Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс

Разыграев, Алексей Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РАЗЫГРАЕВ Алексей Вячеславович

УЧАСТИЕ ФЕРМЕНТОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА

МОНОАМИНОВ В ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ САМОК КРЫС

03.00.13 - физиология человека и животных 03.00.04 - биохимия

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1633Э4

Санкт-Петербург

2007

003163394

Работа выполнена в лаборатории перинатальной биохимии Института акушерства и гинекологии им Д. О. Отта РАМН.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Арутюнян Александр Вартанович Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Клименко Виктор Матвеевич доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович Ведущее учреждение

Институт физиологии им. И П Павлова РАН

Защита состоится « 31 » ЯпЯ, _2008 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 212 23210 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, С -Петербург, Университетская наб , 7/9, ауд 90.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им А.М Горького Санкт-Петербургского государственного

университета.

Автореферат разослан «2-8 » 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема регуляции репродуктивной функции женского организма является одной из сложнейших в функциональной биохимии Особого внимания заслуживает функционирование сложно организованной гипоталамической системы, обеспечивающей синтез и секрецию ключевого регулятора половой цикличности - гонадолиберина (LHRH), рилизинг-гормона, стимулирующего выработку гонадотропинов гипофиза.

Установлено, что максимальный уровень LHRH в крови самок млекопитающих приурочен к определенному времени репродуктивного цикла, а именно, к периоду, предшествующему овуляции У самок крыс пик секреции LHRH происходит в вечернее время на стадии проэструса Одним из условий формирования данного пика является повышение в крови содержания половых стероидов Другое условие, связанное с первым - ежедневно поступающий сигнал от внутреннего таймера, локализованного в супрахиазматических ядрах (СХЯ) гипоталамуса, при этом функция СХЯ также модулируется стероидами (Kennaway, 2005)

Перикарионы специализированных гонадолиберинэргических нейронов в головном мозгу крыс локализованы преимущественно в медиальной преоптической области (МПО); большая часть терминалей данных нейронов проецируется в срединное возвышение (СВ) гипоталамуса, откуда происходит секреция LHRH в кровь (Rivest, Rivier, 1995) Процессы синтеза и секреции LHRH находятся под контролем многочисленных нейромедиаторных систем, среди которых основная роль отводится пептидэргическим и моноаминэргическим системам (Бабичев, 1995). В упрощенном виде представления о вкладе моноаминэргических систем сводятся к следующему, норадреналин и дофамин считаются позитивными регуляторами синтеза LHRH в медиальной преоптической области (в особенности это относится к норадреналину), что же касается секреции LHRH, то дофамин, в противоположность норадреналину, рассматривается как негативный регулятор В отношении серотонина известно ингибирующее влияние на продукцию LHRH. Для различных моноаминов показано наличие изменений в их содержании и секреции в МПО и медиальном базальном гипоталамусе на стадии проэструса, приуроченных к вечернему времени, что связывают с осуществлением их ретуляторной роли в отношении формирования пика LHRH (Thyagarajan et al, 1995, Mohankumar et al, 1995) Также неоднократно был продемонстрирован факт снижения содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах (включая СВ) при старении, что рассматривают как одну из причин развития возрастной дисфункции гипоталамического контроля работы репродуктивной системы (Simpkms et al, 1977, Cano et al, 2001)

Один из основных путей деградации данных нейромедиаторов - путь окислительного дезаминирования, катализируемого

моноаминоксидазами (МАО) Ряд сведений указывает на вовлеченность МАО преоптической области самок крыс в формирование преовуляторного пика секреции LHRH (Alleva et al., 1966, Lima et al, 2007, Yamamoto et al, 1974) В частности, использование паргилина (ингибитора МАО) вызывает отмену преовуляторного пика лютеинизирующего гормона у крыс наряду с повышением содержания серотонина, норадреналина и дофамина в МПО При этом истощение содержания серотонина путем микроинъекций 5,7-дигидрокситриптамина в МПО ведет к усилению секреции лютеинизирующего гормона у овариэктомированных крыс, обработанных эстрадиолом и прогестероном (Lima et al, 2007)

Однако, неизвестно, происходят ли изменения активности МАО в МПО и СВ в преовуляторный период, обуславливающие формирование обнаруженных ранее ритмов содержания моноаминов в данных областях. В связи с этим актуальной является задача исследования динамики активности МАО в МПО и СВ во второй половине дневной фазы суток, соответствующей преовуляторному периоду эстрального цикла

К настоящему времени известно, что во многих областях головного мозга крыс, в частности, в целом гипоталамусе, при старении наблюдается повышение активности МАО (Bhaskaran, Radha, 1983, Meites, 1992) Поскольку в отдельных областях гипоталамуса при старении наблюдается снижение содержания моноаминов, регулирующих репродуктивную функцию, актуальной является задача изучения возрастной динамики активности МАО в МПО и СВ. Данные о возрастных изменениях активности МАО в МПО и СВ будут способствовать пониманию роли данного фермента в возрастном становлении и угасании репродуктивной функции

Актуальным является поиск ответа на вопрос о вовлеченности МАО в механизмы воздействия соединений, обладающих гонадотропным эффектом Экспериментальные исследования показали, что при воздействии антигонадотропного соединения 1,2-диметилгидразина (ДМГ) и гормона эпифиза мелатонина, обладающего прогонадотропным эффектом у половозрелых животных, наблюдаются изменения содержания моноаминов в гипоталамических структурах (Анисимов и др, 1976, Керкешко и др, 2001) Однако, неизвестно, как влияют данные соединения на активность МАО в данных областях Также получены сведения о том, что комплексный пептидный препарат эпифиза эпиталамин способен восстанавливать циклическую активность яичников и фертильность у стареющих самок крыс (Анисимов, 2003, Khavinson, 2002). В то же время неизвестно, что происходит с активностью МАО в гипоталамических структурах, ответственных за продукцию LHRH, при воздействии эпиталамина (а также препарата, синтезированного на

основе изучения аминокислотного состава эпиталамина - тетрапептида эпиталона)

Начиная с 1980-х годов появились сведения о том, что функционирование МАО тесно связано с активностью глутатионпероксидаз (ГПО) - основных ферментов, метаболизирующих пероксид водорода в головном мозгу, являющийся одним из продуктов моноаминоксидазной реакции (Maker et al, 1981, Cohen et al., 1997). Можно предположить наличие корреляционной связи между активностями МАО и ГПО Экспериментальная проверка данного предположения является актуальной, поскольку в случае наличия высокодостоверной корреляционной связи в исследуемых областях активность ГПО будет являться дополнительным показателем потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов, ответственных за регуляцию продукции LHRH

Однако, к настоящему времени, отсутствуют адекватные методы определения МАО и ГПО в микроструктурах головного мозга (в связи с чем понятно отсутствие сведений по изложенным вопросам в литературе).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью представляемого исследования являлось изучение в экспериментах на самках крыс роли моноаминоксидаз в регуляции репродуктивной функции женского организма на уровне гипоталамических структур, участвующих в продукции гонадолиберина.

В соответствии с целью были поставлены задачи.

1 оптимизировать условия определения активности моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы для работы с микроанатомическими структурами головного мозга,

2 исследовать суточную динамику моноаминоксидазной активности в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс в преовуляторный период;

3 исследовать возрастную динамику активности моноаминоксидазы в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс;

4. изучить влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на активность моноаминоксидазы в ответственных за регуляцию репродукции областях гипоталамуса самок крыс; 5 оценить связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы в ткани головного мозга, в том числе в областях, отвечающих за продукцию гонадолиберина.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1 Оптимизированные способы определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей позволяют корректно исследовать активности данных ферментов в микроструктурах головного мозга и

могут быть использованы для оценки потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов

2 Становление и угасание репродуктивной функции сопряжено с изменениями активности моноаминоксидазы в микроструктурах гипоталамуса, ответственных за продукцию гонадолиберина

3 Соединения, обладающие гонадотропным эффектом, влияют на моноаминоксидазную активность в медиальной преоптической области-соединение с антигонадотропными свойствами (1,2-диметилгидразин) снижает активность фермента, вещества с прогонадотропным эффектом повышают (мелатонин) или оказывают протекторный эффект (эпиталамин) на активность моноаминоксидазы

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Представлен новый способ определения моноаминоксидазной активности, основанный на реакции окисления кинурамина с детекцией увеличения концентрации продукта реакции 4-гидроксихинолина при 327 нм Данный метод позволяет определять активность моноаминоксидазы в микроанатомических структурах головного мозга, в том числе ответственных за регуляцию репродуктивной функции Описан новый подход для определения селензависимой глутатионпероксидазной активности, сочетающий использование пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), который применен для изучения глутатионпероксидазной активности ткани головного мозга, в том числе в микроанатомических образованиях.

Впервые описано распределение моноаминоксидазной активности в ткани головного мозга крыс с применением представленного в диссертации метода определения активности МАО.

Описана неизвестная ранее возрастная динамика моноаминоксидазной активности в структурах, отвечающих за синтез и высвобождение гонадолиберина.

Впервые изучено воздействие обладающего нейротоксическими свойствами энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина на уровень активности моноаминоксидазы в преоптической области гипоталамуса самок крыс При этом обнаружен ингибирующий эффект однократной внутрибрюшинной инъекции данного соединения на активность фермента

Впервые обнаружено, что внутрибрюшинное введение мелатонина приводит к сильно выраженному повышению активности моноаминоксидазы в ткани преоптической области гипоталамуса

Обнаружен неизвестный ранее протекторный эффект инъекций эпиталамина на активность моноаминоксидазы в медиальной преоптической области у крыс, направленный против ингибирующего действия 1,2-диметилгидразина

Впервые выявлена высокодостоверная обратная зависимость между активностями немитохондриальной моноаминоксидазы и селеновой

митохондриальной глутатионпероксидазы б ткаки головного мола Выявлена отрицательная корреляционная связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы срединного возвышения.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Представленные микрометоды определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей расширяют возможности дальнейшего исследования данных ферментов Методы характеризуются простотой воспроизведения и использованием недорогих реактивов, пригодны для работы с микроанатомическими стуктурами головного мозга, с отдельными субклеточными фракциями и позволяют решать многие исследовательские задачи. Всего этого зачастую нельзя сказать о многих альтернативных методах Предложенный способ определения активности глутатионпероксидазы характеризуется более высокой селективностью в отношении селеновых изоформ фермента, чем широко используемые методы с применением органических перекисей, что позволяет более корректно судить о селензависимой глутатионпероксидазной активности.

Проведенные исследования способствуют большей детализации представлений о центральной регуляции репродуктивной функции женского организма и дают основание для суждений о значимости моноаминоксидазного компонента в системе гипоталамического звена регуляции данной функции. Полученные данные об эффекте воздействия ксенобиотика 1,2-диметилгидразина мотут быть учтены при оценке влияния антропогенных экологических факторов, включающих наличие в окружающей среде соединений сходной химической природы. Результаты изучения эффекта хронического введения мелатонина указывают на необходимость глубокого изучения влияния потребления данного соединения на гипоталамические механизмы контроля репродуктивной функции. Обнаруженный в данном исследовании эффект, выражающийся в существенном повышении активности моноаминоксидазы в преоптической области, должен быть учтен при разработке клинических подходов применения гормона эпифиза. Выявленное протекторное действие эпитал амина на активность моноаминоксидазы подтверждает уже известный факт нормализующего эффекта данного препарата в отношении репродуктивной функции, что может указывать на адекватность применения эпиталамина в клинической практике для коррекции нарушений в гипоталамической регуляции работы репродуктивной системы. Обнаруженная высокодостоверная зависимость между активностями

немитохондриальной моноаминоксидазы и митохондриальной глутатионпероксидазы позволяет далее рассматривать последнюю как дополнительный параметр, отражающий потенциально возможную скорость окислительной деградации моноаминов в ткани головного мозга

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях лаборатории перинатальной биохимии ГУ НИИАГ им Д О Отта РАМН (2006, 2007 гг) Результаты исследования внедрены в практику работы лаборатории Апробация диссертации состоялась на научном заседании кафедры Физиологии человека и животных биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований (в том числе обсуждение полученных результатов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, иллюстрирована 32 рисунками Библиографический указатель включает 200 наименований, в числе которых 39 отечественных и 161 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 268 крысах-самках линии Вистар из питомника «Рапполово» РАМН Животные содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света 12 ч темноты (дневная фаза - с 7:00 до 19.00 летнего времени)) и получали стандартный корм и воду

Топографическая идентификация анатомических образований осуществлялась с использованием атласов анатомии головного мозга крыс (Paxinos, Watson, 1982, Swanson, 1992)

Оптимизация способов определения активности ферментов для работы с микроструктурами головного мозга крыс. Предварительная обработка биологического материала Микроанатомические структуры выделяли из мозга декапитированных животных, охлажденного в жидком азоте (участки, соответствующие маммилярному телу, медиальной преоптической области, срединному возвышению и паравентрикулярным ядрам гипоталамуса) Ткань гомогенизировали в 0,32 М растворе сахарозы, приготовленном на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8 (для определения активности ГПО гомогенизацию ткани осуществляли также в буфере без сахарозы) Для проведения моноаминоксидазной реакции использовался супернатант, полученный в результате центрифугирования гомогенатов при 1000 g в течение 10 мин. Для определения активности растворимой ГПО супернатант подвергали повторному центрифугированию в течение 5 минут при 15000 g, осадок отбрасывали

Оптимизация метода определения моноаминоксидазной активности Прототипом предлагаемого способа определения активности МАО является метод, описанный в работе (Weissbach et al, 1960) с

использованием кинурамина в качестве субстрата Упомянутый метод основан на измерении убыли концентрации кинурамина (при 360 нм), при окислении которого формируется 4-гидроксихинолин (вследствие спонтанной внутримолекулярной циклизации промежуточного продукта) В вышеуказанной работе также обращается внимание на возможность определения активности МАО по приросту концентрации 4-гидроксихинолина, на основании чего и проводилась оптимизация способа определения активности фермента В результате предварительного снятия спектрограмм реакционной смеси установлено, что 4-гидроксихинолин имеет два максимума поглощения при длинах волн 315 и 327 нм В настоящем варианте метода прирост концентрации данного продукта регистрируется при 327 нм

Реакционная среда представляла собой раствор кинурамина в 0,05 М фосфатном буфере, рН7,8. Конечная концентрация кинурамина -0,19 мМ (В методе (Weissbach et al., 1960) используется более низкая концентрация кинурамина (0,11 мМ), что, согласно литературным данным, не обеспечивает насыщение МАО (Горкин, 1981))

Реакция проводилась в специальных кюветах объемом 1 мл с длиной оптического пути 1 см К 730 - 750 мкл раствора кинурамина (0,192 -0,198 мМ) добавляли супернатант гомогената ткани до объема 760 мкл (конечная концентрация белка 16 - 375мкг/мл) и тщательно перемешивали. В холостую пробу вместо биологического материала вносили раствор сахарозы в фосфатном буфере, использовавшийся для приготовления гомогенатов Инкубацию проводили при 37 °С, периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм, тщательно перемешивая пробы перед измерением

Активность МАО выражали в нмолях окисленного кинурамина/мин/мг белка Для этого использовали экспериментально найденное нами соотношение (равное 1,88) между приростом оптической плотности при 327 нм и одновременной убылью оптической плотности при 360 нм, происходящими вследствие увеличения концентрации продукта (4-гидроксихинолина) и сопряженного с ним снижения концентрации субстрата (кинурамина) Это позволяло использовать раствор кинурамина в качестве стандарта, определяя его концентрацию по величине оптической плотности при 360 нм.

Содержание белка определяли в реакционной среде после окончания инкубации по методу, описанному в работе (Vera, 1988), регистрируя оптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствия кинурамина при более коротких длинах волн Использование данного метода было вызвано необходимостью вносить практически весь супернатант, полученный при предварительной обработке гомогенатов микроструктур, в реакционную смесь При этом широко используемый метод (Lowry et al., 1951) не позволяет исследовать содержание белка в реакционной смеси по причине

взаимодействия кинурамина с реактивами, применяемыми в вышеупомянутом методе, с развитем синего окрашивания

Пригодность метода (Vera, 1988) для использования в настоящем исследовании была предварительно подтверждена нами посредством изучения точности и чувствительности метода Показатель точности опыта Р=(т/М)*100% при четырех параллельных определениях составляет 0,49% Поскольку эмпирическое значение Р значительно меньше 2%, определения выполняются при помощи данного метода с высокой точностью Чувствительность метода при регистрации развившейся оптической плотности при 500 нм составляет 2 мкг/мл, т е является довольно высокой

Оптимизация условий определения глутатионпероксидазной активности Прототипами предлагаемого способа определения активности ГПО являются 1) метод определения активности фермента с использованием трет-бутилгидропероксида в качестве

восстанавливаемого глутатионом субстрата и регистрацией убыли глутатиона с применением 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) (Моин, 1986), 2) метод с использованием пероксида водорода в качестве восстанавливаемого субстрата с добавлением в реакционную среду глутатионредуктазы и НАДФН и регистрацией убыли НАДФН, восстанавливающего окисляемый в глутатионпероксидазной реакции глутатион (Hill et al, 1997)

В настоящем методе осуществлялось совмещение использования пероксида водорода в качестве субстрата и DTNB для регистрации убыли GSH

Определение активности проводилось при рН 7 4 (трис-HCl буфер 0,05 М, содержащий 5 мМ ЭДТА) Использовались следующие концентрации субстратов в реакционной смеси глутатион GSH — 1 мМ, пероксид водорода - 390 мкМ Согласно литературным данным, выбранная концентрация пероксида водорода обеспечивает насыщение селеновых ГПО при миллимолярных концентрациях GSH (Кулинский, Колесниченко, 1993) Концентрация азида натрия (ингибитора гемопротеинов, обладающих пероксидазной активностью) составляла 10 мМ К 890 мкл раствора глутатиона и азида натрия в трис-HCl буфере добавляли 90 мкл супернатанта гомогената При использовании меньших объемов гомогената объем доводили фосфатным буфером для приготовления гомогенатов Пробы преинкубировали в течение 5 мин, после чего реакцию запускали внесением в реакционную смесь раствора пероксида водорода (20 мкл 18 мМ водного раствора), обеспечивающего конечную концентрацию перекиси в реакционной смеси, равную 390 мкМ Инкубация проводилась при 37°С, после чего вносили 110 мкл 50%ТХУ (до конечной концентрации 5% для осаждения белка и терминации реакции) После центрифугирования при 3000 об /мин в течение 10 мин 200 мкл супернатанта добавляли к 2,45 мл трис-HCl

буфера (0,1 М, рН 8 5, с 0 34М ЭДТА) с последующим добавлением 25 мкл 0,01 М раствора DTNB Через 7,5 мин пробы фотометрировали при 412 нм В контрольную (для регистрации неферментативного окисления GSH) и стандартную (для регистрации исходной концентрации глутатиона) пробы вместо супернатанта гомогената вносили фосфатный буфер В стандартную пробу вносили ТХУ сразу после добавления пероксида

Рассчет активности (в нмолях GSH/мин/мг белка) проводили с учетом оптической плотности опытной, контрольной и стандартной проб, разведения биологического материала

Содержание белка в биологическом материале определяли по методу (Lowry et al, 1951). При использовании малых количеств биологического материала (ткань СВ) осажденный при добавлении ТХУ в реакционную смесь белок сразу после окончания центрифугирования растворяли в INNaOH, после чего определяли (с учетом разведений) концентрацию белка по методу (Vera, 1988) Метод (Lowry et al, 1951) в таком случае

непригоден по причине наличия в растворе GSH и GSSG

* * *

Для проверки пригодности описанных условий для корректного определения истинной ферментативной активности исследовалась зависимость количества образовавшегося продукта (в методе определения активности МАО) и израсходованного в ферментативной реакции субстрата (GSH в методе определения активности ГПО) от времени инкубации (скорость реакции), также изучалась зависимость скорости ферментативной реакции от содержания белка в реакционной смеси Линейность зависимостей оценивалась с использованием величины достоверности аппроксимации (R2)

Для оценки точности используемых методов применялся показатель точности опыта (Р), в каждом случае проводили по 3 повторных определения (п)

Чувствительность определялась как минимальная ферментативная активность, которая достоверно различается со средним значением контрольных измерений

Общая схема серии экспериментов После проверки пригодности вышеописанных методов для работы с микроанатомическими структурами проводили предварительное изучение распределения активности МАО среди структур головного мозга и нейроэндокринной системы. Далее в структурах, ответственных за продукцию гонадолиберина, проводили изучение уровней активности МАО в преовуляторный период, исследование возрастной динамики активности МАО, влияния веществ, обладающих гонадотропными эффектами, на активность МАО во фронтальном участке МПО (содержащем максимальную плотность сосредоточения перикарионов

гонадолиберинэргических нейронов) и исследование корреляционных связей между активностями МАО и ГПО

Статистическую обработку данных выполняли с использованием t-критерия Стьюдента, Т-критерия Уайта, Х-критерия Ван-дер-Вардена и двухфакторного дисперсионного анализа (пакет программ «Statistica 5 0») Для исследования корреляционных связей использовали коэффициенты корреляции Спирмена (rs) и Пирсона (г)

Изучение распределения активности МАО среди анатомических структур. Эксперимент выполнен на половозрелых самках (вес 273,1 ± 26,7 г (М ± SD), п =-' 32) Декапитация крыс проводилась в период с 5 ч от начала экспериментальной дневной фазы до ее окончания

Из головного мозга для определения активности МАО выделяли следующие области ряд шпоталамических образований (СВ с окружающей тканью, МПО и маммилярное тело), корковый участок обонятельных бугорков, миндалины, дорсальное ядро шва и locus coeruleus с окружающей тканью МПО выделяли в виде участка тетраэдрической формы, вентральная поверхность которого примыкает к дорсальной стороне оптической хиазмы СВ с окружающей тканью выделяли в виде участка ткани четырехугольно-пирамидальной формы, основание которого содержало собственно срединное возвышение

Для оценки вклада изоферментов МАО (А и В) в общую активность использовали R-депренил в концентрации, ингибирующей специфическую активность МАО В (0,002 мМ)

Изучение динамики активности моноаминоксидазы в преовуляторный период в структурах, ответственных за продукцию гонадолиберина. В условиях циклического освещения (12 ч света 12 ч темноты) декапитацию животных производили в периоды времени, соответствующие 5 - 5,5, 9,5 - 11,5 часам от момента включения света для сопоставления с выявленной ранее в аналогичных условиях динамикой содержания биогенных аминов

Использовали животных (п=32), находящихся в определенных стадиях эстрального цикла Сравнивались стадии диэструс-2 и проэструс как следующие друг за другом фазы цикла, в последней из которых происходит пик секреции LHRH Стадии цикла определяли по соотношению клеток 3 типов, присутствующих в вагинальных мазках (Marcondes, 2002) Правильность определения стадий эстрального цикла контролировалась посредством определения уровней эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови с использованием радиоиммунного анализа (Jurjens et al, 1975, Smith et al, 1975) Также визуально оценивалась степень обводненности матки для подтверждения правильности определения стадий цикла

Для исследования активности МАО использовались участки гипоталамуса (МПО, СВ с окружающей тканью) и ольфакторные бугорки (серое вещество) (Ольфакторные бугорки (ОБ) являются областью относительно большого содержания тел ЫЖН-нейронов (МегсЬепЙгаЬг е1 а1, 1984))

Изучение возрастной динамики активности моноаминоксидазы в анатомических структурах. Для эксперимента использовались крысы трех возрастных групп Первую группу составили самки в возрасте 1,5 — 2 месяцев (массой 84,0 ± 22,1 г (М ± 8Б)) Данный возраст представляет перипубертатный период онтогенеза самок крыс Указанный период охватывает время открытия влагалища и формирования эстральных циклов (Бабичев, 1981) Вторая группа — 4-5-месячные половозрелые крысы (средний возраст, характеризующийся оптимальным функционированием репродуктивной системы) (масса 241,8 ± 12,5 г (М ± 8Б)) В третью группу входили животные в возрасте более 12 месяцев (стареющие крысы) (масса 311,5 ± 18,3 г (М ± ББ)). Старение у крыс начинается с 7 по 10 месяцы жизни и в возрасте более 12 месяцев охватывает механизмы гипоталамо-гипофизарного контроля репродуктивной функции, выражаясь в изменении продукции гонадолиберина, снижении уровня стероид-индуцированного выброса лютеинизирующего гормона и других явлениях, сопровождающих переход в состояние ацикличности (Войтенко, 2002, йоге е1 а1,2000)

Все животные (п = 31) были декапитированы в один день в период с 5 ч до 11 ч дневной фазы экспериментальных суток с чередованием крыс из разных возрастных групп Головной мозг извлекали, охлаждали до 0°С, после чего подвергали замораживанию при -65°С

Все анатомические структуры одного и того же вида (МПО, СВ с окружающей тканью, а также ольфакторные бугорки и эпифиз) подвергались каждому из отдельных этапов обработки в один и тот же день

Исследование ферментативной активности в пробах одного вида проводилось в одной серии определений То же относится к определению концентрации белка в реакционной смеси

Изучение влияния 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на активность моноаминоксидазы во фронтальной части медиальной преоптической области. При исследовании влияния внутрибрюшинных инъекций ДМГ и мелатонина на активность МАО ориентировались на специально разработанную схему отдельного и сочетанного воздействия (таблица)

Таблица

Схема проведения инъекций в экспериментальных группах самок крыс при исследовании _влияния ДМГ и мелатонина на активность МАО в переднем участке МПО_

сутки (с начала воздействия) 1 2 3 4

стадия цикла проэструс эструс диэструс-1 диэструс-2

время (от начала днев фазы) 4 00 9 00-12 00 4 00 9 00-12 00 4 00 9 00-12 00 4 00 9 00-12 00

контрольные животные ФР фр ФР Фр ФР

группа ДМГ ФР ФР Фр дмг ФР

группа мелатонин мел мел мел фр мел

группа сочетанного воздействия ДМГ и мелатонина мел мел мел дмг мел

фр - инъекция физиологического раствора, 250 мкл, дмг - инъекция раствора ДМГ, 4,8 мг/250 мкл, 250 мкл, мел - инъекция раствора мелатонина, 1 мг/мл, 250 мкл

При изучении влияния эпиталамина и эпиталона на уровни активности МАО в переднем участке МПО ориентировались на аналогичную схему введения препаратов, в которой серии инъекций мелатонина были замещены аналогичными по времени введения инъекциями эпиталамина (0,25 мг/животное) и эпиталона (0,5 мкг/животное)

Животные были декапитированы на стадии проэструса (те при наступлении следующего репродуктивного цикла) в период с 5 ч до 11ч дневной фазы экспериментальных суток Общее количество - 205 особей (по 17-37 крыс в группе)

Исследование связей между активностями моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы. После декапитации крыс выделяли фронтальный участок головного мозга между обонятельными луковицами и тангентальной плоскостью сечения мозга, проведенной через переднюю границу гипоталамуса (п = 11) и срединное возвышение гипоталамуса (п = 7)

Изучали активности немитохондриальных (микросомальной + растворимой) МАО и ГПО и митохондриальных форм этих ферментов Гомогенат ткани центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и далее работали с полученным супернатантом (фракция 1) Фракцию, содержащую цитозоль и микросомы (супернатант) получали путем центрифугирования фракции 1 в течение 5 минут при 15000 £ Митохондрии выделяли, используя осажденный материал с ресуспендированием в 0 25 М растворе схарозы в фосфатном буфере (рН7,8) и повторным центрифугированием при 15000 g (5 минут) Промытые таким образом митохондрии ресуспендировали в 0 25 М растворе сахарозы в фосфатном буфере, затем центрифугировали при 1000 g (10 минут) для удаления возможной примеси тяжелых частиц, после чего полученный супернатант с митохондриями хранили при -70°С

до определения активности ферментов Активность МАО и ГПО в срединном возвышении исследовали без предварительного разделения фракции 1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика методов определения активности ферментов.

Определение активности моноаминоксидазы В результате периодических измерений прироста оптической плотности (AOD) при 327 нм была обнаружена линейная зависимость величины AOD от времени инкубации Линейный характер зависимости сохранялся в течение более чем 1,5 ч инкубации при 37 °С (R2 = 0,9994, установлено для ткани маммилярного тела гипоталамуса при концентрации белка 132 мкг / мл реакционной смеси) Также выявлена линейная зависимость AOD в единицу времени от содержания белка в реакционной смеси (R2 = 0,9954), сохраняющаяся вплоть до значения концентрации белка, равного 264 мкг / мл в случае ткани маммилярного тела

Исходя из обнаруженного соотношения между приростом оптической плотности при 327 нм и одновременной убылью при 360 нм (AOD327/AOD36o=1,88) и стехиометрии реакции, следует, что прирост оптической плотности при 327 нм происходит более выраженно, чем ее снижение при 360 нм, что указывает на преимущество использования настоящего подхода как более чувствительного, чем разработанный ранее метод (Weissbach et al, 1960) Чувствительность настоящего метода при инкубации в течение 90 минут составляет 25 пмоль/мин/мл реакционной смеси (25 нМ/мин)

Показатель точности определений Р при п=3 в случае инкубации в течение 90 минут равен 0,63 - 1,95%, т е менее 2%, из чего следует, что определения характеризуются высокой точностью

Определение активности глутатионпероксидазы При использовании указанных выше значений параметров метода скорость окисления глутатиона в течение первой минуты после внесения пероксида сохраняется постоянной наблюдается линейный характер зависимости количества окисленного GSH от времени (R2 = 0,9954, выявлено при содержании белка гипоталамуса в реакционной смеси, равном 78 мкг/мл) Скорость неферментативного окисления GSH остается неизменной по крайней мере в течение первых двух минут (R2 = 0,9967)

Выявлена линейная зависимость скорости ферментативной реакции от содержания белкового материала (R2 = 0,9964), сохраняющаяся вплоть до значения концентрации белка, равного 480 мкг/ мл реакционной среды

Чувствительность метода составляет 15мкМ/мин (15 нмоль/мин/мл реакционной смеси) Полученное значение чувствительности сходно с чувствительностью флюориметрического метода определения активности ГПО (Ramos Martines et al, 1979)

Метод характеризуется высокой точностью показатель точности

определений Р при п=3 составляет 1,00 - 1,79%, т е менее 2%

* * *

Полученные результаты (постоянство скорости реакции и ее пропорциональность содержанию белка) указывают на пригодность предлагаемых значений параметров методов для корректной оценки моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей в микрообразцах ткани головного мозга крыс

С использованием вышеописанных методов получены дальнейшие результаты

Распределение активности МАО среди структур мозга.

Обнаружены ярко выраженные достоверные различия (р<0 001-0 05) по уровням активности МАО между отдельными областями Наибольшая активность (нмоль кинурамина / мин / мг белка, М±ш) выявлена в срединном возвышении с окружающей тканью (8,03±0,28), наименьшая -в ткани гипофиза (0,61±0,05) Промежуточные значения выявлены для дорсального ядра шва (3,10±0,12), медиальной преоптической области (2,61±0,36), locus coeruleus с окружающей тканью (2,20±0,22), маммилярного тела (2,00±0,19), коры обонятельных бугорков (1,43±0,05) и миндалин (1,41±0,32)

Таким образом, для областей, имеющих наиболее прямое отношение к продукции гонадолиберина, т е МПО и СВ, характерны одни из наиболее высоких значений активности МАО, что позволяет получать надежные разультаты при работе с данными микроструктурами

В МПО и СВ выявлено преобладание активности изофермента МАО типа В (метаболизирующего дофамин), составляющей 71 ±4 и 90±3% общей активности, соответственно

Суточная динамика активности моноаминоксидазы в преовуляторный период в структурах, ответственных за продукцию гонадолиберина. Ни в МПО, ни в СВ с окружающей тканью не выявлено достоверных суточных изменений активности фермента То же справедливо для коры ОБ Стадии репродуктивного цикла также не отличаются по уровням активности МАО В отношении каждой из структур для всех групп наблюдаются очень сходные значения с небольшой ошибкой среднего арифметического

Выявленный константный уровень активности МАО в МПО, СВ и ОБ указывает на конститутивный характер формирования активности МАО в данных областях, не подверженной значительным изменениям на протяжении второй половины дневной фазы экспериментальных суток Это означает, что на протяжении данного периода, как в фазе проэструса, так и в фазе диэструса ферментная система находится в состоянии готовности обеспечения определенной скорости метаболизма моноаминов. Ввиду вероятной ненасыщенности МАО субстратами (Горкин, 1981) при высвобождении последних при синаптической

передаче скорость их метаболизма будет зависеть от их поступления в поле действия МАО. Таким образом, МАО, по всей видимости, не инициирует выявленные ранее изменения в высвобождении моноаминов МПО (Mohankumar, Mohankumar, 2004), и обусловливает изменения в содержании моноаминов и формирование пика гонадолиберина посредством сохранениия необходимого конститутивного уровня активности. Необходимость сохранения детерминированного уровня активности МАО для осуществления преовуляторной гиперсекреции LHRH неоднократно подтверждена зарубежными исследователями (Lima et al., 2007, Alleva et al„ 1966, Yamamoto, 1974).

Возрастная динамика активности моноаминоксидазы в анатомических структурах. В ткани МПО наименьшая активность МАО выявлена в перипубертатный период; у молодых половозрелых и стареющих крыс найдены сходные значения активности. В СВ наибольшие значения активности МАО выявлены в группе стареющих крыс; для групп перипубертатного возраста и периода половой зрелости характерны сходные значения (рис.1). У животных возраста 4-5 месяцев выявлена тенденция к отрицательной корреляции между активностями МАО в МПО и СВ с окружающей тканью, rs = -0.59 (критическое значение для р < 0.05 составляет 0.61), что не выявляется в период полового созревания и у стареющих животных.

1.5-2 месяца (10) 4-5 месяцев (11) >12 месяцев (10)

1,5-2 месяца (9) 4-5 месяцев (11) >12 месяцев (10)

Рис. 1. Общая моноаминоксидазная активность ткани медиальной преоптической области (А(мпо)) и срединного возвышения с окружающей тканью (А(св)) в трех возрастных группах самок крыс (нмоль кинурамина/мин/мг белка, М ± т).

В скобках указано количество особей в возрастной группе (п).

А(мпо): * - р < 0,05 при сравнении с минимальным значением, выявленным для структуры.

А(св): * - р < 0,05; ** - р < 0,01 при сравнении с максимальным значением, выявленным для структуры.

На этом основании нами предполагается необходимость наличия относительно высокой моноаминоксидазной активности в МПО и относительно низкой активности МАО в СВ для оптимального состояния гипоталамической системы регуляции репродуктивной функции. Выявленное повышение активности МАО в МПО в первые месяцы онтогенеза подтверждает предположение, основанное на результатах

работ (Cvijic et al, 1997-1998, Lima et al, 2007), о том, что относительно высокий уровень МАО в МПО требуется для успешной реализации репродуктивной функции

-Явное отсутствие корреляционной связи между активностями МАО в МПО и СВ крыс перипубертатного возраста и стареющих самок крыс, возможно, указывает на несогласованность МАО-опосредованной регуляции работы моноаминэргических систем, вовлеченных в контроль синтеза и секреции гонадолиберина Это может отражать относительную незрелость данного механизма у животных, находящихся в перипубертатном периоде онтогенеза, и его разрегулированность в период старения Напротив, тенденция к отрицательной корреляции между активностями МАО в МПО и СВ половозрелых самок крыс, по всей видимости, указывает на наличие согласованных изменений активности МАО, связанных с регуляцией процессов синтеза и высвобождения гонадолиберина

Ранее в ткани гипоталамуса наряду с повышением активности МАО, сопряженным со старением, было выявлено снижение содержания субстратов МАО - норадреналина и дофамина (Bhaskaran, Radha, 1983) В отдельных областях гипоталамуса (передний и медиальный участки) обнаружено более низкое содержание норадреналина у 18-24-месячных крыс (при сравнении с животными возраста 2-х месяцев) (Cano et al, 2001), снижение содержания норадреналина в медиальном базальном гипоталамусе стареющих крыс описано также в работе (Simpkms et al., 1977), в медиальном базальном гипоталамусе, также как и в срединном возвышении, выявлено сниженное содержание дофамина у старых крыс (Simpkms et al, 1977, Cano et al., 2001) В настоящем исследовании в гипоталамических областях (МПО и СВ) у стареющих крыс обнаружены наиболее высокие значения моноаминоксидазной активности. Поскольку МАО катализирует деградацию моноаминов, сниженный при старении уровень норадреналина и дофамина в упомянутых гипоталамических областях, может быть связан с повышением активности МАО

Также (для сравнения) была исследована возрастная динамика моноаминоксидазной активности в негипоталамических структурах (ольфакторных бугорках и эпифизе) Для обеих структур наиболее низкие значения активности МАО выявлены у животных 4-5-месячного возраста, максимальные значения - у стареющих крыс, что сходно с результатами, полученными для ткани СВ

Ранее, в работе, выполненной на самцах крыс линии Вистар (Bhaskaran, Radha, 1983), во всех исследованных обширных областях, за исключением ткани мозжечка, выявлено увеличение активности МАО у животных возраста 24-х месяцев (при сравнении с 3- и 6-месячными животными) Мы полагаем, что увеличение активности МАО при старении организма является особенностью, характерной для большинства структур головного мозга и для ткани эпифиза

Влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на общую моноаминоксидазную активность в медиальной преоптической области. Данные, полученные в результате индивидуального и сочетанного действия препаратов, представлены на рис.2.

Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина. Данные по изучению влияния однократных внутрибрюшинных инъекций ДМГ за день до стадии проэструса указывают на ингибирующий эффект данного соединения (в дозе 4,8 мг/животное) на активность МАО в переднем участке МПО. Наряду с полученным в данном исследовании результатом известен факт снижения содержания моноаминов в том же анатомическом участке мозга под действием 1,2-диметилгидразина (Арутюнян и др., 2007). Также в опытах на самцах крыс под влиянием ДМГ наблюдалось выраженное снижение содержания FSH в гипофизе (Анисимов и др., 1976). Таким образом, становится очевидным однонаправленный эффект ДМГ на отдельные компоненты гипоталамо-гипофизарной системы, в числе которых — регуляторы функции репродукции. По-видимому, ингибирующий эффект ДМГ на отдельные компоненты механизма реализации репродуктивной функции вызывает общее снижение активности всей системы, что сопровождается ее дисфункцией. Это согласуется с известными данными об антигонадотропном эффекте ДМГ (Анисимов и др., 2000, Арутюнян и др., 2003).

Рис. 2. Влияние внутрибрюшинных инъекций 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на уровень активности моноаминоксидазы (А, нмоль кинурамина/мин/мг белка, М ± ш) во фронтальном участке медиальной преоптической области самок крыс .

Обозначения: PS - физиологический раствор, DMH - 1,2-диметилгидразин, MEL - мелатонин, ЕА -эпиталамин, ЕО - эпиталон.

Достоверность различий: * - р<0,05, ** - р<0,01 при сравнении с группой PS, h - р<0,05, hh - р<0,01 при сравнении с группой DMH, mm - р<0,01 при сравнении с группой MEL, оо - р<0,01 при сравнении с группой ЕО.

Влияние инъекций мелатонина Полученный результат свидетельствует о выраженном увеличении уровня общей активности МАО в МПО под влиянием экзогенного мелатонина (в дозе 0,25 мг/животное/сутки), что позволяет говорить о регуляторном влиянии данного гормона на экспрессию МАО и/или о модуляции активности экспрессированного фермента

Исходя из факта необходимости наличия определенного уровня МАО в структурах мозга для обеспечения овуляции, выявленное повышение активности МАО под действием мелатонина свидетельствует о возможности МАО-опосредованной регуляции репродуктивной функции со стороны гормона эпифиза

Сочетанное воздействие ДМГ и мелатонина Полученные данные заставляют неоднозначно интерпретировать результат сочетанного воздействия мелатонина и ДМГ С одной стороны, тот факт, что среднее значение для группы сочетанного действия не отличается достоверно от такового, полученного при введении физиологического раствора, может указывать на протекторную роль мелатонина, который восстанавливает нормальный уровень активности МАО в ткани передней части МПО С другой стороны, различия между группами введения ДМГ и сочетанного действия менее выражены, нежели между группами введения мелатонина и сочетанного действия препаратов Это может означать, что эффект ДМГ при сочетанном действии доминирует над влиянием мелатонина При обработке результатов методом двухфакторного дисперсионного анализа также выявляется преобладание эффекта ДМГ Это может указывать на малую эффективность применения инъекций раствора мелатонина в указанной концентрации для снятия эффекта однократного введения ДМГ на активность МАО в областях мозга, регулирующих функцию репродукции.

Влияние инъекций эпиталамина. Полученные данные согласуются с представлением о том, что эпиталамин оказывает нормализующий эффект на репродуктивную функцию (Анисимов, 2003), что может быть связано со стабилизацией оптимального уровня активности МАО в областях мозга, наиболее значимых в отношении регуляции репродукции

Сочетанное влияние введения эпиталамина и ДМГ Явные различия между группой сочетанного воздействия и группой однократного введения ДМГ позволяют считать, что эффект со стороны эпиталамина, сохраняющий нормальный уровень активности МАО в передней части МПО, преобладает над ингибирующим влиянием ДМГ в условиях данного эксперимента Данный результат позволяет говорить о выраженном нормализующем эффекте используемой дозы эпиталамина на активность МАО в данной области мозга, ответственной за регуляцию репродуктивной функции.

Лпмяиир Мг4Тъ01ГМЫМ •лпмт/УППЫЛ На лгилпоии« плттпоиичу ттоттжтт IV

— ---- - - — ---"/«" — ДЦППШЛ

можно говорить о том, что физиологический уровень активности МАО в переднем участке МПО не подвергается изменениям под влиянием серии инъекций эпиталона в указанных условиях.

Сочетанное воздействие эпиталона и ДМГ Выраженное снижение активности МАО указывает на отчетливое преобладание эффекта ДМГ на исследуемый показатель Синтетический аналог эпиталамина (по крайней мере в используемой концентрации) не оказывает протекторного эффекта в отношении токсического влияния ДМГ, снижающего уровень активности МАО в переднем участке МПО, что отличается от действия эпиталамина

Полученные данные могут указывать на то, что уже известные ранее эффекты ДМГ, регуляторных пептидов и гормона эпифиза на репродуктивную функцию осуществляются через изменения активности МАО в МПО. Влияние исследованных соединений на активность МАО и функционирование репродуктивной системы имеют одинаковую направленность- для оптимального состояния гипоталамической системы регуляции репродуктивной функции требуется относительно высокий уровень активности МАО в МПО, соединение, обладающее антигонадотропным эффектом (ДМГ), вызывает снижение активности МАО в МПО; препарат, обладающий прогонадотропным эффектом у половозрелых самок крыс (мелатонин, стимулирующий секрецию ЫШН), повышает активность МАО в МПО. Эпиталамин, при воздействии которого частично восстанавливается репродуктивная функция у старых крыс (Юшушбоп, 2002), по всей видимости, оказывает стабилизирующий эффект на относительно высокий уровень МАО в МПО (что необходимо для реализации репродуктивной функции)

Связь меяоду активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы В ткани фронтальной части головного мозга между активностью МАО А митохондрий и общей активностью МАО цитозольно-микросомальной фракции выявлена положительная корреляция (г = 0 58, г8 = 0.68, п=10, р<0 05) При изучении связи между активностями МАО и ГПО разных фракций получены коэффициенты, указывающие на наличие отрицательных корреляций Достоверная корреляция выявлена между общей активностью МАО митохондрий и активностью ГПО цитозольно-микросомальной фракции (г = -0 63, п=11, р<0.05). Отрицательная связь сохраняется между активностями митохондриальной МАО В и ГПО цитозольно-микросомальной фракции (г = -0.63, п=10, р<0.05). Наиболее выраженная отрицательная корреляционная зависимость обнаружена между активностями немитохондриальной МАО и митохондриальной ГПО, т е между минорными компонентами общих активностей МАО и ГПО в клетке (г = -0 81, г8 = -0 91, п=11, р<0 01) (рис. 3)

В ткани СВ при определении активности ферментов в супсрнатантс гомогената ткани, полученного в результате центрифугирования при 1 ООО g, также выявлена достоверная отрицательная корреляционная зависимость между активностями МАО и ТОО (г5 = -0.81, п=7, р<0.05).

А(гпо)

,А(мао)

Рис. 3. Корреляционная связь между активностями немитохондриальной моноаминоксидазы и митохондриальной глутатионпероксидазы, представленная в графической форме.

А(мао) - активность немитохондриальной монаминоксидазы, нмоль кинурамина/мин/мг белка цитозольно-микросомальной фракции.

А(гпо) - активность митохондриальной глутатионпероксидазы, нмоль 08Н/мин/мг митохондриального белка.

В некоторых работах ранее уже обращалось внимание на функциональное сопряжение МАО и ГПО. Сюда относятся сообщения об интенсификации окисления глутатиона в грубых экстрактах мозга крыс и в митохондриях, сопряженной с метаболизмом моноаминов посредством МАО (Maker at al., 1981, Cohen et al. 1997). Исходя из подобных результатов можно было предполагать наличие физиологического ответа в виде увеличения активности ГПО при более интенсивном МАО-зависимом катаболизме моноаминов, который, как известно, приводит к продукции пероксида водорода, восстанавливаемого посредством ГПО. В случае наличия данной функциональной связи между МАО и ГПО следовало ожидать положительной корреляции между активностями данных ферментов в одной и той же анатомической структуре.

Вопреки подобным ожиданиям, нами установлен факт отрицательной корреляции между ГПО и МАО, принадлежащих к разным фракциям. В ткани срединного возвышения без предварительного фракционирования субклеточных структур также выявляется отрицательная связь.

Выявленные отрицательные связи между активностями МАО и ГПО согласуются с данными ряда исследователей. Известен факт повышения активности ГПО при действии экзогенных моноаминов, в частности,

норадреналина (Кулинский, Колесниченко, 1993; Колесниченко и др, 1987) Существуют данные, указывающие на обратную зависимость между активностью МАО и содержанием моноаминов в ткани гипоталамуса (Grantyn, Ivanova, 1974) В этом случае, а также при стимулирующем действии моноаминов на активность ГПО, представляется вполне понятным наличие отрицательной связи между активностями МАО и ГПО

Выявленные зависимости между активностями ГПО и МАО указывают на то, что определение ГПО предложенным методом позволит судить о потенциально возможной скорости метаболизма высвободившихся моноаминов, регулирующих репродуктивную функцию, по моноаминоксидазному пути

ВЫВОДЫ.

1 Метод определения моноаминоксидазной активности с применением кинурамина в качестве субстрата и спектрофотометрической регистрацией прироста продукта реакции (4-гидроксихинолина) и метод определения селензависимой глутатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) оптимальны для работы с микроструктурами головного мозга 2. Моноаминоксидазная активность сохраняет постоянный уровень в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс в преовуляторный период 3 У половозрелых самок крыс активность моноаминоксидазы повышена в медиальной преоптической области и остается относительно сниженной в срединном возвышении Угасание репродуктивной функции сопровождается повышением активности моноаминоксидазы в срединном возвышении

4. Внутрибрюшиное введение мелатонина повышает активность моноаминоксидазы в медиальной преоптической области, однократное введение 1,2-диметилгидразина приводит к снижению активности моноаминоксидазы, эпиталамин оказывает протекторный эффект против воздействия 1,2-диметилгидразина

5 Глутатионпероксидазная активность отрицательно коррелирует с моноаминоксидазной активностью в ткани головного мозга 1фыс, что может быть использовано для оценки потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Разыграев А.В Метод определения глутатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клинико-лабораторный консилиум — 2004. — №4 — С 19-22

2. Разыграев А.В, Арупонян А.В Спектрофотометрический метод определения моноаминоксидазной активности в микроструктурах головного мозга крыс, основанный на реакции окисления кинурамина // ВестникСПбГУ —2006 —Сер 3,вып 3 —С 114-118

3 Разыграев АВ, Арупонян А В Активность моноаминоксидазы в структурах головного мозга крыс // Нейрохимия — 2007 — Т 24, № 3 — С 206-210.

4 Razygraev A.V, Arutjunyan А V Monoamine oxidase activity in several structures of rat brain //Neurochemical Journal —2007 —V 1,№3 —P 204207

Отдельные результаты были использованы для написания статьи.

5 Разыграев А.В, Арупонян А В Определение глутатионпероксидазной активности в сыворотке крови человека с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клиническая лабораторная диагностика — 2006 — № 6 — С 13-16

Разыграев А. В. Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс // Автореф дис. канд биол. наук 03.00 13, 03.00 04 - СПб , 2007 - 25 с.

Подписано в печать 20 12 2007 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0

_Тираж 100 экз Заказ /¿¿7_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СГОГЭТУ «ЛЭТИ» Издательство СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 197376, С -Петербург, ул. Проф Попова, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Разыграев, Алексей Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о циркадианной системе млекопитающих

1.2. Современные представления о механизме обеспечения репродуктивной 16 цикличности женского организма

1.3. Роль мелатонина в регуляции репродуктивной функции

1.4. Влияние пептидов эпифиза на репродуктивную функцию

1.5. Влияние нейротропных ксенобиотиков на репродуктивную функцию

1.6. Биохимическая характеристика аминоксидаз

1.7. Возможная связь глутатионпероксидаз с действием аминоксидаз и механизмами регуляции репродукции

1.8. Биохимическая характеристика глутатионпероксидаз

1.9. Методы определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной 59 активностей

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Оптимизация способов определения активности ферментов для работы с микроструктурами головного мозга крыс

2.2. Изучение распределения активности моноаминоксидазы среди анатомических структур

2.3. Изучение суточной динамики активности моноаминоксидазы в медиальной преоптической области, срединном возвышении и обонятельных бугорках

2.4. Изучение возрастной динамики активности моноаминоксидазы в анатомических структурах

2.5. Изучение влияния мелатонина, эпиталамина, эпиталона и 1,2-диметилгидразина на активность моноаминоксидазы во фронтальной части медиальной преоптической области

2.6. Исследование отношений между активностями моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. 1. Характеристики разработанных методов определения активности ферментов

3.2. Распределение активности моноаминоксидазы среди структур мозга

3.3. Исследование суточной динамики моноаминоксидазной активности в медиальной преоптической области, срединном возвышении и обонятельных бугорках

3.4. Изучение возрастной динамики активности моноаминоксидазы в анатомических структурах

3.5. Влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на общую моноам инокеидазную активность в медиальной преоптической области

3.6. Исследования связи моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Проблема регуляции репродуктивной функции женского организма является одной из сложнейших в функциональной биохимии. Особого внимания заслуживает функционирование сложно организованной гипоталамической системы, обеспечивающей синтез и секрецию ключевого регулятора половой цикличности - гонадолиберина (LHRH), рилизинг-гормона, стимулирующего выработку гонадотропинов гипофиза.

Установлено, что максимальный уровень LHRH в крови самок млекопитающих приурочен к определенному времени репродуктивного цикла, а именно, к периоду, предшествующему овуляции. У самок крыс пик секреции LHRH происходит в вечернее время на стадии проэструса. Одним из условий формирования данного пика является повышение в крови содержания половых стероидов. Другое условие, связанное с первым - ежедневно поступающий сигнал от внутреннего таймера, локализованного в супрахиазматических ядрах (SCN) гипоталамуса; при этом функция SCN также модулируется стероидами (Kennaway, 2005).

Перикарионы специализированных гонадолиберинергических нейронов в головном мозгу крыс локализованы преимущественно в медиальной преоптической области (МПО); большая часть терминалей данных нейронов проецируется в срединное возвышение (СВ) гипоталамуса, откуда происходит секреция LHRH в кровь (Rivest, Rivier, 1995). Процессы синтеза и секреции LHRH находятся под контролем многочисленных нейромедиаторных систем, среди которых основная роль отводится пептидергическим и моноаминергическим системам (Бабичев, 1995). В упрощенном виде представления о вкладе моноаминергических систем сводятся к следующему: норадреналин и дофамин считаются позитивными регуляторами синтеза LHRH в медиальной преоптической области (в особенности это относится к норадреналину); что же касается секреции LHRH, то дофамин, в противоположность норадреналину, рассматривается как негативный регулятор. В отношении серотонина известно ингибирующее влияние на продукцию LHRH. Для различных моноаминов показано наличие изменений в их содержании и секреции в МПО и медиальном базальном гипоталамусе на стадии проэструса, приуроченных к вечернему времени, что связывают с осуществлением их регуляторной роли в отношении формирования пика LHRH (Thyagarajan et al., 1995; Mohankumar et al., 1995). Также неоднократно продемонстрирован факт снижения содержания биогенных аминов в гипоталамических структурах (включая СВ) при старении, что рассматривают как одну из причин развития возрастной дисфункции гипоталамического контроля работы репродуктивной системы (Simpkins et al., 1977, Cano et al., 2001).

Один из основных путей деградации данных нейромедиаторов - путь окислительного дезаминирования, катализируемого моноаминоксидазами (МАО). Ряд сведений указывает на вовлеченность МАО преоптической области самок крыс в формирование преовуляторного пика секреции LHRH (Alleva et al., 1966, Lima et al., 2007, Yamamoto et al., 1974). В частности, использование паргилина (ингибитора МАО) вызывает отмену преовуляторного пика лютеинизирующего гормона у крыс наряду с повышением содержания серотонина, норадреналина и дофамина в МПО. При этом истощение содержания серотонина путем микроинъекций 5,7-дигидрокситриптамина в МПО ведет к усилению секреции лютеинизирующего гормона у овариэктомированных крыс, обработанных эстрадиолом и прогестероном (Lima et al., 2007).

Однако, неизвестно, присутствуют ли изменения активности МАО в МПО и СВ в преовуляторный период, обуславливающие формирование обнаруженных ранее ритмов содержания моноаминов в данных областях. В связи с этим актуальной является задача исследования динамики активности МАО в МПО и СВ во второй половине дневной фазы экспериментальных суток на различных стадиях эстрального цикла.

К настоящему времени известно, что во многих областях головного мозга крыс, в частности, в целом гипоталамусе, при старении наблюдается повышение активности МАО (Bhaskaran, Radha, 1983, Meites, 1992). Поскольку в отдельных областях гипоталамуса при старении наблюдается снижение содержания моноаминов, регулирующих репродуктивную функцию, актуальной является задача изучения возрастной динамики активности МАО в МПО и СВ, которая до настоящего момента остается неизвестной. Данные о возрастных изменениях активности МАО в МПО и СВ будут способствовать пониманию роли данного фермента в возрастном становлении и угасании репродуктивной функции.

Актуальным является поиск ответа на вопрос о вовлеченности МАО в механизмы воздействия соединений, обладающих гонадотропным эффектом. Экспериментальные исследования показали, что при воздействии антигонадотропного соединения 1,2-диметилгидразина и гормона эпифиза мелатонина, обладающего прогонадотропным эффектом у половозрелых животных, наблюдаются изменения содержания моноаминов в гипоталамических структурах (Анисимов и др., 1976, Керкешко и др., 2001). Однако, неизвестно, как влияют данные соединения на активность МАО в данных областях. Также получены сведения о том, что пептидный препарат эпифиза эпиталамин способен восстанавливать циклическую активность яичников и фертильность у стареющих самок крыс (Анисимов, 2003, Khavinson, 2000). В то же время, неизвестно, что происходит с активностью МАО в гипоталамических структурах, ответственных за продукцию LHRH, при воздействии эпиталамина, а также его структурно-функционального аналога эпиталона.

Начиная с 1980-х годов появились сведения о том, что функционирование МАО тесно связано с активностью глутатионпероксидаз (ГПО) - основных ферментов, метаболизирующих пероксид водорода в головном мозгу, являющийся одним из продуктов моноаминоксидазной реакции (Maker et al., 1981, Cohen et al., 1997). Можно предположить наличие корреляционной связи между активностями МАО и ГПО. Экспериментальная проверка данного предположения является актуальной, поскольку в случае наличия высокодостоверной корреляционной связи в исследуемых областях активность ГПО будет являться дополнительным показателем потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов, ответственных за регуляцию продукции LHRH.

В соответствии с целью были поставлены задачи:

1)оптимизировать условия определения активности моноаминоксидазы и глутатионпероксидазы для работы с микроанатомическими структурами головного мозга;

2)исследовать суточную динамику моноаминоксидазной активности в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс в преовуляторный период;

3)исследовать возрастную динамику активности моноаминоксидазы в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс;

4)изучить влияние 1,2-диметилгидразина, мелатонина, эпиталамина и эпиталона на активность моноаминоксидазы в ответственных за регуляцию репродукции областях гипоталамуса самок крыс;

5)оценить связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы в ткани головного мозга, в том числе в областях, отвечающих за продукцию гонадолиберина.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1 .Оптимизированные способы определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей позволяют корректно исследовать активности данных ферментов в микроструктурах головного мозга и могут быть использованы для оценки потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов.

2.Становление и угасание репродуктивной функции сопряжено с изменениями активности моноаминоксидазы в микроструктурах гипоталамуса, ответственных за продукцию гонадолиберина.

3.Соединения, обладающие гонадотропным эффектом, влияют на моноаминоксидазную активность в медиальной преоптической области: соединение с антигонадотропными свойствами (1,2-диметилгидразин) снижает активность фермента; вещества с прогонадотропным эффектом повышают (мелатонин) или оказывают протекторный эффект (эпиталамин) на активность моноаминоксидазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Представлен новый способ определения моноаминоксидазной активности, основанный на реакции окисления кинурамина с детекцией увеличения концентрации продукта реакции 4-гидроксихинолина при 327 нм. Данный метод позволяет определять активность моноаминоксидазы в микроанатомических структурах головного мозга, в том числе ответственных за регуляцию репродуктивной функции. Описан новый подход для определения селензависимой глутатионпероксидазной активности, сочетающий использование пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), и применен для изучения глутатионпероксидазной активности ткани головного мозга, в том числе в микроанатомических образованиях.

Впервые описано распределение моноаминоксидазной активности в ткани головного мозга крыс с применением разработанного и представленного в настоящей диссертации метода определения активности МАО.

Впервые изучено воздействие обладающего нейротоксическими свойствами энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина на уровень активности моноаминоксидазы в преоптической области гипоталамуса самок крыс. При этом обнаружен ингибирующий эффект однократной внутрибрюшинной инъекции данного соединения на активность фермента.

Впервые выявлена высокодостоверная обратная зависимость между активностями малоизученной немитохондриальной моноаминоксидазы и селеновой митохондриальной глутатионпероксидазы в ткани головного мозга. Выявлена отрицательная корреляционная связь между активностями глутатионпероксидазы и моноаминоксидазы срединного возвышения.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Представленные микрометоды определения моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностей расширяют возможности дальнейшего исследования данных ферментов. Методы характеризуются простотой воспроизведения и использованием недорогих реактивов, пригодны для работы с микроанатомическими стуктурами головного мозга, с отдельными субклеточными фракциями и позволяют решать многие исследовательские задачи. Всего этого зачастую нельзя сказать о многих альтернативных методах. Предложенный способ определения активности глутатионпероксидазы характеризуется более высокой селективностью в отношении селеновых изоформ фермента, чем широко используемые методы с применением органических перекисей, что позволяет более корректно судить о селензависимой глутатионпероксидазной активности.

Проведеные исследования способствуют большей детализации представлений о центральной регуляции репродуктивной функции женского организма и дают основание для суждений о значимости моноаминоксидазного компонента в системе гипоталамического звена регуляции данной функции. Полученные данные об эффекте воздействия ксенобиотика 1,2-диметилгидразина могут быть учтены при оценке влияния антропогенных экологических факторов, включающих наличие в окружающей среде соединений сходной химической природы. Результаты изучения эффекта воздействия инъекций мелатонина указывают на необходимость глубокого изучения влияния потребления данного соединения на гипоталамические механизмы контроля функции репродукции. Обнаруженный в данном исследовании эффект, выражающийся в существенном повышении активности моноаминоксидазы в преоптической области должен быть учтен при разработке клинических подходов применения гормона эпифиза. Выявленное протекторное действие эпиталамина на активность моноаминоксидазы подтверждает уже известный нормализующий эффект данного препарата в отношении репродуктивной функции, что может указывать на адекватность применения эпиталамина в клинической практике для коррекции нарушений в гипоталамической регуляции работы репродуктивной системы. Обнаруженная высокодостоверная зависимость между активностями немитохондриальной моноаминоксидазы и митохондриальной глутатионпероксидазы позволяет далее рассмотреть последнюю как дополнительный параметр, отражающий потенциально возможную скорость окислительной деградации моноаминов в ткани головного мозга.

СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПЛАНОМ НАУЧНЫХ РАБОТ ИНСТИТУТА. Диссертационное исследование проведено в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института акушерства и гинекологии им Д.О. Отта РАМН по теме: "Экспериментальное моделирование комплексного воздействия неблагоприятных факторов внешней среды малой интенсивности на репродуктивную систему".

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Разыграев А.В. Метод определения глугатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клинико-лабораторный консилиум. — 2004. — № 4. — С. 19-22.

2.Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Спектрофотометрический метод определения моноаминоксидазной активности в микроструктурах головного мозга крыс, основанный на реакции окисления кинурамина // Вестник СПбГУ. — 2006. — Сер. 3, вып. 3. — С. 114-118.

3. Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Активность моноаминоксидазы в структурах головного мозга крыс // Нейрохимия. — 2007. — Т. 24, № 3. — С. 206-210.

4. Razygraev A.V., Arutjunyan A.V. Monoamine oxidase activity in several structures of rat brain // Neurochemical Journal. — 2007. — V. 1, № 3. — P. 204-207.

Отдельные результаты были использованы для написания статьи:

5. Разыграев А.В., Арутюнян А.В. Определение глугатионпероксидазной активности в сыворотке крови человека с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клиническая лабораторная диагностика. — 2006. — № 6. — С. 13-16.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований (в том числе обсуждение полученных результатов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, иллюстрирована 32 рисунками. Библиографический указатель включает 200 наименований, в числе которых 39 отечественных и 161 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Разыграев, Алексей Вячеславович

ВЫВОДЫ.

1. Метод определения моноаминоксидазной активности с применением кинурамина в качестве субстрата и спектрофотометрической регистрацией прироста продукта реакции (4-гидроксихинолина) и метод определения селензависимой глутатионпероксидазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) оптимальны для работы с микроструктурами головного мозга.

2. Моноаминоксидазная активность сохраняет постоянный уровень в медиальной преоптической области и срединном возвышении гипоталамуса самок крыс в преовуляторный период.

3. У половозрелых самок крыс активность моноаминоксидазы повышена в медиальной преоптической области и остается относительно сниженной в срединном возвышении. Угасание репродуктивной функции сопровождается повышением активности моноаминоксидазы в срединном возвышении.

5. Глутатионпероксидазная активность отрицательно коррелирует с моноаминоксидазной активностью в ткани головного мозга крыс, что может быть использовано для оценки потенциально возможной скорости окислительного метаболизма моноаминов.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Нами предпринята попытка ответить на вопрос об участии МАО в регуляции репродуктивной функции на основании полученных в настоящем исследовании данных: -об уровнях активности МАО в областях головного мозга,

- о возрастных изменениях активности МАО в МПО и СВ,

- об эффектах ДМГ, мелатонина и пептидных препаратов эпифиза на активность МАО in vivo,

- о связи между активностями МАО и ГПО.

Константный уровень активности МАО в МПО, служащей основной областью концентрации тел гонадолиберинергических нейронов головного мозга крыс, а также в ольфакторном бугорке, содержащем значительное количество их перикарионов, и в срединном возвышении, где преимущественно происходит накопление гонадолиберина и его квантованное высвобождение в кровь, указывает на конститутивный характер формирования активности МАО в данных областях, не подверженной значительным изменениям на протяжении второй половины дневной фазы экспериментальных суток, когда происходит образование преовуляторного пика гонадолиберина. Это означает, что на протяжении данного периода, как в фазе проэструса, так и в фазе диэструса ферментная система находится в состоянии готовности обеспечения определенной скорости метаболизма моноаминов. Ввиду вероятной ненасыщенности МАО субстратами при высвобождении последних при синаптической передаче скорость их метаболизма будет зависеть от их поступления в поле действия МАО. Таким образом, МАО, по всей видимости, не инициирует выявленные ранее изменения в высвобождении моноаминов МПО (Mohankumar, Mohankumar, 2004), и обусловливает изменения в содежании моноаминов и формирование пика гонадолиберина посредством сохранениия необходимого конститутивного уровня активности. Необходимость сохранения детерминированного уровня активности МАО для осуществления преовуляторной гиперсекреции LHRH неоднократно подтверждена зарубежными коллегами (Lima et al., 2007, Alleva et al., 1966, Yamamoto, 1974).

Выявленное повышение активности МАО в МПО, сопровождающее достижение оптимального состояния функционирования репродуктивной системы, подтверждает представление о необходимости наличия относительно высокого уровня активности МАО в МПО для обеспечения репродуктивной цикличности. Факт повышения активности МАО в СВ, сопряженного с развитием нарушения гипоталамического контроля репродуктивной функции, подтверждает важность относительно низкого уровня активности МАО в СВ для нормального состояния гипоталамической системы, ответственной за секрецию гонадолиберина. Тенденция к отрицательной корреляции между активностями МАО в МПО и СВ, выявленная у

127 половозрелых крыс, также находит свое объяснение в предлагаемой здесь концепции о разнонаправленных изменениях активностей данного фермента в указанных областях для достижения нормального состояния гипоталамической системы, формирующей репродуктивные циклы.

Полученные данные о влиянии ДМГ, мелатонина и пептидных препаратов эпифиза на активность МАО в МПО могут указывать на то, что уже известные ранее эффекты ДМГ, регуляторных пептидов и гормона эпифиза на репродуктивную функцию осуществляются через изменения активности МАО в МПО под действием данных соединений. Влияние исследованных соединений на активность МАО и функционирование репродуктивной системы имеют одинаковую направленность: для оптимального состояния гипоталамической системы регуляции репродуктивной функции требуется относительно высокий уровень активности МАО в МПО; соединение, обладающее антигонадотропным эффектом (ДМГ), вызывает снижение активности МАО в МПО; препарат, обладающий прогонадотропным эффектом у половозрелых самок крыс (мелатонин, стимулирующий секрецию LHRH), повышает активность МАО в МПО. Эпиталамин, при воздействии которого частично восстанавливается репродуктивная функция у старых крыс (Khavinson, 2000), по всей видимости, оказывает стабилизирующий эффект на относительно высокий уровень МАО в МПО (что необходимо для реализации репродуктивной функции).

Установленная связь между моноаминоксидазной и глутатионпероксидазной активностями говорит о возможности использования данных об активности ГПО для суждения о потенциально возможной скорости метаболизма нейромедиаторов-моноаминов МАО-опосредованным путем. Это позволит косвенно судить о вовлеченности метаболизма моноаминов в регуляцию репродуктивной функции на уровне гипоталамических структур.

128

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Разыграев, Алексей Вячеславович, Санкт-Петербург

1.Авакян А.К. Новые молекулярные критерии оценки токсического действия производных гидразина. Активные формы кислорода как ключевые соединения в механизме токсичности. // Фармак. токсикол. - 1990. - Т.53, №1. - С.70-73.

2. Агаджанян Н.А., Радыш И.В., Краюшкин С.И. // Хроноструктура репродуктивной функции. -М.: "Крук", 1998. -248с.

3. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука, 2003. -468 с.

4. Анисимов В.Н., Забежинский М.А., Попович И.Г. Мелатонин угнетает канцерогенез толстой кишки, индуцируемый 1,2-диметилгидразином у крыс: эффекты и возможные механизмы // Вопросы онкологии. 2000. - Т.46,№2. - С. 136-148.

5. Анисимов В.Н., Поздеев В.К., Дмитриевская А.Ю., Грачева Г.М., Ильин А.П., Дильман В.М. Влияние энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина на уровень биогенных аминов в гипоталамусе крыс// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1976. -Т.82,№11. - С. 1359-1361.

6. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина И.И. // Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. СПб: ИКФ "Фолиант", 2000. С. 29-30.

7. Арутюнян А.В., Керкешко Г.О., Анисимов В.Н., Степанов М.Г., Поздеев Н.В. Нарушение циркадианных ритмов биогенных аминов в гипоталамусе крыс при введении 1,2-диметилгидразина. // Вопросы онкологии. 2001. Т.47. - №5. - С.608-615.

8. Ю.Арутюнян А.В., Степанов М.Г., Кореневский А.В. Нарушение нейромедиаторного звена гипоталамической регуляции репродуктивной функции под влиянием нейротоксических ксенобиотиков // Нейрохимия.- 1998.- Т. 15,- №4.- С. 264-270.

9. П.Арутюнян А.В., Степанов М.Г., Кореневский А.В., Прокопенко В.М., Опарина Т.И., Бурмистров С.О. Влияние экологически неблагоприятных факторов на репродуктивную систему // Вестник Рос. асс. акушеров-гинекологов. 1997. - №4. - С.28-31.

10. Арушанян Э.Б, Бейер Э.В. Супрахиазматические ядра гипоталамуса и организация суточного периодизма // Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., ред. Хронобиология и хрономедицина. М.: "Триада-Х", 2000 - С. 50-64.

11. Арушанян Э.Б. Комплексное взаимодействие супрахиазматических ядер гипоталамуса с эпифизом и полосатым телом функционально единая система регуляции суточных колебаний поведения // Журн. высш. нерв, деят,- 1996.- Т. 46.- №1.- С. 15-22.

12. Бабичев В.Н. Нейроэндокринная регуляция репродуктивной системы. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995.-227 с.

13. Бабичев В. Н. Нейроэндокринология пола. М.: Наука, 1981.

14. Брусова Л.В., Горкин В.З., Желязков Д.К., Китросский Н.А., Леонтьева Г.А., Северина И.С. Новый спектрофотометрический метод определения моноаминоксидазной активности в гомогенатах печени // Вопр. Мед. Хим. 1964 - Т.10. - С.83-89.

15. Войтенко Н.Н. Моноаминоксидаза мозга мышей А/Не // Нейрохимия. 2002. Т. 19. N. 3. С.182.186.

16. Войтенко Н.Н., Барыкина Н.Н., Колпаков В.Г. Моноаминоксидаза мозга у генетически предрасположенных к маятникообразным движениям крыс в позднем онтогенезе // Вопросы медицинской химии. 1999. N. 3.

17. Вундер П. А. Эндокринология пола. М.: Наука, 1980.

18. Горкин В.З. Аминооксидазы и их значение в медицине. М.: Медицина, 1981. - 335 с.

19. Ильичева Р.Ф., Горкин В.З. Определение моноаминоксидазной активности в сыворотке крови человека // Лаб. дело. 1979 - Т.9. - С.534-536.

20. Керкешко Г.О. Влияние нейротоксических соединений и мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной системы: диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук.-СПб, 2002. 118 с.

21. Керкешко Г.О., Степанов М.Г., Кореневский А.В., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Влияние мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции крыс при хроническом воздействии ксенобиотиков // Нейрохимия 2001. - Т.18 -No.l - С.67 - 74.

22. Колесниченко Л.С., Манторова Н.С., Шапиро Л.А. Исследование регуляции катехоламинами и сАМР ферментов обмена тиолов и дисульфидов // Биохимия. Т.52, Вып. 5. - С.743-749.

23. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи современной биологии. 1989. - Т.107. Вып. 2. - С. 192-196.

24. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Физиологическое значение регуляции катехоламинами, вторыми посредниками и индукторами ферментов метаболизма глутатиона // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1990. - T.76,N.10. - С.1418 - 1425.

25. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Обмен глутатиона. // Успехи биол. химии. 1990. - Т. 31. -С. 157-179.

26. Кулинский, В.И., Колесниченко, Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Успехи современной биологии 1993. - Т.113. - Вып.1. - С. 107-122.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия. М. 1980.293 с.

28. Лихачев А .Я. Молекулярно-биологические основы тканеспецифического канцерогенного действия диметилгидразина. // Эксперим. онкол. 1980. - Т.2, №6. - С.3-7.

29. Матюшичев В.Б. Элементы статистической обработки результатов биохимического эксперимента. Л. 1990. 130 с.

30. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах. // Лабораторное дело. 1986. - № 12. - С. 724-727.

31. Москвитина Т.А., Медведев А.Е. Исследование цитозольной моноаминоксидазы печени крысы И Вопросы медицинской химии 2000 - Т.46 - N. 1 - С.48-51.

32. Теппермен Д., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир, 1989. - 653 с.

33. Alleva, J. J., Overpeck, J. G., Umberger, E. J. Effect of tranylcypromine and iproniazid on brain amine levels and ovulation in the golden hamster // Life Sci. 1966. V. 5. N. 17. P. 1557-1561.

34. Anisimov V.N. Melatonin and colon carcinogenesis // In: Bartsch, C., Bartsch, H., Blask, D.E. et al. (eds.) The pineal gland and cancer. Neuroimmunoendocrine mechanisms in malignancy. Berlin: Springer, 2001. P. 240-258.

35. Andersen H.R. , Nielsen J., Nielsen P., Grandjean P. Antioxidative enzyme activities in humanerythrocytes / Clinical Chemistry. 1997. - V. 43. - P. 562-568.

36. Arai, Y., Kinemuchi, H. Differences between monoamine oxidase concentrations in striatum and forebrain of aged and young rats // Journal ofNeural Transmission. 1988. V. 72. N. 2. P. 99-105.

37. Bhaskaran D., Radha E. Circadian variations in the monoamine levels and monoamine oxidase activity in different regions of the rat brain as a function of age. // Exp. Gerontol. 1984. - V.19, №3. -P.153-170.

38. Bhaskaran, D., Radha, E. Monoamine levels and monoamine oxidase activity in different regions of rat brain as a function of age // Mech. Ageing Dev. 1983. - Vol. 23, №. 2. - P. 151-160.

39. Binda, C., Newton-Vinson, P., Hubalek, F., Edmondson, D. E., Mattevi, A. Structure of Human Monoamine Oxidase В linked to a membrane lipid double layer // Nature Structural Biology. 2002. V.9. P.22-26.

40. Brigelius-Flohe, R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases // Free Rad. Biol. Med. 1999.-Vol.27.-P.951-965.

41. Brown R.M., Kehr W., Carlsson A. Functional and biochemical aspects of catecholamines metabolism in brain under hypoxia // Brain Res. 1975. - Vol. 85. - P.491-509.

42. Cahill A.L., Ehret C.F. Circadian variations in the activity of tyrosine hydroxylase, tyrosine aminotransferase, and tryptophan hydroxylase: relationship to catecholamine metabolism. // Neurochem.-1981. Vol.37, №5.-P.l 109-1115.

43. Carmagnol F, Sinet PM, Jerome H. Selenium-dependent and non-selenium-dependent glutathione peroxidases in human tissue extracts // Biochim Biophys Acta. 1983. - V.759 N.l-2. - P. 49-57.

44. Cassone V.M., Warren W.S., Brooks D.S., Lu J. Melatonin, the pineal gland, and circadian rhythms. // J. Biol. Rhythms. 1993. - Vol.8. (Suppl). - P.S73-81.

45. Cassone V.M. Melatonin's role in vertebrate circadian rhythms. // Chronobiol. Int. 1998. - Vol.15, №5. - P.457-457.

46. Chambers I, Frampton J, Goldfarb P, Affara N, McBain W, Harrison PR. The structure of the mouse glutathione peroxidase gene: the selenocysteine in the active site is encoded by the 'termination' codon, TGA. // EMBO J. 1986. - V.5 N.6. - P. 1221-1227.

47. Chang C.-P., Pan S.-P., Lin M.-T. A nitric oxide dopamine link pathway in organum vasculosum laminae terminalis of rat brain exerts control over blood pressure // British Journal of Pharmacology. 2001. V.132. P. 1524-1530.

48. Chevillard C., Barden N., Saavedra J.M. Twenty-four hour rhythm in monoamine oxidase activity in specific areas of the rat brain stem. // Brain Res. 1981. - Vol.223, №1. - P.205-209.

49. Chiba A., Akema Т., Toyoda J. Effects of pinealectomy and melatonin on the timing of the proestrous luteinizing hormone surge in the rat. // Neuroendocrinology. 1994. - Vol.59, №2. - P. 163168.

50. Choudhary G., Hansen H. Human health perspective on environmental exposure to hydrazines: a review. // Chemosphere. 1998. - Vol.37, №5. - P.801-843.

51. Christ W., Rakow D., Fernandes M., Magour S. A simple and sensitive spectrophotometric determination of monoamine oxidase activity // Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 1973 - V.11,N.9 -367-370.

52. Colman A.S., Miller J.H. ух-1 Opioid receptor stimulation decreases body temperature in conscious, unstrained neonatal rats.// Experimental Biology and Medicine. 2002. - V. 227. - P. 377 -381.

53. Colombo J.A., Baldwin D.M., Sawyer C.H. Timing of the estrogen-induced release of LH in ovariectomized rats under an altered lighting schedule. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974. - V.145, №3.-P.l 125-1127.

54. Cohen G., Farooqui, R., Kesler, N. Parkinson disease: a new link between monoamine oxidase and mitochondrial electron flow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 -V.94 - P. 4890-4894.

55. Crumeyrolle-Arias, M., Medvedev, A., Cardona, A., Barritault, D., Glover, V. In situ imaging if specific binding of 3H.isatin in rat brain // Journal of Neurochemistry 2003 - V.84. - P.618-620.

56. Curzon G. The turnover of 5-hydroxytryptamine // Pycock C.J., Taberner P.V. (Eds.) Central neurotransmitter turnover. Baltimore: Univ. Park Press, 1981. - P.59-80.

57. Daiguji M., Mikuni M., Okada F., Yamashita I. The diurnal variations of dopamine-beta-hydroxylase activity in the hypothalamus and locus coeruleus of the rat. // Brain Res. 1978. - Vol.155.- P.409-412.

58. Davies MH, Bozigian HP, Merrick BA, Birt DF, Schnell RC. Circadian variations in glutathione-S-transferase and glutathione peroxidase activities in the mouse // Toxicol. Lett. 1983. - V.19. N.l-2. -P. 23-27.

59. Deitrich R.A., Erwin V.G. A convenient spectrophotometric assay for monoamine oxidase // Anal. Biochem. 1969 - V.30,N.3 -P.395-402.

60. Diaz E., Fernandez C., Castrillon P.O., Esquifino A.I., Marin В., Diaz Lopez B. Effect of exogenous melatonin on neuroendocrine-reproductive function of middle-aged female rats. // J. Reprod. Fertil. -1999. Vol.117, №2. - P.331-337.

61. Donnelly, C., Murphy, D.L. Substrate- and inhibitor-related characteristics of human platelet monoamine oxidase // Biochem. Pharm. 1977 - N.26. - P.853-858.

62. Everett J. W., Sawyer С. H. A 24- hour periodicity in the "LH- release apparatus" of female rat, disclosed by barbiturate sedation. // Endocrinology. 1950. - V.47. - P.198- 218.

63. Finley J., Kincaid R. Effect of sex and time of sampling on selenium and glutathione peroxidase activity in tissues of mature rats // Biol. Trace Elem. Res. -1991. V.29. N.3. - P. 181-191.

64. Flatmark T. Catecholamine biosynthesis and physiological regulation in neuroendocrine cells. // Acta. Physiol. Scand. 2000. - Vol.168, №1. - P.l-17.

65. Gauer F., Masson-Pevet M., Stehle J., Pevet P. Daily variations in melatonin receptor density of rat pars tuberalis and suprachiasmatic nuclei are distinctly regulated. // Brain Res. 1994. - Vol.641, №.1.- P.92-98.

66. Gillette M.U., McArthur A J. Circadian actions of melatonin at the suprachiasmatic nucleus // Behav. Brain Res. 1996.- Vol.73. - P. 135-139.

67. Glover, V., Halket, J.M., Watkins, PJ., Clow, A., Goodwin, B.L., Sandier, M. Isatin: identity with purified endogenous monoamine oxidase inhibitor tribulin // Journal of Neurochemistry. 1988. - V.51. -P.656.

68. Gouaze V., Mirault M.-E., Carpentier S., Salvayre R., Levade Т., Andrieu-Abadie N. Glutathione Peroxidase-1 Overexpression Prevents Ceramide Production and Partially Inhibits Apoptosis in

69. Grantyn, V.A., Ivanova, G.V. Changes in monoamine concentration and monoamine oxidase activity in the arcuate nucleus of the hypothalamus during the estrous cycle // Bull. Exp. Biol. Med. 1974. -V.78, N.3. -P.1066-1068.

70. Gunnet J.W., Lookingland K.J., Moor K.E. Effects of gonadal steroids on tuberoinfiindibular and tuberohypophyseal dopaminergic neural activity in male and female rats // Proc. Soc. Biol. Med. -1986. Vol. 183. - №1. - P.48-53.

71. НП1, M.F.; Pawan, K. Singal, PhD. Right and Left Myocardial Antioxidant Responses During Heart Failure Subsequent to Myocardial Infarction // Circulation. 1997. - V.96. - P. 2414-2420.

72. Hoffmann J.C. Effects of light deprivation on the rat estrous cycle. // Neuroendocrinology. 1967. -Vol.2.-P. 1-10.

73. Horvath T.L., Cela V., van der Веек E.M. Gender-specific apposition between vasoactive intestinal peptide-containing axons and gonadotrophin-releasing hormone-producing neurons in the rat. // Brain Res. 1998. - Vol. 795. -P.277-281.

74. Horvath T.L. Suprachiasmatic efferents avoid phenestrated capillaries but innervate neuroendocrine cells, including those producing dopamine. // Endocrinology. 1997. - Vol.138, №3. - P.1312-1320

75. Jamali K.A., Tramu G.Control of rat hypothalamic proopiomelanocortin neurons by a circadian clock that is entrained by the daily light-off signal. // Neuroscience. 1999. - Vol.93, №3. - P. 10511061.

76. Jameson R., B. Carlson, M. Butz, K. Esser, D. Hatfield A. M. Diamond. Selenium Influences the Turnover of Selenocysteine tRNASer.Sec in Chinese Hamster Ovary Cells // J. Nutr. 2002. - V.132. -P. 1830-1835.

77. Jurjens, H., Pratt, J., Woldring, M. Radioimmunoassay of plasma estradiol without extraction and chromatography // J. Clin. Endocrinology and Metabolism. 1975. - V.40. - P. 19-25.

78. Kalra S.P., Horvath Т., Naftolin F., Xu В., Pu S., Kalra P.S. The interactive language of the hypothalamus for the gonadotropin releasing hormone (GNRH) system. // J Neuroendocrinol. 1997. -Vol.9, №8. - P.569-576.

79. Kalra S.P. Mandatory neuropeptide-steroid signaling for the preovulatory luteinizing hormone-releasing hormone discharge. // Endocr. Rev. 1993. - Vol.14, №5. - P.507-538.

80. Kamberi I.A., Kobayashi Y. Monoamine oxidase activity in the hypothalamus and various other brain areas and in some endocrine glands of the rat during the estrous cycle // J. Neurochem. 1970. V. 17. P. 261-268.

81. Karbownik M., Reiter R.J., Garcia J.J., Tan D.-X. Melatonin reduces phenylhydrazine-induced oxidative damage to cellular membranes: evidence for the involvement of iron. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. - V.32 - P. 1045-1054.

82. Kawakami M., Arita J., Yoshioka E. Loss of estrogen-induced daily surges of prolactin and gonadotropins by suprachiasmatic nucleus lesions in ovariectomized rats. // Endocrinology. 1980. -Vol.106, №4.-P.l087-1092.

83. Kennaway D.J. The role of circadian rhythmicity in reproduction // Human Reproduction Update. -2005.- V. 11.N. 1.- P. 91-101.

84. Khan, I. A., Thomas, P. Disruption of neuroendocrine control of luteinizing hormone secretion by Arochlor 1254 involves inhibition of hypothalamic tryptophan hydroxilase activity // Biology of Reproduction. 2001. V. 64. P. 955 964.

85. Khavinson V. Kh. Peptides and ageing // Endocrinology Letters. 2000. - Vol. 23. Special Issue.

86. Knappen M., Zusterzeel P., Peters W., Steegers E. Glutathione and glutathione-related enzymes in reproduction. A review./ European J. Of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 1999. -V. 82.-P. 171-184.

87. K6chli H., Von Wartburg J.P. A sensitive photometric assay for monoamine oxidase // Anal. Biochem. 1978 - V.84,N.l - P. 127-135.

88. Krajl M. A rapid microfluorimetric determination of monoamine oxidase // Biochem. Pharmacol. -1965 V.14,N.l 1 - P. 1684-1686.

89. Kroon, M.C., Veldstra, H. Multiple forms of rat brain mitochondrial monoamine oxidase. Subcellular localization. FEBS Letters 1972 -N. 24. - P. 173-176.

90. Lang U., Rivest R.W., Schlaepfer L.V., Bradtke J.C., Aubert M.L., Sizonenko P.C. Diurnal rhythm of melatonin action on sexual maturation of male rats. // Neuroendocrinology. 1984. - Vol.38, №4. -P.261-268.

91. Lapenna D, De Giola S, Mezzetti A, Porreca E, Ciofani G, Marzio L, Capani F, Di Ilio C, Cuccurulo F. Circadian variations in antioxidant defences and lipid peroxidation in the rat heart // Free Radic. Res. Commun. 1992. - V.17. N.3. - P. 187-194.

92. Lavoie L., Tremblay A., Mirault M.-E. Distinct oxidoresistance phenotype of human T47D cells transfected by rat glutathione S-transferase Yc Expression Vectors // J. Biol. Chem. 1992. - V.267. N.6. - P. 3632-3636.

93. Lee M.K., Hwang B.Y., Lee S.A., Oh G.J., Choi W.H., Hong S.S., Lee K.S., Ro J.S. l-Methyl-2-undecyl-4(lH)-quinolone as an irreversible and selective inhibitor of type В monoamine oxidase // Chem. Pharm. Bull. 2003. - V. 51. N. 4. - P. 409-411.

94. Lee S.S., LeeJ.J., CheongMJ., Kim Y.H., Kim Y., Yun Y.P., Lee C.K., LeeM.K. Inhibitory effects of ethaverine, a homologue of papaverine, on monoamine oxidase activity in mouse brain // Biol. Pharm. Bull. 2001. - V. 24. N. 7. - P. 838-840.

95. Levitt M., Spector S., Sjordsma A. et al. Elucidation of the rate-limitting step in norepinephrine biosynthesis in perfused guinea pig heart // J. Pharmacol. 1965. - Vol. 148. - №1.

96. Levitt P., Pintar, J.E., Breakefield, X.O. Immunocytochemical demonstration of monoamine oxidase В in brain astrocytes and serotonergic neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. -P.6385-6389.

97. Li S., Givalois L., Pelletier G. Effects of aging and melatonin administration on gonadotropin-releasing hormones (GnRH) gene expression in the male and female rat.// Peptides.- 1997.- VI8.-P.1023-1028.

98. Li X., Borjigin J., Snyder S.H. Molecular rhythms in the pineal gland. // Curr Opin Neurobiol. -1998. Vol.8, №5. - P.648-651.

99. Lippmann, W. Relationship between hypothalamic norepinephrine and serotonin and gonadotrophin secretion in the hamster//Nature. 1968. V. 218. P. 173-174.

100. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenolreagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - №2. - P.265-275.

101. Maker, H.S., Weiss, C., Silides, D.J., Cohen, G. Coupling of dopamine oxidation (monoamine oxidase activity) to glutathione oxidation via the generation of hydrogen peroxide in rat brain homogenates // J. Neurochem. 1981. - V.36, N.2. - P.589-593.

102. Manesh V.B., Brann D.W. Regulation of the preovulatory gonadotropin surge by endogenous steroids. // Steroids. 1998. - Vol. 63. - P.616-629.

103. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J. Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations // Brazilian Journal of Biology. 2002. - V.62. N.4a. - P.609-614.

104. Maser R., Magenheimer В., Calvet J. Mouse plasma glutathione peroxidase // J. Biol. Chem. -1994. V.269. N.43. - P. 27066-27073.

105. McCormack C.E., Sridaran R. Timing of ovulation in rats during exposure to continuous light: evidence for a circadian rhythm of luteinizing hormone secretion. // J. Endocrinol. 1978. - Vol.76, №1. - P.135-144.

106. Medvedev, A.E., Glover, V. Tribulin and endogenous MAO-inhibitory regulation in vivo // Neurotoxicology. 2004. - V.25. - P. 185-192.

107. Meites, J. Remembrance: neuroendocrinology and aging. A perspective // Endocrinology. 1992.- Vol. 130. No.6 - P.3107-3108.

108. Merchenthaler, I., Gores, G., Setalo, P., Petrusz, P. Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons and pathways in the rat brain // Cell and tissue research 1984 - V.237 - N. 1 - P. 15-29.

109. Mohankumar P.S., Thyagarajan S., Quadri S.K. Cyclic and age-related changes in norepinephrine concentrations in the medial preoptic area and arcuate nucleus. // Brain Res. Bull. 1995. - Vol.38, №6.- P.561-564.

110. Mohankumar P.S., Thyagarajan S., Quadri S.K. Cyclic changes in the release of norepinephrine and dopamine in the medial basal hypothalamus // Brain Res. 1995. - V.689. - P.122-128.

111. Mohankumar S.M.J., Mohankumar P.S. Aging alters norepinephrine release in the madial preoptic area in response to steroid priming in ovariectomized rats // Brain Research. 2004. V. 1023. P.24-30.

112. Moloney S.J., Prough R.A. Biochemical toxicology of hydrazines. // Hodgeson E., Bend J.R., Philpot R.M. (Eds.). Reviews Biochemical Toxicology. Vol. 5. New York: Elsevier, 1983. - P.313-346.

113. Morin LP., Fitzgerald K.M., Rusak В., Zucker I. Circadian organization and neural mediation of hamster reproductive rhythms. // Psychoneuroendocrinology. 1977. - Vol.2, №1. - P.73-98.

114. Naoi, M., Nagatsu, T. Inhibition of type A monoamine oxidase by methylquinolines and structurally related compounds // J. Neurochem. 1988. - V.50. - P. 1105-1110.

115. Nappi R.E., Rivest S. Effect of immune and metabolic challenges on the luteinizing hormone-releasing hormone neuronal system in cycling female rats: an evaluation at the transcriptional level // Endocrinology. 1997. - V.l38. N.4. - P.l374-1384.

116. Journal of Endocrinology. 2003. - V.177. - P.3-6.

117. Palm I.F., van der Веек E.M., Wiegant V.M., Buijs R.M., Kalsbeek A. The stimulatory effect of vasopressin on the luteinizing hormone surge in ovariectomized, estradiol-treated rats is time-dependent. //Brain Res. 2001. - Vol.901, №1-2. - P. 109-116.

118. Palm I.F., van der Веек E.M., Wiegant V.M., Buijs R.M., Kalsbeek A. Vasopressin induces a luteinizing hormone surge in ovariectomized, estradiol-treated rats with lesions of the suprachiasmatic nucleus. //Neuroscience. 1999. - Vol.93, №2. - P.659-666.

119. Pang S.F., Li L., Ayre E.A. et al. Neuroendocrinology of melatonin in reproduction: recent developments. // J. Chem. Neuroanat. 1998. - Vol.14, №3-4. - P.l57-166.

120. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press, San Diego. 1982.

121. Ramos Martinez J. I., Launay J.-M., Dreux C. A sensitive fluorimetric microassay for determination of glutathione peroxidase activity. Application to human blood platelets. // Anal. Biochem. 1979. V.98. P. 154-159.

122. Rasmussen D.D. Diurnal modulation of rat hypothalamic gonadotropin-releasing hormone release by melatonin in vitro. // J. Endocrinol. Invest. 1993. - Vol.16, №1. - P. 1-7.

123. Rasmussen D.D. The interaction between mediobasohypothalamic dopaminergic and endorphinergic neuronal systems as a key regulator of reproduction: an hypothesis. // J. Endocrinol. Invest. -1991. Vol.14, №4. - P.323-352.

124. Redman J.R. Circadian entrainment and phase shifting in mammals with melatonin. // J. Biol. Rhythms. 1997. - Vol.12, №6. - P.581-587.

125. Reiter R.J. Pineal function during aging: attenuation of the melatonin rhythm and its neurobiological consequences. // Acta Neurobiol. Exp. 1994. - Vol.54 (Suppl.). - P.31-39.

126. Ren, В., Huang W., Akesson, B. & Ladenstein R. (1997) The Crystal Structure of Seleno-Glutathione Peroxidase from Human Plasma at 2.9 A Resolution // J. Mol. Biol. V.268. - P. 869-885.

127. Reuss S. Components and connections of the circadian timing system in animals // Cell Tissue Res. 1996. - Vol.285. - P.353-378.

128. Rivest, S., Rivier, C. The role of corticotropin-releasing factor and interleukin-1 in the regulation of neurons controlling reproductive functions // Endocrine Reviews. 1995. V. 16. N. 2. P. 177-199.

129. Simerly R.B., Chang C., Muramatsu M., Swanson L.W. Distribution of androgen and estrogen receptor mRNA-containing cells in the rat brain: an in situ hybridization study. // J. Сотр. Neurol. -1990. Vol.294, №1. - P.76-95.

130. Simpkins, J.W., Mueller, G.P., Huang H.H., Meites, J. Evidence for depressed catecholamine and enhanced serotonin metabolism in aging male rats: possible relation to gonadotropin secretion // Endocrinology 1977.-Vol. 100-P.l 672-1678.

131. Singh A., Shichi H. A novel glutathione peroxidase in bovine eye // J. Biol. Chem.- 1992. V.123. N.40.-P. 26171-26178.

132. Slotten H.A., Pitrovsky В., Pevet P. Influence of the mode of daily melatonin administration onentrainment of rat circadian rhythms. // J. Biol. Rhythm. 1999. - Vol.14, №5. - P. 347-353.

133. Snyder S.H., Hendley E.D. A simple and sensitive fluorescence assay for monoamine oxidase and diamine oxidase // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1968 - V.163 - P.386-392.

134. Suzuki O., Noguchi E., Yagi K. A simple fluorometric assay for type В monoamine oxidase activity in rat tissues // J. Biochem. 1976 - V.79, N.6 - P. 1297-1299.

135. Tabor C.W., Tabor H., Rosenthal S.M. Purification of amine oxidase from beef plasma // J. Biol. Chem. 1954 - V.208,N.2 - 645-661.

136. Takahashi H., Takahara S. A sensitive fluorometric assay for monamine oxidase based on the formation of 4,6-quinolinediol from 5-hydroxykynurenamine // J. Biochem. 1968 -V.64,N.l - P.7-11.

137. Terasawa E. Davis GA. The LHRH neuronal system in female rats: relation to the medial preoptic nucleus. // Endocrinol. Jpn. 1983. - Vol.30, №3. - P.405-417.

138. Thyagarajan S., Mohankumar P.S., Quadri S.K. Cyclic changes in the release of norepinephrine and dopamine in the medial basal hypothalamus: effects of aging // Brain Research. 1995. V.689. P.122-128.

139. Thyagarajan, S., Meites, J., Quadri, S. K. Deprenyl reinitiates estrous cycles, reduces serum prolactin, and decreases the incidence of mammary and pituitary tumors in old acyclic rats // Endocrinology. 1995. V.136. N.3. P. 1103-1110.

140. Tipton K.F. A sensitive fluorometric assay for monoamine oxidase // Anal. Biochem. 1969 V.28,N.1-P.318-325.

141. Toth B. A review of the natural occurrence, synthetic production and use of carcinogenic hydrazines and related chemicals. // In Vivo. 2000. - Vol.14, №2. - P.299-319.

142. Toth B. Toxicities of hydrazines: a review. // In Vivo. 1988. - Vol.2, №3-4. - P.209-242.

143. Trentini G.P., Genazzani A.R., Criscuolo M. et al. Melatonin treatment delays reproductive aging of female rat via the opiatergic system. // Neuroendocrinology. 1992. - Vol.56, №3. - P.364-370.

144. Ucar, G. Semicarbazide-sensitive amine oxidase: biochemical and physiological properties// Turk. J. Biochem. 2004. - V.29. - N.3. - P.247-254.

145. Van der Веек E.M. Circadian control of reproduction in the female rat. // Prog. Brain Res. 1996. -Vol.111. -P.295-320.

146. Vanecek j., Illnerova H. Effect of short and long photoperiods on pineal N-acetyltransferase rhythm and on growth of testes and brown adipose tissue in developing rats. // Neuroendocrinology. -1985. Vol.41, №3. - P.186-191.

147. Vanecek J. Cellular mechanisms of melatonin action. // Physiol. Rev.- 1998.- Vol. 78.- P. 687-721.

148. Vera J. C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable turbidimetric procedure // Analyt. Biochem. 1988. Vol.174. P.187 196.

149. Veryovkina I.V., Samed M.M., Gorkin V.Z. Mitochondrial monoamine oxidase of rat liver: reversible qualitative alterations in catalytic properties // Biochim. Biophys. Acta. 1972 - V.258,N.l - P.56-70.138

150. Von Harsdorf, R. M. D., Pei-Pheng Li, Ph. D., Rainer Dietz, M. D. Signaling pathways in reactive oxygen species-induced cardiomyocyte apoptosis // Circulation. 1999. - V. 99. - P. 2934 -2941.

151. Walker R.F. Melatonin:serotonin interaction during termination of the LH surge in rats. // Prog. Clin. Biol. Res. 1982. - Vol.92. - P. 167-176.

152. Warren W.S., Hodges D.B., Cassone V.M. Pinealectomized rat entrain and phase-shift to melatonin injections in dose-dependent manner. // J. Biol. Rhythms. 1993. Vol. 8. - P. 233-245.

153. Weetman D.F., Sweetman A J. Realistic estimations of kinetic constants for the oxidation of naturally occurring monoamines by monoamine oxidase // Anal Biochem. 1971 - V.41,N.2 - P.517-521.

154. Weissbach, H., Smith, E., Daly, J. W., Witkop, В., Udenfriend, S. A rapid spectrophotometric assay of monoamine oxidase based on the rate of disappearance of kynuramine // J. Biol. Chem. 1960. Vol. 235, NAP .1160- 1163.

155. Wendel A. Glutathione peroxidase // Methods in enzymology. -1981. V. 77. - P. 325-332.

156. Willoughby, J., Glover, V., Sandler, M. Histochemical localisation of monoamine oxidase A and В in rat brain // Journal of Neural Transmission. 1988. V. 74. N. 1. P. 29-42.

157. Witkin J.W., Paden C.M., Silverman A.J. The luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) systems in the rat brain //Neuroendocrinology. 1982. - V.35. N.6. - P.429-438.

158. Wuttke W., Jarry H., Feleder C., Moguilevsky J., Leonhardt S., Seong J.Y., Kim K. The neurochemistry of the GnRH pulse generator. // Acta Neurobiol. Exp. 1996. - Vol.56, №3. - P.707-713.

159. Yamamoto, S., Satoh, Т., Saito, R. Blockade of spontaneous ovulation by isocarboxazid (MAO-inhibitor) in rats // Endocrinol Jpn. 1974. V. 21. N. 1. P. 9-12.

160. Ying W., Sh.-K. Han, J. W. Miller, R. A. Swanson. Acidosis Potentiates Oxidative Neuronal Death by Multiple Mechanisms // Journal of Neurochemistry. 1999. - V.73. No.4. - P.1549-1556.

161. Youdim, M. В. H. Variation in monoamine oxidase activity in rat brain crude mitochondrial fractions prepared by rate zonal centrifugation // Journal of Neural Transmission. 1976. V. 38. N. 1. P. 15-29.

162. Young M.W., Kay S.A. Time zones: a comparative genetics of circadian clocks. // Nat. Rev. Genet. 2б01. - Vol.2, №9. - P.702-715.

163. Yu, A. Studies on the pargyline-binding site of different types of monoamine oxidase // Can. J. Biochem.-1981 -N. 59. P.30-37.

164. Zeller V., Ramachander G., Zeller E.A. Amine oxidases. XXI. A rapid method for the determination of the activity of monoamine oxidase and monoamine oxidase inhibitors // J. Med. Chem. 1965 - V.8, V.4 - P.440-443.

165. Zisapel N., Egozi Y., Laudon M. Circadian variations in the inhibition of dopamine release from adult and newborn rat hypothalamus by melatonin. // Neuroendocrinology. 1985. - Vol.40, №2. -P.102-108.

166. Zolovick A.J., Pearse, R., Boehlke, K.W., Eleftheriou, B.E. Monoamine oxidase activity in various parts of the rat brain during estrous cycle // Science 1966. -Vol. 154. - N.3749. - P.649.

Информация о работе

Разыграев, Алексей Вячеславович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Участие ферментов окислительного метаболизма моноаминов в гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы