Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции

Зорина, Виктория Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции"

На правах рукописи

Зорина Виктория Владимировна

РОЛЬ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В МОДУЛЯЦИИ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ШИГЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.07. - микробиология

14.00.36. - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Т.Н.Николаева Доктор биологических наук А.Н.Наровлянский

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор В.М.Земсков Доктор биологических наук Н.АЗигангирова

Ведущая организация - ГУ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского МЗ РФ

Защита диссертации состоится « /]0» июня 2005 года в ч часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.007 01. в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул.Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « 0 » мая 2005 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

Е В. Русакова

100G-H

J2/3 7S7V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Облигатная микрофлора желудочно-кишечного тракта является важнейшим компонентом экосистемы кишечника человека и принимает непосредственное участие в регуляции процессов, направленных на поддержание гомеостаза макроорганизма (В М.Богдаренко, А.А Воробьев, 2004, А.И.Хавкин, 2003, Н.В. Хорошилова, 2003)

Ведущими представителями индигенной микрофлоры человека являются бактерии рода Lactobacillus Они обеспечивают колонизационную резистентность и обладают широким спектром антимикробных механизмов, проявляя антагонистическую активность, направленную на ингибирование адгезии, пенетрации и размножения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (S.Bengmark, 1998, M.Cross., 2002., N.Roos, 2002).

Важнейшей функцией лактобактерий (ЛАБ) является участие в формировании местной и системной резистентности макроорганизма, что связано с их универсальными иммуномсщулирующими свойствами. Ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника ЛАБ взаимодействуют с М-клегками пейеровых бляшек, эпителиальными и иммунокомпетентными клетками, активируют механизмы клеточно-опосредованного и гуморального иммунного ответов, функции ретикуло-эндотелиальной системы кишечного тракта и продукцию ряда цитокинов (N.Aattour, 2002, S. Meydani, 2000, G.Perdigon, 2001). Установлено участие ЛАБ в развитии феномена «оральной толерантности» к пищевым антигенам. ЛАБ усиливают цитотоксические функции Т-лимфоцитов, макрофагов и естественных киллеров, стимулируя тем самым функции противоопухолевого иммунитета (KL Ericson, 2002, HS Gill, 2000, D.Haller, 2002, P.Pochard, 2002).

Вопросы, связанные с ролью ЛАБ в формировании Т- и В-клеточного иммунного ответа и продукции цитокинов, обеспечивающих баланс между гуморальной и клеточно-опосредованной иммунными реакциями, требуют более глубокого изучения и являются фундаментальными в определении комплексных связей между макроорганизмом и его интестинальной микрофлорой.

Актуальность этих исследований обусловлена также широким использованием препаратов для профилактики и лечения острых кишечных инфекций, дисбактериозов, иммунодефицитных состояний, а также перспективами создания

вакцин на основе ЛАБ.

Цель работы:

Изучить влияние представителей рода Lactobacillus на клеточные факторы иммунитета, экспрессию генов и продукцию цитокинов у экспериментальных животных в норме и при моделировании шигеллезной инфекции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние живых микробных клеток бактерий рода Lactobacillus на функциональную активность иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов, естественных киллерных (ЕК) клеток селезенки и пейеровых бляшек (ПБ) экспериментальных животных.

2. Провести сравнительный анализ спектра экспрессироеанных генов цитокинов в клетках пейеровых бляшек экспериментальных животных при пероральном введении бактерий рода Lactobacillus.

3 Изучить влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию интерферонов (ИФН) и фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ), клетками ПБ, селезенки и тимуса экспериментальных животных.

4 Изучить значение инвазивных и токсигенных свойств Shigella dysenteriael в развитии клеточного иммунного ответа и индукции цитоки новой сети экспериментальных животных.

5. Изучить влияние бактерий рода Lactobacillus на развитие клеточного иммунного ответа, экспрессию генов цитокинов и продукцию ИФН при экспериментальной шигеллезной инфекции.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Выявлено, что исследуемые ЛАБ вызывают различный по интенсивности и продолжительности, зависимый от штамма и дозы стимулирующий эффект на пролиферацию иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов и функциональную активность ЕК-клетак

Установлено, что лактобактерии активируют экспрессию генов провоспапитель-ных цитокинов (интерлейкинов (ИЛ) 6,12,18, фактора некроза опухолей (ФНО)а, ИФН а и ИФНу) клетками ПБ.

Показано, что исследуемые ЛАБ стимулируют рост титров сывороточного ИФН, индуцируют выработку ИФНа и ИФН? клетками ПБ, селезенки и тимуса, а также являются косгимуляторами продукции интерферонов.

Впервые установлено, что ЛАБ стимулируют продукцию МИФ иммунокомпетентными клетками ПБ и селезенки и его количественное увеличение в сыворотке крови мышей СВА.

Впервые показана ведущая роль инвазивных свойств Shigella dysenteriael в стимуляции пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов, активации экспрессии генов противовоспалительных (ИЛ4 и 10) и прововоспалительных (ИЛ-1р,6,12,18,ФНОа и ИФНу) цитокинов, а также индукции синтеза ИФНа и ИФНу.

Впервые установлено, что предварительное пероральное введение ЛАБ экспериментальным животным усиливает функциональную активность Т-клеточного звена иммунного ответа при развитии шигеллезной инфекции

Выявлено, что при экспериментальной шигеллезной инфекции предварительное введение ЛАБ способствует поддержанию развития клеточно-опосредованных иммунных реакций, не вызывая активации экспрессии генов противовоспалительных цитокинов (ИЛ4 и ИЛ 10) и усиливая синтез ИФНа и ИФНу клетками ПБ, селезенки и тимуса мышей СВА.

Полученные данные являются основой оценки иммуномодулирующей эффективности ЛАБ при создании пробиотических, вакцинных препаратов, в качестве основы для профилактической биокоррекции и применения их в комплексной схеме лечения кишечных инфекций.

Публикации. Основные материалы диссертации отражены в 5 статьях и 3 тезисах.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на международной научно-практической конференции памяти Г И Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), 4 Съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва,2004)

Апробация диссертации проведена на совместной конференции лабораторий Естественного иммунитета, Клеточного иммунитета, Цитокинов, Генетики вирулентности бактерий ГУ НИИЭМ им Н.Ф Гамалеи РАМН 24 марта 2005 года

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов, собственных исследований (2 главы), обсуждения результатов, выводов и списка литературы (73 отечественных и 233 зарубежных

источников). Работа изложена на 200 страницах, иллюстрирована 49 рисунками и 14 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ряутцрии

Лактобактерт: Lactobacillus fermentum 2998, L.plantarum 97, L.pfantaium 30, L plantarum 8R-A3, L.acidophilus D4a, полученные в лаборатории генетики вирулентности бактерий ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН, коммерческие штаммы L.acidophilus NK1 и L acidophilus Кщ24, используемые при производстве проб магического препарата «Аципакт» (ГУ МНИИЭМ им Г.Н Габричевского МЗ РФ).

Вирулентный штамм S.dysenteriael SC500 (in/tox*) и его генетически родственные мутанты- инвазивный нетоксигенный штамм S.dysenteriael SC501 (inv+tox"), неинвазивный токсигенный мутант S.dysenteriael SC502 (inv"tox+), авирулентный (неинвазивный и нетоксигенный) штамм S.dysenteriael SC503 (inv "tox") (A.Fonten et al ,1988). Все штаммы сохранили низкомолекулярную плазмиду 6MD (p6MD), необходимую для синтеза полноценной структуры ЛПС, серологически идентичны.

Антигенные препараты

Липополисахарид (ЛПС) S.dysenteriael, полученный по методу O.Westphal, KJahn (1965).

Неспецифические митогенные препараты- конканавалин А (КонА) в дозе 20мкг/мл (Сигма, США) и фитогемагглюгтинин Р (ФГА Р) в дозе 1мкг/мл (Дифко, США)

Вирусы

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН), полученный из отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН, с титром 1х109ТЦД5о/мл

Вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV), штамм Колумбия SK-Col-SK, с титром 107 ТЦДво/мл Вирус получен из отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН

Клеточные линии

Перевиваемая линия мышиных фибробластов L-929, высокочувствительная к мышиному ИФН.

Животные

Эксперименты выполнены на мышах линии СБА, весом 18-20г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Мышей заражали перорально живыми микробными клетками изученных штаммов ЛАБ в дозе 1x109 КОЕ/мл и S.dysenteriael в дозе 4х108КС)Е/мл

Клеточные суспензии

У животных забирали селезенку, пейеровы бляшки, тимус. Органы гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе.

Гомогенат фильтровали через фильтры из нержавеющей стали с отверстиями диаметром 50-100мкм и затем отмывали в среде для центрифугирования (СЦ) (среда 199 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко), 1мМ буферного раствора HEPES и 50 мкл/мл гентамицина) Суспензию клеток центрифугировали при 4°С, 8001000 об/мин в течение 10 минут. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.

Выделение суммарной РНК из клеток ПБ мышей СВА проводили методом кислой гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ экстракции (P.Chomczynski, N Sacchi, 1987)

Обратная транскрипция и ПЦР-амплиФикация выполнены в соответствии с методикой, предложенной С Gelder в 1995 году В работе использованы пары праймеровдля следующих цитокинов' ИФНа, ИФНу, HJl-1ß, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а. В качестве положительного контроля использовался ß-акгин Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нукпеотидных последовательностей использовали маркер длин фрагментов pUC19/Msp I (Силекс М).

Реакция бласттрансФормаиии лимфоцитов

Пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток определяли в РБТ в присутствии Т-митогена конканавалина А (Кон А) в конечной концентрации 4 мкг/мл (Сигма, США) и В-митогена ЛПС (ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН) в конечной концентрации 200 мкг/мл.

Для постановки РБТЛ готовили суспензию клеток лимфоидных органов в полной среде культивирования (CK) Инкубацию клеток осуществляли в 96-луночных плоскодонных планшетах в течение 72 часов в С02 (5%) инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере. В каждую лунку вносили по 500 тыс клеток. За 16 часов до окончания срока инкубации в каждую лунку вносили по 1 мкКи 3Н-тимидина с удельной активностью 1 Ки/мМ в объеме 5 мкл Пролиферативную активность оценивали по включению радиоактивной метки в ДНК клеток опытных групп в присутствии или без неспецифических митогенов по отношению к контролю.

Определение ИФН в сыворотке крови и супернатантах клеток лимФоидных органов экспериментальных животных

Титр ИФН (Ед/мл) определяли, находя его максимальное разведение, которое защищало 50% клеток от цитопатогенного действия ЮОТЦДм/мл EMCV В качестве клеток - мишеней использовали клеточную линию L-929. В качестве индуктора ИФНа использовали ВБН, в качестве индуктора ИФНу - Т-клеточный митоген ФГА На суточном монослое клеток L-929 расгитровывали исследуемый материал. Инкубировали в течение 24 часов в СОг инкубаторе при 37 °С. К клеткам, проинкубированным с исследуемым материалом, вносили тест-вирус в соответствующем разведении. Через сутки определяли титр ИФН (Ед/мл, или 1одгЕд/мл) в исследуемом материале опытных групп относительно показателей в контролях.

Определение МИФ в реакции торможения миграции макрофагов (РТММ) in vitro

Анализ продукции МИФ проводили на клеточной суспензии перитонеальных макрофагов интактных животных, инкубируемой с исследуемым материалом, в соответствии с методикой, предложенной А.П.Сусловым и В П. Головиным (1989)

Индекс миграции (ИМ) вычисляли по формуле-

ИМ=((002/ Dk2)-1) х 100%

где DO2 - средний диаметр для параллельных опытных микрокультур, Dk2 - то же для контрольных микрокультур.

Отклонение опытных данных от контрольных более чем на 20% являлось статистически значимым.

Метод определения иитотоксической активности ЕК-кпеток.

Цитотоксическую активность ЕК в суспензии клеток лимфоидных органов мышей оценивали с использованием радиометрической методики в модификации (М П Рыкова, 1981) против меченных 3Н-уридином в дозе 3 мкКи/мл клеток-мишеней (KM) L929, стандартных, длительно поддерживаемых в культуре in vitro Клетки инкубировали в 96-луночных планшетах в течение суток, отмывали, добавляли клетки-эффекторы и вносили панкреатическую РНК-азу в дозе 5,0 мкг/мл Инкубировали в течение 14 часов при 37°С во влажной атмосфере в СОг инкубаторе По истечении срока инкубации содержимое лунок осаждали на стекловолокнистые фильтры (Whatman) 12-канапьным харвестром (Flow, Великобритания).

Индекс цитотоксичности рассчитывали по формуле: ИЦ=(1-опыт /контроль) 100

Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных данных проводили путем определения средних арифметических и средних геометрических значений с вычислением средних ошибок и доверительных интервалов Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стъюдента (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние бактерий рода Lactobacillus на экспрессию генов цитокинов клеток пейеровых бляшек экспериментальных животных

Активация продукции цитокинов является одним из механизмов взаимодействия ЛАБ с иммунокомпетентными клетками макроорганизма Анализ влияния ЛАБ на экспрессию генов цитокинов, как начального этапа модуляции медиаторов межклеточного взаимодействия, позволяет определить возможные направления развития иммунных процессов в сторону клеточного или гуморального иммунного ответа

Пейеровы бляшки играют важнейшую роль в функционировании иммунной системы ЖКТ и характеризуются уникальной морфологической структурой. М-клетки, входящие в структуру ПБ, взаимодействуют с бактериями и антигенами просвета кишечника и осуществляют их транспорт в субэпителиальный купол, где происходит их контакт с иммунокомпетентными клетками ПБ состоят из В-зоны (зародышевый центр В-лимфоцитов), Т-зэвисммой зоны (ССИ+-клетки составляют 60% от числа Т-лимфоцитов, С08*-клетки - 25%). Кроме того, ПБ обогащены фагоцитирующими клетками, выполняющими функции АПК. Контакт иммунокомпетентных клеток с антигенами просвета кишечника инициирует развитие иммунного ответа, который сопровождается продукцией цитокинов (А.А.Ярилин,1999, K.L Ericson,2000, Е, Isolauri,2001)

Показано, что исследуемые штаммы ЛАБ индуцируют экспрессию генов спектра цитокинов в клетках пейеровых бляшек экспериментальных животных (табл 1) Эффект зависит от штамма ЛАБ.

При введении L.fermentum 2998 и L.plantarum 8R-A3 отмечена активация экспрессии генов ИФНа и ИЛ18, по сравнению с штатным контролем (ИЛ6, 12 и ФНОа) (рис.1). Штамм L acidophilus D4a стимулирует синтез наименьшего набора мРНК (ИЛ-12 и ФНОа)

Таблица1 Влияние ЛАБ на экспрессию генов цитокинов клеток ПБ мышей

Штамм Цитокины

ИФН-а ИФН-у ИЛ-1Р ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-10 ИЛ-12 ИЛ-18 ФНО-а

L.plantarum

8R-A3 + - - + - + + +

L.plantarum

97 - - - - - - + + +

L.plantarum

30 + - - - - - + + +

L.fermentum

2998 + - - - + - + + +

L.acidophilus

NK1 - + - - + - + - +

L.acidophilus

D4a - - - - - - + - +

L.acidophilus

K3m24 - - - - + - + - +

Примечание «+» - активация экспрессии гена цитокина; «-» - отсутствие активации экспресии гена цитокина

1 234 5678 9 10

Рис 1 Продукты амплификации генов цитокинов клеток ПБ интактных мышей СВА

1 - ИФНа; 2 - ИФНу; 3 - ИЛ-1Р; 4 - ИЛЧ 5 - ИЛ-6, 6 - ИЛ-10, 7 - ИЛ-12, 8 - ИЛ-18, 9-ФНОа, 10-р-актин

Полученные данные свидетельствуют о способности исследуемых штаммов ЛАБ индуцировать синтез медиаторов, опосредующих дифференцировку Т хелперов в направлении Тх1 субпопуляции, что предполагает преимущественное развитие клеточного звена иммунного ответа макроорганизма Реализация эффекта связана, в первую очередь, с синтезом мРНК ИЛ 12, отмеченным при введении ЛАБ Данный цитокин продуцируется клетками миелоидно-моноцитарного ряда под влиянием бактериальных продуктов, в том числе компонентов клеточных стенок, цитоплазмы, и является аутокринным и ларакринным ростовым фактором Т-лимфоцитов, способный направлять их дифференцировку в Сй4* (Тх1) Эффект достигается путем повышения ИЛ-12 экспрессии ИЛ-18, активация генов которого была

зафиксирована при введении ЛАБ. Кроме того, как ИЛ12, так и ИЛ18 являются индукторами синтеза ИФНу Тх1 лимфоцитами, синтез мРНК которого выявлен в группе L.acidophilus NK1.

Экспрессия генов ИФНа в присутствии ЛАБ дает возможность предполагать стимуляцию макрофагапьного звена иммунного ответа, поскольку основными продуцентами данного цитокина являются моноциты и макрофаги, активированные бактериальными продуктами.

Зависимость набора экспрессируемых генов цитокинов от исследуемого штамма ЛАБ, вероятно связана с индивидуальными особенностями строения и состава структур бактериальной клеточной стенки, определяющих специфическое воздействие штаммов ЛАБ на компоненты иммунной системы макроорганизма

Таким образом, сравнительный анализ влияния ЛАБ на экспрессию генов цитокинов, как начального этапа их взаимодействия с клетками лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, выявил индуцирующую активность ЛАБ на экспрессию генов провослалительных цитокинов, обусловливающих пролиферацию Т- и В-лимфоцитов и опосредующих дифференцировку Т-хелперов в направлении Тх1 -субпопуляции.

Влияние бактерий рода Lactobacillus на поолиФеративную активность клеток лимФоидных органов экспериментальных животных

С целью оценки модулирующего влияния ЛАБ на развитие клеточного иммунного ответа изучена пролиферативная активность спленоцитов интактных животных в присутствии живых микробных клеток ЛАБ и их гомологичных нативных фильтратов

Наибольший пролиферативный ответ интактных КС был отмечен в присутствии живых бактериальных клеток L.plantarum 8R-A3 и L. fermentum 2998 в дозе 5хЮ7КОЕ/мл и их гомологичных нативных фильтратов в дозе 1хЮ10КОЕ/мл (р< 0,05) (рис.2). Эффект воздействия Lplantarum 97 в данных дозах был выражен в меньшей степени (р< 0,05).

Уровень включения 3Н-тимидина (имп/мин)

■ Lfermentum 2998

BL plantarum 30

QL plantarum 8R-A3

□ L plantarum 97

□ Контроль

107 КОЕ/мл

10е КОЕ/мл 1010 КОЕ/мл (фильтрат)

Рис 2 Пролиферативная активность спленоцитов интактных мышей в присутствии живых бактерий L fermentum, L plantarum и их гомологичных нативных фильтратов

Среди изученных штаммов L acidophilus максимальное влияние на пролиферацию спленоцитов интактных животных оказывал штамм L acidophilus NK1 в дозе 1x10® КОЕ/мл (рис 3) Введение гомологичных фильтратов в среду культивирования КС не оказывало митогенного эффекта.

Уровень включения 3Н-тимидина (имп/мин)

IL acidophilus

К311124

IL acidophilus NK1

IL acidophilus 04a

□ Контроль

5x10® КОЕ/мл

109 КОЕ/мл

5x108 КОЕ/мл (фильтрат)

Рис 3 Пролиферативная активность спленоцитов интактных мышей в присутствии живых бактерий L acidophilus и их гомологичных нативных фильтратов

Пролиферативная активность клеток селезенки

мышеи

СВА,

сенсибилизированных перорально ЛАБ в дозе 1x109 КОЕ/мл, и инкубируемых в

присутствии специфических митогенов зависела от вида и штамма Бактерии L acidophilus стимулировали статистически достоверное увеличение показателей пролиферации КС в присутствии КонА (р<0,05) (рис 4) Наибольший эффект оказывал штамм L acidophilus NK1 Уровень включения 3Н-тимидина, в %

IKohA

1ЛПС

Ш Культура

□ Контроль (без

антигена)

L acidophilus К311124 L acidophilus NK1 L acidophilus D4a

Рис 4 Пролиферация спленоцитов мышей СБА, сенсибилизированных L acidophilus Бактерии L plantarum и L fermentum стимулировали пролиферацию КС в большей степени в присутствии В-митогена Максимальная пролиферативная активность КС отмечена при введении L plantarum 97 (рис 5). Уровень включения 3Н-тимидина, в %

влпс

в Культура

□ Контроль (без

антигена)

L (amentum 2998

L plantarum 30

L plantarum 8R-A3

L plantarum 97

Рис 5 Пролиферация спленоцитов мышей СВА, сенсибилизированных L fermentum и L. plantarum

Полученные данные свидетельствуют о способности ЛАБ оказывать модулирующий эффект на уровне системного иммунитета Выявлена зависимость показателей пролиферации от штамма ЛАБ Это согласуется с данными литературы, указывающими на межштвммовые различия в стимуляции бластгрансформации Т- и В-лимфоцитов (N.Aattour,2002, TChen, 2002, P.Kirjavainen, 1999).

Таким образом, ЛАБ оказывают комплексную стимуляцию лимфоидных клеток Активированные в пейеровых бляшках и одиночных фолликулах В-лимфоциты мигрируют в слизистые оболочки (в первую очередь lamina propria) и способны заселять удаленные от места активации органы иммунной системы, в том числе и селезенку, тем самым обусловливая воздействие ЛАБ на системные иммунные реакции.

Стимуляция лактобактериями Т-клеточного звена иммунной системы связана с интенсивной рециркуляцией Т-лимфоцитов, базирующейся на механизме «хоминга» Это способствует перемещению активированных клеток из лимфоидных образований слизистой оболочки кишечника в другие периферические органы иммунной системы, где эти лимфоциты и реализуют свое действие

В тоже время, взаимодействие ЛАБ с М-клетками тонкого кишечника стимулирует дифференцировку внутриэпителиальных Т-клеток в сторону супрессорного и цитотоксического фенотипов, обусловливающих клеточно-опосредованные иммунные реакции. Т-лимфоциты lamina propria проявляют под их влиянием хелперный и индукторный фенотипы, что приводит к активации В-клеточного иммунного ответа.

С целью изучения влияния исследуемых штаммов ЛАБ на функциональную активность ЕК-клеток нами проведен анализ показателей цитотоксической активности спленоцитов мышей СВА, сенсибилизированных ЛАБ

Установлено, что пероральное введение ЛАБ экспериментальным животным усиливает цитотоксическую активность ЕК клеток, по сравнению с интактным контролем (рис 6) Эффект зависит от штамма ЛАБ и соотношения КМ/КЭ

Штаммы L plantarum 97 и L.plantarum 30 индуцировали наибольшую цитотоксическую активность спленоцитов при соотношении КМ/КЭ 1.20. Последний также вызывал рост индексов цитотоксичности при соотношении КМ/КЭ 110 (р<0,05).

Индексы цитотоксичности (единицы)

Рис б Показатели цитотоксической активности клеток селезенки мышей СВА, сенсибилизированных ЛАБ

В 1 10 (мишень эффектор) О 120 (мишень эффектор)

Активация ЕК сопровождается продукцией гуморальных факторов, в первую очередь ИФНу и ФНОа Экспрессия генов данных цитокинов выявлена методом ПЦР в клетках ПБ сенсибилизированных ЛАБ животных,"что также подтверждает предположение о способности ЛАБ стимулировать цитотоксические функции ЕК

Регуляция функций ЕК обусловлена продукцией ИФНа, ИФНр и ИЛ12 активированными макрофагами, а также цитокинами Тх1-субпопуляции, повышающими цитолитический потенциал ЕК-клеток

Таким образом, стимуляция ЛАБ функций ЕК-клеток, в первую очередь, реализации цитотоксической реакции при взаимодействии с клетками-мишенями, является важным фактором поддержания гомеостаза и защиты организма-хозяина от опухолей и внутриклеточных инфекций

Продукция интерферонов отражает функциональное состояние клеточных факторов иммунной системы, в первую очередь клеток-продуцентов ИФНу (Тх1-лимфоцитов и ЕК-клеток) и продуцентов ИФНа (В-лимфоцитов и клеток моноцитарно-макрофагапьного ряда)

Оценка продукции ИФН проводилась по следующим параметрам количеству циркулирующего в крови ИФН (сывороточный ИФН), уровням продукции ИФНа и ИФНу в супернатантах клеток ПБ, селезенки и тимуса, а также способности клеток указанных органов продуцировать данные цитокины при дополнительной стимуляции вирусным индуктором ИФНа (ВБН) и индуктором ИФНу (ФГА) в условиях in vitro

Показано, что пероральное введение ЛАБ мышам СВА стимулирует увеличение титров сывороточного ИФН по сравнению с аналогичными показателями интактного

контроля (рис 7) Рост титров ИФН отмечен во всех опытных группах через 24 часа после введения ЛАБ

Титр ИФН (1одг Ед/мл)

Часы

Рис7 ИФН в сыворотке крови мышей СБА, сенсибилизированных ЛАБ ■ L fermentum 2998 S L plantarum 30 И L acidophilus NK1 □ Интактный контроль В Контроль ИФНа (мыши, сенсибилизированные ВБН) О Контроль ИФНу (мыши, сенсибилизированные ФГА)

Данные литературы свидетельствуют, что данный временной показатель соответствует пику продукции ИФНа (Ф И Ершов, 1996) Индукцию данного цитокина исследуемыми штаммами ЛАБ подтверждают результаты ПЦР-анализа экспрессии генов цитокинов, свидетельствующие об активации синтеза мРНК ИФНа

Штамм L acidophilus NK1 приводит к росту титров интерферона через 48 часов (время предполагаемого пика продукции ИФНу) что также согласуется с результатами ПЦР анализа

Таким образом, установлено, что изученные штаммы ЛАБ оказывают индуцирующий эффект на продукцию ИФНа и ИФНу и рост титров ИФН в сыворотке крови мышей СВА.

Дальнейшие эксперименты выявили способность ЛАБ усиливать продукцию интерферонов иммунокомпетентными клетками ПБ, селезенки и тимуса в присутствии индукторов ИФНа и ИФНу и без них в условиях in vitro

Показано, что клетки указанных органов сенсибилизированных ЛАБ животных , культивируемых в полной СК в течение 24 часов без добавления специфических

индукторов интерферонов, синтезируют ИФН через 48 часов после введения ЛАБ (рис.8А,Б). А Титр ИФН (кэдЕд/мл)

■ Ь СегтепШт 2998

ВI- р1атагит

В Ь аск)орЫ1и5 МС1

□ Контроль (ингактные СБА)

безВБН с ВБН 6 часов

безВБН с ВБН

24 часа

безВБН с ВБН

48 часов

Б Титр ИФН (log2 Ед/мл)

L fermentum

2998

Б L plantarum

Г,.acidophilus NK1

□ Контроль (интактные СВА)

без ФГА с ФГА 6 часов

без ФГА с ФГА 24 часа

без ФГА с ФГА 48 часов

Рис 8 Продукция ИФН клетками ПБ мышей, сенсибилизированных ЛАБ, при дополнительной стимуляции индукторами ИФН а (А) и ИФНу (Б) в условиях in vitro Бактерии L fermentum оказывают наиболее выраженное влияние на рост титров интерферонов в супернатантах клеток ПБ и спленоцитов, a L acidophilus NK1 вызывает максимальные титры ИФН в супернатантах тимоцитов

Дополнительная стимуляция клеток лимфоидных органов вирусным индуктором ИФНа (ВБН) и митогеном клеток-продуцентов ИФНу (ФГА) в условиях in vitro существенно повышает титры данных цитокинов в супернатанах клеток лимфоидных

органов по сравнению с показателями интактного контроля (рис.8). Рост титров ИФНа отмечен спустя 24 часа и поддерживается на высоком уровне к 48 часам после введения мышам ЛАБ (рис 8А) Аналогичная картина отмечена при культивировании клеток лимфоидных органов в присутствии ФГА (рис.8Б).

Полученные нами результаты согласуются с данными авторов, свидетельствующими, что ЛАБ оказывают непосредственное индуцирующее действие на продукцию ИФНа и ИФНу и усиливают синтез цитокинов в ответ на дополнительную стимуляцию клеток иммунных органов вирусным индуктором и митогеном ФГА (К1_ Епсзоп, 2000, I* МейгМоу, 2000) Одной из возможных причин данного эффекта является продолжительная стимуляция ЛАБ клеток-продуцентов ИФН на локальном и системном уровнях В условиях инфицирования макроорганизма патогенами вирусной и бактериальной природы это способствует более быстрому и интенсивному интерфероновому ответу. Предположение подтверждается результатами анализа экспрессии генов интерферонов методом ПЦР, свидетельствующими об активации экспрессии генов ИФНа и ИФНу (спустя 72 часа после введения ЛАБ), тогда как по данным авторов, индукция клеток моноцитарно-макрофагального ряда бактериями, либо активация В-лимфоцитов сопровождаются синтезом мРНК ИФНа спустя час, а секреция данного цитокина достигает пика через 24 часа, после чего наблюдается снижение синтезирующей активности клеток (ААЯрилин, KL.Ericson.2000). мРНК ИФНу определяется позднее -через 5-8 часов после связывания Тх-лимфоцитов с антигеном/митогеном, а максимальная продукция цитокина регистрируется к 48 часам (М М1е№пеп,1998, А.Рера,2003)

К факторам регуляции кпеточно-опосредованного иммунитета относится МИФ, ингибирующий миграцию макрофагов и контролирующий реализацию воспалительной реакции.

Проведен анализ миграционной активности интактных макрофагов, культивируемых в присутствии сыворотки крови (рис 9А ), супернатантов клеток ПБ (рис 9Б) и селезенки мышей, сенсибилизированных ЛАБ Результаты экспериментов свидетельствуют о способности ЛАБ стимулировать продукцию МИФ. Выявлена зависимость показателей подавления миграции макрофагов от штамма ЛАБ и сроков с момента сенсибилизации животных.

А Индекс подавления миграции, %

13 7 сутки

Б Индекс подавления миграции, %

1 3 7 сутки

Рис 9 Подавление миграции интактоых макрофагов в присутствии сыворотки крови (А) и супернатантов клеток ПБ (Б) мышей, сенсибилизированных ЛАБ, в % ® L fermentum 2998 S L plant arum 30 И L acidophilus NK1 Е Интактный контроль

Отмечена тенденция к увеличению индексов подавления миграции на 1-3 сутки после введения ЛАБ, наибольшие значения зафиксированы на 7 сутки (р<0,05)

Таким образом, ранняя выработка МИФ (1-3 сутки) предполагает активацию ЛАБ клеток моноцитарно-макрофагального ряда и эозинофилов, как основных продуцентов раннего МИФ Дальнейшее усиление ингибирующего миграцию макрофагов эффекта обусловлено вовлечением в процесс Тх-лимфоцитов (CD4*), активация которых происходит в лимфоидных органах Полученные данные подтверждаются активацией экспрессии генов провоспалительных цитокинов (ИЛ 12 и 18), опосредующих, наряду с иммунным воспалением, процессы дифференцировки лимфоцитов в направлении Тх1 субпопуляции Вероятно, следствием сенсибилизирующего воздействия ЛАБ является комплексная активация

компонентов иммунной системы, которая предполагает готовность организма к реакции на повторное поступление антигена

Заключительный раздел работы посвящен изучению особенностей развития экспериментальной шигеллезной инфекции на фоне предварительного перорального введения ЛАБ

В экспериментах по изучению экспрессии генов цитокинов в клетках ПБ при моделировании шигеллезной инфекции, установлена зависимость спектра активированных генов от генетически детерминированных факторов патогенное™ в.с1у8еп1епае1 (инвазия и токсинообразование) (табл.2)

Таблица 2. Влияние штаммов Э Ьу8еШепае1 на экспрессию генов цитокинов клеток пейеровых бляшек_

Штамм Цитокины

ИФН-а ИФН^г ИЛ-1В ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-10 ИЛ-12 ИЛ-18 ФНО-о

3.<]у8вп1епае1

ЭС500 - + - + - + - + +

в.(*увеп1вг1ае1

вС501 - + + + + - + + +

3.дузегПепае1

ЗС502 - - + - + - + + +

8.4узеп№пае1

вСЮЗ - - - - + - + - +

Вирулентный штамм вС500 вызывает активацию экспрессии генов провоспалительных цитокинов (ИФНу, 18 и ФНОа) и противовоспалительных ИЛ4 и ИЛ10, что предполагает развитие иммунного ответа смешанного типа. При заражении мышей инвазивным и нетоксигенным мутантом ЭС501 отмечена преимущественная активация генов провоспалительных цитокинов ИФНу, ИЛ-1р, 6, 12, 18, ФНОа и противовоспалительного ИЛ4, тогда как неинвазивный токсигенный штамм вС502 не индуцировал синтез мРНК ни ИЛ4, ни ИЛ 10 Спектр экспрессированных генов цитокинов при введении авирулентного мутанта БС503 был сопоставим с показателями интактного контроля (ИЛ6.12 и ФНОа).

Предварительное введение мышам ЛАБ и последующее их заражение вирулентным штаммом ЭС500 индуцировало активацию генов провоспалительных цитокинов, но не ИЛ4 и 10 (табл 3) Наибольшей спектр мРНК цитокинов отмечен при введении L.plantarum вИ-АЗ и 1_.аас)орППиз N(<1.

Таблица 3 Влияние предварительного перорапьного введения ЛАБ при экспериментальной шигеллезной инфекции на экспрессию генов цитокинов клеток ПБ мышей СВА

Штамм Цитокины

ИФН-а ИФН-т ИЛ-1В ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-10 ИЛ-12 ИЛ-18 ФНО-а

1_.р1ап1агит

8Я-А3 + + - - + - + - +

1_.р1атагит

97 - - - - - - + - +

1_.р1ап1агит

30 + - - - + - + - +

1_.ТегтепЬ»п

2998 + - - - + - + - +

1_.ас1с1орМ1ия

ЫК1 - + + - + - + - +

1_.ас1с1орИПид

04а - - - - + - + - +

и.аЫ<1ор11Ниа

К3т24 - - + - + - + - +

Полученные данные дают возможность предполагать способность ЛАБ стимулировать и поддерживать развитие клегочно-опосредованных иммунных реакций, при этом активация генов противовоспалительных цитокинов - медиаторов гуморального звена иммунитета при развитии острых кишечных инфекций выявлено не было Наблюдаемый эффект связан с рядом особенностей взаимодействия ЛАБ с организмом хозяина В первую очередь, это конкурентное связывание живых ЛАБ с рецепторами эпителиальных клеток, что предотвращает адгезию патогенных бактерий и индуцирует выработку цитокинов ИЛ-10,6 и ФНОа. Кроме того, отдельные компоненты бактериальной клеточной стенки, например, липотейхоевые кислоты, способны связываться с рецептором С014, экспрессируемым интестинальным эпителием, и ингибировать воспалительный процесс, вызываемый ЛПС патогена Данные механизмы лежат в основе обеспечения ЛАБ колонизационной резистентности.

Изучение влияния штаммов Э бузе^епаеЧ, различающихся наличием генетически детерминированных факторов патогенное™, на функциональную активность иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов ПБ выявили, что все штаммы вызывали преимущественную стимуляцию пролиферации клеток в присутствии В-клеточного митогена (ЛПС) (р<0,05) (рис 10) Показатели пролиферации клеток ПБ

инкубируемых с КонА, были максимальными в группе животных, зараженных инвазивным и утратившим функцию токсинообразования штаммом в с1у8еп1епае1 8С501 (р<0,05). Уровень включения 3Н-тимидина (имп/мин)

КонА ЛПС Контроль

Рис 10 Пролиферация клеток ПБ мышей СБА, зараженных Э. с1у8еп(епае1 ■ ЭС500 (¡пуЧох*) ВЭС501 (¡тЛох-) В ЭС502 (¡пУЮх+) □ БСбОЗ (шуЧох*)

Предварительное введение мышам Ь.а^орМив нивелировало разрыв мехаду показателями пролиферации В- и Т-лимфоцитов клеток (р<0,05) (рис 11)

Уровень включения 3Н-тимидина (имп/мин)

КонА ЛПС Контроль

Рис 11. Пролиферация клеток ПБ мышей, зараженных S dysentenael SC500 на фоне предварительного введения L acidophilus Q] L acidophilus Кш24 д L.acidophilus NK1 н L acidophilus D4a Полученные данные свидетельствуют о способности ЛАБ поддерживать пролиферативную активность Т-клеточного звена иммунного ответа при развитии экспериментального шигеллезного процесса.

Устойчивая стимуляция факторов естественной резистентности макроорганизма, в том числе усиление функций фагоцитирующих клеток, продуцирующих ИЛИ 2, активация Тх1 лимфоцитов и ЕК-клеток, выработка ИФНу, являются механизмами иммуномодулирующей активности ЛАБ

ИФН действуют как эффекторные молекулы, предотвращая инвазию эукариотических клеток Кроме того, данный цитокин способствует выработке специфических иммуноглобулинов

Показано, что введение вирулентного штамма Э с1узеп(епае1 ЭС500 приводит к усилению продукции ИФН через 48 часов после заражения, что предполагает преимущественную индукцию ИФНу (рис.12).

Титр ИФН (1одг Ед/мл)

ш* 0

Часы

Рис 12 Продукция ИФН клетками ПБ мышей, зараженных Sdysentenael ■ Sdysentenael SC500 BBSdysenteriael SC501 □ Интактный контроль Э Контроль ИФНа (мыши, сенсибилизированные ВБН) В Контроль ИФНу (мыши, сенсибилизированные ФГА)

Предварительное введение ЛАБ мышам и последующее их заражение вирулентным штаммом SC500 вызывает рост титров ИФН в сыворотке крови и супернатантах клеток лимфоидных органов через 24 (рис 13) Титр ИФН (1одг Ед/мл)

24 часа 48 часов

Рис 13 Продукция ИФН клетками ПБ мышей СБА, зараженных Sdysentenael SC500 на фоне предварительного введения ЛАБ

И L fermentum 2998 ® plantarum 30 И l acidophilus NK1 П Интактный контроль В Контроль ИФНа (мыши, сенсибилизированные ВБН) Ш Контроль ИФНу (мыши, сенсибилизированные ФГА)

Эффект зависит от штамма ЛАБ Бактерии L fermentum 2998 индуцируют синтез интерферонов в наибольшей степени

Установлено, что исследуемые штаммы S dysentenael усиливают синтез ИФНа и ИФНу клетками ПБ, селезенки и тимуса в присутствии соответствующих индукторов в условиях in vitro (рис 14) Вирулентный штамм оказывает более выраженный стимулирующий эффект, в отличие от инвазивного и нетоксигенного мутанта SC501 А. Титр ИФН (log2 Ед/мл) Б Тиф ИФН (log2 Ед/мл)

6 часов 24 часа 48 часов 6 часов 24 часа 48 часов

Рис 14 Продукция ИФН клетками ПБ мышей СВА, зараженных S dysentenael SC500, при дополнительной стимуляции ВБН (А) и ФГА (Б) в условиях in vitro ■ S dysentenael SC500 Щ S dysentenael SC501 □ Интакгный контроль

Напротив, дополнительная стимуляция клеток лимфоидных органов мышей с предварительным введением ЛАБ и зараженных в последующем вирулентным штаммом SC500 в условиях in vitro не оказывает индуцирующего влияния на продукцию ИФНа и ИФНу, либо приводит к снижению титров ИФН (рис 15)

А Титр ИФН (log2 Ед/мл) Б Титр ИФН (log2 Ед/мл)

вез ВБН с ВБН бы ВБН с ВБН без ФГА с ФГА без ФГА с ФГА

24 часа 48 часов 24 часа 48 часов

Рис 15. Продукция ИФН клетками ПБ мышей, зараженных S.dysentenael SC500 на фоне предварительного введения ЛАБ, при дополнительной стимуляции ВБН (А) и ФГА (Б) в условиях in vitro ■ L fermentum 2998 S L plantarum 30 И L acidophilus NK1 □ Интакгный контроль

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что S dysenteriael стимулируют продукцию ИФНу Ключевая роль в данном процессе принадлежит инвазинам, что находит подтверждение при сравнительном анализе спектра активированных генов цитокинов мышей, зараженных исследуемыми штаммами шигелл Синтез мРНК ИФНу выявлен в группах животных с введением вирулентного штамма SC500 и инвазивного, но негоксигенного мутанта SC501 Инвазия эпителиальных клеток кишечника стимулирует также экспрессию генов ИЛ-12, опосредующего пролиферацию и дифференцировку клеток-продуцентов ИФНу

Усиление продукции ИФНа клетками лимфоидных органов мышей, зараженных S dysentenael SC500 и SC501, при дополнительной стимуляции ВБН обусловлено, вероятно, активацией клеток моноцитарно-макрофагального ряда и стимуляцией В-лимфоцитов бактериальными продуктами Ведущую роль в данном процессе играют ЛПС и Шига-токсин, но не инвазины Этим объясняется более выраженный эффект на продукцию цитокина, наблюдаемый при введении вирулентного штамма по сравнению с инвазивным вариантом, утратившим функцию токсинообразования Таким образом, стимуляция системы интерферонов, в первую очередь ИФНу,

является важным этапом формирования клеточного иммунного ответа при развитии первичной шигеллезной инфекции Тем не менее, отмечено, что индукция клеточно-опосредованного иммунитета носит непродолжительный характер и может супрессироваться продукцией антивоспалительных цитокинов ИЛ4 и ИЛ10

Полученные данные показывают, что предварительное введение ЛАБ мышам СБА и последующее их заражение вирулентным штаммом S dysenteriael SC500 приводит к усилению продукции ИФН клетками лимфоидных органов и росту титров сывороточного ИФН, по сравнению с аналогичными показателями при экспериментальной шигеллезной инфекции Динамика изменений титров ИФН зависит от штамма ЛАБ. Рост титров ИФН при шигеллезном инфекционном процессе у животных с предварительным введением ЛАБ отражает готовность организма к реакции на заражение При этом отмечено усиление выработки ИФНу, что предполагает способность ЛАБ костимулировать синтез данного цитокина и усиливать ИФНу-ответ при развертывании инфекционного процесса Кроме того, рост титров цитокина коррелирует с усилением пролиферации Т-лимфоцитов, наблюдаемой при заражении мышей вирулентным штаммом на фоне предварительного введения ЛАБ.

Дополнительная стимуляция клеток указанных органов ВБН и ФГА в условиях in vitro не оказывает индуцирующего влияния на продукцию ИФНа и ИФНу либо приводит к снижению титров ИФН Наблюдаемый эффект, вероятно, связан с развитием депрессии иммунореактивности иммунокомпетентных клеток в условиях избытка антигенов Механизмами данного процесса являются блокада антигенраспознающих структур и анергия зрелых эффекторных лимфоцитов

Таким образом, результаты проведенных исследований доказывают функциональное значение ЛАБ в системе иммунологического контроля гомеостаза макроорганизма Установлено усиление пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток лимфоидных органов, цитотоксических функций ЕК-клеток и регуляция миграционной активности макрофагов Проведенные целенаправленные, сравнительные исследования позволили получить фактические данные о механизмах взаимодействия исследуемых штаммов ЛАБ с макроорганизмом в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции Активация экспрессии генов провоспалительных цитокинов, индукция и костимуляция синтеза интерферонов и МИФ являются важными механизмами иммуномодулирующего влияния ЛАБ (табл.4).

Таблица 4. Модуляция лактобактериями факторов иммунитета

Факторы иммунитета

Штамм

ЬТеггаеШиш 2998

Ь.р1ап1агиш 811-АЗ

Ь.р1агНагит 30

Ь.р1а1«ашт 97

L.acidophilus Ж1

Ь.ас1(1ор1и1ш КЗ,,,24

Ь.аа<1орЫ1щ Б4а

Экспрессия

генов

цитокинов

ИФНа

ИФНу

ИЛ-ф

ИЛ4

ИЛ6

ИЛ10

ИЛ12

ИЛ18

ФНОа

+ + +

+ +

Пролиферация лимфоцитов

Т-

клетки

Ч!

-П

■п

в-

клетки

чп

-п

Цитотоксическая

Активность

ЕК-клеток

чп

Продукция интерферонов

ИФНа ИФНу

Выработка МИФ

чп

411

Примечание: «+» - стимуляция ^ - слабая, П" средняя, сильная, «-» - отсутствие й - штамм не использовался в эксперименте

стимуляции.

Полученные данные являются основой оценки и обоснования критериев иммунологической эффективности пробиотических препаратов и отбора потенциально пробиотических штаммов

ВЫВОДЫ

1 Лактобактерии вызывают различный по интенсивности и продолжительности, зависимый от штамма и дозы эффект, усиливая пролиферацию иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов и цитотоксическую активность ЕК-клеток

2 Установлено, что лактобактерии активируют экспрессию генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-6,12,18, ФНОа, ИФНа, ИФНу) клетками ПБ и индуцируют выработку ИФНа и ИФНу, а также являются костимуляторами продукции интерферонов в условиях in vitro

3 Впервые показано, что ЛАБ стимулируют продукцию фактора ингибиции миграции макрофагов (МИФ) иммунокомпетентными клетками ПБ и селезенки и его количественное увеличение в сыворотке крови мышей СВА

4 Впервые показана ведущая роль инвазивных свойств Shigella dysenteriael в стимуляции пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов, активации экспрессии генов противовоспалительных (ИЛ4 и 10) и провоспалительных (ИЛ-1|3, 6, 12, 18, ФНОа, ИФНу) цитокинов, индукции синтеза ИФНа и ИФНу

5 Впервые установлено, что при развитии экспериментальной шигеллезной инфекции предварительное пероральное введение ЛАБ поддерживает и усиливает Т-клеточное звено иммунного ответа, индуцирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов, но не ИЛ4 и 10, усиливает синтез ИФНа и ИФНу клетками ПБ, селезенки и тимуса мышей СВА

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Т Н Николаева, В. В. Зорина, В.М Бондаренко. Иммуномодулирующая активность бактерий рода Lactobacillus // Сборник материалов международной научно-практической конференции памяти Г.И Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». Москва, 2002 -С. 18.

2 Т Н Николаева, В В Зорина, В М Бондаренко Роль цитокинов в модуляции иммунореактивности макроорганизма кишечными бактериями рода Lactobacillus// ЖМЭИ- 2004 -№.6.-С.101-106.

3. В.В. Зорина, Т.Н. Николаева, В.М. Бондаренко. Модуляция клеток иммунной системы бактериями рода Lactobacillus //ЖМЭИ- 2004 -№ 6 -С 57-60.

4 В В Зорина, Т Н Николаева, А Н Наровлянский Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных// Иммунология - 2004.-Т.25 -№.5.-С.28&-290.

5 Т Н Николаева, В В Зорина, В М Бондаренко Иммуностимулирующая и антиканцерогенная активность нормальной микрофлоры кишечника // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология - 2004 -№.4 -С.39-43

6 Т Н. Николаева, В.М. Бондаренко, А.И Николаева, В В.Зорина, Г.Н. Коновалова Иммуномодулирующий эффект белковых фракций, выделенных из бифидобактерий //ЖМЭИ- 2004 -№ 2 -С 60-64

7 В.В. Зорина, Т.Н Николаева, А.Н Наровлянский. Влияние бактерий рода Lactobacillus на формирование цитокиновой сети макроорганизма // Сборник тезисов 111 Международной конференции молодых ученых России с международным участием. Москва, 2004.-С 106

8 В В. Зорина, Т Н Николаева Влияние представителей облигатной микрофлоры кишечника на клеточные иммунные реакции и экспрессию цитокинов в норме и при моделировании экспериментальной шигелпезной инфекции.// Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики Синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» Москва, 2004.-С.49

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 26.04.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 1,5 печ.л. Заказ № П 312

РНБ Русский фонд

2006-4 4983

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зорина, Виктория Владимировна

стр.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Экология бактерий рода Lactobacillus.

1.1. Классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus.

1.2. Локализация ЛАБ в организме человека.

1.3. Роль ЛАБ в регуляции состава микрофлоры.

1.3.1. Участие в обеспечении колонизационной резистентности.

1.3.2. Антагонистическая активность.

1.3.2.1. Продукция бактериоцинов.

1.3.2.2. Синтез антимикробных соединений небелковой природы.

Глава 2. Особенности строения и функционирования желудочнокишечного тракта.

2.1. Морфология слизистой оболочки тонкого кишечника.

2.2. Особенности строения иммунной системы ЖКТ.

2.2.1. Нелимфоидная составляющая иммунной системы.

2.2.2. Лимфоидные структуры слизистой оболочки ЖКТ.

2.2.2.1. Пейеровы бляшки.

2.2.2.2. М-клетки.

2.2.3. Эффекторная зона иммунной системы.

2.3. Особенности функционирования иммунной системы ЖКТ.

2.3.1. Феномен «физиологического воспаления».

2.3.2. Миграция иммунокомпетентных клеток.

2.3.3. Феномен оральной толерантности.

2.3.4. Апоптоз клеток иммунной системы ЖКТ.

Глава 3. Цитокины.

3.1. Функциональная характеристика отдельных цитокинов.

3.1.1. Интерлейкин-1.

3.1.2. Интерлейкин-4.

3.1.3. Интерлейкин-6.

3.1.4. Интерлейкин-10.

3.1.5. Интерлейкин-12.

3.1.6. Интерлейкин-18.

3.1.7. Фактор некроза опухолей.

3.1.8. Интерфероны.

3.1.9. Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов.

Глава 4. Влияние лактобактерий на гомеостаз макроорганизма.

4.1. Участие в поддержании баланса метаболических процессов.

4.2. Модуляция иммунных функций макроорганизма.

4.2.1. Участие в органогенезе вторичной лимфоидной ткани.

4.2.2. Влияние на факторы естественного иммунитета.

4.2.2.1. Модуляция активности фагоцитирующих клеток.

4.2.2.2. Активация функций ЕК-клеток.

4.2.3. Модуляция приобретенного иммунитета.

4.2.3.1. Влияние на пролиферацию лимфоцитов.

4.2.3.2. Влияние на синтез иммуноглобулинов.

4.2.4. Эффекты ЛАБ, оказываемые на цитокиновую сеть макроорганизма.

Глава 5. Лактобактерии — основа пробиотических препаратов.

5.1. Критерии для отбора пробиотических штаммов.

5.2. Клинические испытания пробиотических штаммов ЛАБ.

5.2.1. Использование пробиотических штаммов ЛАБ в терапии ротавирусных инфекций.

5.2.2. Использование пробиотических штаммов ЛАБ в профилактике и терапии диареи путешественников.

5.2.3. Использование пробиотических штаммов ЛАБ в профилактике и терапии антибиотик-ассоциированной диареи.

5.2.4. Использование пробиотических штаммов ЛАБ в профилактике нозокоминальных инфекций.

5.2.5. Использование пробиотических штаммов ЛАБ в профилактике и терапии системных инфекций и неспецифических воспалительных заболеваний ЖКТ.

5.2.6. Использование пробиотических штаммов ЛАБ при лечении аллергии.

5.2.7. Противоопухолевая активность ЛАБ.

5.3. Вакцины на основе лактобактерий.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 6. Материалы и методы.

6.1. Клеточные линии.

6.2. Животные.

6.3. Антигенные препараты.

6.4. Вирусы.

6.5. Бактерии.

6.6. Клеточные суспензии.

6.7. Метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

6.8. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

6.9. Определение интерферонов в сыворотке крови и супернатантах клеток лимфоидиых органов экспериментальных животных.

6.10. Определение МИФ в реакции торможения миграции макрофагов (РТММ) in vitro.

6.11. Метод определения цитотоксической активности ЕК-клеток.

6.12. Статистическая обработка результатов.

Глава 7. Результаты исследований.

7.1. Влияние бактерий рода Lactobacillus на экспрессию генов цитокинов клеток пейеровых бляшек мышей СВА.

7.2. Влияние бактерий рода Lactobacillus на пролиферативную активность клеток лимфоидных органов мышей СВА.

7.3. Влияние бактерий рода Lactobacillus на активность естественных киллеров.

7.4. Влияние л акто бактерий на миграционную активность макрофагов.

7.5. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию интерферонов клетками лимфоидных органов экспериментальных животных.

Глава 8. Развитие экспериментальной шигеллезной инфекции на фоне предварительного введения ЛАБ.

8.1. Сравнительный анализ экспрессии генов цитокинов пейеровых бляшек мышей СВА при экспериментальной шигеллезной инфекции и на фоне предварительного перорального введения лактобактерий.

8.2. Сравнительный анализ пролиферативной активности клеток пейеровых бляшек мышей СВА при экспериментальной шигеллезной инфекции и на фоне предварительного перорального введения L.acidophilus.

8.3. Влияние заражения экспериментальных животных вирулентным штаммом S.dysenteriae 1 SC500 на миграцию макрофагов.

8.4. Изучение продукции ИФН клетками лимфоидных органов мышей СВА при экспериментальной шигеллезной инфекции и на фоне предварительного перорального введения ЛАБ.

ЧАСТЬ III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции"

Актуальность проблемы

Облигатная микрофлора желудочно-кишечного тракта , является важнейшим компонентом микробного биоценоза кишечника и принимает непосредственное участие в регуляции физиологических процессов (пищеварение, обмен веществ), направленных на поддержание гомеостаза макроорганизма. Ведущими представителями индигенной микрофлоры человека являются бактерии рода Lactobacillus, обладающие широким спектром антимикробной активности. Они участвуют в формировании экосистемы кишечника, обеспечивая колонизационную резистентность. Антагонистическая активность лактобактерий (ЛАБ) обусловлена способностью подавлять пенетрацию и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также их метаболизм путем продукции биологически активных веществ белковой и небелковой природы и конкурентного связывания поверхностных рецепторов эпителиальных клеток [6,62,67,71,83,88,118,251].

Важнейшей функцией ЛАБ является участие в формировании местной и системной иммунной резистентности макроорганизма, что связано с их универсальными иммуномодулирующими свойствами. Ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника лактобактерии взаимодействуют с М-клетками пейеровых бляшек, эпителиальными и иммунокомпетентными клетками. В результате процессинга и презентации специфических клеточных компонентов, лактобактерии стимулируют иммунную систему, активируя механизмы клеточно-опосредованного и гуморального иммунного ответов, функции ретикуло-эндотелиальной системы кишечного тракта и продукцию ряда цитокинов. ЛАБ стимулируют пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток, приводят к увеличению числа плазматических клеток и индукции выработки иммуноглобулинов на местном и системном уровнях [74,104,120,165,193].

Кроме того, представители рода Lactobacillus проявляют антиканцерогенную активность, усиливая цитотоксические функции Т-лимфоцитов, макрофагов и естественных киллеров (ЕК). Установлена стимуляция ЛАБ гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и участие в развитие феномена «оральной толерантности» к пищевым антигенам [73,98,186,187].

Однако, вопросы, связанные с ролью лактобактерий в формировании Т- и В-клсточного звеньев иммунитета, продукции цитокинов, обеспечивающих баланс между гуморальным и клеточно-опосредованным типами иммунного ответа требуют глубокого изучения, так как являются фундаментальными в определении комплексных связей между макроорганизмом и его интестинальной микрофлорой. Актуальность этих исследований обусловлена 1 широким использованием препаратов на основе лактобактерий для профилактики и лечения острых кишечных инфекций, дисбактериозов, иммунодефицитных состояний. Полученные данные являются основой оценки и обоснования критериев иммунологической эффективности пробиотических препаратов и отбора потенциально пробиотических штаммов.

Цель работы:

Изучить влияние бактерий рода Lactobacillus на клеточные факторы иммунитета и продукцию цитокинов экспериментальных животных в норме и при моделировании шигеллезной инфекции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние живых микробных клеток бактерий рода Lactobacillus на функциональную активность иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов, ЕК-клеток селезенки и пейеровых бляшек (ПБ) экспериментальных животных.

2. Провести сравнительный анализ спектра экспрессированных генов цитокинов в клетках пейеровых бляшек экспериментальных животных при пероральном введении бактерий рода Lactobacillus.

3. Изучить влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию интерферонов (ИФН) и фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (МИФ), клетками ПБ, селезенки и тимуса экспериментальных животных.

4. Изучить роль инвазивных свойств Shigella dysenteriael в развитии клеточного иммунного ответа и индукции цитокиновой сети экспериментальных животных.

Научная новизна и практическая значимость работы

Установлено, что лактобактерии активируют экспрессию генов провоспалительных цитокинов (ИЛ 6,12,18, ФНОа, ИФН а и ИФНу) клетками ПБ.

Показано, что исследуемые ЛАБ стимулируют рост титров сывороточного ИФН, индуцируют выработку ИФНа и ИФНу клетками ПБ, селезенки и тимуса, а также являются костимуляторами продукции интерфернов.

Впервые показана ведущая роль инвазивных свойств Shigella dysenteriael в стимуляции пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов, активации экспрессии генов противовоспалительных (ИЛ4 и 10) и прововоспалительных (ИЛ-1р,6,12Д8,ФНОа и ИФНу) цитокинов, а также индукции синтеза ИФНа и ИФНу.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о существовании системы взаимодействий между макроорганизмом и его индигенной микрофлорой, направленной на поддержание динамического равновесия. Полученные данные являются основой оценки иммуно-модулирующей эффективности ЛАБ при создании пробиотических, вакцинных препаратов для профилактической биокоррекции и применения их в комплексной схеме лечения кишечных инфекций.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зорина, Виктория Владимировна

выводы

1. Лактобактерии вызывают различный по интенсивности и продолжительности, зависимый от штамма и дозы эффект, усиливая пролиферацию иммунокомпетентных Т- и В-лимфоцитов и цитотоксическую активность ЕК-клеток.

2. Установлено, что лактобактерии активируют экспрессию генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-6,12,18, ФНОа, ИФНа, ИФНу) клетками ПБ и индуцируют выработку ИФНа и ИФНу, а также являются костимуляторами продукции интерферонов в условиях in vitro.

3. Впервые показано, что ЛАБ стимулируют продукцию фактора ингибиции миграции макрофагов (МИФ) иммунокомпетентными клетками ПБ и селезенки и его количественное увеличение в сыворотке крови мышей СВА.

4. Впервые показана ведущая роль инвазивных свойств Shigella dysenteriael в стимуляции пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов, активации экспрессии генов противовоспалительных (ИЛ4 и 10) и провоспалительных (ИЛ-1(3, 6, 12, 18, ФНОа, ИФНу) цитокинов, а также индукции синтеза ИФНа и ИФНу.

5. Впервые установлено, что при развитии экспериментальной шигеллезной инфекции предварительное пероральное введение ЛАБ поддерживает и усиливает Т-клеточное звено иммунного ответа, индуцирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов, но не ИЛ4 и 10, усиливает синтез ИФНа и ИФНу клетками ПБ, селезенки и тимуса мышей СВА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зорина, Виктория Владимировна, Москва

1. Алмагамбетов К.Х., Горская Е.М.,Бондаренко В.М. Транслокация кишечной микрофлоры и ее механизмы //Ж.микробиол.-1991.-№10.-С.73-78.

2. Баженов Л.Г., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. Изучение антагонистического действия лактобацилл на Helicobacter pylori.// Ж.Микробиол.-1997.-КЗ.-С.89-91.

3. Бельмер С.В., Симбирцев А.С., Головенко О.В,.Бубнова Л.В., Карпина Л.М., Щиголева Н.Е., Михайлова Т.Л.Значение цитокинов в патогенезе воспалительных заболеваний толстой кишки у детей.// РМЖ.-2003.-Т.11.-N.3.-C.116-119.

4. Бельмер С.В. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника.//РМЖ 2004.-T.12.-N.3.-C. 148-152.

5. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Бондаренко В.М., Лихачева А.Ю. Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus.// Ж.микробиол.- 1995.-№4.-С. 19-23.

6. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков.//Ж.микробиол.- 1998.-№5.- С.107-112.

7. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Современные представления о молекулярно-биологических основах патогенеза шигеллезов.// Ж.Микробиол. 1998.-N.6.-C.88-92.

8. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Шигеллезы : теория и практика.-М.,2002.-172.

9. Бондаренко В.М. Классификация бактерий рода Lactobacillus // Marep.Vl 11 Всерос. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002.-Т.2.-С.140.

10. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции.// Ж.Микробиол. 1999.-N.6.-С. 102-105.

11. Грачева Н.М., Ющук Н.Д. Чупринина Р.П. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов. Пособие для врачей и студентов.-М.,1999.-44с.

12. Григорян С.С., Майоров И.А., Иванова A.M., Ершов Ф.И. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. // Вопросы вирусологии.-1984.-Т.ЗЗ.-С.433-436.

13. Горская Е.М., Лихачева А.Ю., Горелов А.В., Бондаренко В.М., Касумова С.А. Связывание лактобацилл с некоторыми растворимыми белками и лектинами //Ж.микробиол.-1994.-№1.- С. 11-14.

14. Горская Е.М., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Горелов А.В. Адгезивные свойства бактерий кишечного происхождения.//Ж.Микробтол. 1991.-N.10.-C.5-8.

15. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология.-М.:Академия, 2003.-462с.

16. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов.Под ред.Воробьева А.А.-М.: «КМК Лтд».,1998.-64с.

17. Дьяченко А.Г., Липовская В.В., Дьяченко П.А. Особенности иммунного ответа при острых кишечных инфекциях, вызванных патогенными энтеробактериями.// Ж.Микробиол.-2001.- N.5.-C108-113.

18. Ершов Ф.И. Система интерферонов в норме и при патологии.-М. :Москва, 1996-240с.

19. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях.// Цитокины и воспаление.-2004.-T.3.-N. 1 .-С.3-6.

20. Карсонова М.И., Андронова Т.М., Пинегин Б.В. и др. Иммуностимулирующая активность мурамилдипептида и его производных.//Ж.микробиол. 1999.-N.3.-C.104-110.

21. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры.// РМЖ.-2000.-Т.8.-ШЗ-14.-С.572-576.

22. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета // Иммунология,- 1995.-№ 3.-С.30-44.

23. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология.- 2002.-N2.- С.77-80.

24. Козинец Г.И., Высоцкий В.В., Погорелов В.М. Кровь и инфекция.-М.:Триада-фарм, 2001.-456 с.

25. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология. Иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов.- 2-е изд., испр.-СПб.:Спец.Лит,2000.-592с.:ил.

26. Коршунов В.М., Володин В.В., Ефимов Б.А. Дисбактериозы кишечника.// Детская больница.-2000.-№.1.-С.66-74.

27. Котельникова Е.А., Гельфанд М.С.Выработка бактериоцинов грам-положительными бактериями и механизмы транскрипционной регуляции. // Генетика.-2002.-Т.38.-№6.- С.758-772.

28. Кузьмина Е.Г., Ярилин А.А.,Байсоголов Г.Д. Связь супрессирующего и активирующего эффектов конканавалина А с некоторыми характеристиками Т-лимфоцигов в норме и при лимфогранулематозе.//Иммунология.-1987.-№2.-С.66-68.

29. Лимфоциты: Методы: Пер.с англ.// Под ред. Дж.Клауса.-М.: Мир, 1990.

30. Лихачева А.Ю. Биологические свойства лактобацилл и тест-системы для их идентификации. Автореферат диссерт. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук. Нижн.Новгород.-1992.- С.21

31. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей. /Ж.микробиол. 1996.-N.2.-C.88-91

32. Мальцева Н.Н., Шкарупета М.М., Пинегин Б.В., Коршунов В.М. Иммуномодулирующие свойства некоторых микробов -представителей нормальной микрофлоры кишечника.//Антибиотики и химиотерапия.-1992.-№12.-С.41-43.

33. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги.-М.:Мир,1999.-558с.:ил.

34. Мухина Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей./ РМЖ.-1999.-Т.7.-К11.-С.1-4

35. Мяделец О.Д.Основы частной гистологии. М.: Медицининская книга, Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2002.-374.

36. Николаева Т.Н., Бондаренко В.М. Иммуномодулирующая активность штаммов Shigella dysenteriae 1, различающихся по способности к инвазии и продукции Шига-токсина.//Ж.микробиол.- 1995.-№6,- С.57-58.

37. Николаева Т.Н., Бондаренко В.М., Пронин А.В. Роль токсинообразования Shigella dysenteriae на различных этапах формирования клеточного иммунного ответа экспериментальных животных.// Ж.микробиол.- 1997.-№2.-С.6-10.

38. Николаева Т.Н. Роль факторов патогенности шигелл и сальмонелл в развитии клеточного иммунного ответа при экспериментальном инфекционном и вакцинальном процессах. Автореферат диссерт. на соиск. учен. степ. докт. мед. наук. Москва-1998.- С.40.

39. Николаев А.Я. Биологическая химия.- М.: Медицинское информационное агенство, 2001.-496 с.:ил.

40. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1. Пер.с англ.//Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Снита, Дж. Стейли, С.Уильямса.-М.:Мир, 1997.-432с.,ил.

41. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.2. Пер.с англ.// Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П.Снита, Дж. Стейли, С.Уильямса.-М.:Мир, 1997.-368с., ил

42. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Основные свойства дендритных клеток // Иммунология.-2001.-N.4.-C. 7-16.

43. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Роль дендритных клеток в регуляции иммунного ответа. //Иммунология.-2002.-N.5.-С.313-321.

44. Поздеев O.K. Медицинская микробиология // Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского.-М.:ГЭОТАР-МЕД,2001.-768 с.:ил.

45. Покровский В.И., Ющук Н.Д. Бактериальная дизентерия.- М.: Медицина., 1994.-256 с.

46. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами.//Иммунология.-2002.-Т.23.-К4.-С.237-243.

47. Практическая вирусология. Пер. с нем.Богаутдинова З.Ф и Лансберга. Я.С. //Под ред. В.Н. Сюрина.М.: Колос, 1970.-352 с

48. Пронин А.В. Митогенные факторы микроорганизмов и их роль в развитии противоинфекционного иммунитета.//Автореферат дис.докт. биол. наук.М., 1990.-С.48.

49. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ.-М.: Мир, 2000.-592 с.

50. Рыкова М.П., Спиранде И.В., Зедгенидзе М.С., Ляхов В.В., Фукс Б.Б. Новая высокочувствительная техника тестирования нормальных киллеров.// Иммунология.-1981 .-N.3.-C.88-90.

51. Селедцов В.И.б Суслов А.П. Раннее антигензависимое регуляторное влияние Т-лимфоцитов на макрофаги.// Иммунология.-1988.-М.5.-С. 19-23.

52. Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т., Коронцвит Т.А. Скрининговый тест клеточной миграции из микрокультур in vitro.// Иммунология.-1989.-N.2.-C.73-76.

53. Таболин В.А., Яковлев М.Ю., Ильина А.Я., Лиходед В.Г.,Лазарева С.И. Патогенетические механизмы и клинические аспекты действия термостабильного эндотоксина кишечной микрофлоры.// РМЖ 2003.-T.il.-N3.-C.126-129.

54. Федоров Н.А.,Сухомов Ю.С., Асади Мобархан А.Х.,Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).- Методическое пособие для начинающих // Принципы и практические рекомендации для ее постановки с целью детокции микроорганизмов.М.,1996.-ЗЗс.

55. Фрейдлин И.С. Диагностическая и прогностическая значимость иммуноцитокиновых тестов // Клиническая иммунология.- 1995.- №1.- С. 8186.

56. Фрейдлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети//Иммунология.- 1995.-№1,- С. 44-48.

57. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции.// Иммунология.-2001.- N.5.-C.4-7.

58. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет.// РМЖ -2003.-T.11.-N.3. -С.122-126.

59. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. экологическая иммунология.-М.: Изд-во ВНИРО, 1995.-219.

60. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта : особенности строения и функционирования в норме и при патологии. //Иммунология.-1997.-№5.-С.4-7.

61. Хаитов P.M., Игнатьева Т.А., Сидорович И.Г. Иммунология : Учебник.-М.: Медицина, 2000.-432 с.

62. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии.// Иммунология.-2001 .-N.4.-C.4-7.

63. Хорошилова Н.В. Иммунотерапевтические аспекты применения пробиотиков в клинической практике.//Лечащий врач.- 2003.-N.2.-C. 12-15.

64. Цой И.Г.,Сатаров А.С., Тимофеева И.К., Джумагулова А.Б., Булегенова М.Г., Сексенбаев Б.Д.//Ж.микробиол.- 1994.-№6.-С.112-113.

65. Шахмарданов М.З. Нарушение микрофлоры кишечника и функциональное состояние лимфоцитов у больных шигеллезом.// Эпидемиология и инфекционные болезни.-1999.-Ыг.1.-С.35-38.

66. Шахмарданов М.З., Лучшев В.И., Пирцхалаишвили Г.Г. Применение пробиотиков в комплексном лечении больных шигеллезом Флекснера.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000.-N6.-C.44-46.

67. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Функциональное питание и пробиотики: микроэкологические аспекты.-М.: Агар, 1997.-24с.

68. Ярилин А. А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при паталогии //Иммунология.-1997.-№ 5.-С.7-14.

69. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник.-М.:Медицина, 1999.608 с.:ил.

70. Aattour N., Bouras М., Tome D., Marcos A, Lemonnier D. Oral ingestion of lactic acid bacteria by rats increases lymphocyte proliferation and interferon -gamma production. // Br J Nutr.- 2002.-Vol.87.- N.4. P.367-373.

71. Ashwood P., Harvey R., Verjee Т., Wolstencroft R., Thompson RP., Powell JJ. Fuctional interactions between mucosal IL-1, IL-lra and TGF-beta 1 in ulcerative colitis.//Inflamm Res.-2004.-Vol.53.-N.2.-P.53-59.

72. Asseman C., Mauze S., Leach M., Coffman R., Powrie F. An essential role for Interlukin 10 in the function of regulatory T cell that inhibit intestinal inflamantion // JEM 1999.-Vol.190.- N.7.- P.995-1004

73. Athie-Morales V., Smits HH., Cantrell D., Hilkens CMU. Sustained IL-12 signaling is required for Thl development.// J Immunol.-2004.-Vol. 172.-N.I.-P.61-69.

74. Bagchi AK, Sinha AK. Role of 57 kDa major antigenic component of Shigella dysenteriae outer membrane proteins in induction of major histocompatibility complex II-restricted T-cell response.// Arch Med Res.- 2004.-Vol.35.-N.5.-P.427-434

75. Balkwill F.R. Cytokines. A practical approach.// IRL PRESS. Oxford.-1995.

76. Baugh J.A., Donelly S.C. Macrophage migration inhibitory factor: a neuroendocrine modulator of cronic inflammation // J. Endocrinol.-2003.-Vol.179.-N.l. -P.15-23.

77. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora // Gut -1998. Vol. 42.- N.l. -P. 2-7

78. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber, and probiotic bacteria //Nutrition.-1998.- Vol.l4.-N.7-8.-P.585-594.

79. Bergogne-Berezin E. Tretment and preventation of antibiotic associated diarrhea.// Int J Antimicrob Agents.-2000.- Vol.l6.-N.4.-P.512-516

80. Bevins CL., Martin-Porter E., Ganz T. Defensins and innate host defence of gastrointestinal tract // Gut.- 1999.-Vol.45.- N.6.-P.911-915.

81. Bezkorovainy A. Probiotics: determinants of survival and growth in the gut.//AJCN.-2001.-Vol.73.-N2.-P.399-405

82. Biet F., Locht C., Kremmer L. Immunoregulatory functions of interlukin 18 and its role in defense against bacterial pathogens. // J Mol Med. 2002.-Vol.80.-N.3.- P. 147-162.

83. Biswas T. Role of porin of Shigella dysenteriae type 1 in modulation of lipopolysaccharide mediated nitric oxide and interleukin-1 release by murine peritoneal macrophages. // FEMS Immunol Med Microbiol.-2000.-Vol.29.- N.2. -P.129-136.

84. Bloom P.D., Boedeker E.C. Mucosal immune responses to intestinal bacterial pathogens // Semin Gastrointest Dis.-1996.-Vol.7.- N.3.-P. 151-166

85. Bourdi M., Reilly T.P., Elkahloun A.G., George JW, Pohl LR. Macrophage migration inhibitory factor in drug-induced liver injury: a role in susceptibility and stress responsiveness.// Biohem Biophys Res Commum. 2002.-Vol.294. - N.2. - P.225-230.

86. Bozza M., Satoskar A., Lin G., Lu В., Humbles A., Gerard C., David J. Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis// JEM- 1999.- Vol. 189.- N. 2. -P. 341-346

87. Brandtzaeg P., Farstad IN., Haraldsen G. Jahnsen FL Cellular and molecullar mechanisms of induction of mucosal immunity./ Dev Biol Stand. -1998- N.92.-P. 93-108.

88. Brandtzaeg P, Farstad IN, Haraldsen G. Regional specialization in the mucosal immune system: primed cells do not always home along the same track // Immunol.Today.-1999.-Vol.20.-N.6.-P.267-277

89. Byrne A, Reen D.J. Llipopolysaccharide induces rapid production of IL-10 by monocytes in the presence of apoptotic neutrophils // J Immunol. 2002.-Vol. 168.-N.5. - P. 1968-1977.

90. Calandra Т., Spiegel L., Metz C., Bucala R. Macrophage migration inhibitory factor is a critical mediator of the activation of immune cells by exotoxins of Gram-positive bacteria // PNAS- 1998.- Vol.95.- Issue 19.- P. 1138311388

91. Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor and host innate immune responses to microbes // Scand J Infect. Dis.-2003.-Vol.35.-N.9.-P.573-576.

92. Calandra Т., Froidevaux C., Martin C., Roger T. Macrophage migration inhibitory factor and host innate immune defenses against bacterial sepsis // J. Infect. Dis. 2003. - Vol.187. - N.12. - P.385-390.

93. Calandra Т., Roger T. Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of innate immunity.// Nat. Rev. Immunol. 2003.-N.3. - P.791-800

94. Chakrabarti S., Sinha A.K. Release of interlukin-2 induced by a major antigenic outer membrane protein of Shigella dysenteriae 1 in natural infection // Microbios. -1997.-Vol.92.- N.371.-P.123-132

95. Chen Т., Toivanen P., Vainio O. Suppression of antigin-specific lymphocyte proliferation by Gram-positive bacterial cell wall // APMIS 2002 -Vol.110 - N.6.-P.490-498

96. Chen L, Tsang LL, Ho LS. Modulation of human enteric epithelial barrier and ion transport function by Peyer's patch lymphocytes //World J Gastroenterol-2004-Vol.10.-N.ll.-P. 1594-1599

97. Cheng X., Lopez D. CD4+ , but not CD 8+, T cells from mammary tumor-bearing mice have a down-regulated production of IFN-y: role of phosphatidyl serine // J.Immunol.-1998 Vol. 160 - N.6. - P.2735 - 2741

98. Chomczynski, P., N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.// Anal Biochem.-1987.-Vol. 162.-N. 1 .-P. 156-159.

99. Coffman R., Weid T. Myltiple pathways for the initiation of T helper 2 (Th2) responses //JEM -1997.- Vol.185. -N.3.- P.373-376

100. Cross M. Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial phathogens // FEMS 2002.- Vol.34.- N.4.- P.245-253.

101. Cunliffe RN., Mahida YR. Antimicrobial peptides in innate intestinal host defence.// Gut.- 2000.-Vol.47.- N.I.- P. 16-17.

102. Delassus S., Coutinho GC, Saucier C., Darche S, Kourilsky P. Differential cytokine expression in maternal blood and placenta during murine gestation //J Immunol -1994.-Vol.l52.-N.5.-P. 2411-2420.

103. Didierlaurent A., Sirard JC., Kraehenbuhl JP., Neutra MR. How the gut senses its content // Cell Microbiol.-2002.-Vol.4.-N.2.-P.61-72

104. Dieleman L.A., Goerres M., Sprengers D., Torrice C., Hoentjen F., Grenther W., Sartor R. Lactobacillus GG prevents recurrence of colitis in HLA-B27 transgenic rats after antibiotic treatment // Gut.-2003.-Vol 52.- N.3 .-P.370-376

105. Dorner В., Scheffold A., Rolph M., Huser M., Kaufman S., Radbruch A., Flesch I., Kroczek R. MlP-la, MIP-ip, RANTES, and ATAC/lymphotactin function together with IFN-y as type 1 cytokines // PNAS 2002.-Vol.99.- N.9.- P. 6181-6186

106. Earle W.R. The morphologic stability of six strains of malignant mouse fibroblasts growing in vitro // Cancer Res. 1947.-Vol.7.-N.l 1.-P.727-728.

107. Ericson K.L., Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and disease.// J.Nutr.-2000.-Vol. 130.-N.2.-P.403-409

108. Fellermann K., Stange EF. Defensins innate immunity at the epithelial frontier.//Eur J Gastroenterol Hepatol.- 2001.-Vol.l3.-N.7.-P.771-776.

109. Felley C, Michetti P. Probiotics and Helicobacter pylori / Best Pract Res Clin Gastroenterol.-2003-Vol.17- N.5-P.785-791.

110. Felten A., Barreau C., Bizet C., Lagrance P., Philippon A. Lactobacillus species identification, H202 production, and antibiotic resistance and corellation with human clinical status // J.Clin.Microbiol.-1999.-Vol.37.-N.3.-P.729-733

111. Finkelman FD, Svetic A, Gresser I, Snapper C, Holmes J, Trotta PP, Katona IM, Gause WC. Regulation by interferon alpha of immunoglobulin isotype selection and lymphokine production in mice // J. Exp. Med. -1991.- Vol. 174.-N. 5.-P.1179-1188.

112. Fontaine A., Arondel J., Sansonetti P. Role of Shiga toxin in the pathogenesis of bacillary dysentery, studied by using a Tox" mutant of Shigella dysenteriae 1 // Infect. Immune-1988 Vol.56.- N. 12.- P. 3099-3109

113. Fontaine A., Arondel J., Sansonetti P.J. Constraction of evaluation of live attenuated vaccine strains of Shigella flexneri and Shigella dysenteriae 1.// Res.Microbiol.-1990.-Vol. 141 .-P.907-912

114. Freter R. Experimental enterie Shigella and Vibrio infections in mice and guinea pigs // J. Exp. Med. 1956.-Vol.l04.-N.3.-P.411-418

115. Furrie E., Macfarlane S., Cummings JH. et al. Systemic antibodies towards mucosal bacteria in ulserative colitis and Crohn's disease differentially activate the innate immune response. // Gut.- 2004.-Vol. 53.-N.1.- P.91-98

116. Ganzle M., Holtzel A., Walter J., Jung G, Hammes WP. Chahracterization of reytericyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH2584 // Appl.Environ. Microbiol. -2000.-Vol.66.-N. 10.-P. 4325-4333

117. Gelder C.M., Thomas P.S., Yates D.H. Cytokine expression in normal, atopic, and asthmatic subject using the combination of sputum induction and the polimerase chain reaction // Thorax.-1995.-N.50.-P. 1033-1037

118. Gill HS, Rutherfurd KJ, Prasad J, Gopal PK. Enhancement of natural and acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus (HN017) and Bifidobacterium lactis (HN019).// Br J Nutr.- 2000.-Vol. 83. -N. 2. -P. 167-176.

119. Godfrey DI, Kennedy J., Gately MK., Hakimi J, Hubbard BR, Zlotnik A. IL-12 influences intrathymic T cell development //J Immunol-1994.-Vol. 152-N.6.-P. 2729-2735

120. Golovkina Т., Shlomchik M., Hannum L., Chervonsky A. Organogenic Role of В Lymphocytes in Mucosal Immunity // Science -1999.- Vol 286,- Issue 5446.-P. 1965-1968

121. Gransette C., Muller-Alouf H., Hols P., Goudercourt D, Delcour J, Turneer M, Mercenier A. Enhanced mucosal delivery of antigen with cell wall mutant // Infect.Immun. 2004.-Vol.72.- N.5.- P.2731-2737

122. Gutierrez R., Santos V., Nader-Macias M.E. Protective effect of intranasally inoculated Lactobacillus fermentum against Streptococcus pneumoniae challenge on the mouse respiratory tract // FEMS Immunol Med Microbiol.- 2001.- Vol.31.- N.3.-P. 187-195

123. Haller D., Blum S., Bode C., Hammes W., Schiffrin E.J. Activation of human peripherial blood mononuclear cells by nonpathogenic bacteria in vitro: evidance of NK cells as primary targets // IAI 2002.-Vol.68. -N.2.- P.752-759

124. Haller D., Serrant P., Granato D., Schiffrin E.J., Blum S. Activation of human NK cells by Staphilococci and Lactobacilli requires cell contact-dependent costimulation by autologus monocytes // CDLI 2002.- Vol.9.- N.3.- P.649-657

125. Hashimoto Y., Sudo M. Evaluation of cell demage in immune reactions by release of radioactivity from 3H-uridine labelled cells // Genn.-1971.- Vol.62.-N.2.-P. 139-143

126. Hathaway LJ, Griffin GE, Sansonetti PJ, Edgeworth JD. Human monocytes kill Shigella flexneri but then die by apoptosis associated with suppression of proinflammatory cytokine production.// Infect Immun.- 2002.-Vol.70.-N.7.-P.3 833-42

127. He F., Tuomola E., Arvilommi H., Salminen S. Modulation of humoral immune response through probiotic intake // FEMS Immunol Med Microbiol.-2000.- Vol.29.- N.I.- P.47-52

128. Henderson В., Poole S., Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulance factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis //Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 1996.-Vol.60.-N.2.-P.316-41

129. Heyman M. Effect of lactic acid bacteria on diarrheal diseases // J Am Coll Nutr 2000.-Vol.l9.-N.2.-P. 137-146

130. Hikawa N., Ishikawa Y., Takenaka T. Interlukin-12 p40-homodimer production in sensory dorsal root ganglion neuros.//Neuroscience.-2004.-Vol.l29.-N.1.-P.75-83.

131. Hikosaka S, Нага I, Miyake H, Нага S, Kamidono S. Antitumor effect of simultaneous transfer of interlukin-12 and interlukin-18 genes and its mechanism in a mouse bladder cancer model // Int J Urol.-2004.-VoU 1.-N.8.-P.647-652

132. Holzapfler W., Haberer P., Geisen R., Bjorkroth J., Schillenger U. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition // AJCN 2001.- Vol.73.- N.2.- P.365-373

133. Hughes AK, Stricklett PK, Kohan DE. Shiga toxin-1 regulation of cytokine production by human glomerular epithelial cells.// Nephron.-2001,-Vol.88.-N. 1.-P. 14-23

134. Hurley В., Thorpe M., Acheson D. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration // Infection and Immunity- 2001.-Vol. 69.-N.10.-P. 6148-6155

135. Ischibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety //Am J Clin Nutr.-2001-Vol.73- N.2.-P.465-470

136. Isolauri E., Sutas Y., Kankaanpaa P., Arvilommi H., Salminen S. Probiotics: effects on immunity.// AJCN 2001.- Vol. 73.-N.2.- P.444-450

137. Iwasaki A., Kelsall BL. Freshly isolated Peyer's patch, but not spleen, dendritic cells produce interlukin 10 and induce the differentiation of T helper type 2 cells.// J Exp Med.-Vol. 190.-N.2.- P.229-240

138. Jack R., Tagg J., Ray B. Bacteriocins of Gram-positive bacteria // Microbiol. Rev.- 1995 Vol.59.- N.2. - P. 171-200

139. Ji X., Yao Т., Qin J., Wang S.,Wang H., Yao K. Interaction between M-CSF and IL-10 on productions of IL-12 and IL-18 and expressions of CD 14, CD23, CD64 by human monocytes.// Acta Pharmacol Sin.-2004.-N.10.-P.1361-1365.

140. Joosten L.A., Smeets R.L., Koenders M.I. Interlukin-18 promotes joint inflammation and induces interleukin-1-driven cartilage destruction // Am I Pathol. 2004.- Vol.l65.-N.3.-P.959-67

141. Jump R., Levine A. Murine Peyer's patches favor development of an IL-10 secreting, regulatory T cell population // The JI 2002.- Vol.168.- N.12.-P.6113-6119

142. Juntunen M., Kiijavaninen P.V., Ouwehand A.C., Salminen S.J., Isolauri E. Adherence of probiotic bacteria to human intestinal mucus in healthy infants and during rotavirus infection // CDLI.- 2001.- Vol.8.- N.2.- P.293-296

143. Kailasapathy K., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.//Immunol Cell Biol.-2000.-Vol.78.-N.l.-P. 80-88

144. Kawakami K., Qureshi M.H., Zhang T. Okamura H, Kurimoto M, Saito A. IL-18 protects mice against pulmonary and disseminated infection with Cryptococcus neoformans by inducing IFN-gamma production // J Imimmol-1997.-Vol.159.-N.ll.-P. 5528-5534

145. King AE.,Critchley H., Kelly RW. Innate immune defences in the human ehdometrium // Reprod Biol Endocrinol.- 2003.-Vol. 1 .-N. 1 .-P. 116-124.

146. Kinoshita M., Seki S., Ono S., Shinomiya N, Hiraide H. Paradoxical effect of IL-18 therapy on the severe and mild Escherichia coli infections in burn-injured mice // Ann Surg.-2004.-Vol.240.-N.2.-P.313-20

147. Kirjavainen P., El Nezami H., Salminen S., Ahokas J., Wright F. Effects of oraly administered viable Lactobacillus rhamnosus JS on mouse limphocyte proliferation // Ckinical and Diagnostic Laboratory Immunology -1999.- Vol.6.- N.6.- P.799-802

148. Kishimoto Т., Akira S., Narazaki M., Taga T. Interlukin-6 family of cytokines and gpl30.//Blood.-1995.-Vol.86.-N.4.-P. 1243-1254

149. Юеетапп R., Hans Rorsman H., Rosengren E., Mischke R., Nguyen M., Bernhagen J. Dissection of the enzymatic and immunologic functions of macrophage migration inhibitory factor // Eur. J. Biochem. 2000.- Vol.267.-N.24.-P. 7183-7193

150. Kossodo S., Grau GE. Profiles of cytokine production in relation with susceptibility to cerebral malaria // J Immunol- 1993.-Vol. 151.-N.9.-P.4811-4820

151. LafontF., Nhieu Т., Hanada K., Sansonetti P., Goot F. Initial steps of Shigella infection depend on the cholesterol/sphingolipid raft-mediated CD44-IpaB interaction // The EMBO Journal 2002- Vol.21 .-N. 17.- P.4449-4457

152. Laiho K., Hoppu U., Ouwehand A.C., Salminen S, Isolauri E. Probiotics: on-going research on atopic individuals // Br.J.Nutr.-2002.-Vol.88.-N.1.-P.19-27

153. Lee JW., Shin JG., Kim EH., Kang HE, Yim IB, Kim JY, Joo HG, Woo HJ. Immunomodulatory and antitumor effects in vivo by the cytoplasmic fraction of Lactobacillus casei and Bifidobacterium longum // J Vet Sci. 2004.-Vol.5. - N.I.- P.41-48.

154. Lee YK, Lim CY, Teng WL, Ouwehand AC, Tuomola EM, Salminen S. Quantitative approach in the study of adhesion of lactic acid bacteria tointestinal cells and their competition with enterobacteria.// Appl Environ Microbiol.-2000.-Vol.66.-N.9.-P.3692-3697

155. Leng L., Metz C., Fang Y., Xu., Donnelly S., Baugh J., Delohery Т., Chen Y., Mitchell R., Bucala R. MIF signal transduction initiated by binding to CD74 // JEM 2003.- Vol. 197.-N. 11P. 1467-1476

156. Leroy F., De Vuyst L. The presence of salt and a curing agent reduces bacteriocin production by Lactobacillus sakei CTC 494, a potential starter culture for sausage fermentation // Appl. Environ.Microbiol. 1999.-Vol.65.- N.12.-P.5350-5356

157. Lin S., Yu X., Chen Y., Huang X., Metz C., Bucala R., Lau C., Lan H. De novo expression of macrophage migration inhibitory factor in atherogenesis in rabbits // Circ. Res. 2000.- Vol. 87.- N.12.- P. 1202-1208.

158. Lin Y., Zhang M., Barnes P.F. Chemokyne production by a human alveolas epithelia cell line in response to Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immune. 1998. - Vol.66. -N.3. -P.1121-1126

159. Liyama R., Kanai Т., Uraushihara T. Normal development of the gut-associated lymphoid tissue except Peyer/s patch in MyD88-deficient mice // Immunol Lett.- 2003.-Vol.88.-N.l.-P.63-70.

160. Macfaralane G., Cummings J. Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? // BMJ 1999.-Vol.318.-N.7189.-P.999-1003

161. Madsen K., Cornish A., Soper P. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function.// Gastroenterology.-2001.-Vol.l21.-N.3.- P.580-591.

162. Marteau P., de Vrese M., Ceiller C., Schrezenmeir J. Protection from gastrointestinal diseases with the use of probiotics // AJCN 2001- Vol.73.-N.2.-P.430-436

163. Marth Т., Ring S., Schulte D., Klensch N, Strober W, Kelsall BL, Stallmach A, Zeitz M. Antigen-induced mucosal T cell activation is followed by

164. Thl cell supression in continuosly fed ovalbumin TCR-transgenic mice // Eur J Immunol.- 2000.- Vol.30.-N.12.-P.3478-3486

165. Martin M., Alonso J., Suarez J., Alvarez M. Generation of food-grade recombinant lactic acid bacterium strains by site-specific recombination // Appl. Environ. Microbiol. 2000.- Vol.66.- N.6.- P. 2578-2588.

166. Mastandrea F., Coradduza G., Serio G., Minardi A, Manelli M, Ardito S, Muratore L. Probiotics reduce the CD34+ hemopoietic precursor cell increased traffic in allergic subjects // Allerg Immunol.- 2004.- Vol.36.-N.4.-Vol. 118-122

167. Matsumura A, Saito T, Arakuni M, Kitazawa H, Kawai Y, Itoh T. New binding assay and preparative trial of cell-surface lectin from Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria.//J Daily Sci.- 1999.-Vol.82.-N.12.-P. 25252529

168. Medaglini D., Oggioni MR., Pozzi G.Vaginal immunization with recombinant gram-positive bacteria // Am J Reprod Immunol.- 1998.-Vol.39.-N.3.-P Л 99-208.

169. Medzhitov R., Janeway C. The Toll receptor family and microbial recognition.// Trends Microbiol.- 2000.-Vol.8.-N.10.-P.452-456.

170. Mercenier A., Muller-Alouf H., Grangette C. Lactic acid bacteria as live vaccine // Curr Issues Mol Biol. 2000.-Vol.2 - N. 1. - P. 17-25

171. Meydani S., Ha W. Immunological effects of yogurt // AJCN- 2000.-Vol.71. N.4.- P. 861-872

172. Mitchell R., Metz C., Bucala R., Peng T. Sustained mitogen-activated protein kinase (МАРК) and cytoplasmic phospholipase A2 activation by macrophage migration inhibitory factor (MIF) // Biol. Chem. 1999 - Vol. 274.-Issue 25 - P. 18100-18106

173. Monteleone I., Vavassori P., Biancone L., Monteleone G., Pallone F. Immunoregulation in the gut: success and failures in human disease.// Gut.-2002.-Vol.50.- N3.-P.60-64

174. Morita H., He F., Ouwehand AC, Hashimoto H, Hosoda M, Mizumachi K, Kurisaki J. Adhesion of lactic acid bacteria to caco-2 cells and their effect on cytokine secretion // Microbiol. Immunol. 2002.- Vol.46.-N.6.-P.293-297

175. Mowart A., Steel M., Leishman A.,Garside P. Normal induction of oral tolerance in the absence of a functional IL-12- dependent IFN-y signaling pathway // J Immunol.-1999.- Vol.l63.-N.9.-P.4728-4736.

176. Mukai Т., Asasaka Т., Sato E., Mori K., Matsumoto M., Ohori H. Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri // FEMS Immunology and Medical Microbiology 2002.-Vol. 32.-N.2.-P. 105-110

177. Mullen A., High F., Hutchins A., Lee H., Villarino AV, Livingston DM, Kung AL, Cereb N, Yao TP, Yang SY, Reiner SL. Role of T-bet in commitent of Thl cells before IL-12 dependent selection // Science- 2001 -Vol.292 N. 5523 - P.1907-1910

178. Mutah H., Bito H., Minami M. Two different promoters direct expression of two distinct forms of m RNAs of human platelet-activating factor receptor.// FEBS Letters.-1993.-N.322.-P. 129-134

179. Naka Т., Nishimoto N., Kishimoto T. The paradigm of IL-6: from basic science to medicine.// Arthritis Res.-2002.-Vol.4.-N.3.-P.233-242.

180. Navarre WW., Zychlinsky A. Phatogen-induced apoptosis of macrophages: a common end for different pathogenic strategies. // Cell Microbiol. -2000.- Vol.2. N.4. - P. 265-273.

181. Neeser JR, Granato D, Rouvet M, Servin A, Teneberg S, Karlsson KA. Lactobacillus johnsonii Lai shares carbohydrate-binding specificities with several enteropathogenic bacteria.// GIycobiology.-2000.-VoI. 10.-N. 11 .-P. 11931199.

182. Neutra M. Current concepts in mucosal immunity. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune sistem // AJP 1998.- Vol.274.- N.5.- P.785 - 791

183. Nguyen M., Lue H., Kleemann R., Thiele M., Tolle G., Finkelmeier D., Wagner E., Braun A., Bernhagen J. The cytokine macrophage migration inhibitory factor reduces pro-oxidative stress-induced apoptosis // The JI 2003-Vol.170.- N.6.- P. 3337-3347

184. Nhieu G, Bourdet-Sicard R, Dumenil G, Blocker A, Sansonetti PJ. Bacterial signals and cell responses during Shigella entry into epithelial cells / Cell Microbiol. 2000.- Vol. 2.-N.3.-P. 187-195

185. Ocana V., Holgado A., Nader-Macias M. Characterisation of Bacteriocin-like substance produced by a vaginal Lactobacillus salivarius strain // Appl. Environ.Microbiol. 1999.-Vol.65.-N.12.-P.5631-5635

186. Ohl L., Henning G., Krautwaid S., Lipp M, Hardtke S, Bernhardt G, Pabst O, Forster R. Cooperating mechanisms of CXCR5 and CCR7 in development and organization of secondary lymphoid organs // J.Exp.Med.-2003.-Vol.l97.-N.9.-P. 1199-1204

187. Ohman L., Franzen L., Rudolph U., Birnbaumer L, Hornquist EH. Regression of Peyer's patches in Gai2 deficient mice prior to colitis is associated with reduced expression of Bcl-2 and increased apoptosis // Gut 2002 - Vol.51 -N.l. -P.392-397

188. Oscariz J., Pisabarro A. Classification and mode of actoin of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria // Int Microbiol.-2001 .-Vol.4.-N. 1 .-P. 13-19.

189. Park S., Chiu Y. Jayawardena J., Roark J., Kavita U., Bendelac A. Innate and adaptive functions of the CD 1 patway of antigen presentation // Semin Immunol. 1998.- Vol.10. -N. 5. - P. 391-396.

190. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system // Curr. Issues Intest. Microbiol.- 2001- Vol.2.- N.I.- P.27-42

191. Perez PF, Minnaard J, Rouvet M, Knabenhans C, Brassart D, De Antoni GL, Schiffrin EJ. Inhibition of Giardia intestinalis by extracellular factors from Lactobacilli: an in vitro study // Appl.Environ. Microbiol. 2001.-Vol.67.-N.ll.-P. 5037-5042

192. Plant L., Conway P. Association of Lactobacillus spp. with Peyer's patches in mice // CDLI 2001.- Vol.8.- N.2.-320-324

193. Platzer C., and Blankenstein T. Polymerase chain reaction to quantitate mRNA // Cytokine.- 1995.-Vol.417.-P.57-68

194. Pochard P., Gosset P., Grangette C., Andre C, Tonnel AB, Pestel J, Mercenier A. Lactic acid bacteria inhibit Th2 cytokine production by mononuclear cells from allergic patients // J Allergy Clin Immunol.-2002.- Vol.110.- N.4.-P.617-623.

195. Pohjavuori E., Viljanen M., Korpela R., Kuitunen M, Tiittanen M, Vaarala O, Savilahti E. Lactobacillus GG in increasing IFN-gamma production in infants with cow's milk allergy // J Allergy Clin Immunol.-2004.-Vol.ll4.-N.l.-P.131-136

196. Potolicchio I., Santambrogio L., Stominger J. Molecular interaction and enzymatic activity of macrophage migration inhibitory factor with immunorelevant peptides // Biol. Chem. -2003 Vol.278. - Issue 33.- P. 3088930895

197. Pouwels PH, Leer RJ, Shaw M., Heijne den Bak-Glashouwer MJ, Tielen FD, Smit E, Martinez B, Jore J, Conway PL. Lactic acid bacteria as antigendelivery vehicles for oral immunization purposes.// Int J Food Microbiol.- 1998.-Vol.41.-N.2.-P. 155-67

198. Quadri L. Regulation of antimicrobial peptide production by autoinducer-mediated quorum sensing in lactic acid bacteria.// Antonie van Leeuwenhoek.- 2002.- Vol.82.- N. 10.-P. 133-145.

199. Rafler J., Rafler J. Lactic acid bacteria and cancer: mechanistic persoective.// Br J Nutr.- 2002.- Vol.88.-N.l.-P.89-94

200. Raqib R., Gustafsson A., Andersson J., Bakhiet M. A systemic downregulation of gumma interferon production is associated with acute shigellosis // Infect.and Immune.-. 1997.-Vol.65.-N.12.-P.5338-5341

201. Raqib R., Qardi F., Sarker P., Mia S., Sansonnetti P.J., Albert M.J. Delayed and reduced adaptive humoral immune responses in children with shigellosis compared with adults // Scand.J. Immunol.-2002.-Vol.55.-N.4.-P.414-423.

202. Raqib R., Moly P., Sarker P., Qardi F., Alam N., Mathan M., Andersson J. Persistence of mucosal mast cells and eosinophiks in Shigella-infected children // Infect. Immune.- 2003.- Vol.71.-N.5.-P.2684-2692

203. Rath H., Shultz M., Freitag R., Dieleman L., Li F., Linde H., Scholmerich J., Sartor B. Different subsets of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice // Infect. Immune.-2001.- Vol.69.-N.4.- P.2277-2285

204. Razzaque M.S., Foster C.S., Ahmed A.R. Role of macrophage migration inhibitory factor in conjunctival pathology in ocular cicatricial pemphigoid.// Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004.- Vol.45.-N.4. - P.l 174-1181

205. Reid G. Probiotic agents to protect the urogenital tract against infection.//Am J Clin Nutr.-2001 .-Vol.73.-N.2.-P.437-443.

206. Rennick D, Fort M. IL-10-deficient (IL-10V") mice and intestinal inflammation // Am. J Physiol Gastointest Liver 2000.- Vol.278.- Issue 6.-P. 829833

207. Resta-Lenert S, Barrett KE. Live probiotics protect intestinal epithelial cells from the effects of infection with enteroinvasive Escherichia coli (EIEC).// Gut.- 2003.-Vol.52.-N.7.-P.988-997

208. Rice EK., Nikolic-Paterson DJ. Hill PA., Metz CN, Bucala R, Atkins RC, Tesch GH. Interferon -gamma induces macrophage migration inhibitory factor synthesis and secretion by tubular epithelial cells.//Nephrology. 2003. - Vol.8. -N.3. - P. 156-161

209. Roberfroid M. Prebiotics: preferential substrates for specific germs?// Am J Clin Nutr 2001- Vol.73.-N.2.- P.406-409

210. Rodriguez J.M., Martinez M.I., Horn N., Dodd H.M. Heterologus production of bacteroicins by lactic acid bacteria // International Journal of Food Microbiology -2002-Vol.80.-N.3. P. 101-116

211. Roger T, David J, Glauser MP, Calandra T. MIF regulates innate immune responses through modulation of Toll-like receptor 4.// Nature.-2001.-Vol.414.-N.6866.-P.920-924.

212. Roger Т., Froidevaux F., Martin C., Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) regulates host to endotoxin through modulation of Toll-like receptor 4 (TLR4) // J.Endotoxin Res. 2003.-Vol.9.-N.2.-P.l 19-123

213. Rolfe R. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health//J.Nutr. -2000.-Vol.130.-N. 2.-P.396-402

214. Romani L., Mencacci A.,Tonnetti L., Spaccapelo R, Cenci E, Puccetti P, Wolf SF, Bistoni F. IL-12 is both required and prognostic in vivo for T helper type 1 differentiation in murine candidiasis // J Immunol-1994.- Vol.153.-N.ll-P. 5167-5175

215. Roos N., Katan M. Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, carcinogenesis: review of papers published between 1988 and 1998.// AJCN 2002.- Vol.71.- N.2.- P.405-411

216. Rosenfeldt V., Benfeldt E., Nielsen SD., Michaelsen KF, Jeppesen DL, Valerius NH, Paerregaard A. Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis // Allergy Clin Immunol.- 2003.-Vol.lll.-N.2.-P.389-395.

217. Rossi A., Haslett C., Hirani N., Greening A., Rahman I., Metz C., Bucala R., Donnelly S. Human circulationg eosinophils secrete macrophage migration inhibitory factor (MIF) potential role in asthma.// JCI 1998.- Vol. 101.-N. 12.- P. 2869-2874

218. Russell W.M., Klaenhammer T.R. Identification and cloning of gusA, encoding a new p-glucuronidase from Lactobacillus gasseri ADH // Appl.Environ. Microbiol. 200l.-Vol.67.-N3.-P. 1253-1261

219. Sakamoto I., Igarashi M., Kimura K., Takagi A, Miwa T, Koga Y. Supressive effect of Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21) on Helicobacter pylori infection in humans // JAC 2001.-Vol.47.-P.709-710.

220. Sansonetti P.J., Phalipon A., Arondel J., Thirumalai K, Baneijee S, Akira S, Takeda K, Zychlinsky A. Caspase-1 activation of IL-lbeta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation .// Immunity 2000. - Vol.12. - N.5. - P.581-590

221. Sansonetti P. Host-pathogen interactions: the seduction of molecular cross talk // Gut -2002.- Vol.50.- N.3. -P.2-8

222. Santabrogio L., Benedetti M., Chao M., Muzaffar R, Kulig K, Gabellini N, Hochwald G. Nerve growth factor production by lymphocytes // J.Immunol.-l 994,-Vol. 153.- N. 10.-P.4488-4495

223. Schrezenmeir J., de Vrese M. Probiotics, prebiotics and synbiotics-approaching a definition // AJCN 2001.-Vol.73.-N.2.-P.361-364

224. Schultz M., Linde HJ., Lehn N., Zimmermann K, Grossmann J, Falk W, Scholmerich J. Immunomodulatory consequences of oral administration of Lactobacillus rhamnosus strain GG in healthy volunteers.// J Dairy Res. 2003. -Vol.70.-N.2. - P. 165-173.

225. Sears C., Kaper J. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion //Microbiol. Rev. 1996.-Vol.60.-N.l.- P. 167-215

226. Seegers JF. Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects // Trends Biotechnol.- 2002.-Vol.20.-N.12.-P.508-515

227. Shanahan F. Therapeutic manipulation of gut flora // Science 2000,-Vol.289.- N.5483.- P.1311-1312

228. Sheih Y., Chaing В., Wang L., Liao C. Systemic immunity-enchancing effects in healthy subjects following dietary consumption of the lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus HN001// JAMA 2001.-Vol.20.-N.2.-P.149-156

229. Sheppler L., Vogel M., Zuercher AW. Recombinant Lactobacillus johnsonii as a mucosal vaccine delivery vehicle // Vaccine.- 2002.-Vol.20.-N.23-24.-P.2913-2920

230. Stevens M., van Diemen P., Frankel G.,Phillips A., and Wallis T. Efal influences colonization of the bovine intestine by Shiga toxin-producing Esherichia coli serotypes 05 and Oil// Infect and Immune -2002.-Vol.70.-N.9.-P.5158-5166

231. Strus M., Pakosz K., Gosciniak H., Przondo-Mordarska A, Rozynek E, Pituch H, Meisel-Mikolajczyk F, Heczko PB. Antagonistic activity of Lactobacillus bacteria strains against anaerobic gastrointestinal tract pathogens

232. Helicobacter pylori, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile) // Med Dos Microbiol.- 2001.- Vol.53.- N.2.- P.133-142

233. Sudha P.S., Devaraj H., Devaraj N. Adherence of Shigella dysenteriae 1 to human colonic mucin // Curr Microbiol. 2001.-Vol.42.-N.6.-P.381-387

234. Tannock G. Molecular assessment of intestinal microflora // AJCN -2001.-Vol.73.-N.2.-P.410-414

235. Tejada-Simon MV., Lee JM., Ustunol Z, Pestka JJ. Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium to potentiate immunoglobulin A responses to cholera toxin in mice // J Dairy Sci.- 1999.-Vol.82.-N.4.- P.649-660.

236. Todar K. Bacteriology// UW-Madison.-2001

237. Tuomola E., Ouwehand A., and Salminen S. The effect of probiotic bacteria on the adhesion of pathogens to human intestinal mucus // FEMS Immunol Med Microbiol.- 1999.- Vol.26.- N.2.- P. 137-142

238. Uronen H., Williams A.J., Dixon G. Gram-negative bacteria induce proinflammatory cytokine production by monocytes in the absence of lipopolysaccharide (LPS) // Clin Exp Immunol.-2000.-Vol.l22.-P.312-315.

239. Velraeds MM, van der Mei HC, Reid G, Busscher HJ. Inhibition of initial adhesion of uropathogenic Enterococcus faecalis by biosurfactants from Lactobacillus isolates.// Appl Environ Microbiol.-1996.-Vol.62.-N.6.-P. 1958-63

240. Velraeds MM, van de Belt-Gritter B, Busscher HJ, Reid G, van der Mei HC. Inhibition of uropathogenic biofilm growth on silicone rubber in human urine by lactobacilli a teleologic approach.// World J Urol.-2000.-Vol. 18.-N.6.-P.422-426.

241. Vitini E., Alvarez S., Medina M., Medici M, de Budeguer MV, Perdigon G. Gut mucosal immunostimulation by lactic acid bacteria // Biocell.-2000.-Vol.24.- N.3.-P.223-232.

242. Vrese M., Schrezenmeir J. Probiotics and non-intestinal infectious conditions.// Br J Nutr.-2002.-Vol.88.-N. 1 .-P.59-66.

243. Wallace T.D., Bradley S., Buckley N.D, Green-Johnson JM. Interactions of lactic acid bacteria with human intestinal epithelial cells: effects on cytokine production. // J Food Prot.- 2003.- Vol.66.-N.3.-P.466-472.

244. Wang W., Tanaka Т., Okamura H., Sugita M, Higa S, Kishimoto T, Suemura M. Interlukin-18 enhances the production of interlukin-8 by eosinophils // Eur J Immunol.- 2001.- Vol.31.- N.4.- P. 1010-1016

245. Way S., Borczuk A., Dominitiz R., Goldberg M. An essential role of gamma interferon in innate resistance to Shigella flexneri infection // Infect. Immune.-1998.- Vol.66.-N.4.- P. 1342-1348

246. Weid Т., Bulliard C., Schiffrin E. Induction by a lactic acid bacterium of a population of CD 4+ T cells with low proliferative capacity that produce transforming growth factor and interleukin-10 // CDLI 2001,- Vol.8.- N.4.-P.695-701

247. Weigmann В., Neurath M. T-bet and mucosal Thl responses in the gastrointestinal tract // Gut.-2002.- Vol.51.- N.3.- P.301-303

248. Wilson CL., Ouellette AJ., Satchell DP. Regulation of intestinal a-defensin activation by the metalloproteinase martilysin in innate host defence.// Science.-Vol.286.-P. 113-117.

249. Wilson M., Seymour R., Henderson B. Bacterial perturbation of cytokine networks // Infect. Immune.- 1998.- Vol.66.- N.6.- P.2401-2409

250. Wilson J.W., Schurr M.J., LeBlanc C., Ramamurthy R., Buchanan K., Nickerson C. Mechanisms of bacterial pathogenicity // Postgrad Med.J. 2002.-Vol.78.- N.918.- P.216-224

251. Yan F., Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells // J. Biol. Chem.- 2002.- Vol.277.- Issue 52.-P.50959-50965

252. Yuhas Y., Weizman A., Ashkenazi S. Bidirectional concentration-dependent effects of tumor necrosis factor alpha in Shigella dysenteriae-related seizures // Infect. Immune.-2003.- Vol.71.- N.4.- P. 2288-2291

253. Zhang HM., Ou ZL., Gondaria F., Ohmura M, Kojio S, Yamamoto T. Protective effect of anisodamine against Shiga toxin-1: inhibition of cytokine production and increase in the survival of mice.// J Lab Med.- 2001.-Vol.137.-N.2.- P.93-100.

Информация о работе

Зорина, Виктория Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Роль лактобактерий в модуляции факторов иммунитета в норме и при экспериментальной шигеллезной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы