Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мобильных элементов в регуляции транскрипции и реорганизации геномау DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль мобильных элементов в регуляции транскрипции и реорганизации геномау DROSOPHILA MELANOGASTER"

На правах рукописи

V

N УДК 575.224.46:595.773

БЕЛЕНЬКАЯ Татьяна Юрьевна

РОЛЬ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ И РЕОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА У ВЯОЗОРНПА МЕИЫОаЛБТЕЛ

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.Г. Георгиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор, академик, Ю.В. Ильин кандидат биологических наук, О.М. Симонова

Ведущая организация: ИБР РАН

Защита диссертации состоится ''¿¿2—" ноября 1998 года в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01. при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

ЛО

Автореферат разослан "----" октября 1998 Года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фарм. наук ^у (^¿'-¿С ^ Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Геномы живых организмов содержат разнообразные по структуре мобильные элементы (транспозоны). Так, например, у дрозофилы их известно более 30 видов. Перемещения транспозопов могут вызывать хромосомные перестройки, а также мутации в генах-мишенях, вследствие этого они оказывают большое влияние на изменчивость видов. Так, более половины спонтанных мутаций, изученных у дрозофилы, индуцированы мобильными элементами. Многие наследственные заболевания человека имеют аналогичное происхождение. Кроме того, мобильные элементы находят все большее применение как удобные инструменты для манипуляции с геномами с целью изучения закономерностей протекания различных генетических процессов и создания генно-инженерных конструкций. У дрозофилы для этих целей наиболее удобным оказался Р элементу на основе которого созданы самые популярные вектора. Р элемент также широко используется для сайт-направленного мутагенеза in vivo и получения новых доступных для клонирования мутаций. Другим интенсивно изучаемым мобильным элементом дрозофилы является ретротранспозон МДГ-4. В его составе был обнаружен первый из нескольких известных на сегодняшний день инсуляторов - последовательностей ,, которые' способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена в случае нахождения между ними. Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет интерес как в научном, так и в прикладном плане - для создания векторов с независимой от окружающих последовательностей экспрессией генов. Однако, несмотря на многочисленные работы, ведущиеся в этом направлении, полностью доказанной модели, описывающей механизм функционирования инсуляторов, на данный момент не создано. Также остается открытым целый ряд вопросов, касающихся закономерностей

транспозиций и способов индукции мобильными элементами мутаций, не оценен их вклад в быструю эволюцию регуляторных систем гена.

Все вышеперечисленные проблемы нашли свое отражение в настоящем исследовании. С этой целью в нашей лаборатории на базе локуса yellow, являющегося горячей точкой юнсерции транспозонов, в частности Р элемента и МДГ-4, был создан ряд модельных систем для изучения механизмов транспозиций мобильных элементов и их роли в регуляции экспрессии гена-мишени. Удобство имеющихся систем заключается в том, что экспрессию гена yellow, определяющего окраску кутикулы и ее производных структур, легко оценивать визуально; кроме того, данный ген не является жизненно необходимым, что дает возможность получать любые его перестройки.

Цель и задачи исследования. Основными целями настоящего исследования являются выявление с помощью модельных систем новых механизмов влияния регуляторных последовательностей Р элемента и МДГ-4 на транскрипцию гена-мишени и описание паттернов вырезания Р элемента в различных условиях. В работе были поставлены следующие задачи:

1. изучить паттерны вырезания Р элемента из локуса yellow и выявить роль в этом процессе окружающих последовательностей и цитотипа линий;

2. локализовать последовательности в Р элементе, которые активируют транскрипцию теин yellow;

3. определить роль последовательностей МДГ-4 , отличных от его su(Hw)-связывающего района, в регуляции экспрессии гена-мишени;

4. исследовать инсуляторные свойства Би(Н\¥)-связывающего района МДГ-4 на фоне ослабленных взаимодействий между энханссром и промотором.

Научная новизна и практическое значение работы. Изучены паттерны вырезания Р элемента в разных экспериментальных условиях in vivo. Показано, что полученную

систему можно в дальнейшем использовать для изучения влияния различных факторов на характер вырезания Р элемента. Идентифицирован новый регуляторный район гена yellow, ответственный за активацию его транскрипции. Установлено, что инсерция Р элемента в положение -69 компенсирует делецию этого района и восстанавливает транскрипцию гена yellow. Картированы два участка внутри Р элемента, ответственные за активацию транскрипции гена yellow. Таким образом, показано, что инсерция Р элемента в ген-мишень может усиливать его экспрессию. Полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования систем Р-индуцированного мутагенза.

Впервые выявлена негативная роль последовательностей мобильного элемента МДГ-4, не входящих в состав его 5и(Н\у)-связывающего района, в регуляции транскрипции гена yellow. Обнаружено, что при определенных условиях, su(Hw)-инсулятор может блокировать взаимодействия между энхансером щетинок и промотором гена yellow, пе находясь в положении между ними. Этот результат предполагает пересмотр существующих моделей, касающихся механизмов действия инсулятора, понимание которых необходимо ' для эффективного использования инсуляторных последовательностей при получении трансгенных животных и растений.

Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены: на летней школе Европейского биохимического общества (Спецаи, Греция, 1996), на 38-й и 39-й Ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Чикаго, США, 1997; Вашингтон, США, 1998), на отчетных конференциях Института медицинских исследований при университете г. Осло 1996 и 1997 гг. (Москва) и на межлабораторном семинаре (1998) ИБГ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах,

включая таблиц, рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы тШУ. наименований.

Результаты исследования

Характер вырезания одиночных копий Р элемента из локуса yellow. Используемые в работе у2" аллели имеют вставку одного или двух 1.2 тан Р элементов в положение -69 относительно точки начала транскрипции гена yellow (рис. 1). На месте инсерции во всех случаях имеется делеция последовтельности гена yellow длиной 76 пн. Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинок и имаго. Его экспрессия в различных тканях контролируется энхансерами, расположенными как перед промотором гена (энхансеры кутикулы тела и крыловых пластинок), так и в его интроне (энхансер щетинок), у23 аллели с инсерцией Р элемента в регуляторной области были получены на базе У аллеля. При этом фенотип производных у21 аллелей был идентичен исходной у2 мутации (рис. 1). у1 мутация индуцирована инсерцией мобильного элемента МДГ-4 в положение -700 относительно точки начала транскрипции гена yellow. Причиной мутантного фенотипа - желтые тело и крылья, черные щетинки (рис. 1) - является наличие в 5' регуляторной области МДГ-4 сайтов связывания для белка Su(Hw) (su(Hw)-HncyiMTOpa), блокирующего в данном случае энхансеры кутикулы тела и крыловых пластинок.

Для выяснения характера вырезания одиночной копии Р элемента и роли Р элемента в экспрессии гена yellow была проведена мобилизация Р элемента в линиях, содержащих у2* аллели с одной копией Р элемента (у21^, у3'20 и уы<).

y2sA3 ' y+s3 y+s6 у 2s 14 y2s20 y+s2 yhs7 ^KtS

ДКП

y+s7 y+si

ТКГШБ

—У

2sl4 2 s20

. у * (Ю)

..y+b (3)

2ns

m

ГУ

2sA3

.yds (3)

,y2"5

(31

m

71 U

I

1<-17 □

(1 14 113 -»

JJ

U 15

Рис. 1. Структура и фенотипическое проявление yellow аллелей, содержащих одну копию Р элемента.

А. Два экзонз гена yellow и направление сто транскрипции показаны стрелкой. Энхансеры гена yellow обозначены серыми кругами: Эи-кр, энхаисер отвечающий за экспрессию гена yellow в крыловых пластинках, Эн-т,- в куппсуле тела, Эн-щ,- в щетинках. Делещш последовательностей ДНК обозначены горизонтальными линиями. Стрелки, ограничивающие МДГ4, представляют его длинные концевые повторы (ДКП). su(Hw)- связывающий домен, расположенный в 5' регуляторнои области МДГ4, обозначен заштрихованным овалом. Сокращения для использованных рестрикцжятых ферментов: Н, ЯЫШ; G, Bglil; X, XhoY, К, A/ml; В, ДданШ; S, Sail. Б. Пигментация кутикулы тела (Т), крыловых пластинок (К), грудных (Г), ножных (Н), крыловых (К), брюшных (Б) щетинок оценивалась по пятибалльной шкале у 3-5 дневных самцов при температуре 25° С. "0" соответствует пигментации ноль-мутанта, "5" - у* аллеля. Один кружок приравнивается к одному баллу. Черные кружки показывают исходный уровень пигментации у-мутантов, белые кружки отражают действие мутаций su(Hw)V su(Hw)\ Черные стрелки указывают направление транскрипции Р элемента относительно гена yellow.

С этой целью использовалась линия, содержащая ген транспозазы Р элемента (Д2-3) в 99В районе 3-ей хромосомы. В уя2° и уь'4 аллелях направления транскрипции Р элемента и гена уе11см противоположны, тогда как для у1,АЗ аллеля онисовпадают (рис. 1). Для всех трех взятых в анализ у23 мутаций были получены аналогичные результаты по частоте и спектру полученных событий (Табл. 1)

Таблица 1. Генетический анализ частоты нестабильности у аллелей после введения А2-3(99В) - источника транспозазы Р элемента

у Е Частота

аллель хромо- нестабиль-сом ности

Производные у аллели, количество независимых мутаций с данным фенотипом ( их частота хЮ 3)

J'

,М14

у*6

y+'S

У

10(2.1) 2 (0.7) 4(2.0) 4(2.1) 34(7.1) 14 (5.0) 12(6.1) 5(2.7) 4 (0.8) 2(0.7) 16(3.0) 12(6.5) 3 (0.6) 2(1.0) 1 (0.5)

У yU y+mws уът

1(1.1) 2 (2.3) 2(1.2) 7 (8.0) 4(5.4) 5 (5.4) 6 (3.7)

/"•у" V У»

15(6.2) 11(6.9) 2 (0.8) 1 (0.6)

4650 2775 1940 1846

870 740 920 1620

2420 1580

10.8 6.4 12.1 11.8

10.3

5.4

6.5 4.9

0.78 0.87

Примечание: Частота нестабильности вычислялась как соотношение количества независимых событий к общему числу просмотренных хромосом, умноженное на 1000.

Два фенотипических класса производных, у*' (степень пигментации как у дикого типа) и у1' (ноль-фенотип, полная инактивация гена), по данным Саузерн блот-анализа, являются следствием делеции последовательностей, ограничивающих Р элемент (рис. 1). При этом сам Р элемент не вырезается. Во всех у'1 аллелях делегирован промотор гена yellow, при этом средний размер делеций не превышает примерно 100 пн. По результатам Саузерн блот-анализа, все у** аллели связаны с делецией ьи(Н\у)-связывающего района МДГ-4, что приводит к

активации транскрипции тешуеИст энхансерами тела и крыльев (рис. 1). Делеция 8и(Н\у)-связывающего района может быть следствием либо вырезания МДГ-4 в результате рекомбинации между длинными концевыми повторами (2 события, у+'7 и У+'8)< либо делеции последовательностей, прилегающих к Р элементу (4 события,

+s2 +зЗ +я5 4 т Л. ^ +з v

у , у , у и у ). Сравнительно низкую частоту появления у аллелей по сравнению с у1' аллелями можно объяснить большим размером делеций, около 2 тпн, необходимых для захвата области, занимаемой ш(Н\у)-связывающим районом МДГ-4.

Аллели следующих трех стенотипических групп у", у2x1 и у*1/ у+ь являются результатом вырезаний Р элемента, не сопровождающихся делениями окружающих последовательностей. Наиболее часто возникали производные с у" фенотипом (Табл. 1). Блот-анализ по Саузерну 42 у" аллелей выявил, что в 41 случае вырезание было практически полным и лишь в одном - частичным. Девять у ' аллелей были проклонированы при помощи ПЦР и просеквенированы. Во всех девяти случаях после вырезания Р элемента сохранились по 10-18 пн от каждого концевого инвертированного повтора. При этом четырех случаях между ними были обнаружены короткие последовательности, не принадлежащие к последовательностям Р элемента, но имеющие к ним частичную гомологию. Наконец, в одном у" аллеле от З'конца Р элемента осталось 298 пн, а от 5' конца -17 пн, т.е. столько же, как и у остальных у" аллелей (Рис. 1). Таким образом, при вырезании Р элемента в донорном сайте остаются, в основном, по 10-18 пн от каждого из его концов.

Следующие две фенотипические группы аллелей, у2"1 и У*1/у+1'\ возникают с низкой частотой (Табл. 1) и имеют аналогичную структуру (Рис. 1) - от 5' конца остается от 71 до 92 пн (у2™ аллели) и от 108 до 404 пн (у^/у*1" аллели), в то время как от 3' конца Р элемента , как правило, всего 14-18 пн. Исключение составляют

два у2"1 аллеля, в которых после вырезания Р элемента в донорном сайте сохранились достаточно длинные последовательности от обоих концов (Рис. 1).

Влияние последовательностей МДГ4 и цитотнпа линии на характер вырезания Р элемента. Полученные у+' производные позволяют проанализировать влияние окружающих последовательностей на частоту и характер вырезания Р элемента в локусе yellow. Два аллеля, у+'3 и у+'6 , вызваны делецией последовательностей гена yellow и su(Hw)-cbбывающего района, но при этом большая часть МДГ-4 осталась не измененной (Рис. 1). После мобилизации Р элемента в у+13 и у*16 линиях был получен основной фенотапический класс производных аллелей, y+mlM, для которого характерна желтая окраска щетинок, промежуточный уровень пигментации кутикулы тела и почти нормальный - крыловых пластинок (Рис. 2). С помощью Саузерн блот-анализа для 11 независимых у*тт производных было показано, что все они связаны с практически полным вырезанием Р элемента из гена yellow. Место изменения у 4 у*""" аллелей было клонировано при помощи ПЦР и секвенировано, что подтвердило сохранение лишь 13-34 нп от каждого из концов Р элемента (Рис. 2).

у+з7 и y+sS аллели вызваны делецией МДГ-4 в результате рекомбинации между его ДКП (Рис. 1). После мобилизации Р элемента в у"7 и у"* линиях (Табл. 1) также возникает один основной класс производных, , который отличается по фенотипу от у+т" класса лишь более сильной пигментацией щетинок и кутикулы тела (Рис. 2). С помощью блот-анализа по Саузерну было показано, что только в 7 из 11 проанализированных у*ет аллелях происходит почти полное вырезание Р элемента, что было подтверждено клонированием и сиквенсом места изменения в двух у*"" аллелях. Клонирование и сиквенс места изменения в оставшихся четырех у+™J аллелях показал, что в них происходит частичная делеция Р элемента, в результате которой остается от 198 до 971 пн от 3' конца Р

ТКГШБ

„+j7v+j£ 8 88 у +S2 у +.tJ ^ +sd

яюшкмш

Лб)

je с 1

•• 1334 13-17

¿si ь

1430

Рис. 2. Фенотипичсское проявление производных, полученных юу** аллелей. Все обозначения как на Рис. I. ,

элемента и от 17 до 30 пн от 5' конца Р элемента (Рис. 2). Таким образом, в у"1 и у*"' аллелях происходит увеличение частоты возникновения неполных делеций, по сравнению с уг' аллелями, где было найдено только одно аналогичное событие из 48 проанализированных.Среди производных у*'7 и у*18 аллелей не было найдено таких, в которых от Р элемента остаются длинные 5' и короткие 3' концы. Вероятно, подобные изменения структуры Р элемента в yellow локусе не влияют на фенотип.

Следует отметить, что наблюдаемые нами паттерны вырезания Р элемента согласовывались с общепринятыми представлениями о механизме этого процесса. Однако, они находились в противоречии с данными, полученными ранее для уш'а аллеля (Geyer et aL 1988), который индуцирован инсерцией 1.1 тпн Р элемента в транскрибируемую, но не транслируемую часть гена yellow. В этих экспериментах мобилизацию транспозиций Р элемента индуцировали путем скрещивания гомозиготных ушм самок с самцами, имеющими Р-цитотип, т.е. содержащими много функциональных и делегированных копий Р элемента. В результате дестабилизирующих скрещиваний были получены у+ревертанты с частотой одно

событие на 500 проанализированных хромосом, что сравнительно мало для мутаций, индуцированных Р элементом. Молекулярный анализ трех ревертантов показал, что произошло почти полное вырезание Р элемента, от каждого из концов которого остаются от 4 до 11 пн . Изменения характера вырезания Р элемента можно объяснить тем, что мобилизация Р элемента осуществлялась с использованием другого источника транспозазы, или, что более вероятно, от наличия в используемой для экспериментов линии других копий Р элемента. Для проверки этого предположения мы провели аналогичный эксперимент по индукции нестабильности в у™28 линии, используя с этой целью Л2-3(99В) конструкцию, как источник транспозазы Р элемента, и предварительно, с помощью генетических скрещиваний, очистив исходную линию от большинства других копий Р элемента. В результате было получено 12 независимых у+ ревертантов, которые, как показал блот-анализ по Саузерну, связаны с полным вырезанием Р элемента. Клонирование и секвенирование места изменений у 8 у* ревертантов показало, что во всех случаях в локусе yellow остается, как обычно, от 14 до 17 пн от каждого из концов Р элемента. Таким образом, характер вырезания Р элемента зависит от цитотипа линии.

Анализ вырезания одной из двух копий Р элемента, находящихся по отношении друг к другу в инвертированном положении. Ранее была описана sn" мутация в локусе singed, которая вызвана инсерцией двух Р элементов в ориентации голова-к-голове (Engels 1989). Высокая частота вырезания одной из двух копий Р элемента в sn" мутации, достигающая 90%, объяснялась гомологичной рекомбинацией между двумя со направленными инвертированными повторами Р элемента. Для доказательства возможности такого механизма вырезания Р элемента были использованы уЪ7 и /^''аллели, которые содержат две копии 1.2 тон Р элемента в ориентации голова-к-голове (Рис. 3). При этом одна копия Р

,2s7

,2s 11

Эп-вд

yellow

82 PI

82 PI

1 -"-"Й^ siiiwiiiaai

P2M

PI

Рис. 3. Структура и фенотнпнческое проявление уе11он> аллелей, содержащих две кошм Р элемента.

Все обозначали; как на Рис. 1

элемента, Р1, расположенная ближе к МДГ- 4, имеет полноценные концы, а у второй копии Р элемента (Р2), на 5' конце Р элемента имеется делеция концевых

23 пн (уЪ7) или 82 пн {у23"). Частота событий после мобилизации Р элемента в у2'7 и у2'" линиях была примерно такой же, как в у аллелях, индуцированных инсерциен одной копии Р элемента (Табл. 1). Вырезание одного Р элемента в у237 аллеле не приводило к изменению фенотипа. В потомстве у2з" вырезание одной копии Р элемента всегда приводило к изменению фенотипа - возникало два класса

производных: у2" (желтые щетинки на тораксе и ногах) и у2ь'(у всех типов щетинок снижена пигментация) (Табл. 1). Было клонировано и секвенировано место изменений в 14 независимо полученных производных у2'7 и у2'11 аллелей (Рис. 3). В результате было обнаружено, что две производные у2"7 аллеля вызваны точным вырезанием Р2 элемента, имеющего делецшо 5' конца. Такие события могут быть только следствием рекомбинации между инвертированными концевыми повторами Р1 и Р2 элементов, находящимися в одинаковой ориентации. Среди производных уъ" аллеля такого класса производных обнаружено не было. Таким образом, вырезание одной копии Р элемента за счет рекомбинации между инвертированными повторами соседних его копий является достаточно редким событием. В остальных случаях происходило вырезание Р1 элемента, при этом, как и в случае одиночного Р элемента, оставалось по 13-30 пн от каждого из его концов. Интересно, что почта у всех производных между концевыми последовательностями появляются новые последовательности, которые могут быть довольно длинными, до 53 пн, и часто включают в себя повторы, имеющие гомологию к концам Р элемента. Класс производных мутантов с у2"5 фенотипом связан с простым вырезанием Р1 элемента, в то время как в классе производных мутантов с у2™ фенотипом вырезание Р1 элемента сопровождается инверсией Р2 элемента (Рис. 3). Таким образом, примерно в 40% случаев вырезание Р1 элемента сопряжено с инверсией Р2 элемента.

Последовательность между -69 и -146 пн относительно начала транскрипции rem yellow нужна для активации транскрипции. В предыдущих разделах приведены результаты, которые показывают, что вырезания Р элемента в у" аллелях сопряжено с репрессией транскрипции гена yellow (Рис. 1). Мутанты у" имеют желтое тело и крылья и только слабую пигментацию брюшных и крыловых щетинок, что предполагает нарушение транскрипции гена yellow во всех зонах

кутикулы (Рис. 1). Введение комбинации мутаций su(Hw)2/ su(Hw) ' , которая полностью инактивирует белок Su(Hw), лишь частично восстанавливает пигментацию у" аллелей (Рис. 1). Таким образом, вырезание Р элемента приводит к репрессии транскрипции гена yellow. Как было ранее показано, все у2" аллели и их производные имеют 77 -нп делецню последовательностей гепа yellow между -146 я -69 пн относительно старта транскрипция. Поэтому, наиболее вероятным объяснением полученных результатов является предположение, что 77-пн делеция приводит к инактивации транскрипции гена yellow, которая, однако, может компенсироваться наличием последовательностей Р элемента.

Для проверки этой гипотезы была создана Р [w+ Л yellow] конструкция (Рис. 4) на базе вектора CaSpeR3, несущего маркерный ген white. Эта конструкция содержала ген yellow со всеми регуляторными последовательностями и делецию последовательностей между -69 и -146 пн, как в у" мутациях. В результате трансформации эмбрионов линии у acw было получено 11 линий, которые, по данным блот-анализа по Саузерну, содержали одиночные инсерции P{w+ A yellow] конструкции в различных участках генома. Все одиннадцать независимых трансформантов имели пониженный уровень пигментации кутикулы тела, крыловых пластинок и щетинок, который, однако, зависел от положения конструкции в геноме (данные не приведены).

Таким образом, полученные данные подтверждают рольпоследователъности

между -69 пн и -146 пн в активации транскрипции гена yellow. Следовательно,

P2j

элемента в у мутантах компенсируют делецию регуляторных последовательностей гена yellow.

GH HK

__LL

в к Ayellow)

Эн-кр Эи-т

Эн-щ

Рис. 4. Структура Р [н>+,<4yellow] конструкции.

Всс обозначения как на Рис. I

Картирование регуляторных последовательностей Р элемента, ответственных за' компенсацию делеции между -69 и -146 пн гена yellow. Для картирования регуляторных районов Р элемента, ответственных за активацию транскрипции гена yellow, были использованы результаты молекулярного анализа производных (Рис. 1), полученных из у25713 , уън и у2*20 аллелей, у которых происходила либо слабое уменьшение пигментации (у2" аллели), либо наоборот - усиление пигментации (ул/ у'3 ). Все эти производные характеризуются неполной делецией последовательностей Р элемента. Пигментация в у2™ мутантах частично восстанавливается, по сравнению с мутантами, - только грудные и ножные щетинки имеют желтую вариабельную окраску (Рис. 1). Введение комбинации мутаций su(Hw)2/ su(Hw) ' приводит почти к полной супрессии мутантного фенотипа у21" аллелей (Рис. 1). В четырех исследованных у2"1 аллелях от Р элемента остается от 71 до 92 пн с 5' конца и от 15 до 619 пн с 3' конца. При этом ориентация этих последовательностей относительно промотора гена yellow не имеет значения. Таким образом, последовательности Р элемента, которые находятся на 5' конце между 18 и 71 пн, отвечают за частичное восстановление экспрессии гена yellow (Рис. 5). В то же время последовательности, сохранившиеся на 3' конце Р элемента в у2'" аллелях, имеют вариабельную длину и, следовательно, не важны для экспрессии гена yellow. Этот вывод подтверждается также структурой

200 пн

1 Г

и 31 4$ 71 92 10s 136

2855 2871 2j77 2907

АКТ АКТ

50 пн

Рис. 5. Структура функциональных участков Р элемента.

Сокращения: ИП, 31-пн инвертированные повторы Р элемента; ПР, промотор Р элемента; ТС, участок связывания транспозазы Р элемента; АКТ, районы Р элемента, которые активируют транскрипцию гена уе11ок.

одного у" и четырех у*"" аллелей, в которых от 3' конца сохранилась длинные последовательности Р элемента, не влияющие на фенотипнческое проявление соответствующего у аллсля.

Все три у+и производные, полученные в потомстве у2''4 и уwo аллелей (Р элемент находится в ориентации, противоположной транскрипции гена yellow), имели более интенсивную пигментацию кутикулы тела и крыловых пластинок, по сравнению с исходным у2' мутантом (Рис. 1). Введение комбинации мутаций su(Hw)2/su(Hw) 'приводит к полной супрессии мутантного фенотипа. В у3 аллелях Р элемент имеет от 108 до 404 пн с 5' конца и только от 14 до 17 пн с 3' конца (Рис. 1). Таким образом, 5' последовательность Р элемента длиной 108 пн может не только компенсировать 77-пн делецшо, но и слабо активировать транскрипцию гена yellow (Рис. 5)

Полученные три у* производные имеют пигментацию кутикулы тела и крыловых пластинок промежуточную между пигментацией у2' и уь мутантов (Рис. I). Все они возникли в потомстве у21/13 аллеля (ориентация Р элемента и гена yellow совпадают). Нами было показано, что в у* аллелях с 5' конца Р элемента сохраняется от 172 пн до 542 пн, а с 3' конца - от 14 пн до 61 пн (Рис. I). Таким образом, у"* и уй аллели имеют одинаковые по структуре Р элементы, а

небольшую разницу в степени пигментации можно объяснить различной ориентацией последовательностей Р элемента по отношению к промотору гена yellow.

Для дальнейшего уточнения границ последовательностей Р элемента, участвующих в регуляции транскрипции гена yellow, были использованы выше описанные производные уг'? и у2"" аллелей, которые содержат две копии 1,2 тпн Р элемента в ориентации голова-к-голове (Рис. 3). В результате вырезания Р1 элемента в у217 производных остается Р2 элемент с делецией 23 пн на 5' конце. Фенотип таких у"' производных не изменен и мутации в гене su(Hw) приводят к полной супрессии мутанткого у-фенотипа (Рис. 3). Следовательно, 23 пн, находящиеся на 5' конце Р элемента, не влияют на транскрипцию гена yellow.

В потомстве у2"1' мутанта вырезание Р1 элемента всегда приводило к изменению фенотипа - возникало два фенотипических класса производных: у2™ и у2Ьз (Рис. 3). Введение комбинации мутаций su(Hw)2/ su(Hw) ' приводит к почти

2ru

полному восстановлению пигментации в у мутантах и только к частичному - в у"". Как было выше показано, у2'" и y'h аллели содержат одну копию Р элемента с делецией 82 пн с 5' конца, однако направление транскрипции Р элемента и гена yellow в у2"* аллелях одинаковое а в у21" аллелях -противоположное. Таким образом, 5' концевые 82 пн участвуют в активации транскрипции гена yellow и либо ориентация 5' конца Р элемента, либо его удаленность от промотора, влияют на транскрипцию гена yellow (Рис. 4).

Влияние последовательностей МДГ-4, находящегося в положении -700 пн на транскрипцию гена yellow. При анализе паттернов вырезания Р элемента из у+' аллелей было обнаружено, что фенотип производных зависит от присутствия последовательностей МДГ-4. Если большая часть МДГ-4, за исключением его 5' области, содержащей su(Hw)-HHCyMTop сохранялась, то производные аллели,

связанные с полной делецией Р элемента, имели более светлую окраску, чем у*'т производные, содержащие только один его ДКП (Рис. 2). Этот результат предполагает, что последовательности МДМ, отличные от его su(Hw)-связывающего района, оказывают влияние и на экспрессию гена yellow.

Для подтверждения этого вывода были так же использованы слабые мутации в регуляторных генах е(у)1, е(у)2 и е(у)3, которые регулируют транскрипцию тепа yellow (Georgiev and Gerasttnova 1989). Было показано, что ген е(у)I кодирует белок TAFII40. Белковые продукты генов е(у)2 и е(у)3, по предварительным данным, также являются транскрипционными факторами. В присутствии е(у) мутаций наблюдается снижение транскрипции гена yellow в щетинках у2 мутантов (Табл. 2), что, по всей видимости, является результатом ослабления взаимодействия между энхнасером щетинок и промотором гена yellow. Однако, е(у) мутации не влияют на фенотипическое проявление у+ аллеля, а также ревертантов, полученных из у2 мутации - у*шс и у*змс (Рис. 6), которые возникли

Рис. 6. Структура j» аллелей и конструкций, содержащих ген yellow и su(Hw)-иисулятор.

sii(Hw}-raicyjUTop в канструтаямх показан в виде круга в треугольнике. Остальные обозначения как из Рис. I

Таблица 2. Влияние е(у)1"', е(у)2и1 и е(у)Зи'№ фенотипическое проявление у мутаций и конструкций на базе гена yellow.

Генотип_Пигментация в щетинках

yellow su(Hw) аллель e(Y) е (У) г е(у)2ш e(v)3"

Г Н Б Г н Б Г Н Б Г Н Б

у" „ 5 5 5 1 2 5 3 3 5 3 3 5

ушс 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

+/+ 5 5 5 0 0 3 1 1 4 1 1 3

su/su2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

+/+ 5 5 5 1 1 5 3 3 5 1 1 5

Ххр. su'/su2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

■ +/+ 5 5 5 4 4 5 5 4 5 5 5 5

2хр. su'/su2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

-yrtw ~ макс. 5 5 5 0 0 2 0 0 3 0 0 2

мин. 5 5 5 4 4 5 5 5 5 5 5 5

Сокращения: Г - грудные; Н - ножные; Б- брюшные щетинки; - комбинация мутаций

у* - конструкция ?(у*2*°)

Примечания: Цифры определяют уровень экспрессии генауеИоч1 у самцов (0 - отсутствие экспрессии, 5 - нормальный уровень экспрессии), макс. - лилия с Р(у*^конструкцией, в которой эффект введения е(у) мутаций был максимальный, иин. - Р(у*2т) линия, в которой этот эффект был минимальным.

вследствие вырезания МДГ-4 с сохранением на месте инсерции одного из двух ДКП (Georgiev et aL 1990). Таким образом, усиление мутантного фенотипа у2 аллеля на фоне г (у) мутации вызвано инсерцией в ген yellow мобильного элемента МДГ-4.

su(Hw)-micyAHTop в положении +2490 относительно начала транскрипции может блокировать неизолированный энхансер щетинок гена yellow. Следующая серия экспериментов была щюведена с целью изучения действия su(Hw)-связывающего района МДГ-4 (su(Hw)-HHcyiwTOpa) в присутствии е(у) мутаций, т.е. когда транскрипция гена yellow в щетинках ослаблена. Для этого были использованы ранее полученные линии (Geyer and Corees 1992) с конструкциями Ttm yellow, содержащими ад(Н\у)-инсулятор в -1868, -800, -700, +660, +1310, +2490 положениях по отношению к точке начала транскрипции гена yellow (Рис. 5). Для того чтобы учесть возможный эффект положения, для каждого варианта

конструкции было проанализировано от 3 до 7 независимо полученных линий, содержащих одну копию изучаемой конструкции.

В линиях с Р(у'ш) , Р(у'ш), Р(у 700), Р(у*6в0) и Р(у*ию) конструкциями е(у) мутации не влияли на экспрессию гена yellow. Однако, в линиях, содержащих комбинацию любой го е(у) мутаций с двумя из трех Р(у*2490) конструкций, пигментация щетинок заметно снизилась (Табл. 3). В то же время дополнительное введение su(Hw)'/ su(Hw)2 комбинации мутаций полностью восстанавливало пигментацию щетинок. Таким образом, в этом случае за репрессию транскрипции гена yellow в щетинках ответственен белок su(Hw). Для выяснения зависимости полученного эффекта от места инсерции конструкции, была проведена индукция транспозиций Р(у*2490) конструкции с X хромосомы на одну из аутосом. В результате было получено 12 независимых линий с транспозициями Р(у*24'м) конструкции. Все они были проверены с помощью Саузерн блот-анализа на присутствие единичной копии конструкции. После этого в полученные линии были введены е(у) мутации. Оказалось, что во всех случаях фоне е(у) мутации произошло заметное снижение пигментации грудных, ножных и брюшных щетинок (Табл. 3).

Обсуждение результатов

Паттерны вырезания одной копии Р элемента in локуса yellow. Полученные в данной работе результаты по вырезанию единичной копии Р элемента согласуются с более ранними работами (Takasu-Ishikawa et al. 1992; Staveley et al. 1995) . В большинстве случаев перед промотором гена yellow оставалось только по 15-17 пн от каждого из 31-пн инвертированного повтора Р элемента. Известно, что эти последовательности являются сайтами связывания для белка IRBP (inverted-repeat-binding protein) (Beall et al. 1994), который имеет гомологию к

человеческому антигену Ku-70. IRBP белок защищает от деградации однонитевые 17- пн 3' концы, образующиеся в результате действия транспозазы Р элемента, что облегчает лигирование и восстановление целостности хромосомы. В ряде у аллелей в месте соединения концов Р элемента обнаруживаются новые последовательности, что уже наблюдали при вырезании Р элемента из других локусов (Takasu-Ishikawa et al. 1992; Staveley et al. 1955). Обычно это короткие AT-богатые последовательности, иногда в виде тандемных повторов, которые, как полагают, могут образовываться в результате повторных раундов репликации какого-либо фрагмента инвертированных повторов (Takasu-Ishikawa et al. 1992; Staveley et al. 1995). Намного реже у производные сохраняют терминальные 15-17 пн с одного конца и довольно длинные последовательности с другого конца. Такая структура может возникнуть если один из 3' концов Р элемента образует гетеродуплекс с гомологичной последовательностью (т.е. с Р элементом) на сестринской хроматиде и индуцирует репарацию ДНК путем генной конверсии. Нами было обнаружено, что частота таких событий может зависеть от окружающих последовательностей. Так, подобная конверсия индуцируется в несколько раз реже если в yellow яокусе присутствуют последовательности мобильного элемента МДМ.

На характер вырезания Р элемента оказывает влияние цитотап линии, крторый определяется количеством полноценных и делегированных копий Р элемента, способных активно транскрибироваться. Так, если индуцировать нестабильность Р элемент-содержащего у аллеля в линии с большим количеством дефектных копий Р элемента, продуцирующих нефункциональную транспозазу, то, при практически полных вырезаниях Р элемента, в донорном сайте остается всего по 4-8 нп, тогда как обычно - 15-17 нп. Известно, что дефектная транспозаза, в отличие от функциональной, хорошо связывается с обоими инвертированными

повторами Р элемента (Lee et al. 1996). Поэтому, ее высокая концентрация может помешать IRBP белку, также связывающемуся с первыми 15-17 пн инвертированных повторов (Beall et al. 1994), защитить от действия экзонуклеаз последовательности Р элемента, остающиеся в донорном сайте.

Механизм вырезания одной из двух копий Р элемента, находящихся в инвертированной ориентации. Для объяснения высокой частоты вырезания одной из двух копий Р элемента в мутации sn", достигающей 80% , В. Энгельсом было выдвинуто предположение, что в случае, когда имеются две копии Р элемента, происходит рекомбинация между сонаправленными концевыми

инвертированными повторами соседних копий, например, в процессе репликации ДНК (Engels 1989). Для проверки этого предположения нами были использованы у аллели, содержащие два Р элемента в ориентации голова-к-голове, причем у одного из них 5' конец был дефектен. Такой Р элемент может вырезаться только по механизму рекомбинации между его неповрежденным инвертированным повтором и «»направленным инвертированным повтором соседнего Р элемента. Такие события были получены, что подтверждает высказанное В. Энгельсом предположение, однако, частота рекомбинаций была сравнительно низкой. В подавляющем большинстве случаев происходили обычные вырезания Р элемента с неповрежденными концами.

Последовательности в 5' области Р элемента могут компенсировать делецию регуляторных последовательностей гена yellow. В ходе экспериментов по мобилизации Р элемента в у2' аллелях было обнаружено, что последовательности гена yellow расположенные между -146 и -69 нуклеотидом (относительно точки старта транскрипции гена) важны для нормального уровня экспрессии гена.

Нами было обнаружено, что инсерция Р элемента в yellow локус компенсирует нехватку регуляторных последовательностей в гене yellow, что

приводит к восстановлению экспрессии. Были картированы два участка внутри Р элемента, отвечающие за этот эффект. Один из них расположен между 23 и 71 нуклеотидом Р элемента и содержит сайт связывания для транспозазы и промотр гена транспозазы (Kaufman et al. 1989). Другой цис-регуляторный, G/C - богатый участок Р элемента находится между 92 и 108 пн и включает в себя последовательность GAGAGGA, являющуюся сайтом связывания для белка АР-1, который является активатором транскрипции у млекопитающих (Distel et al. 1987). Оба элемента действуют независимо от своей ориентации по отношению к промотору гена yellow и, взятые по отдельности, способны частично восстановить нарушенную экспрессию гена. Присутствие обеих последовательностей может привести не только к восстановлению нормальной транскрипции гена yellow , но и к слабой ее активации. Таким образом, хотя бы в некоторых случаях, Р элемент, встроенный в регуляторную область гена, способен подцеживать его правильную энхансер-зависимую тканеспецифичную экспрессию.

Роль последовательностей МДГ-4 в репрессии гена yellow. Делеция 76 пн в регуляторной области делает транскрипцию гена yellow чувствительной к различным факторам. Так, например, фенотипическое проявление у" аллелей зависит от температуры, при которой происходит развитие мух. Кроме того, становится заметным влияние на экспрессию гена yellow инсерции МДГ-4 в регуляторную область. Так у*™"* аллели, в которых сохранился почти весь МДГ-4, за исключением одного ДКП и 5и(Нш)-связьшающего района, имеют более экстремальный мутантный фенотип, чем у*'*' аллели, где от МДГ-4 остался только один ДКП. Возможно, с последовательностями МДГ-4 связываются какие-то регуляторные белки, которые влияют на нормальную экспрессию теш yellow.

Новое свойство su(Hw) инсулятора. Как известно, 8и(Н\и)-связывающий район МДГ-4 имеет свойства инсулятора и блокирует взаимодействия между

энхансером и промотором, если располагается между ними (Geyer and Corees 1992). В экспериментах по комбинированию е(у) мутаций с конструкциями, содержащими su(Hw)-ifflcyrorrop в различных положениях по отношению к промотору ram yellow, мы обнаружили, что в позиции +2490 он достаточно эффективно блокирует энхансер щетинок. В указанном положении зи(Н\у)-связьтак>щий район не изолирует энхансер щетинок от промотора гена yellow, однако, препятствует их контакту, по всей видимости, благодаря ослаблению взйимодействия между энхансером и промотором в присутствии е(у) мутаций. Таким образом, описан первый случай, когда инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, не разделяя их. Эти данные противоречат общепринятой модели, объясняющей механизм действия инсуляторов (Schedl andGrosveld 1995).

Выводы

1. Изучены механизмы вырезания одной и двух копий Р элемента из локуса yellow. Показано, что паттерны вырезания Р элемента зависят от окружающих его последовательностей ДНК, а также от цитотипа линии. Доказано, что при наличии двух тандемных копий Р элемента, находящихся по отношению друг к другу в инвертированной ориентации, может происходить вырезание одной из копий за счет рекомбинации между сонаправлепными концевыми инвертированными повторами соседних Р элементов.

2. Показано, что последовательности гена yellow, расположенные между -146 и -69 пн относительно точки старта транскрипции гена, важны для нормального уровня экспрессии гена. Инсерция Р элемента способна компенсировать нехватку этой регуляторной последовательности, что ведет к восстановлению экспрессии. Были картированы два участка внутри Р элемента, отвечающие за активацию транскрипции

гена yellow.

3. Показано, что последовательности мобильного элемента МДГ-4, не входящие в состав его su(Hw)- связывающего района, способны негативно воздействовать на транскрипцию гева yellow. ■ * "

4. Впервые показано, что su(Hw)-HHcyjisTop может блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, не разделяя их физически.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Belenkaya Т., Barseguyan К., Hovhannisyan Н., Biryukova I., Kochieva E.Z., Georgiev P. 1998. P element sequences can compensate for a deletion of the yellow regulatory region in Drosophila melanogaster. If Mol. Gen. Genet. V. 259; P: 79-87.

2. Беленькая Т.Ю., Бирюкова ИЗ., Георгиев П.Г. 1998. Изучение механизмов вырезания Р элемента на модельной системе в локусе yellow у Drosophila melanogaster. П Генетика. Т. 35.N.1 (в печати).

3. Беленькая Т.Ю., Георгиев П.Г. 1998. Роль генов enhancer of yellow в регуляции экспрессии гена yellow у Drosophila melanogaster. // Генетика. Т.35. N2 (в печати)