Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль лидерного белка в нарушении ядерно-цитоплазматического транспорта клетки при кардиовирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Роль лидерного белка в нарушении ядерно-цитоплазматического транспорта клетки при кардиовирусной инфекции"

На правах рукописи

и«-»—

Бардина Марьяна Владимировна

РОЛЬ ЛИДЕРНОГО БЕЛКА В НАРУШЕНИИ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА КЛЕТКИ ПРИ КАРДИОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о

1 и

Москва 2009

П

003472664

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН и РАМН,

доктор биологических наук, профессор, Агол Вадим Израилевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Евстафьева Александра Георгиевна

кандидат биологических наук Карганова Галина Григорьевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «26» июня 2009 г. в_часов на заседании совета Д 501.001.76

по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «25 » мая 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение взаимодействия вирусов с клеткой - одно из наиболее актуальных и интересных направлений вирусологии, поскольку вносит существенный вклад в понимание механизмов патологического действия вирусов, а также особенностей функционирования различных клеточных систем.

Система ядерно-цитоплазматического транспорта (ЯЦТ) обеспечивает контролируемый обмен макромолекул между ядром и цитоплазмой через белковые комплексы ядерных пор (ЯП), пронизывающие ядерную оболочку (ЯО). Ионы и небольшие молекулы пассивно диффундируют через транспортный канал ЯП. Транспорт крупных макромолекул опосредуется специальными транспортными факторами и сопряжён с энергетическими затратами; транспортируемый субстрат должен обладать сигнальными последовательностями, определяющими его локализацию.

Изучение взаимодействия вирусов с транспортной системой клетки способствовало выяснению некоторых важных сторон функционирования этой системы. Так, впервые сигнал ядерной локализации белков (NLS) был охарактеризован в Т-антигене вируса SV40. При изучении ретровирусов были открыты транспортные цис-элементы РНК, а также клеточные транспортные рецепторы, обеспечивающие экспорт из ядра различных классов РНК. Взаимодействие вирусов с транспортной системой клетки имеет и практический аспект. Например, оно может помочь решить проблему доставки в клетку генов при генной терапии с помощью векторов на основе вирусных геномов. Расшифровка механизмов регуляции вирусами ядерного импорта/экспорта открывает новые перспективы для разработки противовирусных препаратов.

Цели и задачи исследования

Ранее было показано, что РНК-содержащие цитоплазматические вирусы семейства Picornaviridae способны изменять ядерно-цитоплазматический обмен клетки. В частности, полиовирус (Enterovirus) - возбудитель полиомиелита - нарушает ассиметричное распределение макромолекул между ядром и цитоплазмой в инфицированных клетках. Ключевую роль в этом играет вирусная протеаза 2А, которая расщепляет белки ядерной поры (Nup62, Nup98, Nupl53), тем самым, нарушая барьерные свойства ЯО (Belov et al., 2000, 2004; Gustin et al., 2001; Park et al., 2008).

Цель настоящей работы - изучить влияние других представителей Picornaviridae на клеточный транспорт. Особый интерес представляет группа Cardiovirus, у представителей которой белок 2А лишён протеолитической активности, а также имеется ряд других отличий в организации генома.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявить и охарактеризовать изменения ядерно-цитоплазматического обмена при

кардиовирусной инфекции.

2. Идентифицировать вирусные продукты и/или клеточные ферменты, индуцирующие изменения транспорта.

3. Сопоставить влияние кардиовирусной инфекции на ЯЦТ с нарушениями при инфекции полиовирусом, а также с известными динамическими изменениями транспортной системы в здоровой клетке.

Научная новизна

Продемонстрировано нарушение барьерных свойств ЯО при инфекции кардиовирусами, установлена роль клеточных ферментов и охарактеризовано влияние кардиовирусов на архитектуру и состав ЯП. Предложен сценарий нарушения транспорта кардиовирусами: вирусный L-белок активирует клеточные протеинкиназы, гиперфосфорилирующие белок Nup62, который локализуется в центральном канале ЯП (а также, возможно, другие компоненты ЯП), что нарушает селективный барьер ЯП и повышает проницаемость ЯО для пассивной диффузии макромолекул. На модели кардиовирусов показана принципиальная возможность регуляции проницаемости ЯО путём модификации нуклеопоринов без существенной разборки основных структур комплекса поры.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов. Результаты работы доложены на XIII (2005, Люнтерен, Голландия), XIV (2006, Саариселька, Финляндия) и XV (2008, Ситжес, Испания) международных конференциях «Молекулярная биология пикорнавирусов», на международной школе «Взаимодействие патогенов с хозяевами» (2008, Берлин, Германия), на международном совещании по программе НВО-РФФИ (2008) и Конференции молодых учёных (2008) в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН в Москве.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 27 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 158 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

К роду СапИстгих относят 1 вида: вирус энцефаломиокардита (ВЭМК) и вирус Тейлера, включающий 5 серотипов, в т.ч. патогенные для людей. В настоящей работе мы использовали ВЭМК, а также его штамм менговирус.

1. Влияние кардиовирусной инфекции на ядерно-цитоплазматический обмен клетки

Для изучения влияния кардиовирусной инфекции на ЯЦТ клетки мы использовали ранее описанные экспериментальные подходы, которые позволили выявить нарушения транспорта полиовирусом.

1.1 Изменение локализации ядерных и цитоплазматических белков при инфекции

Чтобы установить, происходит ли при кардиовирусной инфекции изменения ядерно-цитоплазматического обмена, мы изучили локализацию некоторых маркерных белков в инфицированных клетках. Удобной моделью для изучения локализации ядерных белков является линия клеток НеЬа-ЗЕ (Ве1оу е1 а1., 2004), стабильно экспрессирующая зелёный флуоресцентный белок, несущий сигнал ядерной локализации (N1^) - ЗхЕОРР-ЫЕБ (-90 кДа). В контрольных клетках НеЬа-ЗЕ флуоресценция наблюдается исключительно в ядрах, что обеспечивается наличием КЬЭ в маркерном белке (Рис, 1А). При инфекции ВЭМК и менговирусом локализация ЗхЕСРР-МЬ8 изменяется: уже через 2 ч после инфекции (п.и.) флуоресценция помимо ядра обнаруживается в цитоплазме, а к 4 ч п.и. равномерно распределяется по клеточным компартментам (Рис. 1А). Диффузное распределение белка по клетке сохранятся до финальных стадий инфекции (7 ч п.и.).

Распределение цитоплазматических белков в клетке мы изучали на примере маркерного белка циклин В1-ЕОРР. В контрольных клетках НеЬа, экспрессирующих циклин ВЬЕвРР, преимущественно наблюдается цитоплазматическая флуоресценция (Рис. 1В). После заражения кардиовирусами маркерный белок обнаруживается также в ядрах.

Изменение локализации ядерных и цитоплазматических белков при инфекции свидетельствует о нарушении кардиовирусами ядерно-цитоплазматического обмена в клетке.

1.2 Нарушение барьерной функции ядерной оболочки

Существует несколько возможных причин изменения локализации ядерных белков в клетке. Во-первых, отщепление последовательности N1^ сопровождается выходом ядерных белков в цитоплазму. Во-вторых, подавление активного импорта в ядро приводит к накоплению новосинтезированных ИЕв-содержащих молекул в цитоплазме. В-третьих, нарушение барьерной функции ЯО способствует диффузии ядерных белков в цитоплазму по градиенту концентрации. Мы проверили, какой из возможных механизмов реализуется при кардиовирусной инфекции.

Методом Вестерн-блоттинга мы показали, что 3xEGFP-NLS сохраняет интактность в течение всей инфекции (Рис. 1Б); следовательно, релокализация белка в цитоплазму не связана с отщеплением сигнала NLS.

Происхождение цитоплазматической фракции NLS-содержащих белков можно установить с помощью флуоресцентного белка Timer-NLS. Спектр флуоресценции данного белка меняется со временем от ярко-зелёной (0-3 ч после синтеза), затем желто-оранжевой (10-18 ч) и в конечном итоге до красной флуоресценции (>50 ч). Жёлто-оранжевая флуоресценция складывается из флуоресценции «молодых» (зелёных) и «старых» (красных) форм белка (Terskikh et al., 2000). С помощью Timer-NLS можно ответить на вопрос, происходит ли при кардиовирусной инфекции накопление новосинтезированных NLS-содержащих молекул или цитоплазматическая фракция ядерных белков представляет собой ядерный материал, вышедший в цитоплазму.

Клетки HeLa трансфицировали плазмидой, экспрессирующей Timer-NLS. Как видно на рис. 2А, через 18 ч после трансфекции (п.т.) в ядрах контрольных клеток находится преимущественно «молодой» белок, через 120 ч п.т. в ядрах наблюдается флуоресценция жёлтого цвета. Заражение таких клеток кардиовирусами приводит к перераспределению Timer-NLS между ядром и цитоплазмой (Рис. 2А), как это наблюдалось ранее для 3xEGFP-NLS (Рис. 1А). Согласно модели подавления импорта, следовало бы ожидать, что цитоплазматическая флуоресценция будет всегда иметь зелёный цвет, что соответствовало бы накоплению новосинтезированных молекул Timer-NLS. Однако цвет флуоресценции цитоплазмы указывает на накопление как «молодых», так и «старых» форм белка и всегда совпадает с цветом ядерной флуоресценции. Следовательно, если в инфицированных клетках и происходит подавление активного транспорта в ядро, то данный механизм не вносит существенный вклад в накопление NLS-содержащих белков в цитоплазме. Вероятнее всего, цитоплазматический Timer-NLS преимущественно представляет собой фракцию белка, которая находилась исходно в ядрах и подверглась перераспределению после инфекции.

Мы предположили, что выход маркерного белка из ядер происходит вследствие повышения проницаемости ЯО для пассивной диффузии и изучили, теряет ли ЯО свои барьерные свойства при кардиовирусной инфекции. Для этого контрольные и инфицированные клетки HeLa-3E обрабатывали детергентом (дигитонином), который пермеабилизует плазматическую мембрану, при этом ЯО сохраняет свои барьерные свойства (Adam et al, 1990). Действительно, контрольные пермеабилизованные клетки HeLa-ЗЕ сохраняют флуоресценцию в значительном проценте ядер (Рис. 2Б). Ядра инфицированных клеток не удерживают маркерный белок 3xEGFP-NLS, и он растворяется в окружающем буфере до недетекгируемых концентраций (Рис. 2Б). Потеря ядерной флуоресценции происходит в отсутствии экзогенного источника энергии и, следовательно, вызвана пассивной диффузией маркерного белка по градиенту концентрации, а не активным экспортом в цитоплазму.

вэмк

Менго

Ь £ га Ш CL

Я "

й з:

Я о В-3'

.. V:- V 1ь j ■- > ч •: Ш:

Б.

ВЭМК

2ч

4ч

6ч

3xEGFP-NLS тт

ß-актин

Рис. 1. Изменение локализации ядерных и цитоплазматических белков при кардиовирусной инфекции.

А. Клетки HeLa-ЗЕ заражали ВЭМК или менговирусом (50 БОЕ/кл); через 4 ч п.и. изучали локализацию флуоресцентного маркёра 3xEGFP-NLS. Для визуализации ядер использовали краситель ДНК Hoechst 33342. Б. Интактность 3*EGFP-NLS в течение инфекции (2, 4, 6 ч п.и.) подтверждали с помощью антител к GFP (Вестерн-блотгинг). В. Клетки HeLa трансфицировали плазмидой, экспрессируклцей циклин BI-EGFP; через 48 ч клетки заражали менговирусом (50 БОЕ/кл), через 4 ч п.и. изучали локализацию циклина B1-EGFP.

контроль

ВЭМК

38

интактные клетки

контроль Менго

•••/л

пермеабилизованные клетки

вя У

¡■■■ЯН1 ШШЩЩФ

Рис. 2.Изучение механизмов релокализации ядерных белков при инфекции.

А. Клетки НеЬа трансфицировали плазмидой, экспрессирующей Т1шег-ЫЬ5; через 18 и 120 ч клетки заражали ВЭМК (50 БОЕ/кл); через

4 ч п.и. изучали цвет ядерной и цитоплазматической флуоресценции. Б. Клетки НеЬа-ЗЕ заражали менговирусом (50 БОЕ/кл); через 3 ч п.и. обрабатывали дигитонином (40 мкг/мл,

5 мин, 4°С) и изучали сохранение ядерной флуоресценции. Стрелками отмечены не пермеабилизованные клетки.

На основе вышеописанных результатов можно заключить, что кардиовирусы влияют на ядерно-цитоплазматический обмен, нарушая барьерные свойства ЯО, что приводит к релокализации ядерных белков в цитоплазму путём пассивной диффузии.

Мы предполагаем, что повышение проницаемости ЯО способствует также проникновению цитоплазматических белков в ядро. Нельзя, однако, исключить и другие механизмы. Действительно, циклин В1 не является истинно цитоплазматическим белком: данный белок обладает сигналами NLS и NES и способен курсировать между ядром и цитоплазмой. При активации циклина В1 (например, в начале митоза) происходит фосфорилирование сигнала NES, и белок накапливается в ядрах в результате активного импорта. Реализация такого механизма при кардиовирусной инфекции представляется нам маловероятной. Можно ожидать, что повышение проницаемости ЯО нарушает распределение транспортных факторов между ядром и цитоплазмой (Gorlich et al., 2003), а значит, снижает эффективность или даже подавляет активный экспорт/импорт.

Независимой группой были получены свидетельства нарушения ЯЦТ другим представителем рода Cardiovirus - вирусом Тейлера. Данный вирус вызывает релокализацию в цитоплазму ядерных белков, а цитоплазматический белок 1RF3 накапливается в ядрах (Delhaye et al., 2004). Авторы также полагают, что изменение локализации белков в инфицированных клетках связано с нарушением барьерных свойств ЯО.

препарат ядер + экстракт клеток

Рис. З.Экстракт инфицированных клеток повышает проницаемости ЯО in vitro.

Клетки HeLa-ЗЕ обрабатывали дигитонином (40 мкг/мл, 5 мин, 4°С), полученный препарат ядер инкубировали 1 ч при 37°С с 20%-ным по объёму цитоплазматическим экстрактом (фракция S100) контрольных или инфицированных менговирусом (100 БОЕ/кл, 4 ч п.и.) клеток HeLa и изучали in vitro индукцию проницаемости ЯО. Для дискриминации пермеабилизованных и интактных клеток использовали краситель ДНК Hoechst 33258, слабо проникающий через интактную плазматическую мембрану.

2. Кардиовирусный L-белок отвечает за нарушения транспорта

На следующем этапе перед нами стояла задача выявить вирусные продукты, индуцирующие нарушения ядерно-цитоплазматического обмена.

2.1 Экстракты инфицированных клеток нарушают барьерные свойства ЯО in vitro

Препарат ядер, полученный путём обработки клеток HeLa-ЗЕ дигитонином (см. выше), инкубировали с цитоплазматическим экстрактом контрольных или инфицированных менговирусом клеток HeLa (Рис. 3). Цитозольные факторы из контрольного экстракта стабилизируют ЯО и способствуют сохранению ядерной флуоресценции в течение длительного времени (1-3 ч). Экстракт инфицированных клеток приводит к нарушению барьерных свойств ЯО и потере флуоресценции в 100% ядер. При термической обработке (15 мин, 65°С) экстракт теряет описанную активность (данные не приведены). Следовательно, в экстракте инфицированных клеток находится термолабильный фактор (вероятно, белковой природы), индуцирующий повышение проницаемости ЯО in vitro в отсутствии инфекционного процесса.

2.2 Роль кардиовирусных белков L, 2А и 3D в нарушении транспорта

Нашим следующим шагом было выяснить роль отдельных вирусных продуктов в нарушении ЯЦТ. Лидерная область и белок 2А являются наиболее вариабельными в геноме пикорнавирусов и представляют особый интерес (Рис. 4А).

Мы использовали вирусные рекомбинантные репликоны, содержащие делеции в области генов-кандидатов (Рис. 4Б). Репликон pE-Iuc кодирует под Т7-промотором полноразмерный геном ВЭМК, но участок структурных белков VP1 и VP3 замещен геном люциферазы. Репликон pE-luc-Д2А содержит делецию в гене 2А. В репликоне pE-luc-AL удалено 165 оснований последовательности, кодирующей L-белок. Также мы использовали дефектную по репликации конструкцию pE-luc-A3D с делецией, включающей активный сайт РНК-зависимой РНК-полимеразы (3D). Конструкции pE-luc, рЕ-1ис-Д2А, pE-luc-A3D были созданы и описанны ранее (Aminev et al., 2003); конструкция pE-luc-AL создана нами для настоящих исследований.

РНК репликонов pE-luc, -Д2А, -AL, -A3D получали путём Т7-зависимой транскрипции соответствующих конструкций in vitro и использовали для трансфекций клеток HeLa-ЗЕ. По способности этих репликонов вызывать релокализацию белка 3XEGFP-NLS в цитоплазму судили о роли L, 2А и 3D в нарушении ЯЦТ. В качестве отрицательного контроля использовали транскрипт pGL2 (Рис. 4Б), кодирующий только люциферазу. Как видно на рис. 4В, репликон pE-luc-AL лишён способности вызывать релокализацию маркерного белка в цитоплазму, что указывает на необходимость L-белка для повышения проницаемости ЯО при кардиовирусной инфекции. Все репликоны, кодирующие L-белок (pE-luc, -А2А, -A3D), обладают такой активностью.

Учитывая, что делеции могут влиять на эффективность трансляции репликонов in vivo, РНК репликонов pE-luc, -А2А, -AL, -A3D и pGL2 транслировали in vitro. Препарат ядер клеток HeLa-ЗЕ (см. в раздел 2.1) инкубировали с продуктами трансляции (количественно выровненными по

люциферазной активности), и изучали способность этих продуктов нарушать барьерные свойства ЯО (Рис. 4Г). Продукты трансляции репликона pE-luc вызывали потерю флуоресценции в 100% ядер, что подтверждает способность вирусных белков повышать проницаемость ЯО in vitro. Продукты трансляции конструкций с делениями в 2А и 3D проявляли такую же активность. При инкубации с продуктами трансляции репликона pE-luc-AL ядерная флуоресценция сохраняется, что подтверждает решающую роль L в нарушении кардиовирусами барьерных свойств ЯО. 2.3 Роль доменов L-белка кардиовирусов в нарушении транспорта

В структуре L-белка кардиовирусов выделяют С-концевой мотив Zn-пальца и N-концевой кислый домен с сайтом фосфорилирования казеин-киназы 2 (Рис. 5А). Мы использовали ранее описанные рекомбинантные менговирусы, содержащие мутации в L-белке (Рис 5Б), чтобы установить, какие функциональные домены белка необходимы для нарушения ЯЦТ. Эти мутанты жизнеспособны, однако различаются по эффективности размножения в культуре HeLa-ЗЕ (Рис. 5В), что более явно на поздних стадиях инфекции (после 6 ч п.и.)

Как видно на рис. 5Г, вирус с мутацией Т47Е, мимикрирующей фосфорилирование L-белка, как и вирус дикого типа (wt), вызывают релокализацию 3xEGFP-NLS из ядер уже через 3 ч п.и. Менговирус с мутацией Т47А, предотвращающей фосфорилирование этого сайта, индуцирует детектируемый выход маркёрного белка из ядер существенно менее эффективно и на более поздней стадии (5 ч п.и.). Нарушение мотива Zn-пальца приводит к неспособности вируса вызывать релокализацию маркёрного белка даже на поздних стадиях инфекции. Эти результаты указывают на важность сайта фосфорилирования и особенно мотива Zn-пальца L-белка для способности кардиовирусов вызывать нарушение ЯЦТ.

Можно было думать, что разная способность мутантов по L-белку нарушать ЯЦТ отражает разницу в эффективности их размножения в клетках HeLa-ЗЕ. Поэтому была исследована роль функциональных доменов L-белка при отсутствии инфекционного процесса. Вирионную РНК менговирусов wt, Т47Е, Т47А и Zn транслировали in vitro в присутствии 338-меченого или немеченого метионина. Меченые продукты трансляции анализировали путем электрофореза в ПААГ: мутации в L-белке не влияли значительно на эффективность трансляции РНК, а продукты трансляции в равной степени процессировались (Рис. 5Е). Немеченые продукты трансляции инкубировали с препаратом ядер HeLa-ЗЕ, как описано выше, и изучали их способность индуцировать выход маркёрного белка (Рис. 5Д). Опыты in vitro подтвердили результаты, полученные in vivo.

Таким образом, можно заключить, что в отличие от инфекции полиовирусом, где главная роль в нарушении ЯЦТ отводится вирусной протеазе 2А, ключевую роль при кардиовирусной инфекции играет L-белок. Функционально активной является форма L-белка с интактным мотивом Zn-пальца и сайтом фосфорилирования (треонин в 47-ом положении).

А. полиовирус (Enterovirus)

ВЭМК (Cardiovirus)

5'НТО

~[VÑ VP2 I VP3"

1° Е —

О поли(С)-тракт

ЗВ

ЙЯЕЕ EHIE3

3D

I ЕЛ II 1

А _А А

Б- pE-lüC —° 11—¡ | | люцифераза |2А| Щ' 111 | 3D

pGL2 —I I ™мифераза | ]—

pro

В.

Т7-транскрипты

(Л

pGL2

pE-luc

pE-luc-AL

рЕ-|ис-Л2А pE-iuc-ДЗО

та

Ив 522 к Ш "шт

1,7±0,5

18,4±7,4 1,6±0,2 10,7±1,4

продукты трансляции Т7-транскриптов

17,7±5,2

Ф 9 • > 1 * * • 1 %

0 4 ^ ъ> fli .... в ® ' v' nV -; ■Х- • 9 .'Л 0 - 5 ® } . «" 1 у /Гч > * _ • %

Рис. 4. Роль вирусных белков L, 2А и 3D в нарушении транспорта.

А. Некоторые различия в организации геномов Entero- и Cardiovirus. НТО - нетранслируемые области генома, pro - вирусные протеазы. Б. Строение репликонов pE-luc и конструкции pGL2 (содержит в качестве трансляционного элемента 5'НТО вируса Тейлера); Л - обозначены гены, в которые вводились делеции в рЕТис-производных. В. Клетки HeLa-ЗЕ трансфицировали Т7-транскриптами репликонов; через 8 ч изучали локализацию маркерного белка; указан процент клеток с выходом 3*EGFP-NLS из ядер (примеры отмечены стрелками) от общего числа клеток в поле. Подсчёт проводили по 3-5 полям в двух независимых экспериментах. Г. Препарат ядер, полученный обработкой дигитонином клеток HeLa-ЗЕ, инкубировали (I ч, 37°С) с продуктами трансляции репликонов в присутствии стабилизирующих цитозольных факторов (10%-ный по объёму экстракт клеток HeLa). Использовали краситель ДНК Hoechst 33258.

А.

С

сайт

фосфорилирования

Zn2*;

'СЮ C22v

N MATTMEOEICAHSMTFEECPKCSALOVRNGFYLLKYOEEWYP€ELLTT1GEDDVFOPOLDMEWFETQ С

домен Zn-пальца

Кислый домен

Б.

Вирус

Мутация Описание мутации

Ссылка

Менго \vt Менго Т47Е

Менго Т47А Менго Zu

Thi-47—Glu

Tlu'47—>ALa Cysl9—>А1а/ Cys22—>Ala

дикий тип Duke et al.. 1989

мимикрия конститутивного Hato et al.. 2007 фосфорилирования L-оелка

нарушение сайта фосфорилирования Zoll et al.. 2002

нарушение домена Zn-пальца Hato et al.. 2007

Менго

12 16 время п.и., ч

продукты трансляции РНК Менго

щ щ

l^mj^BblEl §§

Е.

wt Zn Т47АТ47Е

mm _

—«мм» ««

-17

Рис. 5. Роль доменов L-белка в нарушении транспорта кардиовирусами.

А. Схема строения L-белка Cardiovirus на примере менговируса. Б. Описание рекомбинантных менговирусов с точечными заменами в L-белке. В. Кривые роста менговирусов в клетках HeLa-3E при множественности заражения 20 БОЕ/кл; Г. Культуру HeLa-ЗЕ заражали менговирусами с мутациями в L-белке (20 БОЕ/кл), через 3 и 5 ч п.и. изучали их способность вызывать релокализацию 3xEGFP-NLS; Д. Препарат ядер HeLa-ЗЕ, полученный как описано выше, инкубировали (1 ч, 37°С) с продуктами трансляции менговирусных РНК в присутствии стабилизирующих цитозольных факторов (10%-ный по объёму экстракт клеток HeLa). Использовали краситель ДНК Hoechst 33258. Е. Анализ продуктов трансляция in vitro вирионной РНК менговирусов в 12%-ном ПААГ.

Роль L-белка в нарушении ЯЦТ была подтверждена в работах независимых групп авторов. Показано, что при индивидуальной экспрессии L-белка ВЭМК в клетках HeLa подавляется экспорт мРНК из ядер (Porter et al., 2006); для этого необходим интактный домен Zn-пальца. L-белок вируса Тейлера, который обладает всего 35%-ным сходством с L-белками ВЭМК и менговируса, также отвечает за перераспределение ядерных и цитоплазматических белков в инфицированных клетках (Delhaye et al., 2004). Авторами установлена значимость мотива Zn-пальца в L-белке этого вируса.

3. Роль протеаз и протеинкиназ в нарушении транспорта

Учитывая, что L-белок кардиовирусов лишён ферментативной активности, мы предположили, что он действует через вирусные и/или клеточные ферменты. Известно несколько классов ферментов, регулирующих ЯЦТ: (i) протеазы (например, каспазы и протеаза 2А полиовируса); (ii) протеинкиназы (например, митотические); также (iii) метилирование и (iv) убиквитинилирование белков может изменять их локализацию.

Мы проверили участие протеаз и протеинкиназ в нарушении кардиовирусами барьерных свойств ЯО. Для этого изучали действие ингибиторов протеаз и протеинкиназ на способность экстрактов инфицированных менговирусом клеток вызывать выход 3XEGFP-NLS из препарата ядер HeLa-ЗЕ. Результаты ингибиторного анализа представлены в табл. 1. Ни один из протеазных ингибиторов в указанной концентрации не подавлял активность экстрактов инфицированных клеток, что опровергает участие каспаз, протеазы ЗС кардиовирусов и других тестируемых классов протеаз в нарушении ЯЦТ. Большинство исследованных ингибиторов протеинкиназ также не предотвращали выход 3XEGFP-NLS из ядер. Исключение составили ингибитор широкого спектра протеинкиназ стауроспорин и ингибиторы росковитин и оломоуцин (но не изо-оломоуцин - неактивный аналог), при инкубации с которыми экстракты инфицированных клеток теряли свою активность (Рис. 6). Росковитин и оломоуцин являются высокоспецифичными ингибиторами циклин-зависимых протеинкиназ (Cdks), регулирующих прохождение клеточного цикла. Даже при высоких концентрациях (1 мМ оломоуцин и 100 мкМ росковитин), которые мы использовали, данные ингибиторы сохраняют специфичность. Кардиовирусы не кодируют собственных протеинкиназ, следовательно, ингибиторы действуют на клеточные ферменты.

Как было показано выше, наличие потенциально го сайта фосфорилирования играет важную роль в функциональной активности L-белка. Поэтому можно было предположить, что действие протеинкиназ сводиться к фосфорилированию L-белка. Это предположение мы проверили с помощью менговируса Т47Е с мутацией, мимикрирующей конститутивное фосфорилирование L-белка. Если протеинкиназы действуют непосредственно на L-белок, то мутант не должен быть чувствителен к действию ингибиторов. Однако стауроспорин эффективно предотвращал пермеабилизацию ЯО ядер HeLa-ЗЕ при инкубации с продуктами трансляции РНК менговируса

И

Таблица 1. Способность ингибиторов протеаз и протеинкнназ предотвращать нарушение барьерных свойств ЯО in vitro, индуцированное кардиовирусами.

Ингибиторы Конд-ия Мишень Эффект

химостатин 0,3 мМ трипсиновые/химотрипсиновые протеазы нет

ФМСФ 0,6 мМ трипсиновые/химотрилсиновые протеазы нет

антипаин 0,7 мМ сериновые/цистеиновые протеазы; нет

лейпептин 2,0 мМ сериновые/цистеиновые протеазы нет

zVAD(OMe).fmk 0,1 мМ каспазы, протеаза ЗС кардиовирусов нет

zVAD.fmk 0,1 мМ каспазы нет

DEVD.cho 0,1 мМ каспазы нет

YVAD.cho 0,1 мМ каспазы нет

МРСМК 0,5 мМ эластазы нет

пепстатин А 1 мМ кислые протеазы нет

Zn++ 2,5 мМ протеазы нет

Cd++ 1,0 мМ протеазы нет

стауроспорин 1,0 мкМ протеинкиназы да

росковитин 0,1 мМ циклин-зависимые протеинкинызы да

оломоуцин 1 мМ циклин-зависимые протеинкинызы да

генистеин 50 мкМ тирозиновые киназы нет

U0126 10 мкМ МЕК нет

SB202190 10 мкМ р38 МАРК нет

SP6000125 50 мкМ JNK-киназа нет

Myr-РКС ингибитор 20 мкм протеинкиназа С нет

DRB 0,7 мМ казеин-киназа 1 и 2 нет

ФМСФ, фенилметасульфонилфторид;

zVAD(OMe).fmk, М-бензилкарбонил-Уа1-А1а-А5р-(0-метап)- фторметилкетон;

zVAD.fmk, М-бензилкарбонил-Уа1-А1а-А5р-фторметилкетон;

DEVD.cho, Ы-ацетил-Азр-Ии-УаЬАзр-альдегид;

YVAD.cho, К-ацетил-Туг-Уа1-А1а-А5р-адьдегид;

МРСМК, Ы-(метоксисукцинил)-А1а-А1а-Рго-\'а1-хлорметилкетон;

МЕК и р38 МАРК, митоген-активируемые протеинкиназы;

Myr-РКС ингибитор, миристилированный пептидный ингибитор протеинкиназы С (туг-RFARKGALRQKNV);

DRB, 5,6-дихлорбензимидазол l-ß-D-рибофуранозид.

Рис. 6. Ингибиторы протеинкнназ предотвращают in vitro нарушение барьерных свойств ЯО, индуцированное кардиовирусами.

Экстракт инфицированных менговирусом клеток HeLa (100 БОЕ/кл, 4 ч п.и.) прединкубировали с ингибиторами протеинкнназ (20 мин., +4°С), после чего добавляли к препарату ядер HeLa-ЗЕ, полученному как описано выше, и инкубировали 1 ч при 37°С. Использовали краситель ДНК Hoechst 33258.

Т47Е (данные не приведены). Следовательно, протеинкиназы действуют не собственно на L-белок, а принимают участие в цепи событий, запускаемых L-белком.

Таким образом, существует фундаментальное различие в механизмах нарушения ЯЦТ разными группами пикорнавирусов: в отличие от полиовируса, который использует активность собственной протеазы 2А, кардиовирусы при участии L-белка действуют через клеточные протеинкиназы. Возможное участие циклин-зависимых киназ, чувствительных к росковитину и оломоуцину, представляется нам особенно интересным. Действительно, принято считать, что изменение барьерных функции ЯО в митозе связано с каскадом фосфорилирования различных субстратов (нуклеопоринов, ламинов и др.), запускаемых росковитин-чувствительной Cdkl (Macaulay et al, 1995; Collas et al., 1999; Onischenko et al., 2005).

4. Фосфорилирование компонента ядерной поры Nup62

В связи с выявленной ролью протеннкиназ в нарушении ЯЦТ, мы исследовали фосфорилирование белков ЯП при кардиовирусной инфекции.

Комплекс ЯП состоит из -30 различных белков, называемых нуклеопоринами (Nup), представленных в каждой поре во множественных копиях. Многие нуклеопорины модифицированы мономерами N-ацетилглюкозамина, которые специфически узнаются лектином из проростков пшеницы (WGA). При этом нуклеопорины - наиболее обильные WGA-связывающие белки ядра. Для изучения фосфорилирования белков ЯП мы исследовали включение [32Р]-ортофосфата в обогащенную нуклеопоринами WGA-связывающую фракцию белков. Оказалось, что при кардиовирусной инфекции значительно увеличивается фосфорилирование WGA-связывающего белка из мембранной фракции с подвижностью 60-70 кДа (Рис. 7А, стрелка), а также, в меньшей степени, белков с подвижностью -100, 150, 200 кДа (Рис. 7А).

Мы предположили, что белок с подвижностью 60-70 кДа соответствует нуклеопорину р62 (Nup62), который обладает такой же подвижностью в ПААГ и является наиболее обильным WGA-связывающим ядерным гликопротеином (Finlay et al., 1987; Holt et al., 1987). Фосфорилирование Nup62 мы подтвердили его иммунопреципитацией специфическими антителами (Рис. 7Б). Гиперфосфорилирование Nup62 выявляется на протяжении всего срока кардиовирусной инфекции (Рис. 7Б, стрелки).

Мы проанализировали немеченые экстракты клеток, инфицированных кардио- и энтеровирусами, методом Вестерн-блоггинга (Рис. 8А). В контрольных экстрактах Nup62 представлен мажорной полосой на уровне -60-70 кДа. При полиовирусной инфекции мажорная полоса Nup62 убывает, и появляются продукты деградации, что согласуется с ранее установленным протеолитическим расщеплением этого нуклеопорина (Güstin and Sarnow, 2001; Park et al., 2008). При кардиовирусной инфекции продукты деградации отсутствуют, зато

А. контроль Менго

4°С м Ц ~м и

кДа 170130100 -7255-

контроль Менго_ 4°С

0-2 Ч 2-4 ч 0-2 ч 2-4 ч _ 4-6 ч 2-4 ч

Р]

|\1ир62

/ / / *

Рис. 7. Изучение фосфорилироваиия нуклеопоринов методом [32Р]-мечения.

Контрольные и заражённые менговирусом (100 БОЕ/кл) 33~ клетки НеЬа-ЗЕ инкубировали 2 ч при 37°С

в бесфосфорной среде в присутствии [32Р]-ортофосфата (в течение 0-2, 2-4, 4-6 ч п.и.) Контроль на неспецифическую сорбцию метки - проба, которую инкубировали при 4°С. Из клеток получали тотальный экстракт белков. А. Тотальный экстракт (2 ч п.и.) разделяли на мембранную (.м) и цитоплазматическую (ц) фракции и обогащали ИсИАс-содержащими белками с помощью \¥ОА-агарозы (БШау е! а1., 1990). \¥ОА-связывающие белки подвергали электрофорезу в 12%-ном ПААГ с последующей радиоавтографией. Б. №р62 иммунопреципетировали из тотального экстракта [л2Р]-меченых клеток с помощью специфических моноклональных антител. Продукты иммунопреципитации разделяли в 8%-ном ПААГ и анализировали радиоавтографией (верхняя панель), а также методом Вестерн-блоттинг с использованием антител к Ыир62 для контроля количества материала в пробах (нижняя панель). В А. и Б. стрелками отмечено гиперфосфорилирование Ыир62.

Полио

(3-актан

щелочн.

ч» ЯПМ1 щш? тт тт «•»»

Р1

Ыир62

1Мир62

контроль

§ '

Менго

Рис. 8.Изучение фосфорнлнровання Nup62 с помощью специфических антител.

Клетки НеЬа заражали менговирусом и полиовирусом (100 БОЕ/кл). А. Тотальный экстракт разделяли в 8%-ном ПААГ; Вестерн-блоттинг с антителами к Ыир62. Фракция Ыир62 с замедленной электрофоретической подвижностью отмечена стрелкой. Б. Выявление модифицированных форм Ыир62 методом двумерного гель-электрофореза. Тотальный экстракт белков из контрольных и инфицированных менговирусом (4 ч п.и.) клеток НеЬа подвергали сначала изоэлектрофокусированию (в градиенте рН 2-10) , а затем электрофорезу в 6%-ном ПААГ; Вестерн-блоттинг с антителами к №др62. р! -изоэлектрическая точка.

выявляется фракция модифицированного Nup62 с пониженной электрофоретической подвижностью (Рис. 8А, стрелки). При обработке экстрактов щелочной фосфатазой данная фракция убывает, подтверждая, что наблюдаемая модификация Nup62 является фосфорилированием (данные не приведены). Метод двумерного электрофореза позволяет дополнительно охарактеризовать модифицированную фракцию Nup62 (Рис. 8Б): в контрольных экстрактах обнаруживается две основные формы Nup62, при кардиовирусной инфекции (4 ч п.и.) появляется 4-8 дополнительных пятен белка, которые, несомненно, представляют собой в разной степени фосфорилированные формы Nup62.

Фосфорилирование Nup62 по 4-8 сайтам при кардиовирусной инфекции представляется весьма интересным. Nup62 - один из ключевых компонентов ЯП: этот белок входит в состав 'комплекса Nup62\ который локализуется в центральном транспортном канале (Schwarz-Herion et al., 2007). Комплекс задействован в импорте белков, а также, предположительно, регулирует диаметр транспортного канала (Melcak et al., 2007). Известна индукция фосфорилирования Nup62 в здоровой клетке, в том числе гиперфосфоршшрование в митозе. Соответствующие сайты в Nup62 не идентифицированы, результаты опытов in vitro указывают на эффекторную роль МАР-киназы, GSK-За и РКА (Macaulay et al., 1995, Lu et al., 1998, Miller et al., 1999).

Заманчиво предположить, что фосфорилирование Nup62 (возможно, наряду с другими нуклеопоринами) нарушает селективный барьер в ЯП и является причиной изменения проницаемости ЯО для пассивной диффузии. Причём для этого достаточно модификации не всего пула Nup62, а только его фракции (Рис. 8А и Б).

4.1 Корреляция между нарушением транспорта и фосфорилированием Nup62

Чтобы установить причинно-следственную связь между нарушением ЯЦТ при кардиовирусной инфекции и гиперфосфорилированием Nup62, мы сопоставили разную способность мутантных менговирусов нарушать транспорт в клетках HeLa-ЗЕ (см. раздел 2.3) со способностью индуцировать фосфорилирование Nup62. Чтобы скомпенсировать разницу в эффективности размножения мутантов, клетки HeLa-ЗЕ заражали с множественностью 20 БОЕ/кл для вирусов wt, Т47Е и 100 БОЕ/кл для вирусов Т47А, Zn (Рис. 9Б). Нарушение ЯЦТ и фосфорилирование Nup62 в инфицированных клетках изучали на 4 и 6 ч п.и. (Рис. 9А и В). Менговирус Т47Е так же эффективно, как и вирус дикого типа, вызывает транслокацию 3><EGFP-NLS в цитоплазму, и на 4 ч п.и. индуцирует фосфорилирование значительной фракции Nup62. Менговирус Т47А индуцирует лишь незначительную модификацию Nup62 на поздних стадиях инфекции (6 ч п.и.), что коррелирует с его низкой эффективностью в нарушении транспорта. Фосфорилирование Nup62 в клетках, заражённых менговирусом Zn, детектировать данным методом не удаётся, что совпадает с его неспособностью вызывать выход маркерного белка из ядер заражённых клеток даже на поздних стадиях инфекции. Следовательно, способность кардиовирусов с мутациями в L-белке нарушать ЯЦТ коррелирует со способностью индуцировать

гиперфосфорилирование Nup62, что свидетельствует в пользу нашей гипотезы, согласно которой фосфорилирование компонентов ЯП (Nup62 и, возможно, других нуклеопоринов) -потенциальный механизм повышения проницаемости ЯО.

В последнее время опубликованы независимые данные о фосфорилировании Nup62, Nupl53, Nup214, Nup358 при инфекции ВЭМК (Porter and Palmenberg, 2009). Сообщается также о фосфорилировании Nup98 при инфекции вируса Тейлера (Ricour et al., 2009). Nup98 задействован в экспорте транскриптов, и его фосфорилирование может отчасти объяснить подавление активного экспорта мРНК из ядер при инфекции этим вирусом.

А.

Менго

wt

Т47Е

Т47А

Zn

Б.

2

• . -O • * k * - - - < : * ■0« * • », * - M

• • • » ê+' ■ ■ 'Л*. s # •• • *t Л • « » — ■ ■ 1 • • ' •• • ». •»

в.

Менго 4 ч -pî^ Менго 6 ч

¡Р* wt Т47Е Т47А Zn Т47Е Т47А Zn

га

8-1

Nup62

- wt 20 бое/кп T47E 20 6ое/кл T47A 100 бое/кп

- Zn 100 бое/кп р-аКТИН

•W li «*

mmÉ

16

20

24

время п.и., ч

Рис 9. Способность кардиовирусов с мутациями в Ь-белке нарушать ЯЦТ коррелирует с их способностью индуцировать фосфорилирование 1\ир62.

Клетка НеЬа-ЗЕ заражали менговирусами Т47Е (20 БОЕ/кл) и Т47А, Zn (100 БОЕ/кл). А. Релокализация ядерного маркёра через 4 и 6 ч п.и.; Б. Кривые роста вирусов; В. Тотальный 1 экстракт разделяли в 8%-ном ПААГ; Вестерн-блоттинг с антителами к 1\1ир62, ^ Гиперфосфорилирование 1Чир62 отмечено стрелками.

5. Влияние кардиовирусной инфекции на архитектуру ядерных пор

Известно, что фосфорилирование нуклеопоринов в результате активности митотических протеинкиназ приводит к разборке комплекса ЯП. Нашей следующей задачей было установить, сопровождается ли гиперфосфорилирование Nup62 (а также возможно других Nup) при кардиовирусной инфекции изменениями в архитектуре ЯП. Также интересно было сравнить влияние кардиовирусной инфекции на строение ЯП с ее разрушениями при инфекции полиовирусом (Belov et al., 2004; Park et al., 2008).

ЯП представляет собой сложноустроенный белковый комплекс (-125 МДа) с 8-лучевой симметрией, внешним диаметром - 100 им и высотой - 75 нм (Рис. 10). В комплексе выделяют центральный остов, заякоренный в ЯО, к которому крепятся периферические структуры -цитоплазматические филаменты и ядерная корзина. Центральный остов состоит из кольца спиц, ядерного и цитоплазматического кольца, которые окружают центральный транспортный канал поры. При некоторых способах фиксации в канале обнаруживается электронно-плотная гранула, называемая транспортёром (Рис. 10Б). Пока нет единого мнения, является ли транспортёр структурным компонентом ЯП или представляет собой субстрат, зафиксированный в момент транслокации через канал (Stoffler et aL, 2003; Beck et al., 2004). 5. 1 Электронная микроскопия ядерных пор

Мы изучили влияние кардио- и энтеровирусов на общую архитектуру ЯП методом электронной микроскопии (ЭМ) на препаратах пермеабилизованных клеток. Пермеабилизацию проводили Тритоном-ХЮО в буфере с высоким содержанием Mg2+, что способствует стабилизации белковых комплексов. Пермеабилизация позволяет наблюдать ЯП без мембранных компонентов и обеспечивает лучшее разрешение структур комплекса.

В контрольных препаратах клеток HeLa-ЗЕ можно различить все основные структуры комплекса (Рис. 11): на поперечных срезах виден электронно-плотный центральный остов поры (отмечен звёздочками), периферические структуры менее выражены. На тангенциальном сечении хорошо выражены 8 гранул центрального остова; в центральной части большинства ЯП обнаруживается транспортёр (Рис. 11Б и В).

В клетках, инфицированных полиовирусом, обнаруживаются нарушения архитектуры ЯП: центральный остов неразличим в большинстве ЯП. Кроме того, в центральной части большинства ЯП на тангенциальном сечении отсутствует транспортёр. Разрушение ЯП при полиовирусной инфекции согласуется с литературными данными (Belov et al., 2004) и отражает протеолитическую деградацию нуклеопоринов (Güstin and Sarnow, 2001; Park et al., 2008).

Препараты инфицированных кардиовирусами клеток в большей степени напоминают контрольные препараты: на поперечных сечениях центральный остов имеет типичное строение, на тангенциальных сечениях видны характерные 8 гранул кольца спиц и интактный транспортёр.

Рис. 10. Схема строения комплекса ядерной поры

А. Поперечное сечение; Б. Вид в плане (срез в плоскости кольца спиц). ЯО - ядерная оболочка; ЦО - центральный остов; ЦК и ЯК -цитоплазматическое и ядерное кольцо; ЦФ - цитоплазматические филаменты; Т - транспортёр.

Результаты исследований методом ЭМ позволяют заключить, что в отличие от энтеровирусной инфекции, кардиовирусы не нарушают существенно архитектуру ЯП.

контроль

Менго

«V f 7'* *

Полно

v

цит

ч;- % г ш - пм жж • . v

jr.»-

■iw4. ,

r I"

I • ¥ 1>3> £

НЩКнЯв х» *

ж 4

Р ^

Рис. 11. Изучение ядерных пор при кардио- и энтеровирусной инфекции методом электронной микроскопии.

Клетки НеЬа-ЗЕ заражали менговирусом и полиовирусом (100 БОЕ/кл); через 4 ч п.и. клетки пермеабилизовали Тритоном Х-100 в присутствии 3 мМ М§2+, препараты фиксировали. А. Поперечные сечения ядра; обозначены ядерный и цитоплазматический компартменты, области ЯП отмечены звёздочками; Б. Вид ядра в плане (тангенциальные сечения); В. Увеличенный вид ЯП в плане. Шкала размеров соответствует 200 нм.

5.2 Локализация некоторых нуклеопоринов

Характерной особенностью ряда нуклеопоринов является наличие фенилаланин-глициновых (FG) повторов, которые образуют неструктурированные FG-домены. FG-домены играют ключевую роль в создании селективного барьера ЯП для транспорта субстратов. Выход FG-содержащих нуклеопоринов из состава ЯП может нарушать селективный барьер и повышать проницаемость ЯО для пассивной диффузии (Patel et al., 2007). Методом иммунофлуоресцентного анализа мы изучили локализации некоторых FG-содержащих нуклеопоринов при кардио- и энтеровирусной инфекции. Для этого использовали антитела тАЬ414, узнающие консенсус FXFG в нуклеопоринах транспортного канала (Nup62), ядерной корзины (Nupl53) и цитоплазматических филаментов (Nup214, Nup358). Мы использовали также специфические антитела к белкам Nup62 и Nupl53, которые подвергаются деградации при полиовирусной инфекции (Güstin and Sarnow, 2001; Parketal., 2008).

Антитела к FG-содержащим нуклеопоринам окрашивают область ЯО контрольных клеток, что отражает локализацию нуклеопоринов в комплексах ЯП (Рис. 12Б). В клетках,

инфицированных полиовирусом, наблюдается значительное ослабление сигнала от антител к РО-повторам и к Мир153, что согласуется с деградацией ЯП при этой инфекции. Однако антитела к 1Мир62 свидетельствуют, что этот нуклеопорин сохраняет свою локализацию в ЯО, несмотря на деградацию. Это противоречие можно объяснить удержанием фрагментов Ыир62 в составе ЯП благодаря белок-белковым взаимодействиям внутри 'комплекса Мир62\ При кардиовирусной инфекции картина окрашивания всеми тремя антителами мало отличается от контроля, что свидетельствует о сохранении локализации изучаемых Рв-содержащих нуклеопоринов

Рис. 12. Локализация некоторых FG-содержащих нуклеопоринов при кардио-и энтеровирусной инфекции.

Клетки HeLa-ЗЕ заражали менго- и полиовирусом (50 БОЕ/кл) и фиксировали через 4 и 6 ч п.и. А. Изучали локализацию флуоресцентного маркёра 3xEGFP-NLS. Краситель ДНК Hoechst 33342.

Б. Анализировали методом иммунофлуоресценции с использованием антител, специфичных к FG-повторам (шАЬ414), Nupl53 и Nup62.

Основываясь на данных ЭМ и иммунофлуоресценции, можно заключить, что повышение проницаемости ЯО для пассивной диффузии при кардиовирусной инфекции не сопровождается существенным разрушением центрального остова ЯП, а РО-содержащие белки сохраняют локализацию в составе комплекса. Наблюдаемая картина принципиально отличается от описанной ранее для полиовирусной инфекции.

6. Изучение повышения проницаемости ядерной оболочки в профазе митоза

Кардиовирусы задействуют клеточные ферменты (протеинкиназы), следовательно, используют существующие в клетке механизмы для повышения проницаемости ЯО. Как упоминалось выше, в клетке такие механизмы существуют: росковитин-чувствительная проитеинкиназа Сёк1 запускает митотический распад ядра, который начинается с повышения проницаемости ЯП и

сопровождается фосфорилированием различных компонентов ЯО, в том числе нуклеопоринов (Раугеаи й а1., 1996; Мошпатеп й а1., 2006; 01ауу й а1., 2007; ОерЬоиге й а!., 2008). Заманчиво было предположить, что кардиовирусы используют часть митотической программы для повышения проницаемости ЯО путём фосфорилирования некоторых её компонентов, но без существенной разборки ЯП. Мы обратились к изучению проницаемости ЯО и локализации отдельных нуклеопоринов на ранних стадиях митоза, чтобы выяснить, реализуется ли в здоровой клетке ситуация, наблюдаемая при кардиовирусной инфекции.

Локализацию отдельных компонентов ЯП в профазных клетках изучали, как и в случае кардиовирусной инфекции, с помощью антител шАЬ414 к ИО-повторам, наряду со А. тАЬ414 ЗкЕвРР-МЬв ДНК

профаза I

профаза

про-

метафаза

метафаза

Б. Nup153 3*EGFP-NLS ДНК

профаза 1 - : > ~ * ь % ¥ м

профаза II А / /

про- метафаза И щ в

метафаза ✓

Рис. 13. Проницаемость ЯО и локализация некоторых FG-содержащих нуклеопоринов на ранних стадиях митоза. Культуру HeLa-ЗЕ обогащали митотическими клетками путём синхронизации двойным тимидиновым блоком. Стадию митоза определяли в индивидуальной клетке по степени конденсации хроматина (краситель ДНК Hoechst 33342). В клетках на ранних стадиях митоза изучали локализацию 3XEGFP-NLS, а также некоторых нуклеопоринов методом иммунофлуоресценции с помощью антител, специфичных к: А. FG-повторам (тАЬ414), Б. Nupl53 и В. Nup62. Стрелками отмечены клетки на стадии митоза, когда уже изменяется проницаемости ЯО для 3*EGFP-NLS, а изучаемые нуклеопорины ещё сохраняют локализацию в составе ЯП.

В. Nup62 3»EGFP-NLS ДНК

Q а в

ш ML 13

■ ki Б

т 1 %' ъ 1 1 §

специфическими антителами к №ф153 и 1Мцр62. Как показано на рис. 13, в течение ранней профазы (профаза I) БС-содержащие нуклеопорины (в т.ч. Мир 153 и №ф62) сохраняют локализацию в составе ЯП. Более поздние стадии профазы (профаза II) характеризуются повышением проницаемости ЯО, что сопровождается выходом маркерного белка ЗхЕСБР-ЫЬЗ в цитоплазму, при этом значительная фракция изучаемых нуклеопоринов сохраняет связь с ЯО (Рис. 13, отмечено стрелками). В прометафазе происходит распад ЯО, что выражается в частичном или полном распределении нуклеопоринов по всей клетке, которое также сохраняется в течение метафазы.

Следовательно, есть митотическая стадия, которая напоминает ситуацию при кардиовирусной инфекции: проницаемость ЯО для пассивной диффузии повышается без существенной разборки ЯП, в частности, значительная часть Рв-содержащих нуклеопоринов (например, 1Чир153, Ыир62) сохраняют локализацию в составе комплекса поры.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что кардиовирусы нарушают ядерно-цитоплазматический обмен клетки: инфекция сопровождается нарушением барьерных свойств ядерной оболочки и перераспределением макромолекул между ядром и цитоплазмой.

2. Установлено, что ключевую роль в нарушении барьерных свойств ядерной оболочки играет лидерный (Ь) белок кардиовирусов. Выявлены участки Ь-белка, важные для выполнения данной функции (мотив гп-пальца и сайт фосфорилирования).

3. Подавление активности клеточных росковитин- и оломоуцин-чувствительных протеинкиназ нарушает способность кардиовирусов изменять проницаемость ядерной оболочки.

4. Установлена взаимосвязь между нарушением кардиовирусами ядерно-цитоплазматического транспорта и гиперфосфорилированием белка транспортного канала ядерной поры №ф62.

5. Охарактеризовано влияние кардиовирусов на ядерную пору: при инфекции не происходит существенных изменений набора Рв-содержащих нуклеопоринов и разрушения общей архитектуры комплекса поры.

6. Обнаружено сходство между нарушением барьерных свойств ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции и в ранней профазе митоза.

7. Предложен гипотетический сценарий нарушения ядерно-цитоплазматического транспорта кардиовирусами: вирусный Ь-белок активирует клеточные протеинкиназы, фосфорилирующие нуклеопорины; ядерные поры при этом не разрушаются, но повышается их проницаемость для пассивной диффузии макромолекул.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность моему научному руководителю, профессору В.И. Аголу за возможность пройти настоящую научную школу. Я глубоко признательна П.В. Лидскому за предложенную тему работы, неоценимую помощь в проведении экспериментов, а также постоянную поддержку и участие. Все исследования выполнены в тесном сотрудничестве с Е.В. Шевалём, В.Ю. Поляковым, Ф. ван Куппевелдом. Также я хочу поблагодарить за содействие при выполнении работы А.П. Гмыля, Е.В. Хитрину, Т.М. Дмитриеву, С.А. Коршенко, Е.В. Белоусова, М.С. Колесникову, и остальных сотрудников лаборатории за создание дружелюбной рабочей атмосферы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., Fominykh K.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. (2009) Mengovirus-induced rearrangement of the nuclear pore complex: hijacking cellular phosphorylation machinery. J. Virol. 83,3150-3161.

2. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., Aminev A.G., Palmenberg A.C., Sheval E.V., Polyakov V.Y., van Kuppeveld F.J., Agol V.I. (2006) Nucleocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses. J. Virol. 80,2705-2717.

3. Лидский П.В. и Бардина М.В. (2006) Ядро клетки при пикорнавирусной инфекции. Медицинская вирусология 23,194-204.

4. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval Y.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. (2008) Further characterization of mechanisms of nucleocytoplasmic transport disorder induced by cardioviruses: a key role of nucleoporin phosphorylation? XV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Sitges Barcelona, Spain, 26-30 May. P28.

5. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. (2008) Mechanisms of nucleocytoplasmic transport disorder induced by cardioviruses. First International Summer School "Pathogen-Host Interplay", Berlin-Potsdam, Germany, 20-27 July. p. 73.

6. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., Fominykh K.V., Lindberg A.M., Kurinnov V.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. (2006) Picornaviruses differently affect nuclear envelope: evidences for mitotic kinase(s) involvement in cardiovirus-induced nuclear pore complex disorganization. XIV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, SaariselkS, Inari, Finland, 26 Nov.-l Dec. D17.

7. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., Aminev A.G., Palmenberg A.C., van Kuppeveld F.J., Agol V.I. (2005) Nucleocytoplasmic transport disorder induced by cardioviruses. XIII Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Lunteren, The Netherlands, 23-29 May. G09.

Заказ №122/05/09 Подписано в печать 22.05.2009 Тираж 70 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бардина, Марьяна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Система ядерно-цитоплазматического транспорта.

2.1.1 Компоненты ядерной оболочки.

2.1.2 Активный ядерно-цитоплазматический транспорт.

2.1.3 Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта.'.

2.1.4 Динамика ядерной оболочки в клеточном цикле.

2.1.5 Ядерно-цитоплазматический транспорт и апоптоз.

2.2 Ядерно-цитоплазматический транспорт при вирусных инфекциях.

2.2.1 Преодоление барьера ядерной оболочки вирусами.

2.2.2 Взаимодействие цитоплазматических вирусов с системой транспорта.

2.3 Влияние пикорнавирусов на ядерно цитоплазматический транспорт.

2.3.1 Краткая характеристика семейства Picornaviridae.

2.3.2 Некоторые аспекты взаимодействия пикорнавирусов с клеткой.

2.3.3 Нарушение ядерно-цитоплазматического обмена при инфекции некоторыми ппкорнавирусами.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.1.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Методы работы с культурами эукариотических клеток.

4.1.1 Клеточные линии.1.

4.1.2 Культивирование клеток.

4.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами.

4.2.1 Плазмиды.

4.2.2 Создание конструкции pE-luc-ДЬ и методы молекулярного клонирования.

4.3 Методы работы с вирусами и вирусными конструкциями.

4.3.1 Штаммы вирусов.

4.3.2 Размножение вирусов.

4.3.3 Определение титра вирусной суспензии.

4.3.4 Заражение монослоя клеток вирусами.

4.3.5 Получение рекомбинантных вирусов.

4.3.6 Выделение вирионной РНК.

4.4 Экспериментальные подходы для изучения ядерно-цитоплазматического обмена и проницаемости ядерной оболочки.

4.4.1 Изучение локализации флуоресцентных маркёров.

4.4.2 Изучение проницаемости ЯО препарата ядер.

4.5 Изучение фосфорилирования белков ядерной поры.

4.6 Анализ белкового состава ядерных пор методом иммунофлуоресценции.

4.7 Исследование ядерных пор методом электронной микроскопии.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Изучение влияния кардиовирусной инфекции на ядерно-цитоплазматический транспорт.

5 .1.1 Релокализация ядерных белков в цитоплазму.

5.1.2 Причины накопления ядерных белков в цитоплазме.

5.1.3 Релокализация цитоплазматических белков в ядро.

5.2 Поиск вирусных продуктов, отвечающих за нарушения транспорта.

5.2.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки, индуцированное экстрактом заражённых клеток.

5.2.1 Роль кардиовирусных белков в нарушении транспорта.

5.2.2 Роль доменов лидерного белка в нарушении транспорта.

5.3 Поиск ферментативных активностей, участвующих в нарушении транспорта.

5.3.1 Роль протеаз в нарушении транспорта.

5.3.2 Роль протеинкиназ и фосфатаз в нарушении транспорта.

5.4 Изучение модификаций компонентов транспортной системы.

5.4.1 Фосфорилирование белков ядерных пор.

5.4.2 Исследование взаимосвязи между нарушением транспорта и гиперфосфорилированием Nup62.

5.5 Влияние кардиовирусной инфекции на состав и архитектуру ядерных пор.

5.5.1 Анализ набораFG-содержащих нуклеопоринов в ядерных порах.

5.5.2 Электронная микроскопия ядерных пор.

5.6 Изучение изменения проницаемости ядерной оболочки в митозе.

5.6.1 Анализ белкового состава ядерных пор на ранних стадиях митоза.

5.6.2 Митотического фосфорилирование нуклеопорина Nup62.

6. ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами.

6.2 Ключевая роль лидерного белка кардиовирусов в нарушении транспорта.

6.3 Участие клеточных протеинкиназ в нарушении транспорта.

6.4 Фосфорилирование нуклеопоринов — предполагаемый механизм нарушения барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами.

6.5 Сохранение состава и общей архитектуры ядерных пор при инфекции.

6.6 Сходство между нарушением барьерных свойств ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции и на ранних стадиях митоза.

6.7 Механизм изменения проницаемости ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции (гипотеза).

7. ВЫВОДЫ.

8. БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль лидерного белка в нарушении ядерно-цитоплазматического транспорта клетки при кардиовирусной инфекции"

Взаимодействие вирусов с клеткой - одна из наиболее увлекательных проблем вирусологии. Вирусы являются доклеточными формами жизни, которые используют клеточные энергетические ресурсы для репликации собственной нуклеиновой кислоты. Кодируя ограниченный набор генов, вирусы выработали изощрённые стратегии для поражения клеток и ловко подстраивают функционирование клеточных систем для собственных нужд. Клетки-хозяева, в свою очередь, приобрели противовирусные программы, призванные уничтожать чужеродную нуклеиновую кислоту и защищать клетку от вторжения патогенов. Борьба «вирус-клетка» длится со времён обособления данных форм жизни и обеспечивает их ко-эволюцию; следить за развитием этой борьбы -интригующая и зачастую жизненно-важная для всего человечества задача учёных-вирусологов.

Настоящая работа посвящена одному из аспектов взаимодействия с клеткой цитоплазматических РНК-содержащих вирусов семейства Picornaviridae, а именно нарушению ядерно-цитоплазматического транспорта при инфекции. Система транспорта обеспечивает обмен макромолекул между ядром и цитоплазмой через белковые комплексы ядерных пор, пронизывающие ядерную оболочку. Цикл репродукции пикорнавирусов протекает в цитоплазме, и, на первый взгляд, данная группа вирусов не нуждается во взаимодействии с клеточной системой транспорта. Около 10 лет назад было сделано открытие, показавшее, что полиовирус (наиболее хорошо изученный и печально известный представитель семейства) нарушает обмен макромолекул между ядром и цитоплазмой (Belov et al., 2000). За последние годы исследователи значительно продвинулись в понимании механизмов нарушения транспорта полиовирусом: ключевую роль играет вирусная протеаза 2А, которая расщепляет белки ядерной поры и, тем самым, нарушает барьерные свойства ядерной оболочки (Gustin and Sarnow, 2001; Belov et al.

2004; Park et al., 2008). Тем не менее, на многие вопросы до сих пор нет ответа. Например, каково биологическое значение нарушения ядерного транспорта для пикорнавирусов? Является ли взаимодействие с транспортной системой абсолютно необходимым или предпочтительным условием репликации полиовируса? Уникально ли данное свойство для полиовируса или консервативно для всех представителей семейства?

В поисках ответов на некоторые из этих вопросов, в настоящей диссертационной работе нами было продолжено исследование влияния Picornaviridae на клеточный транспорт. В качестве объекта исследований мы выбрали группу Cardiovirus, у представителей которой белок 2А лишён протеолитической активности, чем данная группа и представляла для нас особый интерес. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из обзора литературы, экспериментальной части, а также списка литературы. В разделе 2.1 обзора литературы кратко сформулированы современные представления о механизмах функционирования и регуляции ядерно-цитоплазматического обмена. В следующем разделе (2.2) приведены примеры разносторонних взаимодействий ряда вирусов с системой ядерно-цитоплазматического транспорта. В разделе 2.3 изложена краткая характеристика семейства Picornaviridae, особое внимание уделено известным данным о нарушении клеточного транспорта при инфекции некоторыми пикорнавирусами. Экспериментальная часть состоит из разделов «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение» и включает описание основных результатов, полученных в данной диссертационной работе, а также их интерпретацию.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Бардина, Марьяна Владимировна

7. ВЫВОДЫ

1. Показано, что кардиовирусы нарушают ядерно-цитоплазматический обмен клетки: инфекция сопровождается нарушением барьерных свойств ядерной оболочки и перераспределением макромолекул между ядром и цитоплазмой.

2. Установлено, что ключевую роль в нарушении барьерных свойств ядерной оболочки играет лидерный (L) белок кардиовирусов. Выявлены участки L-белка, важные для выполнения данной функции (мотив Zn-пальца и сайт фосфорилирования). ♦

3. Подавление активности клеточных росковитин- и оломоуцин-чувствительных протеинкиназ нарушает способность кардиовирусов изменять проницаемость ядерной оболочки.

4. Установлена взаимосвязь между нарушением кардиовирусами ядерно-цитоплазматического транспорта и гиперфосфорилированием белка транспортного канала ядерной поры Nup62.

5. Охарактеризовано влияние кардиовирусов на ядерную пору: при инфекции не происходит существенных изменений набора FG-содержащих нуклеопоринов и * разрушения общей архитектуры комплекса поры.

6. Обнаружено сходство между нарушением барьерных свойств ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции и в профазе митоза.

7. Предложен гипотетический сценарий нарушения ядсрпо-цитоплазматического транспорта кардиовирусами: вирусный L-белок активирует клеточные протеинкиназы, фосфорилирующие нуклеопорины; ядерные поры при этом не разрушаются, но повышается их проницаемость для пассивной диффузии макромолекул.

8. БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность моему научному руководителю, профессору В.И. Аголу за возможность пройти настоящую научную школу, интересное и плодотворное обсуждение результатов, воспитание во мне критического подхода к научной деятельности, возможность участвовать в международных конференциях. Я глубоко признательна П.В. Лидскому за предложенную увлекательную тему работы, неоценимую помощь в проведении всех экспериментов (особенно двумерного гель-электрофореза и изучения митотических клеток), а также постоянную поддержку, участие и вдохновение меня на дальнейшую научную деятельность. Я благодарна Е.В. Шевалю и В.Ю. Полякову (НИИФХБ им. А. Н. Белозерского), в тесном сотрудничестве с которыми проводились исследования с использованием методов ЭМ и ИФ. Изучение менговирусов с мутациями в L-белке было выполнено при содействии Ф. ван Куппевелда (Department of Medical Microbiology, Radboud University Nijmegen Medical Centre, NCMLS, Nijmegen, The Netherlands). Я благодарна T.M. Дмитриевой (НИИФХБ им. А. Н. Белозерского) за помощь в размножении менговирусов в клетках асцитной карциномы и советы по методике [32Р]-мечения. Я хочу отметить участие при выполнении работы сотрудников лаборатории биохимии ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН: особенно хочу выделить вклад А.П. Гмыля, проводившего консультации по многим методическим и теоретическим вопросам, и поблагодарить Е.В. Хитрину за обучение методике трансляции РНК in vitro, С.А. Коршенко и Е.В. Белоусова за помощь при проведении очистки транскриптов в градиенте плотности сахарозы, М.С. Колесникову за консультации по вопросам культивации линий эукариотических клеток и титрования вирусов, С.Е. Соцкову содействие в решении многих административных вопросов. Я также благодарна всему коллективу сотрудников лаборатории за создание дружелюбной рабочей атмосферы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бардина, Марьяна Владимировна, Москва

1. Лидский П.В., Агол В.И. (2006) Как полиовирус изменяет клетку. Вопр. вир. 1,4-11.

2. Adam S.A., Marr R.S., Gerace L. (1990) Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol III, 807-816.

3. Agol V.I., Belov G.A., Bienz K., Egger D., Kolesnikova M.S., Romanova L.I., Sladkova L.V., Tolskaya E.A. (2000) Competing death programs in poliovirus-infected cells: commitment switch in the middle of the infectious cycle. J. Virol.lA, 5534 -5541.

4. Agol V.I. (2002) Picornavirus genome: an overview. In Molecular Biology of Picornaviruses. Semler B.L. and Wimmer E., editors. ASM Press, Washington, D.C. 127148.

5. Alvisi G., Rawlinson S.M., Ghildyal R., Ripalti A., Jans D.A. (2008) Regulated nucleocytoplasmic trafficking of viral gene products: a therapeutic target? Biochim. Biophys. Acta. 1784, 213-227. I

6. Aminev A.G., Amineva S.P., Palmenberg A.C. (2003a) Encephalomyocarditis viral protein 2A localizes to nucleoli and inhibits cap-dependent mRNA translation. Virus Res. 95, 45-57.

7. Aminev A.G., Amineva S.P., Palmenberg A.C. (2003b) Encephalomyocarditis virus (EMCV) proteins 2A and 3BCD localize to nuclei and inhibit cellular mRNA transcription but not rRNAtranscription. Virus Res. 95, 59-73.

8. Antonin W., Ellenberg J., Dultz E. (2008) Nuclear pore complex assembly through the cell cycle: regulation and membrane organization. FEBS Lett. 582, 2004-2016.

9. Bach S., Knockaert M., Reinhardt J., Lozach O., Schmitt S., Baratte В., Koken M., Coburn S.P., Tang L., Jiang Т., et al. (2005) Roscovitine targets, protein kinases and pyridoxal kinase. J. Biol. Chem. 280, 31208-31219.

10. Back S.H., Kim Y.K., Kim W.J., Cho S„ Oh H.R., Kim J.E., Jang S.K. (2002) Translation t of polioviral mRNA is inhibited by cleavage of polypyrimidine tract-binding proteins executed by polioviral 3Cpro. J. Virol.16, 2529- 2542.

11. Ball J.R., Ullman K.S. (2005) Versatility at the nuclear pore complex: lessons learned from the nucleoporin Nupl53. Chromosoma 114, 319-330.

12. Beck M., Forster F., Ecke M., Plitzko J.M., Melchior F., Gerisch G., Baumeister W., Medalia O. (2004) Nuclear pore complex structure and dynamics revealed by cryoelectron tomography. Science 306, 1387-1390.

13. Beck M., Lucic V., Forster F., Baumeister W., Medalia O. (2007) Snapshots of nuclear pore complexes in action captured by cryo-electron tomography. Nature 449, 611-615.

14. Belov G.A., Evstafieva A.G., Rubtsov Y.P., Mikitas O.V., Vartapetian A.B., Agol V.I. (2000) Early alteration of nucleocytoplasmic traffic induced by some RNA viruses. Virology 275, 244-248.

15. Belov G.A., Romanova L.I., Tolskaya E.A., Kolesnikova M.S., Lazebnik Y.A., Agol V.I.2003) The major apoptotic pathway activated and suppressed by poliovirus. J. Virol. 77, 45-56.

16. Belov G.A., Lidsky P.V., Mikitas O.V., Egger D., Lukyanov K.A., Bienz K., Agol V.I.2004) Bidirectional increase in permeability of nuclear envelope upon poliovirus infection and accompaying alterations of nuclear pores. J Virol. 78, 10166-10177.

17. Belov G.A., Fogg M.H., Ehrenfeld E. (2005) Poliovirus proteins induce membrane association of GTPase ADP-ribosylation factor. J. Virol. 79, 7207-7216.

18. Belov G.A., Altan-Bonnet N., Kovtunovych G., Jackson C.L., Lippincott-Schwartz J., Ehrenfeld E. (2007) Hijacking components of the cellular secretory pathway for replication of poliovirus RNA. J. Virol. 81, 558-567.

19. Ben-Efraim I., Gerace L. (2001) Gradient of increasing affinity of importing beta for nucleoporins along the pathway of nuclear import. J. Cell. Biol. 152:411-417.

20. Best S.M., Bloom M.E. (2004) Caspase activation during virus infection: more than just the kiss of death? Virology 320, 191-194.

21. Bodoor K., Shaikh S., Salina D., Raharjo W.H., Bastos R„ Lohka M., Burke B. (1999) Sequential recruitment of NPC proteins to the nuclear periphery at the end of mitosis. J. Cell Sci. 112,2253-2264.

22. Brunner J.E., Nguyen J.H., Roehl H.H., Ho T.V., Swiderek K.M., Semler B.L. (2005) Functional interaction of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein С with poliovirus RNA synthesis initiation complexes. J. Virol. 79, 3254-3266.

23. Buendia В., Santa-Maria A., Courvalin J.C. (1999) Caspase-dependent proteolysis of < integral and peripheral proteins of nuclear membranes and nuclear pore complex proteins during apoptosis. J. Cell. Sci. 112, 1743-1753.

24. Carrasco L., Guinea R., Irurzun A., Barco A. (2002) Effects of Viral Replication on Cellular Membrane Metabolism and Function. In Molecular Biology of Picornaviruses. B.L.Semler and E.Wimmer, editors. ASM Press, Washington, D.C. 337-354.

25. Chen H.H., Kong W.P., Roos R.P. (1995) The leader peptide of Theiler's murine encephalomyelitis virus is a zinc-binding protein. J. Virol. 73, 9891-9898.

26. Chen Z., Li Y., Krug R.M. (1999) Influenza A virus NS1 protein targets poly(A)-binding protein II of the cellular З'-end processing machinery. EMBO J. 18, 2273-2283.

27. Clarke P.R., Klebe C., Wittinhofer A., Karsenti E. (1995) Regulation of Cdc2/cyclin В activation by Ran, a Ras-related GTPase. J. Cell Sci. 108, 1217-1225.

28. Collas P. (1999) Sequential PKC- and Cdc2-mediated phosphorylation events elicit zebrafish nuclear envelope disassembly. J. Cell Sci. 112, 977-987.

29. Comer F.I., Hart G.W. (2001) Reciprocity between O-GlcNAc and O-phosphate on the carboxyl terminal domain of RNA polymerase II. Biochemistry AO, 7845-7852.

30. Cornilescu C.C., Porter F.W., Zhao K.Q., Palmenberg A.C., Markley J.L. (2008) NMR structure of the mengovirus Leader protein zinc-finger domain. FEBS Lett. 582, 896-900.

31. Cros J.F., Palese P. (2003) Trafficking of viral genomic RNA into and out of the nucleus: influenza, Thogoto and Borna disease viruses. Virus Res. 95, 3-12.

32. Cronshaw J.M., Krutchinsky A.N., Zhang W., Chait B.T., Matunis M.J. (2002) Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. J. Cell Biol. 158, 915-927.

33. Cullen B.R. (2003) Nuclear mRNA export: insights from virology. Trends Biochern. Sci. 28, 419-424.

34. Daigle N., Beaudouin J., Hartnell L., Imreh G., Hallberg E., Lippincott-Schwartz J., Ellenberg J. (2001) Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells. J. Cell Biol. 154, 71-84.

35. D'Angelo M.A., Anderson D.J., Richard E., Hetzer M.W. (2006) Nuclear pores form de novo from both sides of the nuclear envelope. Science 312, 440-443.

36. Davis L.I., Blobel G. (1986) Identification and characterization of a nuclear pore complex protein. Cell 45, 699-709.

37. Davis L.I., Blobel G. (1987) Nuclear pore complex contains a family of glycoproteins that includes p62: glycosylation through a previously unidentified cellular pathway. PNAS USA 84, 7552-7556.

38. Delhaye S., Van P., Michiels T. (2004) The leader protein of Theiler's virus interferes with nucleocytoplasmic trafficking of cellular proteins. J. Virol. 78, 4357-4362.

39. Denning D.P., Patel S.S., Uversky V., Fink A.L., Rexach M. (2003) Disorder in the nuclear pore complex: the FG repeat regions of nucleoporins are natively unfolded. PNAS USA 100, 2450-2455.

40. Dephoure N., Zhou C., Villen J., Beausoleil S.A., Bakalarski C.E., Elledge S.J., Gygi S.P. (2008) A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. PNAS USA 105, 10762-10767.

41. Deszcz L., Seipelt J., Vassilieva E., Roetzer A., Kuechler E. (2004) Antiviral activity of caspase inhibitors: effect on picornaviral 2A proteinase. FEBS Lett. 560, 51-55.

42. Doedens J.R., Giddings Т.Н., Kirkegaard K. (1997) Inhibition of endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus protein ЗА: genetic and ultrastructural analysis. J. Virol. 71, 9054-9064.

43. Dulz E., Zanin E., Wurzenberger C., Braun M., Rabut G,. Sironi L„ Ellenberg J. (2008) Systematic kinetic analysis of mitotic dis- and reassembly of the nuclear pore in living cells. J. Cell Biol. 180,857-865.

44. Duke G.M., Palmenberg A.C. (1989) Cloning and synthesis of infectious cardiovirus RNAs containing short, discrete poly(C) tracts. J. Virol. 63, 1822-1826.

45. Egger D., Gosert R., Binz K. (2002) Role of cellular structures in viral RNA replication. In Molecular Biology' of Picornaviruses. B.L.Semler and E.Wimmer, editors. ASM Press, Washington, D.C. 247-253.

46. Engelsma D., Valle N. Fish A., Saloir^ N. Almendral J.M., Fornerod M. 2008. A supraphysiological nuclear export signal is required for parvovirus nuclear export. Mol. Biol. Cell 19, 2544-2552.

47. Enninga J., Levy D.E., Blobel G., Fontoura B.M. (2002) Role of nucleoporin induction in releasing an mRNA nuclear export block. Science 295, 1523-1525.

48. Faleiro L., Lazebnik Y. (2000) Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J. Cell. Biol. 151,951-959.

49. Favreau C., Worman H.J., Wozniak R.W., Frappier Т., Courvalin J.C. (1996) Cell cycle-dependent phosphorylation of nucleoporins and nuclear pore membrane protein Gp210. Biochemistry 35, 8035-8044.

50. Ferrari S. 2006. Protein kinases controlling the onset of mitosis. Cell. Mol. Life Sci. 63:781795.

51. Finlay D.R., Forbes D.J. (1990) Reconstitution of biochemically altered nuclear pores: transport can be eliminated and restored. Cell 60, 17-29.

52. Finlay D.R., Meier E., Bradley P., Horecka J., Forbes D.J. (1991) A complex of nuclear pore proteins required for pore function. J. Cell. Biol. 114, 169-183.

53. Frey S., Richter R.P., Gorlich D. (2006) FG-rich repeats of nuclear pore proteins form a three-dimensional meshwork with hydrogel-like properties. Science 314, 815-817.

54. Gingras A.C., Svitkin Y., Belsham G.J., Pause A., Sonenberg N. (1996) Activation of the translational suppressor 4E-BP1 following infection with encephalomyocarditis virus and poliovirus. PNAS USA. 93, 5578-5583.

55. Glavy J.S., Krutchinsky A.N., Cristea Г.М., Berke 1.С., Boehmer Т., Blobel G., Chait B.T. (2007) Cell-cycle-dependent phosphorylation of the nuclear pore Nup 107-160 subcomplex. PNAS USA 104,3811-3816.

56. Gorlich D., Seewald M.J., Ribbeck K. (2003) Characterization of Ran-driven cargo transport and the RanGTPase system by kinetic measurements and computer simulation. EMBOJ. 22, 1088-1100.

57. Gustin K.E., Sarnow P. (2001) Effects of poliovirus infection on nucleo-cytoplasmic trafficking and nuclear pore complex composition. EMBO J. 20, 240-249.

58. Gustin K.E., Sarnow P. (2002) Inhibition of nuclear import and alteration of nuclear pore complex composition by rhinovirus. J. Virol. 16, 8787-8796. '

59. Gustin K.E. (2003) Inhibition of nucleo-cytoplasmic trafficking by RNA viruses: targeting the nuclear pore complex. Virus Res. 95, 35-44.

60. Hahn H. Palmenberg A.C. (1995) Encephalomyocarditis viruses with short poly(C) tracts are more virulent than their mengovirus counterparts. J. Virol.69, 2697- 2699.

61. Harel A., Forbes D.J. (2001) Wellcome to the nucleus: can I take your coat? Nature Cell Biol. 3, E267-E269.

62. Hiscox J.A. (2003) The interaction of animal cytoplasmic RNA viruses with the nucleus to facilitate replication. Virus Res. 95, 13-22.

63. Hofemeister H., O'Hare P. (2008) Nuclear pore composition and gating in herpes simplex virus-infected cells. J. Virol. 82, 8392-8399.

64. Hoffman M.A., Palmenberg A.C. (1996) Revertant analysis of J-K mutations in the encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site detects an altered leader protein. J. Virol. 70, 6425-6430.

65. Holt G.D., Snow C.M., Senior A., Haltiwanger R.S., Gerace L., Hart G.W. (1987) Nuclear pore complex glycoproteins contain cytoplasmically disposed O-linked N-acetylglucosamine. J. Cell Biol. 104, 1157-1164.

66. Hu Т., Guan Т., Gerace L. (1996) Molecular and functional characterization of the p62 complex, an assembly of nuclear pore complex glycoproteins. J. Cell. Biol. 134, 589-601.

67. Jackson W.T., Giddings T.H.Jr., Taylor M.P., Mulinyawe S., Rabinovitch M., Kopito R.R., Kirkegaard K. (2005) Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS Biol. 3, 861-871.

68. Kalab P., Pralle A., Isacoff E.Y., Heald R„ Weis K. (2006) Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature 440, 697-701.

69. Kaminski A., Howell M.T., Jackson R.J. (1990) Initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation: the authentic initiation site is not selected by a scanning mechanism. EMBOJ. 9,3753-3759.

70. Kann M., Schmitz A., Rabe B. (2007) Intracellular transport of hepatitis В virus. World J. Gastroenterol. 13,39-47.

71. Kazachkov Y.A., Chernovskaya T.V., Siyanova E.Y., Svitkin Y.V., Ugarova T.Y., Agol V.I. (1982) Leader polypeptides encoded in the 5'-region of the encephalomyocarditis virus genome. FEBS Lett. 141, 153-156.

72. Kihlmark M., Imreh G., Hallberg E. (2001) Sequential degradation of proteins from the nuclear envelope during apoptosis. J Cell Sci. 114, 3643-3653.

73. Kohler A., Hurt E. (2007) Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 761-773.

74. Kong W.P., Ghadge G.D. Roos R.P. (1994) Involvement of cardiovirus leader in host cell-restricted virus expression. PNAS USA 91, 1796-1800,

75. Kramer A., Ludvvig Y., Shanin V., Oberleithner H. (2007) A pathway separate from the central channel through the nuclear pore complex for inorganic ions and small macromolecules. J. Biol. Chem. 282, 31437-31443.

76. Kramer A., Liashkovich I., Ludvvig S., Shahin V. (2008a) Atomic force microscopy visualizes a hydrophobic meshwork in the central channel of the nuclear pore. Eur. J. PhysiolA56, 155- 162.

77. Kramer A., Liashkovich I„ Oberleithner H., Ludwig S., Mazur I., Shanin V. (2008b) Apoptosis leads to a degradation of vital components of active nuclear transport and a dissociation of the nuclear lamina. PNAS 105, 11236-11241.

78. Kutay U., Hetzer M.W. (2008) Reorganization of the nuclear envelope during open mitosis. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 669-677.

79. Leong L., Cornell C.T., Semler B.L. (2002) Processing determinants and functions of cleavage products of picornavirus polyproteins. In Molecular Biology of Picornaviruses. B.L.Semler and E.Wimmer, editors. ASM Press, Washington, D.C. 187-198.

80. Liang Z., Kumar A.S., Jones M.S., Knowles N.J., Lipton H.L. (2008) Phylogenetic analysis of the species Theilovirus: emerging murine and human pathogens. J. Virol. 82, 1154511554.

81. Lim R.Y.H., Huang N.P., Koser J., Deng J., Lau K.H.A., Schwarz-Herion K., Fahrenkrog В., Aebi U. (2006) Flexible phenylalanine-glycine nucleoporins as entropic barriers to nucleocytoplasmic transport. PNAS USA 103, 9512-9517.

82. Lim R.Y.H., Aebi U., Fahrenkrog B. (2008) Towards reconciling structure and function in the nuclear pore complex. Histochem. Cell Biol. 129, 105-116.

83. Lloyd R.E., Grubman M.J., Ehrenfeld E. (1988) Relationship of p220 cleavage during picornavirus infection to 2A proteinase sequencing. J. Virol. 62, 4216-4223.

84. Lubas W.A., Smith M., Starr C.M., Hanover J.A. (1995) Analysis of nuclear pore protein p62 glycosylation. Biochemistry 34, 1686-1694.

85. Maeshima K., Yahata K., Sasaki Y., Nakatomi R., Tachibana Т., Hashikawa Т., Imamoto F., Imamoto N. (2006) Cell-cycle-dependent dynamics of nuclear pores: pore-free islands and lamins. J. Cell. Sci. 119, 4442-4451.

86. Macaulay C., Meier E., Forbes D.J. (1995) Differential mitotic phosphorylation of proteins of the nuclear pore complex. J. Biol. Chem. 270, 254-262.

87. McBride A.E., Schlegel A., Kirkegaard K. (1996) Human protein Sam68 relocalization and inteaction with poliovirus RNA polymerase in infected cells. PNAS USA 93, 2296-2301.

88. Meerovitch K., Svitkin Y.V., Lee H.S., Lejbkowicz F., Kenan D.J., Chan E.K., Agol V.I., Keene J.D., Sonenberg N. (1993) La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J. Virol. 61, 3798-3807.

89. Melcak I., Hoelz A., Blobel G. (2007) Structure of Nup58/45 suggests flexible nuclear pore diameter by intermolecular sliding. Science 315, 1729-1732.

90. Miller M.W., Caracciolo M.R., Berlin W.K., Hanover J.A. (1999) Phosphorylation and glycosylation of nucleoporins. Arch. Biochem. Biophys. 367, 51-60.

91. Molla A., Hellen C.U., Wimmer E. (1993) Inhibition of proteolytic activity of poliovirus and rhinovirus 2A proteinases by elastase-specific inhibitors. J. Virol.67, 4688 -4695.

92. Nairn В., Brumfeld V., Kapon R., Kiss V., Nevo R., Reich Z. (2007) Passive and facilitated transport in nuclear pore complexes is largely uncoupled. J. Biol. Chem. 282, 3881-3888.

93. Nousiainen M., Sillje H.H., Sauer G., Nigg E.A., Korner R. (2006) Phosphoproteome analysis of the human mitotic spindle. PNAS USA 103, 5391-5396.

94. Onischenko EA, Gubanova NV, Kiseleva EV, Hallberg E. (2005) Cdkl and okadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. Mol. Biol. Cell. 16, 5152-5162.

95. Pante N., Kann M. (2002) Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol Biol Cell. 13, 425-434.

96. Park N., Katikaneni P., Skern Т., Gustin K.E. (2008) Differential targeting of nuclear pore complex proteins in poliovirus-infected cells. J. Virol. 82, 1647-1655.

97. Paschal B.M., Gerace L. (1995) Identification of NTF2, a cytosolic factor for nuclear import that interacts with nuclear pore complex protein p62. J. Cell. Biol. 129, 925-937.

98. Patel S.S., Belmont B.J., Sante J.M., Rexach M.F. (2007) Natively unfolded nucleoporins I gate protein diffusion across the nuclear pore complex. Cell 129, 83-96.

99. Patre M., Tabbert A. Hermann D., Walczak H., Rackwitz H.R., Cordes V.C., Ferrando-May E. (2006) Caspases target only two architectural components within the core structure of the nuclear pore complex. J! Biol. Chem. 281, 1296-1304.

100. Paul S., Michiels T. (2006) Cardiovirus leader proteins are functionally interchangeable and have evolved to adapt to virus replication fitness. J. Gen. Virol. 87, 1237-1246.

101. Paulillo S.M., Powers M.A., Ullman K.S., Fahrenkrog B. (2006) Changes in nucleoporin domain topology in response to chemical effectors. J. Mol. Biol. 363, 39-50.

102. Pemberton L.F. Paschal B.M. (2005) Mechanisms of receptor-mediated nuclear import and nuclear export. Traffic 3, 187-198f

103. Pestova T.V., Kolupaeva V.G., Lomakin I.B., Pilipenko E.V., Shatsky I.N., Agol V.I., , Hellen C.U. (2001) Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. PNAS1. USA98, 7029-7036.

104. Pettit Kneller E.L., Connor J.H., Lyles D.S. (2009) hnRNPs relocolize to the cytoplasm following infection with vesicular stomatitis virus. J. Virol. 83, 770-780.

105. Poon 1.К., Jans D.A. (2005) Regulation of nuclear transport: central role in development and transformation? Traffic 6, 173-186.

106. Porter F.W., Bochkov Y.A., Albee A.J., Wiese C., Palmenberg A.C. (2006) A picornavirus protein interacts with Ran-GTPase and disrupts nucleocytoplasmic transport. PNAS USA 103, 12417-12422.

107. Powers M.A., Forbes D.J., Dahlberg J.E., Lund E. (1997) The vertebrate GLFG nucleoporin, Nup98, is an essential component of multiple RNA export pathways. J. Cell Biol. 136,241-250.1

108. Rabut G., Doye V., Ellenberg J. (2004a) Mapping the dynamic organization of the nuclear pore complex inside single living cells. Nature Cell. Biol. 6, 1114-1121.

109. Rabut G., Lenart P., Ellenberg J. (2004b) Dynamics of nuclear complex organization through the cell cycle. Curr. Opin. Cell. Biol 16, 314-321.

110. Ribbeck K., Gorlich D. (2002) The permeability barrier of nuclear pore complexes appears to operate via hydrophobic exclusion. EMBOJ. 21, 2664-2671.

111. Ricour С, Delhaye S, Hato SV, Olenyik TD, Michel B, van Kuppeveld FJ, Gustin KE, Michiels T. (2009) Inhibition of mRNA export and dimerization of interferon regulatory factor 3 by Theiler's virus leader protein. J. Gen. Virol. 90, 177-186.

112. Rieder E., Wimmer E. (2002) Cellular receptors of picornaviruses: an overview. In Molecular Biology of Picornaviruses. Semler B.L. and Wimmer E., editors. ASM Press, Washington, D.C. 61-70.

113. Riedl S.J., Shi Y. (2004) Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 897-907.

114. Rout M.P., Aitchison J.D., Suprapto A., Hjertaas K., Zhao Y.M., Chait B.T. (2003) Virtual gaing and nuclear transport: the hole picture. Trends Cell. Biol. 13, 622-628.f

115. Salina D., Enarson P., Rattner J.В., Burke B. (2003) Nup358 integrates nuclear envelope breakdown with kinetochore assembly. J. Cell. Bio/. 162, 991-1001.

116. Sandri-Goldin R.M. (2008) The many roles of the regulatory protein ICP27 during herpes simplex virus infection. Front. Biosci. 13, 5241-5256.

117. Schwartz T.U. (2005) Modularity within the architecture of the nuclear pore complex. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 221-226.

118. Schwarz-Herion К., Maco В., Sauder U., Fahrenkrog B. (2007) Domain Topology of the p62 complex within the 3-D architecture of the nuclear pore complex. J. Mol. Biol. 370, 796-806.

119. Segura-Totten M., Wilson K.L. (2001) Virology. HTV—breaking the rules for nuclear entry. Science 294, 1016-1017.I

120. Semler B.L., Waterman M.L. (2008) IRES-mediated pathways to polysomes: nuclear versus cytoplasmic routes. Trends Microbiol. 16, 1-5.

121. Sharma R., Raychaudhuri S., Dasgupta A. (2004) Nuclear entry of poliovirus protease-polymerase precursor 3CD: implications for host cell transcription shut-off. Virology 320, 195-205.

122. Shiroki K., Isoyama Т., Kuge S., Ishii Т., Ohmi S., Hata S., Suzuki K., Takasaki Y., Nomoto A. (1999) Intracellular redistribution of truncated La protein produced by poliovirus ЗСрго-mediated cleavage. J. Virol. 73, 2193-2200.

123. Stanway G„ Hovi Т., Knowles N.J., Hyypia T. (2002) Molecular and biological basis of picornavirus taxonomy. In Molecular Biology of Picornaviruses. Semler B.L. and Wimmer E., editors. ASM Press, Washington, D.C. 17-24.

124. Stanway G., Christian P., Hovi Т., Hyypia Т., King A., Knowles N., Lemon S., Minor P.,

125. Pallahsch M., Palmenberg A., Skern T. (2005) Taxonomy of Picornaviridae: current 1situation and possible future changes. XIII Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses Lunteren, The Netherlands, 23 -29 May.G09

126. Starr C.M., D'Onofrio M., Park M.K., Hanover J.A. (1990) Primary sequence and heterologous expression of nuclear pore glycoprotein p62. J. Cell Biol. 110, 1861-1871.

127. Stewart C.L., Roux K.J., Burke B. (2007) Blurring the boundary: the nuclear envelope extends its reach. Science 318, 1408-1412.

128. Stoffler D., Feja В., Fahrenkrog В., Walz J., Турке D., Aebi U. (2003) Cryo-electron tomography provides novel insights into nuclear pore architecture: implications for nucleocytoplasmic transport. J. Mol. Biol. 328, 119-30. ,

129. Suhy D.A., Giddings Т.Н. Jr., Kirkegaard K. (2000) Remodeling the endoplasmic reticulum by poliovirus infection and by individual viral proteins: an autophagy-like origin for virus-induced vesicles. J. Virol. 74, 8953-8965.

130. Svitkin Y.V., Sonenberg N. (2003) Cell-free synthesis of encephalomyocarditis virus. J. VirolJl, 6551- 6555.

131. Svitkin Y.V., Meerovitch K., Lee H.S, Dholakia J.N., Kenan D.J., Agol V.I., Sonenberg N. (1994) Internal translation initiation on poliovirus RNA: further characterization of La function in poliovirus translation in vitro. J. Virol. 68, 1544-1550.

132. Takizawa C.G., Morgan D.O. (2000) Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B 1 -Cdkl and Cdc25C. Curr. Opin. Cell. Biol. 12, 658-665.

133. HO.Terasaki M., Campagnola P., Rolls M.M., Stein P.A., Ellenberg J., Hinkle В., Slepchenko

134. B. (2001) A new model for nuclear envelope breakdown. Mol. Biol. Cell 12,503-510. 1

135. Terry L.J., Shows E.B., Wente S.R. (2007) Crossing the nuclear envelope: hierarchical regulation of nucleocytoplasmic transport. Science 318, 1412-1416.

136. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S, Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. (2000) "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science 290, 1585-1588.

137. Tolskaya E.A., Romanova L.I., Kolesnikova M.S., Ivannikova T.A., Smirnova E.A., Raikhlin N.T., Agol V.l. (1995) Apoptosis-inducing and apoptosis-preventing functions of poliovirus. J. Virol.69, 1181- 1189.

138. Waggoner S., Sarnow P. (1998) Viral ribonucleoprotein complex formation and nucleolar-cytoplasmic relocalization of nucleolin in poliovirus-infected cells. J. Virol. 72, 6699-6709.132

139. Walther T.C., Askjaer P., Gentzel M., Haberman A., Griffiths G., Wilm M., Mattaj I.W., Hetzer M. (2003) RanGTP mediates nuclear pore complex assembly. Nature 424, 689-694.

140. Weidman M.K., Sharma R., Raychaudhuri S., Kundu P., Tsai W„ Dasgupta A. (2003) The interaction of cytoplasmic RNA viruses with the nucleus. Virus Res. 95, 75-85.

141. Weis K. (2003) Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112, 441-451.

142. Wells L., Vosseller K., Cole R.N., Cronshaw J.M., Matunis M.J., Hart G.W. (2002) Mapping sites of O-GlcNAc modification using affinity tags for serine and threonine post-translational modifications. Mol. Cell Proteomics. 1, 791-804.

143. Wessels E., Duijsings D., Lanke K.H., van Dooren S.H., Jackson C.L., Melchers W.J., van Kuppeveld .FJ. (2006) Effects of picornavirus ЗА Proteins on Protein Transport and GBF1-dependent COP-1 recruitment. J. Virol. 80, 11852-11860.

144. Whittaker G.R. (2003) Virus nuclear import. Adv. Drug Deliv. Rev. 55:733-747.

145. Wild P., Senn C., Manera C.L., Sutter E., Schraner E.M., Tobler K., Ackermann M., Ziegler U., Lucas M.S., Kaech A. (2009) Exploring the nuclear envelope of herpes simplex virus 1-infected cells by high-resolution microscopy. J. Viro/. 83, 408-419.

146. Zamora M., Marissen W.E., Lloyd R.E. (2002) Multiple elF4GI-specific protease activities present in uninfected and poliovirus-infected cells. J. Virol.16, 165- 177.

147. Zatsepina O.V., Polyakov V.Y., Chentsov Y.S. (1983) Chromonema and chromomere: structural units of mitotic and interphase chromosomes. Chromosoma (Berl) 88, 91-97.

148. Zoll J., Galama J.M.D., van Kuppeveld F.J.M., Melchers W.J.G. (1996) Mengovirus leader is involved in the inhibition of host cell protein synthesis. J. Virol. 70, 4948-4952.

149. ZoII J., Melchers W.J.M., Galama J.M.D., van Kuppeveld F.J.M. (2002) The mengovirus leader protein suppresses alpha/beta interferon production by inhibition of the iron/ferritin-mediated activation ofNF-кВ. J. Virol. 76, 9664-9672.