Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль природного ингибитора инвертазы в регуляции запасания и транспорта сахарозы у BETA VULGARIS

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль природного ингибитора инвертазы в регуляции запасания и транспорта сахарозы у BETA VULGARIS"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи БУРАХАНОВА Елена Александровна

РОЛЬ ПРИРОДНОГО ИНГИБИТОРА ИНВЕРТАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ ЗАПАСАНИЯ И ТРАНСПОРТА САХАРОЗЫ У BETA VULGARIS

(03.00.12 — физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К- А. Тимирязева АН

Научные руководители — академик АН СССР А. Л. Кур-санов, кандидат биологических наук И. М. Дубинина.

Официальные оппоненты: доктор биологичских наук, профессор В. В. Мосолов, кандидат биологических наук В. П. Холодова.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им, М. В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита диссертации состоится « /0. » ¿¿^.¿У/Ч-. 1991 г.

на заседании специализированного совета К.002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

СССР.

Автореферат разослан « . »

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. актуальность изучения биохимических процессов, связанных с функцией сахаронакоплзния у.сахарной свеклы /8е-г?с1 ^и/дс/'-Л' ¿/% обусловлена высокой практической значимостью птого растения. Одним из наиболее важных направлений в этих исследованиях служит изучение ферментных систем, тлеющих непосредственное отношение как к возникновению, так и к потере функции сахаронакопления. Не- • смотря на то, что систематическое изучение действия этих систем в свекловичном растении были начаты более полувека назад, некоторые важные элементы механизма их действия до сих пор остаются мало изученными и в настоящее время еше нет полной ясности я вопросе о путях регуляции активности хнэертазн /у? -Яруктофуранозидазы, 3.2.1.26/ в корне сахарной свеклы. Однако становится все более очевидным, что помимо контроля на уровне синтеза инвертазного белка в регуляции активности инвертазы в запасающих и проводящих органах растений важная роль может принадлежать специфическому белку-ингибитору, действующему на уже синтезированные молекулы Фермента. Наличие двойной регуляции активности инвертазы на генном и на Ферментном уровнях, с помощью эндогенного ингибитора, должно с одной стоэоны обеспечивать полное подавление активности фермента в корне сахарной свеклы при нормальных условиях этчзни растения и значительное подавление - в проводящих пучках листьев, с другой, позволяет при необходимости дово.-дить активность инвертазы до нужного уровня, что приводит к гидролизу сахарозы внутри вакуолей. Таким образом, присутствие ингибитора инвертазы может иметь важное значение для процессов накопления и поддержания высокого уровня сахарозы в запасающих тканях, а также ее транспорта па проводящим пучкам листовых черешков.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работа состояла в изучении свойств природного ингибитора важного Фермента обмена

сахарозы - инвертазы и его метаболической роли в процессах аккумуляции и поддержания высокого уровня сахарозы в запасавших и проводящих тканях, а также в процессгигее использования при переходе тканей в другое Физиологическое состояние, связанное с потерей функции са-харонакопления. В соответствии с этим задачи исследования заключались

- в выделении природного ингибитора инвертазы, изучении его свойств, механизма действия и специфичности к различным Ахэрмам инвертазы и другим ферментам углеводного обмена;

- в изучении корреляционных связей между активностью ингибитора, уровнем активности кислой инвертазы. и накоплением сахарозы в различные периоды онтогенеза растения;

- в выяснении роли ингибитора в регуляции активности инвертазы проводящих пучков в связи ке-аду величиной активности йермента и транспортом сахарозы во йяоэмэ;

- в выяснении роли природного ингибитора инвертазы в Ферментативной перестройке, происходящей в "переживающей" ткани корнеплода и и изолированной культуре его ткани и связанной с изменением способности клеток к сахаронакоплечию.

Научная новизна.Установлено..что в ряде тканей растения сахарной

свеклы контроль активности инвертазы осуществляется не только через

генетический аппарат, но сочетается с регулированием инвертазной ак--

■ тивности на ферментном уровне, с помощью белка-ингибитора. Природный

/ ■ ■ . . ингибитор впервые выделен из корней растений сахарной свеклы на раа-

ных стадиях их онтогенеза, из проводящих пучкой листовых черешков

и культуры ткани хранящегося корнеплода. Выявлено наибольшее

сродство выделенных ингибиторов к кислым внутриклеточным инверта-

зам корня и проводящих пучков, подавление которых имеет важное

значение для накопления и -поддержания высокого уровня сахарозы в

этих тканях. Обнаружена зависимость между уменьшением активности ин~

гибитора, активацией гшвептазы и падением содержания в тканях аккумулированной сахарозы. Так, в "перевивающих" тканях корнеплода Л в культуре его изолированной ткани процесс дедиМерекииавии сопровождается снижением активности ингибитора, изменением его свойств, что связано с падением содержания аккумулированной сахарозы» Одновременно показано, что деди<Тфэренииапия клеток различных тканей: сахарной свеклы и культивирование их в виде каллусов в течение многих циклов выращивания не приводит к их полной унификации, а, снимая ряд функциональных признаков, частично сохраняет другие, например, наличие эндогенного ингибитора инвертазы и повышение содержания сахарозы в культуре ткани корнеплода по сравнению с семядольным каллусом.

Практическая значимость. /7олученные результаты расширяют представление о механизмах регуляции активности одного из основных Ферментов обмена сахарозы - инвертазы. Проведенные исследования являются важным этапом на пути получения научно обоснованных рекомендаций по управлению процессами сахаронакопления в свекловичном растении и выработке оптимальных условий хранения корнеплодов сахарной свеклы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XII Международном ботаническом конгрессе / Ленинград, 1975/, на конференциях по культуре клеток растений / Киев, 1975; Абовян, 1979/, на 1У и У Всесоюзных биохимических съездах / Ленинград, 1973, Москва, 1986/, на II Всесоюзном совещании по Физиологии, росту и культуре тканей / Киев, 1983/, на III Всесоюзной конференции " Транспорт ас-симилятов в растениях и проблемы сахаронакопления" / Фрунзе, 1983/, ва II съезде ВОФР / Минск, 1990/.

■ Дуб ли кадии . По материалам диссертации опубликовано 16 работ.

Объем работы, диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит I схему, 9 таблиц и 31 рисунок и состой*!' из введения, 6 глав / обзор литературы, объекты и мс тоды исследования, результаты и их обсуждение/, выводов и списка литературы / 275 наименований/, из них 212 иностранных. ОБЪЕКТЛ И МЕТОДЫ У.ССЩОВШЯ.

Объектами исследования служили корни растений сахарной свекл! / Вс1а м/даг'з / сорта Верхчкчс:<ая 031 в возрасте от 8 до 120 дней, хранящиеся корнеплоды, корнеплоды второго года вегетации и проводящие пучки листовых черешков, а также пересадачные каллусны« ткани , полученнье из семядолей 8-дневных проростков и хранящихся корнеплодов сахарной свеклы диплоидной линга того же сорта.

Растения сахарной свеклы выращивали на опытном участке или в оранжерее при 23°. Культуру ткаки из семядолей сахарной свеклы вы-раципали в темноте, при постоянной температурвУивлажлости У0% на среде Гамборга /£с/т6огд eto/t 1968/.Культуру ткани пз корнеплода выращивали на свету на среде Шенка и Гильдебрандта / е^с .¡.972/ при той же температуре и влажности.

Для определения содержания Сахаров навески ткани <£иксировали кипящим этанолом, трижды экстрагировали 80% этанолом. В очище! них /О.ЗЛ/ Ва (ОН^ и 10?. 2п 0^/ экстрактах определяли сушу Сахаров фенольным методом /Холодова^ 1567/, оахарозу - по методу Бертрана, фруктозу.- по модифицированному методу Рое /Туркина, Соколо! 1971/, глюкозу - глюкозооксидазным методом /Туркина, Соколоза,197] Активность кислой инвертазы определяли в гомогенате ткани /дз ализ против дистиллята, 4 Ш сахароза, рН 4,7, 1-5 час при 30°/,В' некоторых опытах внутриклеточную кнвертазу /супернатант/ отделяли от инвертазы клеточных стейок /осадок/ центрифугированием отдиали-

зованного гомогената 20 мин поя 1000^ , Об активности инвертазы судили по убыли сахарозы, которую определяли по методу Рое после предварительного разруленид свободной фруктозы щелочью. Определение активности сахарозосинтазы проводи™, используя в качестве субстратов для прямой реакций синтеза сахарозы - УДФ-глотозу и фруктозу, для обратной реакции' - еехдоозу и УТФ. Для определения активности гексокиназы использог-ачп методику, оазработаннуп Курсвковш с сотр. /Курсанов я др., 1^60/.

Активацию инвертазы осуществляли путе?/ отмывания Фрагментов тканей в течение Ь суток в хорошо аяр;юуемой роде в стерильных условиях при 25° /каллусные ткани/ ми то же время в проточной водопроводной поде при '¿0-22° / диски корней, изолированные проводящие пучки/, 0 целью активации инчертазь- я проводяасх пучках на целых растениях средние части черешков с отпрепарированными проводящими пучками помещали в плексиглазовые муФты, где они находились в токе хорошо аэрируемой воды в течение 2 суток.

Все этапы выделения и очистки природного ингибитора инвертазы проводили в холодной комнате при 4°, используя модифицаро?анную методику Пресса / 1968/, включающую 20-минутное центрифугирование отжатого сока при 8500 ^ с последующим диализом надосадо-чной жидкости против 0,2/^/^801, осаждение баластного белка при рН. 1,5, высаливание болка надосадочной жидкости-сульфатом аммония /¿0% от полного насыщения/ и фракционирование раствора осажденного белка с выделением фракции меаду 33 и 52$ насыщения ацетоном, содгржащей инглбитор /"ацетоновая Фракция"/.Заключительный этап очистки состоял в разделении "ацетоновой Фракции" белка на колонке сеФ-адекса ^ -100. Активность ингибитора в полученных Фракциях определяли путем измерения оставшейся активности инвертазы я присутствии белка-янги -битора. При выделении и очистке ингибитора инв-е-ртаз^ белок определи-

ли по Лоури / ¿оиr-Lj e.t а/. , I9oi/.

При постановке опытов биологическая ловторность была 4-5-крат-

кой .

ВЫДЕЛЕНИИ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНОГО ИНГИБИТОРА ИНВЕРТАЗЫ ИЗ ХРАНЯЩИХСЯ КОРНЕПЛОДОВ CAXAPHO'/J СВЕКЛЫ

Получение активного препарата природного ингибитора инвертазы из хранящихся корнеплодов сахарной свеклы было связано с пелым рядом операций по выделению и очистке белка, заключительный этап которых состоял в разделении "ацетоновой фракции" белка-ингибитора на колонке сефадекса д-100. На кривой элюции после разделения белков на колонке наиболее отчетливо выделялись три дика. Испытание действия выделенных фракций на активную инвертазу корешков проростков сахарной свеклы показало, что ингибитор содержится во фракции 2.

Спектрофотометрическая характеристика и невысокая термосгабиль-ность выделенной фракции / 15-минутное нагревание до 70° приводило к полной потере активности ингибитора / позволило заключить, что выделенный ингибитор имее,т белковую природу. Молекулярная масса ингиби тора, подсчитанная на основании его элюции с колонки сефадекса ^-100 откалиброванной по алюции трех белков известной молекулярной массы согласно методу Витакера / И/hi to/бег ^ 1963/, оказалась равной

шоо.

Изучение свойств выделенного ингибитора показало, что оптимум действия этого белка совпадает с оптимумом действия кислой инвертазу и находится при рН 4,5-4,7 /рис. I а/. Ингибитор действует на инвертазу путем образования с ней неактивного комплекса, а не путем протв' олаза фермента, т.к. увеличение продолжительности времени прединку-бации инвертазы с ингибитором до добавления субстрата реакции / сахарозы / не приводит к снижению активности фермента. Комплекс ин-

вертазы с ингибитором, по-в,и,:мому, мало диссоциирующий, поскольку зависимость степени подавления активности иквертазы от содержания, в реакционной смеси ингибитора увеличивается по экспоненте / рс£?.1б/ Действие ингибитора из корнеплода сахарной свеклы на активированную инвертазу этого органа неконкурентно по отношению к сахарозе, т.к. оно не может бить ослаблено или устранено-увеличением ее концентрации. Таким образом; зона взаимодействия инвертазы с ингибитором не перекрывается с активным центром Фермента / рис. I в/.

Результаты опытов показам, что выделенный ингибитор наряду -с торможением активной инвертазы различных органов сахарной свеклы / мезофилла листа - на корней 8-дневных проростков - на 70%/ способен подавлять и ту инвертазу, которую можно активировать при длительном промывании в воде кусочков тканей сахарной свеклы. Пр;: этом белок-ингибитор в большей степени подавляет активированную внутриклеточную инвертазу хранящегося корнеплода / на 100^/, чем инвертазу клеточных стенок, что может иметь определенное Физиологическое значение, поскольку к этой.фракции должны быть отнесены Ферменты вакуолей и тонопласта, с которыми непосредственно связано сохранение и мобилизация запасенной сахарозы / табл. I /,Выделенный из корнеплода сахарной свеклы ингибитор специфичен к кислой инвертазе, поскольку он практически не подавляет активности другие ферментов • углеводного обмена / сахарозосинтазы и гексокиназы/ свекловичного растения, а также инвертазы дрожжей / табл. I /.

Полученные результаты позволяют предположить, что в корнеплоде :ахарной свеклы контроль активности ичвертазы осуществляется не толь-:о через генетический аппарат, но сочетается с регулированием инвер-■азной активности на ферментном уровне с помощью специфического изкомолекулярного белка-ингибитора. Этот механизм может играть

Таблица I

Специфичность действия белка-ингибитора инвертазы. выделенного

из хранящихся корней сахарной свеклы. йерменты сахарной свеклы:

Подавление активн.,%

Активированная внутриклеточная инвертаза корнепл./рН 4,7/ 100

Активированная инвертаза вакуолей корня /рН 4,7/ 86

Активированная инвертаза клеточных стенок корнеплода/рН 4,7/ 57

Активированная bhvtd;:клеточная инвеотаза корнеплода /рН 7,6/ О

Инвертаза копией с-дневных прооостяов /рН 4,7/ 70

Инвертаза проводящих пучков листового черешка /рН 4,7/ 52

Инвертаза вакуолей мезофилла листа /рИ 4,7/ 69

Инвертаза клеточных стенок мезофилла листа /рН 4,7/ О

Внутриклеточная инвертаза культуры ткани корнеплода /pfí 4,7/ 100 Сахарозосинтаза корнеплода:

в прямой реакции 12

в обратной реакции О

Гексокиназа проводящих пучков О

Инвертаза дрожжей О

При оиределейии активности ингибитора в 0,5 мл инкубационной среда содержалось 40 мкг белка "ацетоновой фракции".

fió; 1; Некоторые свойства ингибитора инвертаза, выделенного йЗ Хранящихся корней сахарной свеклы

я

«о гз

í<

§ 3

CJ

о

ж §

t=C »-н

s

И -t)

I- без ингибитора ингибитором

5 б

рН

а, Действие белка-ингибитора на активированную инвертазу хранящихся корнеплодов пр* различных значениях рН среды.

-г-

I/v <D 2.0L

1,0

I/./l I-без ингибитора 2-6 мкг ингиб.

100

5 7 9 II

Ингибитор, мкг

Рис, I б.Действие возраставших концентраций ингибитора на активность кислой инвертазы

Рис. I в.ГоаФик Лайнуивера-Вяр-ка для частично очищенной инвертазы и ингибитора из хоаняшегося яоонеилода.

I- стадия dos. 1 листьев ¡2-стздия стойл, ■á- стадия г? ¿т. fi- стадия созр. семян,

120

90 §*

Ук

ai ft

(я

Дни роста

3 7 II Месяиы хпан.

I. 2 3 4 Стадии развития

Píe. 2 Изменение содержания Сахаров /I/, активности иквеотаза /?/ и ее природного ингибитора /столбики/ в растущих /А/, хранящихся /Б/ и прорастающих /В/ корнях сахарной свеклы.

особо важную роль в тех тканях свекловичного растения, которые выполняют функции транспорта сахарозы и ее накопления и где /нверта-за должна быть более или менее глубоко заингибирована. .

РОЛЬЭНДОГЕННОГО ИНГИБИТОРА ЙНЧЕРТАЗЫ В НАКОПЛЕНИИ, СОХРАНЕНИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ САХАРОЗУ В СВЕКЛОВИЧНОМ РАСТЕНИИ Накопление и поддержание высокого уровня сахарозы в запасающих органах растений е значительной степени зависит от активности Ферментов, расщепляющих сахарозу и участвующих в превращении продуктов ее распада. Одной из наиболее важных особенностей таких тканей, к числу которых относится и запасавшая ткачь корня сахарной свеклы, является потеря активности инвертазы / Энгель, Холодова, 1969; Павлинова, Прасолова, 1972 /. Известно, что в корне сахарной свеклы снижение активности этого фермента, связанное с процессами дифференциации и специализации его тканей, происходит на ранних стадиях онтогенеза растения. К 40-45 дню развития-растения, когда корень приобретает третичное строение и усиливается отложение сахарозы в запас, кислая инвертаза практически не проявляет сврего действия. Подавление активности кислой инвертазы в запасающих тканях ряда растений, в том числе и в корне сахарной свеклы, происходит как путем репрессии синтеза инвертазного белка, так и действием на инверг газу специфического белка-ингибитора, образующего с ней неактивный комплекс. '

Была поставлена задача выяснить, на какой' стадии онтогенеза растения сахарной свеклы в корне появляется белок-ингибитор и коррелирует ли его ингибируюцее действие с уровнем активности инвертазы и накоплением сахарозы. ,

Как видно из рис. 2-А, высокая активность кислой инвертаза, свойственная корешкам проростков, быстро снижается вплоть до 35 дня развития корня растения, а затем практически отсутствует до конца

-¿о-

вегетации первого года. При этом хорошо просматривается корреляция между падением активности кислой инвертазы в онтогенезе корня и накоплением сахарозы / рис. 2 А /. Активность инвертазы почти не пю-является в корнях сахарной свеклы после их хранения в термостатированной камере при 4° в течение 2-3 месяцев / рис. 2 Б /. При хранении корнеплодов.в течение 7 месяцев активность инвертазы продолжает оставаться на низком уровне. Это обеспечивает хорошую сохранность сахарозы, содержание которой остается высоким / 159 мг/г сырой массы/ при незначительном содержании гексоз. Еще более продолжительное хранение корней / II месяцев / не приводит к появлению активности инвертазы. Содержание сахарозы в чтих корнях остается высоким, хотя и снижается по сравнению с корнями, хранившимися ? мес.

Важное значение представляло исследование изменения активности инвертазы в корнях на втором году жизни растения, когда происходит массовое использование запасенной сахарозы. Оказалось, что в корнях, проросших до стадии розетки листьев и до стадии образования цветочной стрелки, активность кислой инвертазы все еще продолжает оставаться на очень низком уровне, в то время как содержание сахарозы снижается более, чем вдвое / рис. 2 В /.

При изучении процесса растормачсивания активности инвертазы путем промывания в течение 3 суток высечек корней растений сахарной . свеклы разного возраста было показано, что на всех-стадиях онтогенеза активируется кислая инвертаза, локализованная как на клеточных стенках, так и внутриклеточно. достигаемый при этом уровень активности обеих форм инвертазы определяется возрастом растения и постепенно снижается по мере роста корня / рис. 3 /. Возможность активации различных форм инвертазы, как и достигаемый уровень активности, находится в прямой зависимости от механизмов, регулирующих активность инвертазы, в том числе и от механизма прямого воздей-

-и-

ствия на уже синтезированные молввдлы фермента эндогенным ингибитором. Выделение природного ингибитора из корней растений сахарной свеклы на разных стадиях развития растения, а также сопоставление его активности с активностью инвертазы и составом Сахаров могло свидетельствовать о сроках появления механизма подавления.инвертазы при участии этого белка и его связи с процессом сахаронакопления,

Оказалось, что ингибитор содержится и проявляет свое действие уже в корнях &-дкевкых проростков к его активность постепенно возрастает по мере роста корня I рис. 2А/. Изменение Физиологической функции корня в связи с переходом к процессу активного сахаронакоп-ления, по сроку совпадающее с практически полным подавлением активности кислой инвертазы, связано с еще большим увеличением активности . ингибитора, максимум действия которого достигается в конце вегетации / рис. '¿к ).

В корнях сахарной свеклы, заложенных на длительное хранение при ч0, активность ингибитора хотя и несколько снижается, но все еще продолжает поддерживать активность кислой инвертазы на очень низком уровне, что определяет высокое и устойчивое содержание сахарозы при низком содержании гексоз / рис. 2Б /. Определенная роль принадлежит белку-ингибитору и на втором, году жизни растения, когда идет образование побегов и корешков за счет внутреянних резервов

.корня. В этом случае все еще актирный ингибитор предохраняет в кор/

неплоде сахарозу от гидролиза инвертазой, обесйечивая ее перемещение к отрастающим побегам и питающим корням в обычной "транспортной" фор*, ме / рис. ¡¿В /. .

Таким образом, было показано, что природный.ингибитор кислой. ■ инвертазы, вероятно наряду с другими- механизмам», играет немаловажную роль в становлении функции сахаронакопления у свекловичного корня, в, стабилизации в нем высокого уровня запасенной сахарозы,

-п- -

1

I и

1 и

■Р

С.*«1

л' •

ч г

11

10

0

3

п

30 -60 90 , ДНИ

Рис.3 Активность инвертазы клеточных стенок (1,3) и внутриклеточной инвертазы ,(2,4) при рН 4,7 в дисках растущих и хранящихся „ /столбики/ корней сахарной свеклы после промывания в вода зсуТ,

& о

С-. £

Л Й*

160

80

10

/ПЗ

а

я дач « ! ¡Г

О*

а>с\г

о

о о

о

ри

!§1

«Р а< о

к \о

100

л и о о

•т*

а к я

50

И А

И

А 1.

Рис.

-и

4 Содержание Сахаров /А/, активность кислой инвертазы /Б/ и оо эндогенного ингибитора /В/ а нативной запасающей ткани корнеплода (I), после п ад£ла * зе дисков (2) а при введении ее в культуру (3).

»а

II

Г

I ь. ' «

■ а

га

и

Й 0

Рис. б

V к

о

•эо

45

70

120

возраст,дни

Активность кислой инвертазы в проводящих пучках листовых черешков сахарной свеклы разного возраста до /К/ к после /0/ ее активации-.

-уз-

лак потно скдеть из рис. в модельных опытах в птхшессе длительного / 3 суток / промывания в роде дисков -хранящегося корнеплода сахарной свеклы удалось установить тесную корреляцию между уменьшением активности ингибитора, активацией инвертазы. и падением содержания аккумулированной сахарозы с 15В до 43.мг/г сырой массы,

ОСОБЕННОСТИ РйГУВДИЯ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ИНВЕРТАЗЫ В ГРОВОДЯЩИХ ПУЧКАХ ЛИСТОВЫХ ЧЕРЕШКОВ САХАРНОЙ СВЕКЛУ,

Во флоэме проводящих пучков листьев сахарной свеклы поддержа-. ние низкой активности инвертазы играет важную роль в сохранении необходимого уровня сахарозы, транспортируемой на далекие рассеяния. Как видно кз рис. Ь, в онтогенезе растения сахарной свеклы в проводящих пучках листовых черешков активность кислой инвертазы прогрессивно падает, снижаясь у ¿-6 листа 4-месячных растений до уровня в 10 раз меньшего, чем у тех же листьев 1-месячных растений.

Заторможенная в онтогенезфнвертаза способна значительно активироваться при длительном отмывании в воде кусочков проводящих пучков не только полностью сформированных листьев, как было показано Туркиной и Соколовой / 1968 г./, но и в молодых, еще не закончивших свой рост / рис. о/.

Можно полагать, что во флоэме проводящих пучков на целом расте нии подавление и активация инвертазы играют важную регуляторную рол! в поддержании определенного уровня сахарозы, транспортируемой в проводящих тканях на далекие .расстояния. Если это так, то чрезмерная активация инвертазы в функционирующих проводящих пучках должна приводить к торможению транспорта сахарозы, что будет являться свидетельством непосредственной связи между механизмом подавления

активности кислой инвертазы и процессом передяиг/ения сахари., флоэме.

для проверки высказанного предпс поженил был поселен ряд опытов, е которых инвертазу активировали на Е-ст.* участках проводящих пучков в средней части листовых черешков, находящихся на целом растении. Результаты одного из опытов приведены на табл. '<., Опиты показали, что в отмыгаемой зоне, где активность инвертазы увеличивается, содержание сахарозы .заметно падает /табл. 2/, вероятно, * результате ее пиролиза.

Значительное повышение содержания сахарозы в проводящих пучках над отмываемой зоной и понижение под ней, где активность инвертазы не увеличивается, может свидетельствовать о задатком тормож.е-нии передвижения сахарозы, вызванном активацией инвертазы в средней, отмываемой их части.

Таким образом, оказалось, что судьба сахарозы, которая аккумулируется з проводящих тканях и транспортируется по ним к запасающему корнеплоду, зависит от активности инвертазы. Крайне низкая активность этого фермента 5 проводящих пучках ограничивает использование сахарозы и является одним из ватных условий функционирования флоэмы. Активация фермента, снижая уровень сахарозы в проводящих тканях, нарушает концентрационный градиент по длине проводника и ее нормальный приток к корнеплоду /табл. 2/.

При транспорте сахарозы в проводящих пучках механизму рогуля--ции активности икзертазы, особенно ее подавлению, принадлежит^ по-видимому, немаловажная роль. В этом процессе, помимо регуляции путем репрессии и дерепрессии синтеза фермента, большая роль мотет принадлежать, как и в корнеплоде, эндогенному ингибитору,

' . Из проводящих пучков взрослых листьев сахардйй свеклы выделен •специфический белок, ингибирующий активность кислых инвертаз различных органов этого растения, с наибольшим сродством к кислой внутриклеточной инвертазе самих проводящих пучков, но имеющий мень-

Таблица 2.

Активность инвертазк и содержание Сахаров по длине проводящих

пучков листовых черешков сахар»2]йй свеклы.

Кон Активн. инверт. мг гидр, сах-зы Г-1 св.м. 4"1 ч г роль Сах-за| Фрукт. Активн. инвер. мг г" св.м„4"< Опыт Сах-за1 Фрукт,

мг г 1 св.м. МГ'Г св. м.

Верх черешка Середина черешка Низ черешка 5,42 3,15 •2,01 17,02 2,34 19,10 4,36 23,53 5,61 6,22 10,25 2,51 22,41 4,51 13,64 3,65 17,81 4,24

Таблица 3.

Биохимические характеристики хранящегося корнеплода, семядолей сахарной свеклы я полученных из них каллусов»

Объект Белок мг г~Асв.м Сахароза мг г-1св.м Гексозы /фр.+гл/ МГ'Г"*СВ м» Активность . инвертазы, мг гидр» сах-эы»2ч Увеличение активн. инверт.при активации.

на Г св}мг м. (белка " %

Хранящийся корнеплод 4,5 120,9 0,00 0,02-0,5 0,6 2000

ЬО-дневные каллусы, из хран. корн. ] 2.1 31,1 9,9 3,3 1,6 700

Семядоли АЛ 1.7 5,9 15,7. 3,6 II

30-дневные' каллусы из' семядолей - ;3>з 14,6 32,1 11,2 3,4 • 30

шую активность, чем ингибитор, выделенный из хранящегося кооязплода. Upia этом в тканях сахарной свеклы, выполняющих как £ункют накопления и поддержания высокого уровня сахарозы, так и дальнего транспорта, подавление активности инвертазы может быть связано как с репрессией синтеза инвертазного белка, так и с дерепрессией синтеза ингибитора и образованием комплекса его с инвертазой.

СПЕЦИФИКА УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА ХАЛЛУСНУХ ТКАШ i ОЛУЧЕНШХ ИЗ КОРНЕПЛОДА И СШйдОЛЬКаХ ЛИСТЬЕВ САХАРНО?! СРШЫ Клеточная ди^Феремхировка и возникновение характерных Формообразовательных процессов имеют в своей основе деятельность генетического аппарата клеток. При этом пdoисходит репрессия ряда локусов, обуславливающих синтезы специфических Ферментных белков, свойственных эмбриональным клеткам, и детерминируются новые локуси, что r целом приводит к направленному изменению метаболизма.

Ферментативную перестройку в углеводном обмене, связанную с изменением функции сахаронакопления, можно было ожидать при перероде клеток запасающего .корнеплода сахарной свеклы в дедитФе ре нитрованную культуру. В этом случае происходит процесс, обратный тому, который наблюдается в растущем корне. Дифференцированная запасающая ткань корнеплода от состояния покоя переходит к интенсивному росту, связанному с процессами дедифференциации. Возникающие морфологические изменения сопровоэдаются изменениями в метаболизме ткани. Особое внимание было обращено на изменение функции сахаронакопления, для чего определялись наиболее, характерные показатели этого специализированного процесса: активность инвертазы, которая играет важную роль в вовлечении сахарозы в метаболизм'клеток, степень ее заторможенности, общий уровень сахаристости клеток, т.е. их способность к саха-ронакоплению,■ относительное содержание моно- и дисахаридов, " способ-

ность к синтезу специфического белка-ингибитора инвертазы.

Работа проводилась на каллусных культурах, любезно предоставленных нам в лаборатории Р.Г.Бутенко / ИФР АН СССР/.Основные исследования были проведены на каллусной культуре, полученной из запасающей -ткани корнеплода /штамм 2п/ и на каллусной культуре, полученной из семядольных .листков проростков /штамм САС 9/. Это позволило выявить специфику механизмов регуляции, имеющих отношение к накоплению и использованию сахарозн в каллусах, полученных из функционально различных органов сахарной свеклн.

Таблица 3 позволяет сравнить данные показателей углеводного обмена тканей, использованных для получения каллусов, к самих каллусных тканей. Несмотря на утрату способности к полному подавлению активности инвертазы и потерю Функции сахаронакопления, в культуре ткани корнеплода сохраняется некотооая специфика углеводного обмена, свойственная самому корнеплоду. Она выражается в значительном преобладании сахарозы над гексозами, частичной репрессии инвертазы и способности значительно ее активировать / табл. 3 /. Сохранение этой специфики обмена могло указывать на частичное сохранение в этой ткани механизма регуляции активности инвертазы, присущего запасающей ткани корнеплода. Культура ткани из семядольных листков сохраняет свойственную этим тканям высокую активность кислой инвертазы, что определяет значительное превышение доли гексоз в ткани над сахарозой и невозможность ее значительной активации при промывании ткани водой / табл. 3 /.

Таким образом, дедифференциация клеток различных тканей сахарной свеклы при выращивании из них каллусов не приводит к унификации их метаболизма. Культуры тканей сохраняю! некоторую специфику углеводного обмена дифференцированных тканей, по-видимому, генетически закрепленную более прочно. Возможность особенно сильной активации инвертазы в- тканях с небольшой активностью этого Фермента по-

-а-

называет, что способность к синтезу инвертазного белка, по-зц^яло-му; запрограммирована во всех клетках сахарной свеклы на примерно одинаковом уровне. Поэтому величина активности инвертазы определяется не столько потенциальными способностями этих тканей в синтезу инвертазного белка, сколько системой контроля за активностью Фермента, действувщей в клетках на генетическом и ферментном уровнях, т. е. ина обусловливается как подавлением синтеза инвертазного белка, так и инактивацией уже синтезированных молекул фермента специфическим ингибитором. Показано, что почти 5-кратное увеличение активности инвертазы, происходящее при отмывании культуры ткани корнеплода в воде, на 67% подавлялось в присутствии ингибитора синтеза белка-циклогексимида. Однако далеко неполная репрессия процесса активации инвертазы циклогексимидом предполагает наличие р клетках корня прямых механизмов подавления образующихся молекул этого Фермента. При снятии такого рода ингибирования, вероятно, и может возникать та доля активации, на которую не действуют ингибиторы белкового синтеза.

действительно, из культуры ткани корнеплода был выделен препарат ингибитора инвертазы. После заключительного этапа - фракционирования белка на колонке сефадекса §-100 - на кривой элюиии выделялись два пика. Активность ингибитора была сосредоточена во втором пике. Выделенный ингибитор имел белковую природу, на что указывали спектрофотометрические данные и прямые определения белка по Лоури. . Зтот ингибитор оказался менее активным, чем ингибитор, выделенный яз наивной ткани хранящегося корнеплода сахарной свеклы

'рис. 4В/,Ослабление механизма торможения активности инвертазы с по-юаьй эндогенного ингибитора при введении ткани корнеплода в культуру может быть связано как с изменением общего количества белка, так

к с изменением некоторых его свойств. В частности, молекулярная масса ингибитора из культуры ткани корнеплода оказалась значительно меньше/.: ¿ОииО против 18x00 для ингибитора из хранящегося корнеплода. Кроме того природный ингибитор из каллуской ткани корнеплода менее термостабилен, чем ингибитор из исходной ткани корнеплода: 50% его активности теряется уже за первую минуту прогревания 70°. Подобно ингибитору, выделенному из хранящегося корнеплода сахарной свеклы, он наиболее специфичен к собственной внутриклеточной ингер-таэе не подавляет активности сахарозосинтагы и гекеокиназы культуры ткани корнеплода. Ослабление в культуре ткани корнеплода механизма регуляции с покощью эндогеннрбЪ ингибитора, наряду с отсутствием ряда других особенностей., по-видимому, не создает условий для значительного накопления сахарозы в клетках культуры ткани, а может лип» предопределять развитие втого процесса при переходе к дифференциации и специализации клеток.

Б культуре ткани семядольных листков, которые обладают значитвль но более активной инвертазой и низким содержанием сахарозы, ингибитор инвертазы не обнаруживается и, следовательно, такой способ регуляции ей не свойственен.

Выводы.

1. Регуляция активности кислой инвертазы в проводящих пучках листового черешка и запасающих корнеплодах сахарной -свеклы может .осуществляться как путем репрессии и дерепрессии синтеза инвертазного бел ка, так и с помощью природного ингибитора.

2. Природный ингибитор вцделен-из ряда органов и тканей сахарной све» лы: из корней I и 2 года вегетации, хранящихся корней, из культуры ткани корнеплода и проводящих пучков листового черешка,

3. Ингибитор, выделенный из хранящегося корнеплода, является низкомо-лекулярним белком с невысокой термостабильностью и оптимумом дейст вия при рН 4,7, образующий с.инвертазой слабо диссоциирующий неактивный комплекс. _

4. Выявлена строгая специфичность действия ингибитора по отношению

к кислым инвертазам и, особенно, к кислой внутриклеточной инвертазе.

5. Активность ингибитора постепенно возрастает по мере роста корней, достигая максимума к концу вегетации, что обеспечивает сохранность

сахарозы, отложенной в запас, и предохраняет ее от -гидролиза инвер-

тазой в корнях 20Г0 года вегетации.

6. Обнаружена зависимость между активацией инвертазы, уменьшением активности ингибитора и падением содержания сахарозы,

7. В культуре тнани корнеплода ослабление механизма регуляции активности кислой инвертазы с помощью белка-ингибитора не создает условий для проявления выраженной функции сахаронакопления. однако, определяет сохранение некоторой специфики обмена, свойственной запасающей ткани корнеплода.

в. Подавление активности кислой инвертазы проводящих пучков листово-

, го черешка усиливается по мере роста листа. Экспериментальная активация инвертазы-в средней части проводящих пучков, функционирующих на живом растении, вызывает изменение в составе Сахаров по всей их длине и приводит к торможению транспорта сахарозы.

9 .Полученные результаты свидетельствуют о важной метаболической- роли природного ингибитора инвертазы, о его значении для процесса накопления и поддержания высокого уровня сахарозы в проводящих пучках и в'корнях такого сахаронакопителя, как сахарная свекла.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

X. Курсанов А.Л., Дубинина И.М., Бураханова Е.А. Природный ингибитор инвертазы из корнеплода сахарной свеклы. // Физиология растений. Ь71. Т,18. Вып. 3, С.568

2. Дубинина И.М., Бураханова Е.А.О природе активации инвертазы в переживающих, тканях ,// Физиология растений.1971.Т.18. Вып. 5. С.980

3. Dubinins I.M., Burakhanova E.A., Kudrjavtzeva L.F. Control of invertase activity in sugar beet and tissue culture. // Тез.докл

ill Междунар. ботан. конг., Ленинград, IS75. Т.2. С. 354

4. KyftaHOB А.Л., Дубинина И.М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А. Некоторые особенности углеводного обмена в культурах деди<Мерении-рованных тканей сахарной свеклы // Физиология растений. I976.T.23.

. Был. 6. С. III9.

5. Дубинина И.М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А. Особенности углеводного обмена в культурах изолированных тканей сахарной свеклы/, Сб. трудов II Всесоюзн. конф. по культуре клеток растений. Киев:

• Наукова думка, 1978. С. 214.

6. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. Роль эндогенного ингибитора инвертазы в сохранении и использовании сахарозы в хранящихся и прорастающих корнеплодах сахарной свеклы.// Физиология растений. It/79. Т. 26. Вып. 3. .С. 512.

7. Курсанов АД. Дубинина И.М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А.Роль природного ингибитора инвертазы в углеводном обмене культуры ткани корнеплода сахарной свеклы. /Дез, докл. III Всесоюзн. конф. "Культура клеток растений", Абовян, 1979. С. 27.

8. Дубинина И.U., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. Роль эндогенного ингибитора инвертазы в углеводном обмене корня сахарной свеклы,// Тез. Сообш. 1У Всесоюзн. биохим. съезда. Ленинград. I97S. С. 100.

9. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. К вопросу об условиях аккумуляции сахарозы в корне сахарной свеклы.// Соврем.проблемы Физиологии и биохимии сахарной свеклы. Киев: Наукова думка.

1981. С. 70.

10. Дубинина И.М., Кудрявцева Л.Ф., Бураханова Е.А. Инвертаза в дифференцированных и дедиФФеренцированных тканях сахарной свеклы, // Физиология растений. 1982. Т. 29. Вып. 5. С,-868.

11. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. Регуляция активности инвертазы в изолированных культурах тканей сахарной свеклы//

физиология растений. 1982. Т. 29, Вып. 6. С. 1186. Л. Дубинина 'АЛ., Бураханова S.A., Кудрявцева Л.Ф. ПоирсдныЙ ингибитор инвертазы в корнеплодах сахарной свеклы при хранении и прорастании на второй год. // тез. докл. II Всесоюзн. совещ. по Физиологии, росту и культуре тканей, Киев, 1963. С. 26. .3. Дубинина И.М., Бураханова Б.А., Кудрявцева Л.Ф. Роль природного ин. ибитора инвертазы в проводящих и запасающих тканях сахарной свеклы.// Тез. докл. Iii Всесоюзн.конф."Транспорт ассииилятов в растениях и проблемы сахаронакопления",Фрунзе: Илим, 1983. С. 59. .4. Дубинина U.M., Бураханова Е.А., Кудоявпева Л.Ф. Подавление активности инвертазы в проводящих пучках сахарной свеклы как необходимое условие для транспорта сахарозы.// Физиология растений, 1984. Т. 31. Вып. I. С. 153.

5. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф, Природный белок-ингибитор jä -Фруктофуранозидазы различных тканей сахарной свеклы// Тез. докл. У Всесоюзн. aßbxm. съезда. Москва. 1986. С. 366.

6. Бураханова Е.А., Дубинина И.to., Кудрявцева Л.Ф. Эвдогенный ингибитор инвертазь а-онтогенезе корня сахарной свеклы.//Физиология-растений. х9Ь7. Т. 34. Вып.2. G.292.