Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль моноаминоксидазы в реакции организма на экстремальные воздействия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль моноаминоксидазы в реакции организма на экстремальные воздействия"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи ГОРОШИНСКАЯ Ирина Александровна

УДК 577.152.143

РОЛЬ МОНОАМИИОКСИДАЗЫ В РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ЭКСТРЕМАЛЬНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва —

1988

Работа выполнена в НИИ биологии Ростовского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета.

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР, доктор биологических наук, профессор И. Б. Збарский,

доктор биологических наук, профессор М. Ш. Промыслов,

доктор медицинских наук, профессор А. П. Хохлов.

Ведущая организация — 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.

защита диссертации состоится « » ¿/¡юй^ГЙ. 1989 г. в Уу час на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

В. Э. ТОРБЕК

ОНДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение возможности существования гдаых организмов в экстремальных условиях, в первую очередь ара повишенном я пониженном давлениях кислорода, при низкой температуре окружающей среды, является в настоящее время актуальной медико-биологической проблемой. Актуальность определяется интенсивным освоением высокогорных районов, обварных территорий Севера, морских глубин, развитием авиации и космонавтики, широким применение;! гипербарооксигенации в медицинской практике. Нередко организм подвергается одновременному воздействии нескольких экстремально* факторов. Использование кислорода под повышенным давлением в медицине, при водолазшх я кессонных работая может сопровождаться я влиянием низкой температуры. Сочетание холодового а гадокеического воздействий наблюдается в высокогорных районах и может встречаться пря различных экстремальных условиях трудовой деятельности.

Существенная роль в развитии кислородной интоксикация, в ответной реакции организма на гнпоксическое воздействие, в регуляции процессов адаптации к холоду принадлежит кзйрагуиораль-нш! механизмам а прежде всего.нарушению моаоамияергаческях ме~ диаторнцх систем. Универсальными факторами, участвушшми в развитии патологического процесса, являются нарушение мембранных структур а модификация активности и свойств ыембраяяосвязанкых ферментов. Поэтому пря изучения ыехана^мов плилиня гзпероксии, гипоксии и хатода особое в ¡дамапае привлекает митохоядраальяая моноамияоясидаза (МАО), основной фермент обмена моноаодшоз, непосредственно участвующий в выполнении ими медзаторных функций Ва?£ная роль МАО в процессах лыэнедеятельностя организма а многообразие «е^зболических реакций, связанных с активностью фзр-аента, позволяют предположить, что изменения каталитических свойств 1.!А0 могут вносить суиестаенныИ вклад в реализацию от-вгтной реакции па экстремальные воздействия я в развитие патологического состояния. Несмотря на многолвтннЗ интерес а пс-следовавио МАО а появление все аовых а новых работ по пзучапот ее активности з сзойств пра различиях воздействиях л заболеваниях, значение обнаруживаемы« йгмалзалЗ этого фэрмента о экег~ рамадьгшх условиях остазтся зззыясазяшгм.

В данной работе исследовалось состояяаа МАО ара гиперонов®, гапоксаческой гипоксии, илючии голосного мозга л холодовсм воздействии. Поскольку общепринято'рячделять МАО на типы А и Б, --

изучались обе формы фермента* Существенны?,! различием кееду выбранными для исследования Баз-действиями является их переносимость органиком. Гипероксии относятся к воздействия«, о которыми большинство живых организмов в естественных условие йе встречается и адаптация к которым маловероятна. Ишемия головного иозга .моделирует условия» в которые попадает мозг пр2 КК-судьте, и при достаточной даятелыюоги ведет к необратимому всрзк&шш функций ыозга и табели организма. Использованные пай! условия гшокспчзсеоЛ гипоксии также несовместимы с продолжительной £5{зньо- В отличие от перечисленных состояний дяителыш воздействие низкой температуры в пределах 0-4°С приводит к адаптации органязаа. Исследование каталитических свойств МАО на начальных этапах действии холодового фактора, когда преобладает стрессовая реакция, и при достижении состояния адаптации является необходимым для установлен роли этого фермента в адаптивных процессах в организме.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выяснение участия ыоноаыиноксндазной енотами в реакциях организма в ответ на экстремальные воздействия и при патологических состояниях. Для решения этих вопросов быля поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследование активности, вдэгяки и субстратной специфичности МАО при гипероксии. Определений тканевой чувствительности МАО к'действио повышенного давления кислорода. Установление роли МАО в изменении содержания ряда дологически активных азотсодержащих компонентов клетки при гшероксйй. Изучение возможности применения ингибиторов МАО в качестве защитных вешеств при гипероксии и механизма ях антитагероксического действия,

2. Исследование активности, кинетики и субстратной специфяч> аости МАО в условиях гипоксическоВ гвзоксий и ишемия головного мозга.

3. Исследование активности, кяневдсй и субстратной сиешфга-ности МАО в условиях холодового стресса и адаптации к холоду« Изучение влияния на свойства МАО педгада дельта-сяз, о<Ш№Жв~ го адаптогенным действием.

4. Изучение влияния предварительной холодовой 8Я8ВШ$йИ на чувствительность животных и каталитические свойства ШО яри последующей действии гипероксии и гвдоквей.

5. Изучение состояния нятохсищртмиах иеибрвв врш гипероксии, гипоксии и холодовом воздействии,

Выполнение яоетавленных задач осуществлялось на базе лаборатории адаптации животных к экстремальна факторам среды ШШ биологии Ростовского госуниверситета я ■частично на базе лаборатории нейрохшия Института биохимии Медицинского факультета Белградского университета (СФРЮ), Клинические испытания проведены на базе больницы й 20 г.Ростова-на-Дону,

Научная новизна» В работе впервые проведено комплексное сравнительное исследование своЗетз МАО при экстремальных состояниях разной этиологии (гипероксии, гипоксии а холодовом воздействии) и показана роль МАО в ответной реакции организма на действие различных экстремальных факторов. Для всех изученных экстремальных состояний характерно инглбирование МАО типа А мозга, сопровождающееся снижением сродства к моноаыинам а изменением субстратной специфичности фермента. МАО типа А приобретает способность дезаминировать ашшосахара, да- а поляамннн, ГА.',Ж, гистамин, гомокарнозин. Усиленпе дезаминировання АМФ в зависимости от природы воздействия мояет обусловливаться трансформацией МАО типа А или активацией специфического фермента -АМФ-дезаминазы. Показана наибольшая чувствительность МАО типа А ■ в мозге по сравнению с другими тканями. Г/АО типа Б мозга менее чувствительна к экстремальным воздействия«: не изменяется при гипоксической гипоксии, холодовом стрессе и ингибируется в значительно меньшей степени, чем МАО типа А, в условиях гипероксии, С помощью избирательно действующих ингибиторов МАО однозначно доказано, что существенный вклад в характерное для гипероксии снижение содержания ряда важнейших азотсодержащих компонентов клетки, таких, как ГАЖ и спермилии, вносит МАО типа А вследст-, вие изменения субстратной специфичности. Показана ошибочность ранее существовавшего предположения, что снижение уровня ГАМК при гипероксии связано с ингибированиеи глутаматдекарбоксилазы.

Важнейшими последствиями измеиения каталитических свойств МАО типа А в экстремальных условиях являются: I) нарушение процессов инактивации основных медиаторов и изменение в результате этого нормального соотнояения активностей возбуждающих и тормозных медиаторяых систеа; 2) усилеиве перекиеаого окисления лнпвдов вследствие образования в ходе реакций катализируемых МАО продуктов, обладающих проохсидантным эффектом; 3) нарушение мембранннх структур в результате ирзобретення МАО способности дезаминировать аминосахара а интенсификации процессов перекис-ного окисления липидов ыеыбрвя. В свсю очередь усиление процес-

сов пепекисного окисления лилвдсв и нарушение структуры и проницаемости мембран митохондрий являются факторами, гкзщкетзкЕ изменение активности а субстратной специфичности МАО, Нарушение дгембраннах структур разных типов характерно для всех изучениях экстремальных воздействий. Об этом свидетельствует выход митохондрйзльяой МАО в цитозоль, данные электронной микроскопии и появление эрвтроцитарпых ферментов в сиворстке крови.

Подтверждением роли МАО в механизме развития патологического состояния являются защитный эффект при гаперокски кнгибито-ров МАО типа А, препятствующих изменена? субстратной специфичности фермента, а также адаптогенноэ действие пептида дельта-сна, предотвращающего модификация свойств !/Л0 типа А при холо-довом воздействии« При это« нормализуется ряд показателей ме- • таболизма, нарушение которых характерно для описанных экстремальных состояний, в частности, интенсивность перекленого око-ленвя липидов к стабильность ыеыбран. Полученные данные ккшззь основой для использования ингибитора ТЛАО тпш А пиразвдола в качества протектора при лечешиа методой ГВО-терапии. Показано, что -предварительная холодовая адаптация, для которой характерны нормализация субстратной специфичности МАО к резкое увеличение сродства фермента к мокоакикаи, повывает устойчивость кивзткых к гипероксек е гипоксии и может бить использована в качестве одного кз способов увеличения резистентвостЕ органез-иа £ экстремальным воздействиям. На основании полученных данных выдвигаются новые представления, имеющие общебиологаческов значение, согласно которым изменению каталитических свойств МАО'принадлежи: важная роль в реакциях организма на экстравдь-нке воздействия.

Основные результаты и положения, выносимые на защиту.

I. Снижение активности и изменение субстратной специфичности МАО типа А, обнаруженное при гипероксии, гипоксии и холодо-еок воздействии, ведет к нарушению процессов инактивации медиаторов серотоника, норадреаалвна, гистамина, ГАМК, гомокарно-зина и те« самым изменяет нормальное соотношение между процессами возбукдения и тораожения в ЦНС. Характерное для гиперок-сеп в холодового стресса снижение уровня ГАМК, полиаыинов, го-коЕорнозвиа, глвкозаыина обусловлено в значительной степени их дезаыинированиеы при участии модифицированной МАО типа А. Из-иененяе свойств МАО способствует также усилению процессов пе-рекисного окисления липидоз и нарушении мембранных структур. 4

2. При всех изученных экстре,\<алШ£{ зоздейотзиях происходив изменение структуры и проницаемости ряда мзмОран, о чем свидетельствуют выход ыитохондриальной МАО з цигозоль, дагшыо электронной микроскопии и появление зратроцитзрной глюкозо-6н|>ос-фатдегядрогеназы (Г6ФДГ) в сыворотке кроаи,

3. Ингибиторы МАО типа А оказывают зыражзшюэ антигиперок-сическое действие, механизм которого определяется, по-видимому, их способностью предотвраиать изменение субстратной специфичности фермента, результатом чего является нормализация урошш ГАГЛК и слерыидиш, ангиоксидантный эффект, стабилизация мембран.

4. Предварительная холодозая адаптация, но не холодовой стресс, повышает устойчивость .тавотных к действию гилероксии а гипоксии и препятствует развитию характерных для этих воздействий метаболических нарушений. Одяхм из Докторов, способствузз-пшх неспецифической повышенной сопротивляемости адаптированных к холоду животных, является состояние МАО, характеризующееся повышением сродства (¡¡ерчентл к моноэминам и отсутствием изменения субстратной специфичности.

5. Изменение каталитических свойств У/АО является одш-м аз ведущих звеньев в ответной реакции организма на экстремальные, воздействия, в механизмах развития патологического состояния. Приемы, предотвращающие изменения свойств Г/ЛО или способствующие их нормализации, могут служить основой для разработка эффективных методов повышения устойчивости организаа к действию неблагоприятных факторов среди. I

Практическая значимость работы. Факты и обобщения, получен-/ нне в ходе выполнения настоящей работы, послукяля предпосылкой к развитию нового перспективного направления исследований в области разработки рациональных способов повышения устойчивости организма к действию экстремальных факторов и поиска пригодных для практического использования антигипероксячёсках ярсезк-торов. На примере хлоргклина изучен механизм закатного действия ингибиторов МАО при гипероксии а обосновано ах прлмеазаго в качестве протекторов в клинической практике при лечоаиа методом ГВО-терапив. На основании этих исследованяй разработагш рекомендация по использован:» допущенного в качестве лечзбяогэ препарата ингибитора МАО типа А пяразидолэ у больных, яоторг» по показаниям применялась гипербарооксигенапдя. Разработана оптимальная схема введения пяразвдолэ а апробировано ого

2-1219 5

менение у больных с ишемической болезнью сердца я рядом других сердечно-сосудистых патологий, получавших сеансы гкпербароок-сигеяации. Применение пиразидола позволяет использовать ГБО-терапию и у -чувствительных к повышенному давлению кислорода больных (заявка на изобретение И 433ÏI4/Ï4 (I776I5), приоритет от 2.12.1987 г.).

Показана возможность применения предварительной холодовой адаптации в качестве способа повышения устойчивости организма к гипероксии я гипоксии (рацпредложение » 135/82 от 19.II.1982 г. РТУ внедрено в НИИ акушерства и педиатрии с 1984 г.). Определение активности и субстратной специфичности МАО используется на кафедре биохимии и биотехнологии РТУ и в НИИ биологии ИУ в качестве теста для отбора и апробации аитигилероксичес-ких препаратов и адаптогенов. Разработан способ определения глубины гипероксического поранения и оценки состояния организма при холодовой воздействии, основанный на определении стабильности эритроцитарных мембран по активности Г6ФДГ в сыворотке крови (внедрен в отделении Ш) больницы № 20 г.Ростова-на-Дону' с 1985 г.). Предаояеньг биохимические критерии диффе-рекцировки состояния холодового стресса и адаптации, используемые на кафедре биохимии и биотехнологии РТУ идя научно-исследовательских задач и в учебном процессе.

Материалы диссертации используются при чтении лекций в спецкурсах* по ферментологии, биохимии ЦШ и сравнительной биохимии на кафедре биохимии и биотехнология ИТ"; они включены в монографии "Нейрохимия" (изд. Ростовского университета, 1977) и "Биохимические механизмы кислородной интоксикации" (изд. Ростовского университета, 1980), которые используются как учебные пособия для специализирующихся по биохимии студентов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 22 съездах, симпозиумах и конференциях; 17 Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград, 1979; УШ, П и X Всесоюзных нейрохимических конференциях. Минск, 1980, Ереван, 1963, Горький, IS87; Всесоюзных симпозиумах "Стресс и адаптация", Кишинев, I97B, 1984; "Окислительные ферменты живой клетки И регуляция их активности", Горький, 1978; "ПентозофОсфатный путь превращения углеводов и его регуляция", Гродно, 1978; Карачарово, 1984; 4 Северо-Кавказской биохимической конференция, Нальчик, 1979; Всесоюзных симпозиумах "Кратковременное действие повышенного давления газовой среды на организм Человеке я животных", Ле~ 6

нинград, 1979; "Адаптивные функции головного мозга", Баку, 1980; "Механизмы пластичности мозга яри функциональных и патологических воздействиях", Махачкала, 1982; I и П Всесоюзных конференциях "Важнейшие теоретические и практические проблемы терморегуляции", Новосибирск, 1902, Минск, 1986; I Всесоюзном симпозиуме "Фармакологическая коррекция кислородзависимых патологических состояний", Москва, 1984; 3 Северо-Кавказской школе-семинаре по проблеме "Механизмы экологической адаптации растений и животных к экстремальным факторам среды", Ростов-на-Дону, 1984; 71 Балканских биохимических и биофизических днях, Пловдив (Болгария), 1985; Международной конференции "Фосфолипиды в нервной системе: биохимическая и молекулярная фармакология", Мантова (Италия), 1985; ХШ Конгрессе Союза Югославских физиологических обшесгв с международным участием, Скопье (Югославия), 1985; П Всесоюзной конференции "Биоантиок-сидант", Москва, 1986; У Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологли, Махачкала, 1986.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 65 работ, в том числе 27 статей обзорного и экспериментального характера и 30 публикаций в трудах съездов, конференций, симпозиумов. 10 работ опубликовано на английском языке.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", пяти глав экспериментального материала, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на .340 страницах машинописного текста, включая 57 таблиц и 36 рисунков. : Список использованной литературы, изложенный на 71 странице, состоит из 711 наименований, в том числе 334 зарубежных источников,

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть опытов проведена на половозрелых белых крысах массой 150-200 г. Использовано 1780 крыс. В отдельных сериях использованы кролики, морские свинки, кошки, донорская кровь человека. Исследование ишемии головного мозга проведено на 116 половозрелых монгольских песчанках массой 50-60 г. Клинические испытания применения пиразидола в качестве протектора При лечении методом ГБО-терапии проведены на больных, ишемичес-кой болезнью сердца, атеросклерозом и облитеряруюшин эвдарте-

рикто.у, получавшее курс oKcurgEOvapwTEpanss, состоявший иг 9-12 сеансов 0,2 Ша кислорода в течение 60 минут.

Действие гипероксия изучали при 0,7 Ша кислорода, судорожная фабд в барокамере при лоомянноц реаиме компрессии и декомпрессии 0,2 МПа/мин. Гипоконческую гипоксию вызывали, пшае-Иая крыо на I ч в барокамеру» где производили "подъем" на высоту SOCO и (атмосферное давление 0,029 Ша) при скорости декомпрессии 0,005 МПа/мин. В рлдо опытов животных подвергали действию атмосферного давлешг 0,019 МПа, соответствующего высоте 12000 ¡4 над уровне« «оря, Экспозицию на высоте 12000 м прододкалк до появления у есютных второго атонального вдоха. Ншаыиа головного мозга вызывали двусторонним пережатием общих сонных артерий в шейном районе леанестезированных монгольских песчанок. Животных декапктжроралн сразу после I-минутной и 5-минутной несши а через I чво. и 4 суток после 5-минутной ишемии. При кзучепш дейотвкя низкой температуры крыс помешали в холодовуэ камеру прз 2°Q «а I, 3, 5, 7, 15, 30, 45 и 60 суток. Для исследования сегошз: особенностей влияния низкой температура опыты провод ми £ ДЕЗ периода: зимне-весенняя серия - со второй половины январи со карт н осенняя серая ~ ноябрь - первая Половина декабря.

Активность и евоЕош УА0 в большинстве случае? (гипероксия, гизскеия, холодовов хювдсЯотвие) иоедэдойалк в грубоЕ ие» тохондриальиой фракции. При й<шедое2ее2 еезупв голодного re cnurii йроводшш tm субфраггда чистых ¿¡итохондрпй Л сикапто-соа, получонаих в градиенте фикола.

Лктйвпосч'Ь ЫАО типа А. в ткаккх с субстратами серотоншои й ворадрекалккоу, a reuse дезетшрование глюкозамшза» путреевд-ка, спермина, сперыидйна» гасташша» ЕШК» гоыокарнозгна и Aí-Iíi в Н0р40 пе явишаихся субстратаИЕ UkQt определяли по освобождении БШЕака в ходе 30-ыивутйо& итгубзцшз При 37,бйС, рЙ 7,45 формвнтпого препарата с одшг аз субстратов (Горкка я др.» 38S8). Содерагшо шлваЮз опрвделядй епектрСяуор^етраческй М фг/орцмвтро lüfipiCK "Hitachi 60Э-С0" {Cucaacro, Оуьао, 1981) B06Ü6 И50терйЕчес1:0Й olTótflK, Ar.V8£UOO?b Ш TEBft S в еарейаииш спектрофозшеярпчеенж о субстрате« Е^вдурвфокшшй-шишеу (Москшчш, 107'?)« ОЙР активность с субстрате« КС» иур-iunucu ойрзЖ&ййКЕ $йуорЕМОГряческЕ (Krajl, I9S5). Б обога-швййой тромбоцитах Kícwe крова активность МАО типа А определяй йо сосряашШой р«еюти с алкогольдегидрогеиазой (Веревки-8

на, Курялова, 1070), активность МАО типа Б - во методу А.И.Ш-лаклезвского (1376). Кинетические парлмчтри î^ в '/„^ наделяли на ЭВМ по методу Э.Корнии-Боудена (I07D) и грфачеоки, Ив-пользуя метод двойных обратных величии.

При исследовании влияния вдгиботоров МАО в опытах ta vitirn осуществляли преинкубацио о хлоргйлнзоы и депренилом в КОШ№* трэда» Ю"6 М, в которой ОйУ обладают выраяенныы избирательниц действием. При изучении защитного действия ингибиторов МО а большинстве опытов хлоргилин вводили животным ваутрлбрюшинно в дозо 5 мг на I кг касси за 30 минут до помещения а барокамеру, пмразидол - трехкратно в дозе 25 иг на I кг массы дважды накануне с интервалом в 6 часов а в день опыта за 30 минут до погашения животного в барокамеру.

При оценке общего состояния животных пользовались критерием CTeneim ПОДвюноста (Blenkarn et al., ICS9).

Гпотамш, спермидни а спераин нозга разделяла на колонках с карбоксиметолцеллюлозой (Sndo, Ogura, 1975). Содержание гиста-ШШа определяли колориметрическим методом с диазотированнш пзрэнитроанзшшом (Коробова и др., 1982). Содержание сперляна а спермидана - флуориыетрячески с ортофталевш диальдегидом (Bndo, 1978).

Содержание ГАМК в мозге определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе AAA-881 на малой колонке в 0,2 M иатрий-цитратном буфере рН 4,25. Активность глутааатдегвдрогенази -колориметрический методом (xittka, Нг&апо, IS69). Активность АШ-дезашшазы изучали в митохондриях и растворимой фракции мозга по количеству аммиака (Нерсесян а др., Î98I). Активность ГБФДГ определяла спектрофотоиетрически (Захарьин, IS87), содержание внеэригроцитарного гемоглобина (ВЭГ) - (Каракзпов, Вичев, 1^73), суммарную пероксидазную активность (СБА) - (Покровский, 1969). Ляпиди яз мозга а плазмы кроза выделяла но, методу E.G.Biigb, H.J.Dyer (1959). Определяли содержание первичных продуктов перекисного окисления ляиндов диеновых конызгатов (Владимиров, Лрчаков, 1972) и конечных продуктов -Шиффовых оснований (BicQacic, lappel, 1973). Интенсивность хе-милшинесценции сыворотки крова измеряли в присутствии двухвалентного яелеза (Кейс и др., 1983).

Для электронно-микроскопического исследования кусочки мозга фиксировали в глутаральдегзде по Зервпсону, затем а ОаО^ по Мялоншшгу, заливку проводили в эпон-араддит. Ультрэтоикив 3-I2I9 9

срезы дополнительно окрашивали в солях свинца по Рейкольтсу и в уранилацетате. Срезы исследовали в электронном микроскопе Ба-242 ("Те81а", ЧССР).

При статистической обработке материалов использованы метод Фишера-Стыодента (Бейли, 1973), метод парных сравнений (Коку-нмн, 1975), непараметрический парный критерий Вилкоксона (Губ-лер, 1978), Статистическая обработка проведена на ЭВМ Искра-1256 и ЕС 1033. При сравнении альтернативных распределений пользовались методом "ХК-квадрат" и таблицами, рассчитанными методом Фишера (Гублер, 1978). Корреляционный анализ проведен на ЭЕЛ ЕС 1033.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I, Активность, субстратная специфичность и кинетика коно-вминоксидаз при гкперокс.;»;, гипоксии к холодовом воздействии. В условиях гинероксш, гипоксической гипоксии и холодового стресса имеет место снижение активности ?»!АО типа А в мятохонд-риальной фракции мозга. В судорожную стадио гипероксии активность этой формы фермента ингибируется в среднем на 50%. При гипоксической гипоксии и холодовом стрессе (3 суток при 2°С), активность фермента снижается в меньшей степени - на 22-29% и 29-325? соответственно. Акгивность МАО типа Б в мозге снижается на 21$ при гипероксии и не изменяется в условиях гипоксической гипоксии и холодового стресса. Изучение влияния гипероксии на активность двух форм фермента в разных тканях показало, что наиболее выраженные изменения активности МАО типа А наблюдаются в мозге при незначительном ингибировании МАО типа Б. В отличие от мозга, в печени, легких и сердце активность МАО типа Б снижается в большей степени, чем активность МО типа А.

Изучение кинетики реакции, катализируемой МАО типа А, показало, что при всех изученных экстремальных воздействиях снижается сродство фермента к серогонину: реакции дезаминлрова-ния серотонина возрастает при гипероксии почти в три раза, при гипоксической гипоксии и холодовоы стрессе более чем вдвое.

Снижение специфической ыоноаминоксидазной активности сопровождается изменением субогратной специфичности фермента. МАО приобретает способность дезаминировать глюкозамин, путресцин, полиамияы, ГАМК, гомокарнозиа, гистамин.

Сходные обратимые качественные изменения каталитических свойотв МАО, названные трансформацией, обнаружены и при таких 10

патологических состояниях, как облучение, злокачественный рост; гипервитаминоз Д2 (Горкин, 1976), черепно-мозговая травма (Акопян, Промыслов, 3984), экспериментальная гилерхолестерине-мия и атеросклероз (Яужамбердиев и др., 1986) и др.

Поскольку обязательной предпосылкой возможности трансформации МАО является наличие функционально полноценных каталитических центров, установить способность фермента к качественному изменению каталитических свойств можно без его выделения, применяя ингибиторы Г/АО, блокирующие каталитические центры фермента и тем самым предотвращающие его трансформацию. Инги-биторный анализ, проведенный нами с помощью избирательно действующих ингибиторов МАО типа А хлоргилика и МАО типа Б депре-нила показал, что во всех случаях способность катализировать дезаминированке необычных субстратов приобретает МАО типа А. Параллельно изменению субстратной специфичности МАО типа А наблюдается усиление интенсивности дезаминирования АМФ. Опыты с ингибиторами МАО показали, что при гипоксии АМФ становится, наряду с другими веществами, субстратом МАО типа А. При гипер-оксии и холодовом стрессе усиление интенсивности дезаминирования АМФ обусловлено активацией специфического фермента АМФ-дезаминазы в митохондриях мозга.

При изучении влияния ишемия головного мозга исследовали активность, субстратную специфичность и кинетику МО в митохонд-риальной и синаптосомзльной фракциях коры головного мозга, стриатума и гиппокампа монгольских песчанок в условиях 1-минур-ной и 5-минутной ишемии. Наиболее ярко выраженные изменения каталитических свойств МАО обнаружены в митохондриэльной фракции всех исследованных отделов мозга при 5-минутной ишемии. Изменения проявляются в ингибировании фермента с общим для МАО типов А и Б субстратом кинурамином на 65-705?, приобретении способности дезаминировать глюкозамин, увеличении Ку, снижении ЧтоХ и в значительном отклонении форыы кинетических кривых от гиперболического характера. Опеты с хлоргилином свидетельствуют, что в условиях ишемии ингибируется в равной степени активность МАО типа А и МАО типа Б, В синаптосомальной фракции изменения свойств МАО имеют ту хе направленность, но выражены при 5-минутной ишемии в меньшей степени, чем в митохондриях. В то же время при более мягком воздействии - I-минутной ишемия -синаптосомальная МАО оказалась чувствительнее к действию экстремального фактора по сравнению с митохондриальным ферментом.

II

В пост-юнемический периой активность и субстратная специфичность МАО нормализуется уее через I час рециркуляции. Однако, нормализация кинетических параметров наблюдается через I час лишь в коре, в otptíüfjrMe - через 4 суток. В гиппокампе и через 4 суток Кривая зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата шее? сложный негиперболический характер. Сравнение реакции МАО разных отделов мозга указывает на большую чувствительность гипВДсш.ша по сравнению с корой и стриа-тумом.

Пра адаптации к холоду активность МАО типа А остается сниженной (дезамикяроЕаияе серзт&нкна несколько усиливается, хотя и не достигает уровня контрам). Сродство МАО типа А к субстратам увеличивается; Км реакций дезаминирования серотонпна снимется вдвое по сравнению Q цптактнши животными и в 5 раз по сравнению с кивогкыми, нахояянимися в состоянии холодового стресса. Активность МАО типа Б цвзначительно снижается. В то же время субстратная специфичное^ фермента нормализуется.

Умеренное снижение активности МО типов А и Б при отсутствие вменений субстратной специфич1Ш8К! является, по-видимому, характерном для состояния холодовой ад.'штйщ'к, При введении животным перед: З-суточкой экспозицией нр" £eG пептида дсльта-снсс оказывашзго гдантогешшй эффойФ йрй ДйййШШ 1Ж5ККХ ÍQU-ператур; активность МАО обоих: типов сшшается^ í¡ еуботр?1ШЯ епешфпчность не изменяется. Таким образом, введение пептида ■áéjiíta-сна оказишет на свойства МАО действие, аналогичное Адаптации й Голоду. При этом наблюдается такке нормализация уровня tnctmnna и стабилизация эргггроцнтарных ыембрзн.

П. Последовательное действие ta организм холода и г;:перок-Мй.).колода я гтб№пи Установление значительных изменений «аадгитнческих свойстзШО при развитии гшероксического п гв-пещшййкого поражений и нормализация субстратной спецпфпчнос-№ фоф^шта $ адаптированных к холоду «квотных обусловили ¡itr-терэд ii йсследомпЕо влияния прздварптельной холодовой адаптации щ шкшешм ceoí'ctb фзркенга и условиях шщуншх: a re» ЯОШБ В йа "чуЁатвйтелыюсгь сиьотшк к «

S йрьдьарйтельйых ссследовансях пвкааэка» VíQ увеличение екЖйпосФй 1ВЙДГ в cLíBoporae кровк, йшисоеся показателем де-ШбйлййаЦий (зрпгроцптариых иеыб^ЗК» ©траиаог состояние организма й Шкет йШ Ссйользовако В шчсстве теста глубины гипе-роксйчёйсого, гипоксечосКого й зшщового поражений. 12

У адаптированных к холоду тавотных время наступления судорог при действии гипероксии (0,7 Iffla) увеличивается на 4<1* по сравнению с контрольным. Активность ГЛАО типа А скитается в той же степени, что и при действии гипероксии на ингактнмх животных. Однако у адаптированных к холоду животных не изменяется субстратная специфичность фермента и активность МАО типа Б остается на контрольном уровне. Активность Г6ФДГ в сыворотке не повышается при действии гипероксии, что свидетельствует о стабилизации мембранных структур.

С целью проверить, связано ли понижение чувствительности к гипероксии именно с процессом адаптации, исследовали влияние гипероксии на животных, находящихся в условиях холодового стресса. Холодовой стресс увеличивает чувствительность животных к гипероксии, на что указываот как все изученные нами биохимические показатели (субстратная специфичность МАО типа А, активность МАО типа Б, уровень Г6ФДГ в сыворотке), так и сокращение времени наступления судорог вдвое по сравнению с контрольным.

Следует отметить наличие сезонных особенностей холодового воздействия на организм. З-суточное действие низкой температуры лишь в зимне-весенний, но не в осенний период вызывает развитие стресс-реакции, сопровоадашейся повышением чувствительности к гипероксии, изменением субстратной специфичности МАО а деструкцией эритроцитарных мембран, о чем свидетельствует повышение активности ГбФДГ, СПА и выход эритроцитарного гемоглобина в сыворотку крови. Обнаруженные сезонные различия влияния холода на каталитические свойства МАО и стабильность мембран связаны, вероятно, с сезонными колебаниями антиоксидаитнбй активности.

При действии гипоксии на адоптированных к холоду животных средняя продолжительность жизни увеличивается более чем в 10 раз, достоверно снижается вероятность развития судорог. Адаптация к холоду предотвращает вызываемое гипоксией изменение каталитических свойств МАО. При этом в данной случае нормализуется не только субстратная специфичность, но и активность фермента со специфическими субстратами. Активность Г6ФДГ в сыворотке остается на уровне, характерном для адаптированных к холоду животных. Активность ГБФДГ в мозге увеличивается, что характерно для адаптация к гипоксии.

В отличие от холодовой адаптации холодовой стресс не пред-4-1219 13

отйрааост, в даже усиливает изменение каталитических свойств МАО при гипоксии, не способствует активации лентозного пути обмена глюкозы и вызывает еще более выраженное нарушение проницаемости эритроцитарных мембран, о чем свидетельствует почти 3-кратное увеличение активности Б5ФДГ в сыворотке кроззи. Продолжительность жизни при гипоксии снижается почти вдвое по сравнению о интактными животными.

Таким образом, предварительная холодовая адаптация, но не холодовой стресс, оказывает•выраженный защитный эффект при ги-порокоии и гипоксии. У адаптированного к холоду организма развивается несиецифическая повышенная сопротивляемость к различным экстремальным воздействиям. Полученные данные свидетельствуют о важной роли изменения обмена моноаминергических медиаторов, свойств I.ÎA0 в развитии патологических состояний, что дает возмокность наметить пути предотвращения или направленной коррекции нарушений работы и однаторных систем. В качестве одного из способов повышения устойчивости организма к действию гипероксии и гипоксии может быть использована предварительная холодовая адаптация.

Другим способом влияния на каталитические свойства МАО,приведшим к изменению чувствительности организма к экстремальным воздействиям, является использование ингибиторов МАО типа Л.

Ш. Влияние гигибиторов МАО типа А на некоторые показатели метаболизма мозго и чувствительность организма к гкпероксии. В . условиях экстремальных воздействий субстратами МАО типа А становятся многие вещества, играющие важную роль в метаболизме клетки. С целью установить, вносит ли дезаминирование модифицированной МАО вклад в изменение содержания таких соединений, исследовали влияние ингибитора МАО типа А хлоргилина на уровень ГАМК, полиаминов и гистамина при гипероксии.

В условиях повышенного давления кислорода наблюдается значительное снижение содержания ГАМК и полиаминов, чеку придается важная роль в механизме развития кислородной интоксикации (Wood et al., 1967; Цветненко, Шугалей, 1978). Введение хлоргилина полностью предотвращает снижение уровня ГАМК. Уменьшение содержания ГАМК при гипероксии обычно объясняют ингибиро-ванием глютаматдекарбоксилазы, основного фермента синтеза ГАМК (Щербакова, 1962; Wood et ¿а., 1967). Однако введение хлоргилина не влияет на снижение .активности глютаматдекарбоксилазы, что свидетельствует о ведущей роли в механизме снижения уровня U

ГАЖ при гипероксии ее дезашнкрования под влиянием I.1A0 типа А.

Введение животным хлоргилина также предотвращает увеличение содержания гистамина и снижение уровня спермядина, вызываемые гипероксией. Снижение содержания спермина, в отличие от спермидина, по-видимому, не сачзано с трансформацией МАО, что в определенной степени согласуется со значительно меньшей деэ-амкниругощей активностью фермента при использовании в качестве субстрата спермина по сравнению со спермидином и другими необычными субстратами МАО,

Представленные данные свидетельствуют, что изменение каталитических свойств МАО является одно!! из причин существенных нарушений баланса ванных азотистых компонентов клетки при действии на животных гипероксии. Мы предположили, что ингибиторы МАО типа А, предотвращающие изменение субстратной специфичности фермента, могут влиять на течение кислородной интоксикации.

Введение хлоргилина за 30 минут до сеанса гипероксии в дозе 5 мг/кг внутрибрюЕинно или I нг/хг внутривенно отдаляет время наступления судорог при 0,7 МПа кислорода на 106-1105? и увеличивает выживаемость животных. Внутрибрюашнкое введение хлоргилина в дозе 2 мг/кг массы тела оказывает менее выраженный защитный эффект, отдаляя время наступления судорог лишь на 32%, Учитывая роль перекисного окисления и состояния мембранных структур в механизме кислородной интоксикации, исследовали влияние хлоргилина на интенсивность перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) в мозге и плазме крови и стабильность эритроцитар-ных мембран. В судорожную фазу кислородной интоксикации содержание в мозге диеновых коньпгатов возрастает на 1975?, Шиффошх оснований - на 2115?, в плазме крови увеличение уровня диеновых коньюг тов и Шиффовых оснований достигает 253$ и 1975? соответственно. Предварительное введение животным хлоргилина предотвращает увеличен« уровня ПОЛ в мозге и плазме крови в условиях гипероксии.

Ахтявапия ПОЯ влечет за собой повышение проницаемости мембран. О лабилизацви эритроцитарннх мембран в судорожную фазу кислородной интоксикации свидетельствует увеличение в сыворотке крови содеряания ВЭГ на 635?, СПА - на 1175?, активности Г6ФДГ - на 2475?. У защищенных хлоргилином животных дестабилизация эритроцитаршх мембран отсутствует.

Обнаруженный защитный эффект хлоргилина при гипероксии интересен главным образом с теоретической точки зрения для выяв-

15

ления |;схзйкзл;ов кислородной интоксикации и мишеней действия протекторов. Как и другие необратимые ингибиторы МАО, введение хлоргилина вызывает у человека побочные эффекты.

В этой связи особый интерес представляло исследовать, обладает ли защитным действием при гипероксии пиразидол, также яв-ляюеийся ингибитором МАО типа А, но в отличие от хлоргилина обратимым и хорошо переносимым орга'"'змом. Пиразидол - эффективное лекарственное средство, оказывающее регулирующее влияние на центральную нервную систему - стимулирушее при депрессиях к седативное при тревожных состояниях, что позволяет использовать его как при психических, гак и при невротических и соматических состояниях (Машковский, 1985).

Введение пиразидола интактным животным и при гипероксии ин-гибирует активность МАО типа А (субстрат серотонин) на 45$. При этом у гипероксичесних животных введение пиразидола частично нормализует субстратную специфичность фермента, снижая интенсивность дезашширования глюхозамина на 58$, спермидина -на ЗЪ%.

Введение пиразидола полностью предотвращает интенсификацию процессов ПОЛ в плазме крови, но не влияет на уровень диеновых коныогатов и Шиффовых оснований в мозге. Пиразидол,так же, как хлоргилик, снижает интенсивность хемилгамикесценции сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа, что позволяет предполагать» наличие прямого антиоясвдантного действия исследованных ингибиторов МАО типа А иа процессы ПОЛ в крови. Подобно хлорпшшу, пиразидол оказывает стабилизирующее действие на эритроцитарные мембраны.

Введение пиразидола не отдаляет время наступления.гиперок-сических судорог, но значительно повышает выживаемость животных и улучшает их общее состояние, о котором судили по критерию степени подвижности животных. Сразу после гипероксического воздействия этот показатель у животных, защищенных пиразидо-лом, был на 73$ выше, чем у незащищенных. Через 72 часа после воздействия все защищенные животные выжили и их состояние не отличалось от нормы. Из 15 незащищенных животных 6 погибло, у 8 крыс состояние не отличалось от контроля, у одного животного наблюдались минимальные неврологические повреждения.

Введение пиразидола препятствует развитию отека легких. Индекс отечности легких в судорожную фазу кислородной интоксикации при 0,7 Ша 02 возрастает в 2,5 раза, в досудорожную фазу Iб

.0,3 МПа 02, 4 паса) - в 1,5 раза. У защищенных пиразвдолом жи-/¡лтных индекс отечности легких снижается в судорожную фазу почти вдвое, при действии 0,3 Ша Og в течение 4 часов - не отличается от контроля.

Нами изучено применение пиразидола у больных с диагнозами .шемическоя болезнь сердца, атеросклероз и облитерирующий эн-дартершгт, получавших курс ГБО-терапла. 20 больных из 40 принимали за 30 мин до каждого сеанса по 0,05 г пиразидола per os. У всех испытуемых брали кровь из вены за час до 1-го сеанса (фон), после 3-го сеанса и после 9-го сеанса гипербарооксиге-иашга. В группе больных, подвергавшихся ГБО-терапии без приема пиразидола, отмечались интенсификация ПОЛ на 50-80$ по сравнению с фоном и увеличение уровня показателей, свидетельствующих о дестабилизации эригроцигзрных мембран (СНА, ВЭГ, активность Г6ФДГ) в среднем на 70-130$.'В группе больных, принимавших пи-разидол перед сеансами гипербарооксигенапии, средние уровни содертанкя диеновых коныогатов, 12иффовых оснований, ВЭГ, СПА и активности Г6ФДГ после 3-го и 9-го сеансов достоверно не изменяются по сравнению с фон о вши значениями.

Сравнительный анализ эффективности ГБО-терапии показал, что больные, получавшие подготовку пиразвдолом, лучше переносят лечение гкпероксичееккм кислородом по сравнению с больными, схема лечения которых не включала прием пиразидола. У больных,, получавших пиразидол, не наблюдалось клинических признаков кислородной интоксикации: подъема артериального давления, головных болей, что позволяло увеличивать продолжительность курса лечения до полного исчезновения жалоб и улучшения объективных критериев их состояния.

1у. Состояние клеточных мембран при гипероксии, гипоксии и холодовом воздействии. МАО представляет собой мембраносвязан-ный, липидзависимый фермент, свойства которого в значительной степени определяются липидным окружением и прочностью связи с мембранами. Предполагая наличие зависимости между состоянием мембранных структур и изменением свойств МАО, исследовали возможность выхода митохондриальной МО в цитозоль и электронно-микроскопическое строение мозга.

Как показали проведенные исследования, снижение активности МО типа А в митохондриальной фракции мозга в условиях гипероксии, гипоксии и холодового стресса сопровождается появлением серотонивдезаминазной и глюкозамиддезаминазной активности в

цитозоле. Преинкубация супернатанта, полученного после осаждения митохондрий, с хлоргилином полностью предотвращает появление дезаыинирования серотонина и глюкозамина, что свидетельствует о ыоноаминоксидазном происхождении индуцируемой в супернатанте активности. Обнаружена четкая обратная коррелятивная зависимость между активностью МАО в митохондриальной фракции и супернатанте. У адаптированных к холоду животных дезаминирова-ние серотонина и глюкозамина в супернатанте отсутствует.

Электронно-микроскопические исследования выявили набухание ыигоховдрий, снижение числа крист и просветление матрикса. С набуханием митохондрий связывают изменение проницаемости их мембран. Таким образом, как изучение активности МАО, так и данные -электронной микроскопии свидетельствуют о дестабилизации митоховдриалышх мембран при изученных экстремальных воз-, действиях.- Наблюдение электронно-микроскопических картин свидетельствует также о значительном уменьшении размеров лизосом. . Это в сопоставлении с имеющимися данными о снижении уровня кислых пептядгидролаз в лизосомальной фракции и увеличении их активности в надосадочлой фракции при гипероксин, гипоксии и холодовом стрессе указывает на изменение проницаемости лизо-сомальных мембран.

3-4-кратное увеличение активности эритроцитарной Г60ДГ в сыворотке крови при гипероксин и холодовом стрессе и 2-кратное увеличение этого показателя при гипоксии свидетельствуют также о дестабилизации эритроцитарных мембран.

Сопоставление наших результатов с имеющимися в литературе позволяет сделать вывод, что характерным для гипероксического, гилоксического и холодового повреждений является нарушение мембранных структур всех типов с изменением их проницаемости и свойств мембраносвязанных ферментов.

Полученные данные дают возможность обсудить вопрос о механизме изменения свойств МАО при изученных экстремальных воздействиях.

При гипероксин (Node et el., 1983; Гольдштейн и др., 1986 и др.), гипоксической гипоксии (Шафран и др., 1979), ишемии головного мозга (Laaizumi et el., 1984), холодовом стрессе (Ломакина, 1980) имеет место усиление перекисного окисления ли-пидов. Интенсификация ПОД ведет к реализации нескольких механизмов, вызывающих нарушение структуры мембран и свойств мембраносвязанных ферментов. Для I/1A0 выявлена корреляция ме»ду 18

величиной микровязкости и Хм: чем более вязкой становится мембрана, тем ниже сродство фермента к субстратам (Бурлакова и др., 1984). Увеличение микровязкости мембран мозга и эритроцитов, обнаруженное при гиперокски (Кричевская и др., 1987), сопровождается, как следует из наших данных, увеличением Км реакции дезаминирования серотонина. В условиях эксперимента, идентичных с нашими, показано увеличение микровязкости эрнтро-цитарных,мембран при гипоксии, при которой нами обнаружено двухкратное увеличение К^. Напротив, при холодоьой адаптации, когда Ку реакции дезаминирования серотонина резко снижется, имеет место разжижение липвдяой компоненты мембран (Уоа^се, ВсЬИпке, 1983). Другой повреждающий эффект ПОЛ состоит в образовании между белками и продуктами ПОЯ полимерных соединений - Шиффовых оснований, резкое увеличение которых обнаружено нами в мозге и плазме крови при гиперокоии.

Изменение субстратной специфичности МАО при различных экстремальных воздействиях связывают, главным образом, с окислением сульфгздрилышх групп фермента липвдлыми перекисями, что показано также в модельных опытах на высокоочищенных препаратах фермента (Горкин, 1979, 1985). В пользу того, что транс- ■ формация МАО происходит в результате обратимого окисления ВН-групп фермента липвдными порокисями, свидетельствуют и наши данные о восстановлении исходных свойств ?;5АО при обработке ми-. тохондрий, полученных от гипероксических животных аскорбиновой кислотой и предотвращение трансформации фермента мочевиной, препятствующей усилению процессов ПОЛ (Горошинская, Броновиц-кая, 1976),

Наряду о окислением зн -групп определенную роль при трансформации МАО может играть и состояние митохондриальных мембран Одновременное появление в цитозоле хлоргилинчувствительных се-ротонин- И глюкозаминдезаминазных активностей указывает на выход из митохондрий трансформированной МО типа А.

Таким образом, при изученных экстремальных состояниях изменение каталитических свойств МАО типа А, сопровождающееся изменением кинетики реакции, катализируемой ферментом, является результатом комплексного воздействия лилидных перекисей на сульфгидрильные группы самого фермента и на структуру и свойства митохондриальных мембран, приводящего к ослаблению связи МАО типа А с липидной компонентой мембраны и выходу фермента в цитозоль. При этом снижение активности МАО может быть обуслов-

лено как перераспределением активности фермента в компартмен-тах клетки, так и изменением каталитических свойств МАО, о чем свидетельствует снижение сродства фермента к субстрату.

Определенную роль в ингибировании МО типа А при сохранение активности ШО типа Б может играть табель нейронов (Oreiend et el., 1983), а также активация природных избирательно действующих ингибиторов МАО при экстремальных воздействиях (Glover et al., 1983).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

МАО является уникальным ферментом по крайней мере по двум аспектам: во-первых, по своей роли в организме и прежде всего в функционировании головного мозга, будучи единственным ферментом, с которым связана работа больиинства существующих в организме медиаторных систем и, во-вторых, по своей лабильности, способности изменять каталитические свойства при самых разных нарушениях внутренней и внешней среды. Кроме того, мо-ноаминокевдаза относится к типично мембранным ферментам, играющим первостепенную роль в развитии патологического процесса. Поэтому, изучая механизмы действия на организм разных экстремальных факторов, мы остановились на исследовании роли МАО в ответной реакции организма на стрессовые воздействия разной этиологии.

Изменение активности и субстратной специфичности МАО, обнаруженное нами при изученных экстремальных воздействиях, ведет к дискоордшации работы многих медиаторных систем. Ингибирова-ние МАО типа А, препятствуя нормальной терминации медиаторного действия моноамннов, обусловливает повышение функциональной активности сшпато-адрецаловой системы. Поскольку норадренер-гическая система оказывает тормозящее действие на ГАЖ-ерги-ческую систему мозга, являющуюся основной тормозной системой ЦНС, увеличение активности норадренергической системы ведет к растораагшзашю и усилению процессов возбуждения в ЦНС. Ломимо опосредованного норадренергической системой тормозного действия на ГАЖ-ергическую систему, ШО оказывает и прямое влияние на уровень тормозных медиаторов ГАЖ и гомокаряозина, осуществляя в условиях патологии их окислительное дезаминирование. Как показали опиты с ингибиторами, МО является одним из основных факторов, обусловливающих снижение ГМК, ди- и полиаминов при гипероксии, а также гипоксии и холодовом стрессе. 20

При всех изучении* воздействиях дучдам ковоприобретешшм еубстратом трансформированной МО типа А становится глюкозадт. Дбзаииниро£ание моиоаминоксидазой, по-видимому, является одной КЗ причин екткещш уровня глюкоззмина в мозге при гаперокоцц а Нарушения етруктури и проницаемости мембран, в состав которых ВХодят вмниоеахара» Следовательно, о одной стороны, повреядщ-¡Шб мембран может являться одним из факторов изменения мсмбра-«еевязанных ферментов» » *сом чиоле №0, е другой сторона, нэ-меаенпе каталитических свойств мв£§т, в оесю очорадь, способствовать дальнейшему иарупенйд мембрэнгшх структур.

Одйем из факторов, способствувшх усилений ПОЯ, является персиквь водорода, представляйся собой конечный продукт дея-телькоаув ?.'Л0. Катализируемая МАО реакция считается основным путем абрзав&эння Н202 в мозге (Si.net оЪ о1., 1880; Бегов! et а1., 1932)» Несмотря на с кике/же активности МАО типа А при острой гшсрзхшйи, гшоксическпх состояниях и холодовом стрсс-сс резкое уводпшше суммарногообъема реакций, катализируемых ферментом в рззул!/тате приобретения им способности дезакикиро-гать больше число азотсодержащих компонентов клетки, монет способствовать кабгн&чиой продукции перекиси водорода прп патологических оеатшглпх»

Ваянур роль В 2ШДйЗ!Шй и усилении процессов ПОЛ пграют не тсшл'й верекхеъ вэдеродз, но я другие продукты ноноаьвшокей- . Д38П0Й реакции. Наиболее активная стимуляция ПОЛ имеет «есто в екстеглэ с субстратами МО тала Бис субстратами трансформированной МАО типа А. Серотсшм, напротив, оказывает антпоксидант-ный эффект (Каган п др., 1984). Поскольку при гяпсроксии, гп-Покскк п холодовом стрессе интенсивность де'занвнпрованяя серо-тошша енплается при практически неизменной в мозге активности МО ТИИа В « многократном увелпчетш интенсивности дезамппири^ ваши Необичпик субстратов, создаются условия для усиления ПОЛ: система» еиазшзаэпшо стимулирующее деПствие ка ПОЛ, активно фукщпонкруют, а дезанпниросанпе серотонина, в процессе которого образуются продукта, обладающие актиокепдантнш действие:.', пагибируеТся. Тагав* образо», при исследованных экстремальных воздействиях возникает "порочкий НИИ*» йгрзшпй, по кнепо В.Е,Кагана я соавт. (1904), кайр Я рйЕ&ткн па-оологии. Ишадиация ПОЛ под «отпшгас фор:» шшсфдда

вызывает трансформацию Г/АО, э результате чего уосшюзтоп КОЛ,

которое, в свою очередь, вызывает дополнительную трансформацию МАО и, следовательно, лавинообразное накопление продуктов ПОЛ в биомембранах.

Важно отметить, что изменения МАО не первичны, а являются результатом происходящих при экстремальных воздействиях нарушений. Но затем изменение свойств МАО становится причиной последующих нарушений не только медиаторного обмена, но и структурных компонентов клетки.

Подтверждением роли изменения субстратной специфичности МАО в механизме развития патологического процесса является защитный эффект ингибиторов МАО при гипероксии.

Предполагаемая роль МАО в развитии патологии на примере наиболее изученной нами кислородной интоксикации показана на рисунке.

Представленные данные позволяют заключить, что при различных экстремальных воздействиях наблюдаются однонаправленные изменения активности и субстратной специфичности МАО. Общность реакции МО на изученные экстремальные воздействия и ее физиологические последствия определяются, во-первых, общими пусковыми механизмами и, во-вторых, структурой, локализацией и ролью МАО, обеспечивающей возможность включения фермента в обмен большого числа важнейших компонентов живых систем. Значимость изменений каталитических свойств МАО в ответной реакции организма на различные стрессорные факторы и в механизме развития патологии определяется главным образом ролью специфических и новоприобретенных субстратов и прежде всего тех медиа-торных систем, в метаболизме которых МАО участвует в норме или в обмен которых включается в результате происходящей с ней качественной модификации. Субстратами МАО, помимо медиаторов мо-ноаминовой природы, становятся ГАМК, гомокарнозин, гистамин. То есть работа практически всех основных медиаторных систем, кроме холинергической, начинает в значительной степени зависеть от состояния МАО. Важнейшими последствиями изменения каталитических свойств МАО при экстремальных воздействиях являются дискоорданация работы медиаторных систем, усиление процессов перекисного окисления липидов и нарушение структуры и проницаемости клеточных мембран.

Изучение механизма включения МАО в ответную реакцию организма на экстремальные воздействия позволяет рекомендовать использование препаратов, препятствующих изменению субстратной 22

Место моноаминоксидазы в развитии патологического процесса

Усилевие ПОЛ,

Окисление сульф-гвдрильных групп

Изменение субстратной специфичности МАО типа А

Экстремальное воздействие (гипероксия)

накопление в тканях липидных перекисей-»!

ч

Нарушение структуры и свойств мембран, \

"Снижение активности 1ЛА.0 типа Б в отдельных тканях

Снижение интенсивности дезаминирования норад-реналина и серотонина

Нарушение работы нор-адренерггческой и се-

Нарушение ГЭБ

ротонинергической ме-диаторных систем

Дезамишфование несвойственных субстратов^

Снижение^ Снижение Снижение Снижение Сникение содержа- содержа- содерна- содержа- содержания ГАМК ния гомо- ния пут- ния спер- ння ами-карноэина ресшша мидина носахаров

Нарушение

Нарушение работы ГАМК-ергической системы

рушение нормального соотношения процессов возбуждения и торможения в ЦК!

I

структуры глякояипи-дов и гла-копротешов

-Нарушение -обмена гистамина

J

Усиление образования Н202

го со

Рисунок

специфичности фермента {шпршер, обратимых ингибиторов МАО тиса А и пептида дельта-ша) при адаптации к экстремальным условиям существования и £ клинической практике. Клиничесщш испытания подтвердили перспективность применения пиразидола & качестве антихипероксического средства при лечении методом ГБО-терапщ,

В Н В О Д Ы

I. При гипероксии, гапоксической гипоксии» церебральной ишемии и холодовом стрессе снижается активность и изменяется субстратная специфичность МАО типа А мозга: фермент приобретает способность дезашшировать глюкозамин, ди- и полиашиш, гистаыин, ГАИК и гоыокарнозин.

Активность МАО типа Б не изменяется при гипоксии и холодо-воы стрессе,' незначительно ингпбируется в условиях гипероксии и только при ишемии снижается в равной степени с Ш0 типа А. . 2. При всех изученных экстремальных воздействиях снижается сродство фермента к моноаминам. При ишемии головного мозга кинетические кривые приобретают сложный негиперболический характер. Наибольшей чувствительностью к ишемическому воздействию по сравнению с другими отделами мозга обладает гиппокамп,

3. Вдавлена тканевая специфичность реакции МАО на гияерок-си). В мозге ингибируется преимущественно МАО типа А, в сердце, печени и крови - обе формы фермента, в легких только МАО типа Б, в почках достоверных изменений не обнаружено. Во всех изученных тканях МАО приобретает способность дезаминировать глшозашш.

4. При гипероксии, гипоксии и холодозом стрессе увеличивается интенсивность дезамнирования АМФ. Методом ингибиторного анализа показано, что только при гипоксии АМФ становится субстратом МАО типа А мозга. В условиях гипероксии и холодового

. стресса усиление, дезаминирования АМФ обусловлено активацией АМФ-дезалшназн. Введение АМФ животным оказывает защитный зф- ' фект при гипероксии, улучшая общее состояние животных, предотвращая изменение субстратной специфичности МАО типа А и стабилизируя мембраны.

5. Ингибиторы МАО типа А (хлоргилин и пиразидол), препятствующие изменения субстратной специфичности фермента, оказывают выраженный защитный эффект при гипероксии: улучшают общее состояние животных и увеличивают их выживаемость, оказывают ан-24

тигистаминний эффект, обладают антиоксидаитным действием и стабилизируют мембраны. Введение хлоргалина отдаляет наступление судорог. Пиразидол аптисудорожным действием не обладает п запшШает организм в основном от разлития легочной формы кислородной интоксикации.

6. Клинические испытания впервые показали перспективность применения пиразидола при лечении методом ГБО-терапии. 7 больных, получавших пиразидол, повышалась переносимость кислорода под повышенным давлением, на что указывали как клиническое состояние пациентов, так и отсутствие интенсификации перекидного окисления.липидов и дестабилизации мембран в крови. .

7. Для состояния холодовой адаптации характерно повышенно сродства МАО типа А к серотонину, нормализация субстратной специфичности фермента и стабилизация мембранных структур.

Введение животным пептида дельта-сна препятствует стресоор~ лш изменениям в организме на начальном этапе холодового воздействия. По свойствам МАО и ряду других параметров такиз п> во.тнке не отличаются от животных, адаптированных к холоду,

Холодовая адаптация повышает устойчивость организма к Я0- • слодуушчу гйперокоячоскому и тадоксическому вездеСотзаям. Хслоеомй отрэео, иапротиа, пог^эс? чуяочзэтголыюотъ к друга! вив ярема яыш аоздейвтваям.

8. Впервые установлено появлений моргилякчувстгйтсльной моноаминоксидазной активности в растворной фракции мозга при ■ экстремальный Еоэдайй^вигй, что указшгзет на паруизяг.а связи Ш.О С ЦеМЗрЭЙЙКЗ

Об нвмзезппп структуры и про!зтае?»оотя мембран при изучений экотрзмальнше воздействиях езядотадютйуют такяе даппые ?Л«ктроппой микроскопии и выход эрнтрощтзрвщ ферментов в оизоротку крови.

9. Совокупность впервые полученных эксперимент/штк дап-КУЗ мет основание полагать, что изменению каталитичпоэдй с£Э".37в Г/АО принадлежит ведущая роль в механизме ответной рс-аКЦКП организма на экстремальные воздействия. Следствием ш-гШШПИЯ активности п субстратной специфичности МАО являются • ггзт'пгпше процессов инактивации основных медиаторов ЦНС: нор-ояравэлпна, серотонииа, ГА!,И, гомонарнозина и гистакляа, ия~ теПОПфзкацшг перекиспого окисления лип ядов и нарупенке структур! в свойств мембран.

Защитный эффект ингибиторов МАО, адаптогенов и предварительной холодовой адаптации может быть использован в клинической практике и при адаптации к экстремальным условиям су-шествования,

Основное содержание диссертации изложено в следующих опубликованных работах,

1, Горошинская И,А, Активность моноаминоксидаз типа А и Б в условиях гипербарической оксигенации // Вопр. мед. химии. -1979, - 25, й 3, - 0,328-332.

2, Бондорекко Т,И,, Городинская И,А, Активность некоторых ые-г диаторных систем мозга при гипербаричеокой оксигенации // Физиологический журнал СССР, - 1979, - 65, № 8. - C.I2I4-1219.

3, Горошинская И,А., Шугалей В,С,, Внуков В,В., Могильницкая Л,В., Шерстнева И.Я, Перекисное окисление - фактор регуля-

■ ции активности ферментов // 1У Всесоюзный биохимический съезд (Ленинград, сентябрь 1979), - М,: Наука, 1979. -ТД. - 0,184-185,

4, Горошинская H.A., Броновицкая 3,Г, Активность и субстратная специфичность моноаминоксидазы в мозгу крыс при действии холода // Восьмая Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы (Минск, ноябрь 1980): Тезиоы докладов. -Минск; Наука и техника, 1980. - С,172-173.

5, Горошинская И,А., Ломакина Л.В., Анакян А,А., Шугалей B.C. Роль ферментативных систем головного мозга крыс при аккламации к холоду // Адаптивные функции головного мозга (Баку, октябрь 1980). - Баку; ЭЛМ, 1980. - 0,61.

.6, Горошинская И.А., Броновицкая 3,Г, Роль моноаминоксидазы в механизме развития гипероксического поражения // Известия Северо-Кавказского центра высшей школы, Естественные науки. - IS8I, -Л 3. - С,84-90.

7. Горошинская И,А., Кричевская A.A., Броновицкая З.Г. Влияние низкой температуры на активность и субстратную специфичность моноаминоксидаз в митоховдриальиой фракции мозга крыс // йолле'тень экспериментальной биологии и медицины, -1981. - 91, » 4, - С.431-433,

8. Броновицкая З.Г,, Бондаренко Т,И,, Горошинская И,А,, Милютина Н.П., СулеВыанов А.К., Шерстнева И.Я. Особенности ме-

таболической реакции структур мозга К гипербарической ок-сигенации // УП Международный конгресс по гипербаричоской медицина (Москва, сентябрь 1981). Тезисы. - М,: Наука, 1981. - С.189.

9. Горошинская И.А., Грабовскова Л.Л,, Броновицкая З.Г., Кри-чевская A.A. Активность моноаминоксидаз мозга при холодовой адоптации и совместном действии холода и гипербарооксигена-ции // Физиологический журнал СССР. - 1981. - 67, № XI. -C.I6II-I6I6.

10. Горошинская H.A., Броновицкая З.Г., Крячевская A.A., Каба-рухина Е.Г. Активность и субстратная специфичность моно- • аминоксидаз мозга крыс в условиях гипоксии // Нейрохимия. -1982. - I, № 3. - С.282-266.

11. Горошинская И.А., Броновицкая З.Г. Каталитические свойства моноаминоксидазн мозга крыс при экстремальных воздействиях // Девятая Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы (Ереван, ноябрь 1983). Тезисы научных сообщений. -

. Ереван: Изд-во АН Армянской СССР, 1983. - С.270.

12. Горошинская И.А., Ананян A.A. Сезонные особенности влияния низкой температуры на активность моноаминоксидазы мозга и чувствительность крыс к гипероксии // Физиологический журнал СССР. - 1983. - 69, 3 8. - C.I079-I084.

13. Горошинская И.А., Ананян A.A., Броновицкая З.Г., Шуга- . лей B.C. Активность глшозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови крыс при гипероксии, гипоксии и холодовом воздействии Ц Вопр. мед. химии. - 1984. - 30, № I. - С.60-64.

14. Щугалей B.C., Ананян A.A., Могилышикая Л.В., Горошинская И.А. Биохимическая диагностика и пути коррекции состояния солодового стресса и холодовой адаптации // Стресс, адаптация и функциональные нарушения (Кишинев, июнь 1984). Тезисы всесоюзного симпозиума. - Кишинев: Штииниа, 1984. -С.312.

15. Кричевская A.A., Бондаренко Т.И., Горошинская И.А., Крупен-никова Е.Б., Михалева И.И., Ходакова A.A. Антистрессорный эффект пептида дельта-сна // Стресс, адаптация и функциональные нарушения (Кишинев, июнь 1984). Тезисы всесоюзного симпозиума. - Кишинев: Шткинца, 1984. - С.343. .

16. Горошинская И.А., Цветненко Е.З., Ходакова A.A., Френкель М.Л, Защитный эффект хлоргилина в условиях гипербари-

ческой оксигенации // Фармакологическая коррекция кисло-родзависимых' патологических состояний (Москва, октябрь 1984), Тезисы докладов 1-го Всесоюзного симпозиума. - М,,

1984. - С.173-174.

17. Броновидкая З.Г., Горошинская И.А. Защитное действие АМФ при гипербарооксигенации и ее влияние на свойства некоторых ферментов // Фармакологическая коррекция кислородза-висимых патологических состояний (Москва, октябрь 1984). Тезисы докладов 1-го Всесоюзного симпозиума. - М., 1984,-С.168-169.

18. Горошинская И.А., Ходакова А.А,, Коробова Л.Н., Френкель М.Л., Немашкалова Л.А. Активность моноаминоксидаз и диаминоксидазы в тканях крыс в судорожную фазу кислородной интоксикации // Научные доклады Высшей школы. Биологические науки. - 1984. - й II. - С.20-24.

19. Горошинская И.А., Федоренко Г.М., Ходакова А.А. Исследова-• иие активности ыоноаминоксидазы и ультраструктуры головного мозга крыс при холодовом воздействии // Нейрохимия. -

1985. - 4, J» 2. - С.134-140.

20. Горошинская И.А. Моноашшоксидазная активность мозга крыс при холодовом воздействии // Укр. биохимич. журнал. -1985. - 57, й I. - С.41-45.

21. Горошинская И.А. Возможный механизм изменения каталитических свойств ыоноаминоксидазы мозга крыс // Еюлл. эксперта, биологии и медицины. - 1985. - 99, И 6. - С.672-674.

22. Goroshinskaya I.A,, Eakifc L.H., Krichevskaya А.А. Hat brain monoamine oxidase catalythic properties under extreme conditions // Phospholipids in the Nervous Bystea: Biochemical and Molecular Pharmacology (Mantova, Italy,' May, 1935). Abstracts. Mantova, 1985. - F.91-

23. Miiifc D.V., Gorosinskaya I., Stojanoviô T,, Mrsulja B.Ii. Monoamine oxidase, cytochrome С oxidase and acetylcholine esterase activity in brain mitochondria and synaptosonee during ischemia // VI Balkan Biochemical and Biophysical Daye (Plovdiv, Bulgaria, april 1985). Abstracts. - Plovdiv, 1985. - P.6.

24. Goroshinskaya I.A., Stojanoviê T., Hibife D.V. , Mrsulya B„B. The activity and kinetics of monoanine oxidase during brain ishemia // XIII Congress of the Union of Yugoslav

ÎTiyolol6£iorl Societies With international participation (atopic, Bisoalcvia, September 1985). Abstracts. Skopie, 1935. - P.31.

¿5, äowsliißeJtaya I.A., Boki6 Zj. îlcdiator netebolica regulo-tiea fcy eonoecine oxidesо typo Л and В in rat brain during cold cdaptotion // Ш1 Concresa of the Onion of Yucoslav rtiiciolejjical Societies with international participation (Glsopie, Tugoslevia, Septenber 1985). Abstracts. Skopie, 1935. - ?.300.

26. Oorochinskaya I.A.,. Tsvetnenko E.Z., Krichevskaya A.A., Rofeiè L.îi. Polyandrie level and monoaaiineoxidase activity of rat brain under hyperbaric oxygen // IBC8 Med. Sei. -1985. - 13, H 7. - P.673-67'*.

2?. Goroehinakaya I.A., Hodakove A.A., Tsvetnenko E.Z., Habib Lj. Monoaaina oxidase activity and level of histeaine end polycaino under sosie extrene conditions // IBCS tied, nci. - 1935. - 13, H 10. - P.999-1СЮО.

■ 23. Goroshinckaya I.A., Hodakova A.A. Rat brain oonoaains oxidase catalytic properties and histaaine level during cold ctress and cold adaptation // fJolecular baoiß of îîeuro-trancaiasion (Prague, CsSSH, Septenber 1966). The Sixth Meeting of the European Society for Heurochemistry. Prague, 19B6. - P.1&V.

29. Крячегская A.A., Гороазшская 'A.A.. Фодореаяо Г .M., Ходако-гэ Л .Л. Активность монсакикокоддази я ультрз структура го-лобного мозга крыс при разных резаках гпперскслп // Нейро-мяя. - ÎS8S. - 5, № I. - С.37-44,

Горостиская И.А., Ходакова A.A. Активность ьюноамзяоксидаз и уровень гиствыина в ыозгу крце при холодовом воздействии // Известия СКНЦ БШ. Естественные науки. - 1986. - й 2. -С.II9-122.

3Ï. Гороштнская И.А., Шерстнев К.Б. Влияние хлоргилина на уровень гшма-аминоиасляной кислоты при потероксип // Балл, эксперкм. биологии п медицины. - 1985. 101, Ji I. - С.45-46.

32. Гороштнская И.А., Цвегненко Е.З., Ходакова A.A., Френкель М.Л., Горкин В.З. Мопоакипоксидазкая активность п влияние хлоргилика на уровень поляаминов при гиперокски у крнс и Укр. биохзш. а. - 1986. - 58, » 3. - С.74-77.

33, Кричевская A.A., БондареДко Т.И,, Горошинская И.А., Хода-кова A.A., Михалева И .И., Крупеишжова Е.Ю. Влияние пептида дельта-сна на активность моноаминоксидаз и содержание гисташна в ыозгу и крови крыо при действии холодового стресса // Нейрохимия. - 1986. - 5, Н. - С.408-412.

34. Горошинская И.А., Кричевская A.A., Шугалей B.C., Шерст-нев К.Б., Баламирзоева P.M. Активность моноаминоксидазы и уровень гаыма-ашшомасляной кислоты при гипероксии, влияние хлоргилина // Вопросы мед. химии. - 1986. - 32, й 2. -С.76-79.

35* Горошинская И.А., Милютина Н.П., Бежанова В.А, Антиокси-дантный эффект хлоргилина при действии гипероксии // П Всесоюзная конференция "Биоантиоксидант" (Москва, май 1986). Тезисы докладов, т.1. - Черноголовка, 1986. -С.112.

36. Горошинская И.А., Ананян A.A., Могяльницкая Л.В., Цветнен-. ко Е.З., Шугалей B.C. Биохимические показатели дифференда-

ровки холодового стресса и адаптации // Важнейшие теоретические и практические проблемы терморегуляции (Минск, сентябрь 1986). Тезисы докладов П Всесоюзной конференции. -Минск, 1986. - С.74.

37. Горошинская И.А., Милютина Н.П., Ходакова A.A., Цветнен-ко Е.З., Горкин В.З. Влияние хлоргилина на интенсивность перекисного окисления липвдов и стабильность эритроцитар-ных мембран при гипероксии // Взлл. эксперт, биол. и медицины. - 1987. - 103, W I. - С.54-56.

38. Горошинская И.А., Цветненко Е.З., Френкель М.Л., Ходакова A.A., кричевская A.A. Моноаминоксидазная активность и содержание гистамина и полиаминов мозга при некоторых экстремальных воздействиях // Укр. биохим. я. - 1987. - 59, »2, - С.84-86.

39. Горошинская И.^.» Ананян A.A., Могильницкая Л.В., Шугалей B.C. Биохимические показатели дифференцировки холодового стресса и адаптации // Вопр. мед. химии. - 1987. -33, » 4. - C.62-S5.

40. Броновицкая З.Г., Горошинская И.А., Крючкова Е.Ю. АМФ-дев-аминаза мозга и введение АМФ при гипероксии и действии холода // Фундаментальные достижения нейроышии - медицине. X Всесоюзная конференция по биохимии нервной системы

(Горький, сентябрь 1067). Тезисы докладов. ~ Горький, 1987. - С.31.

41. Горошпская И. Д., Рули it Г, И. Дляяшю холодоваЙ адаптации и кратковременного действия ХОЛоДа на УСТОЙЧИВОСТЬ яивот-ннх к гипоксическоА гипоксия // Физнол. а. ССОР» - 1987.

- 73, № 4. - С.532-536.

42. Горопшнская И.А., Ананян A.A., Щугалэй B.C., Крачевская A.A. Биохимические показатели чувствительности адаптированных к холоду животных к действию пшороксйй // Био-логич. науки. Научные доклады высшей щвояи* - 1Ш7. -

№ II. - С.54-59.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В АВТОРЕФЕРАТ СОКРАЩЕНИЙ

АМФ - аденозин-5' -конофосфат

ВЭГ - внеэритроцитарный гемоглобин

ГА1ДС - гемма-аминомасляяая кислотя

ГБО - гипербарооксигенация

Г6ФДГ - глюко зо-6-фосфзгдегядрэге/иэа

ГЭБ - геыатозндефэлическяЯ бартер

МАО - моноамилоксдазэ

ПОЛ ~ всртжнво окксятт липадов

СШ - в'днщтя верексидазная активность

ШС - центральная нервная система

Км - константа Михаэлиса

- максимальная скорость реащш