Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль малых аминокислот в белковых (D1/D2) взаимодействиях в адаптации к температуре реакционного центра фотосистемы II

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Шлык-Кернер, Оксана Владимировна, Реховот (Израиль)

62 12/39

xntb ron

WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE

Thesis for the degree

Doctor of Philosophy

Диссертация для получения степени

Доктор Философии

. Выполнена Оксаной

Oksana Shlyk-Kerner Шлык-Кернер

.// / /

s

Ропь малых аминокислот в белковых (D1/D2) взаимодействиях в адаптации к температуре реакционного центра фотосистемы II.

The Contribution of Small Amino Acids at the D1/D2 Interface to the Functional Flexibility and Temperature Adaptation of Photosystem II Reaction Center.

Руководитель Проф. Advisor Авигдор Шерц

Prof. Avigdor Scherz

May 2006 Май2006

Submitted to the Scientific Council of Представлена на Защиту Научному

the Совету

Weizmann Institute of Science Научный Институт Вайцмана

Rehovot, Israel Реховот, Израиль

Эта работа была проведена под руководством Профессора Авигдора Шерца

В департаменте Наук о Растениях, Научного Института Вайцмана, Реховот, Израиль

Оглавление

Сокращения.................................................................................................4

Резюме.

.6

Общее введение...........................................................................................12

Фотосинтез................................................................................................ 12

Структура и функция фотосистемы 2.................................................................14

Фотосистема 2-мембранный белковый комплекс..................................................17

Температура и фотосинтез............................................................................. 1 ^

Объяснение для модификации белка...................................................................20

Мотив ГлихххГли....................................................................................... 22

94

Схема мутагенеза...........................................................................................^

95

Биологическая система...................................................................................

11

Ц ель и задачи............................................................................................

Глава 1 Гибкость белка обеспечивает акклиматизацию реакции фотосинтеза к

......29

температуре.................................................................................................

Глава 2 Б1-Гли208 найденный в точке пересечения D1/D2 субъединиц реакционного центра Фотосистемы 2 играет ключевую роль в управлении переноса электронов в

процессе фотосинтеза.....................................................................................^

Глава 3 Роль Dl-Cep209 в функциональной сборке Реакционных Центров Фотосистемы 2..............................................................................................^

91

Введение ......................................................................................................

93

Материалы и методы......................................................................................^

Результаты...................................................................................................^

Глава 4 Общее Обсуждение и Перспективы.....................................................Ю9

115

Ссылки......................................................................................................

Сокращения

Ала • Алании

ДрГ Аргинин

дсн Аспарагин

дрг Аминокислота

дсп Аспартат

АТФ Аденозин трифосфат

Брц Реакционный центр бактерий

Хл Хлорофилл

цис Цистеин

□ I 32 кДа белковая субъединица

¡32 34 кДа белковая субъединица DCMU (3-(3,4-dichlorophyll)-1,1 -dimetyl urea

Э]-[ Электронный перенос

фд Ферредоксин

Гли Глицин

рлн Глутамин

рЛу Глутамат

Н-связь ' Водородная связь

Гис Гистидин HPLC Жидкостная хроматография Высокой эффективности

ПХ Пероксидаза Хрена

Изолейцин

МБВС Межбелковая водородная связь

кда Килодальтон

Лей Лейцин

Лиз Лизин

Мет Метионин

НАДФ Никотинамид Аденин Динуклеотид Фосфат

0д Оптическая Плотность

pggO Специальная пара хлорофилла

ПААГ Полиакриламидный гель электрофорез

щ Пластоцианин

дцр Полимеразная Цепная Реакция

pDg Банк данных белка

Фео ' Феофитин

Y\Yx Пластогидрохинон

Про ПР°Л™

ФС1 Фотосистема 1

ф(22 Фотосистема 2 ПВДФ Поливинилиден Дифлуорид мембрана

qa Первичный акцептор хинона

qb Вторичный акцептор хинона

рц Реакционный центр

дед Додецил Сульфат Натрия

Сер СеРин

То Оптимальная температура роста

уд Термолюминесценция

yjyj Трансмембранный

ТРИС Трис (гидроксиметил) аминоэтан

Три Триптофан

Тир Тирозин

Вал Валин

РЕЗЮМЕ

Фотосинтез-жизненно важный процесс производства биомассы и кислорода, который протекает в разнообразных средах обитания. Реакция фотосинтеза обеспечивается слаженной работой фотосистем (белковых комплексов) при постоянно меняющихся условиях окружающей среды. Один из главных компонентов этой реакции-фотосистема 2 (ФС2), катализирует свето-зависимое окисление воды и восстановление пластохинонов посредством переноса электронов через цепь пигментов-кофакторов. Эти переносчики удерживаются в пространстве реакционным центром (РЦ)-белковым комплексом, состоящим главным образом из двух разных субъединиц Б1 и Ш. Реакция переноса электронов в ФС2 начинается с поглощения кванта света молекулой хлорофилла (Р680) и заканчивается восстановлением первичного пластохинона который передает электрон вторичному пластохинону После двух таких циклов восстановления, 0,в превращается в пластогидрохинон, Р()Н2. Этот конечный продукт ФС2 диффундирует сквозь мембрану, чтобы восстановить фотосистему 1 (ФС1) через цитохром Ь6/ комплекс и таким образом запустить синтез углеводов.

Также, ФС2 очень чувствительна к различным стрессовым воздействиям окружающей среды. Например, резкие колебания температуры, могут подавить (ингибировать) реакцию фотосинтеза, вследствии нарушения целостности структуры ФС2 как наиболее лабильной из белковых систем. В соответствии с литературными данными, есть два способа зависимости реакции переноса

электрона от окружающей температуры.

1. Белковый матрикс удерживает кофакторы в пространстве, и такая ультра точная геометрия пигментов диктует скорость переноса электрона (главным образом быстрых реакций). Соответственно, эта тонкая организация может быть сильно нарушена вследствии структурных изменений или частичной денатурации белка, в результате воздействия экстремальных температур.

2. Следуя классической парадигме Аррениуса, константа скорости переноса электрона с на 0,в, должна линейно расти с повышением температуры, в конечном счёте приводя к насыщению, фотоинактивации и разрушению реакционных центров ФС2.

Однако, фотосинтетические организмы, которые растут при чрезвычайно высоких температурах (термофиллы), поддерживают фотосинтетическую активность и целостность белка. Таким образом, главный вопрос, который не решён до сих пор, состоит в том, как фотосинтетические реакции в таких организмах поддерживаются при экстремальных температурах. Вообще, оптимальная функция белка требует надлежащего баланса между двумя основными факторами: структурная "жесткость", поддерживающая определенную трехмерную структуру при физиологической температуре, и "гибкость", позволяющая белку выполнять его каталитическую функцию. Это неустойчивое равновесие между стабильностью и "гибкостью", которая связанна с функцией, может регулироваться слабыми внутримолекулярными или межмолекулярными взаимодействиями.

Знание структуры и функции ФС2 улучшились с открытием новых кристаллических структур этого мембранного белкового комплекса из термофильных цианобактерий ТЪегтоБупескососсш е1ощаШ. Параллельно, последовательность белков ФС2 РЦ из различных организмов была расшифрована с помощью новых методов биоинформатики, которые позволяют быстрое сравнение многих таких последовательностей фотосинтетических организмов, которые живут в разнообразных средах обитания. Таким образом, анализ пространственной организации кофакторов и аминокислотных (АК) остатков, недавно полученных кристаллических структур, и изменений белковых последовательностей между различными организмами, позволяет искать структурные элементы, которые приспосабливают скорость переноса электронов к окружающим температурам. Следуя этому подходу, задача моей диссертации состоит в определении роли некоторых АК остатков, формирующих белок-белковые взаимодействия между Б1 и Б2 субъединицами

в регуляции скорости переноса электронов от Од к и её акклиматизации к окружающим температурам у мезофильных и термофильных фотосинтетических организмов. Компьютерный анализ структуры белков ФС2 РЦ и мутации т бШсо показал сайты межбелковых водородных связей (Н-связь) и Ван-Дер Ваальсовых взаимодействий, потенциально важных для сохранения структурной жёсткости и функциональной гибкости1.

В частности, боковая цепь аминокислоты в сайте Б1-212 может образовывать Б1/Е>2 межбелковую водородную связь, которая играет ключевую функциональную роль. Дальнейший анализ, сделанный в ходе исследования, используя инструменты визуализации структуры белка, поднял вопрос возможной причастности структурно близких аминокислотных остатков, а именно, 01-208 и 01-209, в упомянутых молекулярных взаимодействиях. На основе результатов была выдвинута гипотеза, что эти остатки и соседние белковые впадины, образуют мотив подобный ГлихххГли, обеспечивают необходимые элементы для температурной модуляции скорости электронного переноса (ЭП)1. Чтобы проверить эту гипотезу и выяснить молекулярные механизмы, был выполнен комбинаторный мутагенез на каждом из предполагаемых аминокислотных остатков в цианобактериях БупескосуяПз РСС 6803. Используя биофизические, биохимические, физиологические измерения, и вычисления термодинамических параметров для каждого из полученных мутантов, предложенная гипотеза была проверена экспериментально. Используя комбинацию экспериментальных и компьютерных методов1, был предложен новый механизм для функциональной адаптации мембранных белков к окружающим температурам. Здесь я перечисляю главные результаты своего исследования:

I. Компьютерный поиск предполагаемых межбелковых взаимодействий показал мотив ГлихххГли в участке между В1/В2 субъединицами ФС2. Используя инструменты визуализации белковых структур, я идентифицировала малые аминокислотные остатки в этом мотиве, которые участвуют в межбелковых водородных связях между £> альфа спиралями белковых

субъединиц D1/D2. Эти связи вовлекают D1-208, 209 и 212 остатки, которые расположены в точке пересечения D альфа спиралей в центре D1/D2 гетеродимера, близко к QaQb сайту ФС2 (Эта часть была сделана в сотрудничестве с lian Samish и была далее продолжена в ходе его кандидатской диссертации.).

II. Сравнение многих аминокислотных последовательностей показало, что последовательность ГлихххГли сохранена в центре спирали D белка D1 во всех кислород производящих фотоавтотрофах.

III. После этого сравнения я нашла, что два сайта (D1-209 и D1-212) претерпевают сохранённые в эволюции изменения между мезофильными и термофильными организмами. Я предположила, что модификации последовательности в этих участках белка могут регулировать местную гибкость белка. Таким образом, эти сайты D1 могут быть "горячими точками" в адаптации скорости переноса электрона к повышенным температурам.

IV. Чтобы доказать гипотезу, я спланировала и выполнила мутаганез D1-208, 209 и 212 остатков в последовательности ГлихххГли. Двадцать четыре мутанта были получены в результате мутагенеза, и последующей селекции функциональных мутантов в этих сайтах белка, организма Synechocystis РСС 6803.

V. Физиологические и биохимические измерения активности ФС2 в разных D1-208, 209 и 212 мутантах показали, что малые АК, (такие как глицин, аланин и серии) обеспечивают быстрые темпы размножения организма, высокое количество белка D1, распределение каротиноидов, подобных дикому типу, высокие константы скорости переноса электрона и стабильное S2jQb-состояние. Средние (по размеру) АК остатки (такие как цистеин, треонин, апарагин и аспартат) показали средне нарушенную функцию ФС2. Большие АК (такие как пролин, глютамин, глутамат, валин, лейцин, изолейцин и метионин) показали сильно нарушенную функцию ФС2. Ароматические и основные заряженные большие АК остатки (такие как тирозин, триптофан, фенилаланин,

гистидин, аргинин и лизин) не выросли на чашках с селективной средой ни в одном из трёх сайтов.

VI. Замена серина в сайте Dl-Cep212 АК остатками класса I (Гли, Цис, Ала, Тре, Асп и Асн) уменьшила отрицательную величину энтропии активации реакции ЭП с QA- на QB по сравнению с диким типом и придала "гибкость" необходимую для функции ФС2. Напротив, АК класса II (Про, Вал, Лей, Иле, Глу, и Глн) увеличили отрицательную энтропию активации, таким образом уменьшающую местную "гибкость" белка и обеспечивающую "жёсткую конформацию" РЦ ФС2. Этот результат указывает на ключевую роль АК остатка серина в сайте D1-212, в функциональной "гибкости" белка ФС2.

Мутации в участке D1-209 дали шесть АК остатков класса I (Гли, Ала, Тре, Цис, Асн, и Асп) и два АК остатка класса II (Про и Вал), и показали высокую корреляцию между размером ("объемом") аминокислотного остатка и скоростью ЭП между QA- и QB при комнатной температуре. Однако, эффект мутации в этом сайте на величины констант скорости и энтропии активации не был столь же силен как в положении D1-212. Таким образом мутации в участке D1-209, кажется, главным образом, затрагивают стабильность свернутого РЦ ФС2 и, в меньшей степени, ее функциональную гибкость. Мутации в положении Dl-Gly208 дали только трех мутантов, имеющие малые АК остатки Ала, Сер и Тре в сайте D1-208. Здесь, уменьшение константы скорости реакции коррелирует с силой водородной связи (Н-связь) образуемой аминокислотным остатком. Это открытие предполагает, что конформационное изменение в контакте D1/D2 облегчает перенос электрона- к QB , и что такое конформационное изменение задерживается в результате образования межбелковой Н связи например, вводя Тре или Сер на место D1-208.

VII. Сравнение графиков Эйринга для констант скорости переноса электрона (к) в различных мутантах класса I в D1-208, 209 и 212 сайтах, продемонстрировали зависимость противоречущую закону Аррениуса при повышении температуры, с выравниванием к в точке То (где То оптимальная температура роста исследуемого организма). Кривая показала постепенный

сдвиг То к более высокой температуре при уменьшении значений плотной упаковки атомов участвующих АК остатков. Выравнивание к было объяснено с точки зрения протонной перестройки в ответ на электрон транспортную реакцию. Изучив литературные данные, я пришла к выводу, что увеличенная "гибкость" белка в "горячей точке" белка ФС2 позволяет протонный тоннельный переход при повышенной температуре и таким образом ограничивает константу скорости переноса электрона. Поскольку "гибкость" в сайтах мутаций уменьшается при внесении различных АК в точке Б1-212, более высокая температура необходима, чтобы соответствовать условиям для

тоннельного перехода.

В заключении: результаты этой диссертации предлагают экспериментальное обоснование нового механизма биокаталитической модуляции в мембраных и возможно водорастворимых белках при различных температурах окружающей среды.

1. ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез. Фотосинтез - процесс преобразования энергии света в энергию химических связей, в ходе которого происходит синтез углеводов в растениях, водорослях, и некоторых видах бактерий2. Биомасса и кислород, непрерывно производящийся во время фотосинтеза, обеспечивают жизнь на земле во всевозможных температурных нишах от холодной Антарктиды до обжигающе горячих источников3. Фотосинтез растений и водорослей является в основном двустадийным процессом, протекающим в хлоропластах, в то время как у фотосинтетических бактерий он происходит в складках специализированной тиллакоидной мембраны. Первая стадия является светозависимым переносом электрона через фотосинтетическую мембрану и участвует в создании протонного градиента. Сформированный энергетический потенциал приводит к синтезу АТФ и НАДФ (Рис. 1). Эти два вещества используются во второй стадии, главным образом, охватывающей цикл Кальвина для синтеза углеводов, которые являются основанием пищевых цепей на земле. Атмосферный кислород - по существу побочный продукт фотосинтеза зелёных растений, морских водорослей и цианобактерий и пополняется каждые десять лет или около этого.

ATP Synthèse

Рисунок 1. Поток электронов проходит от ФС2 (окислитель Н20) к ФС1 (восстановитель НАДФ) в процессе фотосинтеза зеленых растений и цианобактерий. Эта реакция запускается поглощением квантов света ФС2 (первичным донором Р680) и PSI (Р700). Восстановленный пластохинон PQH2 является мобильным электронным переносчиком, направляющим электроны в цитохром bf комплекс. Оттуда, восстановленный пластоцианин (PC) несет электроны к PSI, который создаёт восстановленный ферредоксин (Fd). Этот восстановитель несёт электроны к NAD+, чтобы сформировать NAD®. Протонный градиент через тиллакоидную мембрану формируется, когда электроны текут через цитохром ô/комплекс, и используется АТФ синтазой, чтобы синтезировать АТФ.

Световые реакции происходят в тиллакоидиой мембране объединенным действием реакционных центров и антенн. Это мембранные белковые комплексы со встроенными в них молекулами хлорофилла и другими кофакторами, которые составляют фотосистемы. В кислород производящих фотосинтетических организмах два различных реакционных центра, известные как фотосистема I (ФС1) реакционный центр (РЦ) и фотосистема II (ФС2) реакционный центр (РЦ) работают в тандеме4. ФС2 окисляет воду и переносит электроны к ФС1 которая принимает элект�