Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль липопротеинов плазмы крови в связывании и транспорте ксенобиотиков в организме

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль липопротеинов плазмы крови в связывании и транспорте ксенобиотиков в организме"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

РОЛЬ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ В СВЯЗЫВАНИИ Н ТРАНСПОРТЕ КСЕНОБИОТИКОВ В ОРГАНИЗМЕ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1996

Л •

Работа выполнена в лаборатории медицинской биотехнологии Института биохимии СО РАМН

Научные руководители: академик РАМН, профессор Л.Е.Пкнин;

кандидат медицинских нау^ Л.М. Поляков

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.И. Феденков; кандидат биологических .наук Л.Ф. Гуляева

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

СО РАН

Защита диссертации состоится "V?" )и .00? 1996 года в|{)часов на заседании специализированного Совета К 001.37.01 в Институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "Г/)' |и^'1&1996г.

Ученый секретарь специализированного сивета

кандидат медицинских наук —Т.Г.Филатова

- а -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Проблема селективного транспорта ксенобиотиков и лекарственных препаратов с целью изучения их метаболических путей, а также ограничения побочных эффектов давно привлекает внимание исследователей.

Одними из наиболее вероятных переносчиков для ксенобиотиков различного типа являются липопротеины (ЛП) сыворотки крови. Они представляют из себя уникальную транспортную систему, основной функцией которой является перенос липидов. Кроме этого ЛП выполняют ряд регуляторных функций и транспортируют широкий спектр соединений, в том числе витамины, гормоны, различные метаболиты, ксенобиотики и среди них лекарственные препараты и канцерогены.

Изучение закономерностей распределения в крови и транспорта ксенобиотиков с ЛП представляет несомненный интерес в развитии наших представлений о механизмах действия лекарственных препаратов. Не менее важны проблемы канцерогенеза, в случае транспорта лилопротеинами различных канцерогенов.

Считается, что характер распределения ксенобиотиков между фракциями ЛП, а также связывание их с альбумином сыворотки крови во многом зависит от липофильности вводимого соединения: чем оно липофильнее, тем в большей степени связывается с фракциями ЛП и в меньшей степени - с альбумином [Shu, Nichols 1981].

Однако, в последние годы появились данные, указывающие на важную роль других факторов, в частности, на участие аполипопро-теинов в связывании и транспорте химических соединений. На этот вывод указывают, например, результаты распределения спин-мечен-ного производного клофибрата внутри структуры нативных ЛП-частиц в сравнении с делипидированными образцами. Оказалось, что дели-пидированные ЛПОНП практически не связывали клофибрат, в то время как делипидированные ЛПНП связывали клофибрат даже лучше, чем нативные ЛПНП [Ollever et al., 1988]. Таким образом, взаимодействие ксенобиотиков с аполипопротеинами и полярными липидами может играть ключевую роль в механизме их действия и дальнейших -ЛУЧА* ЛД5ПА ROINU } Mf\,

Делыо настоящего исследования являлось: "Изучить роль липоп-ротеинов плазмы крови в связывании и транспорте ксенобиотиков в организме". Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод оценку связывания гидрофобных соединений с ЛП и любыми водорастворимыми белками.

2. Выявить закономерности связывания и распределения гидрофобных и гидрофильных ксенобиотиков между липопротеинами плагмы крови.

3. Изучить распределение бензоСаЗпирена в составе ЛП различных классов плотности органами и тканями крыс.

4. Рассчитать константы диссоциации и числа мест связывания для комплексов ЛП-бензоСаЗпирен.

5. Выявить участие отдельных аполипопротеинов в связывании липофильных ксенобиотиков.

Научная новизна

Впервые было изучено взаимодействие ряда гидрофобных и гидрофильных веществ с ЛП различных классов, выделенных из плагмы крови крыс и человека. Это бензилпенициллин, цитохалазин, акти-номицин Д, бензантрацен, бензо(а)пирен, глюкоза и сахароза. Показано, что распределение этих соединений среди ЛП-фракций зависит не только от объема самой фракции и от соотношения в ней бе-лок/липид, но и в значительной степени от присутствия в ЛП-час-тице конкретных аполипопротеинов.

На примере эН-бензо(а)пирена впервые изучено поглощение гидрофобных лигандов органами и тканями крыс после внутривенного введения их в составе ЛП различных классов. Показана селективность распределения метки в зависимости от класса ЛП, используемого в качестве переносчика. Полученные в настоящей работе данные дозволяют говорить о целесообразности использования ЛП для направленного транспорта ксенобиотиков в клетку.

Получены основные физико-химические характеристики комплексов БП-ЛП плазмы крови, а именно: константы диссоциации и числа мест связывания.

Впервые показана роль отдельных аполипопротеинов в связывании липофильных ксенобиотиков и простых углеводов.

- 5 -

Практическая ценность работы

Результаты исследования позволили сформулировать гипотезу о том, что одним из путей проникновения липофильных ксенобиотиков в клетку является рецепторно-обусловленный эндоцитоз в составе липопротеиновых; комплексов.

Предложен простой и удобцый метод оценки связывания гидрофобных соединений с липопротеинами плазмы крови или с любыми другими транспортными белками. Метод позволяет количественно оценить характер взаимодействия лиганд-белок, а также получить результаты для постороения графиков в координатах Скзтчарда.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Липопротеины плазмы крови связывают и транспортируют в клетки организма липофильные ксенобиотики.

2. Основным аполипопротеином, связывающим бензо(а)пирен в ЛП-частицах является апоВ.

3. Комплексы гидрофобных лигандов с ЛП могут использоваться для их направленного транспорта в различные ткани организма, при этом наличие переносчика влияет на дальнейший метаболический путь лиганда.

Апробация

Материалы работы докладывались на 8 Международной конференции по органической и биоорганической химии (Рига,1991), IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине" (Москва,1992), XII Международном конгрессе фармакологов (Монреаль,1994).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы Диссертация содержит 129 страниц машинописи, из них собственно текст - ЛОк страниц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 7 глав

собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. В списке литературы приведены 7 отечественных и 159 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 12 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии РАМН.

Объекты и методы исследования

1. Выделение липопро'* эинов сыворотки крови выполнялось методом ультрацентрифугирования (Hatch, Lees, 1968).

2. Делипидирование осуществлялось охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмыркой эфиром (Климов , Петрова-Маслакова, 1979)."

3. Для очистки и выделения отдельных аполипопротеинов использовали гель-фильтрационную и ионообменную хроматографию.

4. Электрофорез аполипопротеинов проводили в полиакриламид-ном геле с додецилсульфатом натрия (Laemmli, 1970).

5. Определение белка (Lowry, 1951) проводили с использованием . бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта "Serva"(ФРГ).

6. Антиеыворотки к отдельным апсшшопротеинам получали путем подкожной иммунизации кроликов в разные точки спины.

7. Иммуноблоттинг выполняли по методу Tovey (1987).

8. В опытах In vivo меченые крысиные ЛП вводили животным в одну из хвостовых вен. -

9. Распределение меченых лигандов между отдельными фракциями ЛП в опытах In vitro изучали методами ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и диск-электрофореза. Радиоактивность измеряли на жидкостном счетчике "Mark-III". (США). Эффективность счета составляла 40%.

10. Количественный анализ образования коньюгатов бензо(а)пи-рен-ЛП проводился методом целлюлозных дисков, разработанным в нашей лаборатории (Поляков Л.М.,Часовских М.И.,Панин Л.Е.,1991).

В экспериментальных исследованиях использовались крысы линии Вистар массой 180-200г. Полученные результаты проанализированы с применением t-критерия Стьюдента.

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БП С ЛИПСПРОТЕИНАМИ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРУС

Добавление ^-бензо[а]пирена к плазме крови крыс и последующее ультрацентрифугирование показало, что основное количество метки - 77,3% связывалось с ЛП-фракциями и только 22,7% содержалось в инфранатанте (табл.1). В таблице так же приведены данные об относительном содержании каждой фракции ЛП. Разумно было бы предположить, что общее количество БП, связавшегося с конкретной ЛП-фракцией, должно быть пропорционально объему липидной фазы

Таблица 1-.

Распределение "^Н-бензоСаЗпирена между фракциями плазмы крови крыс и человека после ультрацентрифугирования

крысы

содержание содержание ЛП Зн-БП во -фракций , % фракцияхД *

человек содержание содержание ЛП Зн-БП во -фракций , % фракциях, % **

ЛПОНП 23,4 22 28 13,83

ЛПНП 13,8 11 57 45

ЛПВП 40,1 67 10 41,17

другие белки 22,7 5

* - данные приведены согласно [Chapman, 19803.

** - данные приведены согласно [Климов, Леви, 19833 этой фракции. Однако, такой зависимости в целом не наблюдается. Так, фракция ЛПНП, которая у крыс составляет 11%, связывает почти 14% БП и это с учетом всех'сывороточных белков.

Исследования, проведенные другими авторами на плазме крови человека показали сходные результаты: подавляющее количество БП

(в сумме 95%) связывалось именно липопротеиновыми фракциями [Shu, Nicols,1979]. Разница состояла в том, что наибольшая радиоактивность была обнаружена в ЛШП, а наименьшая - в ЖПШ (табл.1).

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БП С ЛП МЕТОДОМ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Флуоресценция - ЬроцесС обратный поглощению световой энергии, поэтому отсутствие ее или сниженение у многих сильно поглощающих молекул можно объяснить только наличием конкурентных процессов превращения энергии электронного возбуждения, или процессов "тушения", уменьшающих ее рантовый выход.

Тушенйе флуоресценции вызывают любые причины, мешающие сохранению возбулсценно^ц электронного состояния, в большинстве случаев это -беаизлучательные конкурирующие электронные переходы, происходящие внутри возбужденной молекулы и не приводящие к испусканию световых квантов.

V Большинство реакций, приводящих к тушению флуоресценции, представляют собой высокоспецифические взаимодействия между флуоресцирующими и Тушащими веществами.

, 'В надих экспериментах при добавлении БП к раствору ЛП во всех случаях наблюдалось снижение флуоресценции триптофана. На рис.1(а,б,в) представлены спектры флуоресценции, полученные при максимальном тушении, которое достигается путем титрования раствора ЛП бензо[а]пиреном. Характерно, что изменения величин флюоресценции для каждого класса ЛП имели существенные различия. Наибольшее снижение флуоресценции отмечено для ЛПВП - на 852. - 89%. от-¡исходного уровня. Слабее этот эффект был выражен при добавлении БП к ЛПНП и ЛПОНП (на 64-73% и 50-60% от исходного уровня соответственно). С учетом всех вышеизложенных рассуждений, снижение флуоресценции мы расцениваем как результат образования комплекса аполипопротеин-БП, сопровождающееся изменением" конфор-мацим белка в.ЛП.

Кроме того на рис.1(а,б,в) видно, что при добавлении БП к раствору ЛП во всех случаях несколько меняется форма "макушки" спектра, а так же наблюдается так называемый "голубой сдвиг" -слабый сдвиг максимума испускания в коротковолновую область (в

нашем случае на 1-3 нм). Из литературы известно, что такие сдвиги обычно наблюдаются при локальных конформационных перестройках белка после взаимодействия его с лигандом.

По кривым тушения флуоресценции, полученным по результатам титрования ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП рассчитаны величины констант диссоциации (КсО и число мест связывания (п) для БП и каждого из классов ЛП [А^а1аЬ,1^а;1968]. В таблице 2 приведены полученные значения Кс1 и п для комплексов БП с ЛП плазмы крови крыс.

Интересно отметить, что у крыс самая высокая Кс1 получена именно для ЛПНП, что может свидетельствовать о более высокой связывающей способности белка, входящего в состав ЛПНП по сравнению с белками ЛПВП и ЛПОНП.

Таблица 2.

Физико-химические характеристики связывания бензоСаЗпирена с липопротеинами плазмы крови крыс, полученные методом флуоресцентной спектроскопии

Класс ЛП Константа дис- Число связывающих

социации комплекса мест для БП на

БП-ЛП, Кс), М. 1 ЛП- -частицу, п

ЛПОНП 1,5х10"6 23

ЛПНП 6,6Х10"7 19

ЛПВП 4,2хЮ_б 10

Примечание: Здесь и далее при расчетах ориентировались на среднюю молекулярную массу ЛП-частиц у крыс: ЛПВП - 200 тысяч, ЛПНП - 1 миллион, ЛПОНП - 5 миллионов даль.гон. Содержание белка в этих фракциях принимали за 50, 20 и 10%, соответственно. Приведены средние значения по трем параллельным измерениям

3. ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ ОТДЕЛЬНЫХ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ЛП В СВЯЗЫВАНИИ БП

Окончательный ответ на вопрос, какие именно из аполипопроте-инов ответственны за специфическое связывание ЛП-частиц с БП мы

получили с помощью метода электрофоретического разделения белков в ПААГ. Для этого ЛП-частицы предварительно инкубировали с ^Н-БП, затем частично делипидировали и разделяли в ПААГ.

Диаграмма на рис.2 показывает распределение радиоактивности между апо-ЛПВП- и апо-ЛПНП, согласно локализации каждого аполи-попротеина после электрофореза в ПААГ. Более 80% всей радиоактивности, зафиксировавщейся на геле было локализовано в области расположения полос апоВ-100 и апоВ-48. Присутствие апоВ в ЛПВП крыс было для нас несколько неожиданным. Однако, в литературе имеются данные, подтверждающие наши результаты [Эоиез аЬ а1,1989, УагЛкопеп а1 а1, 1980], хотя они касаются вновь синтезированных ЛПВП. Наличие апоВ в зрелых ЛПВП крыс было нами продемонстрировано с помощью блоттинга со специфическими антителами к апоВ (рис.3).

Очевидно, что локализация БП в области апоВ может быть вызвана двумя основными причинами: образованием устойчивого комплекса БП-апоВ или образованием ковалентной связи. Однако, БП в экспериментальных условиях подготовки образцов к ПААГ-электрофорезу (нагревание образцов в течение 5 мин в присутствии 203) ко-

67 43

30

20 12

12 3

Рис. 2. выявление апоВ в составе крысиных ЛПВП с помощью иммуноблоттинга: 1 - калибровочные белки-стандарты; 2 -белки ЛПВП крыс; 3 - перенос апоЛПВП на нитороцеллюлозу с последующей обработкой антителами к апоВ крыс. Стрелка указывает на участок положительной реакции, соответствующий положению апоВ.

- ta -

а

Ù ouejjj HV ou»j IY ou« 3 QU«

MV outf

m

s////////.

о OU«

IIV IY ou»

S ou\a

AIV

L' ¡ 3 ? ? J ? f 9 ? I У ? r J> !>.' y1 ,Л>',»'','"'

%

i

§ 1

г*

1 * WW/WW * «ISOHKJDIIOHIÍIJ

валентных связей с белками не образует tOsborn, Crosby, 1087]. Остается предположить образование комплекса, но здесь так же может показаться неожиданным сохранение комплекса БП-апоВ в условиях делипидирования. Дело в том, что нагревание ЛП в присутствии 0,5Х SDS приводит лишь к частичному удалению липидов; к полному делипидированюо не приводит даже обработка органическими растворителями.

Таким образом, мы полагаем, что в наших условиях некоторая часть БП остается связанной с белком и этого окавывается достаточно для определения радиоактивности в соответствующих участках геля.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БП с ЛП и с апоВ МЕТОДОМ

ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ДИСКОВ

Метод тушения флуоресценции триптофана наряду с другими известными методами, такими как равновесный диализ, гель-фильтрация, ультрацентрифугирование и т.д. является достаточно традиционным для оценки взаимодействий типа "белок - лиганд". Однако в ряде1 случаев указанные методы неприемлемы или недостаточно информативны. В частности, в водных средах работа с гидрофобными соединениями сопряжена с определенными трудностями.

Мы предложили простой и удобный метод оценки связывания гидрофобных соединений с ЛП плазмы крови (или с какими-либо другими белковши фракциями), осуществляемый при покозл цэдгалозных дисков. Метод состоит из последовательного выполнения следующих этапов: I - нанесение возрастающих количеств нерадиоактивного БП на целлюлозные диски Whatman 3ÎAJ (диаметр 25 мм) и постоянного количества меченого БП в каждой точке; II- инкубирование предварительно высушенных дисков с раствором ЛП (или другого белкового субстрата); 111 - извлечение дисков из раствора и, исходя из оставшейся на диске радиоактивности, расчет Rd комплексов БП-ЛП. На рисунке 4 приведена характерная кривая насыщения, а так же данные по связыванию, выраженные в координатах Скэтчарда для случая связывания БП с ЛПВП. В качестве контроля использовался раствор альбумина.

Исходя из представленных выше результатов, нами был сделан вывод о наибольшей связыващей способности апоВ, поэтому этот

белок был нами выделен и очищен для получения количественных характеристик комплекса алоВ-БП.

В таблице 3 представлены константы диссоциации, полученные разработанным нами методом. Как видим, все константы имеют близкие значения одного порядка. Обращает на себя внимание тот факт, что имеются некоторые различия в сравнении с величинами констант. полученных методом тушения флуоресценции триптофана.

Рис. 4.Кривые связывания БП с ЛПВП плазмы крови крыс (1) и с альбумином (2), полученные методом целлюлозных дисков. Связывание БП с ЛПВП представлено также в координатах Скетчар-да (3). где В - БП, связанный с ЛПВП. Г - свободный БП.

Таблица 3.

Равновесные константы диссоциации (Кс1) для комплексов БП с ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП и изолированного апоВ крыс, полученные с помощью метода целлюлозных дисков

1 I 1 ЖОНП-БП 1 i i ( 0,9 + 0,28 ) X 10~5 i M 1

1 1 1 ЛПНП-БП 1 i i ( 1,5 + 0,37 ) X 10"5 M i

1 1 1 ЛПВП-БП 1 i I ( 4,1 + 1,04 ) X 10"5 M 1

1 1 1 АпоВ-БП 1 i i ( 2,5 + 0,62 ) X IQ"5 M I 1

Примечания: Ошибка рассчитана на основании трех параллельных измерений. Контрольные эксперименты, проведенные с использованием БСА, показали отсутствие связывания.

5. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ^Н-БП ПО ОРГАНАМ И ТКАНЯМ КРЫС ПОСЛЕ ЕГО

ВВЕДЕНИЯ In vivo В СОСТАВЕ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ЛП.

Для оценки роли ЛП в транспорте БП в организме,крысам в одну из хвостоеых вен вводили Ж в комплексе с ^-БП. Забой животных и последующее измерение радиоактивности проводили через 30 мин после введения препарата.

Обращает внимание высокое поглощение БП надпочечниками при использовании Есех классов Ж, но особенно при использовании ЛПВП (табл.4). Этот факт легко понять, так как в надпочечниках крыс для синтеза стероидных гормонов используется холестерин ЛПВП [Qwynne, Mahaffe et.al;19761. Наличие высокой радиоактивности в печени объясняется ведущей ролью этого органа как в синтезе ЛП, так и в их катаболизме CVari Berkel et.al. ,19781.

Следует отметить высокое содержание ^-ЕП в почках, особенно при использовании в качестве транспортной формы .ШЕЛ. Это подтверждается серией интересных исследований, где показана важнейшая роль почек Е катаболизме аполипопротеинов А-1, А-IV и Е, входящих в состав ЛПВП [Dallnga-Thie et.al.,1986; Van Toi et.al,1986].

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить об

участии ЛП в свявывании и избирательном транспорте БП в организме. Эти факты необходимо учитывать в развитии представлений о путях доставки ксенобиотиков в микросомы, и о механизмах индукции ферментов системы микросомалъного окисления.

Таблица 4.

Поглощение Зн-ЕП органами и тканями крыс черев 80 мин после внутривенного введения в составе ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП

радиоактивность, имп/мин на мг ткани

органы и ткани ____

ЛПОНП ЛПНП ЛПВП

печень 27,9 ± 4,1 25,9 ± 2,6 40,8 ± 9,5

легкие 6,6 ± 1,6 5,9 ± 1,0 9.6 4 1.1

сердце 3,1 ± 0,1 2,5 ± 0,2 2.3 ± 0.7

селезенка 1,9 ± 0,3 3,7 ± 0,5 5,9 ± 1,0

почки 11,5 ± 2,0 9,1 ± 1,0 26,3 ± 3,8

надпочечники 24,7 ± 2,3 29,1 ± 3,7 47,5 ± 9,4

тимус 4,1 ± 0,9 3,8 ± 0,4 6,4 ± 1,3

жировая ткань 4,8 ± 0,3 5,4 ± 1.0 6,8 ± 0,8

Примечание: число животных в каждой группе - 5,

6. ВЛИЯНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСА ЛП-БП НА СКОРОСТЬ МЕТАБОЛИЗМА БП

Основной адаптивной ферментной системой органиема, ответственной за метаболические превращения чужеродных неполярных соединений является, как известно, монооксигенаэная система печени. Цитохром Р-450, терминаи>ный компонент ферментного комплекса, представляет собой ключевой фермент, катализирующий окисление сотен субстратов.

Участие ЛП в связывании и транспорте ксенобиотиков в органив-ме бее сомнения должно отражаться на дальнейших путях метаОолив-ма транспортируемых соединений.

Для получения конкретных фивико-химических данных относительно высказанных предположений мы воспользовались возможностью

оценить влияние БП в комплексе с ЛПНП на ферментативную активность цитохрома Р-450 в микросомной моноксигеназной системе печени неиндуцированных крыс.

Для этого нами были рассчитаны величины констант скорости гидроксилирования БД в комплексе с ЛПНП и в свободном состоянии, которые составили 22§~и~125 рМ в мин на мг белка, что свидетельствует о том, что БП в комплексе с ЛП гидроксилируется заметно медленнее.

Таким образом, является несомненным факт влияния ЛП на скорость метаболизирования БП. Очевидно, что полученные результаты требуют дальнейших исследований, поскольку не подлежит сомнению необходимость учета процесса специфических взаимодействий ксенобиотиков метилхолантренового ряда и ЛП в оценке механизма действия ферментных систем, вовлеченных в биотрансформацию поступающих в организм ксенобиотиков.

7. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛП С НЕКОТОРЫМИ КСЕНОБИОТИКАМИ И БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

Считается, что характер распределения каких-либо соединений между фракциями ЛП, а так же их связывание с альбумином сыворотки крови зависит от ряда факторов и, главным образом, от липо-фильности еводимых соединений: чем более липофильно соединение, тем в большей степени оно должно связываться фракциями ЛП и в меньшей степени - альбумином. В этом смысле интересен сравнительный анализ результатов, полученных нами методом ультрацентрифугирования по распределению среди ЛП плазмы крови крыс бен-зилпенициллина, бензантрацена и бензоСаИпирена.

Так же методом ультрацентрифугирования были получены результаты по распределению между ЛП-фракциями плазмы крови человека цитохалазина и актиномицина Д (табл.5).

Проведенные нами исследования наглядно показывают, что действительно, чем более гидрофильно соединение, тем с большей степенью вероятности оно будет связано альбуминовой фракцией. Однако, внимательно изучив результаты, можно увидеть некоторые, на первый взгляд труднообъяснимые факты. Например, сравнивая результаты по распределению бензантрацена между белками плазмы

Таблица 5

Распределение 3Н-бенашше"ницшишна , ^-бензан'трацена , ЭН-БП, ^-цитохалазина и ^-актиномицинаД между фракциями плазмы крови после ультрацентрифугирования

ЛПОНП ЛПНП ЛПВП ' инфранатант

Бензилпенициллин 12,1% 10,4% . 17,6% 59,9%

Бензантрацен 10,85% 9,03% 41,99% 38,13%

БензоСаЗпирен 23,4% 13,8% 40,0% 22,7%

Цитохалазин '3,26% 22,98% 27,14% 46,61%

АктиномицинД 3,66% ■ 6,8% 48,78% 40,76%

крови крыс, видим, что подавляющее количество (в сумме более 80%) этого ксенобиотика, представляющего из себя практически абсолютно гидрофобное соединение, связывается двумя фракциями: альбуминовой и ЛПВП - т.е. фракциями, наиболее обогащенными белком. Аналогичный факт неудивителен для гидрофильного соединения, как это и зафиксировано нами для актиномицинаД - когда более 88% этого препарата, содержащего в своей структуре аминокислотные остатки, связывается двумя наиболее обогащенными белком фракциями в плазме крови человека. Таким образом, в случае с бензантра-ценом, так же как и с подробно исследованном нами ЕП, по-видимому имеют место специфические взаимодействия, определяющие столь нелогичный, на первый взгляд, рисунок распределения этих химических соединений среди фракций плазмы кроЕИ.

Что касается цитохалазина и бензилпенициллина, то эти соединения так же содержат в своей структуре полярные группировки, определяющие их более или менее гидрофильный характер, вследствие чего они преимущественно связываются с обогащенными белком фракциями плазмы крови. Однако, в случае с бензилпенициллином обращает на себя внимание тот факт, что ЛПВП и ЛПНП связьюают сравнимые количества антибиотика, а при этом в Бесовом отношении у крыс ЛПВП в 6 раз больше (табл.1) и белка там, как известно.

около50%, тогда как в ЛПНП только около 20%. И опять Запрашивается выеод том, что мы имеем дело не с простым растворением "подобного в подобном".

8. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОСТЫХ УГЛЕВОДОВ С ЛП-ФРАКЦИЯМИ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРЫС И ЧЕЛОВЕКА

Существует очень мало информации касающейся закономерностей распределения транспортируемых с кровью веществ среди ЛП-фрак-ций. Особенно это касается хорошо растворимых в воде соединений» для которых осноеным способом распространения по организму считается обыкновенная диффузия. В этом смысле интересен сравнительный анализ результатов, полученных нами методом ультрацентрифугирования по распределению глюкозы,и сахарозы среди ЛП-фрак-ций плазмы крови крыс и человека (табл.6).

Таблица 6.

Распределение 14С-глюкозы и 14С-сахарозы между фракциями плазмы крови крыс и человека после ультрацентрифугирования.

ЛПОНП ЛПНП ЛПВП инфранатант

крысы

Глюкоза 24,3% 18,4% 15,9% 41,4%

человек

Глюкоза 11,37% 17,13% 2,03% 69,26%

Сахароза 9,81% 10,74% 0,86% 78,59%

Как видим, существенная доля глюкозы действительно.остается в свободном состоянии в инфранатанте как в случае человеческой, так и крысиной плазмы. Однако, гораздохболее интересным является сам факт, что глюкоза в принципе может связываться и транспортироваться ЛП-фракциями плазмы крови. Ранее считалось, что глюкозе не требуется переносчик и в кровяном русле она присутствует пре-5ЭлущестЕбкко в несвязанном состоянии.-

Если мы остановимся несколько подробнее . на распределении глюкозы среди ЛП - фракций и примем за исходную гипотезу предположение о том, что распределение это должно зависеть от относительного количества самой ЛП-фракции и от процентного содержания белка в этой фракции, то мы обнаружим, что полученные нами результаты не укладываются в это предположение.

Например, известно что в количественном отношении у крыс больше всего ЛПВП (67% по весу) , и белка там 50% - тоже больше всего, однако глюкозы в этой фракции обнаружено меньше всего. Интересно, что ЛПНП, содержание которых по Еесу всего 11%, связывают глюкозы даже больше чем ЛПВП. Еще большее удивление вызывают ЛПОНП, которые казалось бы абсолютно не пригодны для транспорта глюкозы и других углеводов. Эта фракция ЛП , как видим, связывает углеводы лучше всех других фракций. Напрашивается вывод о каких-то специфических взаимодействиях.

С целью выяснения этого вопроса нами была выполнена серия хроматографических исследований. Сначала мы провели гель-фильтрацию ЛПОНП, предварительно инкубированных с глюкозой. Результаты свидетельствуют о том, что глюкоза действительно связывается е ЛПОНП и это взаимодействие достаточно устойчиво. Далее нами были получены основные аполипопротеины из ЛПОНП плазмы крыс. Выделенные и диализованные апо-Е и апо-С были предварительно проинкубированы с глюкозой и подвергнуты гель-фильтрации. Для сравнения аналогичный эксперимент был выполнен с апо-А1, являющийся основным белком ЛПВП. Полученные результаты демонстрируют образование комплекса в случае с апо-С и с апо-Е и отсутствие взаимодействия с апо-А1.

Таким образом, становится понятным почему ЛПОНП связывают в процентном отношении больше остальных классов ЛП. Что касается глюкозы, обнаруженной в ЛПНП и ЛПВП, то можно предположить, что в этих случаях связывание происходит, видимо, га счет взаимодействия с апо-В , а в случае с ЛПВП также за счет взаимодействия с апо-Е и с апо-С, присутствующих в составе этого класса ЛП. Предположительное связывание глюкозы с апо-В не представляется возможным проверить хроматографическими методами вследствие высокой гидрофобности этого белка.

На данном этапе исследований можно считать очевидным существование центров связывания глюкозы е структуре по крайней мере двух белков: апо-С и апо-Е.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в связывании как гидрофобных (бензоСа]пи-рен, бензантрацен, бензилпенициллин), так и гидрофильных (цито-халазин, актиномицин Д, глюкоза, сахароза) соединений с ЛП плазмы крови важную роль играют специфические взаимодействия этих соединений с аполипопротеинами, входящими в состав ЛП различных классов.

2. ЛП плазмы крови, нагруженные ксенобиотиками (бензо[а]пи-рен) и введенные внутривенно, осуществляют перенос последних в различные органы и ткани, и могут использоваться для направленного транспорта ксенобиотиков и лекарственных препаратов в организме.

3. Разработан простой и удобный в исполнении метод оценки связывания гидрофобных соединений водорастворимыми белковыми фракциями - метод целлюлозных дисков.

4. Методами гель-фильтрации и электрофореза в ПААГ показано, что основным белком, участвующем в связывании БП, является апоВ. Белками, наиболее активно участвующими в связывании глюкозы являются апоС и апоЕ.

5. Методом целлюлозных дисков и флюоресцентной спектроскопии получены основные физико-химические характеристики взаимодействия ЛП разных классов с БП. Величины констант диссоциации (10_5М - 10 ~7М) свидетельствуют о специфическом характере взаимодействия .

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 . Панин Л.Е., Часовских М.И., Поляков Л.М. Характеристика связывания и транспорта бенз(а)пирена с липопротеинаш сыворотки крови// Бюл.зксперим.биологии и медицины -1991 -Т.111.- N. 1. - С.31-33.

2. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Оценка связывания бензо(а)пирена липопротеинами сыворотки крови методом бумажных дисков// Укр.биохим.журн.-1991.-Т.63.-М.1 -с 101-104

3. Chasovskikh M.I., Polyakov L.M. Role of apoprotein ' В in the benzo(a)pyrene transport//Proc.8-th Conference of organic and Bioorganic Chemistry- Riga,199l-p 160

4. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е." Использование флуоресцентной спектроскопии для оценки взаимодействия бен-зо(а;пирена с липопротеинами крови//Материаш IV Всесоюзной конференции "Люминесцентный анализ в биологии и медицине"-Москва, 1992 - С.66.

5. Поляков Л.М., Часовских М.И., Панин Л.Е. Липопротеины - уникальная транспортная система для ксенобиотиков и биологически активных веществ// Успехи современной биоло-гии.-1992.-Т.112.- N.4.- С.601-608.

6. Polyakov L.M., Chasovskikh M.I.. Panin L.E. The role of apolipoprotein В in the binding of benzo(a)pyrene-phys co-chemical characteristics of interaction// Can.J.Physiol. Pharmacol.-1994.-V.72.-Suppl,l -P 5Э0

Зак23 . Tnp.i>0. Формат 60x84'/l6- Печ. л. /. Бумага офсетная №0 Подписано в печать

Типография СО РАМН, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 9, 1995.