Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов

Лёзина, Лариса Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов"

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЛЁЗИНА ЛАРИСА ЕВГЕНЬЕВНА

РОЛЬ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ В РЕГУЛЯЦИИ РЕПЛИКАЦИИ И ТРАНСКРИПЦИИ У МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07—микробиология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета и в отделе молекулярной генетики Института анатомии и биологии Уистара (Wistar Institute, г. Филадельфия, США)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор О.Н. Ильинская доктор биологических наук, профессор П.М. Либерман

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор З.И. Абрамова доктор медицинских наук, профессор А.Р. Мавзююв

Ведущее учреждение: Институт молекулярной

биологии РАН, г. Москва

Защита состоится " 16 " декабря 2004 г. в 13°° часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

А.Н. Аскарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Любой живой организм, на каком бы уровне организации он не находился, представляет собой открытую систему. Он постоянно находится под воздействием внешних факторов, и потому должен обладать способностью быстро и адекватно реагировать на изменения, происходящие во внешней среде. Жизненный цикл любого организма включает в себя пролиферацию, сопровождающуюся циклическими изменениями, происходящими во всем организме, и, если речь идет о многоклеточных организмах, дифференциацию, сопровождающуюся изменениями, происходящими на определенной фазе развития организма. Все эти процессы требуют от организма присутствия четких регуляторных механизмов, способных модулировать его функции и поддерживающих его в стабильном состоянии. Из числа таких регуляторных механизмов особое значение принадлежит посттрансляционным модификациям.

Посттрансляционные модификации играют большую роль в регуляции тонких процессов жизнедеятельности. Способность быстро модифицировать функциональный белок, добавляя или снимая с его поверхности физиологически активные группы с помощью специфических ферментов, тем самым меняя заряд на его поверхности, конформацию и другие физико-химические свойства, позволяет использовать эти модификации в качестве «переключателя» во многих клеточных процессах. К таким посттрансляционным модификациям относятся фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование и другие.

Фосфорилирование представляет собой наиболее общий и важный механизм быстрой и обратимой регуляции белковых функций. Исследования животных клеток выявили, что примерно одна треть всех клеточных белков ковалентно модифицирована фосфорилированием. Фосфорилирование белков и последующее их дефосфорилирование действуют совместно в сигнальных путях и вызывают быстрые изменения в ответ на воздействия гормонов, факторов роста и нейротрансмиттеров. Большинство факторов роста [Heldin, 1995] и цитокининов [Ihle et al., 1994] стимулируют фосфорилирование во время связывания со своими рецепторами. Индуцированное фосфорилирование в свою очередь активирует цитоплазматические протеинкиназы [Marshall, 1995]. Дополнительно, клеточный цикл у всех эукариот в обеих G1/S и G2/M переходных фазах регулируется циклин-зависимыми протеинкиназами [Doree and Galas, 1994].

Фосфорилированием также контролируется дифференциация и развитие клеток, а в определенных случаях и метаболизм.

По сравнению с ацетилированим и фосфорилированием, гликозилирование является более узко направленной модификацией, необходимой для поддержания структурной целостности белков. Поли-АДФ-рибозилирование является одним из определяющих процессов, регулирующих жизнь клетки. Он представляет собой посттрансляционную модификацию ядерных белков, как немедленный ответ клетки на разрушение ДНК, вызванное ионизирующей радиацией, окислением и мутагенами [Ате et al., 2000]. Кроме того, поли-АДФ-рибозилирование играет существенную роль в регуляции процессов экспрессии генов и некоторых аспектов репликации ДНК [D'Amours et al., 1999; Dantzer et al., 1999; Kraus and Lis, 2003].

Одновременно вопросы, касающиеся таких фундаментальных процессов регуляции живых организмов, как наследование генетической информации и механизмы ее проявления, находятся на переднем крае современной биологии. Благодаря таким важнейшим процессам, как репликация и транскрипция ДНК, реализуется программа развития всех представителей мира живого, от индивидуальных организмов до целых популяций.

Вышеизложенное определяет актуальность исследования роли различных посттрансляционных модификаций в регуляции жизненно важных функций, таких как репликация и транскрипция, у микроорганизмов, находящихся на различных уровнях эволюционной организации.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение функций белков, принимающих участие в инициации транскрипции дрожжей и репликации вируса Эпстайна-Барр, а также механизмов регуляции этих белков на уровне посттрансляционных модификаций.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

1. Выделить и охарактеризовать белки, входящие в состав комплекса, связанного с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр.

2. Определить потенциальный вклад активности отдельных белков в регуляцию инициации репликации и поддержания стабильности генома вируса Эпстайна-Барр.

3. Установить функциональную активность основного транскрипционного фактора дрожжей TFIIA в зависимости от выбранного промотора in vivo.

4. Выявить роль посттрансляционных модификаций транскрипционного фактора TFIIA в формировании преинициационного комплекса на различных типах промоторов.

5. Подтвердить значение различных типов посттрансляционных модификаций белков - поли-АДФ-рибозилирования и фосфорилирования - в регуляции жизненноважных функций микроорганизмов.

Научная новизна. Используя новую методику биохимической изоляции ДНК-связывающих белков, впервые выделена и идентифицирована группа клеточных белков, специфически взаимодействующих с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр in vitro и in vivo. Этими белками оказались теломерные белки, участвующие в регуляции длины теломер. Показано влияние выделенных белков на функции репликации и поддержания стабильности вирусного генома. Отмечено, что эти функции регулируются механизмами двух типов: пассивным, за счет белок-белковых взаимодействий, и энзиматически активным за счет посттрансляционных модификаций. Установлено, что поли-АДФ-рибозилирОвание регулирует стабильность вирусного генома, модифицируя белки комплекса, связанного с опР.

Впервые показана in vivo необходимость образования стабильного комплекса между транскрипционными факторами TFIIA и ТВР (ТАТА Binding Protein) и промоторной ДНК для нормального роста и жизнеспособности дрожжей Sacchromyces cerevisiae. Показано, что стабильное взаимодействие между TFIIA и ТВР является лимитирующим фактором для экспрессии некоторых, но не всех, генов класса II (регулируемых РНК-полимеразой II). Особенно важны такие взаимодействия для экспрессии генов, содержащих индуцибельные промоторы, а также для генов, специфически регулируемых на определенных фазах клеточного цикла. Все это позволило подтвердить функцию TFIIA, как транскрипционного фактора, зависимого от структуры корового промотора, и необходимого для инициации транскрипции определенной группы генов in vivo. Впервые получены данные о фосфорилировании TFIIA in vivo в дрожжах. Показано, что фосфорилирование TFIIA стимулирует его комплексообразование с ТВР и промоторной ДНК, что является необходимым условием для поддержания максимального уровня транскрипции с некоторых промоторов in vivo.

Вышеуказанные научные факты и наблюдения позволили выявить общие закономерности функционирования живых систем разного уровня

организации, а также механизмов регуляции их наиболее важных процессов жизнедеятельности. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения, отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации:

1. Клеточные белки, связывающиеся с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр, принимают участие в регуляции функций репликации и поддержания стабильности вирусного генома, в том числе использовуя посттрансляционный механизм поли-АДФ-рибозилирования белков для снижения активности исследуемых функций.

2. Основной транскрипционный фактор TFIIA регулирует формирование преинициационного транскрипционного комплекса in vivo на промоторах определенной группы генов в дрожжах Sacchromyces cerevisiae, выполняя в определенных случаях зависимую от его фосфорилирования функцию ко-активатора.

3. Посттрансляционные модификации белков, таких как поли-АДФ-рибозилирование и фосфорилирование, представляют универсальный механизм регуляции жизненно важных функций микроорганизмов, обладающих различными уровнями организации.

Практическая значимость работы. Вирусом Эпстайна-Барр инфицировано более 90% человечества. Хотя он в большинстве случаев устанавливает "молчащую" латентную инфекцию, он также ассоциирован с некоторыми раковыми заболеваниями. Результаты работ по изучению регуляции процессов жизнедеятельности вируса Эпстайна-Барр способствуют выявлению механизма участия вируса в этих заболеваниях. Определение путей регуляции, в частности репликации вирусной ДНК и поддержания стабильности его генома, и нахождение способов модуляции этих процессов дает возможность использовать эти знания в медицинских целях, в разработке фармакологических препаратов. К тому же есть основание предполагать, что некоторые другие вирусы могут обладать схожим механизмом регуляции репликации.

Дрожжи, в частности пекарские дрожжи Sacchromyces cerevisiae, широко применяются в производстве, поэтому базовые исследования транскрипции их белков могут быть использованы в дальнейшем в разработке новых технологий, при получении новых штаммов продуцентов, а также в усовершенствовании производственных процессов.

Связь работы с базовыми научными программами. В течение 1994 -2004 гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследование в рамках тематики работы были поддержанными грантами NIH (GM 12345-01 и GM 54687-02, США) и грантами Leukemia Society of America (США) и American Cancer Society (США).

Апробация работы, Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых конференциях кафедры микробиологии КГУ (2003), на IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2004), на отчетных научно-практических конференциях молодых ученых института анатомии и биологии Уиетера (Филадельфия, США, 1998,1999,2000,2001). -

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 5 печатных работах. Из них 3 научные работы опубликованы в центральной зарубежной и 1 - в российской печати, 1 — в сборнике тезисов докладов российской конференции.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, 24 рисунка, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Список литературы содержит 200 источников, из которых 195 зарубежных.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам института Уистера (США), в процессе совместной работы с которыми возникла идея этого исследования, Д. Озеру, СП. Солоу, 3. Дэнд, Ч.-Д. Чен, С. Штивелбанд, а также сотрудникам кафедры микробиологии Казанского государственного университета за теплую рабочую атмосферу. Автор выражает благодарность профессору Н.А Барлеву за критические замечания по структуре и содержанию диссертационного материала. Автор особо благодарит своих научных руководителей профессора О.И. Ильинскую и профессора П.М. Либермана.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клеточные белки, взаимодействующие с сайтом инициации репликации вируса Эпстайна-Барр (ВЭБ) в присутствии регуляторного вирусного белка EBNA1, выделяли из SL1 клеток, созданных на основе клеточной линии HeLa (HeLaS3) и стабильно продуцирующих EBNA1. Для этого ядерный

экстракт из клеточных культур HeLa и SL1 готовили по стандартной методике [Digman et al., 1983] с некоторыми модификациями и использовали в ДНК-аффинной хроматографии.

Ядерный экстракт инкубировали с биотинилированной ДНК (DS или контрольная ДНК схожего размера ZRE), пришитой к стрептовидиновому магнитному носителю по методике, описанной производителем (Dynal, Norway). ДНК фрагменты получали методом амплификации ПНР с использованием смеси биотинилированного праймера на 5-конце и немодифицированного праймера на 3-конце. Все праймеры были синтезированы в лабораториях IDT (Integrated DNA Technology, США). Аффинные носители затем отмывали от белков неспецифического связывания, и связавшиеся белки элюировали буферами различной ионной силы (150, 300 и 1000 мМ КС1). Элюированные белки разделяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле и полученные белковые спектры анализировали с помощью окраски геля серебром согласно методике, рекомендованной производителем (Invitrogen, США). Белки, специфично взаимодействующие с DS элементом, но не с контрольной ДНК, вырезали из геля, элюировали и определяли их аминокислотный состав методом масс-спектрометрии в специализированных аналитических лабораториях Института Уистара (г. Филадельфия, США) и Гарвардского университета (США).

Иммуноблоттинг белков проводили по стандартной методике [Ausubel et al., 1997] с использованием антител согласно спецификации производителя.

Взаимодействие ядерных белков с oriP ВЭБ in vivo определяли в естественно инфицированных клетках Raji методом иммунопреципитации хроматина [Parekh and Maniatis, 1999] с некоторыми модификациями [Barlev et al., 2001]. Клеточные белки ковалентно сшивались с ДНК путем инкубации клеток Raji с 1% формальдегидом. Ядерную ДНК расщепляли на куски обработкой ультразвуком, и полученный экстракт использовали в реакциях иммунопреципитации со специфичными антителами. Ко-иммунопреципитированную ДНК выделяли и амплифицировали методом ПЦР с праймерами, специфичными для oriP и для контрольного участка ДНК BRLF1.

Кооперативное связывание TRF2 и EBNA1 с DS элементом определяли по стандартной методике гель-ретардации (изменения электрофоретической подвижности комплекса) и методом "отпечатков", полученных в результате гидролиза ДНК ферментом ДНКаза I [Ausubel et al., 1997]. Рекомбинантные

EBNA1 и TRF2 белки выделяли из клеток насекомых Sf9, зараженных бакуловирусом, экспрессирующим указанные белки.

Уровень репликации плазмид определяли методом, основанным на устойчивости реплицированных плазмид к рестрикционному ферменту Dnpl, чувствительному к метилированию. Репликацию трансфецированной ДНК анализировали в клетках НЕК 293, как описано ранее [Yates et al., 2000].

В экспериментах по определению количества клеток, содержащих oriP-или оп7'Да,Ь,с-плазмиду, и числа плазмидных копий на клетку («плазмидная стабильность») использовали клеточные линии D98/HR1 или Akata. Клетки, содержащие вышеуказанные плазмиды, отбирали с помощью проточной флуоресцентной цитометрии, и затем дополнительно выращивали в течение 21 дня [Yates et al.,2000] в условиях воздействия фармакологических препаратов. Для определения общего количества плазмидной ДНК, содержащей oriP, ее выделяли из одинакового количества клеток методом Херта [Ausubel et al., 1997], а затем анализировали с помощью Саузерн-блоттинга. Для определения количества копий на клетку oriP-содержащих плазмид, после 21 дня инкубации клетки повторно сортировали с помощью проточной флуоресцентной цитометрии с последующим выделением плазмидной ДНК и ее анализом методом Саузерн-блоттинга.

Уровень поли-АДФ-рибозилирования DS-ассоциированных белков после выделения из HeLa и SL1 клеток определяли по их способности включать радиоактивно меченный 32Р-НАД или немеченый НАД с последующим соответствующим анализом методом авторадиографии или иммуноблоттинга.

Для изучния роли TFIIA in vivo использовали-дрожжи Sacchromyces cerevisiae. Нормальный или мутантные рекомбинантные Тоа2 субъединицы выделяли на №2+-нитрилотриацетатно-кислой агарозной колонке (Qiagen, США), реассоциировали с нормальной Toal субъединицей TFIIA и, использовали для определения образование ДНК-белкового комплекса TFIIA-TBP-TATA блок (Т-А) методом гель-ретардации.

Для того, чтобы выявить эффект этих и других близких мутаций в кодирующем Тоа2 белок гене ТОА2, в дрожжи вводились мутантные toa2 аллели с помощью техники плазмидной замены [Rose et al., 1990]. Штаммы дрожжей выращивали в различных условиях, варьируя температуру и источник углеводов в питательной среде. Параметры роста определяли стандартными микробиологическими методами.

Влияние Тоа2 мутаций на клеточный цикл дрожжей изучали методами световой микроскопии и проточной флуоресцентной цитометрии для определения соотношения клеток с гаплоидным, диплоидным набором ДНК или флоккулянтов (устойчивое скопление клеток).

Экспрессию генов in vivo соотносили с уровнем соответствующих мРНК, который, в свою очередь, определяли методом устойчивости к S1 нуклеазе по ранее описанной методике [Ozer et al., 1998]. Для этого из дрожжей выделяли общую РНК, гибридизировали ее с 32Р-меченным ДНК олигонуклеотидом, комплементарным исследуемой РНК, и подвергали воздействию S1 нуклеазы (Sigma), которая гидролизует только одноцепочечные остатки нуклеиновых кислот. Количества образовавшихся специфических РНК-ДНК меченых гибридов определяли, используя программу ImageQuant на приборе Phosphorlmager (Molecular Dynamics, США). Олигонуклеотиды синтезировали в Integrated DNA Technologies Corp. (США).

Фосфорилирование дрожжевых белков in vivo проводили по описанной ранее методике [Warner, 1991].

Эффект фосфорилирования Toal на формирование комплекса TFIIA-ТВР-ДНК (Т-А) изучался методом гель-ретардации по стандартной методике [Ausubel et al., 1997] с использованием выделенных нами дрожжевых мутантных или нормальных TFIIA и дрожжевого или человеческого ТВР.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Выделение и идентификация клеточных белков, взаимодействующих с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр

Вирус Эпстайна-Барр (ВЭБ), находясь в латентном состоянии, характеризуется тонкой регуляцией своей репликации, происходящей только один раз в один клеточный цикл, и поддержанием стабильного количества копий своего генома. Характерно, что в латентном состоянии постоянно синтезируется только один вирусный блок - EBNA1 - необходимый для поддержания обоих функций ВЭБ, репликации и стабильности. Белок EBNA1 взаимодействует с двумя участками ДНК ВЭБ, включающие в себя семейство повторов (FR) и участок лучевой симметрии (DS), состоящие из множественных сайтов связывания с EBNA1 и находящиеся на сайте инициации репликации oriP. Поскольку EBNA1 участвует в поддержании основных функций ВЭБ, но не обладает необходимыми для этого ферментативными активностями, легко предположить, что EBNA1 может привлекать к oriP клеточные белки для выполнения этих функций.

В результате ДНК-аффинной хроматографии нами были выделены клеточные белки, специфически взаимодействующие с Б8 элементом, но не с контрольной ДНК (/КБ) в клетках, содержащих ЕБКЛ.1 (клеточная линия 8Ь1) (рис 1А) Белки эти не взаимодействовали с Б8 элементами в отсутствии ЕБКЛ.1 (клеточная линия ИеЬа) (рис 1В) Нами были идентифицированы следующие наиболее обогащенные Б8-связывающиеся ЕБКЛ1-специфичные полипептиды р54 - ЕБКЛ.1 (54 КДа), р32 - Та1-ассоциированный белок, ранее опубликованный как взаимодействующий с ЕБКЛ.1 Примечательно, что остальные идентифицированные потипептиды обладают функциями, ассоциированными с поддержанием длины теломер р150 - танкираза, обладающая АДФ-рибозо-попимеразной активностью и модифицирующая взаимодействующие с теломерными повторами белки ТШ^ и ТЛР2, р60 - ТЫ^, р50 - ТМ^-взаимодействующий белок КЛР1, р116 поли(АДФ-рибозо)полимераза РЛКР1, которая ранее не была зафиксирована в ассоциации с теломерами, но обладает функцией близкой с взаимодействующей с ними танкиразой

Тождественность выделенных полипептидов была подтверждена иммунноблоттингом с использованием спецефичных антител

Рис.1. Идентификация Б8-связывающихся ЕБКЛ1 -специфичных клеточных белков Показана Б8-специфичность (А) и ЕБМЛ1-специфичность (В) Окраска белков серебром

Взаимодействия танкиразы и TRF2 с oriP были подтверждены in vivo методом иммунопреципитации хроматина, используя естественно инфицированную клеточную линию Raji лимфомы Бёркита

Три нонамерных сайта на DS элементе представляют собой последовательности, аналогичные теломерным повторам (TTAGGG). Как известно, теломерные факторы, включая TRF2, связываются с этими повторами на теломерах. Поэтому мы предположили, что, скорее всего, именно нонамеры играют важную роль во взаимодействии TRF2 с DS элементом. Были проанализированы рекомбинантные TRF2 и EBNA1 на предмет совместного связывания с DS элементом методом гель-ретардации. В результате, нами установлено, что связывание EBNA1 с DS элементом усиливается благодаря воздействию TRF2, при этом воздействие это зависит от нонамерных последовательностей, т.к. эффект этот не наблюдался в случае мутаций на нонамерных сайтах с заменой всех шести пар оснований (Да,Ь,с). Экспериментально, методом «отпечатков» с использованием ДНКазы I мы показали, что TRF2 действительно непосредственно и специфично связывается с нормальными, но не с мутированными нонамерами DS элемента только в присутствии EBNA1 (рис. 2). Таким образом, EBNA1 и TRF2 обладают кооперативным механизмом

Рис.2. Кооперативное связывание таБ2 и ЕБКЛ1 с Б8 элементом. Метод «отпечатков» с

использованием ДНКазы I. Ш - нормальный элемент Да,Ь,с - мутантный элемент а, Ь, с - нонамерные сайты 1,2, 3,4 - ЕБКЛ1-связывающие сайты

взаимодействия с DS элементом oriP.

2. Роль выделенных клеточных белков в регуляции репликации и поддержания стабильности вирусной эписомы

Известно, что DS элемент несет функции минимального автономного репликатора и собственно является сайтом инициации репликации на oriP ВЭБ. Для того чтобы проверить, вносит ли TRF2 какой-либо вклад в oriP-зависимую репликацию ДНК, мы проанализировали репликативную активность oriP в клетках, трансфецированных TRF2, либо доминантно-негативным укороченным мутантом ATRF2, или TRF1, белком, схожим с TRF2 в участке домена связывания с ДНК и взаимодействующим с теломерами, как и TRF2. Используя метод устойчивости к метил-зависимой рестриктазе Dpnl, мы определили, что TRF2, спецефически связываясь с нонамерами сайта начала репликации DS, может влиять на уровень вирусной репликации.

Ранее было показано, что нонамеры вносят определенный вклад в поддержание стабильного количества копий генома ВЭБ в Raji клетках лимфомы Бёркитта. Мы так же показали, проанализировав трансфецированные клетки саузерн-блоттингом на содержание ол'Р-плазмид, что нонамерные повторы DS элемента усиливают функции oriP в поддержании стабильности вирусного генома в клетках Akata.

Выделив DS-ассоциированные белки из обработанных различными препаратами D98/HR1 клеток и, проанализировав их иммуноблоттингом, используя антитела, специфичные к поли-АДФ-рибозе, мы обнаружили корреляцию между уровнем рибозилирования DS-ассоциированных белков и поддержанием стабильности вирусной эписомы. Так, ниацинамид и 3-аминобензамид, фармакологические ингибиторы ПАРП активности, понижая уровень рибозилирования DS-ассоциированных белков, усиливают вирусную стабильность по сравнению с контрольными необработанными образцами. Напротив, гидроксимочевина, которая является рибонуклеотид-редуктазным ингибитором, вызывает значительную потерю ол'Р-плазмид, вызывая при этом существенное усиление поли-АДФ-рибозилирования белков с высоким молекулярным весом.

Мы показали, что из числа DS-ассоциированных белков, два белка из SL1 клеток, содержащих EBNA1, но не из контрольных HeLa клеток, являются объектом НАД-зависимой посттрансляционой модификации (рис. ЗА). Эти белки обладают молекулярным весом 54 КДа и 150-200 КДа. Иммуноблоттинг с антителами к EBNA1 и танкиразе подтвердил их НАД-зависимую модификацию, каковой является лоли-АДФ-рибозилирование

(рис. ЗВ). Таким образом, мы установили, что белки ЕБКЛ1 и танкираза, участвующие (или, в случае танкиразы, потенциально участвующие) в регуляции функций опР, являются объектом посттрансляционых модификаций.

Рис.3. Модификация DS-связывающихся EBNA1-специфичных клеточных белков поли-АДФ-рибозилированием.

3. Роль TFIIA в регуляции инициации транскрипции in vivo в дрожжах Sacchatomyces cerevisiae

В качестве другого объекта наших исследований мы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae для изучения роли посттранскрипционной модификации фосфорилирования в регуляции in vivo функций основного транскрипционного фактора TFIIA. Согласно данным кристаллической структуры, аминокислотные остатки Y69 и W76 в Тоа2 субъединице TFIIA ответственны за контакт с ТВР (TATA-binding protein) белком, взаимодействие между которыми приводит к этих белков на ДНК. Мы подтвердили это предположение экспериментальным путём, проанализировав способность дрожжевых мутантов TFIIA образовывать комплекс с ТВР и ДНК (Т-А комплекс) методом гель-ретардации. Мутации вышеуказанных аминокислот путем замены их на другие аминокислотные остатки ослабляли Т-А комплексообразование в 65 раз по сравнению с диким типом, указывая на важную роль Y69 и W76 в поддержании стабильности ТА комплекса.

Мы также экспериментально показали, что функция TFIIA в поддержании Т-А комплексообразования влияет на рост и жизнеспособность дрожжей. Некоторые из вышеуказанных мутаций оказались летальными, другие вызывали общий дефект роста в нормальных условиях и летальность в экстремальных условиях культивирования, особенно при росте на галактозо- и глицерин-содержащих средах вместо глюкозы и в условиях теплового шока.

Мы определили, что стабильное взаимодействие между TFIIA и ТВР не является необходимым для всех генов in vivo, но важно для эффективной транскрипции генов, необходимых для прогрессии клеточного цикла. Эти результаты были получены нами путем сравнительного анализа уровня экспрессии мРНК определённых генов методом устойчивости к S1 нуклеазе в нормальном и мутантном toa2 штаммах дрожжей. К числу таких генов относятся CLB1, CLNJ, CTS1 и другие (рис. 4). Методами световой микроскопии и проточной флюоресцентной цитометрии мы подтвердили, что клеточный цикл у toa2 мутантов останавливается в G2/M фазе.

Рис.4. Понижение экспрессия генов, регулирующих клеточный цикл, в ТР11Л мутантах. Определение уровня мРНК методом устойчивости к 81 нуклеазе.

Нам удалось экспериментально показать, что стабильное TFIIA-TBP взаимодействие необходимо также и для максимальной индуцибельной экспрессии группы генов in vivo. У таких генов постоянная (конституционная) транскрипция (Тс) инициируется с одного сайта, а индуцибельная (TR) - с другого сайта(ов). Регуляция инициации транскрипции с каждого сайта происходит со своего промоторного элемента. К числу генов, обладающих такой организацией, относятся HIS3, GAL80, URA1 и URA3 гены. Проанализировав уровень транскрипции с Тс и TR сайтов

инициации методом устойчивости к 81 нуклеазе, мы установили, что toa2 дрожжевые мутанты дефектны по активации транскрипции с индуцибельных Т сайтов инициации при умеренном дефекте транскрипции с Т(_ сайтов (рис. 5).

UM1

tutu*

Рис.5. Дефект

транскрипции, у мутантов TFIIA Определение уровня * мРНК методом устойчивости к S1 нуклеазе.

Более того, исследовав воздействие различных активаторов на индуцибельную экспрессию разных генов в присутствии - нормального и мутантного TFIIA, мы выяснили, что различие в требованиях к устойчивости TFIIA-TBP взаимодействия при активации максимальной экспрессии индуцибельных генов in vivo может зависеть как от природы активатора, так и от структуры промотора.

4. Влияние фосфорилирования TFIIA на дрожжевую транскрипцию

В связи с важной ролью TFIIA-TBP взаимодействия в регуляции транскрипции генов, взаимодействия эти представляют собой хорошую модель для регуляции с помощью посттрансляционных модификаций. В связи с этим, мы экспериментально показали, что Toal субъединица TFIIA фосфорилируется in vivo в дрожжах. Более конкретно, акцепторами фосфатных групп являются сериновые аминокислотные остатки

в активатор-индуцированном переключении старта

в позициях 220, 225 и 232 С-концевого домена Toal, что следует из анализа toal дрожжевых мутантов.

Чтобы выяснить функцию фосфорилирования в регуляции TFIIA, очищенные фосфорилированный in vivo (wt), и нефосфорилированный мутантный (m) дрожжевые Toal белки были проанализированы методом гель-ретардации на способность формировать стабильный Т-А комплекс. Фосфорилирование TFIIA оказалось необходимым для его стабильного взаимодействия с дрожжевым уТВР и ДНК (рис. 6).

Рис.6. Стимуляция формирования TBP-TFIIA комплекса в результате фосфорилирования Toal

субъединицы. Формирование уТА и hTA комплексов указано стрелками. Метод гель-ретардации уТВР - дрожжевой ТВР hTBP - человеческий ТВР wtTFIIA - нормальный TFIIA mTFIIA - мутантный TFIIA

1 2 3 4 5 6

Сравнив уровень мРНК указанных на рисунке индуцибельных генов, содержащих в своих промоторах несколько стартовых сайтов, в дрожжевых штаммах, экспрессирующих wt Toal и нефосфорилируемый m Toal, мы определили, что фосфорилирование TFIIA необходимо для транскрипции не всех, а только определенных генов in vivo.

Мы также показали, что в целом, фосфорилирование TFIIA является необходимым фактором для роста и жизнеспособности дрожжей. Тройная замена сериновых аминокислотных остатков на нефосфорилируемые остатки аланина в последовательности Toal, объединенная с дополнительной мутацией на границе участка TFIIA-TBP взаимодействия, оказалась летальной для дрожжей.

Таким образом, посттрансляционная модификации TFIIA, в частности, его фосфорилирование, играют существенную роль в регуляции способности

TFIIA стимулировать образование стабильного Т-А комплекса, что особенно критично для транскрипции определенных индуцибельных генов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что посттрансляционные модификации широко используются и играют важную роль в регуляции многих жизненных процессов у эукариот. Чтобы выяснить, имеют ли эти модификации такое же первостепенное значение в более просто организованных живых системах, мы исследовали некоторые аспекты инициации репликации и транскрипции на предмет изучения роли посттрансляционных модификаций в регуляции этих процессов. В качестве моделей мы использовали вирус Эпстайна-Барр и дрожжи Sacch romyces cerevisiae.

' Вирус Эпстайна-Барр устанавливает латентную инфекцию в В-лимфоцитах человека. Геном ВЭБ существует в виде кольцевой внехромосомной эписомы. Область ДНК, ответственная за репликацию эписомы (priP) состоит из двух участков: FR элемента и DS элемента. DS элемент является сайтом инициации репликации вирусного генома [Gahn and Schildkraut, i 1989]. FR элемент необходим для поддержания стабильного количества копий вирусного генома в клетке-хозяине [Alyar et al., 1998; Sugden and Leight, 2001]. Репликация и поддержание стабильности генома ВЭБ зависят от вирусного белка EBNA1. EBNA1 является- единственным белком, кодируемым вирусом в его латентной форме. Поскольку EBNA1 не обладает активностями, необходимыми для инициации репликации ДНК и поддержания вирусной стабильности, то вполне очевидно, что вирусу необходимо использовать клеточные белки хозяина для репликации вирусной ДНК. EBNA1 находится в постоянно связанном состоянии с FR и DS элементами, что является необходимым условием для поддержания стабильной латентной инфекции.

Таким образом, активность EBNA1 должна каким-то образом регулироваться. Посттрансляционные модификации являются, пожалуй, самым быстрым и эффективным способом модулировать активности белков. Потому можно было ожидать, что EBNA1 также может подвергаться таким модификациям. Соответственно гипотетический белок-фермент, модифицирующий EBNA1, может либо непосредственно взаимодействовать с EBNA1, либо образовывать дополнительный контакт с ДНК рядом с EBNA1 -связывающим сайтом.

В своей работе мы использовали оригинальный, разработанный нами метод выделения клеточных белков, взаимодействие которых с DS элементом зависит от присутствия EBNA1. Таким образом, нами было выделено несколько белков, многие из них связаны с функцией регулирования длины теломер. Это белки TRF2, танкираза, Rapl, а также PARP1 - поли(АДФ-рибозо)полимераза, близкая по функциям с танкиразой. Такие результаты являются вполне объяснимыми, т.к. DS элемент вируса Эпстайна-Барр содержит в своем составе три нонамерных повтора, чьи последовательности аналогичны теломерным последовательностям, являющимися сайтами связывания TRF2 на теломерах. Известно, что Rap 1 и танкираза взаимодействуют с TRF2 на теломерах, при этом танкираза посттрансляционно модифицирует его, тем самым модулируя его функции. Мы же показали, что TRF2 и танкираза взаимодействуют с эписомальным oriP in vivo, подтвердив in vitro результаты.

Мы экспериментально показали, что один из выделенных белков, TRF2, связывается с DS элементом в кооперации с EBNA1. Наши данные также дают основание предполагать, что взаимодействующие с нонамерами белки модулируют репликационные функции ЭБ вируса в определенных типах клеток. На основе полученных результатов мы предполагаем, что TRF2 может способствовать образованию комплекса EBNA1 с другими белками, особенно в тех типах клеток, где концентрация белка EBNA1 понижена или ослаблена его способность к связыванию. Согласно другому сценарию, TRF2 может способствовать формированию репликационного комплекса на oriP и инициации синтеза ДНК на нонамерных сайтах. Известно, что TRF2 обладает способностью усиливать разъединение цепей на теломерной t-петле [Stansel et al., 2001], и подобная активность может содействовать репликационным функциям и на oriP.

Ранее было отмечено [Niller et al., 1995; Yates et al., 2000], и мы подтвердили это наблюдение, что нонамеры играют определенную роль в поддержании стабильности вирусного генома. Несколько пассивных механизмов было предложено для описания функции комплекса EBNA1-oriP в этом процессе. Весьма вероятно, что нонамер-связывающие белки также участвуют в этих механизмах. Известно, что индуцированное EBNA1 формирование петли ДНК между DS и FR элементами коррелирует с функциями репликации ДНК и поддержания стабильности вирусных эписом [Frappier and O'Donnell, 1991; Middleton and Sugden, 1992; Su et al., 1991]. Связывающиеся с нонамерами белки могут способствовать образованию и

стабилизировать вторичную структуру опР. С другой стороны, TRF2 и другие теломерные белки могут содействовать ассоциации EBNA1 с определенными хроматиновыми структурами, что в свою очередь может способствовать удерживанию вирусных эписом на митотических хромосомах во время их конденсации и, таким образом, передаче постоянного числа копии вирусного генома от материнской клетки к дочерним.

Нами также было продемонстрировано, что кроме механизма пассивной регуляции, энзиматически активный процесс участвует в поддержании функции стабильности генома вируса Эпстайна-Барр. Хотя точный механизм этой активной регуляции еще не изучен, наши данные указывают на то, что EBNA1 и танкираза могут быть объектами посттрансляционных модификаций. Имеющиеся в литературе данные указывают, что танкираза является позитивным регулятором длины теломер, поли-АДФ-рибозилируя теломерные белки TRF1 и TRF2 и модифицируя доступ теломеразы к теломерам [Smith et al.,. 1998]. Мы можем предложить два возможных механизма регуляции функций генома ВЭБ с помощью выше отмеченных модификаций. С одной стороны, поли-АДФ-рибозилирование может влиять на способность репликационных белков и/или белков стабильности взаимодействовать с опР. С другой стороны, эти модификации могут регулировать аспекты взаимодействия опР с хроматином, что также может быть критично для эписомной стабильности.

, Характерно, что некоторые другие вирусы обладают аналогичными нукдеотидными последовательностями связывания с выделенными нами белками. Поэтому можно предполагать, что предложенные нами механизмы регуляции вирусных функций с использованием посттрансляционных модификаций могут быть общими для целой группы вирусов.

Если даже вирусы, одни из наиболее просто организованных живых существ, используют такой тонкий процесс посттрансляционных модификаций для поддержания своих функций, тем более это характерно для сложно организованных микроорганизмов, к числу которых относятся дрожжи. Регуляция транскрипции у таких организмов играет наиважнейшую роль, а изучение механизмов регуляции особенно отдельных генов или групп генов, а не всего генома представляется весьма актуальным. Большую роль в этом случае играют активаторы и ко-факторы (ко-активаторы). Одним из таких регуляторных белков является основной транскрипционный фактор TFIIA, поскольку еще ранее он был отмечен как позитивный регулятор транскрипции in vitro. Можно было бы предположить, что

посттрансляционные модификации и здесь могут играть свою роль, модулируя функции TFIIA на разных промоторах.

Мы показали, что стабильное взаимодействие между TFIIA и ТВР важно для инициации транскрипции лишь с определенной группы промоторов in vivo. Мы предполагаем, что взаимодействие TFIIA с ТВР может регулировать активность этих промоторов, будучи посредником между активатором и ТВР и таким образом играя роль ко-фактора, или же за счет непосредственного усиления связывания ТВР со специфическими коровыми промоторами. На этих промоторах взаимодействие между TFIIA и ТВР скорее всего будет являться лимитирующим фактором.

Мы охарактеризовали необходимость взаимодействий между TFIIA и ТВР для роста и для поддержания высокого уровня экспрессии некоторых генов класса II в S. cerevisiae. Стабильность этих взаимодействий особенно важна для активатор-индуцибильной экспрессии промоторов с выраженным ТАТА элементом, и для группы генов, контролирующих прогрессию клеточного цикла. Эти результаты подтверждают биохимические исследования, согласно которым TFIIA является ко-активатором, функция которого зависит от структуры корового промотора.

Очевидно, что взаимодействие TFIIA с ТВР является эволюционно консервативным от дрожжей до человека и, вероятно, играет важную роль на многих уровнях генной регуляции. Следовательно, TFIIA может быть объектом посттрансляционных модификаций, что, вероятно играет существенную роль в специфической регуляции экспрессии отдельных генов или группы генов.

Действительно, мы обнаружили, что TFIIA фосфорилируется в дрожжах in vivo. Мы продемонстрировали, что фосфорилирование TFIIA усиливает TFIIA-TBP-ДНК комплексобразование in vitro и важно для поддержания максимальных уровней транскрипций in vivo. Максимальный уровень транскрипции особенно может зависеть от эффективности транскрипционной реинициации, которая, согласно другим исследованиям, коррелирует со стабильностью TBP-TFIIA комплекса [Zawel et al., 1995]. Фосфорилирование TFIIA in vivo коррелирует с жизнеспособностью дрожжей. Необходимо отметить, что значение фосфорилирования в поддержании жизнеспособности дрожжей проявляется только в совокупности с мутацией, влияющей на ассоциацию TFIIA с ТВР. Можно предположить, что сами по себе слабые контакты между белками в совокупности значительно усиливают взаимодействия между TFIIA, ТВР и ДНК. Фосфорилирование Toal может

вносить существенный вклад в образование прямого контакта между ним и ТВР или ДНК, или же индуцировать конформационные изменения, усиливающие стабильность ТБИА-ТВР-ДНК комплекса.

Известно, что активность некоторых других основных транскрипционных факторов также регулируется их фосфорилированием [Натреу, 1998]. Это относится к С-концевому домену большей субъединицы РНК-полимеразы II и к ТБНБ. В обоих случаях их фосфорилирование коррелирует с репрессией инициации транскрипции. Напротив, нами показано, что фосфорилирование ТБИА коррелирует с увеличением транскрипционной активности. Эти результаты отражают различные роли ТБ11А, ТБНБ и РНК-полимеразы II в процессе инициации транскрипции. ТБПБ и РНК-полимераза II являются классическими основными транскрипционными факторами, в то время как ТБИА на многих, в частности индуцибильных, промоторах играет позитивную роль транскрипционного модулятора.

Таким образом, на примере поли-АДФ-рибозилирования и фосфорилироания мы показали, что микроорганизмы имеют в своем активе различные посттрансляционные модификации, которые используются в регуляции таких жизненноважных процессов, как репликация и транскрипция. Тем самым этот факт указывает на универсальность роли пострансляционных модификаций в жизни всех организмов, от вирусов до человека.

ВЫВОДЫ

1. Выделенные нами белки клеток человека, взаимодействующие с Б8 элементом сайта инициации репликации опР вируса Эпстайна-Барр, являются факторами, регулирующими длину теломер. Их взаимодействие с опР строго зависит от ключевого вирусного белка БВМА1. Клеточный белок ЮТ2 непосредственно связывается с нонамерными сайтами Б8 элемента в присутствии БВМА1, кооперативно усиливая способность последнего к комплексообразованию с ДНК.

2. Показано, что клеточные белки, в том числе поли(АДФ-рибозо)полимеразы, являются частью системы регуляции репликации и поддержания стабильности генома вируса Эпстайна-Барр. Нами установлено наличие как пассивного, так и энзиматически активного механизма этой регуляции, к которому относится поли-АДФ-рмбозилирование белков репликационного комплекса.

3. Выявлено, что основной транскрипционный фактор TFIIA, в зависимости от структуры корового промотора, может функционировать как ко-активатор. При этом взаимодействие между TFIIA и ТВР является определяющим фактором в регуляции инициации транскрипции in vivo определенных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

4. Впервые показано, что TFIIA фосфорилируется in vivo в дрожжах. Эта модификация TFIIA важна как для формирования прединициационного транскрипционного комплекса, так и для поддержания максимального уровня транскрипции некоторых индуцибильных генов.

5. На примере микроорганизмов, находящихся на разных уровнях развития — вирусов и дрожжей — нами подтверждена универсальность посттрансляционных модификаций белков, в частности, поли-АДФ-рибозилирования и фосфорилирования, как механизма регуляции важнейших функций живых существ.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ozer J. Association of transcription factor НА with TATA binding protein is required for transcriptional activation of a subset of promoters and cell cycle progression in Saccharomyces cerevisiaeIJ.Ozer, L.E.Lezina, J.Ewing, S.Audi, P.M.Lieberman//Mol. Cell. Biol. - 1998. - 18. - P. 2559-2570.

2. Solow S.P. Phosphorylation of TFIIA stimulates TATA binding protein -TATA interaction and contributes to maximal transcription and viability in yeast / S.P.Solow, L.Lezina, P.M.Lieberman // Mol. Cell. Biol. - 1999. - 19. -P. 2846-2852

3. Lezina L. Telomeric Proteins Regulate Episomal Maintenance of Epstein-Barr Virus Origin of Plasmid Replication / L.Lezina, Z.Deng, C-J.Chen, S.Shtivelband, W.So, P.M.Lieberman // Molecular Cell. - 2002. - Vol. 9. - P. 493-503.

4. Лёзина Л.Е. Исследование механизма связывания теломерных белков с сайтом инициации репликации Эпстейн-Барр вируса / Л.Е.Лёзина, О.Н.Ильинская, П.М.Либерман // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии: Сб. ст. - Томск, 2004 - Т. 3 - С. 32-34.

5. Лёзина Л.Е. Идентификация белков, связывающихся с сайтом репликации Эпстейн-Барр вируса / Л.Е.Лёзина, О.Н.Ильинская, П.М.Либерман // Материалы и технологии XXI века: Тез. док. IV научн. конференции молодых ученых. - Казань, 2004 - С. 48

p??m

Отпечатано в 000 «Печатный двор» Казань, ул Журналистов, 1/16, оф 207 Тел 72-74-59,41- 76-41,41- 76-51 Лицензия ПД№7-0215 от 0111 01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 1211 2004 г Усл пл 1,5 Заказ №К-2228 Тираж 100экз Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать -ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лёзина, Лариса Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус Эпстайна-Барр: молекулярные механизмы регуляции вирусной репликации и роль клеточных факторов.

1.2. Теломеры, как аналоги нонамеров вирусного генома, и факторы, связывающиеся с теломерными повторами.

1.3. Регуляция инициации транскрипции на уровне формирования прединициационного транскрипционного комплекса

1.3.1. Образование и свойства прединициационного транскрипционного комплекса у дрожжей.

1.3.2. Роль фактора TFIIA в регуляции транскрипции.

1.4. Регуляция жизнедеятельности вирусов и клеток на уровне посттрансляционных модификаций белков.

1.4.1. Роль поли-АДФ-рибозилирования белков в жизни клетки.

1.4.2. Фосфорилирование и его роль в регуляции транскрипции.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Идентификация теломерных белков, ассоциированных с DS-элементом через взаимодействие с EBNA1.

3.2. Ассоциация теломерных факторов с oriP в латентно инфицированной клеточной линии лимфомы Бёркитта.

3.3. Кооперативное связывание TRF2 и EBNA1 с DS элементом.

3.4. Влияние белков, связывающихся с нонамерными последовательностями, на опР-зависимую репликацию ДНК.

3.5. Функции нонамеров в поддержании стабильности вирусного генома.

3.6. Влияние поли-АДФ-рибозных модификаций на функцию поддержания стабильности вирусного генома.

3.7. Значение взаимодействия между TFIIA и ТВР для роста и жизнеспособности дрожжей.

3.8. Нарушение клеточного цикла у дрожжей, мутантных по TFIIA.

3.9. Роль взаимодействия между TFIIA и ТВР в выборе промотора in vivo.

3.10. Активатор- и промотор- зависимые дефекты у дрожжей, мутантых по TFIIA.

3.11. In vivo фосфорилирование Toal субъединицы TFIIA комплекса.

3.12. Стимуляция образования TFIIA-TBP-ДНК комплекса в результате фосфорилирования Toal.

3.13. Значение фосфорилирования Toal для поддержания индуцибельной транскрипции группы промоторов in vivo.

3.14. Влияние фосфорилирования Toal на жизнеспособность дрожжей.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов"

Актуальность темы. Любой живой организм, на каком бы уровне организации он не находился, представляет собой открытую систему. Он постоянно находится под воздействием внешних факторов, и потому должен обладать способностью быстро и адекватно реагировать на изменения, происходящие во внешней среде. Жизненный цикл любого организма включает в себя пролиферацию, сопровождающуюся циклическими изменениями, происходящими во всем организме, и, если речь идет о многоклеточных организмах, дифференциацию, сопровождающуюся изменениями, происходящими на определенной фазе развития организма. Все эти процессы требуют от организма присутствия четких регуляторных механизмов, способных модулировать его функции и поддерживающих его в стабильном состоянии. Из числа таких регуляторных механизмов, особое значение принадлежит посттрансляционным модификациям.

Фосфорилирование представляет собой наиболее общий и важный механизм быстрой и обратимой регуляции белковых функций. Исследования животных клеток выявили, что примерно одна треть всех клеточных белков ковалентно модифицирована фосфорилированием. Фосфорилирование белков и последующее их дефосфорилирование действуют совместно в , сигнальных путях и вызывают быстрые изменения в ответ на воздействия гормонов, факторов роста и нейротрансмиттеров. Большинство факторов роста [Heldin, 1995] и цитокининов [Ihle et al., 1994] стимулируют фосфорилирование во время связывания со своими рецепторами. Индуцированное фосфорилирование в свою очередь активирует цитоплазматические протеинкиназы [Marshall, 1995]. Дополнительно, клеточный цикл у всех эукариот в обеих G1/S и G2/M переходных фазах регулируется циклин-зависимыми протеинкиназами [Doree and Galas, 1994]. Фосфорилированием также контролируется дифференциация и развитие клеток, а в определенных случаях и метаболизм.

По сравнению с ацетилированим и фосфорилированием, гликозилирование является более узко направленной модификацией, необходимой для поддержания структурной целостности белков. Поли-АДФ-рибозилирование является одним из определяющих процессов, регулирующих жизнь клетки. Он представляет собой посттрансляционную ' модификацию ядерных белков, как немедленный ответ клетки на разрушение ДНК, вызванное ионизирующей радиацией, окислением и мутагенами [Ате et al., 2000]. Кроме того, поли-АДФ-рибозилирование играет существенную роль в регуляции процессов экспрессии генов и некоторых аспектов репликации ДНК [D'Amours et al., 1999; Dantzer et al., 1999; Kraus and Lis, 2003].

Одновременно вопросы, касающиеся таких фундаментальных процессов регуляции живых организмов, как наследование генетической информации и ее реализация, находятся на переднем крае современной биологии. Такие процессы, как репликация и транскрипция ДНК, являются наиболее важными, благодаря которым реализуется программа развития всех живых организаций, от индивидуальных организмов до целых популяций.

В связи с вышеизложенным определяется актуальность исследования роли различных посттрансляционных модификаций в регуляции жизненноважных функций находящихся на различных уровнях организации микроорганизмов, таких как репликация и транскрипция.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение функций белков, принимающих участие в инициации транскрипции дрожжей и репликации вируса Эпстайна-Барр, а также механизмов их регуляции на уровне посттрансляционных модификаций.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

4. Выявить роль посттрансляционных модификаций транскрипционного фактора TFIIA в формировании прединициационного комплекса на различных типах промоторов.

Научная новизна. Используя новую методику биохимического выделения ДНК-связывающих белков, впервые выделена и идентифицирована группа клеточных белков, специфически взаимодействующих с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр in vitro и in vivo. Этими белками оказались теломерные белки, участвующие в регуляции длины теломер. Показано влияние выделенных > белков на функции репликации и поддержания стабильности вирусного генома. Отмечено, что эти функции регулируются различными механизмами двух типов: пассивным, за счет белок-белковых взаимодействий, и энзиматически активным за счет посттрансляционных модификаций.

Установлено, что поли-АДФ-рибозилированне регулирует стабильность вирусного генома, модифицируя белки комплекса, связанного с oriP.

Впервые показана in vivo необходимость образования стабильного комплекса между транскрипционными факторами TFIIA и ТВР (TATA Binding Protein) и промоторной ДНК для нормального роста и жизнеспособности дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что стабильное взаимодействие между TFIIA и ТВР является лимитирующим фактором для экспрессии некоторых, но не всех, генов класса II (регулируемых РНК-полимеразой II). Особенно важны такие взаимодействия для экспрессии генов, содержащих индуцибельные промоторы, а также для генов, специфически регулируемых на определенных фазах клеточного цикла. Все это позволило подтвердить функцию TFILA, как транскрипционного фактора, зависимого от структуры корового промотора, и необходимого для инициации транскрипции определенной группы генов in vivo. Впервые получены данные о фосфорилировании TFIIA in vivo в дрожжах. Показано, что фосфорилирование TFIIA стимулирует его комплексообразование с ТВР и промоторной ДНК, что является необходимым условием для поддержания максимального уровня транскрипции с некоторых промоторов in vivo.

Вышеуказанные научные факты и наблюдения позволили выявить общие закономерности функционирования живых систем разного уровня организации, а также механизмов регуляции их наиболее важных процессов жизнедеятельности. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения, отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации:

I. Клеточные белки, связывающиеся с сайтом инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр, принимают участие в регуляции функций репликации и поддержания стабильности вирусного генома, в том числе используя посттрансляционный механизм поли-АДФ-рибозилирования белков для снижения активности исследуемых функций.

2. Основной транскрипционный фактор TFIIA регулирует формирование прединициационного транскрипционного комплекса in vivo на промоторах определенной группы генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, выполняя в определенных случаях зависимую от его фосфорилирования функцию ко-активатора.

3. Посттрансляционные модификации белков, на примере поли-АДФ-рибозилирования и фосфорилирования, представляют универсальный механизм регуляции жизненноважных функций микроорганизмов, обладающих различными уровнями организации.

Практическая значимость работы. Вирусом Эпстайна-Барр инфицировано более 90% человечества. Хотя он в большинстве случаев устанавливает "молчащую" латентную инфекцию, он также ассоциирован с некоторыми раковыми заболеваниями. Результаты работ по изучению регуляции процессов жизнедеятельности вируса Эпстайна-Барр способствуют выявлению механизма участия вируса в этих заболеваниях. Определение путей регуляции, в частности репликации вирусной ДНК и поддержания стабильности его генома, и нахождение способов модуляции этих процессов дает возможность использовать эти знания в медицинских целях, в разработке фармакологических препаратов. К тому же есть основание предполагать, что некоторые другие вирусы могут обладать похожим механизмом регуляции репликации.

Дрожжи, в частности Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи), широко применяются в производстве, поэтому базисные исследования транскрипции их белков могут быть использованы в дальнейшем в разработке новых технологий, новой продукции, а также в усовершенствовании производственных процессов.

Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 1994 - 2004 гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследование в рамках тематики работы были поддержанными грантами NIH(GM 12345-01 и GM 5 4687-02, США) и грантами Leukemia S ociety о f America (США) и American Cancer Society (США).

Место выполнения работы. Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета под руководством д.б.н. О.Н. Ильинской и в отделе молекулярной генетики Института анатомии и биологии Уистара (Wistar Institute, г. Филадельфия, США) под руководством д.б.н. П.М. Либермана.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых конференциях кафедры микробиологии КГУ, на IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2004), на отчетных научно-практических конференциях молодых ученых института анатомии и биологии Уистера (Филадельфия, США, 1998, 1999, 2000, 2001).

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 6 печатных работах. Из них 4 научные работы опубликованы в центральной зарубежной и 1 — в российской печати, 1 — в сборнике тезисов докладов российской конференции.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам института Уистера (США), в сотрудничестве с которыми возникла идея этой работы, Д. Озеру, С.П. Солоу, 3. Дэнд, Ч.-Д. Чен, С. Штивелбанд, а также сотрудникам кафедры микробиологии Казанского государственного университета за теплую рабочую атмосферу Автор выражает благодарность профессору Н.А. Барлеву за критические замечания по структуре и содержанию диссертационного материала. Автор особо благодарит своих научных руководителей профессора О.И. Ильинскую и профессора П.М. Либермана.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лёзина, Лариса Евгеньевна

ВЫВОДЫ:

1. Выделенные нами белки клеток человека, взаимодействующие с DS элементом сайта инициации репликации oriP вируса Эпстайна-Барр, являются факторами, регулирующими длину теломер. Их взаимодействие с oriP строго зависит от ключевого вирусного белка EBNA1. Клеточный белок TRF2 непосредственно связывается с наномерными сайтами DS элемента в присутствии EBNA1, кооперативно усиливая способность последнего к комплексообразованию.

4. Впервые показано, что TFIIA фосфорилируется in vivo в дрожжах. Эта модификация TFIIA важна как для формирования прединициационного транскрипционного комплекса так и для поддержания максимального уровня транскрипции некоторых индуцибильных генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лёзина, Лариса Евгеньевна, Казань

1. Кузнецова Н.Н. Методы генной инженерии / Н.Н.Кузнецова, В.Г.Винтер. - М.:Биоинформсервис, 1997. — 256 с.

2. Михайлов B.C. ДНК-полимеразы эукариот // Мол. биол. 1999. - Т.ЗЗ, N4. - С. 567-580.

3. Рубцов П.М. Альтернативные промоторы и процессинг РНК в экспрессии эукариотического генома // Мол. биол. 2000. - Т.34, N4. — С. 626-634.

4. Сингер М. Гены и геномы / М.Сингер, П.Берг. М.:Мир, 1998. - 2т.

5. Журавлева Г.А. Геном дрожжей и первые шаги в постгеномную эру / Г.А.Журавлева, Л.Н.Миронова, С.Г.Инге-Вечтомов // Мол. биол. 2000. -Т.34,N4.-С. 560-571.

6. Adams A. Replication of latent Epstein-Вагг virus genomes in Raji cells // J. Virol. 1987.-61. - P. 1743-1746.

7. Aiyar A. The plasmid replicon of EBV consists of multiple cis-acting elements that facilitate DNA synthesis by the cell and a viral maintenance element / A.Aiyar, C.Tyree, B.Sugden // EMBO J. 1998. - 17. - P. 63946403.

8. Akoulitchev S. Requirement for TFIIH kinase activity in transcription by RNA polymerase II / S.Akoulitchev, T.P.Makela, R.A.Weinberg, D.Reinberg // Nature. 1995. - 377. - P. 557-560

9. Aimer A. Removal of positioned nucleosomes from the yeast PH05 promoter upon PH05 induction releases additional upstream activating DNA elements /

10. A.Almer, H.Rudolph, A.Hinnen, W.Horz // EMBO J. 1986. - 5. - P. 26892696.

11. Althaus F.R. ADP-ribosylation of Proteins. Enzymology and Biological Significance / F.R.Althaus, C.Richter // Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1987.-P. 1-232.

12. Alvarez-Gonzalez R. Regulatory mechanisms of poly(ADP-ribose) polymerase / R.Alvarez-Gonzalez, T.A.Watkins, P.K.Gill, J.L.Reed H.Mendoza-Alvarez // Mol. Cell. Biochem. 1999. - 193. - P. 19-22.

13. Amon A. Mechanisms that help the yeast с ell с ycle clock tick: G2cyclins transcriptionally activate G2 cyclins and repress G1 cyclins / A.Amon, M. Tyers, B.Futcher, K.Nasmyth // Cell. 1993. - 74. - P. 993-1007.

14. Apone L.M. Yeast TAFII90 is required for cell cycle progression through G2/M but not for general transcription activation / L.M.Apone, C.-M.A. Virbasius, J.C.Reece, M.R.Green // Genes Dev. 1996. - 10. - P. 2368-2380.

15. Auble D.T. Motl, a global repressor of RNA polymerase II transcription, inhibits TBP binding to DNA by an ATP-dependent mechanism / D.T.Auble, K.E.Hansen, C.G.Mueller, W.S.Lane, J.Thorner, S.Hahn // Genes Dev.- 1994. -8.-P. 1920-1934.

16. Ausubel F.M. Current Protocols in Molecular Biology / F.M.Ausubel, RBrent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (eds.), // New York: Greene and Wiley-Interscience, 1997.

17. Blackburn E.H. Switching and signaling at the telomere // Cell. 2001. - 106. -P. 661-673.

18. Bochkarev A. Crystal structure of the DNA-binding domain of the Epstein-Barr virus origin-binding protein EBNA 1 / A.Bochkarev, J.A.Barwell, R.A.Pfuetzner, W.Jr.Furey, A.M.Edwards, L.Frappier // Cell. 1995. -83. -P. 39-46.

19. Bochkarev A. Crystal structure of the DNA-binding domain of the Epstein-Barr virus origin-binding protein, EBNAl, bound to DNA / A.Bochkarev, J.A.Barwell, RA.Pfiietzner, E.Bochkareva, L.Frappier, A.M.Edwards // Cell. -1996.-84, 5.-P. 791-800.

20. Bogan J. A. Initiation of eukaryotic DNA replication: conservative or liberal? / J.A.Bogan, D.A.Natale, M.L.Depamphilis // J. Cell. Physiol. 2000. - 184. -P. 139-150.

21. Broccoli D. Human telomeres contain two distinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2 / D.Broccoli, A.Smogorzewska, L.Chong, T.de Lange // Nat. Genet. 1997. - 17. - P. 231-235.

22. Broccoli D. Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells / D.Broccoli, J.W.Young, T.de Lange // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - 92. -P. 9082-9086.

23. Bryant G.O. Radical mutations reveal TATA-box binding protein surfaces required for activated transcription in vivo / G.O.Bryant, L.S.Martel, S.K.Burley, A.J.Berk // Genes Dev. 1996. - 10. - P. 2491-2504.

24. Buratowski S. Five intermediate complexes in transcription initiation by RNA polymerase II / S.Buratowski, S.Hahn, L.Guarente, P.A.Sharp // Cell. 1989. -56.-P. 549-561.

25. Burke T.W. Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters / T.W. Burke, J.T.Kadonaga // Genes Dev. 1996. - 10. - P. 711-724.

26. Burley S.K. Biochemistry and structural biology of transcription f actor IID (TFIID) / S.K.Burley, R.G.Roeder // Annu. Rev. Biochem. 1996. - 65. - P. 769-799.

27. Butler A.J. Poly(ADP-ribose) polymerase binds with transcription enhancer factor 1 to MCAT1 elements to regulate muscle-specific transcription / A.J.Butler, C.P.Ordahl // Mol. Cell. Biol. 1999. - 19. - P. 296-306.

28. Caelles C. M-phase-specific phosphorylation of the POU transcription factor ^ GHF-1 by a cell cycle-regulated protein kinase inhibits DNA binding /

29. C.Caelles, H.Hennemann, M.Karin // Mol. Cell, Biol. 1995. - 15. - P. 66946701.

30. Carey M. A mechanism for synergistic activation of a mammalian gene by GAL4 derivatives / M.Carey, Y.S.Lin, M.R.Green, M.Ptashne // Nature. -1990.-345.-P. 361-364.

31. Cervellera M.N. Poly(ADP-ribose) polymerase is a B-MYB coactivator / M.N.Cervellera, A.Sala // J. Biol. Chem. 2000. - 275. - P. 10692-10696.

32. Chatterjee S. Connecting a promoter-bound protein to TBP bypasses the need for a transcriptional activation domain / S.Chatteijee, K.Struhl // Nature. -1995.-374.-P. 820-822.

33. Chaudhuri B. Human DNA replication initiation factors, ORC and MCM, associate with oriP of Epstein-Barr virus / B.Chaudhuri, H.Xu, I.Todorov, A.Dutta, J.L.Yates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - 98. - P. 1008510089.И

34. Chen Y. Identification of the C-terminal activator domain in yeast heat shock factor: independent control of transient and sustained transcriptional activity / Y.Chen, N.A.Barlev, O.Westergaard, B.KJakobsen // EMBO J. 1993. - 12. -P. 5007-5018.

35. Chi T. A general mechanism for transcriptional synergy by eukaryotic activators / T.Chi, P.Lieberman, K.Ellwood, M.Carey // Nature. 1995. -377.-P. 254-257.

36. Choy B. Eukaryotic activators function during multiple steps of preinitiation complex assembly / B.Choy, M.R.Green // Nature. 1993. - 366. - P. 531536.

37. Cisek L.J. Phosphorylation of RNA polymerase by the murine homologue ofthe cell-cycle control protein cdc2 / L.J.Cisek, J.L.Corden // Nature. 1989. -339.-P. 679-684.

38. Conaway R.C. General initiation factors for RNA polymerase П / R.C.Conaway, J.W.Conaway // Annu. Rev. Biochem. 1993. - 62. - P. 161190.

39. Cook B.D. Role for the related poly(ADP-ribose) polymerases tankyrase 1and 2 at human telomeres / B.D.Cook, J.N.Dynek, W.Chang, G.Shostak, S.Smith // Mol. Cell. Biol. 2002. - 22. - P. 332-342.

40. Dahmann C. S-phase-promoting cyclin-dependent kinases prevent re-replication by inhibiting the transition of replication origins to a pretreplicative state / C.Dahmann, J.F.Diffley, K.A.Nasmyth // Curr. Biol. 1995. -5.-P. 1257-1269.

41. Dahmus M.E. Reversible phosphorylation of the C-terminal domain of RNA polymerase II // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. 19009-19012.

42. D'Amours D. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions / D.D'Amours, S.Desnoyers, I.D'Silva, G.G.Poirier // Biochem. J. -1999.-342.-P. 249-268.

43. Dantzer F. Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair / F.Dantzer, V.Schreiber, C.Niedergang, C.Trucco, E.Flatter, G.De La Rubia, J.Oliver, V.Rolli, J.MeAnissier-de Murcia, G.de Murcia // Biochimie. -1999.-81.-P. 69-75.

44. Deng Z. Telomeric Proteins Regulate Episomal Maintenance of Epstein-Barr Virus Origin of Plasmid Replication / Z.Deng, L.Lezina, C-J.Chen, S.Shtivelband, W.So, P.M.Lieberman // Molecular Cell. 2002. - Vol. 9. - P. 493-503.

45. Dhar S.K. Replication from oriP of Epstein-Barr virus requires human ORC and is inhibited by geminin / S.K.Dhar, K.Yoshida, Y.Machida, P.Khaira, B.Chaudhuri, J.A.Wohlschlegel, M.Leffak, J.Yates, A.Dutta // Cell. 2001. -106.-P. 287-296.

46. Dignam J.D. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei / J.D.Dignam, R.M.Lebovitz, R.G.Roeder // Nucleic Acids Res. 1983. - 11. - P. 1475-1489.

47. Dikstein R. TAFII250 is a bipartite protein kinase that phosphorylates the base transcription factor RAP74 / R.Dikstein, S.Ruppert, R.Tjian // Cell. -1996.-84.-P. 781-790.

48. Doree M. The cyclin-dependent protein kinases and the control of cell division / M.Doree, S.Galas // FASEBJ. 1994. - 85. - P. 1114-1121.

49. Espejel S. Mammalian Ku86 mediates chromosomal fusions and apoptosis caused by critically short telomeres / S.Espejel, S.Franco, S.Rodriguez

50. Perales, S.D.Bouffler, J.C.Cigudosa, M.A.Blasco // EMBO J. 2002. - 21. -P. 2207-2219.

51. Frappier L. Overproduction, purification, and characterization of EBNA1, the origin binding protein of Epstein-Barr virus / L.Frappier, M.J.O'Donnell // Biol. Chem. 1991. - 266. - P. 7819-7826.

52. Gahn T.A. The Epstein-Barr virus origin of plasmid replication, oriP, contains both the initiation and termination sites of DNA replication / T.A.Gahn, C.L.Schildkraut // Cell. 1989. - 58, 3. - P. 527-535.

53. Galande S. Poly (ADP-ribose) polymerase and Ku autoantigen form a complex and synergistically bind to matrix attachment sequences / S.Galande, T.Kohwi-Shigematsu // J. Biol. Chem. 1999. - 274. - P. 20521-20528.

54. Ge H. The high mobility group protein HMG1 can reversibly inhibit class II gene transcription by interaction with the TATAbinding protein / H.Ge, R.G.Roeder // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 17136-17140.

55. Geiger J.H. The crystal structure of the yeast TFIIA/TBP/DNA complex / J.H.Geiger, S.Hahn, S.Lee, P.B.Sigler // Science. 1996. - 272. - P. 830-836.

56. Griesenbeck J. Protein-protein interaction of the human poly(ADPribosyl) transferase depends on the functional state of the enzyme / J.Griesenbeck, S.L.Oei, P.Mayer-Kuckuk, M.Ziegler, G.Buchlow, M.Schweiger // Biochemistry. 1997. - 36. - P. 7297-7304.

57. Griffith J.D. Mammalian telomeres end in a large duplex loop / J.D.Griffith, L.Comeau, S.Rosenfield, R.M.Staansel, A.Bianchi, H.Moss, T.de Lange // Cell. 1999. - 97. - P. 503-514.

58. Halle J.-P. Gene expression: increasing evidence for a transcriptosome / J.P.Halle, M.Meisterernst // Trends Genet. 1996. - 12. - P. 161-163.

59. Hammerschmidt W. Identification and characterization of orilyt, a lytic origin of DNA replicationof Epstein-Barr virus / W.Hammerschmidt, B.Sugden // Cell. 1988. - 55. - P. 427-433.

60. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general transcriptional machinery // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - 62. - P. 465503.

61. Harley C.B. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts /

62. C.B.Harley, A.B.Futcher, C.W.Greider // Nature. 1990. - 345. - P. 458^60.

63. Harris A. Random association of Epstein-Barr virus genomes with host cell metaphase chromosomes in Burkitt's lymphoma-derived cell lines / A.Harris, B.D.Young, B.E.Griffin // J. Virol. 1985. - 56. - P. 328-332.

64. Harrison S. Sequence requirements of the Epstein-Barr virus latent origin of DNA replication / S.Harrison, K.Fisenne, J.Hearing // J. Virol. 1994. - 68, 3.-P. 1913-1925.

65. Hartl P. Mitotic repression of transcription in vitro / P.Hartl, J.Gottesfeld,

66. D.J.Forbes // J. Cell Biol. 1993. - 120. - P. 613-624.

67. Hassa P.O. The functional role of poly(ADP-ribose)polymerase 1 as novel coactivator of NF- B in inflammatory disorders / P.O.Hassa, M.O.Hottiger // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - 59. - P. 1534-1553.

68. Heldin C.-H. Dimerization of cell surface receptors in signal transduction // Cell. 1995. - 80. - P. 213-223.

69. Hershkovitz M. Metaphase chromosome analysis by ligation-mediated PCR: heritable chromatin structure and a comparison of active and inactive X chromosomes / M.Hershkovitz, A.D.Riggs // Proc Natl Acad Sci USA. — 1995.-92.-P. 2379-2383.

70. Hirai K. Epstein-Barr virus genome in infected cells and cancer / K.Hirai, T.Yamamoto, T.Hironaka, T.Arai, H.Takeuchi, R.Kobayashi, I.Hoio, T.Oishi // Epstein-Barr virus and human cancer. Japan Scientific Press, 1998. - P. 29-39.

71. Hirai К. Replication and licensing of the EBV oriP minichromosome / K.Hirai, M.Shirakata // Epstein-Barr Virus and Human Cancer (K. Takada, ed.). Heidelberg: Springer, 2001. - P. 13-33.

72. Hoffinann A. A histone octamer-like structure within TFIID / A.Hoffmann, C.M.Chiang, T.Oelgeschlager, X.Xie, S.K.Burley, Y.Nakatani, R.G.Roeder // Nature. 1996. - 380. - P. 356-359.

73. Holstege F.C.P. Opening of an RNA polymerase II promoter occurs in two distinct steps and requires the basal transcription factors ПЕ and IIH /

74. F.C.P.Holstege, P.C.van der Vliet, H.Th.M.Timmers // EMBO J. 1996. - 15. -P. 1666-1677.

75. Hsieh D.J. Constitutive binding of EBNA1 protein to the Epstein-Barr virus replication origin, oriP, with distortion of DNA structure during latent infection / DJ.Hsieh, S.M.Camiolo, J.L.Yates // EMBO J. 1993. - 12, 13.1. P. 4933-4944. (Dec 15)

76. Hsu H.L. Ku is associated with the telomere in mammals / H.L.Hsu, D.Gilley, E.H.Blackburn, D.J.Chen // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - 96. - P. 1245412458.

77. Huletsky A. The effect of poly(ADP-ribosyl)ation on native and HI-depleted chromatin. A role of poly(ADP-ribosyl)ation on core nucleosome structure / A.Huletsky, G.de Murcia, S.Muller, M.Hengartner, L.Menard, D.Lamarre,

78. G.G.Poirier // J. Biol. Chem. 1989. - 264. - P. 8878-8886.

79. Hunter T. The regulation of transcription by phosphorylation / T.Hunter, M.Karin // Cell. 1992. - 70. - P. 375-387.

80. Ihle J.N. Signalling by the cytok- ine receptor superfamily: JAKS and STATS / J.N.Ihle, B.A.Witthuhn, F.W.Quelle, K.Yamamoto,

81. W.E.Thierfelder, B.Kreider, O.Silvennoinen // Trends Biochem. Sci. -1994. -19.-P. 222-227.

82. Imbalzano A.N. Transcription factor (TF) IIB and TFIIA can independently increase the affinity of the TATA-binding protein for DNA / A.N.Imbalzano, K.S.Zaret, R.E.Kingston // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 8280-8286.

83. Imhof A. Acetylation of general transcription factors by histone acetyltransferases / A.Imhof, X.J.Yang, V.V.Ogryzko, Y.Nakatani, A.P.Wolffe, H.Ge // Curr. Biol. 1997. - 7. - P. 689-692.

84. Iyer V. Mechanism of differential utilization of the his3 TR and TC TATA elements / V.Iyer, K.Struhl / Mol. Cell. Biol. 1995. - 15. - P. 7059-7066.

85. Iyer V. Absolute mRNA levels and transcriptional initiation rates in Saccharomyces cerevisiae / V.Iyer, K.Struhl // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-93.-P. 5208-5212.

86. Jackson S.P. Regulating transcription factor activity by phosphorylation // Trends Cell Biol. 1992. - 2. - P. 104-108.

87. Jankelevich S. A nuclear matrix attachment region organizes the Epstein-Barr viral plasmid in Raji cells into a single DNA domain / S.Jankelevich, J.L.Kolman, J.W.Bodnarand, G.Miller // EMBO J. 1992. - 11. - P. 11651176.

88. Jiang Y. A three-step pathway of transcription initiation leading to promoter ^ clearance at an activation RNA polymerase II promoter / YJiang, M.Yan,

89. J.D.Gralla // Mol. Cell. Biol. 1996. - 16. - P. 1614-1621.

90. Kadonaga J.T. Assembly and disassembly of the Drosophila RNA polymerase II complex during transcription // J. Biol. Chem. 1990. - 265. - P. 26242631.

91. Kang J.J. Analysis of the yeast transcription factor TFIIA: distinct functional regions and a polymerase Il-specific role in basal and activated transcription / J.J.Kang, D.T.Auble, J.A.Ranish, S.Hahn // Mol. Cell. Biol. 1995. - 15. - P. 1234-1243.

92. Karlseder J. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2 / J.Karlseder, D.Broccoli, Y.Dai, S.Hardy, T.de Lange // Science. 1999. - 283. - P. 1321-1325.

93. Karlseder J. Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss / J.Karlseder, A.Smogorzewska, T.de Lange // Science. 2002. - 295. - P. 2446-2449.

94. Kass-Eisler A. Recombination in telomere-length maintenance / A.Kass-Eisler, C.W.Greider // Trends Biochem Sci. 2000. - 25. - P. 200-204.

95. Kaufmann J. Direct recognition of initiator elements by a component of the transcription factor IID complex / J.Kaufmann, S.T.Smale // Genes Dev. -1994.-8.-P. 821-829.

96. Kim Т.К. Effects of activation-defective TBP mutations on transcription initiation in yeast / T.K.Kim, S.Hashimoto, R.J.3rd Kelleher, P.M.Flanagan, R.D.Kornberg, M.Horikoshi, R.G.Roeder // Nature. 1994. - 369. - P. 252255.

97. Kim H. NAD glycohydrolases: a possible function in calcium homeostasis / H.Kim, E.L.Jacobson, M.KJacobson // Mol Cell Biochem. 1994. - 138. - P. 237-243.

98. Kim N.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer / N.W.Kim, M.A.Piatyszek, K.R.Prowse, C.B.Harley, M.D.West, P.L.Ho, G.M.Coviello, W.E.Wright, S.L.Weinrich, J.W.Shay // Science. 1994. - 266. - P. 2011-2015.

99. Kingston R.E. Repression and activation by multiprotein complexes that alter chromatin structure / R.E.Kingston, C.A.Bunker, A.N.Imbalzano // Genes Dev. 1996. - 10. - P. 905-920.

100. Kirov N. The mechanism of repression by DSP1 (dorsal switch protein) involves interference with preinitiation complex formation / N.Kirov, P.Lieberman, C.Rushlow // EMBO J. 1995. - 15. - P. 7079-7087.

101. Kitajima S. Regulation of the human general transcription initiation factor TFIIF by phosphorylation / S.Kitajima, T.Chibazakura, M.Yonaha, Y.Yasukochi // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 29970-29977.

102. Koleske A.J. The RNA polymerase II holoenzyme and its implications for gene regulation / A.J.Koleske, R.A.Young // Trends Biochem. Sci. 1995. -20.-P. 113-116.

103. Koons M.D. The replicator of the Epstein-Barr virus latent cycle origin of DNA replication, oriP, is composed of multiple functional elements / M.D.Koons, S.V.Scoy, J.Hearing // J. Virol. 2001. - 75. - P. 10582-10592.

104. Kraus W.L. PARP goes transcription / W.L.Kraus, J.Lis // Cell. 2003. - 113. -P. 677-683.

105. Kuranda M.J. Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae / M.J.Kuranda, P.W.Robbins // J. Biol. Chem. -1991.-266.-P. 19758-19767.

106. Lee H.W. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs / H.W.Lee, M.A.Blasco, G.J.Gottlieb, J.W.Horner, C.W.Greider, R.A.DePinho // Nature. 1998. - 392. - P. 569-574.

107. Lee D.K. TFIIA induces conformational changes in TFIID via interactions with the basic repeat / D.K.Lee, J.DeJong, S.Hashimoto, M.Horikoshi, R.G.Roeder et al. // Mol. Cell. Biol. 1992. - 12. - P. 5189-5196.

108. Lee M.A. Genetic evidence that EBNA-1 is needed for efficient, stable latent infection by Epstein-Barr virus / M.A.Lee, M.E.Diamond, J.L.Yates // J. Virol. 1999. - 73. - P. 2974-2982.

109. Lei M. Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex / M.Lei, B.K.Tye // J. Cell Sci. 2001. - 114. - P. 1447-1454.

110. Leuther K.K. Two-dimensional crystallography of TFIIB- and IIE-RNA polymerase II complexes: implications for start site selection and initiation complex formation / K.K.Leuther, D.A.Bushnell, R.D.Kornberg // Cell. -1996.-85.-P. 773-779.

111. Li X.Y. Distinct classes of yeast promoters revealed by differential TAF recruitment / X.Y.Li, S.RJBhaumik, M.RGreen // Science. 2000. - 288. - P. 1242-1244.

112. Li B. Identification of human Rapl: Implications for telomere evolution / B.Li, S.Oestreich, T.de Lange // Cell. 2000. - 101. - P. 471-483.

113. Lieberman P.M. A mechanism for TAFs in transcriptional activation: activation domain enhancement of TFIID-TFIIA—promoter DNA complex formation / P.M.Lieberman, AJ.Berk // Genes Dev. 1994. - 8. - P. 9951006.

114. Lindahl T. Quality control by DNA repair / T.Lindahl, RD.Wood // Science. -1999.-286.-P. 897-1905.

115. Lingner J. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase / J.Lingner, T.RHughes, A.Shevchenko, M.Mann, V.Lundblad, T.R.Cech // Science. 1997. - 276. - P. 561-567.

116. Little R.D. Initiation of latent DNA replication in the Epstein-Barr virus genome can occur at sites other than the genetically defined origin / RD.Little, C.L.Schildkraut // Mol Cell Biol. 1995. - 15,5. - P. 2893-2903.

117. Luscher B. Mitosis-specific phosphorylation of the nuclear oncoproteins Мус and Myb / B.Luscher, RN.Eisenman // J. Cell Biol. 1992. - 118. - P. 775784.Г141

118. Ma D. Separation of the transcriptional coactivator and antirepression functions of transcription factor IIA / D.Ma, I.Olave, A.Merino, D.Reinberg // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - 93. - P. 6583-6588.

119. Marshall C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signalling: Transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation // Cell. -1995.-80.-P. 179-185.

120. Martinez-Balbas M.A. Displacement of sequence-specific transcription factors from mitotic chromatin / M.A.Martinez-Balbas, A.Dey, S.K.Rabindran, K.Ozato, C.Wu // Cell. 1995. - 83. - P. 29-38.

121. Mathis G. Release of core DNA from nucleosomal core particles following (ADP-ribose)n-modification in vitro / G.Mathis, F.R.Althaus // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - 143. - P. 1049-1054.

122. Matsui T. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase II / T.Matsui, J.Segall, P.A.Weil, R.G.Roeder // J. Biol. Chem. 1980. - 255. - P. 11992-11996.

123. Maxon M.E. Transcription factor HE binds preferentially to RNA polymerase Ila and recruits TFIIH: a model for promoter clearance / M.E.Maxon, J.A.Goodrich, R.Tjian // Genes Dev. 1994. - 8. - P. 515-524.

124. Meyer R. Negative regulation of alkylation-induced sister-chromatid exchange by poly(ADP-ribose)polymerase-1 activity / R.Meyer, M.Muller, S.Beneke, J.H.KuEpper, A.BuErkle // Int J Cancer. 2000. - 88. - P. 351355.

125. Middleton T. EBNAl can link the enhancer element to the initiator element of the Epstein-Barr vims plasmid origin of DNA replication / T.Middleton, B.Sugden // J. Virol. 1992. - 66. - P. 489-495. /

126. Mitsiou D.J. TAC, a TBP-sans-TAFs complex containing the unprocessed TFIIA alphabeta precursor and the TFIIA gamma, subunit / D.J.Mitsiou, H.G.Stunnenberg et al. // Mol. Cell. 2000. - 6. - P. 527-537.

127. Miyamoto Т. Inhibition of nuclear receptor signalling by poly(ADP-ribose) polymerase / T.Miyamoto, T.Kakizawa, K.Hashizume // Mol. Cell. Biol. -1999.-19.-P. 2644-2649.

128. Nie J. Interaction of Oct-1 and automodification domain of poly(ADP-ribose) synthetase / J.Nie, S.Sakamoto, D.Song, Z.Qu, K.Ota, T.Taniguchi // FEBS Lett. 1998. - 424. - P. 27-32.

129. Nikolov D.B. Crystal structure of a TFIIB-TBP-TATA-element ternary complex / D.B.Nikolov, H.Chen, E.D.Halay, A.A.Usheva, K.Hisatake, D.K.Lee, R.G.Roeder, S.K.Burley // Nature. 1995. - 377. - P. 119-128.

130. Nikolov D.B. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view / D.B.Nikolov, S.K.Burley // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - 94. - P. 1522.

131. Niller H.H. Nucleoprotein complexes and DNA 5'-ends at oriP of Epstein-Barr vims / H.H.Niller, G.Glaser, R.Knuchel, H.Wolf// J Biol Chem. -1995.-270, 21.-P. 12864-12868.

132. O'Brien T. Functional analysis of the human TAFII250 N-terminal kinase domain / T.O'Brien, R.Tjian // Mol. Cell. 1998. - 1. - P. 905-911.

133. Oei S.L. Regulation of RNA Polymerase II-dependent transcription by poly(ADP-ribosyl)ation of transcription factors / S.L.Oei, J.Griesenbeck, M.Schweiger, M.Ziegler // J Biol Chem. 1998. - 273. - P. 31644-31647.

134. Oelgeschlager T. T opology and г eorganization о f a human Т FIID-promoter complex / T.Oelgeschlager, C.-M.Chiang, R.G.Roeder // Nature. 1996. -382. - 735-738.

135. Ozer J. Transcription factor IIA mutations show activator-specific defects and reveal a IIA function distinct from stimulation of TBP-DNA binding / J.Ozer, A.H.Bolden, P.M.Lieberman // J. Biol. Chem. 1996. - 271. - P. Ill 8211190.

136. Ozer J. Molecular cloning of the small (gamma) subunit of human TFIIA reveals functions critical for activated transcription / J.Ozer, P.A.Moore, A.H.Bolden, A.Lee, C.A.Rosen, P.M.Lieberman // Genes Dev. 1994. - 8. -P. 2324-2335.

137. Ozer J. A testis-specific transcription factor IIA (TFILAtau) stimulates TATA-binding protein-DNA binding and transcription activation / J.Ozer, P.Moore, P.M.Lieberman // J. Biol. Chem. 2000. - 275. - P. 122-128.

138. Plaza S. Involvement of poly (ADP-ribose)-polymerase in the Pax-6 gene regulation in neuroretina / S.Plaza, M.Aumercier, M.Bailly, C.Dozier, S.Saule // Oncogene. 1999. - 18. - P. 1041-1051.

139. Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation of polynucleosomes causes relaxation of chromatin structure / G.G.Poirier, G.de Murcia, J.Jongstra-Bilen, C.Niedergang, P .Mandel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1 982. - 79. - P. 3423-3427.

140. Ranish J.A. Isolation of two genes that encode subunits of the yeast transcription factor IIA / J.A.Ranish, W.S. Lane, S.Hahn // Science. 1992. -255.-P. 1127-1129.

141. Realini C.A. Histone shuttling by poly(ADP-ribosylation) / C.A.Realini, F.R.Althaus // J. Biol. Chem. 1992. - 267. - P. 18858-18865.

142. Roeder R.G. The complexities of eukaryotic transcription initiation: ^ regulation of preinitiation complex assembly // Trends Biochem. Sci. 1991.-16.-P. 402-408.

143. Roeder R.G. The role of general i nitiation factors in transcription b у RNA polymerase II // Trends Biochem. 1996. - 21. - P. 327-335.

144. Rose M. Construction and use of gene fusions to lacZ (beta-galactosidase) that are expressed in yeast / M.Rose, D.Botstein // Methods Enzymol. 1983. -101.-P. 167-180.

145. Rose M. Methods in yeast genetics / M.Rose, R.Winston, P.Hieter. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. - 348p.

146. Rudolph K.L. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice / K.L.Rudolph, S.Chang, H.W.Lee, M.Blasco, G.J.Gottlieb, C.Greider, R.A.DePinho // Cell. 1999. - 96. - P. 701-712.

147. Ruscetti T. Stimulation of the DNA-dependent protein kinase by poly(ADP-ribose) polymerase / T.Ruscetti, B.E.Lehnert, J.Halbrook, H.Le Trong,

148. M.F.Hoekstra, D.J.Chen, S.R.Peterson //J Biol Chem. 1998. -273.- P. 14461-14446.

149. Sakurai H. Two alternative pathways of transcription initiation in the yeast negative regulatory g ene GAL80 / H.Sakurai, T.Ohishi, T.Fukasawa // Mol. Cell. Biol. 1994. - 14. - 6819-6828.

150. Segil N. Mitotic phosphorylation of the Oct-1 homeodomain and regulation of Oct-1 DNA binding activity / N.Segil, S.B.Roberts, N.Heintz // Science. -1991.-254.-P. 1814-1816.

151. Segil N. Mitotic regulation of TFIID: inhibition of activator-dependent transcription and changes in subcellular localization / N.Segil, M.Guermah, A.Hoffmann, R.G.Roeder, N.Heintz // Genes Dev. 1996. - 10. - P. 23892400.

152. Shirakata M. Identification of minimal oriP of Epstein-Barr virus required for DNA replication / M.Shirakata, K.Hirai // J Biochem (Tokyo). 1998. - 123, l.-P. 175-181.

153. Shirakata M. Requirement of replication licensing for the dyad symmetry element-dependent replication of the Epstein-Barr virus oriP minichromosome / M.Shirakata, K.I.Imadome, K.Hirai // Virology. 1999. - 263. - P. 42-54.

154. Shire К. EBP2, a human protein that interacts with sequences of the Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 important for plasmid maintenance f K.Shire,

155. D.F.Ceccarelli, T.M.Avolio-Hunter, L.Frappier // J. Virol. 1999. - 73. - P. 2587-2595.

156. Sikorski R.S. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae / R.S.Sikorski, P.Hieter // Genetics. 1989. - 122. - P. 19-27.

157. Smith S. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres / S.Smith, I.Giriat, A.Schmitt, T.de Lange // Science. 1998. - 282. - P. 14841487.

158. Smogorzewska A. Different telomere signaling pathways in human and mouse cells / A.Smogorzewska, T.de Lange // EMBO J. 2002. - 21. — P. 4338-4348.

159. Soldatenkov V.A. Transcriptional repression by binding of poly(ADP-ribose) polymerase to promoter sequences / V.A.Soldatenkov, S.Chasovskikh, V.N.Potaman, I.Trofimova, M.E.Smulson, A.Dritschilo // J. Biol. Chem. -2002.-277.-P. 665-670.

160. Solomon M.J. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene / M.J.Solomon, P.L.Larsen, A.Varshavsky // Cell. 1988. - 53, 6. - P. 937947.

161. Song K. Interaction of human Ku70 with TRF2 / K.Song, D Jung, Y.Jung, S.G.Lee, I.Lee // FEBS Lett. 2000. - 481. - P. 81-85.

162. Srinivas S.K. Spontaneous loss of viral episomes accompanying Epstein-Barr virus reactivation in a Burkitt's lymphoma cell line / S.K.Srinivas, J.T.Sample, J.W.Sixbey // J. Infect. Dis. 1998. - 177. - P. 1705-1709.

163. Stansel R.M. T loop, assembly in vitro involves binding of TRF2 near the 30 telomeric overhang / R.M.Stansel, T.de Lange, J.D.Griffith // EMBO J. -2001.-20.-P. 5532-5540.

164. Stargell L.A. The TBP-TFIIA interaction in response to acidic activators in vivo / L.A.Stargell, K.Struhl // Science. 1995. - 269. - P. 75-78.

165. Strahl-Bolsinger S. Grunstein MSIR2 and SIR4 interactions differ in core and extended telomeric heterochromatin in yeast / S.Strahl-Bolsinger, A.Hecht, K.Luo // Genes Dev. 1997. - 11, 1. - P. 83-93.

166. Struhl K. Yeast transcriptional regulatory mechanisms // Annu. Rev. Genet. -1995.-29.-P. 651-674.

167. Sugden B. Molecular mechanisms of maintenance and disruption of virus latency / B.Sugden, E.R.Leight // Epstein-Barr Virus and Human Cancer.(K. . Takada, ed.) Heidelberg: Springer, 2001. - P. 3-11.

168. Sugden B. A vector that replicates as a plasmid and can be efficiently selected in B-lymphocytes transformed by Epstein-Barr virus / B.Sugden, K.Marsh, J.Yates // Mol. Cell. Biol. 1985. - 5. - P. 410-413.

169. Sun X. Reconstitution of human TFIIA activity from recombinantpolypeptides: a role in TFIID-mediated transcription / X.Sun, D.Ma, M.Sheldon, K.Yeung, D.Reinberg // Genes Dev. 1994. - 8. - P. 2336-2348.

170. Tan S. Crystal structure of a yeast TFIIA/TBP/DNA complex / S.Tan, Y.Hunziker, D.F.Sargent, T.J.Richmond // Nature. 1996. - 381. - P. 127134.

171. Tupler R. Expressing the human genome / RTupler, G.Perini, M.RGreen // Nature. 2001. - 409. - P. 832-833.

172. Upadhyaya A.B. Identification of a general transcription factor TFIIA alpha/beta homolog selectively expressed in testis / A.B.Upadhyaya, S.H.Lee, J.DeJong // J. Biol. Chem. 1999. - 274. - P. 18040-18048.

173. Usheva A. Specific interaction between the nonphosphorylated form of RNA polymerase II and the TATA-binding protein / A.Usheva, E.Maldonado,

174. A.Goldring, H.Lu, C.Houbavi, D.Reinberg, Y.Aloni // Cell. 1992. - 69. - P. 871-881.

175. Van Dyke M.W. Physical analysis of transcription preinitiation complex assembly on a class II gene promoter / M.W.Van Dyke, R.G.Roeder, M.Sawadogo // Science. 1988. - 241. - P. 1335-1338.

176. B.van Steensel, A.Smogorzewska, T.de Lange // Cell. 1998. - 92. - P. 401413.

177. Walker S.S. Yeast TAFII145 required for transcription of Gl/S cyclin genes and regulated by the cellular growth state / S.S.Walker, W.-C.Shen, J.C.Reese, L.M.Apone, M.R.Green // Cell. 1997. - 90. - P. 607-614.

178. Wang Y. P32/TAP, a cellular protein that interacts with EBNA-1 of Epstein

179. Wesierska-Gadek J. ADP-ribosylation of wild-typep53 in vitro: binding of p53 protein to specific p53 consensus sequence prevents its modification /

180. J.Wesierska-Gadek, G.Schmid, C.Cerni // Biochem Biophys Res Commun. -1996.-224.-P. 96-102.

181. Yates J.L. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells / J.L.Yates, N.Warren, B.Sugden // Nature. 1985. — 313.-P. 812-815.

182. Yates J.L. Epstein-Barr virus-derived plasmidsteplicatr only onceper cell cycle and are not amplifiedafter entryinto cells / J.I.Yates, N.Guan // J. Virol. -1991.-65.-P. 423-431.

183. Yates J.L. The minimal replicator of Epstein-Barr virus oriP / J.L.Yates, S.M.Camiolo, J.M.Bashaw // J. Virol. 2000. - 74. - P. 4512^1522.

184. Yokomori K. Drosophila TFIIA directs cooperative DNA binding with TBP and mediates transcriptional activation / K.Yokomori, M.P.Zeidler, J.L.Chen, C.P.Verrijzer, M.Mlodzik, R.Tjian // Genes Dev. 1994. - 8. - P. 2313-2323.

185. Zawel L. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process / L.Zawel, D.Reinberg // Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1993. -44.-P. 67-108.

186. Zawel L. Common themes in assembly and function of eukaryotic transcription complexes / L.Zawel, D.Reinberg // Annu. Rev. Biochem. -1995.-64.-P. 533-561.

187. Zawel L. Recycling of the general transcription factors during RNA polymerase II transcription / L.Zawel, K.P.Kumar, D.Reinberg // Genes Dev. -1995.-9.-P. 1479-1490.

188. Zhou X.Z. The Pin2/TRF1 interacting protein PinXl is a potent telomerase inhibitor / X.Z.Zhou, K.P.Lu // Cell. 2001. - 107. - P. 347-359.

189. Zhu X.D. Cell cycle-regulated association of Rad50/MRE11/NBS1 with TRF2 and human telomeres / X.D.Zhu, B.Kuster, M.Mann, J.H.Petrini, T.de Lange // Nat. Genet. 2000. - 25. - P. 347-352.

190. Ziegler M. A cellular survival switch: poly(ADP-ribozyl)ation stimulates DNA repair and silences transcription / M.Ziegler, S.L.Oei // BioEssays. -2001.-23.-P. 543-548.

Информация о работе

Лёзина, Лариса Евгеньевна
кандидата биологических наук
Казань, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль посттрансляционных модификаций клеточных белков в регуляции репликации и транскрипции у микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы