Aspergillus oryzae thiA requires splicing of the intron containing a riboswitchlike domain in the 5'UTR//FEBS Lett. 2003. V. 555. PP. 516-520.

69. Cheah, M.T., Wachter, A., Sudarsan, N., Breaker, R.R. Control of alternative RNA splicing and gene expression by eukaryotic riboswitches // Nature. 2007. V. 447. PP. 497-500.

70. Croft, M.T., Moulin, M.,Webb, M.E., Smith, A.G. Thiamine biosynthesis in algae is regulated by riboswitches // Proc Natl Acad Sci. 2007. V. 104. PP. 2077020775.

71. Bocobza, S., Adato, A., Mandel, T., Shapira, M., Nudler, E., Aharoni, A. Riboswitch-dependent gene regulation and its evolution in the plant kingdom // Genes Dev. 2007. V. 21. PP. 2874-2879.

72. Wachter, A., Tunc-Ozdemir, M., Grove, B.C., Green, P.J., Shintani, D.K., Breaker, R.R. Riboswitch control of gene expression in plants by splicing and alternative 3' processing of mRNAs // Plant Cell. 2007. V. 19. PP. 3437—3450.

73. Borsuk, P., Przykorska, A., Blachnio, K., Koper, M., Pawlowicz, J.M., Pekala, M., Weglenski, P. L-arginine influences the structure and function of arginase mRNA in Aspergillus nidulans // Biol Chem. 2007. V. 388. PP. 135-144.

74. Rodionov, D.A., Vitreschak, A.G., Mironov, A.A., Gelfand, M.S. Comparative genomics of the methionine metabolism in Gram-positive bacteria: a variety of regulatory systems // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. PP. 3340—3353.

75. Andre', G., et al. S-box and T-box riboswitches and antisense RNA control a sulfur metabolic operon of Clostridium acetobutylicum II Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. PP. 5955-5969.

76. Winkler, W.C., Nahvi, A., Roth, A., Collins, J.A., Breaker, R.R. Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme // Nature. 2004. V. 428. PP. 281-286.

77. Brooks, K.M., Hampel, K.J. A rate-limiting conformational step in the catalytic pathway of the glmS ribozyme // Biochemistry. 2009. V. 48. PP. 56695678.

78. Collins, J.A., Imov, I., Baker, S., Winkler, W.C. Mechanism of mRNA destabilization by the glmS ribozyme // Genes Dev. 2007. V. 21. PP. 3356-3368.

79. Breaker, R.R. Riboswitches and the RNA World // Cold Spring Harb Perspect Biol doi: 10.1101/cshperspect.a003566. 2010. Nov 24. PP. 1-15.

80. Meyer, M.M., Hammond, M.C., Salinas, ¥., Roth, A., Sudarsan, N., Breaker, R.R. Challenges of ligand identification for riboswitch candidates // RNA Biol. 2011. V. 8(1). PP. 5-10.

81. Hendrix, D.K., Brenner, S.E., Holbrook, S.R. RNA structural motifs: building blocks of a modular biomolecule // Q Rev Biophys. 2005. V.38. PP. 221-243.

82. Leontis, N.B., Lescoute, A., Westhof, E. The building blocks and motifs of RNA architecture // Current Opinion in Structural Biology. 2006. V. 16. PP. 279287.

83. Batey, R.T., Gilbert, S.D., Montange, R.K. Structure of a natural guanine-responsive riboswitch complexed with the metabolite hypoxanthine // Nature. 2004. V. 432. PP. 411-415.

84. Edwards, A.L., Batey, R.T. A structural basis for the recognition of 2'-deoxyguanosine by the purine riboswitch // J Mol Biol. 2009. V. 385. PP. 938-948.

85. Montange, R.K., Batey, R.T. Structure of the S-adenosylmethionine riboswitch regulatory mRNA element // Nature. 2006. V. 441. PP. 1172-1175.

86. Gilbert, S.D., Rambo, R.P., Van Tyne, D., Batey, R.T. Structure of the SAM1. riboswitch bound to S-adenosylmethionine // Nat Struct Mol Biol. 2008. V. 15. PP. 177-182.

87. Lu, C., Smith, A.M., Fuchs, R.T., Ding, F., Rajashankar, K., Henkin, T.M., Ke, A. Crystal structures of the SAM-III/S(MK) riboswitch reveal the SAM-dependent translation inhibition mechanism // Nat Struct Mol Biol. 2008. V. 15. PP. 1076-1083.

88. Edwards, T.E., Ferre-D’Amare, A.R. Crystal structures of the thi-box riboswitch bound to thiamine pyrophosphate analogs reveal adaptive RNA-small molecule recognition// Structure. 2006. V. 14. PP. 1459—1468.

89. Serganov, A., Polonskaia, A., Phan, A.T., Breaker, R.R., Patel, D.J. Structural basis for gene regulation by a thiamine pyrophosphate-sensing riboswitch // Nature.2006. V. 441. PP. 1167-1171.

90. Thore, S., Leibundgut, M., Ban, N. Structure of the eukaryotic thiamine pyrophosphate riboswitch with its regulatory ligand // Science. 2006. V. 312. PP. 1208-1211.

91. Serganov, A., Huang, L., Patel, D;J. Coenzyme recognition and gene regulation by aflavin mononucleotide riboswitch // Nature. 2009. V. 458. PP: 233237.

92. Cochrane, J.C., Lipchock, S.V., Strobel, S.A. Structural investigation of the GlmS ribozyme bound, to its catalytic cofactor // Chem Biol. 2007. V. 14. PP. 97— 105.

93. Klein, D.J., Ferre'-D’Amare', A.R. Structural basis of glmS' ribozyme activation by glucosamine-6-phosphate // Science. 2006. V. 313. PP. 1752—1756.

94. Kang, M., Peterson, R., Feigon, J. Structural Insights into riboswitch control of the biosynthesis of queuosine, a modified nucleotide found in the anticodon of tRNA // Mol Cell. 2009. V. 33. PP. 784-790.

95. Klein, D.J., Edwards, T.E., Ferre-D’Amare, A.R. Cocrystal structure of a class I' preQl riboswitch reveals a pseudoknot recognizing an essential hypermodified nucleobase // Nat Struct Mol Biol. 2009. V. 16. PP. 343-344.

96. Spitale, R.C., Torelli, A.T., Krucinska, J., Bandarian, V., Wedekind, J.E. The structural basis for recognition of the PreQ0 metabolite by an unusually small riboswitch aptamer domain // J Biol Chem. 2009. V. 284. PP. 11012-11016.

97. Kulshina, N., Baird, N.J., Ferre-D’Amare, A.R. Recognition of the bacterial second messenger cyclic diguanylate by its cognate riboswitch // Nat Struct Mol Biol. 2009. V.16. PP. 1212-1217.

98. Smith, K.D., Lipchock, S.V., Ames, T.D.,Wang, J., Breaker, R.R., Strobel,

99. S.A. Structural basis of ligand binding by a c-di-GMP riboswitch // Nat Struct Mol Biol. 2009. V. 16. PP. 1218-1223.

100. Mandal, M., Boese, B., Barrick, J.E., Winkler, W.C., Breaker, R.R. Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria // Cell. 2003. V. 113. PP. 577—586.

101. Leontis, N.B.,Westhof, E. Geometric nomenclature and classification of RNA base pairs // RNA. 2001. V. 7. PP. 499-512.

102. Batey, R.T., Rambo, R.P., Doudna, J.A. Tertiary Motifs in RNA Structure and Folding // Angew Chem Int Ed Engl. 1999. V. 38. PP. 2326-2343.

103. Holbrook, S.R. Structural principles from large RNAs // Annu Rev Biophys. 2008.37: 445-464.

104. Varani, G. Exceptionally stable nucleic acid hairpins // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1995.24: 379^104.

105. Cate, J.H., Gooding, A.R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B.L., Kundrot, C.E., Cech, T.R., Doudna, J.A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: Principles of RNA packing // Science 1996. V. 273. PP. 1678—1685.

106. Jaeger, L., Michel, F.,Westhof, E. Involvement of a GNRA tetraloop in long-range RNA tertiary interactions // J Mol Biol. 1994. V. 236. PP. 1271—1276.

107. Murphy, F.L., Cech, T.R. GAAA tetraloop and conserved bulge stabilize tertiary structure of a group I intron domain // J Mol Biol. 1994. V. 236. PP. 49-63.

108. Sudarsan, N., Lee, E.R., Weinberg, Z., Moy, R.H., Kim, J.N., Link, K.H., Breaker, R.R. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP // Science. 2008 V. 321. PP. 411-413.

109. Blouin, S., Lafontaine, D.A. A loop loop interaction and a K-tum motif located in the lysine aptamer domain are important for the riboswitch gene regulation control //RNA. 2007. V. 13. PP. 1256—1267.

110. Winkler, W.C., Grundy, F.J., Murphy, B.A., Henkin, T.M. The GA.motif: An RNA element common to bacterial antitermination systems, rRNA, and eukaryotic RNAs//RNA. 2001. V. 7. PP. 1165-1172.

111. Grundy, F.J., Lehman, S.C., Henkin, T.M. The L box regulon: lysine sensing by leader RNAs of bacterial lysine biosynthesis genes // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. PP. 12057-12062.

112. Sudarsan, N., Wickiser, J.K., Nakamura, S., Ebert, M.S., Breaker, R.R. An mRNA structure in bacteria that controls gene expression by binding lysine // Genes Dev. 2003. V. 17. PP. 2688-2697.

113. McDaniel, B.A., Grundy, F.J., Henkin, T.M. A tertiary structural element in S box leader RNAs is required for S-adenosylmethioninedirected transcription termination. Mol Microbiol 2005. V. 57. PP. 1008—1021.

114. Montange, R.K., Batey, R.T. Riboswitches: emerging themes in RNA structure and function // Annu Rev Biophys. 2008. V. 37. PP. 117-133.

115. Gilbert, S.D., Love, C.E., Edwards, A.L., Batey, R.T. Mutational analysis of the purine riboswitch aptamer domain // Biochemistry. 2007. V. 46. PP. 1329713309.

116. Lemay, J.F., Penedo, J.C., Tremblay, R., Lilley, D.M., Lafontaine, D.A. Folding of the adenine riboswitch // Chem Biol. 2006. V. 13. PP. 857-868.

117. Stoddard, C.D., Gilbert, S.D., Batey, R.T. Ligand-dependent folding of the three-way junction in the purine riboswitch // RNA. 2008. V. 14. PP. 675-684.

118. Soukup, G.A. and Breaker, R.R. Relationship between intemucleotide linkage geometry and the stability of RNA // RNA. 1999. V. 5. PP. 1308-1325.

119. Mandal, M., Breaker, R.R. Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator // Nat Struct Mol Biol. 2004. V. 11. PP. 2935.

120. Gilbert, S.D., Mediatore, S.J. and Batey, R.T. Modified pyrimidines specifically bind the purine riboswitch // J. Am.Chem. Soc. 2006. V. 128. PP. 14214-14215.

121. Lemay, J. and Lafontaine, D.A. Core requirements of the adenine riboswitch aptamer for ligand binding // RNA. 2007. V. 13. PP. 339—350.

122. Kim, J.N., Roth, A., Breaker, R.R. Guanine riboswitch variants from Mesoplasma florum selectively recognize 2'-deoxyguanosine // Proc Natl Acad Sci.2007. V. 104. PP. 16092-16097.

123. Kim, J.N., Breaker, R.R. Purine sensing by riboswitches // Biol Cell. 2008.V. 100: PP. 1-11.

124. Famulok, M. Molecular recognition of amino acids by RNA-aptamers: an 1-citrulline binding RNA motif and its evolution into an 1-arginine binder // J. Am. Chem. 1994. V. 116. PP. 1698-1706.

125. Yang, Y., Kochovan, M., Burgstaller, P., Westhof, E. and Famulok, M. Structural basis of ligand discrimination by two related RNA aptamers resolved by NMR spectroscopy // Science. 1996. V. 272. PP. 1343—1347.

126. Thelander, L. and Reichard, P. Reduction of ribonucleotides // Annu. Rev. Biochem. 1979 V. 48. PP. 133-158.

127. Kolberg, M., Strand, K.R., Graff, P. and Andersson, K.K. Structure, function, and mechanism of ribonucleotide reductases // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1699. PP. 1-34.

128. Cech, T.R., Zaug, A.J. and Grabowski, P.J. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor of Tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence // Cell. 1981. V. 27. PP. 487-496.

129. Shu, D. and Guo, P. A viral RNA that binds ATP and contains a motif similar to an ATP-binding aptamer from SELEX // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. PP. 71197125.

130. Mandal, M., Lee, M., Barrick, J.E., Weinberg, Z., Emilsson, G.M., Ruzzo, W.L. and Breaker, R.R. A glycine-dependent riboswitch that uses cooperative binding to control gene expression // Science. 2004. V. 306. PP. 275-279.

131. Sudarsan, N., Hammond, M.C., Block, K.F., Welz, R., Barrick, J.E., Roth, A. and Breaker, R.R. Tandem riboswitch architectures exhibit complex gene control functions // Science. 2006. V. 314. PP. 300—304.

132. Welz, R. and Breaker, R.R. Ligand binding and gene control characteristics of tandem riboswitches in Bacillus anthracis // RNA. 2007. V. 13. PP. 573-582.

133. Edwards, T.E., Klein, D.J., Ferre-D’Amare, A.R. Riboswitches: Small molecule recognition by gene regulatory RNAs // Curr Opin Struct Biol; 2007. V.17. PP. 273-279.

134. Gilbert, S.D., Batey, R.T. Riboswitches: natural SELEXion // Cell Mol Life Sci. 2005. V. 62. PP. 2401-2404.

135. Jenison, R.D., Gill, S.C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA // Science. 1994. V. 263. PP: 1425-1429.

136. Zimmermann, G.R., Jenison, R.D., Wick, C.L., Simorre, J.P., Pardi, A. Interlocking structural motifs mediate molecular discrimination by a theophylline-binding RNA // Nat Struct Biol. 1997. V. 4. PP. 644-649:

137. Zimmermann, G.R., Wick, C.L., Shields, T.P., Jenison, R.D., Pardi, A. Molecular interactions and metal binding in the theophylline-binding core of an RNA aptamer // RNA. 2000. V. 6. PP. 659-667.

138. Williamson, J.R. Induced fit in RNA-protein recognition // Nat Struct Biol. 2000. V.7 PP. 834-837.

139. Wickiser, J.K., Winkler, W.C., Breaker, R.R., Crothers, D.M. The speed of RNA transcription and metabolite binding kinetics operate an FMN riboswitch // Mol Cell. 2005. V. 18. PP. 49-60.

140. Gilbert, S.D., Stoddard, C.D., Wise, S.J., Batey, R.T. Thermodynamic and kinetic characterization of ligand binding to the purine riboswitch aptamer domain // J Mol Biol. 2006. V. 359. PP. 754-768.

141. Wickiser, J.K., Cheah, M.T., Breaker, R.R., Crothers, D.M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch // Biochemistry. 2005. V. 44. PP. 13404-13414.

142. Rieder, R., Lang, K., Graber, D. and Micura, R. Ligand-induced folding of the adenosine deaminase a-riboswitch and implications on riboswitch translational control // Chembiochem. 2007. V. 8. PP. 896-902.

143. Neu, H.C. The crisis in antibiotic resistance // Science. 1992. V. 257. PP. 1064-1073.

144. Gold, H.S. and Moellering, R.C. Antimicrobial-drug resistance // N. Engl. J. Med. 1996. V. 335. PP. 1445-1453.

145. Sudarsan, N., Cohen-Chalamish, S., Nakamura, S., Emilsson, G.M. and Breaker, R.R. Thiamine pyrophosphate riboswitches are targets for the antimicrobial compound pyrithiamine // Chem. Biol. 2005. V. 12. PP. 1325-1335.

146. Blount, K.F. and Breaker, R.R. Riboswitches as antibacterial drug targets // Nat. Biotechnol. 2006. V. 24. PP. 1558-1564.

147. Blount, K.F., Wang, J.X., Lim, J., Sudarsan, N. and Breaker, R.R. Antibacterial lysine analogs that target lysine riboswitches // Nat. Chem. Biol. 2006. V. 3. PP. 44-49.

148. Kim, J.N., Blount, K.F., Puskarz, I., Lim, J., Link, K.H., Breaker, R.R. Design and antimicrobial action of purine analogues that bind Guanine riboswitches //ACS Chem. Biol. 2009. V.4(ll). PP. 915-27.

149. Soukup, J.K., and Soukup, G.A. Riboswitches exert genetic control through metabolite-induced conformational change // Curr Opin Struct Biol. 2004. V. 14. PP. 344-349.

150. Gilbert, W. The RNA world // Nature. 1986 V. 319. P. 618.

151. Jeffares, D.C., Pool, A.M. and Penny, D. Relics from the RNA world // J. Mo.l Evol. 1998. V. 46. PP. 18-36.

152. White, H.D. 3rd. Coenzymes as fossils of an earlier metabolic state // J. Mol. Evol. 1976. V. 7. PP. 101-104.

153. Vitreschak, A.G., Rodionov, D:A., Mironov, A.A., Gelfand, M.S. Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression? // Trends Genet. 2004. V. 20. PPi 44-50.

154. Tucker, B. J. and Breaker, R. R. Riboswitches as versatile gene control elements // Current Opinion in Structural Biology. 2005. V. 15. PP. 342-348.

155. Sullivan, J.E., Brocklehurst, K.J., Marley, A.E., et al. Inhibition of lipolysis and lipogenesis in isolated rat adipocytes with AICAR, a cell-permeable activator of AMP-activated protein kinase // FEBS Lett. 1994. V. 353. PP. 33-36.

156. Karp, P.D., Riley, M., Paley, S.M., Pellegrini-Toole, A. The MetaCyc Database //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30(1). PP. 59-61.

157. Van den Berghe, G., Gruber, H. Method for lowering blood lipid levels. W09303734; 1993.

158. Hardie, D.G., Hawley, S.A., Scott, J.W. AMP-activated protein kinase -development of the energy sensor concept // J Physiol. 2006. V. 574. PP. 7-15.

159. Gruber, H.E., Hoffer, M.E., McAllister, D.R., et al. Increased adenosine concentration in blood from ischemic myocardium by AICA riboside. Effects on flow, granulocytes, and injury// Circulation. 1989. V. 80. PP. 1400-1411.

160. Hardie, D.G. AMP-activated protein kinase: the guardian of cardiac energy status // J Clin Invent. 2004. V. 117. PP. 465-468.

161. Winder, W.W., Hardie, D.G. AMP-activated protein kinase, a metabolic master switch: possible roles in type 2 diabetes // Am J Physiol. 1999. V. 277. PP. 1-10.

162. Schimmack, G., Defronzo, R.A., Musi, N. AMP-activated protein kinase: role in metabolism and therapeutic implications // Diabetes Obes Metab. 2006. V. 8. PP. 591-602.

163. Consoli, A., Nurjhan, N., Capani, F., Gerich, J. Predominant role of gluconeogenesis in increased hepatic glucose production in NIDDM // Diabetes. 1989. V. 38. PP. 550-557.

164. Merrill, G.F., Kurth, E.J., Hardie, D.G., Winder, W.W. AICA riboside increases AMP-activated protein kinase, fatty acid oxidation, and glucose uptake in rat muscle // Am J Physiol. 1997. V. 273. PP. 1107-1112.

165. Kurth-Kraczek, E.J., Hirshman, M.F., Goodyear, L.J., Winder, W.W. 5’ AMP-activated protein kinase activation causes GLUT4 translocation in skeletal muscle // Diabetes. 1999. V. 48. PP. 1667-1671.

166. Narkar, V.A., Downes, M., Yu, R.T., et al. AMPK and PPARdelta agonists are exercise mimetics // Cell. 2008. V. 134. PP. 405-415.

167. Goransson, O., McBride, A., Hawley, S.A., et al. Mechanism of action of A-769662, a valuable tool for activation of AMP-activated protein kinase // J Biol Chem. 2007. V. 282. PP. 32549-32560.

168. Richter, E.A., Kiens, B., Wojtaszewski, J.F. Can exercise mimetics substitute for exercise? // Cell Metab. 2008. V. 8. PP. 96-98.

169. Xiang, X., Saha, A.K., Wen, R., et al. AMP-activated protein kinase activators can inhibit the growth of prostate cancer cells by multiple mechanisms // Biochem Biophys Res Commun. 2004. V. 321. PP. 161-167.

170. Swinnen, J.V., Beckers, A., Brusselmans, K., et al. Mimicry of a cellular low energy status blocks tumor cell anabolism and suppresses the malignant phenotype // Cancer Res. 2005. V. 65. PP. 2441-2448.

171. Rattan, R., Giri, S., Singh, A.K., Singh, I. 5-Aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside inhibits cancer cell proliferation in vitro and in vivo via AMP-activated protein kinase // J Biol Chem. 2005. V. 280. P. 39582-39593.

172. Baumann, P., Mandl-Weber, S., Emmerich, B., et al. Activation of adenosine monophosphate activated protein kinase inhibits growth of multiple myeloma cells // Exp Cell Res. 2007. V. 313. PP. 3592-3603.

173. Garcia-Gil, M., Pesi, R., Pema, S., et al. 5’-aminoimidazole-4-carboxamide riboside induces apoptosis in human neuroblastoma cells // Neuroscience. 2003. V.117. PP. 811-820.

174. Pesi, R., Micheli, V., Jacomelli, G., et al. Cytosolic 5’-nucleotidase hyperactivity in erythrocytes of Lesch-Nyhan syndrome patients // Neuroreport. 2000 V. 11. PP. 1827-1831.

175. Kefas, B.A., Heimberg, H., Vaulont, S., et al. AICA-riboside induces apoptosis of pancreatic beta cells through stimulation of AMP-activated protein kinase // Diabetologia. 2003. V. 46. PP. 250-254.

176. Meisse, D., Van de Casteele, M., Beauloye, C., et al. Sustained activation of AMP-activated protein kinase induces c-Jun N-terminal kinase activation and apoptosis in liver cells // FEBS Lett. 2002. V. 526. PP. 38-42.

177. Campas, C., Lopez, J.M., Santidrian, A.F., et al. Acadesine activates AMPK and induces apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells but not in T lymphocytes // Blood. 2003. V. 101. PP. 3674-3680.

178. Campas, C., Santidrian, A.F., Domingo, A., Gil, J. Acadesine induces apoptosis in B-cells from mantle cell lymphoma and splenic marginal zone lymphoma // Leukemia. 2005. V. 19. PP. 292-294.

179. Lopez, J.M., Santidrian, A.F., Campas, C., Gil, J. 5-Aminoimidazole-4-carboxamide riboside induces apoptosis in Jurkat cells, but the AMP-activated protein kinase is not involved // Biochem J. 2003. V. 370. PP. 1027-1032.

180. Bochner, B.R., Ames, B.N. ZTP (5-amino 4-imidazole carboxamide riboside 5’-triphosphate): a proposed alarmone for 10-formyl-tetrahydrofolate deficiency // Cell. 1982. V. 29. PP. 929-937.

181. Cashel, M. Regulation of bacterial ppGpp and pppGpp // Ann. Rev. Microbial. 1975. V. 29t PP. 301-318.

182. Gallant, J. A. Stringent control in Escherichia coli II Ann. Rev. Genet. 1979 V. 73. PP: 393-415.

183. Udaka, S. and Moyed, H. S. Inhibition of parental and,mutant xanthosine 5’-phosphate aminases by psicofuranine // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. PP. 27972803.

184. Slechta, L. Studies on the mode of action of psicofuranine // Biochem. Pharm. 1960. V.5.PP. 96-107.

185. Dougherty, M.J., Boyd, J.M., Downs, D.M. Inhibition of fructose-1,6-bisphosphatase by aminoimidazole carboxamide ribotide prevents growth of Salmonella enterica pnrH mutants on glycerol // J Biol Chem. 2006 V. 281. PP. 33892-33899.

186. Benkovic, S.J, deMaine, M.M. Mechanism of action of fructose 1,6-bisphosphatase // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1982 V. 53. PP. 45-82.

187. Tejwani, G. A. Regulation of Fructose-Bisphosphatase Activity // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1983. V. 54. PP. 121-194.

188. Pilkis, S., El-Maghrabi, M., Pilkis, J., and Claus, T. Inhibition of fructose-1,6-bisphosphatase by fructose 2,6-bisphosphate // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. PP. 3619-3622.

189. Ke, H., Thorpe, C. M., Seaton, B. A., Lipscomb, W. N., and Marcus, F. Structure refinement of fructose-1,6-bisphosphatase and its fructose 2,6bisphosphate complex at 2.8 A resolution // J. Mol. Biol. 1990. V. 212. PP. 513— 539.

190. Taketa, K., and Pogell, B. M. Allosteric Inhibition of Rat Liver Fructose 1,6-Diphosphatase by Adenosine 5'-Monophosphate // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. PP. 651-662.

191. Ke, H. M., Zhang, Y. P., and Lipscomb, W. N. Crystal structure of fructose-1, 6-bisphosphatase complexed with fructose 6-phosphate, AMP, and magnesium // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. V. 87. PP. 5243-5247.

192. Liang, J. Y., Zhang, Y., Huang, S., and Lipscomb, W. N. Allosteric transition of fructose-1,6-bisphosphatase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. V. 90. PP. 2132-2136.

193. Fraenkel, D. G., and Horecker, B. L. Fructose-1,6-Diphosphatase and Acid Hexose Phosphatase of jEscherichia coli II J. Bacteriol. 1965. V. 90. PP: 837-842.

194. Iversen, L. F., Brzozowski, M., Hastrup, S., et al. Characterization of the allosteric binding pocket of human liver fructose-1,6-bisphosphatase by protein crystallography and inhibitor activity studies // Protein Sci. 1997. V. 6. PP. 971— 982.

195. Vincent, M.F., Marangos, P.J., Gruber, H.E., Van den Berghe, G. Inhibition by AICA riboside of gluconeogenesis in isolated rat hepatocytes // Diabetes. 1991. V. 40. PP.1259-1266.

196. Vincent, M.F., Erion, M.D., Gruber, H.E., Van den Berghe, G. Hypoglycaemic effect of AICAriboside in mice // Diabetologia. 1996. V. 39t PP. 1148-55.

197. Holmes, W. B., and Appling, D. R. Cloning and characterization of methenyltetrahydrofolate synthetase from Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. PP. 20205-20213.

198. Rebora, K., Laloo, B., and Daignan-Fomier, B. Revisiting Purine-Histidine Cross-Pathway Regulation in Saccharomyces cerevisiae: A Central Role for a Small Molecule // Genetics. 2005 V. 170. PP. 61-70.

199. Pinson, B., Vaur, S., Sagot, I., Coulpier, F., Lemoine, S., and Daignan-Fomier, B. Metabolic intermediates selectively stimulate transcription factor interaction and modulate phosphate and purine pathways // Genes Dev 2009. V. 23. PP. 1399-1407.

200. Rebora, K., Desmoucelles, C., Borne, F., Pinson, B., and Daignan-Fornier, B. Yeast AMP Pathway Genes Respond to Adenine through Regulated Synthesis of a Metabolic Intermediate // Mol Cell Biol. 2001. V. 21. PP. 7901-7912.

201. Sabina, R. L., Patterson, D., and Holmes, E. W. 5-Amino-4-imidazolecarboxamide riboside (Z-riboside) metabolism in eukaryotic cells // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. PP. 6107-6114.

202. Anagnostopoulos, C., Spizizen, J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis II J.Bacteriol. 1961. V.81. P. 741-746.

203. Yoshikawa, H., Sueoka, N. Sequental replication of Bacillus subtilis chromosome, I. Comparison of marker frequencies in exponential and stationary growth phases // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V. 49. P. 559-566.

204. Blattner, F.R., Plunkett, G., Bloch, C.A. et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12 // Science. 1997. V. 277. P.1453-1462.

205. Vagner, V., Dervyn, E., Ehrlich, S.D. A vector for systematic gene inactivation in Bacillus subtilis. //Microbiology. 1998. V. 144. P. 3097-3104.

206. Shatalin, K.Y. and Neyfakh, A.A. Efficient gene inactivation in Bacillusanthracis. // FEMS Microbiology Letters. 2005. V. 245. P. 315-319. .

207. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis,,T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. N.Y. Cold Spring Harbor Lab. 1989.

208. Saito, H., Miura, K.I. Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment // Biochim.Biophys. Acta. 1963. V. 42. P.619-629.

209. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.74.

210. Mironov A., Epshtein V., Nudler E. Transcriptional approaches to riboswitch studies // Methods in Mol.Biol. 2009. V. 540. P. 39-51.

211. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике М.: Мир, 1976.

212. Zuker М., Mathews D.H., Turner D.H. // RNA Biochemistry and Biotechnology / Eds. J.Barciszewsky, B.F.C.Clark. NATO ASI Series; Kluwer Academic Publishers, Boston, 1999. — P. 11- 43.

213. Hove-Jensen, B., Nygaard, P. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli, Identification of a mutant enzyme. // Eur. J. Biochem. 1982. V.126. P.327-332.

214. Meyer, E., Switzer, R.L. Regulation of Bacillus subtilis glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase activity by end products // J. Biol. Chem. 1979. V.254. P.5397-5402.

215. Tumbough, C.L., Switzer, R.L. Oxygen-dependent inactivation of glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase in stationary-phase cultures of Bacillus subtilis II J.Bacteriol. 1975. V.121. P.108-114.

216. Hove-Jensen, B., Harlow, K.W., King, C.J., Switzer, R.L. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli. Properties of the purified enzyme and primary structure of the prs gene I I J. Biol. Chem. 1986. V.261. P.6765-6771.

217. Henkin, Т. М. / In Sonenshein, A. L. Hoch, J. A. and Losick R. (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1993. P. 669-682.

218. Lindner, G., Nijland, R., van Hartskamp, М., Bron, S., Hamoen, L.W., Kuipers, O.P. Differential expression of two paralogous genes of Bacillus subtilis encoding single-stranded DNA binding protein // J. Bacteriol. 2004. V. 186. PP. 1097-1105.

219. Estrem, S.T., Gaal, Т., Ross, W. Gourse, R.L. Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.9761-9766.

220. Blouin S., Mulhbacher J., Penedo J.K., Lafontaine, D.A. Riboswitches: ancient and'promising genetic regulators // ChemBioChem. 2009. V.10. PP. 400416.

221. Johansen L. E., Nygaard P., Lassen C. et al. Definition of a second Bacillus subtilis pur regulon comprising the pur and xpt-pbuX operons plus pbuG, nupG (yxjA), andpbuE (ydhL) II J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 5200-5209.

222. Asahara, Т., Mori, Y., Zakataeva, N.P., Livshits, V.A., Yoshida, K., Matsuno, K. Accumulation of gene-targeted Bacillus subtilis mutations that enhance fermentative inosine production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V.87. PP. 2195-207.

223. Пресс-релиз компании «ADVANCELL» от 16.02.2011.У

Информация о работе

Лобанов, Константин Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Роль сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы