Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль молекулярной динамики в реакциях переноса электрона в структуре нативных и мутантных реакционных центров фотосинтезирующих бактерий

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль молекулярной динамики в реакциях переноса электрона в структуре нативных и мутантных реакционных центров фотосинтезирующих бактерий"

На правах рукописи

Горячев Николай Сергеевич

РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ В РЕАКЦИЯХ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА В СТРУКТУРЕ НАТИВНЫХ И МУТАНТНЫХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.01.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

005555815

27 НОЯ 2014

Москва —2014

005555815

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем химической физики РАН

Научный руководитель: профессор, доктор физико-математических наук Котельников Александр Иванович

Официальные оппоненты:

Крупянский Юрий Федорович доктор физико-математических наук, зам. директора Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, г. Москва.

Черепанов Дмитрий Александрович, кандидат физико-математических наук, ст.н.с. Института физической химии и электрохимии имени А. Н. Фрумкина РАН, г. Москва.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино.

Защита состоится 11 декабря 2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, Биологический факультет, аудитория_

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова и на сайте http://www.bio.msu.ru/dissertations/view.php?ID=649

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Известно, что ключевым моментом многих биохимических процессов, происходящих в живых организмах и растениях, являются реакции переноса электрона. В качестве наиболее яркого примера можно привести процесс, происходящий в структуре реакционных центров (РЦ) - белковых комплексов, осуществляющих направленный трансмембранный перенос зарядов в процессе фотосинтеза, в результате чего происходит запасание энергии. Высокий квантовый выход процесса разделения зарядов в результате фотовозбуждения пигментов в структуре РЦ позволяет рассматривать их в качестве перспективных фотопреобразователей световой энергии в электрическую, прообразов элементов молекулярной электроники и логических устройств. Актуальность исследования закономерностей таких процессов является общепризнанной и является ключевым моментом многих исследовательских программ. Известно, что эффективность переноса электронов в структуре белков определяются как особенностями их структуры, так и динамическими характеристиками белковой глобулы. В тоже время до последнего времени большинство исследований влияния молекулярной динамики на эффективность дистанционного переноса электрона в белках выполнялись лишь на качественном уровне.

В данной диссертационной работе представлено развитие и экспериментальная проверка ряда новых моделей, позволяющих провести исследование влияния различных типов молекулярной динамики на эффективность реакций переноса электрона в структуре реакционных центров фотосинтезирующих бактерий и осуществить количественное определение конкретных физических параметров, контролирующих скорость такого переноса.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института проблем химической физики РАН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 02-03-32330-а, 05-03-33127-а, 08-03-00094-а) и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН № 24 «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов»

Цели и задачи работы. Основной целью работы являлось экспериментальное и теоретическое исследование роли молекулярной динамики в процессе переноса электрона в структуре реакционных центров фотосинтезирующих бактерий.

Дня осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1. Развитие экспериментального метода анализа релаксационной динамики матрицы в микро- и миллисекундном диапазоне времен по регистрации

релаксационных сдвигов спектров фосфоресценции ксантеновых красителей и применение данного метода для исследования релаксационной динамики вязких растворителей и белков в диапазоне температур 295 - 170 К.

2. Создание эмпирических и микроскопических моделей для описания процесса переноса электрона в структуре белковых глобул с учетом вклада различных степеней свободы в процесс диэлектрической реорганизации белковой матрицы.

3. Проведение анализа экспериментальных данных по кинетике переноса электрона от восстановленного проксимального гема с-559 цитохрома к катион-радикалу димера бактериохлорофилла Р+ в структуре нативных и мутантно модифицированных РЦ из Rps. viridis и Rps. sulfoviridis в диапазоне температур 295 - 8 К с целью определения количественных параметров, описывающих квантовые и классические, в том числе диффузионные, степени свободы.

4. Анализ в рамках предложенных моделей механизмов влияния молекулярной динамики среды на процессы переноса электрона в белках и определение основных квантомеханических и термодинамических параметров, определяющих скорость переноса.

Научная новизна. Разработаны простые экспериментальные подходы определения количественных параметров, описывающих процессы диэлектрической релаксации в структуре белков и вязких сред по регистрации кинетики релаксационных сдвигов спектров флуоресценции и фосфоресценции люминесцентных зондов.

Сформулированы комбинированные модели, учитывающие вклад различных типов подвижности в процесс переноса электрона и позволяющие с высокой точностью описать кинетику переноса электрона в структуре белков в широком диапазоне температур.

С помощью предложенных моделей впервые определены численные значения основных параметров, описывающих квантовые и динамические эффекты в реакциях переноса электрона от восстановленного проксимального гема с-559 цитохрома к катион-радикалу димера бактериохлорофилла Р+ в структуре нативных и мутантно модифицированных РЦ из Rps. viridis и Rps. sulfoviridis.

Получена температурная зависимость постоянной времени релаксации белковой глобулы РЦ в широком диапазоне температур. Обсуждается роль внутрибелковых молекул воды и системы водородных связей в организации динамических процессов в белковой глобуле и определяемых ими условий организации реакций переноса электрона.

Научно-практическая значимость исследования. Разработанная методика анализа релаксационной динамики матрицы в микро- и миллисекундном диапазоне времен может выступать в роли универсального инструмента в физической химии для

изучения микроскопической динамики в растворах и белках. Предложенные модели представляют интерес для исследователей, занимающихся вопросами переноса электрона в белках и в других высокоорганизованных молекулярных системах. Результаты диссертационной работы могут быть использованы для дальнейшего развития теории переноса электрона в белках.

Личный вклад автора. Автором была разработана и успешно применена в исследованиях методика регистрации релаксационных сдвигов стационарных и мгновенных спектров флуоресценции и фосфоресценции ксантеновых красителей. В работе представлены результаты исследований, выполненных лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением роли релаксации среды в реакциях переноса электрона в белках. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, в их проведении и в обобщении результатов исследований.

Положения, выносимые на защиту

1. Методика определения времен диэлектрической релаксации среды по кинетике релаксационных сдвигов спектров люминесценции в различных растворителях и белках.

2. Эмпирическая модель переноса электрона в белках, на примере анализа кинетики ПЭ в структуре реакционного центра фотосинтезирующих бактерий.

3. Анализ кинетики переноса электрона в структуре нативных и мутантно-модифицированных реакционных центров в рамках микроскопической двухмодовой модели.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены в виде устных и стендовых докладов на 43 российских и международных конференциях, в том числе: Всероссийская конференция «Разообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (Пущино, 2012), International conference "Organic Nanophotonics", (Санкт-Петербург, 2009), XIX Пущинские чтения по фотосинтезу (Пущино, 2009),. International Conference on Biological Inorganic Chemistry (Vienna, Austria, 2007), XX Симпозиум «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), XIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Москва, 2007), VII Voevodsky conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Chernogolovka, 2007), 14th European Bioenergetics Conference (Moscow, 2006), International conference "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems" (Pushchino, 2006), 6-th International Conference on Low Temperature Chemistry (Chernogolovka, 2006), International conference "Bioca-talysis: Fundamentals and Applications" (Sankt-Petersburg, 2005), The second international conference "Highly-organized catalytic systems" (Moscow, 2004), III Съезд биофизиков

России (Воронеж, 2004), XVII Pushchino Readings in Photosyntesis and International Conference "Primary Process of Photosyntesis in Bacterium and Plant Photosystem II" (Pushchino, 2002), 201st Meeting of Electrochemical Society (Philadelphia, USA, 2002), 16-th International Conference on Biodectrochemistry and Bioenergetic (Bratislava, Slovakia 2001), 20-th International Conference on Photochemistry (Moscow, 2001), П Съезд биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации

По материалам работы опубликовано 7 статей в рецензируемых российских и международных научных журналах, входящих в перечень ВАК, и 41 тезиса докладов на всероссийских и международных симпозиумах и конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129-ти страницах, включает введение, литературный обзор, экспериментальную часть, результаты и обсуждения, выводы и список использованной литературы (143 наименование). В качестве иллюстраций использовано 25 рисунка и 3 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ

Введение

Во введении обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Обзор литературы

Литературный обзор посвящен анализу литературных данных по структурным и динамическим факторам, контролирующим реакции переноса электрона в белках, и состоит из трех частей. Первая и вторая части посвящены анализу реакций переноса электрона в структуре белков в рамках неадиабатического и адиабатического приближений.

Согласно теории Маркуса, в рамках неадиабатического приближения при условии быстрой реорганизации матрицы константу скорости переноса электрона

ККА

Ket можно представить в виде

/

bNA _ ,NA .

1 NA

= k0 exp

'^ЩГ) (1Х ГДе ° ~П^4хЯкйТ'

к«"~ предэкспоненциальный фактор, УаЬ- интеграл перекрывания, ДО - свободная энергия реакции, X - энергия ядерной реорганизации, й - постоянная Планка, кв -постоянная Больцмана. Неадиабатическое приближение справедливо при условии

4nV'hT < hX, где т - время реорганизации среды. В этом случае экспоненциально зависит от расстояния Л и не зависит от частоты релаксации среды v=1/t.

Если условие неадиабатичности не выполняется, то в рамках адиабатического приближения

Ъ? - v-A-J- (2), гяе ^ JM + Xf sj Я ^

I квт) " 4Л еа{16лквТ)

ss и еа — значения диэлектрической проницаемости при статических измерениях и в пределе высоких частот. В этом случае kf:D определяется молекулярной динамикой среды и не зависит от расстояния переноса R. Такая ситуация реализуется в белках, где в силу размеров и структуры белковой глобулы релаксация замедлена и может конкурировать с ПЭ. Но она же и наименее изучена.

Различия в функциональной зависимости к^ от R и v между неадиабатическим и адиабатическим приближениями очень важны для анализа реакций переноса электрона в белках, потому что как R, так и v определяются пространственной и динамической организацией макромолекул и могут значительно варьироваться от белка к белку. Учет этого обстоятельства может быть определяющим для корректного количественного анализа экспериментальных результатов.

В третьей части литературного обзора анализируются особенности реакций переноса электронов в структуре РЦ из фотосинтезирующих бактерий.

Глава 2. Материалы и методы

Стационарные спектры флуоресценции, а также стационарные и мгновенные спектры фосфоресценции регистрировали на спектрофлуориметре "Cary-Eclipse". Кинетика затухания флуоресценции регистрировалась на 16-канальном детекторе PML-Spec с использованием счетчика фотонов SPC-830 фирмы Becker & Hickl GmbH.

Температура образцов поддерживалась с помощью криостата КРИОПТ-Ю5 с точностью 0.1 К. Температура образцов постепенно понижалась со скоростью 3-5 К/мин. Далее образец выдерживался 2-3 минуты при требуемой температуре и затем осуществлялась регистрация спектральных параметров красителей.

Эксперименты были выполнены на изолированных реакционных центрах из Rps. Viridis и Rps. Sulfoviridis, в которых тирозин L162 (Y) был замещён фенилаланином (F), триптофаном (W), глицином (G), метионином (М), лейцином (L), треонином (Т) или гистидином (Н). Они проводились в водных растворах с содержанием глицерина 60 об. % при pH 8. Кинетика восстановления фотоокисленной специальной пары Р+ измерялась на длине волны 1283 нм в диапазоне времён до 2000-4000 мкс.

Глава 3.

При анализе реакций ПЭ важно определить времена релаксации белков. Для этого мы развиваем новый экспериментальный метод, основанный на анализе релаксационной динамики матрицы в микро- и миллисекундном диапазоне времен по регистрации релаксационных сдвигов мгновенных спектров фосфоресценции и стационарных спектров флуоресценции ксантеновых красителей. Этот метод применяется для исследования релаксационной динамики белков в диапазоне температур 295 - 90 К.

При исследовании перестройки матрицы в непосредственном окружении возбужденной молекулы-фотохрома данный подход позволяет более адекватно оценить взаимосвязь «динамика - функция» по сравнению с интегральными характеристиками, полученными методом прямого измерения диэлектрической релаксации. Это важно при исследовании процессов переноса электрона в структуре природных белков, где мозаика локальных зарядов является чрезвычайно гетерогенной, а их подвижность определяется иерархией структур биологической макромо-лекулы, и может варьироваться в широких пределах.

Комбинированное использование метода флуоресценции и фосфоресценции

с процессах в растворителях или в организованных молекулярных системах в диапазоне от долей наносекунд до секунд.

В первой части главы описано исследование релаксационной динамики в модельной системе - изобутиловом спирте. Исследовались мгновенные и стационарные релаксационные сдвиги спектров фосфоресценции красителей эозина и эритрозина, а также стационарные сдвиги флуоресценции этих красителей в изобутиловом спирте, для которого опубликованы подробные данные по температурной зависимости времен диэлектрической релаксации.

Обнаружено, что при температурах 90 - 120 К сдвигов стационарных и мгновенных спектров фосфоресценции эозина и эритрозина не происходит. При повышении температуры (140-170 К) наблюдается сдвиг как стационарных, так и мгновенных спектров фосфоресценции. В интервале 140 - 170 К изобутанол

позволяет получить информацию о релаксационны

Рис. 1. Кинетические зависимости корреляционной функции ДСС спектра фосфоресценции эозина в изобутаноле при разных температурах и их теоретический анализ в рамках распределения Коула-Давидсона.

проходит точку стеклования и наблюдается динамический стоксов сдвиг (ДСС) в результате размораживания процессов ориентационной дипольной релаксации изобутанола в окружении возбужденного хромофора (рис.1). При температурах 170 -200 К ДСС происходит в субмикросекундном диапазоне времен и не разрешается экспериментальной установкой. Сдвиги стационарных спектров флуоресценции эозина и эритрозина регистрировались в диапазоне 100 - 350 К и обнаруживают максимальный наклон в области 225 К.

Кинетические кривые релаксации при температурах 140-155 К представлены на рис. 1 в виде нормированной корреляционной функции ДСС C(t), определяемой формулой

,3)

v(0) - К(оо)

где v(t), v(0) и v(co) - максимумы спектра фосфоресценции в момент времени t, при t=0 и при t=oo.

Кинетика релаксационных кривых описывалась с помощью интегрального уравнения:

ro

C(t)=]g(T)exp(-t/T)dT (4)

о

где g(t) - функция распределения времен релаксации Коула-Дэвидсона, использующаяся для описания диэлектрических процессов в стеклующихся полярных органических растворителях, определяемая выражениями

g(T) = S'n(7tp)f—1 при 0 < г < г0 н g(t) = 0 при г>т0, (5)

т VTo-V

где т0 - максимальное время релаксации в данной матрице, (5 - параметр, характеризующий форму распределения времен релаксации.

Путем компьютерного моделирования кинетических кривых с помощью интегрального уравнения (4) были определены параметры т0 и (3 и среднее время релаксации матрицы х„ = т0-(3. Как видно из рис.2, в рамках данной модели удается достичь хорошего описания кинетических кривых.

Полученные значения эффективных времен релаксации изобутилового спирта вокруг триплетно возбужденного эозина и эритрозина хорошо совпадают с данными диэлектрических измерений (рис.2).

!|1(тл)

Рис. 2. Аррениусовы зависимости времен молекулярной релаксации молекул изобутанола:

1- среднее время релаксации в рамках модели Коула-Дэвидсона, полученные из анализа функции ДСС фосфоресценции спектра эозина (•) и эритрозина В (о);

2 - данные диэлектрических измерений изобутанола;

3 и 4 - анализ по сдвигу стационарного спектра флуоресценции и фосфоресценции спектра эозина (•) и эритрозина (о).

Согласно простейшей модели диэлектрической релаксации в одноэкспоненциальном приближении, предложенной ранее в работах Ю.Т. Мазуренко (1978), релаксационный сдвиг стационарных спектров люминесценции на половину максимальной величины наблюдается при температуре, когда эффективное время релаксации равно времени жизни возбужденного состояния хромофора. Используя полученные значения времен релаксационных процессов из данных по флуоресценции и фосфоресценции, различающиеся по временам возбуждения на 5 - 6 порядков, по формуле

можно получить значения Еа=0.47 еУ и Еа=0.46 еУ для релаксационных процессов изобутанола в окружении эозина и эритрозина, соответственно (зависимости 3 и 4, рис. 2). В этом случае также наблюдается достаточно хорошее соответствие с полученными значениями времен релаксации и с данными диэлектрических измерений.

Во второй части главы предложенный метод применяется для исследования процессов дипольной релаксации в белках. Исследовалась кинетика ДСС спектров фосфоресценции эозинмалеимида, ковалентно присоединенного к (3-93 5Н группе гемоглобина, растворенного в 75% глицерине. Аналогично исследованиям в изобутаноле, из наблюдаемых релаксационных кинетик были рассчитаны параметры ориентационной дипольной релаксации - максимальные времена релаксации т0, параметр [3, характеризующий форму распределения и средние по распределению

и,

времена релаксации Tav=x0ß- Используя зависимость т от температуры, представляется возможным по формуле (6) оценить энергию активации Еа для исследуемых систем.

На рис. 3 приведены в аррениусовых координатах значения эффективных времен релаксации 66% (v/v) водно-глицеринового раствора в окружении триплетно возбужденного эозина и эозинмалеимида, присоединенного к гемоглобину, а также представлены литературные данные по временам релаксации в сходных системах, полученные различными физическими методами. Видно, что значения характеристических времен релаксации, полученные в данной работе, а также другими независимыми методами, в том числе прямым методом диэлектрических измерений, хорошо согласуются между собой. С помощью разработанной методики

определены энергии активации релаксационной подвижности эозина в растворе (Еа=1.05 eV) и эозинмалеимида, ковалентно присоединенного к ß-93 SH-группе гемоглобина (ЕА=0.43 eV).

Из приведенных

данных следует, что релаксационные процессы в структуре белка и в водно-глицериновом растворе заметно отличаются. Энергии активации для белковых систем примерно в два раза меньше, чем для растворов.

На молекулу эозинмалеимида, присоединенного к гемоглобину, заметное влия-ние, помимо полярного растворителя, могут оказывать как аминокислотные остатки, так и водородные связи белка. Это указывает на возможность значительного

Рис. 3. Аррениусовые зависимости времен молекулярной релаксации:

1 - из диэлектрических измерений 70% (vvt) водно-глицеринового раствора (литературные данные); 2, 3 - полученные методом регистрации ДСС спектров фосфоресценции эозинмалеимида, ковалентно присоединенного к ß-93 SH-группе гемоглобина, и эозина в 66% водно-глицериновом растворе;

4 - из экспериментальных данных по кинетике переноса электрона в реакционных центрах Rps. viridis (глава 4);

5 и 6 - методом мессбауэровской спектроскопии гемового железа в миоглобине и ионов железа в 94% водно-глицериновом растворе (литературные данные);

7 - методом регистрации релаксационных сдвигов стационарных спектров флуоресценции и фосфоресценции эозина.

влияния структуры белковой глобулы на процессы переноса электронов в биологических системах.

Глава 4.

Эта глава посвящена анализу кинетики ПЭ в структуре РЦ фотосинтезируюших бактерий с использованием эмпирических моделей. Она состоит из пяти частей.

Первая часть посвящена анализу кинетических кривых ПЭ в структуре РЦ фотосинтезирующих бактерий в рамках приближения Рипса-Джортнера [Rips I. et al, Chem. Phys. Lett., 1987], согласно которому, если характеристические времена релаксационных процессов в матрице определяются распределением Кола-Девидсона (5), то для константы скорости реакции в начальный момент времени получается выражение:

s„4

J f

exp

(AG + Я)

4 ÄkDT

D

(7)

c-554

—1

c-5561 f „Of

При р = 0 данная формула переходит в формулу (1) описывающую неадиабатическое приближение, а при Р = 1 - в формулу (2), описывающую адиабатическое приближение. Эта формула была использована для анализа температурных зависимостей констант скорости ка для реакций переноса электрона на расстояние 12 А между гемом с-559 и димером бактериохлорофилла Р+ в структуре

РЦ (рис. 4). Значения констант

л _____скорости переноса электрона

определялись из наклона начального участка кинетической кривой (рис. 5). Полученные значения начальных констант при различных температурах и степенях восстановления гемов с-559, с-556 и с-552 приведены на рис. 6. Используя опубликованные ранее значения ДО и X (ЛС] = 0.14 эв, ЛС2 = 0.16 эв, АС, = 0.22 эв и Л = 0.26 эв) \Frolov ЕЖ е( а!., Eur.Biophys.J-, 1996], по формулам (1) или (7) для трех состояний восстановления цитохрома можно получить энергии активации

МЕМБРАНА

'Си

Рис. 4. Структура белкового комплекса реакционного центра с цитохромом из фотосинтезирующих бактерий

Rhodopseudomonas viridis.

£■'=0.014 эВ, Е* =0.009 эВ

Е* =0.0014 эВ. Эти значения не соответствуют экспериментальным зависимостям на рис. 6. Температурные зависимости для к,., линейны в координатах Аррениуса с

P+(t)/P+(0)

E\ =0.073 ±0.01 эВ, £a2 =0.064 ±0.006 эВ и £a3 =0.062 ±0.005 эВ в первом, втором и третьем состоянии восстановления цитохрома, соответственно.

Разрешить противоречие можно, представив энергию активации для константы ka в уравнении (7) в виде суммы

Ei=Er-p + Elt (g) где Ег ■ Р является энергией активации от члена , отражающего динамику среды, и Е'а - энергия активации Маркуса с использованием ДО/ и X.

Из анализа экспериментальных данных получается Р = 0.23, что находится в

__________хорошем соответствии с

величинами f} из опубликованных исследований динамики миоглобина с помощью мессбауэровской спектроскопии в температурном диапазоне 232-245 К [Chang /. et ей., Chem.Phys. 1996\. Однако этот формализм справедлив только для начальных участков

кинетических кривых и не позволяет описать

кинетические кривые на всем их протяжении.

Во второй части главы 4 для анализа

1.4 1.2 1.0 0,8 0,6 0.4 0,2 0.0

V,

'S... .

С- .2»*'J-.";!.']

268 К •-'■...--.•

294"К* " ' ■••-'•

1000

2000

3000

4000

Ммкс

Рис. 5. Кинетика восстановления катион-радикала Р+ в РЦ из Л/и. зЫ/спгтйЫ при различных температурах. Цитохром в первом состоянии восстановления (восстановлен гем с-559, Еш =+360 мВ). Точки — экспериментальные измерения, сплошные линии — компьютерный расчет в соответствии с комбинированной двухмодовой моделью. На вставке - начальные участки кинетических кривых на протяжении 1.5 мкс.

экспериментальных данных используется эмпирическая двухмодовая модель,

базирующаяся на работах Овчинниковой и Суми-Маркуса [Овчинникова М.Я. Теор. и эксп. хим. 198], Sumí Н., Marcus R.A. J.Chem.Pys., 1986]. В рамках этой модели было сделано предположение о возможности диссипации энергии при переносе электрона одновременно по двум степеням свободы: по колебательной q и диффузионной Х\ (рис. 7).

Если движение вдоль обеих координат с/ и Л'| является быстрым, реакция идет по наиболее оптимальной

неадиабатической траектории 1 от точки В| к точке С с минимальной

~ гчпт _

энергией активации Ьа в точке Б]. Однако, если при понижении температуры

движение вдоль

диффузионной координаты Х\ замедляется и реакция переноса электрона вдоль диффузионной координаты становится формально

адиабатической, то

эффективный перенос

электрона продолжает

осуществляться благодаря протеканию реакции преимущественно вдоль колебательной координаты через другое переходное состояние с большей энергией активации 82. Так как процесс релаксации вдоль колебательной координаты

1п к

1000/Г, К'

Рис. 6. Аррениусовские зависимости констант ка для трех состояний восстановления цитохрома. 1 - восстановлен гем с-559; 2 - восстановлены гемы с-559 и с-556; 3 - восстановлены гемы с-559, с-556 и с-552. Пунктиром показаны аррениусовские зависимости для различных состояний

восстановления цитохрома, рассчитанные по формуле (1) и (7) с использованием параметров АС>= 0.14 эв, ЛС2 = 0Л6 эв, ЛО-!, = 0.22 эв и Л = 0.26 эв.

Рис. 7. Поверхность свободной энергии для реакции переноса электрона от гема с-559 цитохрома к катион-радикалу Р' в рамках двухмодовой модели.

Оси д и ^соответствуют колебательной и диффузионной координатам реакции.

быстрый и перенос электрона вдоль этой координаты всегда неадиабатический (для реакций переноса электрона в микросекундном диапазоне времен), то в этом случае реакция протекает в комбинированном адиабатическо-неадиабатическом режиме вдоль пути 2.

Такой сдвиг переходного состояния может быть описан феноменологически с помощью г-зависимых предэкспоненциального фактора и энергии активации. Зависимость от т можно описать функцией <р(т), которая служит для переключения между высокотемпературным (неадиабатическим) и низкотемпературным (адиабатическим) пределами; соответственно, ср(т)~\ при комнатной температуре и <р(т) «1 при низких температурах.

Используя этот подход, были проведены расчеты температурных зависимостей эмпирического параметра Q, который использовался ранее в работах П. Матиса для описания процесса переноса электрона в структуре РЦ для различных состояний восстановления цитохрома в широком диапазоне температур от 296 К до 40 К. В то же время этот анализ был сделан в предположении, что диффузионная координата характеризуется одним характеристическим временем релаксации г, что не позволяло объяснить неэкспоненциальность наблюдающихся экспериментальных кинетик.

В третьей части главы 4 рассмотрена комбинированная двухмодовая модель. Приведенная в предыдущей части модель была усовершенствована путем использования комбинации моделей Овчинниковой-Суми-Маркуса и Рипса-Джортнера.

Функция F(t) = P*(t)l0), описывающая кинетические кривые, может быть записана в виде:

где ке, (г) - зависящая от г константа скорости, g(т) - функция Кола-Девидсона.

В формуле (9) интегральный член описывает быструю прямую реакцию с-559" —>Р+, а экспоненциальный член - обратную реакцию для

коэффициентов А\ и Ач выполняется соотношение А\+А2= 1.

Интегральный член в формуле (9) соответствует модели Рипса-Джортнера. С целью описания температурного поведения кинетических зависимостей на всем временном интервале для различных состояний восстановления цитохрома в широком диапазоне температур в формулу (9) введена модификация, использованная в эмпирической двухмодовой модели. А именно, ке1 (г) была определена формулами

Fit) - 4 jg(r)exp[- ke,{r)t\ir + Л2 exp(-krt),

(9)

о

( F fr^

MO = a(r)exp "-fV .

V kbl у

£o(r) = _[АС(г) + Я]2 (ux cr(r) = k™ [Pa + (1 -Pa Mr)]

4A(r)

(10)

(12)

AG(r) = AG[pc

в которых зависимость от г введена в виде функции

которая служит для переключения между высокотемпературным (неадиабатическим, <р{т)~ 1) и низкотемпературным (адиабатическим, <р(т)«1) пределами.

В заключительньрс двух частях главы 4 приводятся результаты анализа кинетики ПЭ в РЦ в рамках комбинированной двухмодовой модели. С помощью такого подхода удалось с высокой точностью описать весь ансамбль экспериментальных кривых (более 50) в температурном диапазоне 40-298 К для трех состояний восстановления цитохрома и получить значения всех параметров, характеризующих реакцию переноса электрона в структуре реакционного центра (рис. 5). При этом параметры Л, АС, ра рх, и ра были едины для всех трех состояний восстановления цитохрома и температурно независимы, а /? и температурно зависимы и описываются единой температурной зависимостью для трех степеней восстановления цитохрома (рис. 8).

Анализ показывает, что интегральный член с А| в (9) описывает только начальные участки кинетических кривых в диапазоне времен 0.1 - 40 мкс. При временах более 40 мкс все кинетические кривые хорошо описываются экспоненциальным членом Аг ехр(-кг1) с кг = (1-4)х102 с"1. Это можно объяснить присутствием в образце двух состояний белков: популяции В1 с быстрым переносом электрона от восстановленного гема с-559" к Р* с = 107-104 с"1 и популяции В2, в которой восстановление Р+ осуществляется за счет медленной обратной реакции (рис. 7). Так как соотношение А\ и Аг изменяется с температурой и степенью восстановления гемов цитохрома, разность свободных энергий этих двух состояний должна быть сравнима с энергией теплового движения и энергией электростатического взаимодействия между электроном на проксимальном геме цитохрома и добавляемыми электронами на соседних гемах, т.е. должна составлять 0.04-0.15 эВ.

Реальной физической причиной различия между двумя такими состояниями может быть протонирование аминокислотного остатка вблизи проксимального гема с энергией протонирования 0.1-0.2 эВ. Например, в зависимости от температуры или состояния восстановления соседних гемов карбоксильная группа вблизи остатка может находиться в депротонированном состоянии при комнатной температуре и

К / мкс"

Р

о

0,4

0.5

0,8

0.3

0,1

О 50 100 150 200 250 ЗОО

\

б

О

50 100 150 200 250 300

7 /К

Г /К

Рис. 8. Температурные зависимости параметров £0КЛ (а) и р(б), определенных с помощью комбинированной двухмодовой модели для трех различных состояний восстановления цитохрома. 1,2 и 3 - первое, второе и третье состояние восстановления цитохрома

соответственно._____

протонироваться при ее понижении. В результате возможен быстрый перенос электрона от состояния В, к конечному состоянию С вдоль пути 1 при комнатных температурах или вдоль пути 2 при понижении температуры (рис. 7). При низких температурах происходит протонирование карбоксилат-иона, что переводит белок в состояние В2 с пониженной энергией электрона. Из состояния В2 система может перейти в конечное состояние С вдоль пути В2=>В,=>С (путь 2) или прямо из В2 в С (путь 3) со значительно большей энергией активации (рис.7). Скорость реакции переноса электрона от В2 к С вдоль обоих путей 2 и 3 меньше, чем 10с".

Таким образом, в данной модели анализ закономерностей изменения с температурой и степенью восстановления цитохрома кинетики быстрой компоненты и относительных вкладов быстрой и медленной компоненты реакции востановления Р+ в структуре РЦ позволяет с высокой точностью описать данную реакцию, предполагая наличие в структуре белка широкого распределения по временам диэлектрической релаксации. Разделение процесса релаксации в белках на два типа, диффузионный и колебательный, имеющие разные активационные параметры, позволяет эффективно управлять скоростью переноса электрона в организованных молекулярных системах в пределах четырех и более порядков.

Однако предложенная комбинированная двухмодовая модель, описывая все многообразие кинетических кривых в широком диапазоне температур, не позволяет связать значения эмпирических параметров с конкретной структурой белковой глобулы, что сильно ограничивает возможность анализа процесса переноса электрона в различных белках.

С целью более полного учета квантовых и динамических эффектов в реакциях переноса электрона в структуре белковых глобул была предложена дальнейшая

Глава 5.

\

модификация модели Сумн-Маркуса, которая базируется на работах Овчинниковой-Гельмана-Суми-Маркуса (модель ОГСМ). Предполагается, что в начальной точке В (рис. 9) существует гауссово распределение по энергиям вдоль диффузионной координаты X и диэлектрическая релаксация белка описывается классическим уравнением диффузии вдоль координаты X с возможностью реакции вдоль колебательной координаты q.

Оси ¡7 и X соответствуют колебательной и диффузионной координатам реакции. При высоких температурах процесс переноса электрона идет по траектории 1 с минимальной энергией активации за счет быстрой диффузии в точку Е). При понижении температуры заселенность в точке О уменьшается за счет изменения ширины распределения и замедления диффузии вдоль координаты X, что открывает возможность протекания конкурирующих реакций по другим траекториям (траектория 2). При самых низких температурах в условиях медленной диффузии или при ее отсутствии реакции возможны при различных значениях X с сильно различающимися скоростями (в том числе траектория 3), что приводит к широкому распределению по скоростям реакции, даже если процесс диффузии вдоль координаты X характеризуется одним временем г, без распределения по временам релаксации.

Эта модель описывается классическим уравнением диффузии с реакцией для функции распределения Р(Х;1):

дР_ к„Т д2Р &

Рис. 9. Поверхность свободной энергии для реакции переноса электрона в рамках модели ОГСМ.

т эх2 тдх\ ах)

(16)

гармонический потенциал по диффузионной координате в

где У{Х) = ~Х2 2

состоянии реагентов и где не учитывается обратная реакция [Рубин А.Б. Биофизика, М. 2004].

Константа скорости реакции при данном Сдаётся формулой

¿1

у1

к{Х) = ^ Тг

ЛгквТ

ехр

(Я, + АС(Х))

Ч

4Я^к Т

(17)

Релаксационный спектр белка включает три моды: медленно релаксирующую диффузионную моду X (частота а>х, энергия реорганизации Хх) и две быстро релаксирующие моды, «квантовую» внутримолекулярную (<и, ,Хд) и «классическую» (а>с! ЛыУ, первая определяет зависимость движущей силы от X, АС(Х) = + Лх - Х^2Лх , а две последние - параметры X, =Л„ + и

В рамках этой модели были проанализированы реакции переноса электрона в РЦ, выделенных из бактерий Rps. viridis, Rps. sulfoviridis и в семи мутантно модифицированных РЦ из Rps. viridis, в которых аминокислота тирозин LI 62 (Y), находящаяся на пути переноса между с-559~ и Р+ (рис.7), была замещена фенилаланином (F), триптофаном (W), глицином (G), метионином (М), лейцином (L), треонином (Т) или гистидином (Н). Исследования проводились температурном диапазоне 298 - 8 К.

Ряд статических параметров а>с/ = сох ~ 250 см"1, a>q = 800 см ', АС\ = -0.14 эв, AG2 = -0.18 эв, ЛС?3 = -0.29 эв были заданы на основе литературных данных одинаковыми и температурно независимыми дня всех типов РЦ.

В то же время из рентгенострукггурных данных известно, что вблизи траектории переноса электрона в структуре белка Rps. viridis находится несколько молекул воды, одна из которых, НОН38, расположена рядом с гемом с-559. Очевидно, что даже небольшое изменение структуры аминокислотного остатка в этом районе может повлиять на значение квадрата матричного элемента КД, изменить локальную полярность белка и тем самым энергию реорганизации и вероятность внедрения молекулы воды НОН38 в структуру реакционного центра, что в значительно мере определяет скорость переноса электрона.

Анализ статических параметров

Для каждого нативного или мутантного РЦ из моделирования кинетических кривых были определены параметры Vab, Xq , Хс, и Хх, не зависящие от температуры и от степени восстановления цитохрома (табл. 1), а также зависящее от температуры среднее время релаксации белка г, которое характеризует его подвижность.

Из таблицы видно, что значение матричного элемента Vab, определяющего экспоненциальную зависимость вероятности переноса электрона от расстояния, меняется при замене аминокислот на пути до 40 раз.

X Vab, см"1 К, эВ Xy, эВ Л.„эВ Я,эВ***

F 1,1 0,035 0,22 0,66 0,92

G 0,2 0,020 0,19 0,31 0,52

М 3,4 0,039 0,09 0,89 1,02

L 0,2 0,022 0,20 0,34 0,56

W 1,5 0,034 0,21 0,64 0,88

Т 0,08 0,015 0,19 0,19 0,40

н 1,5 0,033 0,12 0,69 0,84

у* 2,2 0,035 0,09 0,77 0,90

R.s.** 0,25 0,010 0,20 0,22 0,43

Таблица1. Статические параметры модели для нативных реакционных центров и мутантов L162X Rps. viridis. * Дикий штамм Rps. viridis. ** Rps. sulfoviridis,.

Учитывая, что Vab входит в выражения (1) и (17) для константы скорости в квадрате, изменение только этого параметра может привести к изменению к(Х) более чем на три порядка.

Полученные значения Vab можно сопоставить с эмпирической формулой, которая предсказывает линейную зависимость logI0 от р, доли пространства между донором и акцептором, занятого атомами:

log10Fi =log10Fl -(1.2-0.8/7)^-3.6), (18)

где R - расстояние от края до края в А и Vab0 - значение матричного элемента при непосредственном контакте (R=3.6 A) [Page С.С. etal., Nature, 1999].

поглощение Р* (отн.ед.) 2.5,

Рис, 10. Экспериментальные кинетические кривые для РЦ - мутанта 1Л62Т (точки), полученные: а - при Г = 295 (1). 288 (2), 278 (3), 268 (4), 256 (5) и 246 К (б)) и б - при Г= 293 (1), 237 (2), 220 (3), 203 (4), 182 (5), 159 (6), 140 (7), 120 (8), 102 (9), 80 (10), 60 (11), 38 (12) и 10 К (13)) и их теоретические аппроксимации (линии). Вставка - Т= 182 К.

100

//мкс

Был выполнен расчёт р для фрагмента структуры РЦ, заключенного внутри цилиндра диаметром 4 А и длиной 8.5 А, ось которого проходит через ион железа гема с-559 и ион Mg специальной пары в субъединице L. Результаты расчета для исследованных РЦ приведены на рис. 11. Видно, что расчетные данные для дикого штамма и мутантов Rps. viridis согласуются с формулой (18), если принять Уаьо~ 103 см"1.

Большое значение Vm означает, что при тесном контакте реакция является адиабатической на всех временах и её скорость достигает максимального значения 1013 с"1, заложенного в эмпирических формулах для скорости реакции [Котельников.. Биофизика, 1993].

Как видно из табл.1, полная энергия реорганизации Л. изменяется в пределах 0.4-1,0 эВ; в частности, Л=0.9 эВ для дикого штамма Rps. viridis, что согласуется с литературными данными (0.6-0.8 эВ). Энергия реорганизации по конформационной координате Хх варьируется в пределах 0.09-0.22 эВ и равна 0.09 эВ для дикого штамма, что согласуется с величиной 0.07 эВ, полученной для Rps. viridis [Cherepanov D.A., et al„ Biophysical Journal. 200!]. В работах Воршела с сотр. проведен расчёт с учётом рентгеновской структуры белка энергии реорганизации, соответствующей переносу электрона между двумя цитохромами с в белковой матрице, который дал Я ~ 0.39-Ю.65 эВ для полной энергии реорганизации и Я,=1 ккал/моль =0.043 эВ для внутримолекулярной реорганизации. Наши результаты качественно согласуются с цитированными, в том числе в отношении малой величины Xq.

Анализ температурных зависимостей г

Динамический параметр г сильно зависит от Т; его значения определялись для каждой кинетической кривой путем компьютерного моделирования. На рис. 12 приведена температурная зависимость г для L162T в координатах (1/Т, logi0 г). Для нативного РЦ из Rps. viridis энергия активации равна Еа = 0.5±0.1 эВ (в 66% глицерине). Это значение совпало с энергией активации релаксационной дипольной

0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Р

Рис. 11. Зависимость квадрата электронного матричного элемента КД (точки - данные табл. 1) от доли пространства между донором и акцептором, занятого атомами, которая изменяется при замене аминокислоты в положении Ы62. Прямая линия - формула (18) с Ум= 103 см"1. Расстояние переноса принято одинаковым для всех штаммов: Я = 12.3 А.

перестройки вязкого 66% глицерина в окружении трштлетно возбужденного красителя эозина (времена релаксации в этом случае определялись по регистрации мгновенных спектров фосфоресценции красителя, см. рис. 3). Можно было полагать,

что молекулярная динамика белковой глобулы в основном определяется динамикой растворителя. Однако в аналогичных экспериментах на РЦ из Rps. sulfoviridis значение Е„ оказалось значительно меньше, оно равно 0.05 эВ (табл. 2).

Такое различие для близких по своим свойствам белков может быть связано с изменением сетки водородных связей, обусловленных присутствием молекулы воды вблизи гема с-559. В структуре »RC в Brookhaven Protein Databank) присутствует молекула воды НОН38 вблизи гема с-559, которая, судя по расстояниям и углам, может образовывать четыре водородные связи (две как донор и две как акцептор протона). Большое значение Еа для Rps. viridis может означать, что процесс релаксации включает разрыв нескольких водородных связей этой молекулы, а малое значение для Rps. sulfoviridis - отсутствие НОН38 в структуре реакционного центра.

Аналогично, можно предположить, что вариация Еа в диапазоне 0.15 - 0.30 эВ среди мутантных реакционных центров Rps. viridis связана с изменением числа водородных связей этой молекулы с окружением или изменением числа самих молекул воды. Энергии активации 0.23 и 0.15 эВ для L162F и L162T (табл.2) могут свидетельствовать о том, что положение этой молекулы изменилось (так что число водородных связей уменьшилось или они ослабли) по сравнению с диким штаммом (L162F) или что она вовсе отсутствует (L162T).

Табл. 2.

г/МКС

Рис. 12. Зависимость времени релаксации г от обратной температуры для мутантного РЦ Ы62Т.

реакционного центра из Rps. viridis (шифр

X Y* F G М L W т Н Rps. sulfovir.**

Еа (эВ) 0,50 0,23 0,22 0,09 0,30 0,27 0,15 - 0,05

*- дикий штамм РЦ из Rps. viridis. ** - РЦ из Rps. sulfoviridis.

Анализ соотношения заселенностей медленной и быстрой популяций

РЦ

Анализ показывает, что соотношение амплитуд медленной и быстрой компонент кинетических кривых резко возрастает при понижении температуры (рис. 5 и 10). Основываясь на этом, можно предположить, что им соответствуют два состояния РЦ с разными значениями энергии и энтропии, находящиеся в термодинамическом равновесии. Если обозначить через АЕ и А5 соответствующие разности, то температурную зависимость заселенности медленной популяции А, можно представить формулой

А. =

( ГА5 - АЕ

(20)

На рис. 13 показаны зависимости к^ю[(1—ДО/Лг] от ИТ для РЦ из Яря. зиЦомтсИя для трех степеней восстановления гемов цитохрома.

1п[(1-А.)/А„]

Рис. 13. Аррениусовские зависимости параметра 1п(1 -А1)/Ая отражающего соотношение «быстрой» и «медленной» популяций белковых комплексов РЦ из Крэ. виЦочтсИх при различных состояниях восстановления гемов цитохрома:

1 - восстановлен гем с-559;

2 - восстановлены гемы с-559 и с-556;

3 — восстановлены гемы с-559, с-556 и с-551.

На основе аналогичных аррениусовских зависимостей для всех нативных и мутантных РЦ определены значения АЕ и AS. Если предположить, что две популяции отличаются состоянием протонирования определенной группы белка, то можно рассчитать рКа этой протонируемой группы по формуле рКа=рН-(ТА8-ДЕ)/(АвГ1п10). Оказалось, что полученные значения рКа для всех нативных и мутантных РЦ близки и лежат в диапазоне 6,4 - 6,8. Это означает, что мутации слабо влияют на значение рКа данной гипотетической группы для всех исследованных нативных и мутантных белков, оно имеет значение 6.6±0.2 для рН=8.0 и Т=294 К. При понижении температуры равновесие смещается в соответствии с определенными для разных РЦ значениями энергии активации, что приводит к изменению потенциала в районе донорного или акцепторного центра.

В то же время из эксперимента на РЦ из Л/м. 5и//от/>гк& видно, что равновесие между популяциями также сильно зависит от степени восстановления гемов цитохрома. Это означает, что данная гипотетическая протонируемая группа

располагается вблизи гемов цитохрома, по-видимому, рядом с донором электронов гемом с-559. Как видно из рис. 13, из зависимости logio[(l-.<4j)//ij] от 1 /Г для РЦ можно определить значения энергии активации для первой, второй и третьей степени восстановления цитохрома, которые равны соответственно 0.25, 0.16 и 0.04 эВ, что очень хорошо соответствует аналогичным значениям, полученным в рамках комбинированной двухмодовой модели (стр. 14).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные в диссертационной работе экспериментальные результаты и их анализ в рамках развитых моделей позволяет сделать заключение, что процессы переноса электрона в структуре РЦ подчиняются общим закономерностям переноса электрона в конденсированной фазе, если соответствующим образом учитывать специфику белковых молекул как высокоорганизованных динамических наноструктур. Показано, что эффективность переноса электрона в РЦ в значительной степени зависит от природы и скорости релаксационных процессов в белке, которые в свою очередь определяются структурой и динамикой белковой глобулы. Рассмотренные в обзоре модели в разной степени учитывают эти особенности белков.

Наиболее адекватной является модель ОГСМ, которая позволяет описать динамику переноса электрона в структуре нативных и мутантно модифицировнных РЦ с помощью единого набора физических параметров в широком диапазоне температур (от комнатных до гелиевых), используя только один температурно-зависимый параметр - время релаксации вдоль диффузионной координаты.

ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная методика анализа релаксационной динамики матрицы в микро- и миллисекундном диапазоне времен по регистрации кинетики релаксационных сдвигов спектров фосфоресценции красителей. С помощью данного подхода определены времена диэлектрической релаксации и энергия активации релаксационной динамики белковой матрицы в рамках формализма Коула-Девидсона.

2. Для количественного описания сложных кинетических зависимостей переноса электрона от восстановленного проксимального гема с-559 цитохрома к катион-радикалу димера бактериохлорофилла Р+ в структуре нативных и мутантно модифицированных РЦ из Rps. viridis и Rps. sulfoviridis в диапазоне температур 295 -8 К предложены две модификации модели Суми-Маркуса (эмпирическая и микроскопическая), позволяющие учитывать вклад в реакцию как квантовых, так и классических степеней свободы, в том числе диффузионных.

3. В рамках предложенных моделей осуществлен анализ механизмов влияния структуры и молекулярной динамики белковой глобулы на процессы переноса

электрона в исследованных РЦ. Определены основные параметры модели (матричный элемент и энергии реорганизации среды), а также получена температурная зависимость среднего времени релаксации белка т в диапазоне температур 220 - 300 К.

4. Высказано предположение о важной роли локального протонирования отдельных функциональных групп в районе донорного и акцепторного центров, что приводит к изменению как свободной энергии переноса, так и релаксационных процессов в окружении донора и акцептора, и позволяет объяснить изменение константы скорости реакции переноса электрона на 5 и более порядков.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Котельников, А. И., Медведев, Э. С., Горячев, Н. С. Перенос электрона в белковых системах. В монографии «Физическая химия биопроцессов», (под редакцией С.Д. Варфоломеева), Москва, КРАСАНД, (2014), 800 с.

2. Баринов, A.B., Горячев, Н.С., Котельников, А.И. (2011). Анализ микросекундной релаксационной динамики белков и вязких сред методом регистрации релаксационнных сдвигов спектров фосфоресценции. Оптика и спектроскопия, ПО (5), 755-761.

3. Котельников, А. И., Медведев, Э. С., Горячев, Н. С. (2011). Структурные и динамические аспекты переноса электрона в белках - высокоорганизованных природных наноструктурах. Язе. РАН. Серия химическая., 7,1295—1318.

4. Медведев, Э. С., Котельников, А. И., Горячев, Н. С., Ортега, X. М., Стучебрюхов, А. А. (2011). Кинетика восстановления димера бактериохлорофилла в реакционных центрах фотосинтезирующих бактерий. Химическая физика, 30 (3), 71.

5. Medvedev, Е. S., Kotelnikov, A. I., Goryachev, N. S., Psikha, В. L., Ortega, J. М., & Stuchebrukhov, А. А. (2006). Protein dynamics control of electron transfer in reaction centers from Rps. viridis. Molecular Simulation, 32 (9), 735-750.

6. Баринов, А. В., Горячев, H. С., Шмит, Ф. И., Ренгер, Г., Котельников, А. И. (2009). Люминесцентный анализ микросекундной релаксационной динамики вязких сред. Опт. и спектр., 107(1), 101-106.

7. Котельников, А. И., Горячев, Н. С., Рубцов, А. Ю., Психа, Б. Л., Ортега, X. М. (2005). Анализ кинетики переноса электрона в реакционных центрах фотосинтетических бактерий в рамках модели Рипса-Джертнера. Дот. АН., 405 (1), 1-4.

8. Kotelnikov, A. I., Medvedev, Е. S., Psikha, В. L., Pastukhov, А. V, Litvinov, P. Y., Goryachev, N. S., Mathis, P. (2001). A mixed adiabatic/nonadiabatic model for electron transfer in metal containing proteins. Journal of Inorganic Biochemistry, 86 (1), 63.

Тезисы докладов.

1. Котельников А.И., Медведев Э.С., Горячев Н.С., Ортега Х.М. Структурные и

динамические аспекты переноса, электрона в реакционных центрах

i

фотосинтезирующих бактерий. Тезисы докладов XX Путинских чтений по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Разообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе». 25-29 июня 2012 г. Пущино. С. 33.

2. А.И. Котельников, Э.С. Медведев, Н.С. Горячев, А.В. Баринов, Х.М. Ортега.// Перенос электрона между проксимальным гемом и димером бактериохлорофилла в мутантно модифицированных реакционных центрах Rps. viridis. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах». Пущино, 15-19 июня 2009 г.

3. A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, N.S. Goryachev, A.V. Barinov, A.A. Stuchebrukhov, J.M. Ortega. Photostimulated electron transfer in structures of mutationally modified reaction centers from photosynthetic bacteria. International conference "Organic nanophotonics", (ICON-RUSSIA 2009), Санкт-Петербург, 21 - 28 июня 2009 г.

4. R.A.Kotelnikova, D.V.Mishchenko, D.A.Zhokhova, A.V.Barinov, N.S.Goryachev, A.Yu.Rybkin, G.N.Bogdanov, V.S.Romanova, V.V.Grigor'ev, A.I.Kotelnikov. // Luminescence technique in the study of biological properties of fullerene based hybrid nanostructures. International conference "Organic nanophotonics", (ICON-RUSSIA 2009), Санкт-Петербург, 21-28 июня 2009 г., Сборник трудов, стр. 89-93.

5. Баринов А.В., Горячев Н.С., Котельников А.И. Анализ параметров молекулярной динамики белков и вязких растворов по регистрации релаксационных сдвигов спектров люминесценции красителей. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах». Россия, Пущино, 15-19 июня 2009 г.

6. Горячев Н.С. Влияние мутаций на физические параметры, описывающие перенос электрона между проксимальным гемом и димером бактериохлорофилла в реакционных центрах Rps.viridis. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах». Пущино, 15-19 июня 2009 г., с.31.

7. Kotelnikov A.I, Medvedev E.S, Goryachev N.S, Barinov A.V, Psikha B.L, Ortega J.M, Stuchebrukhov A.A. Protein dynamics control of electron transfer in reaction centers from photosynthetic bacteria. Abstracts of The 13-th International Conference on Biological Inorganic Chemistry. 2007, p. 172, Vienna, Austria.

8. Анализ механизма функционирования реакционных центров из данных по кинетике реакций переноса электрона.// Тезисы докладов XXVI Всероссийской школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. Пансионат «Юность», Московская обл., 2008, с.15. А.И. Котельников, Э.С. Медведев, Горячев Н.С., Баринов А.В., Ортега Х.М.

9. А.И. Котельников, Горячев Н.С., Баринов А.В., Э.С. Медведев. Квантовые и динамические особенности белков как гибридных наноструктур в реакциях переноса

электрона. Тезисы докладов XX Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 2008, с. 22.

10. Горячев Н.С. Баринов А.В. Котельников А.И. Исследование низкотемпературной спектральной релаксации в вязких средах. Тезисы докладов XX Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 2008, с. 47.

11. Белки как высокоорганизованные макромолекулярные структуры в реакциях переноса электрона.// Тезисы. XIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 2007, г. Москва., т.4, с.472Л Котельников А.И, Медведев Э.С, Психа Б.Л, Горячев Н.С, Баринов А.В.

12. Coupling of Protein Dynamics and Electron Transfer Reactions in Reaction Centers of Photosynthetic Bacteria.// VII Voevodsky conference "Physics and chemistry of elementary chemical processes". 2007, Chernogolovka, p.79-80.// Kotelnikov A.I, Medvedev E.S, Psikha B.L, Goryachev N.S, Barinov A.V, Stuchebrukhov A.A, Ortega J.M.

13. "Protein dynamics control of electron transfer in reaction centers from Rps. viridis'V/ 14th European Bioenergetics Conference, Moscow, July 22-27, 2006., BBA, v.14., p.281. A. I. Kotelnikov, E. S. Medvedev, A.A. Stuchebrukhov, N. S. Goryachev, B. L. Psikha, J. M. Ortega,

14. "Coupling of protein dynamics and electron transfer in reaction centers from Rps. viridis'V/ International conference "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems", Pushchino, 2006, p.94.// A.I. Kotelnikov, E. S. Medvedev, A.A. Stuchebrukhov, N. S. Goryachev, B. L. Psikha, J. M. Ortega.

15. Regularities of electron transfer in proteins at low temperatures", 6-th International conference on low temperature chemistry// 6-th International conference on low temperature chemistry, Chernogolovka, 2006, p.21.// A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, A.A. Stuchebrukhov, N.S. Goryachev, A.V. Barinov, B.L. Psikha, J.M. Ortega.

16. Properties of Low-Temperature Spectral Relaxation in Proteins and Viscous Media// 6-th International conference on low temperature chemistry, Chernogolovka, 2006, c.64. // A.V. Barinov, N.S. Goryachev, A.I. Kotelnikov.

17. Quantum and dynamical factors determining electron transfer reactions in enzymes as highly organized molecular systems.// Abstracts of International conference "Biocatalysis: Fundamentals and applications". Sankt-Petersburg, Ed. Moscow State University, 2005, p.84. 1// A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, B.L. Psikha, N.S. Goryachev.

18. Development of adiabatic model for discription of electron transfer in proteins// The second international conference Highly-organized catalytic systems, Moscow,2004, p. 27. Kotelnikov A.I., Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu., Barinov A.V., Psikha B.L., Medvedev E.S.

19. Coupling of electron transfer and protein dynamics studied by triplet probe method// The second international conference Highly-organized catalytic systems, Moscow,2004, p. 70// Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu.,Barinov A.V., Kotelnikov A.I.

20. Исследование связи конформационной динамики и функции глобулярных белков на примере ферментативных реакций, катализируемых миоглобулином // III Съезд биофизиков России, тезисы докладов, Воронеж т. I, стр.11, 2004// Белоногова О.В., Психа Б.Л., Горячев Н.С., Садков А.П., Котельников А.И.

21. Исследование микросекундной реорганизации белков с помощью кинетической фосфоресцентной спектроскопии // III Съезд биофизиков России, тезисы докладов, Воронеж т. I, стр.23, 2004// Горячев Н.С., Баринов А.В., Рубцов А.Ю., Котельников А.И.

22. Развитие двумерной колебательно-диффузионной модели для описания роли молекулярной динамики белков в реакциях переноса электрона.// III Съезд биофизиков России, тезисы докладов, Воронеж т. I, стр.55-56, 2004// Котельников А.И., Горячев Н.С., Баринов А.В., Рубцов А.Ю., Психа Б.Л., Медведев Э.С., Ортега Х.М.

23. Анализ кинетики переноса электрона в структуре реакционных центров фотосинтетических бактерий с учетом молекулярной динамики белков // III Съезд биофизиков России, тезисы докладов, Воронеж т.И, стр.451-452, 2004// Рубцов А.Ю., Горячев Н.С., Баринов А.В., Психа Б.Л., Медведев Э.С., Котельников А.И.

24. Basic principles of electron transfer between clusters in biomacromolecules as natural nanostructures// In "6-th Biennial International Workshop "Fullerene and Atomic Clusters", St-Petersbuig, 2003, p.240// Kotelnikov A.I., Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu., Romanov R.V., Psikha B.L., Medvedev E.S., Ortega J M

25. Development of two-dimensional model for description of electron transfer in reaction centers// Conference primary processes of photosynthesis, Pushchino, 2003, p. 22// Kotelnikov A.I., Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu., Barinov A.V., Psikha B.L., Medvedev E.S., Ortega J M

26. Исследования фундаментальных закономерностей переноса электрона в белках с целью создания высокоэффективных катализаторов, биосенсоров и элементов нанэлектроники // II Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2003, с.235// Котельников А.И., Медведев Э.С., Психа Б.Л., Горячев Н.С., Рубцов А.Ю., Сырцова Л.А., Ортега Х.М.

27. Comparative Analisis of Electron Transfer in Reaction Centers of Photosynthetic Bacteria Within Rips-Jortner Approach and Two-Dimensional Model// I International Conference "Highly-Organized Catalytic Systems", Chemogolovka, Russia, 2002, p. 2627// A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, B.L. Psikha, N.S. Goryachev, J.M. Oitega, P. Mathis.

28. Proteins as natural nanostructures. Role of quantum and dynamical factors in creation of high effective bioelectromc devices.// 5-th ISTC Scientific Advisory Committee Seminar

"Nanotechnology in the area of physics, chemictry and biotechnology", St-Pitersburg, 2002, p.74-75// Kotelnikov A.I., Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu., Yudintsev K.Ye, Medvedev E.S.

29. Combined Dynamic Model for the Electron Transfer from Cytochrome to Bacteriochlorophill Dimer in Bacterial Reaction Centers.// XVII Pushchino Readings in Photosyntesis and International Conference "Primary Process of Photosyntesis in Bacterium and Plant Photosystem II", Pushchino, 2002, p.20// Kotelnikov A.I., Medvedev E.S., Psikha B.L., Goryachev N.S., Rubtsov A.Yu., Ortega J.M., Mathis P.

30. The photoisommerisation of stilbazolium betaine M catalysed by myogiobin. The relation between the conformational dynamics and function.// I International Conference "Highly-Organized Catalytic Systems", Chernogolovka, Russia, 2002, Chemogoloyka, p. 66 // Goryachev N.S., Belonogova O.V., Sadkov A.P., Kotelnikov A.I.

31. Electron transfer in reaction centers within two-dimensional model New role of local charges.// In "Symposium on Bioelectrochemistry. 201st Meeting of Electrochemical Society", Philadelphia, 2002, p, 1268// A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, B.L. Psikha, N.S. Goryachev, A.Yu Rubtsov., K.E. Yudintsev, J.M. Ortega, P. Mathis.

32. Reaction centers of photosynthetic bacteria as nanomolecular transistor. The role of quantum and dynamical factors in electron transfer in proteins.// Symposium and Summer School "Nano and Giga Challenges in Microelectronics. Research and Opportunities in Russia", Moscow, 2002, p. 163// A.I. Kotelnikov, E.S. Medvedev, N.S. Goryachev, A.Yu. Rubtsov., I.M. Ortega, P. Mathis

33. Effect of protein relaxation and gating on electron transfer within mixed adiabatic/fiooadiabatic model.// In "16-th International Conference on Biodectrochemistry and Bioenergetic", Bratislava, Slovakia 2001, p. 9 // Kotelnikov AI., Medvedev E.S., Pastukhov A.V., Litvinov P Yu, Goryachev N. S., Ortega J.M., Mathis P.

34. Phtostimulated long range electron transfer reactions in proteins within combined two-dimensional model.// In"20-th International Conference on Photochemistry", Moscow, 2001, p.87 // Kotelnikov A I., Medvedev E.S.,LitvinovP.Yu„ Goryachev N.S., Psikha B.L., Ortega J.M., Mathis P.

35. The cis-trans isimcnzation reaction of stilbazole betain as a probe of hemeprotein large scale confbrmational dynamics.// In" 20-th International Conference on Photochemistry', Moscow, 2001, p.352// Litvinov P.Yu., Pastukhov A.V., Sadkov A.P., Goryachev N.S., Kotelnikov A.I.

36. Белки как природные наноструктуры. Новые принципы управления переносом электронов.// в сб. "Научные исследования в наукоградах Московской области", Черноголовка, 2001, с. 10 // Котельников А.И., Медведев Э.С., Психа Б.Л., Горячев Н.С., Литвинов Н.Ю., Рубцов А.Ю.

37. Исследование медленной конформационной динамики гембелков с помощью реакции изомеризации стильбазола бетаина// в сб. ((Научные исследования в

наукоградах Московской области", Черноголовка, 2001, с. 103 // Литвинов П.Ю., Пастухов A.B., Горячев Н.С., Белоногова О.В., Садков А.П., Котельников А.И.

38. Влияние заряда на спектр диэлектрической поляризации воды.//в сб. "Научные исследования в наукоградах Московской области", Черноголовка, 2001, с. 95// Горячев Н.С., Котельников А.И.

39. Analysis of long range electron transfer reactions in metal containing proteins within combined two-dimensional model.// In'4-ый ИНТАС междисциплинарный симпозиум по физическими химическим методам в биологии, медицине и охране окружающей среды", 2001, Moscow р. 24-25// Kotelnikov A.I., Medvedev E.S., Litvinov P.Yu., Goryachev N.S., Psikha B.L., Sadkov A.P., Ortega J.M., Mathis P.

40. Особенности дистанционного переноса электронов в белках как высокоорганизованных молекулярных системах // в сб. "П Всероссийское совещание "Высокоорганизованные каталитические системы", Москва, 2000,сЛ8// Котельников АИ., Пастухов A.B., Горячев Н.С., Литвинов Н.Ю., Медведев Э.С.

41. Роль молекулярной динамики белков в реакциях дистанционного переноса электронов//в сб. "П Съезд биофизиков России", Москва, т. 1,1999, с. 201 //Котельников АИ., Пастухов A.B., Фогель В.Р., Горячев Н.С., Литвинов П.Ю., Акентьева Н.П.

Сдано в печать 07.10.14. Подписано в печать 07.10.14. Формат 60x90 1/16 Объем 1,75 п. л. Заказ 122. Тираж 100

Отпечатано в типографии ИПХФ РАН 142432, Московская обл., г. Черноголовка, пр-т ак. Семенова, 5 Тел.: +7(49652)2-19-38