Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль карбоангидразы в ингибировании избытком CO2 фотосинтеза протопластов C3 растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль карбоангидразы в ингибировании избытком CO2 фотосинтеза протопластов C3 растений"

Р Г Б ОД На правах рукописи

УДК 531.132.1

2 4 ДПР 1925

Игнатова Людмила Казимировна

РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗЫ В ИНГИБИРОВАНИИ ИЗБЫТКОМ СО, ФОТОСИНТЕЗА ПРОТОПЛАСТОВ С3 РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в

Институте почвоведения и Российской Академии Наук

фотосинтеза

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Романова А.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Пронина H.A.

кандидат биологических наук Лысенко Г.Г.

Ведущая организация: Институт биохимии им.А.Н.Баха Российской Академии Наук

Защита состоится "¡0 " ,МйЛ 1995 г. в /У

Ъ-0

- на заседании

диссертационного совета К.053.05. 14 в Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан Л-М-гЛ-^ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук. Полесская О.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Углекислота является субстратом ключевой реакции фотосинтеза - карбоксилирования рибулеэо-1,5-бисфосфата, катализируемой бифункциональным ферментом рибулеэо-1,5-бисфос-фаткарбоксилазой/оксигеназой, который характеризуется сравнительно слабым сродством к СО, [Романова, 1991]. Известно, что добавление углекислоты вызывает стимуляцию фотосинтеза in vivo как у высших растений, так н у водорослей, что связано с устранением недостаточности С09 в центрах карбоксилирования.

В процессе эволюции были выработаны способы усиления угле-родэапасающей функции, которые развивались по двум направлениям: увеличения эффективности карбоксплирующей реакции (сродство РБФК/О к СО2 возрастает в ряду: фототрофные бактерии цианобактерии - водоросли - С, - С0 растения) и эволюции

4 J

(^-концентрирующих механизмов [Smith, 19881. Обязательным компонентом этих механизмов является карбоангидраза [Price, Badger, 1989; Thielmann et al., 1990]. У микроводорослей KA является единственным ферментом, активность которого варьирует при изменении концентрации СО2 в окружающей среде [Tsuzuki et ai . , 19841. Большая часть сведений о локализации в клетках и адаптивных свойствах растительной КА получены при изучении водорослей (водных фототрофов) [Пронина, Семененко, 1991; Aizawa, Miyachi, 19861.

Широко распространено мнение, что углекислота в клетки и хлоропласты высших растений проникает в виде СО2 [Heidt et al., 1974; Heidt, 19761. Однако существуют немногочисленные свидетельства поступления в хлоропласты [Poincelot, 1974; 1975; Cham-pigni, Bismuch, 19771 и протопласты высших растений [Volokita et al., 1981] также и иона бикарбоната. Некоторые авторы находят у высших растений признаки наличия С09-концентрирующего механизма [Mächler et al., 1986; 1990].

В то же время известно, что избыточные концентрации углекислоты могут оказывать иигибирующее действие на фотосинтез. Этот эффект показан на хлоропластах [Fnser, Heber, 1980; Werdan et al., 1975], протопластах [Игнатова, 1983; Heber, Krause, 1983] высших растений, клетках водорослей [Hogetsu, Miyachi,

Принятые сокращения:КА-карбоангидраза, АА-ацетаэоламид, С - неорганический углерод, РБФК/0 - рибулезо-1,5-бисфосфаткар-боксилаэа/оксигенаэа, ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

1979] и целых растениях [Woo, Wong, 1983]. Полагают, что причиной ингибирующего действия является подкисление стромы вследствие непрямого переноса протонов при поступлении и гидратации СО2 [Enser, Heber, 1980]. Однако некоторые авторы предполагают, что ингибирование фотосинтеза избытком СО2 может быть результатом недостатка энергоэквивалентов для цикла Кальвина, вследствие работы энергопотребляющего С02~концентриру-ющего механизма [Фридлянд, Калер, 1988].

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение механизмов ингибирования фотосинтеза при избыточном поступлении Сн в протопласты С^ растений. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить фотосинтетически активные протопласты мезофилла листьев Сд растений, клевера и гороха, и охарактеризовать влияние освещенности, температуры, pH и концентрации углекислоты на их фотосинтез.

2. Установить форму углекислоты, транспортируемую через плазмалемну, и исследовать возможное участие КА в процессе проникновения Сн в протопласты и ингибирования фотосинтеза бикарбонатом.

3. Проверить возможную связь избыточного поступления углекислоты в протопласт с энергетикой фотосинтеза.

Научная новизна работы. 1. Обнаружена КА активность, локализованная на плазмалемме протопластов клевера и гороха. Установлено, что плазмалемная КА характеризуется более слабым сродством к С0£, чем внутриклеточная форма фермента.

2. Показано превышение (3-5-кратное) буферной емкости хлоропластов клевера, более резистентных к избытку по

сравнению с буферной емкостью хлоропластов гороха. Этот факт позволяет считать одной из возможных причин разной реакции фотосинтеза протопластов клевера и гороха на сверхвысокую концентрацию СО2 различие буферных емкостей их хлоропластов.

Практическая ценность работы. Новые методические приемы, разработанные в диссертации, в частности, получение протопластов клевера и гороха с активным фотосинтезом, применение высоких концентраций бикарбоната для исследования КА активности плазмалеммы протопластов, оценка реакции растений на повышение концентрации углекислоты по фотосинтетическому выделению 0j могут быть использованы физиологами растений в научных исследованиях. Предложен удобный критерий интактности протопластов. Полученные результаты могут найти применение в исследованиях транспорта углекислоты в клетки высших растений.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации били представлены на Всесоюзном совещании "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" (г.Пущино, 1981); Всесоюзном совещании "Фотосинтез как основа продукционного процесса и продуктивности растений" (г.Чернигов, 1987); Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтеэирующих системах и их моделях" (г.Пущино, 1989); Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (г.Пущино, 1991); Международном совещании "Метаболизм углерода и азота при фотосинтезе" (г.Пущино, 1991); Российско-Американском совещании по фотосинтезу (г.Пущино, 1992); III съезде ВОФР (г.Санкт-Петербург, 1993).

Публикации■ По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 10 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 26 отечественных и 216 иностранных публикаций.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили горох (Pisum sativum L.) сорт Превосходный и клевер (Trifolium pratense L.) сорт ВИК-7, выращенные в оранжерее при температуре 23°/17° (день/ночь),

2

продолжительности фотопериода 12 часов и освещенности 90 Вт/м . Опыты проводили на протопластах или на хлоропластах, полученных из протопластов.

Протопласты гороха и клевера получали ферментативным методом с помощью целлюлазы и пектиназы, подобрав предварительно условия мацерации [Игнатова, 1980; 1990]. Для дополнительной оценки результатов ферментативной обработки использовали предложенный нами критерий интактности [Игнатова, 1980], представляющий собой отношение количества целых протопластов в миллилитре к содержанию хлорофилла в мг/мл суспензии.

Отмыв к у протопластов проводили в сахарозо-декстрановой смеси одно-, дву- или трехкратно в зависимости от требований, предъявляемых к чистоте препарата протопластов. Режим отдывки (время и скорость центрифугирования) и состав сред были подобраны в соответствии с рекомендациями [Leegood et al., 1982]. Интактность полученных протопластов, проверявшаяся по активности гликолатоксидазы полярографическим методом [Nishimura et al., 1985], составляла 90-100%.

Хлоропласт получали путем продавливания суспензии отмытых протопластов через нейлоновую сетку с диаметром пор 20 мкм и последующего центрифугирования при 250-g [Leegood et al., 1982].

Выделение кислорода протопластами определяли амперометри-ческим методом в стеклянной ячейке с платиновым электродом с использованием полярографа LP7 и самописца EZ-7 (Чехословакия).

Активность КА (КФ 4.2.1.1) определяли рН-метрическим методом в охлажденной до 2° ячейке [Романова, 1980] в веронало-вом и фосфатном буферах. В среду для определения КА активности интактных протопластов и в соответствующий контрольный вариант добавляли сорбит в концентрации 0,4 M для предотвращения осмотического шока протопластов. Активность фермента определяли в относительных единицах Вильбура и Андерсена по формуле А = (Т /Т - 1)-10 /мг хлорофилла, где TQ- время неэнзиматической реакции, Т -время реакции в присутствии фермента.

Содержание хлорофилла определяли в ацетоновых или этаноль-ных экстрактах по методам [Arnon, 1949; Kinterraan, De Mots, 1965].

Измерение флуоресценции проводили на установке [Ignatova et al., 1993] позволяющей одновременно регистрировать (в термостатируемой ячейке при перемешивании) изменения содержания кислорода (электрод Кларка) и квантового выхода флуоресценции хлорофилла а. Суспензию освещали голубым светом 400-600 нм через светофильтр СЗС-22. Флуоресценцию регистрировали с помощью ФЭУ, закрытого от возбуждающего света системой светофильтров с максимумом пропускания при 685 нм.

Определение буферной емкости проводили методом, описанным в работе [Опанасенко, 1980] в условиях поддержания над суспензией протопластов атмосферы инертного газа.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Большая часть наших результатов получена с использованием протопластов, которые являются удобными объектами для изучения фотосинтеза на клеточном уровне. Из протопластов легко могут быть получены хлоропласты, в то время как выделение их обычным механическим путем из многих видов высших растений технически затруднительно.

Листья гороха легко мацерируются целлюлолитическими ферментами. Процесс получения протопластов достаточно быстр, они хорошо хранятся в течение 10 часов без потери активности.

Ткани листьев клевера имеют ряд особенностей, в частности,

трудно мацерируемую клеточную оболочку и большое количество фенолов в листьях. Освобождающиеся при неизбежном разрушении части клеток фенолы влияют на функциональную активность целых протопластов. В диссертации подробно описаны условия выделения фотосинтетически активных протопластов клевера. Главные из них -выращивание растений в смеси торфа с вермикулитом при рН около 6,5, затемнение растений в процессе мацерации и обязательное добавление нерастворимого поливинилпирролидона для связывания фенолов.

В диссертации дана сравнительная характеристика протопластов клевера и гороха по отношению к освещенности, рН среды, температуре и концентрации С02-

У протопластов гороха наблюдался широкий рН оптимум активности фотосинтеза в пределах значений от 6 до 8 единиц рН при поддержании постоянной концентрации СО2 (100 мкИ) в среде (рис.2, кривая 3). У клевера столь же широкий оптимум сдвинут в щелочную сторону: от 7 до 9 единиц рН.

ВЫСОКИМИ

ИНГИБИРОВАНИЕ ФОТОСИНТЕЗА ПРОТОПЛАСТОВ ГОРОХА КОНЦЕНТРАЦИЯМИ БИКАРБОНАТА

Основное различие исследованных нами видов С^ растений

состояло в том, что ингибирование фотосинтеза протопластов

гороха наблюдалось при более низких концентрациях углекислоты,

чем у клевера: фотосинтез протопластов гороха снижался при

концентрациях бикарбоната в среде более 10 мИ (рН 7,1), тогда как

для протопластов клевера снижение фотосинтеза происходило при

концентрациях бикарбоната превышающих 40 мМ (рис.1).

. 160 Ф

и н т е з (%)

"ío-й-í¡3-?сг

Рис.1 Зависимость фотосинтеза протопластов листьев гороха (1) и клевера (2) от концентрации бикарбоната в реакционной среде. За 100% принята скорость выделения 0- при равновесной с воздухом

30 1КНС0-J, мМ

концентрации СО

Исследование влияния кислотности среды на выделение С>2 протопластами гороха без добавления бикарбоната показало (рис.2, кривая 1), что фотосинтез при рН 7 и ниже был близок к максимальному, а выше 7 быстро снижался, что можно объяснить недостатком СС^.

При постоянной сверхвысокой концентрации бикарбоната (10 мМ) наблюдалось ингибирование фотосинтеза в кислых и нейтральных средах (рис.2, кривая 2). Кроме того, бикарбонат смещал оптимум рН для С02_эависимого выделения в сторону щелочных значений.

При поддержании в среде постоянной концентрации СО2 (ЮОмкМ) наблюдался широкий максимум фотосинтеза (рис.2, кривая 3), что

виде СО,

свидетельствует

о

поступлении

углекислоты в

(концентрация добавленного КНСО^, рассчитанная по уравнению Гендерсона - Хассельбаха, при этом изменялась от 0,1 до 70 мМ). Добавление бикарбоната (до 500 мкМ по СО2) вызывало ингибирование фотосинтеза, величина которого одинакова во всем диапазоне исследованных значений pH (рис.2, кривая 4).

Мы предположили, что в случае протопластов, так же как и у хлоропластов lEnser, Heber, 1980], ингибирование вызвано непрямым переносом протона в щелочные компартменты протопласта. После проникновения в цитоплазму нейтральной молекулы СО2 происходит

%

100 80 60 40 20 0

..........................1-.-

\>

"Ж"

Рис.2 Влияние рН на скорость зависимого выделения О2

протопластами гороха и ингибирование сверхвысокими концентрациями СО2. При равновесной с воздухом концентрации СО2 (1), в присутствии 10 мМ КНСОд (2), при поддержании в среде постоянной концентрации СО2 (100 мкМ, кривая 3). Кривые нормированы, для 1 и 2 за 100% принята максимальная скорость выделения О2 при 10 мМ КНСО3, для кривой 3 максимальная скорость выделения ©2> Кривая 4 - степень ингибировакия при добавлении бикарбоната <500 мкМ по СО2) к суспензии протопластов, выделяющих О2 при 100 мкМ СО2.

её гидратация: С02 + 1^0 —>— НСО^ + 11 , приводящая к образованию протонов.

Противоположным действием на величину рН внутри хлоропласта обладает аммоний. Проникая через мембрану в виде NHj и соединяясь с протоном, аммоний смещает рН стромы в щелочную сторону [Crofts, 1967].

Для проверки гипотезы о связи механизма ингибирования выделения 07 протопластами гороха с подкислением стромы хлоропласта изменяли рН внутри протопласта добавлением ацетата и аммония в среду. Показано, что ацетат оказывал ингибирующее действие, подобно бикарбонату, а хлористый аммоний частично снижал ингибирующий эффект (табл.1). При рН 6,7 влияние лодкисленмя на скорость выделения О,, более заметно, чем при рН 7,1 (см. также рис,2, кривая 2). Добавление только аммония либо незначительно повышало скорость выделения , либо сохраняло ее на уровне контроля.

Таблица 1.

Влияние подкисляющих и подщелачивающих солея на скорость выделения О., протопластами листьев гороха. (Концентрация бикарбоната и ацетата 10 мМ, хлористого аммония 4 мМ ).

Скорость выделения 0о

Вариант (мкмоль 02/мг х л • ч а с 1

рП 6,7 рН 7,1

Без добавок 24,0 26,8

+ МаНСО^ 5,4 22,0

+ Ш14С1 30,6 28,2

№а!1С0д добавлен в темноте 1 ,2 11 ,6

+ Ш14С1 21,4, 28,0

Без добавок 34,6 27,2

+ СН3С00Ка 28,8 24,8

+ ЫНДС1 34,6 со C^ï

СН^СОО^ добавлен в темноте 22,2 20,6

+ Ш1ДС1 37,8 28,0

Если сдвиг рН стромы хлоропластов является основной причиной подавления их фотосинтеза при избыточном поступлении С09, то разная реакция протопластов клевера и гороха па повышение концентрации С0£ могла быть связана с разной способностью содержимого хлоропластов нейтрализовать избыточные протоны.

Прямые измерения величины буферной емкости хлоропластов обоих видов показали, что буферная емкость хлоропластов клевера во всем диапазоне исследуемых рН (от 4 до 9) была выше буферной емкости хлоропластов гороха (табл. 2).

Таблица 2.

Величины буферной емкости (Э) хлоропластов клевера и гороха при разных значениях рН.

Объект ß(pH) мкмоль Н+/мг хл-ед.рН)

pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

клевер 3,89 1,06 1 ,42

горох 1 ,56 0,24 0,36

ß(pH)клевера 2,5 4,4 4,4

0(рН)гороха

УЧАСТИЕ КАРБОАНГИДРАЗН В ИНГИБИРОВАНИЙ ФОТОСИНТЕЗА

ПРОТОПЛАСТОВ ГОРОХА ИЗБЫТКОМ С02 Гидратация С02 в биологических системах ускоряется благодаря участию КА. Нами было обнаружено, что специфический ингибитор КА ацетаэоламид [Maren, 1967] снижал ингибирухщее действие высокой концентрации С02 на фотосинтез. Степень подавления фотосинтеза избытком С02 уменьшалась как в случае предварительной инкубации протопластов с ингибитором на свету и в темноте, так и при внесении АА в ячейку на свету.

С другой стороны, при низких концентрациях С02 исследование зависимости скорости фотосинтеза от концентрации С02 без АА и в его присутствии не выявило влияния ингибитора на скорость выделения 02 (рис.3) и значение КМ(С02) фотосинтеза протопластов, которое было равно 3,7±0,9 мкМ в присутствии АА и 3,9±0,7 мкМ в его отсутствие (из 8 повторностей).

Известно [Maren, 1984], что АА не способен проникать через клеточные мембраны водорослей и высших растений, поэтому обнаруженный нами эффект снятия этим соединением ингибирующего действия избытка С02 на фотосинтез позволил предположить, что КА протопластов гороха, по крайней мере, частично, может быть локализована на (или в) плазмалемме. Мы нашли, что неповрежденные протопласты проявляют активность КА, составляющую, однако, сравнительно небольшую часть от общей активности осмолизата протопластов гороха (в среднем 7,8±1,4» из 11 повторностей). Для

1/[С02Ь 10 "м

ТДЗ 4,0 6,0 Гсо,],

10~6М

Рис.3 Зависимость фотосинтетического цеитрации СО2 (А). (Б) - то же в

выделения О2 от кон-обратных координатах

Лайнуивера-Бэрка (—о—) - без ацетазоламида, (-•-) - протопласты предварительно инкубировали с 0,5 мМ ацетазоламидом. Скорость выделения выражена в мкмоль О2/МГ хл'Час.

клевера активность поверхностной КА составляла 12,4±1,1Ж.

Активность КА в суспензии протопластов была достаточно стабильна при концентрациях сорбита от 0,5 до 0,3 М, но резко возрастала при дальнейшем снижении концентрации осмотика, достигая максимального значения в его отсутствие, т.е. при полном разрушении протопластов (рис.4).

В присутствии стабилизатора сульфгидрильных групп 2-меркап-тоэтанола активность КА интактных протопластов повышалась в 2-2,5 раза. Однако она составляла лишь малую долю общей активности гомогената, поэтому требовались дополнительные доказательства отсутствия загрязнения фракции протопластов остатками внутриклеточной КА. Из данных, представленных на А-103,

1 о

"ТТЛ О О 0.5 [сорбит], И

Рис.4 Изменение активности карбоангидразы в суспензии протопластов в процессе осмолизиса. А - активность КА в относительных единицах Вильбура н Андерсена в пробе, содержащей 12,3 мкг хлорофилла.

рис.5, видно, что активность КА, высокая в первоначальной среде суспендирования протопластов, при последующих двух отмывках резко снижалась, а при третьей отмывке практически была равна нулю. В то же время КА активность фракции протопластов при последовательных отмывках изменялась мало (опыты проводили без протектора БН-групп).

Выделение протопластов в присутствии 0,5%-ного бычьего сывороточного альбумина, защищающего мембрану полученных протопластов от сорбции белков из разрушенных в процессе мацерации клеток, привело к некоторому повышению активности поверхностной КА по сравнению с контролем, которая составила 14,3+2,7% от активности осмолизата в присутствии альбумина и 9,9±2,2% в его отсутствие.

140

120

100 80 60 40 20 0

(Г

п

п

Рис.5 Изменение активности карбоангидразы в процессе отмывки нротопластов гороха. 0-неочищениая суспензия протопластов; 1-3-последовательные процедуры отмывки; 4-очищениые интактные протопласты. Заштрихованные столбики - активность КА в среде для отмывки, светлые столбики - активность КА в интерфазе, содержащей интактные протопласты. А - суммарные активности фракций в единицах Вильбура и Андерсена.

Таким образом, полученные результаты (рис.4 и 5) свидетельствуют, что, наряду с высокоактивной КА, содержащейся, по-видимому, в хлоропластах, часть КА активности локализована в плазма-лемме протопластов. Активность фермента 1п у1уо может быть значительно выше, что подтверждается повышением активности при выделении протопластов в присутствии протекторов (2-меркаптоэта-нола и бычьего сывороточного альбумина).

Измерение зависимости активностей поверхностной и внутриклеточной форм КА гороха от концентрации СО2 (рис.6) показало, что значение Бд ^ для поверхностной КА в вероналовом буфере равно 119±14 мМ. В осмолизате протопластов, представленной,

главный образом, внутрихлоропластной формой фермента, значение

8Л с были в несколько раз ниже, чем у КА на поверхности и, э

неповрежденных протопластов, и составляли 27,8±6,1 мМ. А 1/у10~3

'0,05

"0705*"

ТТЛ 1/1 СО2 J, мН

Жги

-

тггт5з~

"071 1/1С02] , мМ

Рис.6 Зависимость скорости карбоангидразиой реакции от концентрации С02 в двойных обратных координатах Лайиуивера-Бэрка. А-для поверхностной КА, Б-для внутриклеточной КА. Скорость реакции (у) выражена в мкмоль Н+/мг хл-мин.

О ВОЗМОЖНОЙ СЕЯЗИ ПОСТУПЛЕНИЯ УГЛЕКИСЛОТЫ в протопласта с ЭНЕРГЕТИКОЙ «ОТОСИНТЕЗА

Для выявления возможной связи между поступлением

углекислоты и энергетикой фотосинтеза исследовали действие

специфического ингибитора Н+-АТФазы о-ванадата [De Michelis,

Spanswick, 1986] и фузикокцина - активатора Н -АТФазы

[Giaguinta, 1979]. Нами исследовано действие нескольких

-5 -3

концентраций о-ванадата (в диапазоне от 10 до 5 10 И). Действия этих веществ на фотосинтез ни при оптимальных, ни при повышенных концентрациях С02 не обнаружено, т.е. протонная вана-дат-чувствительная АТФаза, если она имеется в плазмалемме протопластов гороха, не участвует в процессе поступления углекислоты.

Для выявления связи между проникновением С02 и работой ЭТИ хлоропластов был использован метод измерения флуоресценции хлорофилла с анализом компонентов её тушения [Krause et al., 1981; 1982; Horton, Hague, 1988].

Релаксация тушения флуоресценции после добавления диурона в суспензию освещенных протопластов (рис.7,А) состоит из двух фаз: быстрой (Rf ..) релаксации фотохимического тушения при

перекрытии диуроном переноса электронов с центров ФС.11, и медленной релаксации нефотохимического тушения (Rsjow)> которое

на тилакоидной мембране и тушением [Krause et al., тушение характеризуется

зависит в основном от наличия часто называется "энергозависимым" 1981; 1982]. "Энергозависимое"

коэффициентом q„, определяемым по формуле

Чр =

Rslow

где (Fra)s = F_

Fq максимальный уровень

( ГШ) Б ' """ V--./- -т

флуоресценции при полностью закрытых реакционных центрах ФСП в

отсутствие нефотохимического тушения.

Величина фотохимического тушения отражает долю

открытых реакционных центров ФСП и оценивается по формуле 1иа51

Rfast+Fv ' где

Fv "

стационарный уровень флуо-

ресценции .

[о2]

отн. ед.

[02]

отн.

ед.

1 2 3 5 5 5 7 8 9~ время, мин. Рис.7 Кривые индукции флуоресценции хлорофилла (а) и выделения С>2 (б) протопластов листьев гороха. А-при изменении концентрации С(>2 от 10 мкМ (в равновесии с воздухом) до 50 мкМ. Б - первоначальная концентрация С02 100 мкМ, добавлено 8 мМ КНСОд (1 мМ С02). Пунктирная линия на обоих рисунках - ход кривых в присутствии 0,5 мМ ацетазоламида.

После 6 мин. освещения протопластов и установления стационарного состояния добавляли бикарбонат (10-40 мкМ по С02) (рис.7,А). Скорость выделения 02 при этом увеличивалась, а стационарный уровень флуоресценции оставался, как правило, неизменным. С помощью анализа коэффициентов тушения обнаружено, что при ускорении выделения 02 происходило увеличение фотохимического и уменьшение энергозависимого тушения флуоресценции хлорофилла относительно величины этих параметров при равновесной с воздухом концентрации С02 (рис.8). Видно, что изменение было более значительным.

: 0,7

4 4 0,6 '■¿г 0,5 ' •й 0,4 л° 0,3 0,2

----в 2

"3Ь [С02], мкМ

"ТТГ-20-ЗТГ

Рис.8 Влияние концентрации С02 на параметры тушения флуоресценции хлорофилла протопластов листьев гороха (1 - коэффи-

коэффициент нефотохими-

циент фотохимического тушения, 2 ческого тушения).

При добавлении 8 мМ бикарбоната (1 мМ по С02 при рН 7,1) на фоне насыщенного по-С02 стационарного фотосинтеза (в присутствии 100 мкМ С02) происходило снижение выделения кислорода (рис.7,Б) и наблюдалось уменьшение относительное изменение д_

и увеличение (табл.3), причем

било также более выраженным, чем

изменение д

0'

Предварительная инкубация протопластов с АА в течение 10 мин. уменьшала ингибврование фотосинтеза высокой концентрацией углекислоты, наблюдавшееся как по выделению 02, так и по параметрам флуоресценции (табл.3, рис.7,Б), тогда как предынкубация с АА в опыте с нормальными концентрациями С02 не оказала влияния на выделение 02 и на параметры флуоресценции (рис.7,А).

Итак, при насыщающей концентрации С02 (100 мкМ) наблюдалось

снижается скорость

С02-зависимого выделения 02> реакция карбоксилирования становится лимитирующим звеном, образуется избыток НАДФН, что приводит к увеличению циклического и

или увеличении концентрации С02. При уменьшении концентрации СО

Таблица 3.

Влияние высокой концентрации СС^ (5 мМ) на скорость выделения О2 и параметры тушения флуоресценции на протопластах гороха в присутствии и в отсутствие ацетазоламида. (Начальная концентрация С(>2 100 мкМ).

Добавление КНСО, (5 мМ По С02) Инкубация с АА Скорость выделения 0„ (мкмоль Oj/mг хл-част Коэффициенты флуоресценции

перед добавл. после добавл. qQ ЧЕ

- + 26 26 0,18 0,10

+ + 23 14 0,21 0,24

+ - 23 6 0,2 0 0,28

псевдоциклического потока электронов в ЭТИ и протонного градиента на мембранеи, соответственно, увеличению значения q^.

При увеличении концентрации СО2 выше оптимального уменьпение выделения 0j происходило, по-видимому, вследствие снижения активности ряда ферментов цикла Кальвина, вызванного подкислением стромы хлоропластов при поступлении избыточных количеств С02 [Flügge et al . , 1980]. В результате отношение НАДФН/НАДФ+ увеличивалось, приводя к состоянию фотосинтетического аппарата с высоким q^., и, следовательно, как и в случае с низкой концентрацией СО2, с высоким Таким образом,

ингибирование высокой концентрацией COg не могло быть результатом недостатка энергетических эквивалентов для цикла Кальвина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование высоких концентраций углекислоты, ингибирующих СО^- зависимое выделение О2, позволило показать участие КА в поступлении углекислоты в протопласт. Ацетазоламид, непроникаюций ингибитор КА, снижал подавление выделения О2 (рис.7,Б). Прямыми экспериментами на поверхности протопластов обнаружена КА активность (рис.4, 5), не снижающаяся в процессе отмывок протопластов (рис.5). Активность фермента увеличивалась при выделении протопластов в присутствии бычьего сывороточного альбумина и 2-меркаптоэтанола в качестве протекторов.

Измерение значений Бд 5 внутриклеточной и плазмалеммной КА активностей обнаружило более слабое сродство поверхностной КА к субстрату, что объясняет отсутствие влияния АА при низких концентрациях СО2 (рис.3).

внешняя среда

рН 7,0 НСО3 -Н20

ф —

/ СО,

. +Н2°

цитоплазма Н НСО^

рН <7,5 -Н20

со2

хлоропласт I

рН <8,0

карбоангидразы в

при супероптимальиых

Можно полагать, что при низких (физиологических) концентрациях С02 стационарный поток С02 не приводит к аккумуляции протонов в цитоплазме в результате гидратации С02> так как они включаются в процесс дегидратации бикарбоната перед транспортом С02 в хлоропласт (рис.9). Однако в случае нефизиологических (миллимолярных) концентраций С02 хлоропласты не могут его использовать полностью. Избыточное поступление С02 приводит не только к подкислению стромы хлоропластов, но и цитоплазмы, что в свою очередь снижает скорость поступления С02 в клетку. Удаление избытка протонов из цитоплазмы облегчило бы дальнейший вход С02 в протопласт. Мы предполагаем, что плазмалеммная КА может включаться в процесс вывода избытка протонов из цитоплазмы (рис.9). Поэтому наблюдаемое снижение в присутствии АА ингибирования фотосинтеза высокими концентрациями С02> могло быть результатом блокирования выхода протонов, что приводило к увеличению подкисления цитоплазмы и, следовательно, снижению избыточного проникновения С02 в клетку. Диасом с сотр. [Diaz et al., 1982] предложена модель такой работы мембраносвязаной КА животных клеток с образованием канала с протонной проводимостью. Протонвыводящая роль КА может быть особенно существенна из-за высокой локальной концентрации протонов, возникающей на внутренней поверхности плаэмалеммы вблизи работающего фермента.

Рис.9 Гипотетический механизм участия транспорте С02 в протопласты гороха концентрациях С02-

выводы

1. Установлено, что транспорт углекислоты в протопласты гороха и клевера осуществляется в виде негидратированной молекулы СО^, о чем свидетельствует высокий уровень фотосинтеза при низких значениях pH среды, аирокий pH-оптимум фотосинтеза протопластов в условиях постоянства концентрации СО2 (при варьировании концентрации бикарбоната) и независимость эффекта иигибирования от pH.

2. Показано, что сверхвысокие концентрации СО^ вызывают иигибирование фотосинтетического выделения 02 у протопластов гороха и клевера, вследствие непрямого переноса протонов в строму хлоропластов. Обнаружено, что фотосинтез протопластов гороха более чувствителен к сверхвысоким концентрациям СО2, чем фотосинтез протопластов клевера, имеющих большую (в 3-5 раз) буферную емкость.

3. Анализ компонентов тушения кривых флуоресценции хлорофилла и использование эффекторов Н -АТФаз (о-ванадата и фузикокцина) на интактных протопластах свидетельствует об отсутствии энергозависимого транспорта С02 при избыточном поступлении в протопласты.

4. Прямыми измерениями активности и с применением ингибитора ацетазоламида установлено наличие плазмалеммной КА активности протопластов клевера и гороха, составляющей 7,8±1,4% от общей КА активности осмолизата протопластов у гороха и 12,4*1,1% у клевера и отличающейся от КА осмолизата более слабым сродством к С02.

5. Плазмалеммная КА из-за слабого сродства к СО2 не принимает участия в фотосинтезе при низких и насыщающих концентрациях Предполагается, что при избыточном поступлении СО2 плазмалеммная КА может стабилизировать pH цитоплазмы путем удаления избыточных протонов, образованных при гидратации поступающего С02-

Список овублихова&яих работ »о теме диссертации

1. Игнатова Л.К. Получение протопластов из С^ и С^ растений и их фотосинтетическая активность. Физиология растений, 1980, т.27, вып.1, с.80-85

2. Игнатова Л.К. Особенности С02-зависимого выделения кислорода протопластами листьев гороха в слабокислых и нейтральных средах. Тез. докл. Всес. конф. "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе", Пущино, 1981, с.23

3. Игнатова Л.К. Ингибируюдее действие углекислоты на СС^-зависимое выделение кислорода протопластами листьев гороха. Физиология растений, 1983, т.30, вып.5, с.950-954

4. Игнатова JI.K. Ингибирование фотосинтеза протопластов гороха избытком углекислоты и возможная роль карбоангидразы. Тез. докл. Всес. коиф. "Преобразование световой энергии в фотосинтезируюдих системах и их моделях", Пущино, 1989, с.158

5. Игнатова JI.K. Особенности выделения и некоторые свойства изолированных протопластов листьев клевера лугового. Физиология растений, 1990, т.37, вып.2, с.372-377

6. Москвин О.В., Игнатова Л.К., Иванов Б.Н., Романова А.К. Влияние поступления С02 в протопласты гороха на скорость выделения кислорода и параметры тушения флуоресценции хлорофилла а. Тез. докл. межд. коиф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", Пущино, 1991, с.47

7.Romanova А.К., Ignatova L.K., Ivanov B.N., Moskvin O.V. Inhibition of pea leaf protoplasts photosynthesis by excess of C02 and possible mechanism of inorganic carbon transport. Abstr. Russian-USA Workshop on Photosynthesis, Pushchino, 1992, p.29

8. Игнатова JI.K., Романова А.К. Участие карбоангидразы в ингибировании фотосинтеза протопластов гороха избытком С02• Физиология растений, 1992, т.34, вып.4, с.711-717

9. Ignatova L.K., Moskvin O.V., Ivanov B.N., Romanova А.К. The effect of C02 uptake by pea protoplasts on 02 evolution rate and parameters of chlorophyll fluorescence quenching. Plant Physiol. Biochem., 1993, v.31, Nq3, p.295-301

10. Игнатова JI.K., Романова А.К. Участие поверхностной карбоангидразы протопластов листьев гороха в поступлении углекислоты при фотосинтезе. Тез. докл. III съезда В0ФР, С.-Петербург, 1993, т.2, с.117

11. Игнатова Л.К., Романова А.К., Золотарева Е.К., Иванов Б.Н. Сравнение влияния повышенных концентраций углекислоты, на фотосинтез протопластов клевера и гороха. Тез. докл. III съезда В0ФР, С.-Петербург, 1993, т.2, с.118

30.03_.,9и г. 3ак,б534р. _экэ.__Уч.-иэд«_л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в СИТИ ЛИЦ РАИ