Роль коррекционной репарации ДНК (MMR) в механизме гено- и цитотоксического действия метилнитрозомочевины в опухолевых клетках человека

Крамаренко, Инга Игнатьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль коррекционной репарации ДНК (MMR) в механизме гено- и цитотоксического действия метилнитрозомочевины в опухолевых клетках человека
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль коррекционной репарации ДНК (MMR) в механизме гено- и цитотоксического действия метилнитрозомочевины в опухолевых клетках человека"

на правах рукописи

КРАМАРЕНКО Инга Игнатьевна

РОЛЬ КОРРЕКЦИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ДНК (MMR) В МЕХАНИЗМЕ ГЕНО- И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

ЧЕЛОВЕКА

специальность 03.00.02 - «Биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Институте химической физики им. H.H. Семенова Российской Академии Наук

Научный руководитель

Доктор биологических наук

В.А. Тронов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук, профессор

K.JI. Ерзинкян Л.Б. Горбачева

Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета (МГУ) им. М.В.Ломоносова.

на заседании диссертационного совета Д 002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 119991 г.Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук Л.А. Радкевич

Защита состоится « »

2006 г. в

час.

мин.

ДООС£_ Z473

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак толстого кишечника (РТК) является одной из самых распространенных онкопатологий в развитых странах. Кумулятивный риск заболевания РТК на протяжении жизни индивида составляет 5 - 6% [Grady, 2003]. 3 - 5% всех случаев заболеваний приходится на наследственную (семейную) форму, которая характеризуется высоким риском заболевания (до 90% в течение жизни). Во всех случаях наследственной формы РТК в опухолевых клетках обнаруживаются свидетельства дефицита пострепликативной корректирующей репарации ДНК (MMR, mismatch repair).

Из всех известных на сегодня заболеваний, связанных с генетическими дефектами и предрасположенностью к раку, только в двух прослеживается однозначно связь с дефектами в механизмах репарации ДНК. Это наследственный неполипозный рак толстого кишечника (НРТК, синдром Линча) и пигментная ксеродерма [Jiricny, 1994; Friedberg et al., 1995; Bootsma et al., 1998]. В случае НРТК дефекты MMR проявляются в виде мутаций в генах системы MMR и/или в виде микросателлитной нестабильности (МСН). Поэтому мутации генов системы MMR и микросателлитная нестабильность генома в опухолевых клетках стали распространенными маркерами заболевания НРТК [Vasen et al., 1999].

В то же время в многочисленных исследованиях показано, что в 30% случаев заболевания спорадическим РТК в клетках опухолей также наблюдается МСН генома [Штам и др., 2004; Boland et al., 1998]. Однако в отличие от семейной формы заболевания, здесь МСН чаще всего ассоциирована не с мутациями в генах системы MMR, а с гиперметилированием промоторов этих генов [Veigl et al., 1998]. Сюда же можно отнести и многочисленную группу заболеваний, формирующих так называемый «спектр РТК» [Vasen et al., 1999]. Таким образом, для довольно большой группы заболеваний РТК такой показатель как мутации генов MMR не может быть исчерпывающим маркером заболевания. Мы полагаем, что в большей степени этому требованию соответствует такой показатель как функциональная активность MMR. Кроме того, разработка универсальных маркеров заболевания позволило бы выделить группы риска, прогнозировать возникновение заболевания и предупреждать его.

Как следствие дефицита MMR, в опухолевых клетках формируется мута-торный фенотип и устойчивость к цитотоксическому действию алкилирую-щих/метилирующих агентов [Aquilina et al., 7ППО] Гпяд^м цитптпугинррунм

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ i

БИБЛИОТЕКА I Gflerapg— -О»

повреждением при химическом метилировании ДНК является 06-метилгуанин (06-MeG) [Kaina et al., 1993]. Две особенности отличают 06-MeG от других алкилированных оснований: в клетках млекопитающих он может быть репа-рирован только прямым деметилированием при участии метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) [Kaina et al., 1990]; не будучи репарированным, это повреждение не блокирует репликацию и сохраняется в пострепликативный период [Kaina et al., 1997]. В этом случае образуется некорректная пара 06-MeG : Т, которая является субстратом для механизма коррекционной репарации ДНК (MMR). 06-MeG сильно напоминает аденин, и потому полимераза в процессе синтеза вставляет комплементарный ему тимин, формируя неправильную пару 06-MeG : Т. В ответ инициируется MMR, начинающая процесс эксцизионного удаления тимина в дочерней цепочке ДНК. Создается тупиковая для MMR ситуация, когда в матрице присутствует неудаляемый дефект, а полимераза не может подобрать ему комплементарную пару, всякий раз в процессе ресинтеза воспроизводя пару 06-MeG : Т. Если клетка, содержащая в геноме такую пару, вступит в следующий цикл репликации, то неизбежной будет транзиция G : С—»A : Т (последовательно: G : С + Alk —> 06-MeG : С + I цикл репликации —> 06-MeG : Т + II цикл репликации -»А : Т). Показано, что в опухолевых клетках эпителия толстого кишечника (дефицитных по MMR) частота таких транзиций соответствует 1 на 8 06-MeG для гена hprt [Rasouli-Nia et al., 1994], но может быть и выше в случае, например, онкогена K-ras [Esteller et al., 2000; Jackson et al., 1999]. Однако вступлению во второй цикл репликации препятствует активная система MMR, которая возобновляет процесс эксцизии и последующего ресинтеза. Разрешается эта коллизия радикально: длительное существование обширной бреши в дочерней цепи ДНК делает неизбежным формирование двунитевого разрыва под действием внутриклеточных эндонуклеаз. Его появление запускает механизм апоптоза. Таким образом, эффективная система MMR инициирует программу гибели полноценных по репарации клеток, содержащих 06-MeG. Дефицитные по MMR опухолевые клетки при РТК сохраняют жизнеспособность. При этом они приобретают новые мутации за счет G : С—>А: Т транзиций, что, с одной стороны, увеличивает вероятность их трансформации, а с другой - расширяет селективные возможности опухолевых клеток и позволяет им адаптироваться к генотоксическим воздействиям. Этот механизм может частично объяснять их пониженную способность к апоптозу в ответ на действие алкилирующих агентов [Bedi et al., 1995]. Таким образом, в основе механизма

цитотоксического действия 06-MeG лежат вторичные разрывы ДНК, которые формируются в ходе функционирования системы MMR [Kaina, 2003].

Как видно, активная система MMR трансформирует первичное повреждение 06-MeG в двунитевой разрыв ДНК. Эти вторичные разрывы, возникающие в пострепликативный период (спустя >1 цикла репликации), могут быть показателем функциональной активности MMR в клетке и маркером в оценке риска возникновения РТК у человека.

Экспериментальная проверка этого предположения составляет содержание данной диссертации.

Цель и основные задачи исследования

Цель настоящего исследования состоит в проверке на опухолевых клетках человека предположения о юм, что количество вторичных двунитевых разрывов ДНК (ДР) в ответ на действие монофункционального метилирующего агента может отражать эффективность функционирования системы MMR в клетке.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Отобрать три линии клеток опухолей человека, которые генетически отличаются по активности коррекционной репарации ДНК.

2. Оценить чувствительность этих клеток к действию монофункционального метилирующего агента метилнитрозомочевины (МНМ) по показателю цитотоксичности.

3. Исследовать частоту гибели этих клеток по механизму апоптоза, индуцированного метилнитрозомочевиной.

4. Исследовать количество и динамику образования вторичных двунитевых разрывов в клетках под влиянием МНМ.

5. Исследовать первичную структуру генов MLH1 и MSH2 в линии опухолевых клеток Colo320HSR с неохарактеризованной системой коррекционной репарации с целью выявления мутаций в этих генах, приводящих к возникновению рака толстого кишечника.

6. Сопоставить эти показатели между собой и прокоррелировать их с предполагаемой активностью MMR.

Научная новизна

1. В работе предложен механизм реализации генотоксического действия монофункционального метилирующего агента метилнитрозомочевины в цито-токсический эффект через вторичные двунитевые разрывы ДНК, возникающие в результате функционирования пострепликативной MMR. Таким образом, три показателя: количество вторичных МНМ-индуцированных разрывов ДНК, цитотоксический эффект МНМ (частота отсроченного апоптоза) и эффективность MMR — представлены взаимосвязанными в одном механизме.

2. На основании этого предлагается простая процедура оценки функциональной эффективности пострепликативной репарации, MMR. Процедура апробирована на трех линиях опухолевых клеток человека, различающихся генетически по эффективности MMR. Впервые эффективность MMR этих клеток выражена количественно в виде числа вторичных двунитевых разрывов ДНК, возникающих в ответ на действие метилнитрозомочевины.

4. Результаты проведенного исследования являются основанием для разработки простой системы тестирования MMR с целью прогноза эффективности химиотерапии, а также для оценки риска возникновения рака (используя соматические клетки человека — лимфоциты здоровых доноров и онкологических больных).

Научно-практическая значимость работы

Результаты данного исследования могут иметь фундаментальное и прикладное значение.

1. Они позволяют понять механизм реализации генотоксического сигнала алкилирующих агентов в цитотоксический эффект.

2. Оценить роль вторичных разрывов в цитотоксическом эффекте алкилирующих агентов и разработать на этой основе модельные системы для определения эффективности новых лекарственных препаратов и прогноза их использования в терапии опухолей с дефектной системой MMR.

3. Эффективный механизм MMR является фактором, противостоящим генотоксическому прессингу алкилирующих агентов эндогенного происхождения и в окружающей среде. С другой стороны, эффективная MMR является предпосылкой успешного применения противоопухолевых лекарств, включая алкилирующие соединения (поскольку дефицит MMR сочетается с устойчивостью клеток ко многим химиотерапевтическим препаратам). Результаты данного исследования помогут разработать простую систему тестирования MMR с целью прогноза эффективности химиотерапии, а также для оценки риска возникновения рака.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. Один из путей реализации цитотоксического эффекта метилнитрозомо-чевины в клетках включает в себя: образование 06-MeG - 1-й цикл репликации -формирование неканонической пары (06-MeG : Т) - активизацию MMR, повторяющиеся циклы эксцизия - ресинтез в функционирующей MMR (абортивная MMR) - формирование обширной долго живущей однонитевой бреши в ДНК - трансформация бреши в ДР - инициация апоптоза.

2. Цепочка в полной мере реализуется только в делящихся клетках с функционирующей системой MMR (в данной работе - в клетках HeLa).

3. Клетки, дефицитные по MMR (в данной работе - клетки НСТ116), проявляют устойчивость к МНМ (по показателям клеточной гибели) и не обнаруживают предшествующих апоптозу двунитевых разрывов в ДНК.

4. Клетки аденокарциномы сигмовидной кишки Colo320HSR содержат нейтральную мутацию в 520 кодоне 10 экзона гена MSH2. По количеству MIIM-индуцированных вторичных разрывов клетки Colo320HSR занимают промежуточное положение между MMR-профицитными клетками HeLa и дефицитными клетками НСТ116. В клетках линии Colo320HSR наблюдается пониженная способность МНМ-индуцированных ДР вызывать апоптоз.

5. Предлагаемая процедура определения количества вторичных ДР в ответ на действие МНМ может стать основой для оценки функциональной эффективности MMR в опухолевых и соматических клетках.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на ежегодных научных конференциях Института химической физики им. H.H. Семенова РАН, Москва; 1-ом Съезде Общества клеточной биологии и Междуна-

родном симпозиуме по проблемам мейоза, Санкт-Петербург (2003); 35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society, Greece (2005). Список тезисов, полнотекстовых докладов и статей представлен в конце автореферата

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из___названий. Работа

изложена на_страницах, иллюстрирована_таблицами и_рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клетки. Исследования проводили на трех линиях опухолевых клеток человека: MMR-профицитных клетках HeLa (карцинома эндометрия), MMR-дефицитных клетках НСТ116 (клетки карциномы толстого кишечника, в которых произошла делеция в 255 кодоне гена hMLHl, приведшая к полной инактивации белка [Parsons et al., 1993]) и на неохарактеризованных по состоянию генов системы MMR клетках аденокарциномы сигмовидной кишки человека Colo320HSR. Клетки были получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург (HeLa, Colo320HSR) и предоставлены проф. Селивановой Г.Н., Каролинский Раковый Институт, Стокгольм (НСТ116). Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей глютамин, эмбриональную телячью сыворотку (10%) и антибиотики, в атмосфере СОг (5%) при 37°С.

Воздействия. В качестве метилирующего агента использовали метил-нитрозомочевину (МНМ), которая была синтезирована в ИХФ РАН и в кристаллическом виде хранилась в холодильнике (-20°С). МНМ-обработку проводили через 24 часа после высева клеток. Препарат растворяли в питательной среде и немедленно добавляли к клеткам. Учитывая тот факт, что МНМ быстро распадается в растворе, клетки от агента не отмывали.

Для подавления прямого деметилирования оснований в ДНК, использовали 06-бензилгуанин (Sigma), конкурентный ингибитор метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы, который вносили в культуру за час до добавления МНМ.

МТТ-тест. Цитотоксический эффект оценивали по жизнеспособности (МТТ-тест) и по апоптотическому индексу (частоте морфологически различимых апоптотических клеток в терминальной фазе). Использовали 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (МТТ) фирмы R&D Systems (США). МТТ-тест проводили, согласно протокола фирмы [www.RnDSystems.com/pdfta5355.pdf], в 96-луночных планшетах. Оптическую плотность на 594 нм регистрировали с помощью иммуноферментного планшетного фотометра ЭФОС 9305 (Россия).

Апоптоз. Апоптотический индекс определяли как частоту клеток с апоптотаческой морфологией ядра Морфологические изменения прослеживали во флуоресцентном микроскопе после окрашивания клеток смесью красителей акридинового оранжевого и бромистого этидия, руководствуясь протоколом фирмы Merk Biosciences (Calbiochem, США). К апоптотическим относили клетки, в которых хроматин был коллапсирован, т.е. в высокой степени конденсирован, так, что в нем не прослеживалась какая-либо структурная гетерогенность. Коллапсированный хроматин приобретал форму кольца, полумесяца, шара или виноградной грозди. Зеленая окраска свидетельствовала о целостности клеточных мембран. Клетки с проницаемой мембраной окрашивались в желтый или оранжевый цвет. Клетки с интактной структурой хроматина, окрашенные в желтый или оранжевый цвета, считались некротическими. В отдельных экспериментах определяли численность клеточной популяции, подсчитывая клетки в 20 - 50 цифровых микрофотографиях, выполненных в проходящем свете.

Двунитевые разрывы ДНК. Генотоксический эффект оценивали по количеству двунитевых разрывов (ДР) в геноме, определяемых с помощью метода нейтральных ДНК-комет [Singh, 2000]. Суспензию клеток в PBS (1 -3x105/мл) смешивали с равным объемом 1.5% раствора Low melting agarose, type IV (Sigma); смесь наносили на предметное стекло, которое ранее было покрыто тонким слоем 1% агарозы, накрывали покровным стеклом, и после застывания геля с иммобилизованными в нем клетками стекла погружали в сосуд, заполненный лизирующим раствором (2.5 М NaCl, 0.1 М EDTA, 0.02 М Tris-HCl, 1% Triton Х-100, 10% DMSO, pH 10). После лизиса в холодильнике в течение 12 - 24 часов слайды помещали в камеру для горизонтального электрофореза, заполненную ТАЕ-буфером, pH 8. Электрофорез проводили спустя 30 мин при

15 В/см в течение 45 мин в холодильнике. По завершении электрофореза слайды помешали на 10 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaOH и 1 мМ EDTA, рН >13. Процедура завершалась нейтрализацией раствором 0.4 М Tris (рН 7.4) и высушиванием слайдов на воздухе. Высушенные слайды дегидратировали в метаноле, подсушивали, окрашивали раствором йодистого пропидия в антифейде (5 мкг/мл PI, 50 мкл на слайд), накрывали покровным стеклом (24x24 мм) и мик-роскопировали (возбуждение флуоресценции при 490 нм, барьерный фильтр 540 нм). Изображения комет, получаемые с помощью фотокамеры Coolpix 4500 (Nikon), анализировали с использованием программы CASP [Konca et al., 2003]. В каждом слайде анализировали не менее 100 комет.

В качестве показателя поврежденности ДНК использовалась ее электро-форетическая подвижность, мерой которой является момент хвоста кометы (mt) — параметр, численно равный произведению доли ДНК в хвосте кометы на среднее расстояние миграции, измеряемое от центра головы кометы (mt = Xm х Ft). Параметр mt был предварительно прокалиброван по количеству двунитевых разрывов (N), индуцированных в геноме покоящихся лимфоцитов человека после их гамма-облучения (Со-60) в известных дозах (mt - 1.922 + 0.079 * N). Скорость образования ДР при гамма-облучении клеток была принята постоянной в диапазоне доз 0 - 80 Гр и равной 50 ДР на диплоидный геном после гамма-облучения в дозе 1 Гр [Holley, Chatteijee, 1996]. Количество разрывов приводится в расчете на диплоидный геном лимфоцитов человека.

Помимо параметра mt для каждой кометы находили интегральную флуоресценцию кометы, которая пропорциональна количеству ДНК в клетке (Мс). По этому параметру строили гистограмму распределения клеток, из которой находили долю гиподиплоидных клеток с пониженным содержанием ДНК. Этот показатель является косвенным отражением доли апоптотических клеток.

Определение мутаций в генах MLH1 и MSH2 в клетках Colo320HSR.

Определение мутантных фрагментов ДНК генов MLH1 [Kolodner et al., 1995] и MSH2 [Kolodner et al., 1994] проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле и выявлением характеристик мутационной замены путем секвенирования. Работа включала в себя следующие процедуры: выделение ДНК из культуры клеток Colo320HSR; амплификацию экзонов изучаемых генов; электрофоретический анализ продуктов амплификации и идентификацию экзонов, содержащих замены нуклеотидов; секвенирование фрагментов ДНК, содержащих замены; идентификацию мутантных кодонов и мутаций в них. Выделение ДНК проводили

стандартным методом [Sambrook et al., 1989]. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор синтезированных олигонуклео-тидных праймеров, обеспечивающих амплификацию кодирующей части генов, экзонов, с примыкающими к ним частями интронов (50 - 100 п. н.). Было синтезировано 35 пар праймеров, что позволяло охватить все экзоны генов MLH1 (19 экзонов) и MSII2 (16 экзонов). После амплификации пробы инкубировали при 68°С в течение 50 мин для комплементарной реассоциации синтезированных фрагментов. В результате мутантные фрагменты давали гетеродугшексы (несовершенные дуплексы, содержащие негомологии в области мутировавшего кодо-на) и гомологичные биспиральные фрагменты, содержащие только комплементарные цепи ДНК. В силу этого между ними имеется небольшое конформацион-ное различие, по которому они могут быть разделены. Для разделения гомо- и гетеродуплексов использовали конформационно-чувствительный гель электрофорез (CSGE, conformation-sensitive gel electrophoresis) [Ganguly et al., 1993]. CSGE проводили с добавлением в гель слабо денатурирующих агентов этиленг-ликоля и формамида, за счет различий в степени денатурации гомо- и гетеродуплексов усиливается конформационное различие между ними. Таким образом, добавление мягко денатурирующих растворителей усиливает конформационные различия между совершенным дуплексом и гетеродуплексом, и тем самым увеличивает различия в скорости миграции гетеродуплексов и гомодуплексов ДНК при электрофорезе. Разделяющий электрофорез амплифицированных экзонов генов MLHJ и MSH2 проводили с использованием гелей большой протяженности на аппаратах (типа Macrophor, LKB, Швеция). Для окраски геля использовали 0.2% раствор нитрата серебра. Очистку амплифицированной ДНК для секве-нирования проводили с помощью наборов Wizard (Promega, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе (IBI, США). Праймеры подбирались с помощью программы Vector NTI 9.0 (InfoMax Inc., США).

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно сложившимся представлениям, клетки с нормальной системой MMR наиболее чувствительны к алкилирующим агентам. Поэтому условия инкубации клеток, концентрации МНМ и ингибитора метилтрансферазы 06-bzG, нами были отработаны на клетках HeLa. На рис. 1 представлен цитотоксиче-

ский эффект различных концентраций МНМ спустя 3 суток после добавления агента в ростовую среду и влияние на него Об-ЬгС.

100 80 -I

Í5 5

% 60-§40

S ¿20

10000

100 1000 [NNJl чкМ

Рисунок 1. Цитотоксический эффект МНМ на клетках HeLa по данным МТТ-теста спустя 72 часа после пульс-обработки различными концентрациями МНМ и — МНМ, □ — МНМ + 06-bzG (10 мкМ), А — МНМ + 06-bzG (20 мкМ)

Видно, что кривая имеет два участка: область сравнительно малого изменения жизнеспособности клеток под влиянием МНМ (< 250 мкМ МНМ) и область, в которой токсический эффект быстро нарастает с ростом концентрации МНМ (> 450 мкМ). 06-bzG в концентрации 10 мкМ усиливает токсическое действие МНМ, снижая более чем в два раза ингибирующую дозу МНМ (50% Inhibiting Dose, ID50) с 1000 мкМ до 450 мкМ. Сенсибилизирующий эффект О6-bzG обнаруживается во всем диапазоне концентраций МНМ (от 10 мкМ до 1 мМ). Отметим, что увеличение концентрации 06-bzG до 20 мкМ не сопровождается возрастанием токсического эффекта МНМ. Сам по себе 06-bzG не обнаруживал цитотоксичности в пределах используемых концентраций. Эти результаты позволили нам выбрать концентрации МНМ - 250 мкМ и 06-bzG - 20 мкМ в качестве рабочих, используя которые мы сравнивали цитотоксический эффект МНМ на клетках HeLa и НСТ116, имеющих различный MMR-статус.

Влияние МНМ на опухолевые клетки HeLa и НСТ116. Рис. 2 (а и в) демонстрирует динамику жизнеспособности клеток HeLa и НСТ116 в течение трех суток после внесения в ростовую среду МНМ, 250 мкМ. Отметим два существенных факта: (1) цитотоксический эффект МНМ обнаруживается только на третьи сутки и только на MMR-полноценных клетках HeLa; (2) клетки НСТ116, дефицитные по MMR, как видно, устойчивы к воздействию МНМ (рис.

2, в). Наблюдаемая цитотоксичность МНМ на клетках НеЬа включает в себя апоптоз, отмечаемый также на третьи сутки (рис. 2, б). В отличие от НеЬа, клетки НСТ116 не обнаруживают цитотоксического действия агента по МТТ-тесту (рис.2, в) и по апоптотической гибели в течение трех суток после воздействия (рис. 2, г). Во всех случаях в инкубационной среде присутствовал ингибитор ме-тилтрансферазы 06-Ьг0 (20 мкМ).

I 6 8

1 2

Время, сутки Время, суши

Рисунок 2. Изменение во времени жизнеспособности клеток (МТТ-тест, а ив) и апоптотического индекса (б и г)

я, а- интактные; •, о - обработанные МНМ, 250 мкМ + О'-Ьгв, 20 мкМ

Генотоксический ответ клеток также обнаруживает принципиальные различия между линиями НеЬа и НСТ116. Как следует из рисунка 3, образование разрывов в геноме клеток НеЬа наблюдается спустя 48 час после добавления МНМ к клеткам (250 мкМ). На срок 72 час число разрывов ДНК недостоверно отличается от их количества на 48 час. К этому времени значительная часть клеток НеЬа (30%) проявляла морфологические признаки апоптоза (рис. 2, б), характерные для терминальной фазы гибели клетки. На этой стадии происходит также деградация ДНК и лизис части клеток (рис. 5, в, г). Устойчивость клеток НСТ116 к цитотоксическому действию МНМ коррелирует с отсутствием в ДНК этих клеток двунитевых разрывов (рис. 3).

HeLi

¿oj

l M>

MO.

0 wi>

1 12®

HCT116

:t±fci

U 10 Л 40 5П 00 70 00 Екемя чаг

Рисунок 3. Динамика накопления двунитевых разрьшов в клетках НеЬа и НСТ116, после обработки МНМ (250 мкМ) и 06-Ь/0 (20 мкМ) Заштрихованная полоса - контрольные значения +/- 80

При этом обе линии клеток остаются чувствительными к генотоксическо-му действию индуктора двунитевых разрывов в ДНК этопозиду (рис. 4, а, в). Как видно, этопозид индуцирует разрывы в ДНК уже через несколько часов после добавления к клеткам. Как следствие этого, цитотоксический ответ клеток на действие этопозида проявляется в более ранние сроки (24 час) по сравнению с эффектом МНМ. Апоптотический индекс двух линий клеток к этому времени составляет примерно 40% (рис. 4, б, г). Во всех случаях апоптоз подтверждался также возрастанием доли гиподиплоидных клеток, которые регистрировали по снижению флуоресценции ДНК-комет (рис. 5, а, в). Результат изучения эффекта этоиозида показывает, что обе исследованные линии клеток сохраняют высокую чувствительность к двунитевым разрывам в ДНК. ДР запускают в них механизм апоптотической шбели независимо от MMR-статуса клеток. Отсроченный апоптоз MMR-профищггаых клеток HeLa (спустя более 1 цикла после внесения МНМ в ростовую среду и её распада) ассоциирован также с отсроченным появлением ДР в геноме (48 час после внесения агента в среду). К этому времени клетки проходят более 1 цикла, о чем говорят данные МТТ-теста (рис.2, а) а также более чем двукратное увеличение числа клеток в культуре. Тем не менее, образование ДР предшествует апоптотической гибели клеток HeLa (рис.2, б). Это позволяет связать ДР и МНМ-индуцированный апоптоз клеток HeLa как причину и следствие. В клетках НСТ116, дефицитных по MMR, как видно, не наблюдается образования ДР в течение 72 час после добавления метилирующего агента, при этом клетки не проявляют апоптотической гибели в ответ на действие МНМ (рис. 2, г).

НЛл

Апоптпткческкй индекс клеток Не1.а на 24 час. в

Е1орогн1е (мкМ) АИ, %

0 2,5

10 39

НСТ116

а—^о-£>

Рисунок 4. Индукция этопозидом двунитевых разрывов в клетках НеЬа (а) и НСТ116 (в) и последующая гибель этих клеток (б и г)

Для НСТ116 представлены доли апоптотических - ■ и некротических - о клеток Заштрихованные области - изменения в контроле +/-80

НО 200 «00«»ххит ДИК

Рисунок 5. Гистограммы распределения ДНК-комет, получаемых из интактных клеток (а, б) и апоптотических клеток НеЬа после обработки МНМ (в, г)

Пунктирная линия - верхняя граница содержания ДНК в гиподиплоидных клетках

Цито- и генотоксический эффекты МНМ на клетках Colo320HSR.

В отличие от клеток НСТ116, являющихся почти диплоидными [Masramon et al, 2000], клетки аденокарциномы толстого кишечника Colo320HSR характеризуются высокой хромосомной нестабильностью и имеют анеугагоидный ка-риотип [Tsushimi et al., 2001]. Сравнительно недавно в них продемонстрирована микросателлитная стабильность [Kleivi et al., 2004]. В совокупности эти данные позволяют ожидать в клетках Colo320HSR дефицита репаративной системы MMR. Рисунок 6 демонстрирует цитотоксический эффект МНМ на клетках Colo320HSR. МНМ (250 мкМ) значительно снижает МТТ-показатель жизнеспособности клеток на третьи сутки после воздействия агентом (рис. 6, а). Этот ответ клеток Colo320HSR на токсический стресс МНМ, совпадает с таковым клеток HeLa (рис. 2, а). В то же время уровень гибели клеток Colo320HSR в результате такой обработки слабо превышает таковой в контроле (рис. 6, б). Это говорит о том, что в данном случае снижение МТТ-показателя отражает, скорее всего, не гибель, а снижение скорости пролиферации клеток Colo320HSR в ответ на действие МНМ.

Тем не менее, в клетках индуцируется заметное количество двунитевых разрывов ДНК (рис. 6, в). Таким образом, МНМ оказывает гено- и цитотоксиче-ское действие на Colo320HSR, однако оно не сопровождается адекватным возрастанием частоты апоптоза. Этот вывод подтверждает сравнение гистограмм распределения клеток по содержанию ДНК для контрольной популяции и обработанной МНМ, спустя 72 час после обработки клеток (рис. б, г, д). Хотя распределения значительно отличаются между собой, очевидно, что МНМ-обработка клеток Colo320HSR не приводит к образованию в них гиподиплоид-ных клеток, характерных для апоптоза (рис. 5, в).

Исследование мутаций в генах MLH1 и MSH2 в клетках Colo320HSR.

Из литературных данных следует, что наибольший вклад в колоректаль-ный канцерогенез, вносят мутации двух генов системы MMR - MLH1 и MSH2. Поэтому поиск мутаций в системе MMR клеток Colo320HSR был ограничен этими двумя генами. Были исследованы все 19 экзонов гена MLH1 и 16 экзонов гена MSH2 исследуемых клеток. На рисунке 7 представлен фрагмент электрофо-реграммы продуктов ПЦР, включающий в себя полосы 4-х экзонов (8-11) гена MSH2 MMR-профицитных клеток HeLa и MMR-дефицигаых CoIo320HSR. Результат на клетках HeLa используется как контроль, представляющий дикий тип исследуемого гена.

алрвпе ян (дел. vi

Рисунок 6. Цито- и генотоксическое действие МНМ (250 мкМ + 20 мкМ О -bzG) на клетки Colo320HSR

а - динамика жизнеспособности клеток по результатам МТТ-теста,

V - интактные, Т - обработанные МНМ; б - изменение апоптотического индекса клеток; в - динамика двунитевых разрывов ДНК в клетках; Заштрихованная полоса - диапазон изменений в контроле; гид - распределения клеток по содержанию ДНК в интактных и обработанных МНМ клетках спустя 72 часа после обработки;

Пунктирная линия - верхняя граница содержания ДНК в гиподиплоидных клетках

Ь 3 10 II

& 9 10 11

IleLa Colo320

Рисунок 7. Электрофоретическое разделение методом CSGE амплифииирован-ных фрагментов ДНК гена MSH2 клеток HeLa и Colo320HSR

Представлены полосы 4-х экзонов (8-11) гена

Стрелкой отмечено расщепление полосы 10-го экзона гена MSH2 в клетках Colo320HSR

Как видно, полоса 10-го экзона гена MSH2 в клетках Colo320HSR расщеплена, что свидетельствует о наличии, наряду с гомодуплексами, части копий этого фрагмента, которые содержат структурные изменения, характерные для гетеродуплексов. Последующее секвенирование этого экзона обнаружило наличие в нем мутации - трансверсии в 520 кодоне GGA—»GGG. Данная мутация является нейтральной, поскольку оба триплета, исходный и мутантный, кодируют аминокислоту глицин. Ни в одном из 19 экзонов второго исследованного гена MLH1 не было обнаружено каких-либо изменений первичной структуры ДНК. Поэтому некоторое снижение активности MMR в этих клетках по сравнению с клетками HeLa (Рис. 6) не связано с мутацией в генах MLH1 и MSH2.

МНМ — монофункциональный алкилирующий агент, используемый в химиотерапии опухолей [Mehta, 2000; Дементьева, Корман, 2001; Горбачева, 2003]. Цитотоксичность МНМ выражается в двух формах: в форме клеточной гибели и в форме подавления роста клеток. На клетках СНО показано, что первая форма цитотоксичности индуцируется при концентрациях МНМ выше 5 мМ и наблюдается через 24 ч после добавления МНМ в культуру [Mizumoto, Farber, 18

1995]. Сигналом, запускающим клеточную гибель, было снижение уровней NAD и АТР в клетках. Дорепликативная эксцизионная репарация истощала энергетику клетки и приводила ее к некрозу. Ингибиторы репарации защищали клетки от этой формы цитотоксичности [Buschfort et al., 1997]. Вторая форма цитотоксич-ности МНМ наблюдалась при низких, терапевтических концентрациях (< 5 мМ) и в более поздние сроки (спустя > 2 цикла репликации). Эта цитотоксичность определялась степенью алкилирования гуанина и способностью клеток к его репарации (т.е. активностью MGMT) [Mizumoto, Farber, 1995]. Данный механизм цитотоксичности МНМ являлся предметом наших исследований и определил выбор действующих концентраций агента (< 1 мМ) и время наблюдения эффекта (> 48 час).

Наблюдаемое снижение жизнеспособности клеток HeLa в результате действия МНМ может быть связано как со снижением метаболической активности клеток, гак и с задержкой пролиферации по механизму «cell cycle checkpoint». В ответ на возникший стресс, в том числе и на повреждение генома, такая задержка неизбежна и необходима для его репарации. Если репарация невозможна или затруднена, то активируется цепь реакций, завершающаяся апоптозом. Сравнение динамики жизнеспособности (рис. 2, а) а также оценка численности клеток HeLa свидетельствуют о том, что в течение первых 48 час заметной задержки деления клеток, обработанных МНМ, не происходит. Расхождение кривых для интактных и МНМ-обработанных клеток наблюдается после 48 час. Аналогичный ход отмечается и для кривых, описывающих динамику апоптоза этих клеток (рис. 2, б). Это говорит о том, что цитотоксический эффект МНМ на клетках HeLa обусловлен главным образом их апоптотаческой гибелью.

Апоптозу предшествует процесс, формирующий ДР в МНМ-обработанных клетках (рис. 3). Тот факт, что ДР в ДНК, как и последующий апоптоз MMR-профицитных клеток HeLa, обнаруживаются спустя 1 - 2 цикла репликации после воздействия метилирующим агентом, позволяет исключить возможность индукции ДР в результате таких эксцизионных механизмов репарации как BER (base excision repair) и NER (nucleotide excision repair), поскольку они, скорее всего, осуществляют свою функцию в дорепликативный период и оперируют с такими модификациями оснований, которые препятствуют нормальному ходу репликации. В случае действия МНМ, таковыми являются в основном N-метилированные основания [Tatsuka et al., 1995; Grombacher, Kaina, 1996]. «По-стрепликативные» ДР появляются и не в результате прямого действия агента на ДНК, в силу их отсроченное™ от момента обработки. Таким образом, получен-

ные нами результаты говорят в пользу того, что ДР формируются в ходе функционирования пострепликативной коррекции, MMR. Важным повреждением, возникающим при действии МНМ, является 06-MeG [Bignami et al., 2000]. O6-MeG не может быть репарирован механизмом BER, поскольку он не узнается ни одной из известных ДНК-гликоэилаз: в связи с отсутствием в клетке О-специфичных алкилгликозилаз, репарация 06-MeG может осуществляться главным образом прямым деметилированием метилтрансферазой [Pegg, Byers, 1992]. В условиях подавления ее активности ингибитором 06-bzG клетки, содержащие в геноме 06-MeG, вступают в цикл. При этом 06-MeG не является стопором для ДНК-полимеразы, которая узнает в нем аденин в силу их структурного сходства, но в то же время он не комплементарен ни одному из 4-х оснований ДНК. Формируются некорректные пары 06-MeG : С и 06-MeG : Т, являющиеся субстратом для MMR. Безуспешные циклы эксцизия - ресинтез во время коррекционной репарации приводят к появлению ДР в области, прилегающей к 06-MeG. Вероятность такой трансформации безразрывного дефекта 06-MeG в разрыв возрастает в связи с тем, что размер эксцизионной бреши при функционировании MMR может превышать 1000 пар нуклеотидов [Bellacosa et al., 1999]. Таким образом, в MMR-профицитных клетках HeLa обнаруживаются признаки гено- и цитоток-сичности МНМ, проявляющиеся спустя не менее 2-х клеточных циклов.

Одновременно наши результаты показывают, что в отличие от HeLa, MMR-дефицитные клетки НСТ116 обнаруживают устойчивость к МНМ по всем использованным нами показателям гено- и цитотоксичности (рис. 2, в, г, рис. 3). Исследования с этопозидом показали, что эта устойчивость, по-видимому, связана не с пониженной способностью клеток НСТ116 к апоптозу вообще. Как видно их чувствительность к этопозиду и к ДР, индуцированным агентом, примерно такая же, как и у MMR-полноценных клеток HeLa (рис 4).

Приведенные ранее литературные данные о генетической нестабильности клеток Colo320HSR указывают на то, что в них может быть понижена активность MMR. Однако подобно MMR-профицитным клеткам HeLa, клетки Colo320HSR снижали свою жизнеспособность и накапливали разрывы в ДНК в ответ на МНМ-воздействие (рис.6, а, в). С другой стороны, образовавшиеся разрывы не индуцировали в клетках Colo320HSR увеличение частоты апоптоза (рис. 6, б, г, д). Во многих опухолевых клетках обнаруживается один из нескольких механизмов, позволяющих им избежать апоптоза: повышенная экспрессия транскрипционного фактора NFkB, обладающего антиапоптотической активностью [Payne et al., 1998]; повышенная экспрессия белка bcl-2, защищаю-

щего митохондрии [Yang et al., 1997]; повышенная экспрессия ингибиторов кас-паз [Wang et al., 1998]; мутации в гене р53 [Hollstein et al., 1994]. Поэтому апоп-готический индекс опухолевых клеток вряд ли находится в строгой корреляции с функциональной активностью их системы MMR, что и подтверждают результаты исследования Colo320HSR. Более высокая толерантность к ДР клеток Colo320HSR по сравнению с другими исследованными здесь клетками, возможно объясняет их более высокую хромосомную нестабильность.

Рисунок 8 представляет итог проведенной работы — количество вторичных разрывов, образовавшихся спустя 48 час после МНМ-обработки 3-х линий опухолевых клеток с различным MMR-статусом. Этот результат является количественной презентацией функциональной активности системы коррекционной репарации, MMR в исследованных нами линиях опухолевых клеток человека. Как видно, все колоректальные опухолевые клетки проявляют достоверное снижение количества МНМ-индуцированных вторичных двунитевых разрывов в ДНК по сравнению с клетками HeLa. Это снижение прямо коррелирует с дефицитом коррекционной репарации в этих клетках.

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

с; и s ОТ

_С

HeLa Сп1л32П НСТ116

Рисунок 8. Число вторичных двунитевых разрывов (N1), индуцированных через 48 часов после обработки клеток МНМ

Хотя разброс значений N в клетках НСТ116 перекрывает значения в Co1o320HSR, тем не менее, особенности ответа Colo320HSR на действие метил-нитрозомочевины (отсутствие апоптоза, и одновременно снижение жизнеспособности за счет задержки клеточного цикла) позволяют нам утверждать, что эта линия клеток по активности MMR занимает промежуточное положение между MMR-профицитными HeLa и MMR-дефицитными НСТ116 линиями клеток.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что цитотоксический эффект МНМ на клетках HeLa проявлялся на 3-й сутки после действия агента.

2. Раньше этого срока (через 48 час) в клетках обнаружены двунитевые разрывы в ДНК.

3. MMR-дефицитные клетки НСТ116 устойчивы к МНМ: в них не возникают двунитевые разрывы, и отсутствует апоптоз в течение 72 час после действия МНМ.

4. Обе линии клеток проявляют высокую чувствительность к геноток-сическому действию этопозида, классическому индуктору нерепа-рируемых двунитевых разрывов в ДНК. Этопозид индуцирует в клетках двунитевые разрывы (через 6-12 час) и последующий апоптоз (через 24 час).

5. По уровню МНМ-индуцированной гено- и цитотоксичности клетки Colo320HSR занимают промежуточное положение между MMR-профицитными клетками HeLa и MMR-дефицитными НСТ116. Вместе с тем, по частоте апоптоза клетки Colo320HSR остаются толерантными к возникшим в их ДНК двунитевым разрывам.

6. Впервые в клетках Colo320HSR обнаружена нейтральная мутация в гене MSH2 (трансверсия GGA-»GGG в 520 кодоне 10 экзона).

7. Впервые на трех линиях опухолевых клеток показана прямая корреляция между количеством вторичных двунитевых разрывов, возникших в пострепликативный период, и эффективностью системы MMR.

Публикации

Статьи:

1. Тронов В.А., Константинов Е.М., Крамаренко И.И. Роль эксцизионных механизмов репарации ДНК в индукции аиоптоза // Биохимия.-2002.-Т. 61.-С. 882-889.

2. Тронов В.А., Константинов Е.М., Крамаренко И.И. Сигнал к апоптозу, индуцированный гипертермией, и пути его передачи в клетке // Цитология.-2002.-Т. 44.-С. 1079-1088.

3. Тронов В.А., Крамаренко И.И., Карпухин A.B. Рак толстого кишечника: дефицит репарации, нестабильность генома, устойчивость к апоптозу, оценка риска заболевания//Вопросы онкологии.-2005.-Т. 51.-С. 159-166.

4. Тронов В.А., Крамаренко И.И., Смирнова Т.Д., Терехов С.М. Сравнение гено- и цитотоксического эффектов метилнитрозомочевины на линиях клеток, профицитных и дефицитных по коррекционной репарации ДНК (MMR) // Цитология.-2006.-Т. 48.-С. 19-27.

Тезисы конференций, симпозиумов и т.д.:

1. Тронов В.А., Константинов Е.М., Крамаренко И.И. Сходство и различие путей развития апоптоза, индуцированного гипертермией и окислительным стрессом. IV съезд по радиационным исследованиям. Москва, 20 - 24 ноября 2001. Тезисы докладов. Т.1, стр. 331.

2. Константинов Е.М., Тронов В.А., Крамаренко И.И. Сходство и различие путей развития апоптоза в лимфоцитах крови человека, индуцированного окислительным стрессом и гипертермией. Восьмая научная конференция Института химической физики им. H.H. Семенова РАН. Москва, апрель 2002. Тезисы докладов, стр. 56.

3. Константинов Е.М., Тронов В.А., Крамаренко И.И. Исследование связи репарации повреждений ДНК с гибелью покоящихся клеток - лимфоцитов крови человека. Девятая научная конференция Института химической физики им. H.H. Семенова РАН. Москва, ноябрь 2003. Тезисы докладов, стр. 54.

4. Крамаренко И.И., Тронов В.А., Константинов Е.М. Роль эксцизионного механизма корректирующей репарации ДНК в индукции апоптоза в опухолевых клетках человека. Девятая научная конференция Института химической физики им. H.H. Семенова РАН. Москва, ноябрь 2003. Тезисы докладов, стр. 55.

5 Константинов Е.М, Крамаренко И.И., Смирнова Т.Д., Терехов С.М., Тронов В.А. Роль репарации ДНК в развитии клеточной гибели, индуцированной генотоксическими воздействиями 1 Съезд Общества клеточной биологии и Международный симпозиум по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология, 2003,45, 888-889.

6 Тронов В.А., Крамаренко И.И., Смирнова Т.Д., Терехов С.М., Корректирующая репарация ДНК участвует в индукции апоптоза в клетках HeLa, обработанных алкилирующим агентом метилнитрозомочевиной. 1 Съезд Общества клеточной биологии и Международный симпозиум по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология, 2003,45,937-938.

7. Крамаренко И.И., Тронов В.А. Сравнение гено- и цитотоксического эффектов метилнитрозомочевины на линиях клеток, профицитных и дефицитных по коррекционной репарации ДНК (MMR). Десятая научная конференция Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. Москва, апрель 2005. Тезисы докладов, стр. 96.

8. Kramarenko I.I., Tronov V.A. Comparison of genotoxic and cytotoxic responses of mismatch repair-proficient (HeLa) and mismatch repair-deficient (HCT116) human tumor cells to methylnitrosourea. Possible approach to evaluation of functional activity of mismatch repair and of cancer risk. 35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society "Environment and human genetic disease- Causes, mechanisms and effects". Kos Island, Greece, 2005.

»-2479

Подписав > в печать Мэ^лД- 2006 г. Формат 60x84/16. заказ № .ТиражНов экз. ПлИ.^ .

Отпечатано вРИр'С ФИАН с оригинала-макета заказчика. 1199Э1 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 13251 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крамаренко, Инга Игнатьевна

Введение

Обзор литературы по теме

2.1. МЕХАНИЗМЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ДНК В КЛЕТКЕ

2.1.1. Дорепликативная эксцизионная репарация

2.1.2. Пострепликативная эксцизионная репарация

2.2. 06-MeG ИНДУКТОР MMR И АПОПТОЗА

2.3. РАК ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА: ДЕФИЦИТ MMR, ОЦЕНКА РИСКА РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Собственные исследования

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1.1. Клетки

3.1.2. Воздействия

3.1.3. Оценка жизнеспособности клеток с использованием МТТ-теста

3.1.4. Определение жизнеспособности по апоптотическому индексу

3.1.5. Определение количества двунитевых разрывов методом ДНК-комет

3.1.6. Определение мутаций в генах MLH1 и MSH2 в клетках Colo320HSR

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.2.1. Влияние МНМ на клетки HeLa и НСТ

3.2.2. Гено- и цитотоксический эффекты МНМ на клетках Colo320HSR

3.2.3. Мутации в генах MLH1 и MSH2 в клетках Colo320HSR

3.3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль коррекционной репарации ДНК (MMR) в механизме гено- и цитотоксического действия метилнитрозомочевины в опухолевых клетках человека"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рак толстого кишечника (РТК) является одной из самых распространенных онкопатологий в развитых странах. В России эта форма рака занимает 3-место после рака легкого и желудка. За период 1992-1995 г. зарегистрировано 40000 случаев заболевания. Смертность составила более 75%. Статистика заболевания по Европе за 1992-1995: в 130000 случаях заболевания смертельные исходы наблюдались в 75% [Александров, 2003]. В США в 2002 году было зарегистрировано 142000 случаев заболевания РТК. Кумулятивный риск заболевания РТК на протяжении жизни индивида составляет 5-6% [Grady, 2003]. 3-5 % всех случаев заболеваний приходится на наследственную (семейную) форму, которая характеризуется высоким риском заболевания (до 90% в течение жизни). Во всех случаях наследственной формы РТК в опухолевых клетках обнаруживаются свидетельства дефицита пострепликативной корректирующей репарации ДНК (MMR, mismatch repair).

Из всех известных на сегодня заболеваний, связанных с генетическими дефектами и предрасположенностью к раку, только в двух прослеживается однозначно связь с дефектами в механизмах репарации ДНК. Это наследственный неполипозный рак толстого кишечника (НРТК, синдром Линча) и пигментная ксеродерма [Jiricny, 1994; Friedberg et al., 1995; Bootsma et al., 1998].В случае НРТК дефекты MMR проявляются в виде мутаций в генах системы MMR и/или в виде микросателлитной нестабильности (МСН). Поэтому мутации генов системы MMR и микросателлитная нестабильность генома в опухолевых клетках стали распространенными маркерами заболевания НРТК [Vasen et al., 1999].

В то же время в многочисленных исследованиях показано, что в 30% случаев заболевания спорадическим РТК в клетках опухолей также наблюдается МСН генома [Штам и др., 2004; Boland et al., 1998]. Однако, в отличие от семейной формы заболевания, здесь МСН чаще всего ассоциирована не с мутациями в генах системы MMR, а с гиперметилированием промоторов этих генов [Veigl et al., 1998]. Сюда же можно отнести и многочисленную группу заболеваний, формирующих так называемый «спектр РТК» [Vasen et al., 1999]. Таким образом, для довольно большой группы заболеваний РТК такой показатель как мутации генов MMR не может быть исчерпывающим маркером заболевания. Мы полагаем, что в большей степени этому требованию соответствует такой показатель как функциональная активность MMR. Кроме того, разработка более-менее универсальных маркеров заболевания позволило бы выделить группы риска, прогнозировать возникновение заболевания и предупреждать его.

Как следствие дефицита MMR, в опухолевых клетках формируется мутаторный фенотип и устойчивость к цитотоксическому действию алкилирующих/метилирующих агентов [Aquilina et al., 2000]. Главным цитотоксическим повреждением при химическом метилировании ДНК является О -метилгуанин (06-MeG) [Kaina et al., 1993]. Две особенности отличают 06-MeG от других алкилированных оснований: в клетках млекопитающих он может быть репарирован только прямым деметилированием при участии метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) [Kaina et al., 1990]; не будучи репарированным, это повреждение не блокирует репликацию и сохраняется в пострепликативный период [Kaina et al., 1997]. В этом случае образуется некорректная пара Oó-MeG : Т, которая является субстратом для механизма коррекционной репарации

ДНК (MMR). 06-MeG сильно напоминает аденин, и потому полимераза в процессе синтеза вставляет комплементарный ему тимин, формируя неправильную пару 06-MeG : Т. В ответ инициируется MMR, начинающая процесс эксцизионного удаления тимина в дочерней цепочке ДНК. Создается тупиковая для MMR ситуация, когда в матрице присутствует неудаляемый дефект, а полимераза не может подобрать ему комплементарную пару, всякий раз в процессе ресинтеза воспроизводя пару 06-MeG : Т. Если клетка, содержащая в геноме такую пару, вступит в следующий цикл репликации, то неизбежной будет транзиция G : С—»A : Т (последовательно: G : С + Alk -» 06-MeG : С +. I цикл репликации-» 06-MeG : Т + II цикл репликации —> А : Т). Показано, что в опухолевых клетках эпителия ТК (дефицитных по MMR) частота таких транзиций соответствует 1 на 8 06-MeG для гена hprt [Rasouli-Nia et al., 1994], но может быть и выше в случае, например, онкогена K-ras [Esteller et al., 2000; Jackson et al., 1999]. Однако вступлению во второй цикл репликации препятствует активная система MMR, которая возобновляет процесс эксцизии и последующего ресинтеза. Разрешается эта коллизия радикально: длительное существование обширной бреши в дочерней цепи ДНК делает неизбежным формирование двунитевого разрыва под действием внутриклеточных эндонуклеаз. Его появление запускает механизм апоптоза. Таким образом, эффективная система MMR инициирует программу гибели полноценных по репарации клеток, содержащих 06-MeG. Дефицитные по MMR опухолевые клетки при РТК сохраняют жизнеспособность. При этом они приобретают новые мутации за счет G : С -> А : Т транзиций, что, с одной стороны, увеличивает вероятность их трансформации, а с другой — расширяет селективные возможности опухолевых клеток и позволяет им адаптироваться к генотоксическим воздействиям. Этот механизм может частично объяснять их пониженную способность к апоптозу в ответ на действие алкилирующих агентов [Bedi et al., 1995]. Таким образом, в основе механизма цитотоксического действия 06-MeG лежат вторичные разрывы ДНК, которые формируются в ходе функционирования системы MMR [Kaina, 2003].

Цель и основные задачи исследования

Цель настоящего исследования состоит в проверке на опухолевых клетках человека предположения о том, что количество вторичных двунитевых разрывов ДНК (ДР) в ответ на действие монофункционального метилирующего агента может отражать эффективность функционирования системы MMR в клетке.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

3. Исследовать частоту гибели этих клеток по механизму апоптоза, индуцированного метилнитрозомочевиной.

4. Исследовать количество и динамику образования вторичных двунитевых разрывов в клетках под влиянием МНМ.

6. Сопоставить эти показатели между собой и прокоррелировать их с предполагаемой активностью MMR.

Научная новизна

1. В работе предложен механизм реализации генотоксического действия монофункционального метилирующего агента метилнитрозомочевины в цитотоксический эффект через вторичные двунитевые разрывы ДНК, возникающие в результате функционирования пострепликативной MMR.

Ч Таким образом, три показателя: количество вторичных МНМиндуцированных разрывов ДНК, цитотоксический эффект МНМ (частота отсроченного апоптоза) и эффективность MMR - представлены взаимосвязанными в одном механизме.

3. Впервые проведено исследование первичной структуры генов MLH1 и MSH2 системы MMR клеток рака сигмовидной кишки человека Colo320HSR. Обнаружена мутация-трансверсия в 520 кодоне 10-го экзона гена MSH2. Показано, что по эффективности MMR, выраженной в количестве вторичных разрывов ДНК, эта линия клеток занимает промежуточное положение между линиями HeLa и НСТ116, занимающих крайние позиции MMR-профицитных и MMR-дефицитных клеток. 4. Результаты проведенного исследования являются основанием для разработки простой системы тестирования MMR с целью прогноза эффективности химиотерапии, а также для оценки риска возникновения рака (используя соматические клетки человека — лимфоциты здоровых доноров и онкологических больных).

Научно-практическая значимость работы

Результаты данного исследования могут иметь фундаментальное и прикладное значение.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. Один из путей реализации цитотоксического эффекта метилнитрозомочевины в клетках включает в себя: образование 06-MeG - I -й цикл репликации - формирование неканонической пары (06-MeG : Т) - активизацию MMR, повторяющиеся циклы эксцизия-ресинтез в функционирующей MMR (абортивная MMR) -формирование обширной долго живущей однонитевой бреши в ДНК - трансформация бреши в ДР - инициация сигнального пути апоптоза.

3. Клетки, дефицитные по MMR (в данной работе - клетки HCT 116), проявляют устойчивость к МНМ (по показателям клеточной гибели) и не обнаруживают предшествующих апоптозу двунитевых разрывов в ДНК.

4. Клетки аденокарциномы сигмовидной кишки Colo320HSR содержат нейтральную мутацию в 520 кодоне 10 экзона гена MSH2. По количеству МНМ-индуцированных вторичных разрывов клетки Colo320HSR занимают промежуточное положение между MMR-профицитными клетками HeLa и дефицитными клетками HCT 116. В клетках линии Colo320HSR наблюдается пониженная способность МНМ-индуцированных ДР вызывать апоптоз.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Крамаренко, Инга Игнатьевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что цитотоксический эффект МНМ на клетках HeLa проявлялся на 3 сутки после действия агента.

2. Раньше этого срока (за 24 часа) в клетках обнаружены двунитевые разрывы в ДНК.

4. Обе линии клеток проявляли высокую чувствительность к генотоксическому действию этопозида, классическому индуктору нерепарируемых двунитевых разрывов в ДНК. Этопозид индуцирует в клетках двунитевые разрывы (через 6 -12 час) и последующий апоптоз (через 24 час).

6. Впервые в клетках Colo320HSR обнаружена нейтральная мутация в гене MSH2 (трансверсия GGA->GGG в 520 кодоне 10 экзона).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крамаренко, Инга Игнатьевна, Москва

1. Тронов В. А., Константинов Е.М., Крамаренко И.И. Роль эксцизионных механизмов репарации ДНК в индукции апоптоза // Биохимия.-2002.-Т. 67.-С. 882-889.

2. Штам Т.А., Вострюхина O.A., Гуляев В.В., и др. Генетические повреждения в ходе прогрессии наследственного неполипозного рака толстой кишки // ДАН.-2004.-Т. 395.-С. 126-131.

3. Aarnio M., Sankila R., Pukkala E., et al. Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair genes // Int. J. Cancer.-1999.-Vol. 81.-P. 214218.

4. Aebi S., Kurdi-Haidar B., Gordon R., et al. Loss of DNA mismatch repair in acquired resistance to cisplatin // Cancer Res.-1996.-Vol. 56.-P. 30873090.

5. Allen D.J., Makhov A., Grilley M., et al. MutS mediates heteroduplex loop formation by a translocation mechanism // EMBO J.-1997.-Vol. 16.-p. 4467-4476.

6. Barnes C.J., Wahl A.F., Shen B., et al. Mechanism of Tracking and Cleavage of Adduct-damaged DNA Substrates by the Mammalian 5/- to 3/ -Exonuclease/Endonuclease RAD2 Homologue lor Flap Endonuclease 1 // J. Biol. Chem.-1996.-Vol. 271.-P. 29624-29631.

7. Barras F., Marinus M.G. The great GATC: DNA methylation in E. coli // Trends Genet.-1989.-Vol. 5.-P. 139-143.

8. Bedi A., Pasricha P.J., Akhtar A.J., et al. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer // Cancer Res.-1995.-Vol. 55.-P. 18111816.

9. Bellacosa A. Functional interactions and signaling properties of mammalian DNA mismatch repair proteins // Cell Death and Differentiation.-2001.-Vol. 8.-P. 1076-1092.

10. Bellacosa A., Cicchillitti L., Schepis F., et al. MED1, a novel human methyl-CpG-binding endonuclease, interacts with DNA mismatch repair protein MLH1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1999.-Vol. 96.-P. 39693974.

11. Beneke R., Geisen C., Zevnik B., et al. DNA excision repair and DNA damage-induced apoptosis are linked to Poly(ADP-ribosyl)ation but have different requirements for p53 // Mol. Cell Biol.-2000.-Vol. 20.-P. 66956703.

12. Beranek D.T. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkilation with monofunctional alkylating agents // Mutat. Res.-1990.-Vol. 231.-P. 11-30.

13. Bignami M., O'Driscoll M., Aquilina G., Karran P. Unmasking a killer: DNA 06-methylguanine and the cytotoxicity of methylating agents // Mutat. Res.-2000.-Vol. 462.-P. 71-82.

14. Bocker T., Ruschoff J., Fishel R. Molecular diagnostics of cancer predisposition: hereditary non-polyposis colorectal carcinoma and mismatch repair defects // Biochim. Biophys. Acta.-1999.-Vol. 1423.-P. 110.

15. Borner M.M., Joncourt F., Hotz M.A. Similarity of apoptosis induction by 2-chlorodeoxyadenosine and cisplatin in human mononuclear blood cells //Br. J. Cancer.-1997.-Vol. 76.-P. 1448-1454.

16. Chou K.-M., Cheng Y.-C. An nucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on 3 ' mispaired DNA // Nature.-2002.-Vol. 415.-P. 655-659.

17. Claij N., Te Riele H. Methylation tolerance in mismatch repair proficient cells with low MSH2 protein level // Oncogene.-2002.-Vol. 21.-P. 28732879.

18. Croitoru M.E., Cleary S.P., Di Nicola N., et al. Association between biallelic and monoallelic germline MYH gene mutations and colorectal cancer risk//J. Natl. Cancer Inst.-2004.-Vol. 96.-P. 1631-1634.

19. Drummond J.T., Li G.M., Longley M.J., Modrich P. Isolation of an hMSH2-pl60 heterodimer that restores DNA mismatch repair to tumor cells // Science.-1995.-Vol. 268.-P. 1909-1912.

20. Fichtinger-Schepman A.M., van der Veer J.L., Den Hartog J.H., et al. Adducts of the antitumor drug cis-diamminedichloroplatinum(II) with DNA: formation, identification, and quantitation // Biochemistry.-1985.-Vol. 24.-P. 707-713.

21. Genschel J., Littman S.J., Drummond J.T., Modrich P. Isolation of MutSbeta from human cells and comparison of the mismatch repair specificities of MutSbeta and MutSalpha // J. Biol. Chem.-1998.-Vol. 273.-P. 19895-19901.

22. Goodman M.F., Cai H., Bloom L.B., Eritja R. Nucleotide insertion and primer extension at abasic template sites in different sequence contexts // Ann. N. Y. Acad. Sci.-1994.-Vol. 726.-P. 132-142.

23. Grady W.M. Genetic testing for high-risk colon cancer patients // Gastroenterology.-2003.-Vol. 124.-P. 1574-1594.

24. Grombacher T., Kaina B. Isolation and analysis of inducibility of the rat N-methylpurine-DNA glycosylase promoter // DNA Cell Biol.-1996.-Vol. 15.-P. 581-588.

25. Holley W.R., Chatterjee A. Clusters of DNA induced by ionizing radiation: formation of short DNA fragments. I. Theoretical modeling // Radiat.Res.-1996.-Vol. 145.-P. 188-199.

26. Hollstein M., Rice K., Greenblatt M.S., et al. Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell-lines // Nucl. Acids Res.-1994.-Vol. 22.-P. 3551-3555.

27. Hotchkiss J.H. A review of current literature on N-nitroso compounds in foods // Adv. Food Res.-1987.-Vol. 3l.-P. 53-115.

28. Jiricny J. Colon cancer and DNA repair: have mismatches met theirmatch?//Trends Genet.-1994.-Vol. 10.-P. 164-168.

29. Jiricny J., Hughes M., Corman N., Rudkin B.B. A human 200-kDa proteinbinds selectively to DNA fragments containing G.T mismatches // Proc.

30. Natl. Acad. Sci. USA.-1988.-Vol. 85.-P. 8860-8864.

31. Kaina B., Lohrer H., Karin M., Herrlich P. Overexpressed humanmetallothionein IIA gene protects Chinese hamster ovary cells from killingby alkylating agents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1990.-Vol. 87.-P.2710-2714.

32. Karpukhin A.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., et al. Frequencies of single-nucleotide polymorphisms and mutations in the BRCA1 gene in patients with hereditary breast or ovarian cancer // Dokl. Biol. Sci.-2002.-Vol. 383.-P. 144-146.

33. Karran P., Hampson R. Genomic instability and tolerance to alkylating agents // Cancer Surv.-1996.-Vol. 28.-P. 69-85.

34. Kolodner R.D., Hall N.R., Lipford J., et al. Structure of the human MSH2 locus and analysis of two Muir-Torre kindreds for msh2 mutations // Genomics.-1994.-Vol. 24.-P. 516-526.

35. Margison G.P., Povey A.C., Kaina B., Santibanez Koref M.F. Variability and regulation of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase // Carcinogenesis.-2003.-Vol. 24.-P. 625-635.

36. Masramon L., Ribas M., Cifuentes P., et al. Cytogenetic characterization of two colon cell lines by using conventional G-banding, comparative genomic hybridization, and whole chromosome painting // Cancer Genet. Cytogenet.-2000.-Vol. 121.-P. 17-21.

37. McGlynn A.P., Wasson G.R., O'Reilly S., et al. Detection of replicated integrity in small colonic biopsies using the BrdUrd comet assay // Br. J. Cancer.-2003.-Vol. 88.-P. 895-901.

38. Mehta R.G. Experimental basis for the prevention of breast cancer // Eur. J. Cancer.-2000.-Vol. 36.-P. 1275-1282.

39. Meikrantz W., Bergom M.A., Memisoglu A., Samson L. 06-alkylguanine DNA lesions trigger apoptosis // Carcinogenesis.- 1998.-Vol. 19.-P. 369372.

40. Nicolaides N.C., Papadoloulos N., Liu B., et al. Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer // Nature.-1994,-Vol. 371.-P. 75-80.

41. Ochs K., Kaina B. Apoptosis induced by DNA damage 06-methylguanine is BCL-2 and caspase-9/3 regulated and Fas/caspase-8 independent // Cancer Res.-2000.-Vol. 60.-P. 5815-5824.

42. Ostling O., Johanson K.J. Bleomycin, in contrast to gamma irradiation, induces extreme variation of DNA strand breakage from cell to cell // Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med.-1987.-Vol. 52.-P. 683-691.

43. Palombo F., Gallinari P., Iaccarino I., et al. GTBP, a 160-kilodalton protein essential for mismatch-binding activity in human cells // Science.-1995.-Vol. 268.-P. 1912-1914.

44. Parker A.R., O'Meally R.N., Oliver D.H., et al. 8-Hydroxyguanosine Repair Is Defective in Some Microsatellite Stable Colorectal Cancer Cells //Cancer Res.-2002.-Vol. 62.-P. 7230-7233.

45. Parsons R., Li G.M., Longley M.J., et al. Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells // Cell.-1993.-Vol. 75.-P. 12271236.

46. Parsons R., Li G.M., Longley M.J., et al. Mismatch repair deficiency in phenotypically normal human cells // Science.-1995.-Vol. 268.-P. 738740.

47. Partlin M.M., Homer E., Robinson H., et al. Interactions of the DNA mismatch repair proteins MLH1 and MSH2 with c-MYC and MAX // Oncogene.-2003.-Vol. 22.-P. 819-825.

48. Pegg A.E., Dolan M.E., Moschel R.C. Structure, function, and inhibition of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.-1995.-Vol. 51.-P. 167-223.

49. Peltomaki P. DNA mismatch repair and cancer // Mutat. Res.-2001.-Vol. 488.-P. 77-85.

50. Povey A.C., Hall C.N., Badawi A.F., et al. Elevated levels of the pro-carcinogenic adduct, 0(6)-methylguanine, in normal DNA from the cancer prone regions of the large bowel // Gut.-2000.-Vol. 47.-P. 362-365.

51. Povey A.C., Badawi A.F., Cooper D.P., et al. DNA alkylation and repair in the large bowel: animal and human studies // J. Nutr.-2002.-Vol. 132.-P. 3518S-3521S.

52. Preuss I., Eberhagen I., Haas S., et al. 06-methylguanine-DNA methyltransferase activity in breast and brain tumors // Int. J. Cancer.-1995.-Vol.61.-P. 321-326.

53. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, NY.-1989.

54. Savio M., Stivala L.A., Bianchi L., et al. Involvement of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in DNA repair induced by alkylating agents and oxidative damage in human fibroblasts // Carcinogenesis.-1998.-Vol. 19.-P. 591-596.

55. Schreiber V., Huntin D., Trucco C., et al. A dominant-negative mutant of human poly(ADP-ribose) polymerase affects cell recovery, apoptosis, and sister chromatid exchange following DNA damage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1995.-Vol. 92.-P. 4753-4757.

56. Seeberg E., Eide L., Bjoras M. The base excision repair pathway // Trends Biochem. Sci.-1995.-Vol. 20.-P. 391-397.

57. Seigneur M., Bidnenko V., Ehrlich S.D., Michel B. RuvAB acts at arrestedreplication forks // Cell.-1998.-Vol. 95.-P. 419-430.

58. Shivji K.K., Kenny M.K., Wood R.D. Proliferating cell nuclear antigen isrequired for DNA excision repair// Cell.-1992.-Vol. 69.-P. 367-374.

59. Sia E.A., Kokoska R.J., Dominska M., et al. Microsatellite instability inyeast: dependence on repeat unit size and DNA mismatch repair genes //

60. Mol. Cell Biol.-1997.-Vol. 17.-P. 2851-2858.

61. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res.-1988.-Vol. 175.-P. 184-191.

62. Thykjaer T., Christensen M., Clark A.B., et al. Functional analysis of the mismatch repair system in bladder cancer // Br. J. Cancer.-2001.-Vol. 85.-P. 568-575.

63. Vasen H.F.A., Meklin J.-P., Meera Khan P., et al. The International Collaborative Group on hereditary non-polyposis colorectal cancer // Dis. Colon Rectum.-1991.-Vol. 34.-P. 424-425.

64. Wildenberg J., Meselson M. Mismatch repair in heteroduplex DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1975.-Vol. 72.-P. 2202-2206.

65. Yang J., Liu X., Bhalla K., et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome C from mitochondria blocked // Science.-1997.-Vol. 275.-P. 1129-1132.

66. Yu Z., Chen J., Ford B.N., et al. Human DNA repair systems: an overview // Environ Mol. Mutagen.-1999.-Vol. 33.-P. 3-20.

67. Zhou Z.-Q., Manguino D., Kewitt K., et al. Spontaneous hepatocellular carcinoma is reduced in transgenic mice overexpressing human 06-methylguanine-DNA-methyltransferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-Vol. 98.-P. 12566-12571.

Информация о работе

Крамаренко, Инга Игнатьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль коррекционной репарации ДНК (MMR) в механизме гено- и цитотоксического действия метилнитрозомочевины в опухолевых клетках человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы