Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль углеводного метаболизма в устойчивости растений к гипотермии на примере картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль углеводного метаболизма в устойчивости растений к гипотермии на примере картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы"

003053766

САБЕЛЬНИКОВА Елена Павловна

РОЛЬ УГЛЕВОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА В УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ГИПОТЕРМИИ НА ПРИМЕРЕ КАРТОФЕЛЯ, ТРАНСФОРМИРОВАННОГО ГЕНОМ ДРОЖЖЕВОЙ ИНВЕРТАЗЫ

03 00 12 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биочогических наук

1 7 МАП 2007

Москва 2007

003059766

Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Института физиологии растений им К.А Тимирязева РАН

Научный руководитель-

доктор биологических наук, профессор

Трунова Тамара Ильинична

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, профессор

Рыбакова Майя Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Кириченко Евгений Борисович

Ведущая организация РГАУ-МСХА им К А Тимирязева

Защита состоится 22 мая 2007 г в 10 часов на заседании Диссертационного совета К 002 210 01 при Институте физиологии растении им К А Тимирязева РАН по адресу 127276, Москва, ул Ботаническая, 35 Факс (495) 9778018, e-mail ifrfg.ippras ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН

Автореферат разослан апреля 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

МИ Азаркович

Актуальность Температура среды обитания является одним из наиболее значительных факторов, оказывающих существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов (Туманов, 1979, Levitt,1980) Известно, что в ответ на различные стрессоры, в том числе гипотермию, в растениях происходит неспецифическое усиление гидролиза полимерных форм углеводов и накопление низкомолекулярных растворимых Сахаров, что играет важную роль в формировании устойчивости к низким температурам (Максимов, 1952, Туманов, 1979, Трунова, 1984, Регега et al, 1995, Winter, Huber, 2000) Наиболее полно этот вопрос изучен на примере морозостойких растений (Трунова, 1963, 1998, Туманов и др 1969, Самыгин, 1974, 1994, Сундухадзе, Рыбакова, Морозова, 2003) и в значительно меньшей степени у холодостойких растений, неустойчивых к льдообразованию, но адаптирующихся к низким положительным температурам (Дроздов, Курец, 2003)

Учитывая значимость Сахаров в устойчивости растений к гипотермии, научный интерес представляют гидролитические ферменты углеводного метаболизма, в частности инвертаза, катализирующая реакцию расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу и поэтому играющая важную роль в у!леводном метаболизме На сегодняшний день, вопрос о роли инвертаз (вахуолярной, апопластной, цитоплазматической) в устойчивости холодостойких растений к гипотермии остается открытым Отсутствуют четкие экспериментальные доказательства связи активности инвертаз и содержания различных форм Сахаров с формированием устойчивости холодостойких растений к гипотермии, стратегия выживания которых направлена на сохранение от повреждений надземной части, как наиболее уязвимой к действию пониженных температур Решению этих вопросов может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом В частности, трансформация типичного представителя группы холодостойких растений - картофеля геном дрожжевой инвертазы (апопластный вариант локализации фермента) способна изменить соотношение моно- и дисахаров в листьях за счет гидрочиза сахарозы в апопласте (Kallarakal, 1989, Schaewen et al, 1990, Sonnewald et al, 1997) и, возможно, повлиять на устойчивость растений к гипотермии

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы состояла в изучении зависимости формирования устойчивости к гипотермии растений картофеля от активности инвертаз и содержания разных форм Сахаров, изменения которых достигались тремя способами

1) путем трансформации растений геном дрожжевой инвертазы, 2) культивированием in vitro на средах с различной концентрацией сахарозы и 3) длительной экспозицией растений при пониженной адаптирующей температуре В связи с этим были поставлены следующие задачи

1 Исследовать влияние трансформации растений картофеля геном дрожжевой инвертазы на активность инвертаз, содержание разных форм Сахаров и устойчивость к гипотермии по определению перекисного окисления липидов в тканях листьев и экзоосмосу электролитов

2 Определить интенсивность процесса фотосинтеза и его вклад в изменение содержания Сахаров в листьях растений исследуемых генотипов, выращенных in vitro

3 Изучить активность инвертаз и содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных и трансформированных растений картофеля, выращенных на средах с различной концентрацией сахарозы (2, 4, 6%), и исследовать вызванные этим фактором изменения в устойчивости к гипотермии

4 В иериод длительной адаптации растений картофеля к низкой положительной температуре изучить динамику активности инвертаз, содержание разных форм Сахаров и установить их связь с формироватгем холодостойкости

5 Выявить возможные изменения в учьтраструктурной организации хлоропластов растений картофеля, вызванные трансформацией геном дрожжевой инвертазы, а также длительным воздействием низких положительных температур

Научная новтна Впервые проведено комплексное изучение роли инвертаз и содержания разных форм Сахаров в формировании устойчивости холодостойких растений к гипотермии, на примере растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, находящегося под контролем пататинового промотора (апопластный вариант локализации фермента)

Установлено, что введение гена дрожжевой инвертазы в растения картофеля вызывает увеличение активности всех форм фермента и особенно кислой нерастворимой инвертазы апопластной локализации, что приводит к частичному

гидролизу транспортируемой в апопласт сахарозы на глюкозу и фруктозу Это, по-видимому, сопровождается торможением загрузки флоэмы сахарозой и вызывает накопление Сахаров в клетках листа не только в форме глюкозы и фруктозы, но и в большей степени в форме сахарозы в результате поступления образующихся моноз из апопласта в клетки, их фосфорилирования и использования для синтеза сахарозы

Впервые показано, что увеличение содержания Сахаров в трансформированных растениях картофеля без воздействия пониженных температур приводит к повышению устойчивости к гипотермии, выражающемуся в уменьшении интенсивности перекисного окисления липидов и более низком уровне выхода электролитов из клеток при разных режимах охлаждения

Культивирование растений картофеля in vitro на средах с повышенным содержанием сахарозы позволило индуцировать активность всех типов инвертаз и особенно кислой нерастворимой формы, а также повысить способность исследуемых растений аккумулировать сахара в листьях в большом количестве Определена оптимальная концентрация сахарозы в среде (4%) для формирования наибольшей холодостойкости исследуемых генотипов картофеля

Впервые экспериментально показано, что у контрольных и особенно у трансформированных растений картофеля период адаптации к низкой положительной температуре составляет не более трех суток, о чем свидетельствуют максимальная активность кислых инвертаз и наибольшее содержание Сахаров в листьях в виде сахарозы и глюкозы, которое коррелирует с устойчивостью к гипотермии Теоретическая н практическая значимость Полученные в работе экспериментальные данные о роли инвертаз и Сахаров в формировании устойчивости растений к гипотермии расширяют наши представления о механизме этого процесса и могут быть использованы в селекционной практике Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут быть полезны при чтении курсов лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны Апробация работы Основные результаты работы докладывались на V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции "Физиология растений — основа фитобиотечнологии" (Пенза, 2003), научной конференции молодых ученых в Институте физиологии растений им К А Тимирязева РАН (Москва, 2003),

семинарах лаборатории зимостойкости Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН (Москва, 2002-2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ'

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных

результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа

изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 17 рисунков и

1 схему Список цитируемой литературы включает 257 наименований, из них 173

иностранных

Проведенные исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 01-04-49085)

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В представленной работе были использованы растения картофеля (Solanum tuberosum L cv Desiree), трансформированные геном дрожжевой инвертазы (rav), находящимся под контролем клубнеспецифичного пататинового промотора ВЗЗ класса I и с последовательностью лидерного пептида ингибитора протеиназы II для апопластной локализации фермента (ВЗЗ-znv - растения) В качестве контролей использовали нетрансформированные растения картофеля сорта Дезире (К), а также трансформированные растения, экспрессирующие репортерный ген GUS, находящийся под контролем пататинового промотора ВЗЗ класса I (КТ) - растения) или промотора 35S вируса мозаичности цветной капусты (CaMV) (Кт2 - растения) Все трансгенные конструкции включали в себя ген устойчивости к канамицину nptll Растения были отобраны из коллекции клонов, полученных в результате совместной работы сотрудников Института молекулярной физиологии растений им Макса Планка (Golm, Germany) и лаборатории роста и развития им М X Чайлахяна ИФР РАН

Трансформанты были проверены на экспрессию трансгенов методами полимеразной цепной реакции и прямого определения активности GUS (Rosha-Sosa et al, 1989, Sonnewald et al, 1997) Контрольные трансформированные растения (KTi и Кт2) использовали в качестве контроля на сам процесс трансформации Растения

размножали микрочеренкованием in vitro и выращивали в камере фитотрона ИФР РАН при температуре 22°С и 16-ч фотопериоде (освещенность 4 клк) в течение 5 недель на агаризованной MC-среде (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 2% сахарозы и витамины (мг/л) тиамин - 0,5, пиридоксин - 0,5, мезоинозит - 60,0

Для определения ростовых характеристик еженедельно проводили измерения длины стебля у 30 растений картофеля каждого генотипа.

Газообмен у растений изучен с использованием установки открытого типа с инфракрасным газоанализатором Uras 2Т ("Hartmann und Braun", Германия) по измерению скоростей видимой ассимиляции СОг и темпового дыхания (Klimov et al, 1999)

Холодостойкость трансформированных и контрольных растений оценивали по индексу повреждения листьев, который определяли путем измерения выхода электролитов из поврежденной холодом ткани в водную фазу (Hepburn et al, 1986) Холодостойкость (H, %) рассчитывали по формуле H = 100(Lk-L,)/Lk, где Lt -электропроводность образца после холодовой экспозиции и Lk - электропроводность того же образца после кипячения, Ом"1 см110"1

Об интенсивности перекисгюго окисления липидов (ПОЛ) в листьях исследуемых генотипов картофеля судили по накоплению одного из продуктов окисления - малонового диальдегида (МДА) Содержание МДА определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кисчотой с последующим измерением оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО"', Россия) при длине волны 532 им Количество МДА выражали в мкмоль/г сырой массы листьев (Жиров и др, 1982)

Для определения активности разных типов инвертаз навески ткани листьев (0,3-0,5г) растирали при температуре 4°С с небольшим количеством разбавленного в 10 раз фосфатно-цитратного буфера (pH 7,0), диализовали 20 ч (при 4°С) против этого же буфера для удаления Сахаров, содержащихся в ткани Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 8000g Надосадочную жидкость использовали для определения растворимых типов инвертаз Осадок после трехкратного промывания тем же буфером (10 мин при 200g) использовали для определения нерастворимой инвертазы клеточных стенок Инкубационная смесь общим объемом 0,5 мл содержала 0,2 мл фракции клеточных стенок или растворимой фракции, 0,3 мт

буфера с сахарозой, конечная концентрация которой в смеси составляла 150мМ Для определения активности кислой инвертазы использовали 1М ацетатный буфер (pH 4,7), для щелочной - фосфатно-цитратную буферную смесь* (pH 7,5) Время инкубации составляло 1 ч при 30°С Об активности фермента судили по количеству образовавшейся глюкозы в инкубационной среде, которую определяли глюкозооксидазным методом (Туркина, Соколова, 1971)

Для определения содержания Сахаров в листьях навеску ткани 0,3-0,5г фиксировали кипящим 96%-ным этиловым спиртом и растирали в фарфоровой ступке Сахара извлекали трехкратной экстракцией 80% этанолом В полученных экстрактах определяли глюкозу - глюкозооксидазным методом, сахарозу и фруктозу -по методу Рое (Туркина, Соколова, 1971)

Для исследования ультраструктуры клеток и хлоропластов листьев, последние отчленяли из средней части растения и фиксировали в течение 4 ч 2,5%-ныч глутаровым альдегидом в 1,0 М фосфатном буфере, pH 7,4 Затем, после 4-краггного промывания тем же буфером, материал рефиксировали 1%-ным раствором OsÜ4 и заливали в Эпон-812 Ультратонкие срезы полисадной паренхимы получали на ультрамикротоме LKB-3 ("LKB", Швеция) и контрастировали сначала насыщенным водным раствором уранилацетата при 37°С в течение 30 мин, а затем лимонпокислым свинцом при комнатной температуре в течение 15 мин Срезы просматривали в электронном микроскопе TEMSCAN 100СХ2 ("JEOL", Япония) Морфометрические исследования клеток и органелл проводили на приборе MOP-VIDEOPLAN ("Reichert", Австрия), просматривая не менее 100 клеток каждого варианта.

Данные обработаны статистически (применяли критерий Стьюдента для парных выборок, Р=0,05) Во всех экспериментах биологическая повторность измерений была 3-5-кратная, аналитическая - 3-4 -кратная В работе представлены средние значения типичного опыта и их стандартные ошибки

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ активности пат атн но во го промотора и разных типов инвертаз в

вегетативных органах растении картофеля.

Изначально важно было подтвердить экспрессию клубнеспеци финне го промотора пататина ВЗЗ в иных органах картофеля, помимо клубней, показанную в работе немецких ученых (Sonnewald et at., 1997). Исследования были проведены на базе Лаборатории роста и развития им. М.Х. Чайяахяна ИФР РАН »а 2,5-месячных трансформированных растениях картофеля, у которых указанный промотор контролировал экспрессию репортерного гена GUS. Определение активности GUS показало, что из вегетативных органов (стебель, корень, лист) Ktl и Кт? растений наибольшей активностью патати нового промотора характеризовались листья.

80

60

ШШ ЁЗЗ-mv

Листья Стебли Корни

Рис.1. Суммарная активность инвертаз в вегетативных органах контрольных (Кт2) и ВЗЗ-j'nv растений картофеля, при температуре 223С.

50-,

I j кислая нерастворимая ■I кислая растворимая I i щелочная

гЬ

Дикий (К) ВЗЗ-Gt/S (К^) 35S-GUS (К |

Рис. 2, Активность разных типов инвертаз в листьях контрольных растений картофеля, при температуре 22°С.

Эффективность встроенного гена дрожжевой инвертазы была подтверждена также, в результате сравнения суммарной активности инвертаз и вегетативных органах Кт2 и ВЗЗ-mv растений. Наибольшая суммарная активность фермента была выявлена в листьях ВЗЗ-mv растений (рис. 1). Кроме того, был проведен сравнительный анализ активности разных типов инвертаз в листьях контрольных расгений картофеля, который не выявил у них существенных различий (рис. 2). На этом основании в экспериментах были использованы все представленные контроля.

Таким образом, подтверждение экспрессии встроенного гена дрожжевой инвертазы в листьях ВЗЗ-inv расгений позволило нам использовать их для изучения роли инвертаз я Сахаров в формировании устойчивости к гипотермии.

3. Активность инвертаз и содержание Сахаров в листьях контрольных и ВЗЗ-щу растений картофеля.

Эффективность встроенного гена дрожжевой инвертазы была подтверждена также путем сравнения активностей разных типов инвертаз в листьях исследуемых генотипов в оптимальных условиях (22°С). Введение reirá дрожжевой инвертазы в ВЗЗ-í'flv растения, по сравнению с контролем (Кт2), увеличивало активность кислой нерастворимой формы почти в 2 раза, кислой растворимой более, чем в 2,5 раза, а щелочной инвертазы в 1,3 раза (рис. 3).

ЕЙЙ tosenaa нерастворимая

7 100-, ШЯ кислая рас g - | 1 щелочная

кислая растворимая

Рис. 3. Активность разных типов инвертаз в листьях контрольных (Krz) и ВЗЗ-inv растений картофеля, при температуре Х>°С.

и

Рис. 4. Содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных (Ктг) и ВЗЗ-иу растений картофеля, при температуре 22°С.

Фруктоза Глюкоза Сахароза Сумма Сахаров

Повышенная активность иивергаз в листьях исследуемых генотипов отразилась также на содержании и соотношении моно- и дисахаров. В листьях B33-/nv растений, по сравнению с контролем (Кт;), было выявлено повышенное содержания глюкозы и сахарозы. Содержание же фруктозы заметно снижалось (рис 4). Можно предположить, что повышение содержания сахарозы d листьях ВЗЗ-mv растений достигается вследствие того, что высокоактивная инвертаза апопласта ¡ идролизует предназначенную для транспорта сахарозу, препятствуя в результате её оттоку во флоэму (Kallarakal, 1989; Schaewen et al., 1990). Образующиеся гексозы поступают обратно в клетки мезофилла и включаются в путь синтеза сахарозы (Maynard, Lucas, 1982).

Таким образом, трансформация растений карго фе ля геном дрожжевой инвертазы приводила к возрастанию активности инвертаз, главным образом кислых и увеличению содержания Сахаров в листьях в форме сахарозы и глюкозы, что открывало перспективы изучения зависимости формирования холодоустойчивости этих растений от особенностей их углеводного метаболизма.

Прежде чем перейти к изучению устойчивости растений к гипотермии, необходимо было определить интенсивность фотосинтеза и его вклад в изменение уровня Сахаров у исследуемых генотипов картофеля в условиях ш vitro. Нашими исследованиями было подтверждено, что видимый фотосинтез у обоих генотипов, выращенных in viiro, имел низкие значения, причем у ВЗЗ-ini' растений он был ниже, чем в контроле. Пониженная скорость ассимиляции С02 у B33-;nv растений, возможно, вызвана иигибирующим действием образующихся Сахаров на ряд ферментов процесса фотосинтеза (Семененко, Афанасьева, 1972; Sc Ii ас wen et а!.,

1990) Известно, что культивирование растений in vitro приводит к снижению функциональной активности фотосинтеза и, в результате, к незначительному фотосинтетическому образованию углеводов (Grout, Millam, 1985, Sutter et al, 1985, Цоглин и др, 1988, 1991) Видимо, это связано с лимитированием процесса по основному субстрату - углекислому газу, которое возникает из-за изолированности растения от внешней среды в стерильных условиях выращивания

Таким образом, при выращивании растений в условиях т vitro обнаружена низкая интенсивность процесса фотосинтеза у исследуемых генотипов, причем у ВЗЗ-ihv она была ниже, чем в контроле, что, по-видимому, связано с более высоким содержанием Сахаров в них и свидетельствует об основном поступлении их из культуральной среды

4. Устойчивость к гипотермия контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля.

Одной из причин повреждения растений при действии небчагоприятных факторов среды, в том числе гипотермии, является нарушение структуры клеточных мембран Основным процессом разрушения мембранных липидов при охлаждении является их перекисное окисление (ПОЛ) (Жиров, 1982, Лукаткин, Голованова, 1988, Hanyadi, Parkin, 1993), по интенсивности которою можно определять относительную устойчивость растений к гипотермии (Владимиров, Арчаков, 1972, Мерзляк, 1989)

Поскольку процесс инициирования и распространения цепных реакций ПОЛ очень быстрый, изучение изменений его интенсивности в листьях картофеля мы проводили в динамике охлаждения Показано, что температура 3°С в течение суток пе вызывала существенных изменений в интенсивности ПОЛ у исследуемых растений, что свидетельствует об их устойчивости к данному температурному режиму (рис 5а) Только суточная экспозиция при более низкой температуре минус 1°С приводила к повышению интенсивности ПОЛ у обоих генотипов, но в большей степени в листьях контрольного варианта (рис 56) Различия между вариантами за более короткий период охлаждения (6 часов) удалось установить только после действия температуры

Рис 5 Интенсивность ПОЛ в листьях контрольных (Кт2) и ВЗЗ-ггсу растений картофеля после охлаждения при температуре а - 3°С, б - минус 1°С

« Рис 6 Интенсивность ПОЛ в т2

листьях контрольных (Кт2) и ВЗЗ-/лу ВЗЗ-глу растений картофеля после охлаждения при температурю минус 2°С

12ч при 22°С после Длительность охлаждения, ч 244 охлаждения

минус 2 °С интенсивность ПОЛ у контрольных растений была в 1,5 раза выше, чем у ВЗЗ-шу растений (рис 6) Эти же различия сохранялись и спустя 12 ч пребывания при 22 °С после 24 ч действия температуры минус 2 °С (рис 6) Следовательно, у ВЗЗ-шу растений в течение суточного охлаждения и после его действия про- и антиокислительное равновесие стабилизировалось и находилось на уровне, близком к исходному, тогда как у контрольного варианта (Кт2) нарушение равновесия наступало уже после шести часов и усиливалось при более длительном охлаждении

Применение более жестких (минус 9°С), но кратковременных режимов охлаждения (в течение 20 и 30 мин, при которых растения были переохлаждены), позволило выявить более четкие различия в показателях холодостойкости между ВЗЗ-mv и контрольными (Кг:) растениями картофеля, о чем свидетельствует значительно более высокий уровень ПОЛ после охлаждения контрольных растений (рис, 7). Возможно, что сниженная интенсивность процессов ПОЛ у ВЗЗ-inv растений, по сравнению с контролем, связана с повышенным содержанием в них Сахаров я их способностью перехватывать гидроксильный радикал для предотвращения вызываемых им повреждений (Mohanly, 1981; Czapski, 1984; Аверьянов, Лапикова, 1989).

Рис. 7. Интенсивность ПОЛ в листьях контрольных (К,2) и ВЗЗ~|'лу растений картофеля после охлаждения при температуре минус 9"С в течение 20 и 30 минут.

Длительность охлаждения, мин.

Известно, что резу;штатом усиления ПОЛ является нарушение целостности клеточных мембран, вследствие чего увеличивается выход электролитов из клеток. Определение электропроводности водных экстрактов из тканей листьев растений показало (табл. 1), что жесткие, но краткосрочные, не вызывающие образования льда в тканях, низкотемпературные воздействия при минус 12'С в течение 10, 30 мин и при температуре минус 14'С в течение 20 мин выявили различия в холо достой кости изучаемых ¡енотипов, а именно, более высокую устойчивость к холодовому воздействию растений картофеля, экспрессирующих ген дрожжевой инвертазы. Следует заметить, что тестирующая температура не отражает абсолютную величину устойчивости, она лить служит для выявления различий между вариантами, на основании которьтх можно судить об относительной резистентности растений.

Таблица 1

Влияние разных режимов гипотермии на холодостойкость (%) листьев контрольных (Кт1) н ВЗЗ-(/п> растений картофеля.

Температура (°С), длительность охлаждения, мин Контроль (К-п) ВЗЗ-hiv

22°С 59 59

-12°С, 10 мин 15 59

-12°С, 30 мин 16 59

-12°С, 50 мин 10 14

-14°С, 20 мин 22 45

Таким образом, в результате проведенных опытов выявлено, что растения картофеля, трансформированные геном дрожжевой инвертазы, характеризующиеся более высокой активностью фермента и повышенным содержанием Сахаров, проявляли большую устойчивость к охлаждению С помощью трансформации растений геном дрожжевой инвертазы, без воздействия пониженной, закаливающей температуры были получены прямые доказательства участия инвертаз, особенно кислой формы, связанной с клеточными стенками, в формировании холодостойкости растений картофеля

Для подтверждения этих результатов, был использован также и другой способ воздействия на углеводный метаболизм, основанный на выращивании растений т vitro на средах с различными концентрациями сахарозы

5. Изменения в активности инвертаз, содержании Сахаров и устойчивости к гипотермии контрольных и ВЗЗ-mv растений растений картофеля при выращивании на культуральной среде с разной концентрацией сахарозы.

О применении экзогенных растворов Сахаров, действующих на поверхность илазмалеммы, для повышения морозостойкости растений известно ещё из

классических работ H.A. Максимова (1952). Экспериментально была подтверждена положительная корреляция между содержанием Сахаров и морозостойкостью озимых культур. Доказательством их защитного действия явились работы по закаливанию тканей озимых злаков и интактных растений на экзогенных растворах Сахаров (Туманов, Трунова ¡957, 'Грунова 1972; Crawford, Huxter 1977; Туманов 1979; Steponkus, 19S4; King et al, 1988). Продемонстрировано значительное повышение содержания Сахаров (до 50% от сухой массы) и морозостойкости озимых злаков более, чем на 10°С (Трунова, 1963; 1969; 1972; Sohansson and Knill, 1970). Способ варьирования содержания Сахаров в листьях путем выращивания растений in vitro на средах с различной концентрацией сахарозы (2, 4. 6%) был использован и в наших опытах.

Показано, что при выращивании на среде с 4% сахарозы, суммарная активность фермента в листьях ВЗЗ-inv растений повышалась почти в 2 раза, а на 6% концентрации - в 3 раза, по сравнению с 2% концентрацией сахарозы в среде (рис. 8). При этом, у ВЗЗ-mv растений происходило увеличение активности всех форм фермента, но особенно кислых инвертаз, а в контроле увеличивалась главным образом активность щелочной формы.

Увеличение концентрации сахарозы в среде и повышение активности инвертаз отразилось на содержании разных форм Сахаров в листьях исследуемых растений (рис. 9). Так, повышение концентрации сахарозы до 4% приводило к увеличению содержания Сахаров в листьях обоих генотипов, но в большей степени (в 1,3 раза) у ВЗЗ-inv растений. В результате, у растений, экс пресс ируюших ген инвертазы

5 -

11

ID Си

п> £ 111

I I

га ао. л ö о

о

£ S

II = I

m кислая нерастворимая

кислая растворимая 1 1 щелочная

ВЗ~пу К ВЗЗ-Ы К, B33-wv

Т1 т1 Т1

2% 4% 6%

Рис. 8. Активность разных типов инвертаз в листьях контрольных (Кт|) и ВЗЗ-(/П' растений картофеля при культивировании па МС-среде с 2, 4 и 6% концентрациями сахарозы.

Рис. 9. Содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных (Кн) и ВЗЗ-t/iv растений картофеля при культивировании на МС- среае с 2, 4 и 6% концентра-циями сахароз ы.

дрожжей, выращенных на среде с 4% сахарозой, суммарное содержание Сахаров, по сравнению с контрольными растениями (KTi), стало выше почти в 1,5 раза. Увеличение содержания Сахаров в листьях обоих генотипов наблюдалось и при выращивании на 6% конце1Гграции сахарозы, при этом ВЗЗ-t'nv растения превосходили контроль в 1,2 раза.

Анализ изменений активности инвертаз и содержания Сахаров позволяет предположить, что увеличение активности фермента у обоих генотипов индуцируется повышенными концентрациями сахарозы, поступающей из кул игральной среды, а это, в свою очередь, способствует значительному накоплению Сахаров в листьях, главным образом в форме глюкозы и сахарозы (рис. 9). Причем у трансформантов, обладающих более высокой активностью кислой нерастворимой инвертазы, этот процесс, по-видимому, протекает более интенсивно. Полученные данные подтверждают сведения об индукции активности инвертаз клеточных стснок и вакуолярной высокими концентрациями сахарозы, а также глюкозы и фруктозы, поглощаемыми из инкубационной среды (Kaufman el al., 1979).

Определение устойчивости растений к гипотермии, выращенных на разньос концентрациях сахарозы, «оказало, что оба генотипа формировали бопее высокую холодостойкость при выращивании на среде с 4% сахарозы, при этом у ВЗЗ-иу растений она была выше, чем в контроле (рис. 10).

фруктоза ЯШ глюкоза 1 ! сахароза

К, B33-/ni| К~ ВЭЗ-inJ К ВЗЗ^г?

2%

4%

6%

Рис. 10. Интенсивность ПОЛ в листьях контрольных и ВЗЗ-1йу растений картофеля, выращенных на средах с 2, А и 6% сахарозы, после охлаждения при температуре Е Концентрация сахарозы в культуральной среде, % ИИНУС 2°С в течение 15 мин.

Полученные данные еще раз подтвердили важную роль повышения активности инвертаз в ответ на дейст вие гипотермии, особенно кислой нерастворимой формы, и содержания Сахаров в формировании холодостойкости растений.

7. Влияние длительной адаптации на активность инвертаз и содержание Сахаров р листьях контрольных и ВЗЗ-шу растений картофеля.

Длительная экспозиция растений при низких закаливающих температурах позволяет также направленно изменять углеводный метаболизм и устойчивость к низкотемпературному стрессу (Калоша, Костенко, ] 976; АгШзо е( а!., 2000; Трунова, 2007).

Как следует из полученных мам» данных, при температуре 5°С в течение трёх суток происходило постепенное увеличение активности инвертаз у обоих генотипов, но в большей степени у ВЗЪ-Ш растений, причем главным образом за счет кислых типов, активность которых увеличивалась в 1,5 раза (рис. 11). Высокая активность инвертаз в условиях действия адаптирующих температур является, на наш взгляд, еще одним, аргументом в пользу доказательства важной роли повышения активности фермента при гипотермии.

Н50, ^

5 __'-' Т1

0 — ВЗЗ-/№ о

И 100-1 ч.

I 50-1

X &

£

oJ

5

ГШ

Длительность охлаждения, сут Длительность охлаждения, сут

Длительность охлаждения, сут

Рис И Активность разных типов инвертаз в листьях контрольных (К) и ВЗЗ-;яу растении картофеля в период длительной адаптации (5°С) а) щелочная, б) кислая нерастворимая, в) кислая растворимая

Параллельно с исследованием динамики изменений активности инвертаз проводили анализ содержания разных форм Сахаров (рис 12) Показано, что к третьим суткам охлаждения происходит максимальное их накопление в листьях исследуемых генотипов, но в значитетыю большей мере у ВЗЗ-шу растении, у которых почти в 2 раза повышался уровень глюкозы и более, чем в 5 раз увеличиваюсь количество фруктозы, при этом, по сравнению с другими сахарами, абсолютное ее содержание оставалось низким Наряду с этим, у ВЗЗ-шу растений возрастаю и содержание сахарозы в 1,7 раза Возможно, что инвертаза причастна не только к накоплению моносахаров за счет гидролиза сахарозы, но и к накоплению сахарозы, как ранее указывалось, за счет активации кислой нерастворимой инвертазы, препятствующей оттоку Сахаров из клеток, а также вследствие гидролиза

ВЗЗ-inv (

-а 15 8

1 2 3 4 5 6 Длительность охлаждения, сут

B33-*nv

1 2 3 4 5 6 Длительность охлаждения, сут

Рис 12 Динамика содержания Сахаров в листьях контрольных (К) и ВЗЗ-inv растений картофеля в период длительной холодовой адаптации (5°С) а - фруктоза, б - глюкоза, в - сахароза, г - сумма Сахаров

олигосахаридов, которое показано в опытах с колеоптилями и узлами кущения растений озимой пшеницы (Трунова, 1979, 1984, Miller, Ranwala, 1994) Это предположение согласуется с данными о невысокой субстратной специфичности кислых инвертаз пшеницы, которая способна гидролизовать раффинозу и другие олигосахариды, имеющие гликозил-гликозидные связи (Krishnan et al, 1985) Не исключено, что из моносахаров, образующихся при гидролизе олигосахаридов, может

происходить рссинтсз сахарозы, поскотьку в условиях холодового закаливания выявлена достаточно высокая активность сахарозосинтезирующих ферментов (Calderón, Potic, 1985, Crespi et al, 1991)

При сопоставлении полученных данных можно сделать вывод, что динамика изменения содержания Сахаров в листьях обоих генотипов согласуется с данными изменения активности инвертаз Максимальная активность фермента к третьим суткам адаптации соответствовала наибольшему содержанию Сахаров, при этом ВЗЗ-inv растения по этим показателям превосходили контрольные растения

8. Изменения в интенсивности перекисного окисления липидов и ионной проницаемости клеточных мембран в листьях контрольных и B33-t'/iv растений картофеля при длительной адаптации к низкой положительной температуре.

Одновременно с исследованием изменений активности инвертаз и содержания Сахаров было проведено определение интенсивности ПОЛ в динамике длительной адаптации (рис 13) Показано, что суточная адаптация при 5°С не вызвала значительных изменений в интенсивности ПОЛ у исследуемых растений Трехсуточное воздействие низкой температуры приводило к незначительному повышению интенсивности ПОЛ, а более продолжительное, шестидневное охлаждение сопровождалось существенным увеличением ПОЛ в листьях контрольных растений и почти не оказывало влияние на этот процесс у ВЗЗ-г/п' растений В результате после шести суток проявлялись четкие различия между исследуемыми растениями, у контрольных растений содержание МДА возрастало по сравнению с неохлажденным вариантом в 2,5 раза, тогда как у ВЗЗ-mv растений наблюдалось лишь небольшое его повышение

Полученные данные свидетельствуют о том, что картофель, как типичный представитель холодостойких растений, обладает сравнительно мощной антиоксидантной системой, емкость которой достаточна для предотвращения развития ПОЛ в течение трех суток действия пониженной гемпературы Ее истощение начинается после трехдневного влияния гипотермии, что очевидно на примере контрольных растений У ВЗЗ-ínv растений за счет большего повышения

■8 20 Г

15

10

с

0

1 5 £

Рис 13 Влияние длительной холодовой адаптации (5°С) на динамику ПОЛ в листьях

ВЗЗ-ШУ

^ контрольных (К) и ВЗЗ-/лу

растений картофеля

1 2 з 4 5 е Длительность охлаждения, сут

содержания Сахаров в листьях усиление окислительных процессов не наблюдали, возможно, благодаря их стабилизирующему действию на мембраны, и участию в роли низкомолекулярных антиоксидантов, на что указывали ряд авторов (Аверьянов, Лапикова, 1989)

Для подтверждения полученных данных, также проводились измерения холодового повреждения по выходу электролитов из листьев исследуемых генотипов, что широко используется для диагностики холодоустойчивости, которая является обратной величиной ионной проницаемости мембран Показано, что в листьях ВЗЗ-/лу растений изменения в проницаемости мембран почти не наблюдались Напротив, у контрольных растений после шестисуточной адаптации холодостойкость уменьшалась, по сравнению с неохлажденным вариантом, что указывает на развитие повреждений (рис 14) Как видно из проведенных исследований, динамика развития

ЮОг

ВЗЗ-1ПУ

о к

1 2 3 4 5 6 Длительность охлаждения, сут

Рис 14 Холодостойкость тканей листьев контрольных (К) и ВЗЗ-ип' растений картофеля в период длительной холодовой адаптации (5°С)

окислительного стресса и изменения проницаемости клеточных мембран происходят в разные периоды действия пониженной температуры

Об адаптивных изменениях свидетельствуют также проведенные нами электронно-микроскопические и морфометрические исследования клеток палисадной паренхимы листьев, которые выявили, что в период низкотемпературной адаптации исследуемые растения формируют ксероморфную, характерную для холодостойких растений ультраструктуру

Таким образом, в наших опытах показано, что растения картофеля к третьим суткам адаптации при пониженной (5°С) температуре формируют максимальную холодостойкость, при этом растения, трансформированные геном дрожжевой инвертазы, проявляли большую холодостойкость, по сравнению с контролем, о чем свидетечьствуют более низкая интенсивность ПОЛ и отсутствие нарушений в ионной проницаемости мембран Этому, по-видимому, способствовало повышенное содержание Сахаров и их многообразные защитные функции при гипотермии (Трунова, 1979, Sauter et al, 1998)

Заключение

Многие произрастающие на Земле дикорастущие и культурные растения относятся к группе холодостойких видов, устойчивых к низким положительным температурам, но погибающим от образования льда при действии мороза. В эту группу входят хозяйственно важные растения, среди которых картофель, как продовольственная культура, занимает одно из первых мест Однако механизм устойчивости холодостойких растений к гипотермии изучен в значительно меньшей мере, по сравнению с морозостоикими и теплолюбивыми растениями

Известно, что формирование низкотемпературной устойчивости основано на реализации под влиянием гипотермии генетической программы адаптации растений, связанной с развитием комплекса защитных реакций, в числе которых существенное значение имеют, достаточно хорошо изученные для морозостойких растений, изменения в углеводном метаболизме Это относится, прежде всего, к одному из ключевых ферментов - ипвертазе, разным ее типам, локализованным в различных

клеточных компартментах и приводящих к изменению содержания и состава Сахаров Применительно к холодостойким растениям доказательства важной роли Сахаров почти отсутствуют Одной из причин недостаточного внимания к этой проблеме может быть тот факт, что у холодостойких растений, в отличие от морозостойких, при адаптации в условиях пониженных температур концентрация Сахаров в клетках изменяется в значительно меньшей степени Другая причина, по-видимому, связана с отсутствием до недавнего времени методов прямого воздействия на углеводный метаболизм Традиционные способы изменения содержания Сахаров и устойчивости путем закаливания низкими положительными температурами не достаточно эффективны, поскольку понижение температуры приводит к проявлению многих защитных реакций, в том числе и экспрессии не только генов белков углеводного метаболизма, но и белков холодового шока существенно влияющих на формирование холодостойкости, что мешает однозначной интерпретации полученных результатов В связи с этим в настоящей работе, наряду с традиционными, были использованы современные подходы и методы исследования

Применение растений, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, позволило изменить углеводный метаболизм без воздействия низкой температуры Впервые экспериментально показано, что повышение содержания Сахаров за счет активации разных форм инвертаз привело к значительному увеличению устойчивости, которое в представленной работе было подтверждено многими методами

Благодаря использованию растений с введенным геном дрожжевой инвертазы апопластной локализации, была выявлена важная роль кислой нерастворимой формы в повышении содержания сахарозы в листьях за счет торможения загрузки флоэмы Этот процесс чрезвычайно важен для холодостойких растений, у которых, в отличие от морозостойких, стратегия адаптации направлена в основном на сохранение надземной части растений, в том числе и листьев Полученные данные подтверждены и традиционными методами как выращиванием растений картофеля на средах с повышенным содержанием сахарозы, так и их длительным закаливанием при пониженных температурах при этом обнаружена способность растений картофеля развивать максимальную холодостойкость к третьим суткам адаптации Таким образом, используя традиционные и современные методы исследования,

продемонстрирована связь формирования устойчивости холодостойких растений с активацией инвертаз и накоплением Сахаров

На основании ночученных данных можно сделать следующие выводы

Выводы:

1 Эффективность встроенного гена дрожжевой инвертазы у ВЗЗ-mv растений картофеля, наряду с молекулярными методами, подтверждена значительно более высокой, по сравнению с контролем, активностью разных форм инвертаз (вакуолярной, апопластной, цитоплазматической) Среди вегетативных органов у ВЗЗ-mv растений наибольшая активность фермента выявлена в листьях

2 Трансформация растений геном дрожжевой инвертазы с апопластной локализацией фермента приводила к особенно заметному увеличению активности кислой нерастворимой инвертазы, что, по-видимому, сопровождалось торможением загрузки флоэмы и накоплением Сахаров в листьях не только в форме глюкозы и фруктозы, но и в большей степени в форме сахарозы

3 Установлено, что ВЗЗ-глу растения, обогащенные разными формами Сахаров, проявляли большую устойчивость к гипотермии, то сравнению с контрольными растениями, что проявлялось в меньшей интенсивности перекисного окисления липидов и более низком уровне выхода электролитов из клеток при разных режимах охлаждения

4 Культивирование растений т vitro позволило выявить зависимость активности всех форм инвертаз, в том числе и кислой нерастворимой формы, а также степень аккумулирования Сахаров в клетках от содержания сахарозы в культурапьной среде Установлено, что на среде с 4% концентрацией сахарозы у обоих генотипов, и особенно у ВЗЗ-<иу растений, формировалась наиболее высокая холодостойкость

5 Показано, что при длительном охлаждении в условиях адаптирующих температур у контрольных и ВЗЗ-шу растений к третьим суткам происходило наибольшее увеличение активности инвертаз, главным образом кислых форм,

и содержания Сахаров в виде сахарозы и глюкозы, которое коррелировало с повышением устойчивости растений к низкой положительной температуре, выраженной в большей степени у ВЗЗ-шу растений

6 Более высокая холодостойкость ВЗЗ-mv растений подтверждена исследованиями ультраструктурной организации хлоропластов Выявлено, что действие длительного охлаждения на растения, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей, приводило к образованию более устойчивой к холоду, ксероморфной структуры и выражаюсь в редукции мембранных элементов хлоропластов, характерной для более холодостойких растений

7 Совокупность полученных данных может служить убедительным доказательством важной роли инвертаз и особенно кислой нерастворимой формы в повышении содержания Сахаров, способствующих формированию устойчивости растений, относящихся к холодостойкому типу

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Дерябин А.Н, Трунова Т.И, Дубинина И.М., Бураханова Е А., Сабелышкова Е.П, Крылова Е М., Романов Г.А. (2003) Устойчивость к гипотермии растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, находящимся под контролем промотора пататина ВЗЗ Физиоюгт растений, 50, 505-510

2 Трунова Т.И, Астахова И В, Дерябин А И, Сабельникова Е.П (2003) Ультраструктурная организация хлоропластов листьев растений картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы, в норме и при гипотермии Доклады АН, 389, 842-845

3 Deryabin A.N., Dubinina IМ, Burakhanova Е.А, Astakhova N.V., SabcPnikova E P., Smkevich M.S , Trunova T.I. (2004) Tolerance to low temperature of potato plants transformed with yeast invertase gene Acta Agrobolanica, 57, 31 -39

4 Deryabin A., Dubinina I, Burakhanova E, Astakhova N., SabePnikova E., Smkevich M, Trunova T. (2004) Studying of cold tolerance of potato plants transformed with yeast invertase gene Agriculture Scientific articles, 2, 22-29

5 Deryabin A.N., Dubinina IM, Burakhanova E.A., Astakhova N.V, Sabel'nikova E P., Trunova TI (2005) Influence expressing yeast-denved invertase gene in potato plants on membranes lipid peroxidation at low temperature Journal of Thermal Biology, 30, 73-77

6 Трунова T II, Дерябин A.II, Сабелышкова Е П , Алиева Г П, Аксенова If П , Константинова T.II, Романов Г.А. (2001) Холодостойкость растений картофеля

трансформированного геном дрожжевой инвертазы Вестник Башкирского университета, 4,43-45

7 Сабслышкова Е.П, Дерябин А.П., Дубинина ИМ., Бураханова Е.Л., Трунова Т.П. (2002) Влияние трансформации картофеля (Solarium tuberosum L cv Desiree) геном дрожжевой инвертазы на устойчивость к гипотермии Материалы IV Междунар научно-практ конф "Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений " (24-28 июня 2002 г), Ульяновск, 2, с 48-50

8 Sabelnikova Е.Р., Deryabin A.N , Dubinina I.M , Burakhanova E.A., Alieva G.P., Aksenova N P., Konstantmova T.N, Romanov G A., Trunova T.I (2001) Influence of low-temperature stress on potato transformed with yeast invertase gene fused to patatin promoter Abslr Intern Symp "Plants under Environmental Stress" Moscow, К A Timiryazev Institute of Plant Physiology, October 23-28, pp 246-247

9 Трунова ТИ, Астахова II.B., Дерябнн A.H, Сабельникова Е.П. (2002) Ультрасгруюура хлоропластов растений картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы Тез докл XIX Российской конф по электронной микроскопии "ЭМ'2002', Черноголовка, 28-31 мая 2002, с 266

10 Deryabin A.N., Astakhova N.V., Sabelnikova Е P., Trunova T.I. (2002) Chloroplasts ultrastructure in potato transformed by the yeast invertase gene in connection with cold resistance Abslr The 3rd International IRAN and RUSSIA Conference "Agriculture and Natural Resources" (September 18-20, 2002), MTAA, Moscow, Russia, pp 22-23

11 Sabelnikova E P., Deryabin A N. (2002) Increasing of tolerance to hypothermia of potato transformed with yeast invertase gene fused to patatm promoter Abstr 1-st International Congress "Biotechnology - state of the art&prospects of development" Moscow, October 14-18,200, pp 109

12 Сабельникова Е.П, Дубинина И.М., Бураханова Е.А, Дерябин А.П., Трунова Т И. (2003) Влияние трансформации геном дрожжевой инвертазы на углеводный метаболизм у растений картофеля (Solanum tuberosum L , cv Desiree) Тез Докл V съезда общества физиологов растений России Пенза, 15-21 сент 2003, с 494-495

13 Deryabin A., Dubinina I, Burakhanova Е., Astakhova N., Sabelnikova E., Sinkevich M., Trunova T. (2004) Tolerance increase of potato plants (Solanum tuberosum L , cv Desiree) expressing yeast-denved invertase to low temperature Abstr Intern Scientific Conf "Growth and development of plants Theoretical and practical problems" Lithuanian Inst Horticulture Babtai, 7-9 June 2004, pp 34-35

14 Дерябин A.II., Синькевич M.C, Сабельникова Е П., Бураханова Е.П., Дубинина И.М., Трунова Т И. (2006) Роль Сахаров в устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гинотермиеи Годичное собрание общества физиологов растений России Ростов-на-Дону, 2-6 окт 2006 Тез докл , с 77

Подписано в печать 18 04 2007 г Исполнено 19 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ №388 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабельникова, Елена Павловна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Физиологические и молекулярные механизмы повреждений 6 и устойчивости растений к действию гипотермии

1.2 Инвертазы растений, их физиологическая роль и значение 21 при гипотермии

1.3 Функции углеводов в низкотемпературной адаптации 32 растений

1.4 Трансгенные растения, как модель для изучения стрессовых 36 ответов

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Выращивание растений in vitro

2.3 Определение проницаемости мембран

2.4 Определение интенсивности перекисного окисления 42 липидов

2.5 Измерение газообмена растений

2.6 Определение активности разных типов инвертаз в листьях 44 растений

2.7 Определение содержания Сахаров в листьях растений

2.8 Исследование ультраструктурной организации

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Влияние введенного гена дрожжевой инвертазы на 46 углеводный метаболизм трансформированных растений картофеля {Solanum tuberosum L.) сорта Дезире

3.1.1 Анализ активности пататинового промотора и разных типов 46 инвертаз в вегетативных органах ВЗЗ-шу растений картофеля

3.1.2 Активность инвертаз и содержание Сахаров в листьях 51 контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля

3.1.3 Особенности фотосинтеза, дыхания и роста контрольных и 55 ВЗЗ-шу растений картофеля в условиях in vitro

3.2 Холодостойкость контрольных и ВЗЗ-inv растений 61 картофеля

3.2.1 Изменение интенсивности перекисного окисления 62 мембранных липидов при охлаждении контрольных и ВЗЗwv растений картофеля

3.2.2 Изменение ионной проницаемости клеточных мембран при 70 охлаждении контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля

3.3 Изменения в углеводном метаболизме и устойчивости к гипотермии контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы

3.3.1 Активность разных типов инвертаз и содержание Сахаров в 75 листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы

3.3.3 Интенсивность перекисного окисления липидов при 81 гипотермии в листьях контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы

3.4 Действие холодового закаливания на углеводный 85 метаболизм и устойчивость к гипотермии контрольных и B33-//IV растений картофеля

3.4.1 Влияние низкой закаливающей температуры на активность 86 разных типов инвертаз в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля

3.4.2 Изменение содержания Сахаров в листьях контрольных и 91 ВЗЗ-wv растений картофеля в условиях холодового закаливания

3.4.3 Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях 97 контрольных и ВЗЗ-шу растений картофеля при холодовом закаливании

3.4.4 Изменение ионной проницаемости клеточных мембран при 100 адаптации контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля

3.4.5 Влияние низкотемпературной адаптации на 104 ультраструктурную организацию хлоропластов в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль углеводного метаболизма в устойчивости растений к гипотермии на примере картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы"

Температура среды обитания является одним из наиболее значительных факторов, оказывающих существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов (Туманов, 1979; Levitt, 1980). Известно, что в ответ на различные стрессоры, в том числе гипотермию, в растениях происходит неспецифическое усиление гидролиза полимерных форм углеводов и накопление низкомолекулярных растворимых Сахаров, что играет важную роль в формировании устойчивости к низким температурам (Максимов, 1952; Туманов, 1979; Трунова, 1984; 2007; Perera et al., 1995; Winter, Huber, 2000). Наиболее полно этот вопрос изучен на примере морозостойких растений (Трунова, 1963; 1998; Туманов и др. 1969; Самыгин, 1974; 1994) и в значительно меньшей степени у холодостойких растений, неустойчивых к льдообразованию, но адаптирующихся к низким положительным температурам (Дроздов, Курец, 2003).

Учитывая значимость Сахаров в устойчивости растений к гипотермии, значительный интерес представляют гидролитические ферменты углеводного метаболизма, в частности, инвертаза, катализирующая реакцию расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу и поэтому играющая важную роль в углеводном метаболизме. На сегодняшний день, вопрос о роли инвертаз (вакуолярной, ч апопластной, цитоплазматической) в устойчивости холодостойких растений к гипотермии остается открытым. Отсутствуют четкие экспериментальные доказательства связи активности инвертаз и содержания различных форм Сахаров с формированием устойчивости холодостойких растений к гипотермии, стратегия выживания которых направлена на сохранение от повреждений надземной части, как наиболее уязвимой к действию пониженных температур. Решению этих вопросов может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом. В частности, трансформация типичного представителя группы холодостойких растений - картофеля геном дрожжевой инвертазы апопластной локализации способна изменить содержание и соотношение моно- и дисахаров в листьях за счет гидролиза сахарозы в апопласте (Kallarakal, 1989; Schaewen et al., 1990; Sonnewald et al., 1997) и, возможно, повлиять на устойчивость растений к гипотермии.

Цель настоящей работы состояла в изучении зависимости формирования устойчивости к гипотермии растений картофеля от активности инвертаз и содержания разных форм Сахаров, изменения которых достигались тремя способами:

1) путем трансформации растений геном дрожжевой инвертазы; 2) культивированием in vitro на средах с различной концентрацией сахарозы и 3) длительной экспозицией при пониженной адаптирующей температуре. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние трансформации растений картофеля геном дрожжевой инвертазы на активность инвертаз, содержание разных форм Сахаров и устойчивость к гипотермии по определению перекисного окисления липидов в тканях листьев и экзоосмоса электролитов из них.

2. Определить интенсивность процесса фотосинтеза в условиях in vitro и его вклад в изменение содержания Сахаров в листьях растений исследуемых генотипов.

3. Изучить активность инвертаз и содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных и трансформированных растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы (2, 4, 6%), и исследовать вызванные этим фактором изменения в устойчивости к гипотермии.

4. В период длительной адаптации растений картофеля к низкой положительной температуре изучить динамику активности инвертаз, содержания разных форм Сахаров и формирования холодостойкости.

5. Выявить изменения в ультраструктурной организации хлоропластов растений картофеля, вызванные трансформацией геном дрожжевой инвертазы, а также длительным воздействием низких положительных температур.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Сабельникова, Елена Павловна

Выводы:

1. Эффективность встроенного гена дрожжевой инвертазы у ВЗЗ-wv растений картофеля, наряду с молекулярными методами, подтверждена значительно более высокой, по сравнению с контролем, активностью разных форм инвертаз (вакуолярной, апопластной, цитоплазматической). Среди вегетативных органов у ВЗЗ-wv растений наибольшая активность фермента выявлена в листьях.

2. Трансформация растений геном дрожжевой инвертазы с апопластной локализацией фермента приводила к особенно заметному увеличению активности кислой нерастворимой инвертазы, что, по-видимому, сопровождалось торможением загрузки флоэмы и накоплением Сахаров в листьях не только в форме глюкозы и фруктозы, но и в большей степени в форме сахарозы.

3. Установлено, что ВЗЗ-wv растения, обогащенные разными формами Сахаров, проявляли большую устойчивость к гипотермии, по сравнению с контрольными растениями, что проявлялось в меньшей интенсивности перекисного окисления липидов и более низком уровне выхода электролитов из клеток при разных режимах охлаждения.

4. Культивирование растений in vitro позволило выявить зависимость активности всех форм инвертаз, в том числе и кислой нерастворимой формы, а также степень аккумулирования Сахаров в клетках от содержания сахарозы в культуральной среде. Установлено, что на среде с 4% концентрацией сахарозы у обоих генотипов, и особенно у ВЗЗ-wv растений, формировалась наиболее высокая холодостойкость.

5. Показано, что при длительном охлаждении в условиях адаптирующих температур у контрольных и ВЗЗ-wv растений к третьим суткам происходило наибольшее увеличение активности инвертаз, главным образом кислых форм, и содержания Сахаров в виде сахарозы и глюкозы, которое коррелировало с повышением устойчивости растений к низкой положительной температуре, выраженной в большей степени у ВЗЗ-inv растений.

6. Более высокая холодостойкость ВЗЗ-inv растений подтверждена исследованиями ультраструктурной организации хлоропластов. Выявлено, что действие длительного охлаждения на растения, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей, приводило к образованию более устойчивой к холоду, ксероморфной структуры и выражалось в редукции мембранных элементов хлоропластов, характерной для более холодостойких растений.

7. Совокупность полученных данных может служить убедительным доказательством важной роли инвертаз и особенно кислой нерастворимой формы в повышении содержания Сахаров, способствующих формированию устойчивости растений, относящихся к холодостойкому типу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многие произрастающие на Земле дикорастущие и культурные растения относятся к группе холодостойких видов, устойчивых к низким положительным температурам, но погибающим от образования льда при действии мороза. В эту группу входят хозяйственно важные растения, среди которых картофель, как продовольственная культура, занимает одно из первых мест. Однако механизм устойчивости холодостойких растений к гипотермии изучен в значительно меньшей мере, по сравнению с морозостойкими и теплолюбивыми растениями.

Известно, что формирование низкотемпературной устойчивости основано на реализации под влиянием гипотермии генетической программы адаптации растений, связанной с развитием комплекса защитных реакций, в числе которых существенное значение имеют, достаточно хорошо изученные для морозостойких растений, изменения в углеводном метаболизме. Это относится, прежде всего, к одному из ключевых ферментов - инвертазе, разным её типам, локализованным в различных клеточных компартментах и приводящих к изменению содержания и состава Сахаров. Применительно к холодостойким растениям доказательства важной роли Сахаров почти отсутствуют. Одной из причин недостаточного внимания к этой проблеме может быть тот факт, что у холодостойких растений, в отличие от морозостойких, при адаптации в условиях пониженных температур концентрация Сахаров в клетках изменяется в значительно меньшей степени. Другая причина, по-видимому, связана с отсутствием до недавнего времени методов прямого воздействия на углеводный метаболизм. Традиционные способы изменения содержания Сахаров и устойчивости путем закаливания низкими положительными температурами не достаточно эффективны, поскольку понижение температуры приводит к проявлению многих защитных реакций, в том числе и экспрессии не только генов белков углеводного метаболизма, но и белков холодового шока, существенно влияющих на формирование холодостойкости, что мешает однозначной интерпретации полученных результатов. В связи с этим в настоящей работе, наряду с традиционными, были использованы современные подходы и методы исследования.

Применение растений, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, позволило изменить углеводный метаболизм без воздействия низкой температуры. Впервые экспериментально показано, что повышение содержания Сахаров за счет активации разных форм инвертаз приводило к значительному увеличению конститутивной устойчивости, что в представленной работе было подтверждено многими методами.

Благодаря использованию растений с введенным геном дрожжевой инвертазы апопластноЙ локализации, была выявлена важная роль кислой нерастворимой формы в повышении содержания сахарозы в листьях за счет торможения загрузки флоэмы. Этот процесс чрезвычайно важен для холодостойких растений, у которых, в отличие от морозостойких, стратегия адаптации направлена в основном на сохранение надземной части растений, в том числе и листьев. Полученные данные подтверждены и традиционными методами: как выращиванием растений картофеля на средах с повышенным содержанием сахарозы, так и их длительным закаливанием при пониженных температурах, при этом обнаружена способность растений картофеля развивать максимальную холодостойкость к третьим суткам адаптации. Таким образом, используя традиционные и современные методы исследования, продемонстрирована связь формирования устойчивости холодостойких растений с активацией инвертаз и накоплением Сахаров.

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабельникова, Елена Павловна, Москва

1. Аверьянов А.А., Лапикова В.П. (1989) Взаимодействие Сахаров с гидроксильным радикалом в связи с фунгитоксичностью выделений листьев. Биохимия, 54, 10, 1646-1651.

2. Александров В.Я. (1985) Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 318 с. Астахова Н.В., Климов С.В., Трунова Т.И., Райхман Л.Д. (1991) Влияние холодового закаливания на ультраструктуру клеток озимой пшеницы. ДАН, 320, 1, 252-255.

3. Балагурова Н. И., Тихова М. А., Маркова Т. М. (1987) Электронно-микроскопическое исследование влияния низкой положительной температуры на палисадные клетки. Физиология растений, 34,3,612-617.

4. Балагурова Н.И., Дроздова С.Н., Тихова М.А., Сулимова Г.М. (1980) Влияние низких положительных и отрицательных температур на ультраструктуру клеток листьев картофеля. Бот. журн., 65, 8,1156-1161.

5. Барабой В. А. (1991) Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии. 111,6,923-931.

6. Белоус A.M., Бондаренко В.Н. (1982) Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка, 225 с.

7. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. (1985) Перекисное окисление липидов мембран и природные антиксиданты. Успехи химии, LIV, 9,1540-1558.

8. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. (1993) Стресс у растений. М.: Изд-во Моск. ун-та., 144 с.

9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: изд-во Наука, 252 с.

10. Доспехов Б.А. (1977) Методика опытного дела. М.: Колос, 416 с.

11. Дубинина И.М. (1969) Инвертаза и её индуцирование в корневой системе сахарнойсвеклы. Физиология растений, 16,6, 981-987.

12. Дубинина И.М., Бураханова Е.А. (1971) О природе активации инвертазы впереживающих тканях. Физиология растений, 18, 5, 980-986.

13. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. (1984) Подавление активностиинвертазы в проводящих пучках сахарной свеклы как необходимое условие длятранспорта сахарозы. Физиология растений, 31,1,153-161.

14. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. (1982) Регуляция активностиинвертазы в культурах изолированных тканей сахарной свеклы. Физиологиярастений, 29, 6, 1188-1195.

15. Ермаков Е. И., Полевой А. В. (1993) Изменение баланса эндогенных ИУК и АБК в корнях проростков кукурузы при прямом и опосредованном низкотемпературном стрессе. Докл. Росс. акад. с.-х. наук, 3, 16-19.

16. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов Л.В. (1982) Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами. Физиология растений, 29, 6, 1045-1052.

17. Заботин А.И., Барышева Т.С., Заботина О.А., Ларская И.А., Лозовая В.В. (1995) Клеточная стенка растений и формирование гипотермического синдрома. Докл. РАН, 343, 567-570.

18. Заботина О.А, Аюпова Д.А, Ларская И.А, Николаева О.Г, Петровичева Г.А, Заботин А.И. (1998) Физиологически активные полисахариды, накапливающиеся в корнях озимой пшеницы в ходе низкотемпературной адаптации. Физиология растений, 45,262-267.

19. Зауралов О. А, Жидкин В. И. (1982) Влияние охлаждения на соотношение эндогенных регуляторов роста в растениях проса В сб: Растения и среда. Межвуз. сб. науч. тр. Саранск, с. 118-130.

20. Карасев Г.С, Нарлева Г.И, Боруах К.К, Трунова Т.И. (1991) Изменение состава и содержания полипептидов в процессе адаптации озимой пшеницы к низким отрицательным температурам. Физиология и биохимия культурных растений, 23, 5, 480.

21. Кириченко Е.Б. (1984) Физико-химические факторы экорезистентности растений в онтогенезе и филогенезе. Пущино: ОНТИ АН СССР, 19 с.

22. Колоша О.И. (1975) Физиологические основы морозостойкости озимых злаковых культур. В сб: Методы и приемы повышения зимостойкости озимых зерновых культур. М.: Колос, с. 294-306.

23. Колоша О.И., Костенко И.И. (1976) Морозостойкость озимых зерновых культур в связи с водным режимом и ходом метаболических процессов. В сб: Устойчивость растений к неблагоприятным температурным условиям среды. Киев: Наук. Думка, с. 5-19.

24. Колупаев Ю.Е., Борисенко Л.Р., Рябчун Н.И. (1993) Особенности проявления активности инвертазы в условиях гипотермии в связи с морозостойкостью озимых злаков. Физиол. и биохим. культ, раст, 25,4,378-393.

25. Колупаев Ю.Е., Трунова Т.И. (1994) Активность инвертазы и содержание углеводов в колеоптилях пшеницы при гипотермическом и солевом стрессах. Физиология растений, 41, 4, 552-557.

26. Колупаев Ю.Е., Трунова Т.И. (1992) Особенности метаболизма и защитные функции углеводов растений в условиях стрессов. Физиол. биохим. культ, раст., 24, 6, 523-533.

27. Кузнецов Вл. В., Кимпел Дж., Годжиян Дж., Ки Дж. (1987) Элементы неспецифичности генома растений при холодовом и тепловом стрессе. Физиология растений, 34, 5, 853-858.

28. Куркова Е.Б. (1970) Изменение ультраструктуры клеток различных по холодостойкости сортов огурцов. Физиология и биохимия культурных растений, 2, 4,385-389.

29. Лютге У., Хигинботам Н. (1984) Передвижение веществ в растениях. М.: Колос, 408 с.

30. Новицкая Г.В., Суворова Т.А. (1994) Изменение липидного состава мембранных фракций проростков озимой пшеницы при низкотемпературной адаптации. Физиология растений, 41, 539-545.

31. Опритов В.А., Худяков В.А., Пятыгин С.С. (1992) О роли жидкостности липидного матрикса плазмалеммы клеток высшего растения в модуляции активности Н5+0-АТФазы при различных формах умеренного холодового воздействия. Физиология растений, 39, 3, 533-540.

32. Пахомова В.М. (1992) Об адаптивном значении увеличения проницаемости мембран при обратимой альтерации клеток отсеченных корней. Физиология и биохимия культурных растений, 24, 6, 568.

33. Петрова О.В., Колоша О.И., Сухарева И.Б. (1984) Изменение в составе легкорастворимых белков озимой пшеницы при криоадаптации. Физиология и биохимия культурных растений, 16, 2, 166-170.

34. Попов В.Н. (2002) Сравнительное исследование низкотемпературной адаптации томата и огурца в связи с их углеводным метаболизмом. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 115 с.

35. Приходько Н.В. (1977) Изменение проницаемости клеточных мембран как общее звено механизмов неспецифической реакции растений на внешние воздействия. Физиол. и биохим. культ, раст., 9, 3, 301-309.

36. Романов Г.А. (2000) Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности. Физиология растений, 47, 3,343-353.

37. Савич И.М., Таджибаева Т. Л. (1988) Влияние холодового стресса на изопероксидазы проростков кукурузы и пшеницы, различающихся по изоэлектрическим точкая. Физиология растений, 35, 5, 841-847.

38. Трунова Т.И. (1984) Физиологические и биохимические основы адаптации растений к морозу. С-х. биология, 6, 3-10.

39. Хочачка П., Сомеро Дж. (1977) Стратегия биохимической адаптации. М. Мир, 400 с.

40. Худяков В.А., Гнездилов А.В., Яркова О.Ю. (1986) Термоиндуцированные структурные переходы в плазматических мембранах растений различной холодоустойчивости. В сб.: Биоэлектрогенез и транспорт веществ у растений. Горький, Изд-во Горьк. Ун-та, с. 58-61.

41. Шеяхметова И.Ш. (1987) Адаптационные изменения липидов при формировании морозостойкости озимой пшеницы и влияние света на этот процесс. Автореф. дисс. канд. биол. наук, Москва, с. 14.

42. Эйдус Л.Х. (1977) Неспецифическая реакция клеток и радиочувствительность. М.: Агропромиздат, 151 с.

43. Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N. (1998) Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine. Plant J., 16, 155.

44. Bartolozzi F., Mencuccini M., Fontanazza G. (2001) Enhancement of frost tolerance in olive shoots in vitro by cold acclimation and sucrose increase in the culture medium. Plant Cell, tissue and organ culture, 67, 299-302.

45. Benhamou N., Grenier J., Chrispeels M. (1991) Accumulation of ^-fructosidase in the cell walls of tomato roots following infection by a fungal wilt pathogen. Plant Physiology, 97, 739-750.

46. Berberich Т., Kusano T. (1997) Cycloheximide induces a subset of low temperature inducible genes in maize. Molecular & General Genetics, 254, 3,275-283.

47. Beruter J. (1985) Sugar accumulation and changes in the activities of related enzymesduring development of apple fruit. J. Plant Physiol, 121, 331-341.

48. Billett E.E, Billett M.A. and Burnett J.H. (1977) Stimulation of maize invertase activityfollowing infection by Ustilago maydis. Phytochemistry, 16, 1163-1166.

49. Bournay A, Hedley P, Maddison A, Waugh R, Machray G. (1996) Exon skippinginduced by cold stress in a potato invertase gene transcript. Nucleic Acids Research, 24,2347-2351.

50. Bracho G, Whitaker J. (1990) Purification and partial characterization of potato (Solanum tuberosum) invertase and its endogenous proteinaceous inhibitor. Plant Physiology, 92, 386-394.

51. Brunner M, Kocsy G, Ruegsegger A, Schmutz D, Brunold C. (1995) Effect of chilling on assimilatory sulfate reduction and glutathione synthesis in maize. J. Plant Physiol., 146, 5-6, 743-747.

52. Cabane M, Calvet P, Vincens P, Boudet A. M. (1993) Characterization of chilling acclimation-related proteins in soybean and identification of one as a member of the heat-shock protein (HSP-70) family. Planta, 190, 3, 346-353.

53. Caffery M., Tonseca V, Leopold A.C. (1988) Lipid-sugar interactions Reveauce to anhydrous biology. Plant Physiol., 3, 754-758.

54. Calderon P, Pontic N.G. (1985) Increase of sucrose Synthase activity in wheat plante after a chilling shoch. Plant Sci., 42, 3, 173-176.

55. Carlson M. (1987) Regulation of sugar utilization in Saccharomyces species. Journal of Bacteriology, 169, 4873-4877.

56. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. (1983) Involument of abscisic acid in potato cold acclimation. Plant Physiol., 71,2,362-365.

57. Chen J., Black C. (1992) Biochemical and immunological properties of alkaline invertase isolated from sprouting soybean hypocotyls. Archives of Biochemistry and Biophysics, 295,61-69.

58. Chen Z-Q., Xu C-H., Chen M-Y., Xu L.W., Ke-Bin L.S.-Q., Kuang T-Y. (1994) Effect of cold hardening on thylakoide membrane lipids and proteins of spring wheat and winter wheat. Acta Bot. Sinica., 36,6,423-429.

59. Cheng W., Taliercio E., Chourey P. (1996) The Miniature 1 seed locus of maize encodes a cell-wall invertase required or normal development of endosperm and maternal cells in the pedicel. The Plant Cell, 8, 971-983.

60. Crawford R. M. M., Huxter T. J. (1977) Root growth and carbohydrate metabolism at low temperatures. J. Exp. Bot., 28, 105, 917-925.

61. Crespi M.D., Zabaleta E.J., Pontis H.G., Salerno G.L. (1991) Sucrose synthase expression during cold acclimation in wheat. Plant Physiol., 96, 3, 887-891. Czapski G. (1984) On the use of *OH scavengers in biological systems. Israel J. Chem., 24,1,29-32.

62. Darley C. P., Davies J. M., Sanders D. (1995) Chill-induced changes in the activity and abundance of the vacuolar proton-pumping pyrophosphatase from mung bean hyrocotyls. Plant Physiol., 109, 2, 659-665.

63. Delaney T.P. (1997) Genetic Dissection of Acquired Resistance to Disease. Plant Physiol., 113, 5-12.

64. Dochlert D.C., Felker F.C. (1987) Characterisation and distribution of invertase activity in developing maise kernels. Physiologia Plantarum, 70, 51-57.

65. Ebrahim M. К. Н., Vogg G., Osman M. N. E. H., Komor E. (1998) Photosynthetic performance and adaptation of sugarcane at suboptimal temperatures. J. Plant Physiol., 153, 5-6, 587-592.

66. Eschrich W., Eschrich B. (1992) Control of phloem unloading by source activities and light. Plant Physiology and Biochemistry, 25, 625-634.

67. Fleischmacher O.L., Prado F.E., Sampietro A.R. (1980) Cell wall invertases from apex and callus tissues. Plant Cell Physiol., 21, 7, 1273-1281.

68. Goupil P., Croisille Y., Croisille E. and Ledoigt G. (1988) Jerusalem artichoke invertases-immunocharacterization of a soluble form and its putative precursors. Plant Science, 54, 45-54.

69. Greenland A.J., Lewis D.H. (1981) The acid invertases of the developing third leaf ofoat. 11. Changes in the activities of soluble isoinzymes. New Phytol., 88,2,279-288.

70. Grout B.W., Millam S. (1985) Photosynthetic Development of Micropropagated

71. Strawberry Plantlets Following Transplanting. Annals Bot., 55,1,129.

72. Guo J-Q., Yang Y-Z., Chen W-T. (1994) Protective effect of exogenous cholesterol onrice seedling during chilling injury. Acta Bot.Sinica., 36 (Suppl), 203-206.

73. Guy C. Huber J.L.A., Huber S.C. (1992) Sucrosephosphate synthase and sucroseacclimation at low temperature. Plant Physiol., 100, 1, 502-508.

74. Guy C. L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of proteinmetabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 41, 187-223.

75. Hakam N., Simon J.P. (1996) Effect of low temperatures on the activity of oxygenscavenging enzymes in two populations of the C-4 grass Echinochloa crusgalli (L.).

76. Physiologia Plantarum, 91,2,209-216.

77. Hamilton E.W., Heckathorn S.A. (2001) Mitochondrial Adaptations to NaCl. Complex I Is Protected by Anti-Oxidants and Small Heat Shock Proteins, Whereas Complex II Is Protected by Proline and Betaine. Plant Physiol., 126, 1266.

78. Hodges D.M., Andrews C.J., Johnson D.A., Hamilton R.I. (1997) Antioxidant enzyme responses to chilling stress in differentially sensitive inbred maize lines. Journal of Experimental Botany, 48, 310, 1105-1113.

79. Hodgson R.A.J., Raison J.K. (1991) Lipid peroxidation and superoxide dismutase activity in relation to photoinhibition induced by chilling in moderate light. Planta., 185, 2,215-219.

80. Hong J. H., Gross К. C. (2000) Involvement of ethylene in development of chilling injury in fresh-cut tomato slices during cold-storage. J. Amer. Soc. Hortic. Sci., 125, 6, 736-741.

81. Jaynes Т.A., Nelson O.E. (1971) An invertase inactivator in maize endosperm and factors effecting inactivation. Plant Physiology, 47,629-634.

82. Johnson I.R., Thornley J. H.M. (1985) Temperature dependence of plant and crop processes. Ann. Botany., 55, 1, 1-24.

83. Jones R.A., Kaufman P.B. (1975) Multiples forms of invertase in developing oat internodes. Plant, physiol., 55, 114-119.

84. Jones T. L., Turcker D. E., Ort D. R. (1998) Chilling delays circadian pattern of sucrose phosphate synthase and nitrate reductase activity in tomato. Plant Physiol., 118, 1, 149158.

85. Jouve L., Engelmann F., Noirot M., Charrier A. (1993) Evaluation of biochemical markers (sugar, prolin, malonedialdehyde and ethylene) for cold sensitivity in microcuttings of two coffee species. Plant Sci., 91,1, 109-116.

86. Kallarakal J., Komor E. (1989) Transport of Hexoses by the Phloem of Ricinus communis L. Seedling. Planta., 177, 336-341.

87. Klimov S.V., Astakhova N.V., Trunova T.I. (1999) Changes in photosynthesis, dark respiration rates and photosynthesis carbon partitioning in winter rye and wheat seedlings during cold hardening. J. Plant Physiol., 155, 6, 734-739.

88. Klimov S.V., Trunova T.I. (1999) An increased ratio of photosynthesis to respiration at low temperatures is a prerequisite for cold hardening of winter cereals. In: Morozoodpornose. Ed. By T. Holubowicz. Poznan, pp. 61-67.

89. Koike S., Satake T. (1987) Sterility caused by cooling treatment at the flowering stage inrice plants. II. The abnormal digestion of starch in pollen grain and metabolic changes inanthers following cooling treatment. Jap. J. Crop Sci., 56, 4, 666-672.

90. Konstantinova Т., Parvanova D., Atanasson A., Djilianov D. (2002) Freezing toleranttobacco, transformed to accumulate osmoprotectants. Plant Sci., 163,157.

91. Koster K.L., Lynch D.V. (1992) Solute accumulation and compartmentation during thecold acclimation of Puma rye. Plant Physiol., 98, 1, 108-113.

92. Kotyk A., Janacek K., Koruta J. (1988) Biophysical chemistry of membrane functions. Chichester etc.: J. Wiley and Sons, pp. 377.

93. Kratsch H. A., Wise R. R. (2000) The ultrastructure of chilling stress. Plant Cell Environm., 23, 4, 337-350.

94. Maciejewska U., Kacperska A. (1987) Changes in the level of oxidized and reduced pyridine nucleotides during cold acclimation of winter rape plants. Physiol. Plant., 69, 4, 687-691.

95. Markowski A., Augustyniak G., Janowiak F. (1990) Sensitivity of different species of field crops to chilling temperature. III. ATP content and electrolyte leakage from seedlings leaves. Actaphysiol. plantarum., 12, 2, 167-173.

96. Massacci A., Jannelli M.A., Pietrini F., Loreto F. (1995) The effect of growth at low temperature on photosynthetic characteristics and mechanism of photoprotection of maize leaves. J.Exptl. Botany., 46, 282, 119-127.

97. Masuda H., Ozeki Y., Amino S., Komamine A. (1984) Changes in Cell Wall Polysaccharides during Elongation in a 2,4-D Free Medium in a Carrot Suspension Culture. Physiol. Plantarum., 62, 65-72.

98. Matsuo Т., Graham D., Patterson B. D., Hockley D. B. (1994) An electrophoretic method to detect cold-induced dissociation of proteins in crude extracts of higher plants. Anal. Biochemistry, 223, 2, 181-184.

99. Matsushita K., Uritani I. (1976) Isolation and characterization of acid invertase inhibitor from sweet potato. Journal of Biochemistry, 79, 633-639.

100. Matsushita К, Uritani S. (1977) Synthesis and apparent turnover of acid invertase in relation to invertase inhibitor in wounder sweet potato root tissue. Plant Physiol., 59, 5, 879-883.

101. Maynard J.W, Lucas W.J. (1982) Sucrose and Glucose Uptake into Beta Vulgaris Leaf

102. Tissues. A Case for General Retrieval Systems. Plant Physiol., 70, 1436-1443.

103. Mazliak P. (1977) Glyco- and phospholipids of biomembranes in higher plants. In: Lipidsand lipid polymers in higher plants. Berlin etc.: Springer Verlag, pp. 48-77.

104. Mercado J. A, Reid M. S, Valpuesta V, Quesada M. A. (1997) Metabolic changes andsusceptibility to chilling stress in Capsicum annuum plants grown at suboptimaltemperature. Austral. J. Plant Physiol., 107, 2, 166-173.

105. Miller W. B, Ranwala A.P. (1994) Characterization and localization of three soluble invertase forms from Lilium longiflorum flower buds. Physiologia Plantarum., 92, 247253.

106. Ming Gong, Arnold H. van der Luit, Marc R. Knight, and Anthony J. (1998) Trewavas. Heat-Shock-Induced Changes in Intracellular Ca Level in Tobacco Seedlings in Relation to Thermotolerance. Plant Physiol., 116,429-437.

107. Minorsky P.V. (1985) An heuristic hypothesis of chilling injuri in plants: a role for calcium as the primary physiological transducer of injuri. Plant Cell Environm., 8, 2, 7594.

108. Morris L.L. (1982) Chilling injury of horticultural crops: An overview. Hort Sci., 17, 2, 161-162.

109. Munro S, Perham H.R.B. (1985) Nature, 317, 377.

110. Murashige T, Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-497.

111. Murelli C, Rizza F., Albini F.M., Dulio A, Terzi V„ Cattivelli L. (1995) Metabolic changes associated with cold-acclimation in contrasting cultivars of barley. Physiol. Plantarum, 94, 1, 87-93.

112. Nelson C.J., Smith D. (1986) Fructans: their nature and occurrence. Current Top. Plant Biochem. Physiol., 5, 1.

113. Olien C.R. (1984) An adaptive response of rye to freezing. Crop Sci., 24,1, 51-54. Olien C.R., Lester C.E. (1985) Freezing-induced changes in soluble carbohydrates of rye. Ibid., 25, 2, 288-290.

114. Palta J.P., Whitaker B.D., Weiss L.S, (1993) Plasma membrane lipids associated with genetic variability in freezing tolerance and cold acclimation of Solanum species. Plant Physiol., 103,3, 793-803.

115. Pardka S., Jmram H. (1987) Correlated changes in carbohydrate levels and associated enzyme activities during development and senescence of ray florits in Chrysanthemum. Proc. Indian. Acad. Sci. (Plant Sci), 97, 377-384.

116. Parr D.R., Edelman J., Hawker J.S. (1976) Growth and sucrose metabolism of carrot callus strains with normal and low acid invertase activity. Physiol. Plantarum, 37, 223228.

117. Peschke J., Riegler J., Mohwald H. (1987) Quantitative analysis of membrane distortions induced by mismatch of protein and lipid hydrophobic thickness. Eur.Biophys. J., 14, 7, 385-391.

118. Pilon-Smits E.A.H., Ebskamp M.J.M., Paul M.J., Jeuken M.J.W., Weisbeek P.J., Smeekens S.C.M. (1995) Improved Performance of Transgenic Fructan-Accumulating Tobacco under Drought Stress. Plant Physiol., 107, 125.

119. Platt-Aloia К. (1988) Physiological regulation of membrane fluidity. Alan. R. Lice, Ink., 259-271.

120. Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. (1987) Calcium messenger system in plants. Crit. Rev. Plant. Sci., 6, 1,47-103.

121. Pressey R. (1966) Separation and properties of potato invertase and invertase inhibitor.

122. Archives of Biochemistry and Biophysics, 113, 667-674.

123. Pressey R., Shew R. (1966) Effect of temperature on invertase, invertase inhibitor and sugar in potato tuber. Plant Physiology, 41, 10, 1657-1661.

124. Pryor W.A., Start W., Rock C.L. (2000) Beta carotene: from biochemistry to clinical trials. Nutr. Rev., 58, 1, 39.

125. Purvis A.C., Rice J.D. (1983) Low temperature induction of invertase activity in Grapefruit flavedo tissue. Phytochemistry, 22,4, 831-834.

126. Quinn P.J. (1989) Effect of sugar on the phase behaviour of phospholipid model membranes. Biochem. Soc. Transactions., 17, 6, 957-960.

127. Rausch Т., Greiner S. (2004) Plant Protein Inhibitors of Invertases. Biochimica et Biophysica Acta, 1696 , 253-261.

128. Ricardo C. (1974) Alkaline /?-fructosidases of tuberous roots; possible physiological function. Planta, 118, 333-343.

129. Ricardo C.P.P., Rees T. (1970) Invertase activity during the development of carrot roots. Phytochemistry, 9, 239-247.

130. Richter C. Gogvadze V., Laffran chi R., Schlapbach R., Schweizer M., Suter M., Walter P., Yaffee M. (1995) Oxidants in mitochondria:from physiology to disease. BBA, 1271, 67-74.

131. Ristic Z., Salzman R., Ashworth E.N., Bordelon B. (1993) Changes in lipid metabolism in the leaf tissue of Arabidopsis thaliana during rapid cold acclimation. Plant Physiol. (Suppl.), 102, 1,92.

132. Roberts D.W.A. (1975) The invertase complement of cold-hardly and cold sensitive wheat leaves. Can. J. Bot., 53, 1333-1337.

133. Roberts D.W.A. (1982) Changes in the of invertase daring the development of uheat leaves graving inder cold-hardening and nonhardening conditions. Canad, J. Bot., 60, 1, 1-6.

134. Roberts D.W.A. (1976) A method for separeting the verios forms of invertase in extractsof single leaves of plante of wheat. Canad. J. Bot., 54, 13,1509-1511.

135. Roitsch Т., Biyner M., and Godt D.E. (1995) Induction of apoplastic invertase of

136. Chenopodiwn rubrum by D-glucose and a glucose analog and tissue-specific expressionsuggest a role in sink-source regulation. Plant Physiology, 108,285-294.

137. Roitsch T. and Gonzalez M-C. (2004) Function and regulation of plant invertases: sweetsensation. Trends Plant Sci., 9, 12, 606-613.

138. Roitsch Т., Balibrea M.E., Hofmann M„ Proels R., Sinha A.K. (2003) Extracellular invertase: key metabolic inzime and PR protein. Journal of Experimental Botany, 54, 513-524.

139. Rorem E., Schwimmer S. (1963) Double pH optima of potato invertase. Experientia, 19, 150-151.

140. Rosha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W., Stratmann M., Schell J., Willmeitzer L. (1989) Both Developmental and Metabolic Signals Activate the Promoter of a Class I Patatin Gene. EMBO J., 8, 23-29.

141. Rybka Z. (1995) Estimation of energy expenditure in wheat crowns during acclimation tofrost using metabolic inhibitors. Acta Physiol. Plantarum, 17, 1, 31-36.

142. Sacher J.A., Hatch M.D., Glasziou K.T. (1963) Regulation of invertase synthesis in sugarcane by auxin and sugar-mediated control system. Physiol. Plant., 16, 836-842.

143. Sairam R.K., Spirastava G.C. (2000) Induction of oxidative stress and antioxidantactivity by hydrogen peroxide treatment and susceptible wheat genotypes. Biol1. Plantarum, 43, 381-386.

144. Salanoubat M., Dtlliard G. (1989) The steady-state level of potato sucrose synthase mRNA is dependent on wounding, anaerobiosis and sucrose concentration. Ibid., 84, 181-185.

145. Sampietro A., Vattuone M., Prado F. (1980) A regulatory invertase from sugar cane leaf-sheaths. Phytochemistry, 19, 1637-1642.

146. Sasaki Т., Todokoro K., Suzuki S. Multiple forms of invertase of potato tuber storage at low temperature. Phytochemistry, 10, 2047-2050.

147. Sauter J.J. (1988) Seasonal changes in the efflux of sugar from parenchyma cells into the apoplast in popular stem. Trees., 2, 4, 242-249.

148. Savitch L.V., Harhey Т., Huner N.P.A. (2000) Sucrose metabolism in spring and winter wheat in response to high irradiance, cold stress and cold acclimation. Physiol. Plantarum, 108, 3,270-278.

149. Schmulling Т., Schell J., Spena A. (1988) Single enes from Agrobacterium rhizogenes Influence Plant Development. EMBOJ., 7,2621-2629.

150. Schneider J. C., Nielsen E., Somerville C. (1995) A chilling-sensitive mutant of Arabidopsis is deficient in chloroplast protein accumulation at low temperature. Plant Cell Environm., 18, 1, 23-31.

151. Schwimmer S., Makower R., Rorem E. (1961) Invertase and invertase inhibitor in potato. Plant Physiology, 36, 313-316.

152. Serrano M., Pretel M. Т., Martinez-Madrid M. C., Romojaro F„ Riquelme F. (1998) C02 treatment of Zucchini squash reduces chilling-induced physiological changes. J. Agr. Food Chem., 46, 7, 2465-2468.

153. Shearman L.L., Olien C.R., Marchetti B.L., Everson E.H. (1973) Characterization offreezing inhibitors from winter wheat cultivars. Crop. Sci., 13, 514-519.

154. Simon E.W. (1974) Phospholipids and plant membrane permeability. New Phytol, 73, 3,377.420.

155. Singh J., Laroche A. (1988) Freezing tolerance in plants: a biochemical overview. Biochem. And Cell Biol., 66, 6, 650-657.

156. Sonnewald U., Brauer M., von Schaeven A., Stitt M., Willmitzer L. (1991) Transgenic Tobacco Plants Expressing Yeast-derived Invertase in Either the Cytosol, Vacuole or

157. Apoplast: a Powerful Tool for Studying Sucrose Metabolism and Sink/Sourse Interactions. Plant J., 1, 96-106.

158. Sonnewald U., Hajlrezaei M.-R., Kossmann J. Heyer A., Thethewey R.N., Willmitzer L. (1997) Increased Potato Tuber Size Resulting from Apoplastic Expression of a Yeast Invertase. Nature Biotechnol., 16, 794-797.

159. Stanzer M., Sjolund R.D., Komor E. (1988) Transport of Glucose, Fructose and Sucrose by Steptanthus tortuosus Suspension Cells. 1. Uptake at Low Sugar Concentration. Planta, 53, 6, 270.

160. Steponkus P.L. (1984) Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant. Physiol., 35, 543-584.

161. Sturm A., Chrispeels M. (1990) cDNA cloning of carrot extracellular /?-fructosidase and its expression in response to wounding and bacterial infection. The Plant Cell, 2, 11071119.

162. Suzuki Т., Kaneko M., Harada T. (1997) Increase in freezing resistance of excised shoot tips of Asparagus officinalis L by preculture on sugar-rich media. Cryobiology, 34, 3, 264-275

163. Tymowska-Lalanne Z, Kreis M. (1998) The plant Invertases: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Adv. Bot. Res., 28, 71-117.

164. Uemura M, Steponkus P.L. (1998) Alterations in the incidence of freeze-induced lesions of arabidopsis protoplast by artificial manipulation of intracellular sugar content. Plant Cell. Physiol., 39 (Suppl.), 140.

165. Uemura M, Steponkus P.L. (1989) Effect of cold acclimation on the incidence of two forms of freezing injury in protoplasts isolated from rye leaves. Plant Physiol., 91, 3, 1131-1137.

166. Uemura M, Steponkus P.L. (1997) Effect of cold acclimation on the lipid composition of the inner and outer membran of the chloroplast envelope isolated from rye leaves. Plant Physiol, 114, 1493-1499.

167. Vereshchagin A.G, Trunova T.I, Shayakhmetova I.S, Tsydendambaev V.D. (1990) On the role of cell membrane lipids in cold hardening of winter wheat leaves and crowns. Plant Physiol. Biochem., 28, 5, 623-630.

168. Weil M. and Rausch T. (1990) Cell wall invertase in tobacco crown gall cells. Plant Physiolog, 94, 1575-1581.

169. Weiss L.S., Whitaker B.D., Palta J.P. (1993) Temporal changes in plasma membrane lipids during cold acclimation of potato species differing in acclimation capacity. Plant Physiol. (Suppl.), 102, 1, 84.

170. Wu L.L., Song I., Kim D., Kaufman P.B. (1993) Molekular basis of the increase in invertase activity elicited by gravistimulation of oat-shoot pulvini. Plant. Physiol., 142, 179-183.