Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль протеинкиназы С и кальция в регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок почки крысы вазопрессином в постнатальном онтогенезе

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль протеинкиназы С и кальция в регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок почки крысы вазопрессином в постнатальном онтогенезе"

На правах рукописи

КАТКОВА

Любовь Евгеньевна

РОЛЬ ПРОТЕИНКИНАЗЫ С И КАЛЬЦИЯ В РЕГУЛЯЦИИ ВОДНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ СОБИРАТЕЛЬНЫХ ТРУЬОК ПОЧКИ КРЫСЫ ВАЗОПРЕССИНОМ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

03 00 13 ФИЗИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

003160881

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научные руководители Официальные оппоненты

д б н Соленов Е И

доктор биологических наук, профессор АйзманРИ ГОУ ВПО Новосибирский государственный педагогический университет МОиН РФ г Новосибирск

доктор биологических наук, Меркулова Т.И

Институт цитологии и генетики СО РАН г Новосибирск

Ведущее учреждение -

Институт эволюционной физиологии и биохимии им ИМ Сеченова РАН

Защита состоится 2007 г на заседании

диссертационного совета Д 001 014 01 при Институте физиологии СО РАМН (630017, г Новосибирск, ул Тимакова, 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии СО РАМН

Автореферат разослан

Л/

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Бузуева И И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

У млекопитающих главным эффекторным органом системы поддержания водного гомеостаза является почка. Экскреция осмотически свободной воды определяется ее реабсорбдией в собирательных трубках под действием вазопрессина Согласно современным представлениям, основной механизм увеличения транспорта воды через главные клетки собирательных трубок почки под действием вазопрессина состоит в обратимом встраивании аквапорина 2 (AQP2) в апикальную мембрану На молекулярном уровне происходит связывание гормона с V2 рецепторами, расположенными на базолатеральной мембране клеток собирательных трубок Образование гормон-рецепторного комплекса приводит к активации аденилатциклазы, происходит наработка дАМФ что, в свою очередь, приводит к запуску каскада внутриклеточных процессов, одним из конечных результатов которых является встраивание AQP2 в апикальную мембрану (Agre, 1993, Nielsen et al, 1995)

Кроме того, по-видимому, существуют пути регуляции проницаемости клеток собиратетьных трубок почки, в которых непосредственно не участвует цАМФ Было установлено, что вазопрессин, наряду с повышением количества цАМФ, вызывает кратковременное повышение концентрации внутриклеточного кальция, которое показано в клетках собирательных трубок внутреннего мозгового вещества (Соленов и др, 1991, Ecelbarger et al, 1996) Увеличение концентрации кальция, очевидно, имеет важное значение для реализации эффекта вазопрессина в собирательных трубках, поскольку обработка суспензии собирательных трубок хелатором кальция-В APTA приводит к подавлению реакции на гормон (Chou et al, 2000)

Протеинкиназа С (РКС) является одним из наиболее вероятных участников кальций-зависимого пути регуляции водной проницаемости собирательных трубок вазопрессином и, вероятно, может принимать участие в механизмах созревания чувствительности к гормону в ходе постнатального онтогенеза Так, было показано, что хроническая обработка ингибитором РКС приводит к нарушению нефрогенеза (Saxena et al, 1994) Однако, несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярных основ действия вазопрессина, многие аспекты остаются неясными Среди них - процессы становления гормональной компетентности почки в ходе постнатального развития

В ранний постнатальный период почка незрелорождаюхцих млекопитающих нечувствительна к действию антидиуретического гормона (вазопрессина) У крыс гормональная компетентность к действию вазопрессина появляется у 20-22 дневных животных, что совпадает с периодом перехода от молочного вскармливания к самостоятельному питанию В этот период завершается формирование всего комплекса регуляторных систем водно-солевого гомеостаза, обеспечивающих работу почки, исходя из потребностей организма (Dlouha, 1976, Соленов, Иванова, 1997) Однако причины отсутствия реакции на вазопрессин в настоящее время не ясны Исследования формирования чувствительности почки к вазопрессину относительно немногочисленны и носят фрагментарный характер В то же время, понимание процесса становления гормональной компетентности почки необходимо для прояснения путей поддержания водно-солевого гомеостаза в ходе постнатального развития

Целью настоящей работы являлось исследование роли протеинкиназы С и внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости эпителия собирательных трубок почки крысы в постнатальном онтогенезе

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи

1 Получить данные о влиянии водной депривации и десмопрессина, агониста У2 рецепторов вазопрессина, на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок почки крысы и на содержание водных каналов 2 и 3 типов в мембранной фракции наружного мозгового вещества у взрослых животных и в постнатальном онтогенезе

2 Изучить изменение содержания и перераспределение белка из цитозольной фракции в плазматическую мембрану различных изоформ протеинкиназы С в ходе постнатального развития

3 Исследовать участие протеинкиназы С в регуляции вазопрессином водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок мозгового вещества почки взрослых крыс и в ходе постнатального онтогенеза

4 Исследовать роль внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок мозгового вещества почки крысы

Научная новизна

С использованием разработанного в лаборатории метода была охарактеризована водная проницаемость собирательных трубок почки крысы Показано, что водная проницаемость плазматической мембраны клеток собирательных трубок повышается в ходе постнатального развития, и одновременно нарастает содержание водных каналов типов 2 и 3 в плазматической мембране

Впервые показано подавление эффекта десмопрессина на водную проницаемость ингибитором протеинкиназы С и установлено, что протеинкиназа С участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ

Обнаружено, что связывание внутриклеточного кальция с помощью хелатора ВАРТА приводит к подавлению стимулируемой десмопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок почки крысы

Установлено, что созревание механизма регуляции водной проницаемости собирательных трубок почки крысы в онтогенезе происходит при переходе животного от грудного вскармливания к самостоятельному питанию, что соответствует 20-24 дню жизни Формирование системы кальций-зависимой регуляции идет параллельно развитию цАМФ-зависимого пути трансдукции сигнала вазопрессина и заканчивается в тот же период

Научно-практическая значимость

Полученные данные дополняют и расширяют существующие представления о механизмах действия вазопрессина на эпителий собирательных трубок почки млекопитающих Кроме того, результаты данного исследования могут представлять интерес для разработок прикладного значения, поскольку дефект любого из звеньев на пути передачи гормонального сигнала вазопрессина приводит к тяжелейшим нарушениям водно-солевого гомеостаза, особенно в детском возрасте Глубокое и всестороннее исследование механизмов регуляции водного и ионного транспорта в

клетках эпителия почки позволит применить полученные результаты в разработке методов компенсации нарушений водного баланса у человека

Положения, выносимые на защиту

1 Созревание механизма регутации водной проницаемости собирательных трубок почки крысы происходит во время перехода к самостоятельному питанию, что соответствует 20-24 дню жизни Формирование кальции-зависимой регуляции идет параллельно развитию цАМФ-зависимого пути трансдукции сигнала вазопрессина и заканчивается в тот же период

2 Повышение концентрации внутриклеточного кальция необходимо для реализации вазопрессин-зависимого повышения водной проницаемости клеток собирательных трубок почки, опосредованное V2 рецепторами вазопрессина В механизм регуляции водной проницаемости клеток собирательных трубок почки, как одно из звеньев, входит протеинкиназа С

3 Протеинкиназа С, вероятно, участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ Повышение внутриклеточною кальция, необходимо на нескольких различных этапах передачи сигнала в клетках эпителия собирательных трубок почки крысы

Апробация материалов

Материалы диссертации доложены на конференции, посвященной 80-летию со дня рождения М Г Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на XIX съезде физиологического общества им И П Павлова (Екатеринбург, 2004), на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XX съезде физиологического общества им Павлова (Москва 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных (4) журналах

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы результаты исследования, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (240 наименований) Работа изложена на 122 страницах, содержит 23 рисунка и 1 таблицу

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальные животные

В экспериментах использовали крыс линии Вистар обоего пола в возрас re 9-12 дней, 20-24 дней и половозрелых животных в возрасте около 2 месяцев Всех животных получали из лаборатории экспериментальных животных ИЦиГ СО РАН (г Новосибирск) В экспериментах с водной депривацией (дегидратацией), животных лишали доступа к воде и обеспечивали свободный доступ к сухой пище в течение 48 часов Гидратация животных, с целью снижения уровня эндогенного вазопрессина достигалась содержанием крыс в течение 2 суток без пищи, но при свободном доступе к 5% водному раствору сахарозы В опытах использовали животных с осмолярностью мочи от 150 мОсм до 400 мОсм

Измерение водной проницаемости эпителия собирательных трубок

Получение фрагментов собирательных трубок После декапитации животного обе почки извлекали и помещали на лед Почки декортицировали, сохраняя наружную зону мозгового вещества, сосочек удаляли Выделенное наружное мозговое вещество пропускали через иглу с внутренним диаметром 0,45 мм в охлажденном растворе PBS с низким содержанием кальция (137 мМ NaCl, 4,7 мМ Na2HP04, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ КН2Р04, 0,5 мМ MgCl2, 5,5 мМ глюкоза. 0,05 мМ СаС12) Полученную суспензию помещали в среду МЕМ с 15мМ HEPES и фильтровали через капроновую сеточку с ячейкой ~ 0 3 мм Далее суспен даю центрифугировали с ускорением 100 - 200 g 5 мин при +4° С, Супернаташ осторожно отбрасывали, осадок канальцев ресуспендировали в 3-4 мл культуральной среды МЕМ с 15 мМ HEPES На протяжении эксперимента суспензию канальцев сохраняли в той же среде на льду в атмосфере 5% СО? и 95% воздуха

Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок. Метод измерения водной проницаемости плазматической мембраны клеток на открытом конце почечного канальца основан на световой микроскопии в темном поте и цифровой записи изображения с последующим ее автоматическим анализом Суспензию канальцев объемом 100-200 мкл наносиии на стекло, обработанное полилизином Затем стекло помещалось в перфузионную камер> экспериментальной установки (JIOMO Микмед-2, объектив ФВИ х40, конденсор темного поля КОН-7Т) В центре поля зрения микроскопа устанавливали фрагмент собирательной трубки мозгового вещества почки Конструкция камеры позволяет проводить смену растворов с изоосмотического PBS, 300 мОсм'л (137 мМ NaCl, 4,7 мМ Nd2HP04, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ КН2Р04, 0,5 мМ MgCl2 5,5 мМ глюкоза, 0,1 мМ СаС12) на гипоосмотический PBS, 200 мОсм/л, который получали разбавлением дистиллированной водой в 1,5 раза, со временем полусмены растворов ~ ЮОмсек Кинетику осмотического набухания объема клеток записывали с помощью цифровой видеокамеры FUM-930H, установленной на микроскопе и соединенной с компьютером (скорость съемки 25 кадров/сек)

Анализ осмотического набухания клеток проводили с помощью разработанного нами программного обеспечения для автоматического измерения лтощади изображения исследуемого объекта При анализе видеозаписи выделяли небольшой фрагмент изображения канальца В этом фрагменте программа определяла количество пикселей S выше порога дискриминации в каждом кадре видеозаписи По данным площади S рассчитывали индекс объема V=S3/2 при осмотическом набухании клеток Далее по этим значениям рассчитывали коэффициент линейной регрессии индекса объема, по уравнению V=Kr t+S^o, где ^о - начальный индекс объема в момент времени i=0, KR - коэффициент линейной регрессии индекса объема Коэффициент водной проницаемости Pf рассчитывали по формуле Pf = Kr/nSoV w(C|n~""Cout)» где К, - коэффициент линейной регрессии индекса объема SJ , nSo - площадь поверхности обмена (п = 4 - поправочный коэффициент). F, -молярный объем воды (18 см3/моль), Ст = 300 мОсм/л и С„„, = 200 мОсм/л - вн) гри-и внеклегочные осмолярности, соответственно

Измерение водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок Для оценки водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок (CT) использовали счедующ\ю

модификацию метода, описанного выше Для блокирования транспорта воды через апикальную мембрану клеток в просвет канальца вводили каплю вазелинового масла Фрагмент канальца уравновешивали в гипертоническом растворе (PBS+маннит, 600 мОсм/л) в течение 15 сек Процесс набухания клеток эпителия в ответ на снижение осмолярности среды до изотонической (PBS 300 мОсм/л) записывали с помощью цифровой видеокамеры FUM-930H, установленной на микроскопе ЛОМО-МИКМЕД-2 (объектив 60-х ВИ и 1 1-х кратное увеличение фото приставки) Время полуобмена среды в перфузионной камере ~ 70 мс, частота записи - 25 кадров в секунду Для определения степени набухания на кадрах видеозаписи измеряли высоту клеток с шагом в несколько пикселей в интервале ограниченном каплей масла, с помощью специально созданного программного обеспечения Полученный ряд данных изменения высоты вдоль канальца усредняли Полученные усредненные значения использовали далее в анализе кинетики изменения высоты клеток эпителия По значениям средней высоты рассчитывали коэффициент линейной регрессии из уравнения линейной регрессии H-Kgf+Ho, где Но- начальная высота в момент времени t= 0, Kr - коэффициент регрессии Коэффициент водной проницаемости Pf рассчитывали по формуле P/=K¡¡ /Vw (С,„-

Cout), где Vw - молярный объем воды (18 см3/моль), С,„=600 мОсм/л и Сш= 300 мОсм/л - внутри- и внеклеточные осмолярности, соответственно

Вестерн-блот анализ.

После декапитации животного почки извлекали и помещали на лед Почки декортицировали, сохраняя наружную зону мозгового вещества, сосочек удаляли С помощью бритвенного лезвия выделенное наружное мозговое вещество разделяли на срезы толщиной 2-3 мм и помещали их в среду MEM с 15 мМ HEPES на лед Инкубацию с различными агентами проводили в среде той же среде при 37° С в атмосфере 5% СОг и 95% воздуха

Для получения препарата плазматических мембран наружное мозговое вещество почки гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе со свободным пестом в трис-хлоридном буфере, содержащем сахарозу и ингибиторы протеаз (10 мМ Трис-С1 pH 7 4, 0 25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, ингибиторы протеаз) Ингибиторы протеаз (Complete protease ínhoditor tablete, Santa Cruz) использовали в рекомендованных производителем концентрациях Гомогенат центрифугировали 15 минут при 3000 g , супернатант повторно центрифугировали при 10000 g в течение 30 минут Все процедуры выполняли на холоду Полученный осадок растворяли в буфере содержащем SDS (10 мМ Трис-С1 pH 7 4, 0 25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, ингибиторы протеаз ,1% SDS) Для получения цитозольной фракции наружное мозговое вещество почки гомогенизировали в трис-хлоридном буфере, без сахарозы (10 мМ Трис-С1 pH 7 4, 1 мМ ЭДТА, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, ингибиторы протеаз) Гомогенат центрифугировали 50 минут при 40000 g, отбирали супернатант

Измерение концентрации белка проводили с помощью Protein assay реагента (BioRad) согласно приложенным протоколам Концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой построенной по БСА Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) Концентрирующий гель содержал 4%-акриламид, разделяющий гель состоял из 12% акриламида На дорожку наносили по 1 мкг белка Для определения молекулярной массы детектируемых белков на гель наносили маркеры молекулярного веса (SDS-PAGE Standards,

BioRad), весами от 112 кД до 21кД После разделения белки переносили на PVDF мембрану в буфере содержащем Трис 50мМ, Глицин 40мМ, SDS 0,5%, Метанол 20% в камере для полусухого переноса (Hoefer scientific) в течение ночи при 50 мА Затем проводили Вестерн-блот анализ

Для проведения Вестерн-блот анализа использовали коммерческие наборы с хемилюминисцентной детекцией (ECL plus Western Blotting Detection System Amersham Biosciences) согласно приложенным протоколам Хемилюминисцентный сигнал детектировали с помощью фотопленки Kodak Biomax Light Film После проявления автографы сканировали, величину оптической плотности измеряли в программе Adobe Photoshop 5 0 Антитела использовали в следующих разведениях Против AQP2, AQP3, РКСа, РКС б, РКС £ в разведении 1 4000, вторичные антитела в разведении 1 10000 На атографах, полученных с помощью специфических антител против AQP2 и AQP3 детектировали 2 полосы, размерами около 50 кД и ЗОкД, отражающие рибозилированную и нерибозилированную форму белка При денситометрии учитывалась суммарная оптическая плотность 2-х полос На атографах, полученных с помощью специфических антител против РКСа детектировали одну полосу размером около 80 кД, против РКС 5 - около 70 кД, против КС С, - около 75 кД Статистика

Для оценки достоверности различий в изучаемых группах применяли t-критерий Стьюдента для парных сравнений Различия признавались достоверными при р<0,05 Для сравнения независимых выборок анализ достоверности различий проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа Различия признавались достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Регуляция десмопрессином водной проницаемости клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы и экспрессии AQP2, AQP3 в постнатальном онтогенезе

Известно, что почка незрелорожденных млекопитающих, в том числе и крыс, в раннем постнатальном онтогенезе не чувствительна к вазопрессину и не способна продуцировать осмотически концентрированную мочу (Nash, Edelman, 1973, Dlouha, 1976, Elinder, 1989) Вазопрессин начинает играть регуляторную роль у крыс между 2-й и 3-й неделями после рождения В наших экспериментах было показано, что клетки собирательной трубки крыс в возрасте от 9 до 12 дней имеют водную проницаемость примерно в 3 раза ниже, чем у взрослых животных и не чувствительны к действию селективного агониста V2 рецепторов вазопрессина -десмопрессина Реакция клеток на десмопрессин, выражающаяся в увеличении водной проницаемости мембраны, появляется на 20-24 день постнатального развития (Рис 1)

Рис. 1. Эффект десмопрессина на водную проницаемость плазматической мембраны клеток собирательных трубок почки крыс в постнатальном онтогенезе. По оси ординат -коэффициент осмотической водной проницаемости (Pf, мкм/сек) Линиями соединены значения индивидуальных измерений Pf до и после 25 минут воздействия

десмопрессина у 10-ти дневных (квадраты), 20-24 дневных (треугольники) и взрослых (кружки) животных

По-видимому, низкая водная проницаемость собирательных трубок у 9-12 дневных животных обусловлена пониженной экспрессией водных каналов в плазматической мембране клеток эпителия В главных клетках собирательных трубок почки крысы находят три типа аквапоринов AQP2, AQP3 и AQP4, но в наружном мозговом веществе локализованы главным образом AQP2 и AQP3 (Brown, 1995, Terris et al, 1995) В экспериментах по оценке содержания белка водных каналов было показано, что количество AQP2 и AQP3 в плазматической мембране увеличивается в ходе постнатального онтогенеза Инкубация срезов почки с десмопрессином (dDAVP 10"8М, 30 мин) и дегидратация животных приводили к увеличению экспрессии AQP2 в плазматической мембране, начиная с 20-ти дневного возраста, что совпадает со временем появления реакции собирательных трубок на десмопрессин (Рис 2) Такая же картина наблюдалась и для AQP3

Причина отсутствия чувствительности эпителия собирательных трубок к вазопрессину на ранних этапах развития в настоящее время активно обсуждается Существуют данные, позволяющие предположить, что в раннем постнатальном периоде несовершенен как сам рецептор, так и сопрягающий компонент при наличии функционально активной аденилатциклазы (Иванова и др, 1990) Кроме того, важное значение придают активности фосфодиэстеразы, разрушающей цАМФ Но на данный момент не накоплено достаточно данных, позволяющих выявить значимость фосфодиэстеразы в становлении реакции на вазопрессин Кроме фосфодиэстеразы, в роли ингибитора действия вазопрессина на водную проницаемость эпителия собирательных трубок, рассматривают PGE2 (Hebert et al, 1990, Zelenma et al, 2000) PGE2, связываясь со своими рецепторами ЕРЗ (Takeuchi et al, 1993), приводит к подавлению синтеза цАМФ, вызванного вазопрессином, что, в итоге, может приводить к подавлению водной проницаемости собирательных трубок (Zelenma et al, 2000) Значительный вклад в цитоплазматическую рецепцию цАМФ обусловлен регуляторными субъединицами цАМФ-зависимой протеинкиназы (РКА) В период вининга происходит смена типов регуляторных субъединиц, и свойства цАМФ-связывающих белков становятся , по видимому, более адекватными для регуляции активности цАМФ-зависимой протеинкиназы

(Соленов, Иванова, 1985). Кроме того, все большее влияние уделяется вероятному участию кальций-зависимых путей трансдукции сигнала вазопрессина в созревании гормонального ответа.

А.

! О дней 20-24 лня взрослые 49кД '-—---------—■--—

36 кД * V»» № Ш ^^ ЧШ

-' ■ ■ '

Б.

Рис. 2. Содержание белка АС?Р2 в мембранной фракции наружного мозгового вниисгва почки крыс в посткатальном онтогенезе. Влияние инкубации с (Шл\Р и дегидратации животных.

А, Типичный автограф, полученный с помощью Вестерн-блог анализа. Слева направо -10 дневные животные: контроль, сШАУР, 20-24 дневные: контроль, <ШДУР, водная депривация, взрослые: контроль, (ГОАУР, водная депривация.

Б. Де не ито метрический анализ автографов. Столбцы на рисунке Б соотвествуют полоскам на рисунке А. По оси ординат - суммарная оптическая плотность двух полос (рибозилированная и нерибозилнро ванная формы белка)

Число измерений п=9, *-р<0.05. по отношению к 9-12 дневным животным, # -<0,05 по отношению к контролю внутри возрастной группы

Оценка экспрессии различных изо форм РКС в наружном мозговом веществе ночки крыс разного возраста,

13 настоящее время активно изучается возможное участие кальция и кальций-зависимых протеин к ин аз (РКС) в реализации и становлении эффекта вазочрессина на эпителий собирательных трубок. Так, показано, что долговремеиенное ингибирование функции РКС в ходе развития приводит к нарушению нефрогенеза (5ег1асЫик е( а!., 1997). В пользу этой гипотезы говорит и факт снижения концентрирующей способности г го чек у мышей с мутацией в гене, кодирующем РКСа (Уао е( а1., 2004).

В данной работе с использовпием Вестерн-блот анализа оценивалась экспрессия белка трех изоформ РКС у крыс в разные периоды постнатаяьного

развития: кальций-зависимой РКСа, кальций-независимой РКС 5 и атипичной РКС с,. Было показано, что экспрессия РКСа и РКС6 увеличивается к холе развития, в то время как экспрессия и перераспределение РКС !; в плазматическую мембрану остаются неизменными. При этом наиболее вероятным участником механизмов созревания гормональной компетентности клеток собирательных трубок к вазопрессину является кальций зависимая РКСа, поскольку ее общее количество и экспрессия в плазматической мембране максимальна на 20-24 день, что совпадает с периодом становления эффекта вазопрессина на проницаемость собирательных трубок (Рис, 3). Кроме того, на 20-24 день, происходит перераспределение белка РКСа в мембранную фракцию (Рис. 3), что принято связывать с увеличением вероятности нахождения фермента в активной форме (Вам, Г\:е1ьгагиег], 1988; МоеЫ-Ко8еп еьа1., 1991). Совокупность литературных и полученных нами данных позволяет предположить, что РКСа может принимать непосредственное участие в процессе реализации реакции на вазопрессин.

А. Б.

и

г-Ц

¡и

1

9-12 дней Г~Н 20-24 дня ИЗ взрослые

С1] 9-12 лией СИ] 2С-24 ли ИСТ азрос:1ые

/ /у //У // / /■/ /// //

4 ■ у + у

Рис, 3, Влияние <ШАУР и дегидратации 'животных на содержание белка РКСа в наружной мозговом после веществе почки у крыс разного возраста

А. Суммарное количество белка РКСа (содержание в цитозольной + мембраной фрации наружного мозгового вещества почки крысы). По оси ординат-оптическая плотность.

Б. Соотношение содержания белка РКСа в мембраной фракции отнесенное к содержанию в цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки.

Количество измерений для каждой возрастной группы п=10, *-р<0.05 по сравнению с 10-ти дневными животными.

Экспрессии многих белков, принимающих непосредственное участие в эффекте вазопрессина на водную проницаемость собирательных трубок, таких как ЛрР2, АРРЗ, У2-рецептора возрастает в ответ на водную депривацию животных и экзогенное введение гормона (НауакЫ е!.а1., 1994; МЫзеп ет.а!,, 1996; ЕссШаг^ег с1.а!.. 1997; итешзЫ е1а1.,1996; НаЫег е1.а!.. 2002). В данной работе мы исследовали

содержание белка РКСа в цитозольной и мембранной фракциях наружного мозгового вещества почки крысы у контрольных, дегидратированных животных и после 30 минутной инкубации срезов с dDAVP (10" M) Было показано, что дегидратация животных и введение dDAVP не оказывает эффекта на общее содержание и перераспределение РКСа у крыс всех исследуемых возрастов Это согласуется с литературными данными, полученными на клеточной линии LLC-PK1 и микродиссектированных собирательных трубок внутреннего мозгового вещества согласно которым инкубация с вазопрессином не приводила к транслокации альфа изоформы РКС из цитозольной фракции в мембранную (Dibas et al, 1996, Chou et al, 1998)

Поскольку активация РКС зависит не только от ее локализации в плазматической мембране, но и от конформационного состояния фермента, Вестерн-блот анализ не позволяет оценить изменения активности РКС Можно предположить, что в ходе постанатального развития происходит накопление РКС и для реализации эффекта вазопрессина достаточно активации фермента, уже локализованного в мембране

Влияние внутриклеточного хелатора Са2+ на десмопрессин-зависимое повышение водной проницаемости собирательных трубок почки крысы и содержание РКСа и водных каналов типов 2 и 3.

Известно, что вазопрессин приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция (Star et al, 1988, Chou et al, 1998) Было показано, что в клетках собирательных трубок повышение концентрации кальция под действием вазопрессина не связано с активацией фосфолипазы С и увеличением содержания IP3 (Chou et al, 1998) Возможно, вызываемое вазопрессином повышение внутриклеточной концентрации Са2+ в главных клетках собирательных трубок может быть опосредовано активацией аденилатциклазной системы Для выявления вероятного участия кальция в реализации эффекта вазопрессина мы провели исследование влияния внутриклеточного хелатора кальция В АРТА на десмопрессин-зависимое повышение водной проницаемости эпителия собирательных трубок В наших экспериментах было показано, что предварительная инкубация собирательных трубок с ВАРТА не оказывала эффекта на нестимулированную водную проницаемость клеток эпителия, но подавляла эффект dDAVP на величину водной проницаемости (Рис 4) Поскольку связывание хелатором ионов кальция в клетках эпителия собирательных трубок приводило к подавлению действия десмопрессина, наши данные подтверждают значимость повышения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в механизме трансдукции сигнала АДГ Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что инкубация канальцев гидратированных крыс с dDAVP в течение 30 минут приводила к увеличению коэффициента водной проницаемости базолатеральной мембраны 2,3 раза (Батурина и др, 2003, Solenov et al, 2003) Для выявления роли внутриклеточного кальция в реализации эффекта вазопрессина на базолатеральную мембрану клеток эпителия собирательных трубок нами были поставлены эксперименты по оценке гидроосмотического действия десмопрессина при предварительной загрузке клеток хелатором кальция ВАРТА Было показано, что нестимулированная водная проницаемость базолатеральных мембран при этом остается неизменной, однако наблюдается ингибирование эффекта dDAVP на коэффициент водной проницаемости (Рис 4) Вероятно, повышение концентрации внутриклеточного кальция при воздействии вазопрессином играет важную роль в реализации эффекта

ЛДГ как на тотальную проницаемость эпителия, так и на родную проницаемость только базолатеральной мембраны.

250-, 225200175150-ÍÍ5-100755025-

А,

Рг цу/с

V

ГА

г

ш

3

гоо 175 150 125 1007550 26 0

л*

ítír

Ряс. 4. Влияние десмопрессина (dDAVP) и в куч рн клеточного хелатора кальция (ВЛРТА) на водную проницаемость тотальной (А) в базолатеральной (Б) мембран собирательных трубок почки крысы. По оси ординат - величины РЛмкм/сех), но оси абсцисс - контроль, Pf интактной ткани, - dDAVP (!0's .4), -контроль после загрузки ВАРТА (5 мкМ), -ВАРТА (5 мкМ) и dDAVP (10 s М). Линиями соединены измерения водной проницаемости в контроле и после инкубации с dDAVP для каждой собирательной трубки. **р<0.05 по сравнению с контролем

Повышение водной проницаемости клеток эпителия обусловлено увеличением количества водных каналов в плазматической мембране, главным образом, по-видимому, аквапоринов 3 и 2. Согласно результатам Вестерн-б.лот анализа, проведенного с использованием специфических антител против аквапоринов типа 3 и 2 видно повышение содержания белка этих каналов в суммарном препарате плазматических мембран, выделенных из ткани наружного мозгового вещества почки (Рис, 5). При этом повышение содержания AQP3 при кратковременных воздействиях десмопрессином нами было показано впервые. Связывание внутриклеточного кальция хелатором ВАРТА приводит к ингибированию повышения содержания белка аквапорина 2 п мембранной фракции, вызванного десмопрессином- Реакцию аквапорина 3 на десмопресеин, хелатирование внутриклеточного кальция не изменяет (Рис. 5), и вестерн-анализ показывает повышение количества этого белка, по-видимому, в базолатеральной мембране, поскольку пег данных об экспрессии AQP3 на апикальной поверхности.

В главных клетках собирательных трубок экспрессируются аквапорины типов 2, 3, 4. Аквапорин 2, известный как ваз о прессин-регулируемый водный канал встраивается преимущественно в апикальную мембрану. AQP3 находят в базолатеральной мембране (Hayashi et.al.. 1994; Mar pi« et.a!., 1998; Takeaki el.al.,1999), Однако, как следует из литературных данных AQP2 может встраиваться не только в апикальную, но и в базолатеральную мембрану, (Katsura.,1995). Преимущественно базолатеральное распределение AQP2 после воздействия вазопрессина было получено также и па первичной кулыурс клеток наружного мозгового вещества (Marie et al, 1998), До последнего времени вопрос о возможном

вкладе этого белка в водную проницаемость базолатеральной поверхности, в частности клеток собирательных трубок в наружном мозговом веществе, остается открытым. В наших экспериментах хеяатирование внутриклеточного кальция не отменяло повышения экспрессии белка AQP3 в плазматической мембране, но подавляло прирост волной проницаемости при действии десмопреесина. Таким образом, можно допустить, что AQP2 участвует в повышении водной проницаемости обеих поверхностей эпителия собирательной трубки я наружном мозговом веществе, и внутриклеточный кальций вовлечен в регуляцию его функции. Это хорошо согласуется с литературными данными, согласно которым при связывании внутриклеточного кальция хелатором ВАРГА не происходит встраивания везикул с AQP2 в апикальную мембрану под воздействием десмопреесина (Chou et al., 2000; Yip. 2002), С другой стороны, нельзя исключать, что изменение проницаемости может быть связано с регуляцией функции водных каналов, локализованных в базолатеральной мембране главных клеток собирательшя трубок ACJP3 и AQP4.

А.

Б,

"APTA

В A IT А

коетттшль tPAVP ко1гтроль dDAVP IЁШ "" ШШ. •vjS^S ф яррГ

ъ* - ' - i'1"

контроль dDAVP контроль dDAVP

Г.

Y

■ i Ж • - ■ ~

■

ооГ'»

M*

Рис. 5. Влияние внутриклеточного хелатора кальция НАРТА на десмопресснн-зависимое повышение содержания ЛОР 2 и АрРЗ в мембранной фракции наружного мозгового вещества почки крысы.

А, Б. Пример автографов, полученных с помощью Вестерн-б лот анализа. Дорожки 1 и 2 - контрольная группа: 1-контроль, 2- (10АУР; 3 и 4 - срезы предварительно загруженные В А РТА: 3-контроль. 4- десмопресснн (10'8 М).

А - первичаые антитела против аквапорина2.

В - первичные антитела против аквапоринаЗ. В,Г Денситометрическин анализ сигнала, определяемого в мембранной фракции (суммарно риСозипирвдаи!!ая и иерибсз.широййнная форма белка). Столбцы на рисунке В соотвеетвуют полоскам на рисунке А . Столбцы на рисунке Б соотвествуют полоскам на рисунке I". По оси ординат - относительная оптическая плотность.

Подавление ингибитором РКС Ro-31-8220 эффекта десмопрессина на водную проницаемость базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы

За последние несколько лет активно развиваются работы в направлении исследования роли кальций-зависимых изоформ РКС в механизмах поддержания водно-солевого баланса организма млекопитающих (Yao et al, 2004, Уао et al, 2006), но на данный момент не было установлено значение активности РКС в механизме вазопрессин-зависимой регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок В наших экспериментах по оценке экспрессии РКСа ВАРТА не оказывал заметного влияния на содержание и перераспределение белка Однако, в экспериментах проведеннных на клеточной линии С6, с трансфецированной а-изоформой РКС, было показано влияние ионов кальция на ее транс токацию из цитозоля в мембрану Удаление кальция из омывающего раствора приводило к значительному снижению содержания РКСа в мембране, и, напротив, повышение внутриклеточной концентрации кальция с помощью ионофора иономицина приводило к встраиванию фермента в клеточные мембраны (Chen, 1994) Возможно, происходит кратковременное, обратимое увеличение активности РКС В пользу этой гипотезы косвенно говорит и тот факт, что как принудительное ингибирование, так и дополнительная стимуляция РКС приводит к нарушению осцилляций концентрации кальция, вызываемых вазопрессином (Schaefer М, Mischak Н et al, 2004) В наших экспериментах было показано, что инкубация канальцев с ингибитором РКС Ro-31-8220 приводила к перераспределению РКСа из мембранной фракции в цитозольную, что указывает на ингибирование ее ферментативной активности, и подавлению эффекта десмопрессина на водную проницаемость эпителия собирательных трубок При этом Ro-31-8220 в использованной концентрации не оказывал воздействия на нестимулированную водную проницаемость собирательных трубок Аналогичное действие ингибитор оказывал на собирательные трубки 20-24 дневных животных (Таблица 1) Эти данные указывают на то, что функционально активные изоформы протеинкиназы С могут участвовать в трансдукции сигнала АДГ и реализации его эффекта

Таблица 1. Коэффициент осмотической водной

проницаемости(Р/ мкм/сек) клеток собирательных трубок при различных

экспериментальных воздействиях (М± ш) *-р<0 05 отличия при экспериментальных воздействиях внутри одной группы животных, по сравнению с предыдущим состоянием канальца

экспериментальное воздействие Р/ мкм/сек

нестимулированная проницаемость/ dDAVP 124+9,5/192+15,8 *

Ro-31 -8220/Ro-31 -8220+dDAVP 115+19,2/105+18,3

BAPTA/BAPTA+dDAVP 123±13,2/125±14,1

нестимулированная проницаемость/ дб-цАМФР 136+15,1/197+16,2*

Ro-3 l-8220/Ro-31-8220 +дб-цАМФ 122+10,5/183+15,1*

ВАРТА/ВАРТА+дб-цАМФ 138±15,5/157±20,3

Влияние ингибитора РКС Ro-31-8220 и внутриклеточного хелаюра кальция ВАРТА на эффект цАМФ-дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательной трубки почки крысы

Для выявления вероятной локализации действия РКС в механизме трансдукции сигнала вазопрессина, мы провели эксперименты по измерению водной проницаемости эпителия собирательных трубок под действием проникающего аналога цАМФ- дибутирил-цАМФ (дбцАМФ) Было показано, что инкубация канальцев с дбцАМФ так же, как и с десмопрессином приводит к увеличению водной проницаемости эпителия, что является ожидаемым результатом, поскольку хорошо известно, что связывание вазопрессина с V2 рецептором приводит к активации аденилатциклазы (Chabardes et al, 1996, Hoffert at al, 2005), являющейся основным вторичным посредником в механизме трансдукции сигнала вазопрессина При этом прединкубация канальцев с ингибитором РКС не приводила к отмене этого эффекта Можно предположить, что РКС участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ Наиболее вероятным элементом воздействия в данном случае представляется аденилатциклаза В главных клетках собирательных трубок почки экспрессируются 2 изоформы аденилатциклазы -АЦ 3 и АЦ6, которые могут регулироваться РКС и кальцием Согласно современным литературным данным, АЦ6 может активироваться протеинкиназой С (Beazely et al, 2005) Кроме того, методами иммуногистохимии была показана экспрессия кальмодулин-зависимой АЦЗ, которая экспрессируется в собирательных трубках внутреннего мозгового вещества (Hoffert et al, 2005) Можно предполагать, что РКС способна модулировать вазопрессин- засисимое накопление цАМФ, действуя через аденилаткциклазы 3 и 6 типов Тот факт, что инкубация с внутриклеточным хелатором кальция ВАРТА приводит к ингибированию эффекта проникающего аналога цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок указывает на необходимость повышения внутриклеточной концентрации кальция Наиболее вероятным представляется участие внутриклеточного кальция во встраивании и транспорте везикул, содержащих AQP2 в плазматическую мембрану Согласно литературным данным, при обработке ВАРТА может повышаться концентрация цАМФ, но нарушается транспорт AQP2 из внутриклеточных депо в плазматическую мембрану (Chou et al, 2000) Возможно, увеличение уровня цАМФ в клетке приводит к активации РКА, которая в свою очередь способна фософрилировать рианодиновые рецепторы и обеспечивать увеличение концентрации внутриклеточной концентрации кальция Однако, разработка этой гипотезы требует проведения дополнительных экспериментов

ВЫВОДЫ

1 В ходе постнатального онтогенеза происходит повышение водной проницаемости эпителия собирательных трубок, которое, вероятно, опосредовано увеличением экспрессии водных каналов 2 и 3 типов Созревание механизма трансдукции сигнала вазопрессина к 20 дню постнатального онтогенеза обеспечивает повышение содержания этих водных каналов в мембране клеток, что лежит в основе появления реакции на вазопрессин

2 Экспрессия альфа и дельта изоформ РКС изменяется в ходе посгнатального онтогенеза Содержание кальций зависимой альфа изоформы РКС в мембранной фракции максимально у 20-24 дневных животных, в период становления реакции на десмопрессин При этом общее количество белка РКСа в наружном мозговом веществе почки крысы и соотношение фермента в мембранной и цитозольной

фракциях не изменяется при дегидратации животных и инкубации срезов почки с десмопрессином

3 Связывание внутриклеточных ионов Са2+ подавляет вазопрессин-зависимое повышение водной проницаемости клеток собирательных трубок почки крыс и приводит к ингибированию повышения содержания белка АС)Р2 в мембранной фракции наружного мозгового вещества почки, вызванного десмопрессином Реакцию А<ЗРЗ на десмопрессин, выражающуюся в увеличении содержания данного белка в плазматичеких мембранах, хелатирование внутриклеточного кальция не изменяет

4 Селективный ингибитор протеинкиназы С Яо-31-8220 вызывает перераспределение РКСа из мембранной франкции в цитозоль, при этом не влияет на величину нестимулированной водной проницаемости, но подавляет эффект десмопрессина на водную проницаемость общей поверхности клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы у взрослых животных и в конце вининга

5 Проникающий аналог цАМФ (дбцАМФ) так же, как и десмопрессин, оказывает стимулирующее действие на величину водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок, при этом ингибирование протеинкиназы С не оказывает влияния на эффект дбцАМФ на водную проницаемость Предполагается, что протеинкиназа С участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ

6 Внутриклеточный хелатор кальция ВАРТА приводит к ингибированию повышения коэффициента водной проницаемости, вызванного проникающим аналогом цАМФ Повышение внутриклеточного кальция, вероятно, необходимо на различных этапах передачи сигнала в клетках эпителия собирательных трубок почки крысы

7 Таким образом, в процессе постнатального становления реакции на вазопрессин в эпителии собирательных трубок почки крыс одновременно с развитием цАМФ-зависимого пути трансдукции сигнала гормона происходит формирование системы кальций-зависимой регуляции, которая завершается к 2024 дню жизни

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Батурина Г С , Ходус Г Р , Исаева Л Е, Нестеров В В , Соленов Е И, Иванова Л Н Влияние водной депривации на транспорт воды через базолатеральную поверхность эпителия собирательных трубок почки крысы // Тезисы докладов всероссийской конференции с международным участием Механизмы функционирования висцеральных систем С 32, Санкт-Петербург, Россия 2003

2 Батурина Г С , Исаева Л.Е , Ходус Г Р , Нестеров В В , Соленов Е И, Иванова Л Н Водная проницаемость базолатеральной мембраны собирательных трубок наружного и внутреннего мозгового вещества почки крыс в условиях дегидратации и при действии сЮАУР // Росс физиол журнал им И М Сеченова 2004 Т 90 № 7 С 865-872

3 Исаева Л Е., Нестеров В В , Катков С П, Батурина Г С , Ходус Г Р , Соленов Е И, Иванова Л Н Метод дифференциальной оценки величины водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток эпителия вдоль собирательной трубки // Тезисы докладов XIX Съезда физиологического общества им И П Павлова Росс физиол жури им И М Сеченова Т 90 № 8 С 63 2004

4 Соленов Е И, Нестеров В В , Батурина Г С , Ходус Г Р , Исаева Л.Е , Иванова Л Н Регуляция водной прониацемости эпителия собирательных трубок почки вазопрессином в постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов XIX Съезда физиологического общества им ИП Павлова Росс физиол журн им И М Сеченова Т 90 № 8 С 11 2004

5 Ходус Г Р , Батурина Г С, Нестеров В В , Исаева Л Е , Е И Соленов, Иванова Л Н Исследование водной проницаемости клеток собирательных трубок почки Применение автоматического анализа изображения // Тезисы докладов XIX Съезда физиологического общества им И П Павлова Росс Физиол Журн Им И М Сеченова Т 90 № 8 С 74 2004

6 Исаева Л.Е., Батурина Г С Возможная роль Gi белков и гиалуронангидролаз в регуляции водной проницаемости эпителия собирательных трубок почки крысы при водной депривации// Тезисы докладов седьмой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, С 108, Ст -Петербург, 2004

7 Каткова Л.Е., Нестеров В В , Соленов Е И, Иванова Л Н Роль ионов Са2+ в регуляции вазопрессином водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток эпителия собирательных трубок почки крыс// Тезисы докладов V Сибирского физиоло1 ического съезда Бюллетень сибирской медицины 2005 Приложение 1 С 55 Т 4 Томск, 2005

8 Ходус Г Р , Каткова Л.Е., Нестеров В В , Соленов Е И, Иванова Л Н Участие кальций-зависимых путей трансдукции сигнала вазопрессина в регуляции водной проницаемости эпителия собирательных трубок почки мыши // Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда Бюллетень сибирской медицины 2005 Приложение 1 С 57 Т 4 Томск, 2005

9 Каткова Л.Е , Нестеров В В, Ходус Г Р , Иванова Л Н Роль ионов Са2+ в вазопрессин-зависимой регуляции водной проницаемости базолатеральной поверхности собирательных трубок почки крыс // Тезисы докладов IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им И П Павлова РАН «Механизмы функционирования висцеральных систем» С 256, Ст -Петербург, 2005

10 Ходус РГ, Соленов ЕИ, Нестеров ВВ, Каткова Л.Е., Иванова ЛН Роль кальций зависимых процессов в регуляции вазопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок почки мыши // Росс физиол журнал им И М Сеченова 2006 Т 92 № 5 С 626-632

11 Соленов Е И , Каткова Л Е., Нестеров В В , Иванова Л Н Роль Са2+ и аквапорина2 в регуляции водной проницаемости базолатеральной мембраны собирательной трубки почки крыс // Росс физиол журнал им И М Сеченова

2006 Т 92 №11 1358-1364

12 Нестеров В В , Каткова Л Е , Батурина Г С , Соленов Е И , Иванова Л Н Роль Gi-белков в регуляции водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток эпителия собирательной трубки почки крысы // Росс физиол журнал им И М Сеченова 2007 Т 93 № 3 С 329-336

13 Соленов Е И ,Логвиненко Н С .Каткова Л Е, Ходус Г Р Регуляция клеточного объема главных клеток собирательных трубок почки крысы в условиях гипоосмотического шока Влияние вазопрессина и альдостерона //Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им Павлова С 426 Москва,

2007

Подписано к печати 12 сентября, 2007г Формат бумаги 60 х 90,1/16 Печ л 1 Уч изд л 0,7

Тираж 100 экз Заказ 109_

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр ак Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каткова, Любовь Евгеньевна

Список сокращений.

Введение.

Акутальность проблемы.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость.:.

Апробация материалов.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Морфофункциональная характеристика нефрона почки млекопитающих.

1.2. Транспорт воды через эпителий собирательных трубок почки.

1.3.Регуляция проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок вазопрессином.

1.4. Кальций-зависимые пути регуляции водной проницаемости плазматической мембраны эпителия собирательных трубок вазопрессином.

1.5. Модуляторы регуляции водной проницаемости эпителия сбирательных трубок вазопрессином.

1.6.Регуляция проницаемости базолатеральной мембраны.

1.7. Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в постнатальном онтогенезе.

1.8.3аключение.

Глава II. Материалы и методы.

2.1.Экспериментальные животные.

2.2. Реактивы.

2.3.Измерение водной проницаемости эпителия собирательных трубок.

2.3.1 Растворы.

2.3.2 Обработка стекол полилизином.

2.3.3 Получение фрагментов собирательных трубок.

2.3.4 Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок.

2.3.5 Измерение водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок.

2.3.6 Исследование влияния dDAVP на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок у крыс разного возраста.

2.3.7. Оценка влияния проникающего аналога цАМФ - дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок.

2.3.8. Исследование влияния внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект dDAVP и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок.

2.3.9. Исследование влияния ингибитора протеинкиназы С на эффект dDAVP и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок.

2.4. Вестерн-блот анализ.

2.4.1. Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами.

2.4.2. Полученение мембранной и цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки.

2.4.3. Измерение концентрации белка.

2.4.5. Электрофоретическое разделение белков, перенос белко на

PVDF мембрану.

2.4.6 Проведение Вестерн-блот анализа.

2.5. Статистика.

Глава III. Результаты исследований.

3.1. Регуляция водной проницаемости клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы и экспрессии AQP2, AQP3 десмопрессином в постнатальном онтогенезе.

3.2. Оценка экспрессии различных изоформ РКС в наружном мозговом веществе почки крыс разного возраста.

3.3. Влияние внутриклеточного хелатора Са2+ на десмопрессин-зависимое повышение водной проницаемости собирательных трубок почки крысы и содержание РКСа и водных каналов 2 и 3 типа.

3.4. Подавление ингибитором РКС Ro-31-8220 эффекта десмопрессина на водную проницаемость базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы.

3.5. Влияние ингибитора РКС Ro-31-8220 и внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект цАМФ-дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательной трубки почки крысы.

Глава IV. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль протеинкиназы С и кальция в регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок почки крысы вазопрессином в постнатальном онтогенезе"

Акутальность проблемы.

У млекопитающих главным эффекторным органом системы поддержания водного гомеостаза является почка. Экскреция осмотически свободной воды определяется ее реабсорбцией в собирательных трубках под действием вазопрессина. Согласно современным представлениям, основной механизм увеличения транспорта воды через главные клетки собирательных трубок почки под действием вазопрессина состоит в обратимом встраивании аквапорина 2 (AQP2) в апикальную мембрану. На молекулярном уровне происходит связывание гормона со специфическими V2 рецепторами, расположенными на базолатеральной мембране клеток собирательных трубок. Образование гормон-рецепторного комплекса приводит к активации аденилатциклазы, происходит наработка цАМФ что, в свою очередь, приводит к запуску каскада внутриклеточных процессов, одним из конечных результатов которых является встраивание AQP2 в апикальную мембрану (Agre,1993; Nielsen et.al., 1995; Shaw, Marples, 2002; Hoffert et.al., 2005).

Кроме того, по-видимому, существуют пути регуляции проницаемости клеток собирательных трубок почки, в которых непосредственно не участвует цАМФ. Было установлено, что вазопрессин, наряду с повышением количества цАМФ, вызывает кратковременное повышение концентрации внутриклеточного кальция, которое показано в клетках собирательных трубок внутреннего мозгового вещества (Соленов и др., 1991; Ecelbarger et.al., 1996; Chou et.al., 1998). При этом не наблюдается повышения концентрации кальция при действии дб-цАМФ, 8-бромо-цАМФ и форсколина, активирующих цАМФ зависимый путь трансдукции сигнала вазопрессина (Nickols et al., 2004). Увеличение концентрации кальция, очевидно, имеет важное значение для реализации эффекта вазопрессина в собирательных трубках, поскольку обработка суспензии собирательных трубок хелатором кальция-ВАРТА AM приводит к подавлению реакции на гормон (Chou et al., 2000; Yip, 2002).

PKC является одним из наиболее вероятных участников цАМФ независимого пути регуляции водной проницаемости собирательных трубок вазопрессином и, вероятно, может принимать участие в механизмах созревания чувствительности к гормону в ходе постнатального онтогенеза. Так, было показано, что хроническая обработка ингибитором РКС приводит к нарушению нефрогенеза (Saxena et al., 1994; Serlachius et al., 1997)

Однако, несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярных основ действия вазопрессина, многие аспекты остаются неясными. Среди них - процессы становления гормональной компетентности почки в ходе постнатального развития.

В ранний постнатальный период почка незрелорождающих млекопитающих нечувствительна к действию антидиуретического гормона (вазопрессина). У крыс гормональная компетентность к действию вазопрессина появляется у 20-22 дневных животных, что совпадает с концом периода виннинга и переходом от молочного вскармливания к самостоятельному питанию. В этот период завершается формирование всего комплекса регуляторных систем водно-солевого гомеостаза, обеспечивающих работу почки, исходя из потребностей организма (Aperia, Herin, 1975; Dlouha, 1976; Соленов, Иванова, 1997). Однако причины отсутствия реакции на вазопрессин в настоящее время не ясны. Исследования формирования чувствительности почки к вазопрессину относительно немногочисленны и носят фрагментарный характер. В то же время, понимание процесса становления гормональной компетентности почки необходимо для прояснения путей поддержания водно-солевого гомеостаза в ходе постнатального развития.

Целью настоящей работы являлось исследование роли РКС и внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости эпителия собирательных трубок почки крысы в постнатальном онтогенезе.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Получить данные о влиянии водной депривации и десмопрессина, агониста V2 рецепторов вазопрессина, на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок почки крысы и на содержание водных каналов 2 и 3 типов в мембранной фракции наружного мозгового вещества у взрослых животных и в постнатальном онтогенезе.

2. Оценить изменение содержания и перераспределение белка из цитозольной фракции в плазматическую мембрану различных изоформ протеинкиназы С в ходе постнатального развития

3. Исследовать участие протеинкиназы С в регуляции вазопрессином водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок мозгового вещества почки взрослых мышей и в ходе постнатального онтогенеза.

4. Исследовать роль внутриклеточного кальция в регуляции вазопрессином водной проницаемости клеток собирательных трубок мозгового вещества почки крысы

Научная новизна.

С использованием разработанного в лаборатории метода была охарактеризована водная проницаемость собирательных трубок почки крысы. Показано, что водная проницаемость плазматической мембраны клеток собирательных трубок повышается в ходе постнатального развития, и одновременно нарастает содержание водных каналов 2 и 3 типов в плазматической мембране.

Впервые показано подавление эффекта десмопрессина на водную проницаемость ингибитором протеинкиназы С и выяснено, что протеинкиназа С участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ

Обнаружено, что связывание внутриклеточного кальция с помощью хелатора ВАРТА приводит к подавлению стимулируемой десмопрессином водной проницаемости общей поверхности и базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы.

Установлено, что созревание механизмов трансдукции сигнала вазопрессина, в том числе и кальций-зависимых путей, происходит к 20-24 дню постнатального развития.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные дополняют и расширяют существующующие представления о механизмах действия вазопрессина на эпителий собирательных трубок почки млекопитающих. Кроме того, результаты данного исследования могут иметь и прикладное значение, поскольку дефект любого из звеньев на пути передачи гормонального сигнала вазопрессина приводит к тяжелейшим нарушениям водно-солевого гомеостаза, особенно в детском возрасте. Глубокое и всестороннее исследование механизмов регуляции водного и ионного транспорта в клетках эпителия почки позволит применить полученные данные в разработке методов компенсации нарушений водного баланса у человека.

Апробация материалов.

Материалы диссертации доложены на конференции, посвященной 80-летию со дня рождения М. Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), XX съезде физиологического общества им.Павлова (Москва, 2007).

Основное содержание диссертации изложено в 4 статьях и 9 тезисах докладов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Каткова, Любовь Евгеньевна

Выводы.

1. В ходе постнатального онтогенеза происходит повышение водной проницаемости эпителия собирательных трубок, которое, вероятно, опосредовано увеличением экспрессии водных каналов 2 и 3 типов. Созревание механизма трансдукции сигнала вазопрессина к 20 дню постнатального онтогенеза обеспечивает повышение содержания этих водных каналов в мембране клеток, что лежит в основе появления реакции на вазопрессин.

2. Экспрессия альфа и дельта изоформ РКС изменяется в ходе постнатального онтогенеза. Содержание кальций зависимой альфа изоформы РКС в мембранной фракции максимально у 20-24 дневных животных, в период становления реакции на десмопрессин. При этом общее количество белка РКСа в наружном мозговом веществе почки крысы и соотношение фермента в мембранной и цитозольной фракциях не изменяется при дегидратации животных и инкубации срезов почки с десмопрессином.

3. Связывание внутриклеточных ионов Са подавляет вазопрессин-зависимое повышение водной проницаемости клеток собирательных трубок почки крыс и приводит к ингибированию повышения содержания белка AQP2 в мембранной фракции наружного мозгового вещества почки, вызванного десмопрессином. Реакцию AQP3 на десмопрессин, выражающуюся в увеличении содержания данного белка в плазматичеких мембранах, хелатирование внутриклеточного кальция не изменяет.

4. Селективный ингибитор протеинкиназы С Ro-31-8220 вызывает перераспределение РКСа из мембранной франкции в цитозоль, при этом не влияет на величину нестимулированной водной проницаемости, но подавляет эффект десмопрессина на водную проницаемость общей поверхности клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы у взрослых животных и в конце вининга.

5. Проникающий аналог цАМФ (дбцАМФ) так же, как и десмопрессин, оказывает стимулирующее действие на величину водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок, при этом ингибирование протеинкиназы С не оказывает влияния на эффект дбцАМФ на водную проницаемость. Предполагается, что протеинкиназа С участвует в трансдукции сигнала вазопрессина на этапе, предшествующем образованию цАМФ.

6. Внутриклеточный хелатор кальция ВАРТА приводит к ингибированию повышения коэффициента водной проницаемости, вызванного проникающим аналогом цАМФ.Повышение внутриклеточного кальция, вероятно, необходимо на различных этапах передачи сигнала в клетках эпителия собирательных трубок почки крысы.

7. Таким образом, в процессе постнатального становления реакции на вазопрессин в эпителии собирательных трубок почки крыс одновременно с развитием цАМФ-зависимого пути трансдукции сигнала гормона происходит формирование системы кальций-зависимой регуляции, которая завершается к 20-24 дню жизни.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каткова, Любовь Евгеньевна, Б.м.

1. Зеленина М.Н., Соленов Е.И., Зеленин С.М., Иванова J1.H. Функциональная характеристика Gs-белка в развивающейся почке млекопитающих // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1994. Т. 80, № 7. С. 81-87.

2. Иванова J1.H., Горюнова Т.Е., Климова В.П. Активность гиалуронидазы в ткани почках белой крысы вызванная дегидратацией и действием экзогенного антидиуретического гормона.//Доклады Академии наук СССР. 1975. Т.224. С: 1209-1211.

3. Иванова J1.H., Зеленина М.Н., Логвиненко Н.Г., Свиташева Н.Г., Соленов Е.И. Возрастные изменения молекулярных механизмов гормональной регуляции функции почек // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1990. Т. 26, № 4. С. 482-489.

4. Пруцкова Н.П., Шахматова Е.И, Наточин Ю.В. Изучение функциональной роли V!- и V2- рецепторов апикальной и базолатеральной мембран клеток эпителия мочевого пузыря лягушки. //Физиологический журнал имени И.М.Сеченова. 2000. Т. 86. №1 С. 76-85.

5. Соленов Е.И., Батурина Г.С., Иванова JI.H. Влияние вазопрессина на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок почки в постнатальном онтогенезе крыс // Российский физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2001. Т. 87, № 7. С. 965-972.

6. Соленов Е.И., Иванова J1.H. Изучение цитоплазматических рецепторов цАМФ в почках крыс различного возраста с помощью гель-фильтрации // Бюлл. Эксперимент. Биол. и Мед. 1985. Т. XCIX, № 6. С. 683-685.

7. Соленов Е.И., Иванова JI.H. Онтогенетическое изменение рецептора вазопрессина в почке млекопитающих // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1997. Т. 83, № 7. С. 120-129.

8. Соленов Е.И., Иванова JI.H. Применение морфометрического подхода для изучения эффекта АДГ на изолированной собирательной трубке почки крысы // Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова. 1999. Т. 85, № 2. С. 290-297.

9. Соленов Е.И., Логвиненко Н.С., Свиташева Н.Г., Иванова JI.H. Влияние альдостерона и вазопрессина на концентрацию внутриклеточного Са2+ в кортикальных отделах собирательных трубок почек крыс.//Биологические мембраны. 1991. Т.8, № 8. С. 882-885

10. Шахматова Е.И., Пруцкова Н.П., Наточин Ю.В. Изучение роли люминальных рецепторов и простогландина Е2 в модуляции гидроосмотрического эффекта вазотоцина в мочевом пузыре лягушки.//Доклады академии наук. 1999.Т.368. №1 С.132-134.

11. Agre P. Aquaporin water channels in kidney // J. Am. Soc. Nephrol. -2000. Vol. 11. P. 764-777.

12. Agre P., Sasaki S., Chrispeels M. J. Aquaporins: a family of water channel proteins //Am. J. Physiol. 1993. Vol. 256. P. F461-F472.

13. Almazan G., Lefebvre D.L., Zingg H.H. Ontogeny of hypothalamic vasopressin, oxytocin and somatostatin gene expression// Brain Res. Dev. Brain Res. 1989. - Vol. 45(1). - P: 69-75.

14. Alper S.L., Natale J., Gluck S., Lodish H.F., Brown D. Subtypes of intercalated cells in rat kidney collecting duct defined by antibodies against erythroid band 3 and renal vacuolar Hl-ATPase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 5429-5433.

15. Ammar A, Roseau S and Butlen D. Postnatal ontogenesis of vasopressin receptors in the rat collecting duct // Mol. Cell. Endocrinol. -1992. Vol. 86.-P: 193-203

16. Ankorina-Stark I, Haxelmans S, Schlatter E. Functional evidence for the regulation of cytosolic Ca2+ activity via VlA-receptors and beta-adrenoceptors in rat CCD.Cell Calcium. 1997 Vol. 21(2) P:163-171.

17. Aperia A., Herin P. Development of glomerular perfusion rate and nephron filtration rate in rats 17-60 days old // Am. J. Physiol. 1975. Vol. 228(5). P. 1319-1325.

18. Baertschi A.J., Friedli M. A novel type of vasopressin receptor on anterior pituitary corticotropins // Endocrinology. 1985. Vol. 116. P. 499-502.

19. Barberis C., Audiger S., Durroux Т., Elands J., Schmidt A., Jard S. Pharmacology of oxytocin and vasopressin receptors in the central and peripheral nervous system// Ann. NY Acad. Sci. 1992. Vol. 652. P: 39-45

20. Baum M.A, Ruddy M.K., Hosselet C.A., Harris H.W. The perinatal expression of aquaporin-2 and aquaporin-3 in developing kidney// Pediatr. Res. 1998. - Vol. 43(6). - P: 783-790.

21. Bazzi MD, Nelsestuen GL. Constitutive activity of membrane-inserted protein kinase C.Biochem Biophys Res Commun. 1988 Vol.152(1) P.336-343.

22. Beazely M.A., Alan J.K., Watts V.J. Protein kinase С and epidermal growth factor stimulation of Rafl potentiates adenylyl cyclase type 6 activation in intact cells // Mol. Pharmacol.2005. Vol. 67(1). P. 250-259.

23. Birnbaumer M., Seibold A., Gilbert S., Ishido M., Barberis C., Antaramian A., Brabet P., Rosenthal W. Molecular cloning of the receptor for human antidiuretic hormone //Nature. 1992. Vol. 357. P. 333-335.

24. Bloch 0, Papadopoulos MC, Manley GT, Verkman AS. Aquaporin-4 gene deletion in mice increases focal edema associated with staphylococcal brain abscess. J Neurochem. 2005 Vol. 95(1) P:254-62.

25. Bonilla-Felix M., Jiang W. Aquaporin-2 in the immature rat: expression, regulation, and trafficking // J. Am. Soc. Nephrol. 1997. Vol. 8(10). P. 1502-1509.

26. Bonilla-Felix M., Jiang W. Expression and localization of prostaglandin EP3 receptor mRNA in the immature rabbit kidney // Am. J. Physiol. -1996. Vol. 271(1 Pt. 2). P. 30-36.

27. Breyer M.D., Ando Y. Hormonal signalling and regulation of salt and water transport in the collecting duct // Annu. Rev. Physiol. -1994. Vol. 56. P. 711-739.

28. Brown D., Hirsch S., Gluck S. An Hl-ATPase in opposite plasma membrane domains in kidney epithelial cell subpopulations // Nature. 1988. Vol. 331. P. 622-624.

29. Brown D., T. Katsura, M. Kawashima, A.S. Verkman, I. Sabolic. Cellular distribution of the aquaporins: a family of water channels proteins// Histochem. Cell Biol. 1995. Vol. 104. P: 1 -9.

30. Burbach J.P., de Hoop M.J., Schmale H., Richter D., de Kloet E.R., Ten Haaf J.A., de Wied D. Differential responses to osmotic stress of vasopressin-neurophysin mRNA in hypothalamic nuclei// Neuroendocrinology. 1984. Vol.39. P: 582-584.

31. Champigneulle A., Siga E., Vassent G., Imbert-Teboul M. V2-like vasopressin receptor mobilizes intracellular Ca in rat medullary collecting tubules 11 Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. F35-F45

32. Chen C.C. Effects of Ca2+ on the activation of conventional and new PKC isozymes and on TPA and endothelin-1 induced translocations of these isozymes in intact cells // FEBS Lett. 1994. Vol. 348(1). P. 21-26.

33. Chen P.Y., Pearce D., Verkman A.S. Membrane water and solute permeability determined quantitatively by self-quenching of an entrapped fluorophore//Biochemistry. 1988. Vol. 27(15). P. 5713-5718.

34. Chou C.L., Rapko S.I., and Knepper M.A. Phosphoinositide signaling in rat inner medullary collecting duct. // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 274. P. F564-F572.

35. Chou CL, Knepper MA, Hoek AN, Brown D, Yang В, Ma T, Verkman AS Reduced water permeability and altered ultrastructure in thin descending limb of Henle in aquaporin-lnull mice// J Clin Invest. 1999. Vol 103. P: 491-496.

36. Chrisrensen B.M., Zelenina M., Aperia A., Nielsen S. Localization and regulation of PKA-phosphorylated AQP2 in response to V(2)-receptor agonist/antagonist treatment // Am. J. Physiol.2000. Vol. 278. P. F29-F42.

37. Deen P.M.T., Verdijk M.A., Knoers N.V.A.M., Wieringa В., Monnens L.A.H., van Os C.H., van Oost B.A. Requirement of human renal water channel aquaporin-2 for vasopressin-dependent concentration of urine //Science. 1994. Vol 264. P: 92-95.

38. Defer N., Best-Belpomme M., and Hanoune J. Tissue specificity and physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase // Am. J. Physiol. 2000. Vol. 279. P. F400-F416.

39. Dennis B. The ins and outs of aquaporin-2 trafficking//Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003. Vol.284. P: F893-F901.

40. Dibas A, Mia AJ, Yorio T. Is protein kinase С alpha (PKC alpha) involved in vasopressin-induced effects on LLC-PK1 pig kidney cells? Biochem Mol Biol Int. 1996 Vol.39(3).P.581-8.

41. Dlouha H. The effect of vasopressin on renal function in young rats a clearance and micropuncture study // Physiol. Bohemoslov. 1976. Vol. 25(6). P. 535-542.

42. Ecelbarger C. A., Chou C.L., Lolait S. J., Knepper M. A., DiGiovanni S. R. Evidence for dual signaling pathways for V2 vasopressin receptor in rat inner medullary collecting duct // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 270. P. F623-F633.

43. Ecelbarger C.A., Terris J., Frindt G., Echevarria M., Marples D., Nielsen S., Knepper M.A. Aquaporin-3 water channel localization and regulation in rat kidney // Am. J. Physiol. 1995.Vol 269. P. F663-F672.

44. Ecelbarger CA, Nielsen S, Olson BR, Murase T, Baker EA, Knepper MA, and. Verbalis JG. Role of Renal Aquaporins in Escape from Vasopressin-induced Antidiuresis in Rat //J. Clin. Invest. -1997. Vol. 99.-P:1852-1863.

45. Echard A., Jollivet F., Martinez O., Lacapere J.J., Rousselet A., Janoueix-Lerosey I., Goud B. Interaction of a Golgi-associated kinesin-like protein with Rab6 // Science. 1998. Vol. 279(5350). P. 580-585.

46. Elinder G. Renal response to isotonic volume expansion in the developing rat // Acta. Physiol. Scand. 1989. Vol. 110. P. 24-30.

47. Enslen H, Sun P, Brickey D, Soderling SH, Klamo E, Soderling TR. Characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV. Role in transcriptional regulation.J Biol Chem. 1994 Vol. 269(22) P.l5520-15527.

48. Farinas J., Simanek V., Verkman A.S. Cell volume measured by total internal reflection microfluorimetry: application to water and solute transport in cells transfected with water channel homologs // Biophys. J. 1995. Vol. 68(4). P. 1613-1620.

49. Fitgerald PG, Bok D, Horwitz J. Immunocytochemical localization of the main intrinsic polypeptide (MIP) in ultrathin frozen sections of rat lens.// J Cell Biol. 1983. 97(5 Pt l):1491-9.

50. Fitzgerald P.G., Bok D., Horwitz J. Immunocytochemical localization of the main intrinsic polypeptide (MIP) in ultrathin frozen sections of rat lens// J. Cell. Biol. 1983.-Vol. 97(5 Pt 1). -P: 1491-1499.

51. Flamion В., Spring K. and Abramow M. Adaptation of inner medullary collecting duct to degidration involves a paracellular pathway // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. P. F53-F63.

52. Frigeri A., Gropper M.A., Turck C.W. and Verkman A.S. Immunolocalization of the mercurial-insensitive water channel and glycerol intrinsic protein in epithelial cell plasma membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 4328-4331.

53. Fujita N, Ishikawa SE, Sasaki S, Fujisawa G, Fushimi K, Marumo F, Saito T. Role of water channel AQP-CD in water retention in SIADH and cirrhotic rats. Am J Physiol. 1995. Vol. 269(6 Pt 2) P:F926-31.

54. Fushimi K, Sasaki S, and Marumo F. Phosphorylation of Serine 256 Is Required for cAMP-dependent Regulatory Exocytosis of the Aquaporin-2 Water Channel //J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. P: 14800-14804.

55. Fushimi K., Uchida S., Hara Y., Hirata Y., Marumo F., Sasaki S. Cloning and expression of apical membrane water channel of rat kidney collecting tubule//Nature. 1993. Vol. 361. P. 549-552.

56. Garvin J.L., Herrera M. Physiological actions of renal collecting duct endothelin//Am. J. Physiol.2005. Vol. 288(5). P. F910-F911.

57. Ghosh PM, Bedolla R, Thomas С A, Kreisberg JI. Role of protein kinase С in arginine vasopressin-stimulated ERK and p70S6 kinase phosphorylation J Cell Biochem. 2004 Vol. 91(6) P.l 109-1129.

58. Gimol G., Fahrenholz F. The oxytocin receptor system: structure, function, and regulation // Physiol. Reviews.2001. Vol. 81. P. 629- 668.

59. Goncharevskaya O.A., Dlouha H. The development of various generations of nephrons during postnatal ontogenesis in the rat // Anat. Rec. 1975. Vol. 182(3). P. 367-375.

60. Gonzalez CB, Figueroa CD, Reyes CE, Caorsi CE, Troncoso S, Menzel D. Immunolocalization of VI vasopressin receptors in the rat kidney using anti-receptor antibodies. // Kidney Int. 1997. Vol. 52(5) P: 1206-15.

61. Hamann S., Zeuthen Т., La Cour M., Nagelhus E.A., Ottersen O.P., Agre P., Nielsen S. Aquaporins in complex tissues: distribution of aquaporins 1-5 in human and rat eye // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 274(5 Pt 1). P. С1332-C1345.

62. Hamm-Alvarez S. and Sheetz M. Microtubule-Dependent Vesicle Transport: Modulation of Channel and Transporter Activity in Liver and Kidney // Physilogical Reviews. 1998. Vol. 78. P. 1109-1129.

63. Hancox NM., Komender J. Quantitative and qualitative in the «dark» cells of the renal collective tubules in rats deprived of water. // Q J Exp Physiol Cogn Med Sci.-1963.-Vol. 48. -P: 346-354.

64. Нага M., Ma Т., Verkman A.S. Selectively reduced glycerol in skin of aquaporin-3-deficient mice may account for impaired skin hydration, elasticity, and barrier recovery // J. Biol. Chem.2002. Vol. 277(48). P. 46616-46621.

65. Haslam R.J., Rosson G.M. Effect of vasopressin on human blood platelets// I. Physiol. 1971. Vol. 219. P: 36P-38P.

66. He'lieVToussaint C., Lotfi Aarab, Jean-Marie Gasc, Verbavatz J.M., and Chabarde's D. Cellular localization of type 5 and 6 ACs in collecting duct and regulation of cAMP synthesis // Am. J. Physiol. 2000. Vol. 279. P. F185-F194.

67. Hebert R.L., Jacobson H.R., Breyer M.D. PGE2 inhibits AVP-induced water flow in cortical collecting ducts by protein kinase С activation // Am. J. Physiol. 1990. Vol. 259(2 Pt 2). P. 318-325.

68. Herman J.P., Schafer M.K., Watson S.J., Sherman T.G. In situ hybridization analysis of arginine vasopressin gene transcription using intron-specific probes//Mol. Endocrinol. 1991.Vol. 5. P: 1447-1456.

69. Hirasawa A., Shibata K., Kotsa K., Tsujimoto G. Cloning, functional expression and tissue distribution of human cDNA for the vascular-type vasopressin receptor// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 203. P: 72-79.

70. Hoffert J.D., Chou C.L., Fenton R.A., Knepper M.A. Calmodulin is required for vasopressin-stimulated increase in cyclic AMP production in inner medullary collecting duct // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280(14). P. 13624-13630.

71. Hozawa S., Holtzman E.J., Ausiello D.A. cAMP motifs regulating transcription in the aquaporin 2 gene// Am. J. Physiol. 1996. Vol. 270 (6 Pt 1). P:C1695—1702.

72. Imai M., Kokko J.P. Sodium chloride, urea, and water transport in the thin ascending limb of Henle. Generation of osmotic gradients by passive diffusion of solutes// J. Clin. Invest. 1974. Vol. 53(2). P: 393-402.

73. Imbert-Teboul M., Chabardes D., Clique A., Montegut M., Morel F. Ontogenesis of hormone-dependent adenylate cyclase in isolated rat nephron segments // Am. J. Physiol. 1984. Vol. 247(2 Pt 2). P. 316-325.

74. Ishibashi K., Yamauchi K., Kageyama Y., Saito-Ohara F., Ikeuchi Т., Marumo F., Sasaki S. Molecular characterization of human aquaporin-7 gene and its chromosomal mapping // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1399. P. 62-66.

75. Ivanova L.N., Melidi N.N. Effects of vasopressin on hyaluronate hydrolase activities and water permeability in the frog urinary bladder// Pflugers Arch. 2001. Vol. 443. P:72 77.

76. Jacobowitz O., Chen J., Premont R.T., Iyengar R. Stimulation of specific types of Gs-stimulated adenylyl cyclases by phorbol ester treatment. // J Biol Chem. 1993. Vol. 268(6). P. 3829-3832.

77. Jard S. Mechanisms of action of vasopressin and vasopressin antagonists // Kidney International. 1988. Vol. 34. P. S38-S42.

78. Jard S., Barberis C., Audigier S., Tribollet E. Neurohypophyseal hormone receptor systems in brain and periphery // Prog. Brain Res. 1987. Vol. 72. P. 173-187.

79. Kamsteeg EJ., Heijnen I., Van Os Ch., Deen PMT. Shuttling ofaquaporin-2 tetramers to the plasma membrane requires phosphor-ylation of three out of four aquaporin-2 monomers (Abstract)// J Am Soc Nephrol. 1999. Vol.10. P : 17A.

80. Kato M., Sasaki Т., Ohya Т., Nakanishi H., Nishioka H., Imamura M., Takai Y. Physical and functional interaction of rabphilin-3 A with alpha-actinin // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271(50). P. 31775-31778.

81. Kim J., Kim Y.H., Cha J.H., Tisher C.C., Madsen K.M. Intercalated cell subtypes in connecting tubule and cortical collecting duct of rat and mouse// J. Am. Soc. Nephrol.- 1999.-Vol. 10(1).-P: 1-12.

82. King L.S., Nielsen S., Agre P. Aquaporins in complex tissues. I. Developmental patterns in respiratory and glandular tissues of rat // Am. J. Physiol. 1997. Vol. 273(5 Pt 1). P. C1541-C1548.

83. Kirschenbaum M.A., Lowe A.G., Trizna W., Fine L.G. Regulation of vasopressin action by prostaglandin synthesis in the rabbit cortical collecting tubule//J. Clin. Invest. 1982. Vol. 70. P. 1193-1204.

84. Kishore B.K., Chou C.L., Knepper M.A. Extracellular nucleotide receptor inhibits AVP-stimulated water permeability in inner medullary collecting duct // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 269(6 Pt 2). P: 863-869.

85. Kovbasnjuk O., Leader J.P., Weinstein A.M., Spring K.R. Water does not flow across the tight junctions of MDCK cell epithelium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95(11). P. 6526-6530.

86. Koyama Y., Yamamoto Т., Tani Т., Nihei K., Kondo D., Funaki H., Yaoita E., Kawasaki K., Sato N., Hatakeyama K., Kihara I. Expression and localization of aquaporins in rat gastrointestinal tract // Am. J. Physiol. 1999. Vol. 276(3 Pt 1). P. C621-C627.

87. Kriz W., Bankir L. A standard nomenclature for structures of the kidney. Published simultaneously in several journals // Am. J. Physiol. 1988. Vol. 254. P. F1-F7; Kidney. Int. 1988. Vol. 33. P. 1-7; Pflugers Arch. 1988. Vol. 411. P. 113-120.

88. Kuwahara M, Asai T, Terada Y, Sasaki S. The C-terminal tail of aquaporin-2 determines apical trafficking.// Kidney Int. 2005 Vol. 68(5) P. 1999-2009.

89. Lande M. В., Jo I., Zeidel M.L., Somers M., Harris H.W. Phosphorylation of aquaporin-2 does not alter the membrane water permeability of rat papillary water channel-containing vesicles // J. Biol. Chem. 1996. Vol 271. P. 5552— 5557.

90. Laurent F.M., Hindelang C., Klein M., Stoeckel M.E., Felix J.M. Expression of the oxytocin and vasopressin genes in the rat hypothalamus during development: an in situ hybridization study// Brain Res. Dev. Brain. Res. -1989.-Vol. 46(1).-P:145-154.

91. Lightman S.L., Young W.S. III. Vasopressin, oxytocin, dynorphin, enkephalin and corticotrophin-releasing factor mRNA stimulation in the rat// J.Physiol. 1987. Vol.394. P: 23-39.

92. Liu Y. Ruoho A.E., Rao V.D., Hurley J.H. Catalytic mechanism of adenylyl cyclases: modelyng and mutational analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 13414-13419.

93. Lolait S.J., O'Caroll A., Morel A., McBride O.W., Konig M., Brownstein M.J. Cloning and characterization of a vasopressin V2 receptor and possible link to nephrogenic diabetes insipidus //Nature. 1992. Vol. 357. P. 336-339.

94. Lolait S.J., O'Carroll A.M., Mahan L.C., Felder C.C., Button D.C., Young W.S. 3rd, Mezey E., Brownstein M.J. Extrapituitary expression of the rat Vlb vasopressin receptor gene II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92(15). P. 6783-6787.

95. Ma Т., Frigeri A., Skach W. Cloning of a novel rat kidney cDNA homologous to CHIP28 and WCH-CD water channels // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 197. P. 654-659.

96. Ma Т., Song Y., Gillespie A., Carlson E. J., Epstein C. J., Verkman A. S. Defective secretion of saliva in transgenic mice lacking aquaporin-5 water channels// J. Biol. Chem. 1999. - Vol 274. - P: 20071-20071.

97. Maeda Y., Han J.S., Gibson C.C., Knepper M.A. Vasopressin and oxytocin receptors coupled to Ca mobilization in rat inner medullary collecting duct // Am. J. Physiol. 1993. Vol.265. P. F15-F25.

98. Majzoub J.A., Rich A., van Bocm J., Habener J.F. Vasopressin and oxytocin mRNA regulation in the rat assessed by hybridization with synthetic oligonucleotides // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 14061— 14064.

99. Mandon В., Chou C., Nielsen S., Knepper M. Syntaxin-4 Is Localized to the Apical Plasma Membrane of Rat Renal Collecting Duct Cells: Possible Role in Aquaporin-2 Trafficking // J. Clin. Invest. -1996. Vol.98.-P.906-913.

100. Marie K., Oksche A., Rosenthal W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 275(5 Pt 2). P. F796-F801.

101. Marples D., Christensen S., Christensen E. I., Ottosen P. D., Nielsen S. Lithium-induced downregulation of aquaporin-2 water channel expression in rat kidney medulla//J.Clin. Invest. 1995. Vol.95. P: 1838-1845.

102. Marples D., Frokiaer J., Nielsen S. Long-term regulation of aquaporins in the kidney//Am. J. Physiol. 1999. Vol. 276. P. F331-F339.

103. Martial S., Ripoche P. An ultrarapid filtration method adapted to the measurements of water and solute permeability of synthetic and biological vesicles// Anal. Biochem. 1991. - Vol. 197(2). - P: 296-304.

104. Matsumura Y., Uchida S., Rai Т., Sasaki S., Marumo F. Transcriptional regulation of aquaporin-2 water channel gene by cAMP // J. Am. Soc. Nephrol. 1997. Vol. 8(6). P. 861-867.

105. Meinild A-CH, Klaerke D.A., Zeuthen T. Bidirectional Water Fluxes and Specificity for Small Hydrophilic Molecules in Aquaporins 0-5// J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273 (49). - P: 32446-32451

106. Melendez E., Reyes J.L., Escalante B.A., and Melendez M.A. Development of the receptors to prostaglandin E2 in the rat kidney and neonatal renal functions // Dev. Pharmacol. Ther. 1990. Vol. 14. P. 125-134.

107. Michell R.H., Kirk C.J., Billah M.M. Hormonal stimulation of phosphatidylinositol breakdown, with particular reference to the hepatic effect of vasopressin// Biochem. Soc. Trans. 1979. Vol. 7. P: 861- 865.

108. Mochly-Rosen D, Khaner H, Lopez J. Identification of intracellular receptor proteins for activated protein kinase С.// Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Vol l;88(9)P.3997-4000.

109. Moore G.J., Rosenior J.C. Biosynthesis of neurohypophysial hormones: historical and current events // Can. Biochem. Cell. Biol. 1983. Vol. 61. P. 594-601.

110. Morel A., O'Caroll A., Brownstein M.J., Lolait S.J. Molecular cloning and expression of a rat Via arginine vasopressin receptor // Nature. 1992. Vol, 356. P. 523-526.

111. Murillo-Carretero M.I., Ilundain A.A., Echevarria M. Regulation of Aquaporin mRNA Expression in Rat Kidney by Water Intake// J Am Soc Nephrol. 1999.-Vol 10.-P: 696-703.

112. Nadler S.P., Zimpelmann J.A., Hebert R.L. Endothelin inhibits vasopressin-stimulated water permeability in rat terminal inner medullary collecting duct //J. Clin. Invest. 1992. Vol. 90(4). P. 1458-1466.

113. Nash M.A., Edelman C.W. The developing kidney. Immature function or inappropriate standart? //Nephron. 1973. Vol. 11. P. 71-90.

114. Nathanson M.N., Moyer M.S., Burgstahler A.D., O'Carro A.M., Brownstein M.J., Lolait S.J. Mechanisms of subcellular cytosolic Ca2+ signaling evoked by stimulation of the vasopressin Via receptor // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 23282-23289.

115. Neely J.D., Christensen B.M., Nielsen S., and Agre P. Heterotetrameric composition of aquaporin-4 water channels // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P.11156-11163.

116. Nielsen S., DiGiovanni S.R., Christensen E.I., Knepper M.A., Harris H.W. Cellular and subcellular immunolocalization of vasopressin-regulated water channel in rat kidney II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 11663-11667.

117. Nielsen S., Frokiaer J, Marples D., Arples, Kwon Т.Н., Agre P., Knepper M.A. Aquaporins in the Kidney:From Molecules to Medicine // Physiol Rev. 2002. Vol 82. P. 205-244.

118. Nishimoto G., Zelenina M., Li D., Yasui M., Aperia A., Nielsen S, Nairn A.C. Arginine vasopressin stimulates phosphorylation of aquaporin-2 in rat renal tissue // Am. J. Physiol. 1999. Vol 276 (Renal Physiol.45). P. F254-F259.

119. Ohshiro K., Yaoita E., Yoshida Y., Fujinaka H., Matsuki A., Kamiie J., Kovalenko P., Yamamoto T. Expression and immunolocalization of AQP6 in intercalated cells of the rat kidney collecting duct // Arch. Histol. Cytol. 2001. Vol. 64(3). P. 329-338.

120. Orloff J., Handler J. The role of adenosine 3',5'-phosphate in the action of antidiuretic hormone // Am. J. Med. 1967. Vol. 42. P. 757-768.

121. Ostrom RS, Gregorian C, Drenan RM, Xiang Y, Regan JW, Insel PA. Receptor number and caveolar co-localization determine receptor coupling efficiency to adenylyl cyclase. J Biol Chem. 2001 Vol.276(45) P.42063-42069.

122. Ozawa T. Ryanodine-sensitive Ca2+ release mechanism in non-excitable cells (review)//Int. J. Mol. Med. 2001. Vol. 7(1). P. 21-25.

123. Phillips M.E., Taylor A. Effect of nocodazole on the water permeability response to vasopressin in rabbit collection tobules perfused in vitro.//J.Physiol. 1992. Vol.411. P. 529-544

124. Pi M, Spurney RF, Tu Q, Hinson T, Quarles LD. Calcium-sensing receptor activation of rho involves filamin and rho-guanine nucleotide exchange factor.Endocrinology. 2002 Vol.l43(10) P.3830-3838.

125. Preston G.M., Carroll T.P., Guggino W.B., Agre P. Appearance of water channels in Xenopus oocytes expressing red cell CHIP28 protein // Science. 1992. Vol 256. P. 385-387.

126. Querfurth HW, Haughey NJ, Greenway SC, Yacono PW, Golan DE, Geiger JD. Expression of ryanodine receptors in human embryonic kidney (HEK293) cells // Biochem. J. 1998. Vol. 334(Pt 1). P. 79-86.

127. Quigley R., Chakravarty S., and Baum M. Antidiuretic hormone resistance in the neonatal cortical collecting tubule is mediated in part by elevated phosphodiesterase activity // Am. J. Physiol. 2004. Vol. 286. P. 317-322

128. Rai T, Sasaki S, Uchida S. Polarized trafficking of the aquaporin-3 water channel is mediated by an NH2-terminal sorting signal.// Am J Physiol Cell Physiol. 2006 Vol. 290(1) P 298-304

129. Rai Т., Uchida S., Marumo F., Sasaki S. Cloning of rat and mouse aquaporin-2 gene promoters and identification of a negative cis-regulatory element // Am J Physiol. 1997. - Vol. 273. - P. F264-273.

130. Rivers R.L., McAteer J.A., Clendenon J.L., Connors B.A., Evan A.P., Williams J.C Jr. Apical membrane permeability of MDCK cells // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 271(1 Pt 1). P. C226-C234.

131. Roychowdhury S, Panda D, Wilson L, Rasenick MM. G protein alpha subunits activate tubulin GTPase and modulate microtubule polymerization dynamics.// J.Bio. Chem.-1999-Vol.274(19) P: 13485-14490.

132. Sands J.M., Flores F.X., Kato A., Baum M.A., Brown E.M., Ward D.T., Hebert S.C., Harris H.W. Vasopressin-elicited water and urea permeabilities are altered in IMCD in hypercalcemic rats // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 274. P. F978-F985.

133. Sasaki S., Fushimi K., Ishibashi K., Marumo F. Water channels in the kidney collecting duct // Kidney International. 1995. Vol. 48. P. 1069-1081.

134. Sasaki S., Ishibashi K., Marumo F. AQUAPORIN-2 AND -3: Representatives of Two Subgroups of the Aquaporin Family Colocalized in the Kidney Collecting Duct S. //Annu. Rev. Physiol. 1998. Vol. 60. P: 199220.

135. Saxena R., Saksa B.A., Hawkins K. S., Ganz M. B. Protein kinase С (31 and PII are differentially expressed in the developing glomerulus // FASEB J. 1994. Vol. 8. P. 646-653.

136. Schaefer M, Mischak H, Schnell S, Griese A, Iakubov R, Riepenhausen G, Schofl C. Mechanisms of arginine-vasopressin-induced Ca2+ oscillations in beta-cells (HIT-T15): a role for oscillating protein kinase C.Endocrinology. 2004 Vol.145(10) P.4635-4644

137. Schafer J. A. Mechanisms coupling the absorption of solutes and water in the proximal nephron// Kidney International. 1984. Vol.25. P:708-716.

138. Schillace R.V., Scott J.D. Organization of kinases, phosphatases, and receptor signaling complexes // J. Clin. Invest. 1999. Vol. 103(6). P. 761— 765.

139. Schimmoller F., Simon I., Pfeffer S.R. Rab GTPases, directors of vesicle docking//J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273(35). P. 22161-22164.

140. Schlondorff D., Zanger R., Satriano J.A., Folkert V.W., Eveloff J. Prostaglandin synthesis by isolated collecting tubules from adult and neonatal rabbits //Am. J. Physiol. 1985. Vol. 248. P. F134-F144.

141. Schmale H., Richter D. Single base deletion in the vasopressin gene is the cause of diabetes insipidus in Brattleboro rats// Nature. 1984. Vol.308. P: 705-709.

142. Schnermann J., Chou C.L., Ma Т., Traynor Т., Knepper M.A., Verkman A.S. Defective proximal tubular fluid reabsorption in transgenic aquaporin-1 null mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 9660-9664.

143. Schuster V.L., Bonsib S.M., Jennings M.L. Two types of collecting duct mitochondria-rich (intercalated) cells: Lectin and band 3 cytochemistry // Am. J. Physiol. 1986. Vol. 251. P. C347-C355.

144. Serlachius E., Svennilson J., Schalling M., Aperia A. Protein kinase С in the developing kidney: isoform expression and effects of ceramide and PKC inhibitors // Kidney Int. 1997. Vol. 52(4). P. 901-910.

145. Shaw S., Marples D. A rat kidney tubule suspension for the study of vasopressin-induced shuttling of AQP2 water channels // Am. J. Physiol. 2002. Vol. 283(5). F1160-F1166.

146. Sherman T.G., Civelli O., Douglass J., Herbert E., Watson S.J. Coordinate expression of hypothalamic pro-dynorphin and pro-vasopressin mRNAs with osmotic stimulation// Neuroendocrinology. 1986. Vol. 44. P: 222-228.

147. Shinbo I., Fushimi K., Kasahara M., Yamauchi K., Sasaki S., Marumo F. Functional analysis of aquaporin-2 mutants associated with nephrogenic diabetes insipidus by yeast expression// Am. J. Physiol. 1999. - Vol 277 (Renal Physiol. 46) -P: F734-F741.

148. Sinding C., Seif S.M., Robinson A.G. Levels of neurohypophyseal peptides in the rat during the first month of life. I. Basal levels in plasma, pituitary, and hypothalamus// Endocrinology. 1980. - Vol. 107(3). - P: 749-754.

149. Skach W., Shi L. В., Calayag M. C., Frigeri A., Lingappa V. R., Verkman A. S. Topology and biogenesis of the CHIP28 water channel at the endoplasmic reticulum//J. Cell Biol. 1994.-Vol.125.-P: 803-816

150. Smith В., Agre P. Eritrocyte Mr 28,000 transmembrane protein exists as a multisubunits oligomer similar to channel proteins. // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 6407-6415.

151. Snyder H.,Noland TD.,Breyer MD. cAMP -dependent protein kinase mediates hydrosmotic effect or vasopressin in collection duct// Am. J. Physiol. 1992 Vol. 263. P: C147- 153.

152. Solenov E.I., Nesterov V.V., Baturina G.S., Khodus G.R., Ivanova L.N. Effect of dDAVP on basolateral cell surface water permeability in the outer medullary collecting duct // Eur. Biophys. J. 2003. Vol. 32(7). P. 614-619.

153. Solenov E.I., Vetrivel L., Oshio K., Manley G.T., Verkman A.S. Optical measurement of swelling and water transport in spinal cord slices from aquaporin null mice // J. Neurosci. Methods. 2002. Vol. 113(1). P. 85-90.

154. Solenov E.I., Watanabe H., Manley G.T., Verkman A.S. Sevenfold-reduced osmotic water permeability in primary astrocyte cultures from AQP4-deficient mice, measured by a fluorescence quenching method // Am. J. Physiol. 2004. Vol. 286(2). P. C426-C432.

155. Star R.A., Nonoguchi H., Balaban R., Knepper M.A. Calcium and cyclic adenosine monophosphate as second messengers for vasopressin in the rat inner medullary collecting duct // J. Clin. Invest. 1988. Vol. 81(6). P. 18791888.

156. Suko Y., Kawahara K., Fukuda Y., Masuda Y. Nuclear and cytosolic calcium signaling induced by extracellular ATP in rat kidney inner medullary collecting duct cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 234(1). P. 224-229.

157. Sundelin В., Bohman S.O. Postnatal development of the interstitial tissue of the rat kidney // Anat. Embiyol. 1990. Vol. 182(4). P. 307-317.

158. Takeaki I., Terris J., Ecelbarger C. A., Chou Ch.-L., Nielsen S., Knepper M.A. Vasopressin regulates apical targeting of aquaporin-2 but not of UT1 urea transporter in renal collecting duct// Am. J.Physiol. 1999. - Vol.76. -P:-F566.

159. Takeuchi К., Abe Т., Takahashi N., Abe K. Molecular cloning and intrarenal localization of rat prostaglandin E2 receptor EP3 subtype // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 194(2). P. 885-891.

160. Tamma G., Carmosino M., Svelto M., and Valenti G. Bradykinin Signaling Counteracts cAMP-Elicited Aquaporin 2 Translocation in Renal Cells // J. Am. Soc. Nephrol. 2005. Vol. 16: 2881-2889.

161. Tamma G., Klussmann E., Procino G., Svelto M., Rosenthal W., Valenti G. cAMP-induced AQP2 translocation is associated with RhoA inhibition through RhoA phosphorylation and interaction with RhoGDI // J. Cell. Sci. 2003. Vol. 116. P. 1519-1525.

162. Taniguchi S., Watanabe Т., Nakao A., Seki G., Uwatoko S., Kurokawa K. Detection and quantitation of EP3 prostaglandin E2 receptor mRNA along mouse nephron segments by RT-PCR // Am. J. Physiol. 1994. Vol. 266(5 Pt 1). P. 1453-1458.

163. Taylor A., Mamelak M., Reaven E. Mafft R. Vasopressin: Possibke role of Role of microtubules and microfilaments in its action.// Science 1973 Vol.181 P:347—351.

164. Teitelbaum I, Berl T. Increased cytosolic Ca2+ inhibits AVP-stimulated adenylyl cyclase activity in rat IMCT cells by activation of PKC.Am J Physiol. 1994 Vol. 266(3 Pt 2) P.486-490.

165. Teitelbaum I. Protein kinase С inhibits arginine vasopressin-stimulated cAMP accumulation via a Gi-dependent mechanism. Am J Physiol. 1993 Vol. 264(2 Pt 2) P. 216-20.

166. Tengumnuay P., Verlander J.W., Yuan W., Tisher C.C., Madsen K.M. Identification of distinct subpopulations of intercalated cells in the mouse collecting duct//J. Am. Soc. Nephrol. 1996. Vol. 7. P. 260-274.

167. Terris J., Ecelbarger C.A., Marples D. Distribution of aquaporin-4 water channel expression within rat kidney // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 269. P. F775-F785.

168. Thibonnier M., Auzan С., Madhum Z., Wilkins P., Berti-Mattera L., Clauder E. Molecular cloning, sequencing, and functional expression of a cDNA encoding the human Via vasopressin receptor// J.Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P:3304— 3310.

169. Tsukahara H., Hata I., Sekine K., Miura M., Kotsuji F., Mayumi M. Renal water channel expression in newborns: measurement of urinary excretion of aquaporin-2 //Metabolism. 1998. Vol. 47(11). P. 1344-1347.

170. Tunwell R.E., Lai F.A. Ryanodine receptor expression in the kidney and a non-excitable kidney epithelial cell // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271(47). P. 29583-29588.

171. Umenishi F., Verkman A., Gropper M. Quantitative analisis of aquaporin mRNA Expression in rat tissues by RNase protection assay. // DNA and Cell Biol. 1996. Vol. 15. P. 475-480.

172. Verbavatz J., Broun D., Sabolic I., Valenti G., Ausiello D.A., Van Hoek A.N., Ma Т., Verkman A.S. Tetrameric assembly of CHIP28 water channel in liposome and cell membranes: a freeze-fracture study. // J. Cell Biol. 1993. Vol. 123. P. 605-618.

173. Verkman A. S. Role of aquaporin water channels in kidney and lung // Am. J. Med. Sci. 1998. Vol 316. P. 310-320.

174. Verkman A., Mitra A. Structure and function of aquaporin water channels // Am. J. Physiol. 2000. Vol. 278. P. F13-F28.

175. Verkman A.S. Role of aquaporin water channels in eye function // Exp. Eye. Res. 2003. Vol. 76 (2). P. 137-143.

176. Verkman AS, Binder DK, Bloch O, Auguste K, Papadopoulos MC. Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice //Biochim Biophys Acta. 2006. Vol. 1758(8) P: 1085-93.

177. Verkman AS. Lessons on renal physiology from trans-genic mice lacking aquaporin water channels// J Am Soc Nephrol. -1999. Vol 10. - P: 1126— 1135.

178. Verlander J.W., Madsen K.M., Tisher C.C. Effect of acute respiratory acidosis on two populations of intercalated cells in rat cortical collecting duct // Am. J. Physiol. 1987. Vol. 253. P. F1142-F1156.

179. Wade J.B., Stetson D.L., Lewis S.A. ADH action: evidence for a membrane shuttle mechanism.//Ann. NY Acad. Sci. 1981. Vol. 372. P. 106-117.

180. Ward D.T., Hammond T.G., Harris H. Modulation of vasopressin-elicited water transport by trafficking of aquaporin2-containing vesicles // Annu. Rev. Physiol. 1999. Vol. 61. P. 683-697.

181. Xu D.L., Martin P.Y., Ohara M., St John J., Pattison Т., Meng X., Morris K., Kim J.K., Schrier R.W. Upregulation of aquaporin-2 water channel expression in chronic heart failure rat// J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 99. -P: 1500—1505.

182. Yamaguchi N., Xu L., Pasek D.A., Evans K.E., Meissner G. Molecular basis of calmodulin binding to cardiac muscle Ca(2+) release channel (ryanodine receptor) // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278(26). P. 23480-23486.

183. Yamamoto N., Sobue K., Miyachi Т., Inagaki M., Miura Y., Katsuya H., Asai K. Differential regulation of aquaporin expression in astrocytes by protein kinase СП Brain. Res. Mol. Brain. Res. 2001. Vol. 95(1-2). P:110-116.

184. Yang В., Ma Т., Verkman A.S. Erythrocyte water permeability and renal function in double knockout mice lacking aquaporin-1 and aquaporin-3 // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276(1). P. 624-628.

185. Yao L., Huang D. Y., Pfaff I. L., Nie X., Leitges M., Vallon V. Evidence for a role of protein kinase C-alpha in urine concentration // Am. J. Physiol. 2004. Vol. 287(2). P. F299-F304.

186. Yao L.J., Leitges M., Vallon V. Mice Lacking Protein Kinase С Beta Present Modest Increases in Systolic Blood Pressure and NH(4)C1-Induced Metabolic Acidosis // Kidney Blood Press. Res. 2006. Vol. 29(1) P. 36-42.

187. Yasui M., Hazama A., Kwon Т.Н. Rapid gating and anion permeability of an intracellular aquaporin. //Nature. 1999. Vol. 402. P. 184-187.

188. Yasui M., Kwon Т.Н., Knepper M. Aquaporin-6: An intracellular vesicle water channel protein in renal epithelia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 5808-5813.

189. Yasui M., Marples D., Belusa R., Eklof A-Ch., Celsi G., Nielsen S., Aperia A. Development of urinary concentrating capacity: role of aquaporin-2 // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 271. P: F461-F468.

190. Yasui M., Zelenin S.M., Celsi G., Aperia A. Adenylate cyclase-coupled vasopressin receptor activates AQP2 promoter via a dual effect on CRE and API elements// Am. J. Physiol. 1997. Vol 272. P: 443-450.

191. Yeaman C., Grindstaff K.K., Nelson W.J. New Perspectives on Mechanisms Involved in Generating Epithelial Cell Polarity // Phisyologycal Reviews. 1999. Vol. 79. P. 73-98.

192. Yip K. P. Coupling of vasopressin-induced intracellular Ca2+ mobilization and apical exocytosis in perfused rat kidney collecting duct // J. Physiol. 2002. Vol. 538(Pt 3). P. 891-899.

193. Yool A.J., Stamer W.D., Regan J.W. Forskolin stimulation of water and cation permeability in aquaporin-1 water channels // Science. 1996. Vol 273. P.1216-1218.

194. Zelenina M., Bondar A.A., Zelenin S., Aperia A. Nickel and extracellular acidification inhibit the water permeability of human aquaporin-3 in lung epithelial cells//J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278 (32). P:30037-43.

195. Zelenina M., Brismar H. Osmotic water permeability measurements using confocal laser scanning microscopy// Eur. Biophys J. 2000. Vol. 29(3). P: 165-171.

196. Zelenina M., Christensen B.M., Palme J., Nairn A.C., Nielsen S., Aperia A. Prostaglandin E2 interaction with A VP: effects on AQP2 phosphorylation and distribution // Am. J. Physiol. 2000. Vol. 278. P: F388-F394.

197. Zelenina M., Zelenin S., Bondar A.A., Brismar H., Aperia A. Water permeability of aquaporin-4 is decreased by protein kinase С and dopamine// Am. J. Physiol. 2002. Vol. 283(2). P: F309-18.

198. Zeuthen Т., Klaerke A. Transport of Water and Glycerol in Aquaporin 3 is Gated by H+. // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. P: 21631-21636.

199. Zhang M., Yuan T. Molecular mechanisms of calmodulin's functional versatility//Biochem. Cell. Biol. 1998. Vol. 76(2-3). P. 313-323.