Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль регуляторных пептидов (Pro-Gly-Pro-Leu и Leu-Pro-Gly-Pro) в процессах фибринообразования, фибринолиза и липидного обмена в норме и при гиперхолестеринемии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль регуляторных пептидов (Pro-Gly-Pro-Leu и Leu-Pro-Gly-Pro) в процессах фибринообразования, фибринолиза и липидного обмена в норме и при гиперхолестеринемии"

//« прагшх рукописи

„ -ли - .

РОЧЕВ ДМИТРИЙ ЛЕОНИДОВИЧ

РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ (РКО-СЕУ-РКО-ЕЕи И ЬЕи-РИО-СЬУ-РИО) В ПРОЦЕССАХ ФИКРИНООБРАЗОВАПНЯ, ФИКРИПОЛИЗЛ И ЛИПИДИОГО ОБМЕНА В НОРМЕ И ПРИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ

специальность - ОЗ.ОЗ.О! - фи тология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискамие ученом степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Москва, 2013

005542816

005542816

Работа выполнена в лаборатории защитных систем крови им. проф. Б.А. Кудряшова (заведующая - проф. Л.А. Ляпина) кафедры физиологии человека и животных (заведующий - проф. А.А. Каменский) биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией защитных систем крови им. проф. Б.А. Кудряшова Ляпина Людмила Анисимовна

Официальные оппоненты:

Островская Рита Ушеровна доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, главный научный сотрудник ФГБУ ГУ ПИИ фармакологии имени В.В. Закусова,

Дугипа Тамара Николаевна

кандидат биологических наук,

начальник лаборатории ООО «Криоцентр»

Ведущая организация: Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук - ГУ ГНЦ РАМН

Защита состоится 23 декабря 2013 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться п Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27)

Автореферат разослан 23 ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических паук /

Умарова Белла Анверовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема борьбы с гиперлипидемией в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость в связи с тем, что в последние годы увеличивается количество больных с повышенным уровнем холестерина в крови. В исследовании INTERHEART было продемонстрировано, что 45 % сердечно-сосудистых событий с тромбозами у жителей Западной Европы были связаны с различными проявлениями гиперлипидемий. Гиперлипидемии (гиперлипопротеинемии) являются одним из основных факторов риска развития атеросклероза, атеротромбоза и других сосудистых патологий.

Гиперлипопротеинемии представляют собой нарушения транспорта липидов, обусловленные ускоренным синтезом или замедленным разрушением липопротеинов, переносящих холестерин и триглицериды в плазме крови. Одни гиперлипопротеинемии обусловливаются непосредственно первичным нарушением процессов синтеза и разрушения липопротеиновых частиц. Другие развиваются вторично, т.е. повышение уровня липопротеинов в плазме служит одним из проявлений аномалий, связанных с нарушением регуляторных метаболических систем, например с недостаточностью тиреоидных гормонов или инсулина (Craber R„ et al., 1994).

Гиперлипидемии приводят к появлению симптомов сердечно-сосудистых заболеваний (коронарной болезни сердца, заболеваниям периферических артерий). Высокое содержание триглицеридов (> 11,3 ммоль/л) может вызывать симптомы острого панкреатита. Высокие показатели липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) приводят к появлению ксантом (подкожные отложения холестерина) и ксантелазм (небольшие образования бледно-желтого цвета в области верхнего века, обусловленные отложением в них липидов) (Judith R. et al., 1990).

В качестве основной терапии обычно назначают статины в связи с их достаточно высокой эффективностью. Гипохолестеринемическое действие статинов основано на их способности конкурентно ингибировать активность гидроксиметил-глутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы), которая принимает важное участие в синтезе эндогенного холестерина. Это приводит к компенсаторной экспрессии гепатоцитами повышенного числа рецепторов ЛПНП, что увеличивает клиренс ЛПНП из плазмы. Но при этом статины обладают рядом нежелательных побочных эффектов.

Нарушения липидного обмена часто сопровождаются нарушениями работы системы гемостаза и приводят к повышенной свёртываемости крови. Одной из важных

задач физиологии и медицины является разработка новых нетоксичных препаратов пептидной природы, способных положительно влиять как на систему гемостаза, так и на липидный обмен. В институте молекулярной генетики был получен пептид пролил-глицил-пролин (PGP) в 2 модификациях: с лейцином (L) на N-конце и на С-конце.

Цель настоящего исследования — изучение влияния пептидов PGPL и LPGP на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина, фибринолитическую активность и липидный профиль в плазме крови в норме и в условиях гиперхолестеринемии.

Задачи исследования:

1. В условиях in vitro на крысиной плазме установить действие обоих пептидов и лейцина на процессы свёртывания крови и фибринолиз;

2. Изучить влияние PGPL и LPGP на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина в условиях in vitro;

3. Исследовать влияние каждого из пептидов на показатели свёртывающей и противосвёртывающей систем в условиях in vivo при внутривенном и интраназальном введении здоровым животным;

4. Продемонстрировать одновременное действие каждого из пептидов на жировой обмен и свёртывание крови в организме крыс с гиперхолестеринемией при их хроническом интраназальном введении;

5. Показать эффект каждого из пептидов на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина и на липидный профиль в условиях ex vivo у людей с гиперхолестеринемией;

6. Провести сравнительный анализ гиполипидемического и фибриндеполимеризационного действия PGPL и LPGP в организме.

Научная новизна исследования: Впервые нами было исследовано сочетанное действие пептидов на липидный обмен, гемостаз и фибринолиз и выявлены различия в степени выраженности эффектов глипролинов, включающих лейцин на С- и N-концах. В экспериментах на животных и на плазме крови людей изучены эффекты этих регуляторных пептидов на параметры гемостаза и липидный обмен: антикоагулянтные, фибринолитические, фибриндеполимеризационные и гиполипидемические.

Впервые установлен факт ингибирования процесса полимеризации фибрина в присутствии исследуемых пептидов в плазме крови людей спектрофотометрическим методом, вследствие чего уменьшалась скорость образования сгустка по сравнению с контролем.

Впервые в экспериментах на животных показано, что пептид РОРЬ оказывает более значительный фибриндеполимеризационный эффект, чем ЬРОР. В то же время 1ЛЧЗР проявляет гиполипидемический эффект в большей степени, чем РОРЬ.

Впервые выявлено на плазме крови людей, что оба пептида вызывают гиполипидемический и фибриндеполимеризационный эффекты.

Теоретическая и практическая значимость работы:

В эксперименте определена физиологическая роль глипролинов, содержащих лейцин сИ-и С-концов, и показано их участие в регуляции жидкого состояния крови и липидного обмена в организме. Результаты работы дополняют представление о механизмах антикоагулянтно-фибринолитического и гиполипидемического действия глипролинов.

Результаты работы позволяют предложить пептиды РОРЬ и ЬРОР в качестве перспективных антитромботических и гиполипидемических средств направленного действия в условиях гиперхолестеринемии.

Разработан способ определения полимеризации и деполимеризации фибрина, основанный на применении спектрофотометрического анализа.

Апробация работы: Основные результаты работы были представлены на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (11 сентября 2013 г.). Отдельные фрагменты работы доложены на XVIII международной научной конференции Ломоносов-2011, конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (2010 г.), конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (2011 г.).

Объём и структура работы: Диссертация изложена на /^страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы

(86 отечественных и 58 иностранных источников), иллюстрирована 7 таблицами и 27 рисунками.

Материалы и методы

В работе применялись препараты пептидов PGPL и LPGP, синтезированные в институте молекулярной генетики РАН.

Исследования in vitro были проведены с плазмой крови животных и ex vivo с плазмой . крови человека. Нами использовались экспериментальные модели гиперхолестеринемии, основанной на методе Вильграмма в нашей модификации, и тромбообразования, основанной на методе Весслера с нашей модификацией, которые были разработаны в нашей лаборатории. Наряду с этим проводились совместно с Центром неврологии РАН исследования действия PGPL и LPGP на крови пациентов с повышенным уровнем холестерина.

В работе использовались стандартные коагулологические методы анализа (тромботест, активированное частичное тромбопластиновое время - АЧТВ, суммарная фибринолитическая активность - СФА, неферментативный фибринолиз - НФ, ферментативная фибринолитическая активность - ФФ, активность тканевого активатора плазминогена - ААП), спектрофотометрическое определение процессов полимеризации и деполимеризации фибрина, основанное на турбидиметрическом анализе, предложенном Щербак и др., с нашей модификацией, а также определение уровня холестерина и липидного профиля (триглицериды, ЛПНП, липопротеины высокой плотности - ЛПВП) плазмы крови по стандартной методике с реагентами фирмы Ольвекс Диагностикум.

Оценку динамики полимеризации и деполимеризации фибрина проводили спектрофотометрическим методом. В эксперименте свёртывание плазмы инициировали добавлением 0,1 мл рабочего раствора тромбина (2 NIH ед./мл) к 0,1 мл плазмы, инкубированной с пептидами и разведённой в 0,8 мл боратного буфера рН 7,2. Прохождение полимеризации регистрировали сразу после добавления тромбина на протяжении 10 минут по увеличению оптической плотности среды при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см, термостатируемой при 37° С. Деполимеризацию ускоряли добавлением раствора монохлоруксусной кислоты (МХУ) в конечной концентрации 2%. Определяли следующие показатели: tg а форость возрастания оптической плотности), tg р (скорость снижения оптической плотности), Ополим (изменение оптической плотности сгустка при полимеризации), ОдеПолим (изменение оптической плотности сгустка при деполимеризации).

В условиях in vitro пептиды добавлялись к плазме крови в концентрациях от 10"' до 10"'° М. In vivo препараты пептидов в дозе 1 мг/кг вводились внутривенно и интраназально. Гиперхолестеринемию вызывали специальной диетой с повышенным содержанием насыщенных (пальмитиновой, стеариновой), а также гидрогенизированных жирных кислот, глюкозы и холестерина с необходимым количеством витаминов и микроэлементов с добавлением желчегонных средств.

В условиях ex vivo на крови людей исследования проводились следующим образом: к плазме крови добавлялись пептиды в концентрации 10~3 М и инкубировались в течение не менее 10 мин при 37° С. Далее проводилось исследование процессов поли- и деполимеризации, параметров гемостаза, уровня общего холестерина и липидного профиля до и после добавления пептидов на одной и той же плазме.

В работе было использовано 114 крыс. Всего было проведено 8 серий экспериментов в условиях in vitro, in vivo и ex vivo.

Статистическая обработка осуществлялась по методу Стьюдента и критерию Вилкоксона.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияние пептидов PGPL и LPGP на параметры системы гемостаза в условиях in vitro.

Изучение эффектов тетрапептида PGPL и аминокислоты L на гемостаз: в диапазоне концентраций от 10"'° до 10° М (10"7 до 1 мг/мл) в концентрации, эквивалентной её содержанию в пептиде, в условиях in vitro показало, что при добавлении к плазме крови животных исследуемого пептида в концентрациях 10"5 - 1(У3 М наблюдалось достоверное удлинение времени образования сгустка по тесту АЧТВ.

Исследование фибринолитических свойств данного пептида продемонстрировало, что при добавлении его к плазме крови в диапазоне концентраций Ю-10 - 10"3 М происходило достоверное увеличение СФА на 50 - 250% по сравнению с контролем. При этом сам пептид при взаимодействии с нестабилизированным фибрином оказывал литическое действие.

При исследовании влияния пептида на агрегацию тромбоцитов установлено, что при инкубации растворов пептида с плазмой, богатой тромбоцитами и последующей стимуляции смеси раствором аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) в концентрации 5

мкМ/мл во всем интервале исследуемых концентраций (от Ю"10 до 10"3 М) происходило достоверное снижение агрегации тромбоцитов в 2-4 раза по сравнению с контролем. Табл. 1 Антикоагулянтные, фибринолитические и антитромбоцитарные эффекты пептида PGPL в условиях in vitro.

Группа АЧТВ, с СФА, MMz НФ, мм2 ФФ, мм7 Агрегация, индекс

NaCl 28,6±0,5 36,2±7,8 24,6±2,2 11,3±1,2 14,3 ±0,6

PGPL, моль/л

ю-10 56±3,4* 30±2,1 26±1,7* 3,7±0,4**

К)"9 30±0,7 72±5,6* 36±2,7* 36±2,6*

10"8 30,1±0,5 81±5,3* 42±2,5* 39±2,2* 4,7±0,3**

10-' 31,1±0,9 99±7,6** 56±3,1* 43±1,9*

IO" 31,1±1,2 110±8,8** 72±3,6* 38±2,3* 4,4±0,5**

10° 32,1±1,1* 115±7,5** 81±3,4* 34±1,5*

32,5±0,6* 126,5±6,7** 94±5,7* 33±2,1* 2,7±0,25**

10-J 40,3±2,3** 110±5,9** 76±4,4* 34±2,6* 0,8±0,2**

Таким образом, пептид PGPL в условиях in vitro обладал антикоагулянтными и антитромбоцитарными свойствами (за счёт ингибирования активности тромбина), фибринолитическими неферментативной природы за счёт прямого фибриндеполимеризационного действия.

При этих же условиях лейцин не вызвал достоверных изменений антикоагулянтной фибриндеполимеризационной и антитромбоцитарной активности плазмы крови (различия по сравнению с контрольной группой были недостоверны).

В следующей серии экспериментов мы исследовали суммарную и фибринолитическую активность пептида LPGP. В диапазоне концентраций от 10"9 до 10"1 М пептид обладает фибриндеполимеризационной активностью, а также способен повышать суммарную фибринолитическую активность плазмы крови за счёт проявления НФ. СФА: на 64-89%, НФ: на 69-103%. Следовательно, LPGP обладает неферментативными фибринолитическими свойствами в условиях in vitro.

Рис. 1 Рис. 2

Неферментативная фпоринолитаческая а ¡_еи-Ргй С1у-Рго в условиях т \itrp в присутствии плазмы

10"* 10"* 10"' 10"* 10"' 10"* 10"' 10"1 10"

Пептид с лейцином на С-конце - РвРЬ проявлял больший эффект на систему фибринолиза при выраженной дозозависимости: повышение концентрации пептида приводило к значительному росту фибринолитической активности, что не наблюдалось в случае ЬРОР.

Влияние пептидов РвРЬ и 1_РОР на процессы полимеризации и деполимеризации фибрина. В плазме крови спектрофотометрическим методом показано, что в присутствии исследуемых пептидов в концентрации 10"3 М в плазме крови (опыт) замедляется процесс полимеризации фибрина, вследствие чего уменьшается скорость образования сгустка, по сравнению с контролем. Однако и в контроле, и в опыте фибриновый сгусток обладал сравнимой оптической плотностью. При исследовании деполимеризации фибрина в течение 10 минут в плазменной среде установлено отличие контрольных и опытных проб. В присутствии пептида Ьеи-Рго-01у-Рго происходит достоверное снижение оптической плотности сгустка с течением времени, что не наблюдается в контроле, а также достоверное увеличение скорости деполимеризации сгустка. Добавление лейцина с конца оказывает большее влияние на уменьшение оптической плотности сгустка и увеличение скорости деполимеризации.

Табл. 2. Процессы полимеризации и деполимеризации фибрина под действием ЬРвР и РОРЬ в плазме крови крыс.

Препарат Параметры полимеризации и деполимеризации

'Т ^о. -Полимеризация, % ^тах полимеризации, % те(3- Деполимеризация, % О™* деполимеризации, %

100±12% 100±12,5% 100±57% 100±37%

РвРЬ 82,5±7%* 96±11% 236±31%* 162±26%

ЬРОР 75±8%* 95±9% 321 ±44%* 395±47%*

Суммарная фибринолнтическая активность Ьей-Рго-Фу-Рго в условиях ш мою в присутствия

Концентрации

пептида, м

10"* 10"* 10"' 10"* 10"* 10"* 10"1 10"* 10"

Следовательно, исследуемые пептиды замедляют образование фибринового сгустка под действием тромбина, существенно не влияя на его оптическую плотность, а также ускоряют лизис образующегося сгустка нестабилизированного фибрина.

Исследование влияния пептидов PGPL и аминокислоты L на состояние свёртывающей и противосвёртывающей систем на крысах в условиях in vivo.

Влияние пептида PGPL и аминокислоты L на показатели системы гемостаза при однократном внутривенном введении животным.

В этой серии экспериментов исследовали влияние однократного внутривенного введения животным пептида PGPL и аминокислоты L в эквивалентной дозе на параметры гемостаза, которое оценивали по изменению АЧТВ, СФА, фибриндеполимеризационной активности или НФ, ААП и агрегации тромбоцитов (АТ). Однократное внутривенное введение пептида крысам в дозе 1 мг/кг через 10 мин после его инъекции привело к повышению антикоагулянтного потенциала плазмы опытных животных. Так в опытной группе время образования сгустка по тесту АЧТВ достоверно возрастало и составило 128,0% (р<0,05) по сравнению с контролем. Введение лейцина вызывало недостоверное снижение времени образования сгустка (91,7% по сравнению с контролем).

Табл. 3. Показатели системы гемостаза плазмы крови животных через 10 мин после однократного внутривенного введения пептида Pro-Gly-Pro-Leu в дозе 1 мг/кг и аминокислоты Leu в дозе 0,33 мг/кг (М±т)

Показатели Пептид PGPL Лейцин Контроль NaCl

гемостаза п=8 п=5 п=7

АЧТВ, % 128,0±8,3 * 91,7±9,9 100,0±8,1

СФА, % 143,5±б,9 ** 128,8±15,9 100,0±4,2

НФ, % 131,7±8,9 * l2l,2±ó,8 100,0±2,8

AA1I, % 253,1±23,1 ** 73,7±20,3 100,0±7,6

AT, % 69,0±8,3 117,2±1,4 100,0±11,7

Наряду с этим, исследуемый пептид вызывал достоверное возрастание показателей фибринолитической системы плазмы крови экспериментальных животных. СФА выросла на 43,5% по сравнению с контролем. Её увеличение было обусловлено как повышением НФ, так и возрастанием ААП, НФ и ААП составили 131,7% (р<0,05) и 253,1% (р<0,01) соответственно по сравнению с контролем. Очевидно, что рост ААП обусловлен повышением его концентрации в крови за счёт выброса тканевого активатора

плазминогена из сосудистой стенки в результате действия пептида на её рецепторы. Кроме того, при внутривенном введении наблюдалась тенденция к снижению агрегации тромбоцитов (на 31,0%). Лейцин повышал суммарную (128,8%, р>0,05) и неферментативную (121,2%, р>0,05) фибринолитическую активности, но эти изменения были незначительны.

При исследовании пептидов чаще всего используют интраназальный способ введения, так как он неинвазивный и эффективный.

Табл. 4. Показатели системы гемостаза плазмы крови животных через 10 мин после 3-хкратного интраназального введения пептида Pro-Gly-Pro-Leu в дозе 1 мг/кг и аминокислоты Leu в дозе 0,33 мг/кг (М±га)

Показатели гемостаза Пептид PGPL п=9 Лейцин п=9 Контроль NaCl п=9

АЧТВ, % 118,0±2,6 ** 95,2±1,6 100,0±2,2

СФА, % 145,2±19,8 * 102,7±6,8 100,0±2,6

НФ, % 139,1±5,б ** 105,4±4,4 100,0±5,2

ААП, % 164,4±12,9 ** 99,7±27,8 1Ü0,0±6,6

AT, % 82,5±7,0 93,8±9,б ЮО,0±Ю,0

Состояние системы гемостаза при трёхкратном интраназальном введении пептида РОРЬ и аминокислоты Ь в эквивалентной дозе. Животным в течение 3 дней через каждые 24 часа интраназально вводился пептид РОРЕ. в дозе 1 мг/кг в объеме 0,025 мл/животное, Ь - в дозе 0,33 мг/кг. Контрольным животным в тех же условиях вводили равный объём 0,85% раствора №С1. Через 1 час после последнего введения у животных брали кровь для анализа, в этот период происходило достоверное увеличение антикоагулянтной активности плазмы крови (по тесту АЧТВ) на 18,0% по сравнению с контролем (р<0,01), а также тенденция к снижению агрегации тромбоцитов. Введение пептида увеличило СФА на 45,2% (р<0.05), а НФ - на 39,1% (р<0,01) по сравнению с контролем. ААП в опытной группе животных после введения пептида достоверно повышалась и составляла 164,4% по сравнению с контрольной группой (р<0,01), принятой за 100%.

При данном способе введения Ь не оказывал достоверного влияния на антикоагулянтные, фибринолитические и антитромбоцитарные свойства плазмы крови крыс по сравнению с контролем.

Антитромботические эффекты пептида РОРЬ и аминокислоты Ь на экспериментальной модели тромбообразования

Животным в течение 3-х дней интраназально вводили пептид в дозе 1 мг/кг массы тела (1-я группа), лейцин (2-я группа) - в дозе, эквивалентной его содержанию в пептиде (0,33 мг/кг) или 0,85%-й раствор №С1 (3-я группа - контроль). Через 1 час после 3-го введения препаратов проводили в яремной вене образование тромбов. Ещё через 1 час образующийся тромб удаляли, высушивали и взвешивали. После экспериментального тромбообразования вес свежих фибриновых сгустков в сосуде (яремной вене) на фоне предварительного введения пептида составил 31,5% (р<0.01) по сравнению с контролем. При этом вес фибриновых сгустков на фоне предварительного введения лейцина составил 70,4% по отношению к контрольным животным, хотя эти данные не достигали уровня достоверности (р>0,1). Это происходило на фоне достоверного повышения антикоагулянтной и фибринолитической активности плазмы крови животных 1-й группы (введение пептида), у которых наблюдалось удлинение АЧТВ (117,4% по сравнению с контролем), усиление СФА, НФ и возрастание ААП (156,4, 169,2 и 134,7% соответственно по сравнению с контролем).

Табл. 5. Показатели системы гемостаза плазмы крови животных и вес сгустков на фоне формирования тромбов после 3-х кратного интраназального введения пептида РОРЬ и аминокислоты Ь.

Показатели гемостаза и вес сгустков Пептид РвРЬ п=8 Лейцин п=8 Контроль п=7

АЧТВ, % 117,4±5,5 * 98,3±5,1 100,0±5,7

СФА, % 156,4±15,5 ** 88,3±5,9 100,0±8,5

НФ, % 169,2±18,6 ** 94,1±14,5 100,0±5,3

ААП, % 134,7±6,16** 98,2±7,4 100,0±7,9

АТ, % 93,9±14,7 98,1±12,5 100,0±6,0

Вес сгустков, % 31,5±6,5 ** 70,4±15,8 100,0±3,6

Влияние пептидов РвРЬ и ЬРвР на параметры системы гемостаза и липидный обмен на животных с экспериментально вызванной гиперхолестеринемией.

Две группы животных находились на жировой диете в течение одного или трёх месяцев. В результате по сравнению с интактными животными уровень общего холестерина (ОХ) вырос на 0,2-0,3 ммоль/л при норме 0,9 ммоль/л, повысилось содержание триглицеридов на 0,1 ммоль/л и ЛПНП на 0,4 ммоль/л, а также снизились показатели антикоагулянтной и фибринолитической активности (на 20-27%). Крысы содержались на жировой диете до конца эксперимента. После этого ежедневно в течение 9 дней крысам интраназально вводили пептиды в дозе 1 мг/кг веса и через 1 час после последнего введения, а также через неделю после отмены препаратов проводили измерения антикоагулянтной, фибринолитической активности, а также определяли липидный профиль плазмы крови опытных и контрольных (0,85% раствор №С1) животных.

Рис. 3. Липидный профиль после 9-дневного Рис. 4. Липидный профиль после 9-дневного введения пептидов на фоне 1-месячного введения пептидов на фоне 3-месячного

содержания крыс на холестериновой диете. содержания крыс на холестериновой диете.

мом ;

*-р<0,05

После 9-дневного введения пептидов на фоне 1-месячного содержания крыс на холестериновой диете под влиянием обоих исследуемых пептидов наблюдалось достоверное увеличение СФА и НФ и тенденция к увеличению АЧТВ, ТВ и ферментативного фибринолиза - ФФ. Под действием ЬРвР достоверно снижался общий уровень холестерина за счёт достоверного снижения уровня ЛПНП. В случае РвРЬ проявлялась тенденция к снижению уровня ТГ и ЛПНП.

Через неделю после отмены пептидов на фоне продолжающегося содержания крыс на холестериновой диете достоверно увеличились тромбиновое время - ТВ, СФА, НФ под действием обоих пептидов. Выраженность действия обоих пептидов различалась незначительно. Под действием РвРЬ и ЦЧЗР достоверно повысилось содержание ЛПВП, наблюдалась тенденция к снижению уровня триглицеридов и ЛПНП.

Таким образом, исследуемые пептиды способны снижать степень нарушений липидного обмена и улучшать состояние системы гемостаза при умеренно выраженной гиперхолестеринемии. LPGP оказывал более выраженный эффект.

После 9-дневного введения пептидов на фоне 3-месячного содержания крыс на холестериновой диете под влиянием обоих исследуемых пептидов наблюдалось достоверное увеличение СФА, а также тенденция к увеличению АЧТВ и НФ. При этом достоверно снижался уровень триглицеридов и повышался уровень ЛПВП. Под действием PGPL наблюдалась тенденция к снижению уровня ЛПНП.

Через неделю после отмены препаратов уровень ЛПВП оставался повышенным, но остальные эффекты были менее выражены.

Следовательно, исследуемые пептиды уменьшали степень нарушений липидного обмена и системы гемостаза при более сильно выраженной гиперхолестеринемии в результате 3-хмесячного содержания на диете в меньшей мере, чем при умеренной в результате 1-месячного содержания.

Влияние пептидов PGPL и LPGP на состояние системы гемостаза и липидного обмена в плазме крови людей in vitro.

В работе использовалась плазма крови людей с гиперхолестеринемией, у которых уровень холестерина варьировал от 6.0 до 9.8 ммоль/л. Исследования проводились следующим образом: к плазме крови добавлялись пептиды в концентрации 10"J М и инкубировались в течение не менее 10 мин при 37° С. После чего проводилось исследование процессов поли- и деполимеризации, параметров гемостаза, уровня общего холестерина и липидного профиля до и после добавления пептидов на одной и той же плазме.

Добавление обоих исследуемых пептидов привело к снижению уровня общего холестерина за счёт снижения уровня триглицеридов и ЛПНП в сыворотке крови людей с гиперхолестеринемией, а также к повышению уровня ЛПВП. Действие пептидов не зависело от исходного уровня холестерина: снижение было сравнимым как в группе с высоким содержанием общего холестерина, так и в группе с незначительно повышенным уровнем. Эффект не зависел от исходного уровня холестерина.

Рис. 5. Липидный профиль сыворотки крови человека в присутствии пептидов РвРЬ и ЬРйР

Ммоль/л

#- р<0,05

Рис. 6. Полимеризация и деполимеризация фибриновых сгустков в присутствии

Ополим-рост оптической плотности при образовании сгустка, О деполим- снижение оптической плотности сгустка при деполимеризации. Полимеризация и деполимеризация измерялись как тангенс угла наклона графика роста и снижения оптической плотности под влиянием пептидов соответственно.

При этом добавление РОРЬ и ЬРОР к плазме крови людей вызывало достоверное повышение СФА и НФ, а также удлинение ТВ. Исследуемые пептиды уменьшили как скорость полимеризации фибрина под действием тромбина, так и плотность образующихся сгустков. Индуцированная МХУ кислотой деполимеризация под действием РвРЬ и иЧЗР ускорилась, а фибриновые сгустки в большей степени растворились за 10 минут. При этом РОРЬ показал большую эффективность, чем ЬРвР.

Чтобы выяснить возможные механизмы действия пептидов на липидный обмен, мы решили проверить их влияние на активность липид-зависимой фосфолипазы А2 (ЬрРЬА2) в плазме крови людей с гиперхолестеринемией.

Табл. 6. Изменение уровня липид-зависимой фосфолипазы А2 после инкубации с LPGP и PGPL.

Группы людей Исходный уровень LpPLA2, нг/мл LpPLA2 после инкубации с LPGP, нг/мл LpPLA2 после инкубации с PGPL, нг/мл

1 2,65±0,09 3,08±0,12 * 3,48±0,1 4*

2 3,3±0,07 3,2±0,21 3,5±0,1

3 6,0±0,11 5,3±0,08 3,9±0,1

Примечание: ЬрРЬА2-липид-зависимая фосфолипаза А2. *-р<0,05, группа 1 объединяет людей, у которых под действием пептидов уровень липазы значительно повысился, группа 2 тех, у кого уровень липазы заметно не изменился, группа 3 тех, у кого уровень липазы снизился. Нормальный уровень LpPLA2 у здоровых людей - до 2,0 нг/мл.

Нами была выявлена зависимость эффекта пептидов от исходной активности липазы: у людей с незначительно повышенным уровнем липазы её концентрация росла, у людей со значительно увеличенным уровнем - снижалась, то есть наблюдалась нормализация концентрации липазы на среднем уровне.

Приведенные данные говорят о том, что одним из возможных механизмов гиполипидемического действия пептидов можно считать их модулирующее действие на регулятор(ы), который(е) предположительно активирует(ют) LpPLA2.

Итак, нами было исследовано сочетанное действие пептидов на липидный обмен, гемостаз и фибринолиз и выявлены некоторые различия в степени выраженности эффектов пептида с лейцинов на С- и N-концах. Пептид PGPL в условиях in vitro обладал антикоагулянтными и антитромбоцитарными свойствами за счёт ингибирования активности тромбина, а также фибринолитическими неферментативной природы действиями за счёт их прямого фибриндеполимеризационного эффекта. Пептид LPGP обладал неферментативными фибринолитическими свойствами в условиях in vitro. Кроме того, в присутствии исследуемых пептидов ингибировался процесс полимеризации фибрина, вследствие чего уменьшалась скорость образования сгустка по сравнению с контролем (0,85%-ный раствор NaCl). Большее влияние на деполимеризацию

наблюдалось в присутствии PGPL. В этих же условиях аминокислота лейцин не вызывала достоверных изменений перечисленных параметров.

Пептид PGPL в условиях in vivo как при внутривенном, так и при интраназальном способах введения способствовал усилению антикоагулянтного и фибринолитического фона как ферментативной, так и неферментативной природы в плазме крови животных и при этом имел тенденцию к снижению агрегации тромбоцитов. Кроме того, при многократном интраназальном введении пептид PGPL проявлял способность замедлять процессы тромбообразования.

Исследуемые пептиды улучшали значения показателей холестерина у крыс с моделью гиперхолестеринемии как при кратковременном, так и при долговременном содержании на жировой диете. LPGP оказался более эффективным. При этом в случае более выраженной гиперхолестеринемии, развивавшейся в течение трёх месяцев оба пептида проявляли меньший эффект, чем при содержании крыс на жировой диете в течение одного месяца.

PGPL и LPGP способны улучшать показатели липидного профиля, а также положительно влиять на параметры гемостаза у людей в условиях in vitro, то есть обладают сочетанным действием на липидный обмен и на систему гемостаза.

Нами выявлен один из механизмов действия глипролинов на липидный обмен, заключающийся в модуляции активности липид-зависимой фосфолипазы А2 крови.

Пептид с лейцином на N-конце в большей степени восстанавливал нарушения липидного обмена и стимулировал деполимеризацию сгустка, пептид с лейцином на С-конце эффективнее повышал фибринолитические свойства плазмы.

Следовательно, результаты наших исследований позволяют считать, что пептиды PGPL и LPGP могут быть перспективными средствами для лечения патологий гемостаза и липидного обмена.

ВЫВОДЫ

1) Пептид PGPL в условиях in vitro обладает антикоагулянтными и антитромбоцитарными свойствами, проявлял прямое фибриндеполимеризационное действие.

2) Пептид LPGP повышал суммарную фибринолитическую активность плазмы за счёт увеличения неферментативных фибринолитических свойств в условиях in vitro.

3) Оба исследованных пептида ингибировали процесс полимеризации фибрина и ускоряли деполимеризацию образующегося сгустка при использовании усовершенствованного нами способа определения полимеризации и деполимеризации фибрина спектрофотометрическим методом.

4) Пептиды PGPL и LPGP в условиях in vivo способствовали усилению антикоагулянтного и фибринолитического фона плазмы крови как при однократном внутривенном , так и при многократном интраназальном способах введения.

5) На модели экспериментального тромбоза предварительное интраназальное введение PGPL замедляло процессы тромбообразования;

6) Пептиды PGPL и LPGP приводили к значительному улучшению липидного профиля и параметров гемостаза у крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией. Пептид PGPL оказывал более выраженный эффект на систему фибринолиза, a LPGP - на липидный обмен.

7) В условиях ex vivo на крови пациентов с дислипидемией PGPL и LPGP снижали выраженность дисфункции систем гемостаза, фибринолиза и липидного обмена.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Оберган Т.Ю., Рочев Д.Л.. Ляпина Л.А. Эффекты пептида Pro-Gly-Pro-Leu в процессах гемостаза в норме и при тромбообразовании у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, том 152, №8, с 144-147.

2. Мясоедов Н. Ф., Рочев Д. Л.. Ляпина Л. А., Оберган Т. Ю., Андреева Л. А.

Лейцинсодержащие глипролины (Pro-Gly-Pro-Leu и Leu-Pro-Gly-Pro): участие в реакциях гемостаза in vitro и in vivo в условиях нарушений процессов свертывания крови и жирового обмена у крыс // Доклады академии наук, 2013, том 453, № 4, с. 457-460.

3. Рочев Д. Л., Оберган Т. Ю., Ляпина Л. А. Оценка влияния глипролинов PGPL и LPGP на процессы полимеризации фибрина и липидный профиль в условиях in vivo // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2012. — №4(52). — С. 45.

Тезисы конференций

1. Рочев Д.Л. Участие пептида Leu-Pro-Gly-Pro в процессах полимеризации и деполимеризации фибрина в плазменной среде // тез. XVIII международной научной конференции Ломоносов-2011, секция «Биология», подсекция «Физиология человека и животных», с 268-268.

2. Оберган Т.Ю., Рочев Д.Л. Противосвёртывающие и антитромбоцитарные эффекты аминокислоты лейцин и пептида Pro-Gly-Pro-Leu при внутривенном введении животным // тез. конф. «Физиологическая активность регуляторных пептидов», с 67-67.

3. Рочсв Д.Л. Аптитромботичсскис эффекты рсгуляторного исптила Pro-Cily-Pro-Lcu //тез. комф. «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», с 67-67.

Список сокращений

ЛПНП - липомротсииы низкой плотности; ЛПВП - липопротсины высокой плотности; ГМГ-КоА-рсдуктазы - гидроксимстилглутарил-коэпзим А-рсдуктаза; PGP -иролил-глицил-иролин; PGPL - иролил-глицил-пролил-лсйним; LPGP - лсйцил-пролил-глииил-пролии; АЧТВ - активированное частичное тромбопластииовос время; СФА -суммарная фибриполитичсская активность; ПФ - псфсрмснтативпый фибринолиз; ААГ1 -активность тканевого активатора плазминогена; МХУ-моиохлоруксусная кислота; tg а -скорость возрастания оптической плотности; tg Р - скорость снижения оптической плотности; D„ram, - изменение оптической плотности сгустка при полимеризации; D,clll);lll4l - изменение оптической плотности сгустка при деполимеризации; ОХ - общий холестерин; ТВ -тромбииовос время; LpPLA2-липид-зaвиcнмaя фосфолипаза А2.

Подписано н печать 21.1 1.2013 Формат А5 Бумага офсстиая. Печать цифровая. Тираж 100 ж !. Заказ № 2418 Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова 1 19192 Москва, Ломоносовский проспект, 27