Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток

Кудряшова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток"

Кудряшова Татьяна Владимировна

РОЛЬ КАЛЬДЕСМОНА В МИГРАЦИИ НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

f Г 4 " ГЛ <* <*

О I Ü.-.I ¿Uil

Москва-2011

4841759

Работа выполнена па кафедре биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и в лаборатории клеточной подвижности НИИ Экспериментальной Кардиологии Российского Кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент, Воротников Александр Вячеславович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Гусев Николай Борисович

кандидат биологических наук, Александрова Антонина Юрьевна

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «04» «апреля» «2011» г. и 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «

О /1-?

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность эукариотических клеток к направленной миграции и хемотаксису играет важную роль в процессах эмбриогенеза, ангиогенеза, нейрогенеза и репарации поврежденных тканей. Множество патологий и заболеваний, включая рак, атеросклероз и воспалительные реакции связаны с нарушением клеточной подвижности и, преимущественно, с повышением миграционной активности клеток. Поэтому установление механизмов регуляции двигательной активности клеток и определение основных ее регуляторов является важной задачей для понимания физиологии и патофизиологии этих процессов.

Связывание хемоаттрактанта с поверхностными рецепторами запускает направленную миграцию клетки. Сигнал от связывания хемоаттрактанта передается каскадным путем к экспрессирующемуся во всех клетках белку актину, который реализует двигательные, сократительные и адгезивные реакции клеток. Усиленная полимеризация актина в филаменты определяет формирование листообразных (ламсллиподий) и иглообразных (филоподий) протрузий на переднем крае клетки, которые обеспечивают перемещение клетки. Другим важным фактором, контролирующим миграцию клеток, является сократимость актиновых стресс-фибрилл, содержащих моторный белок миозин II типа и обеспечивающих адгезию клетки и подтягивание ее тела и хвостовой части.

Различные актин-связывающие белки контролируют структуру актина и его взаимодействие с миозином, регулируя, таким образом, скорость миграции клеток. Кальдесмон - это многофункциональный белок, который взаимодействует с актином и миозином и влияет как на структуру актина, так и на моторную активность актомиозина. Он стабилизирует полимерный актин, изменяет скорость его полимеризации и механические свойства, ингибирует АТФазу актомиозина и, таким образом, может тормозить подтягивание тела клетки в процессе движения. Однако несмотря на многочисленные биохимические данные, предполагающие регуляторную функцию кальдесмона, до сих пор остается неясным как и насколько влияет кальдесмон на скорость движения живой клетки.

Некоторые данные указывают на способность кальдесмона влиять на движение клетки. Сверхэкспрессия кальдесмона в культивируемых эндотелиальных и гладкомышечных клетках приводит к снижению их направленной миграции (Mirzapoiazova et al., 2005; Yokouchi et al., 2006), а в фибробластах оказывает двоякий эффект, как уменьшая, так и увеличивая скорость миграции (Surgucheva and Bryan, 1995). Показано, что кальдесмон влияет на силу адгезии клеток, образование подосом, организацию кортикального цитоскелета и стабильность микрофиламентов актина (Helfraan et al., 1999; Eves et al., 2006; Mirzapoiazova et al., 2005; Warren et al., 1996). Кальдесмон регулирует активность других актин-связывающих белков, таких как

гельзолин и тропомиозин, фасцин, Агр2/3, что опосредовано влияет на динамику внутриклеточного актина (Ishikawa et al., 1989; Ishikawa et al., 1998; Yamakita et al., 2003). Однако вклад этих изменений в скорость движения клеток остается неясным.

Известно, что фосфорилирование регулирует связывание кальдесмона с актином. В немышечных клетках оно изменяет активность кальдесмона в подосомах, кортикальном цитоскелете и стресс-фибриллах (Gu et al., 2007; Eppinga et al., 2006; Kordowska et al., 2006). В гладкомышечных клетках кальдесмон, в основном, фосфорилируют МАР-киназы, модифицируя два остатка (Сер759 и Сер789), расположенные в С-концевом домене вблизи от участков связывания актина. Долгое время основным считался остаток Сер759 и последствия его фосфорилирования были детально исследованы in vitro (Redwood et al., 1993; Patchell et al., 2002). Однако позднее стало ясно, что в клетках преимущественному фосфорилированию подвергается остаток Сер789, в том числе в процессе хемотаксиса (Goncharova et al., 2002). Тем не менее, остается неясным, как фосфорилирование Сер789 влияет на активность кальдесмона in vitro, а также является ли оно необходимым для ускорения миграции клеток, или происходит параллельно и независимо.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснить, какой вклад вносит кальдесмон и его фосфорилирование МАР-киназами в скорость миграции немышечных клеток, и определить, в каких клеточных компартментах реализуется его действие. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить эффект фосфорилирования кальдесмона по остатку Сер789 на связывание кальдесмона с актином и способность регулировать активность АТФазы актомиозина in vitro.

2. Разработать экспериментальную клеточную модель с пониженным уровнем экспрессии кальдесмона и определить насколько кальдесмон влияет на скорость миграции клеток.

3. Определить как кальдесмон влияет на организацию актинового цитоскелета на лидирующем крае мигрирующих клеток, сборку стресс-фибрилл внутри клеток и адгезию клеток.

4. Оценить влияние фосфорилирования кальдесмона МАР-киназами на скорость миграции фибробластов.

Научная новизна работы. Впервые в условиях in vitro исследованы эффекты фосфорилирования Сер789 кальдесмона. Установлено, что фосфорилирование остатка Сер789 приводит к ослаблению взаимодействия кальдесмона с F-актином и значительно подавляет способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина. Показано, что фосфорилирование Сер789 и взаимодействие кальдесмона с комплексом Са2+-кальмодулин дает синергичный эффект в устранении ингибиторной активности кальдесмона. Установлено, что 5-10 кратное снижение экспрессии кальдесмона в

клетках HeLa 1469 и ЗТЗ фибробластах вызывает ускорение спонтанной и стимулированной хемоаттрактантами миграции клеток. Обнаружено, что подавление экспрессии кальдесмона приводит к изменению структуры актина на лидирующем крае, уменьшению времени жизни ламеллиподий и нарушению сборки стресс-фибрилл в теле клетки. Фосфоршшрование Сер789 кальдесмона МАР-киназами не является критичным условием для PDGF-стимулированной миграции фибробластов.

Практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции миграции немышечных клеток, проясняют роль кальдесмона в регуляции актин-зависимых механизмов движения клеток и фосфорилирования этого белка МАР-киназами в процессе миграции. Результаты, полученные in vitro, показывают каким образом фосфоршшрование кальдесмона по Сер789 MAP -киназами, наблюдаемое in vivo, регулирует актин и актомиозиновый мотор клетки. Эти данные позволяют предполагать, что актомиозин-зависимая сократимость не лимитирует движение фибробластов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на совместном заседании кафедры Биохимии биологического факультета и кафедры Биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, а также на на международных симпозиумах "Биологическая подвижность" (Пущино, Россия, 2006 и 2008), на 35й и 37й Европейских мышечных конференциях (Гейдельберг, Германия, 2006; Оксфорд, Великобритания, 2008), на Международном студенческом форуме (Омаха, США 2008), и на 6м симпозиуме имени Аберкромби по клеточной миграции (Оксфорд, Великобритания, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок. Список литературы включает 269 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Трансформация бактериальных клеток и экспрессия рекомбинантных белков (Н22 фрагмента, его мутированных форм, GST- р44егк| МАР-киназы) проводилась с использованием клеток Е. coli штамм BL21 (DE3)pLys. Плазмидную ДНК (10 нг) вводили в клетки, подвергая их тепловому шоку (42°С) в течение 45 сек. Экспрессию индуцировали изопропил-бета-О-тиогалактопиранозидом (3 мМ).

Выделение Н22 фрагмента и его точечных мутантов. Бактериальные клетки, экспрессирующие исходный и мутантные фрагменты кальдесмона Н22, ресуспендировали в буфере (50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 2 мМ ЭГТА, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ

ФМСФ, 1 мМ ДТТ, ингибиторы протеаз) подвергали ультразвуковой обработке, центрифугировали 40 мин (42 ООО g). Супернатант диализовали против буфера К (10 мМ MES, pH 6.5, 0.2 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 10 мМ 2-МЕ), пропускали через колонку с Q - сефарозой (Pharmacia Biotech., Швеция). Хроматографию проводили на носителе SP-сефароза (Pharmacia Biotech., Швеция) при скорости 25 мл/ч, элюируя белок градиентом раствора 0 - 400 мМ NaCl (80 мл) на буфере К. Полученные белки диализовали против буфера 5 мМ PIPES, pH 7.0, 2.5 мМ MgCl2) 0.1 мМ ЭГТА, 10 мМ KCl, 3 мМ ДТТ и хранили при - 70°С.

Экспрессия и очистка GST-p44erld МАР-киназы. Химерную GST-MAP-киназу выделяли из лизата бактериальных клеток, согласно протоколу производителя, аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе (Pharmacia Biotech., Швеция). Белок диализовали в буфер МРВ (10 мМ MOPS, pH 7.0, 1 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭГТА, 20 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащий 60% глицерина, и хранили при - 20°С. Перед использованием очищенную GST-p44erkl-KHHa3y активировали, фосфорилируя ее 30 мин при 30°С конститутивно активной ddMeklca-Hisó (любезно предоставлена Хапчаевым А.Ю., РКНПК) в соотношении 20: 1 (мг/мл) в буфере для фосфорилирования РВ (10 мМ HEPES, 20 мМ NaCl, 3 мМ ДТТ, 0.1 мМ ЭГТА, pH 8.0) в присутствии 1 мМ АТФ и 5 мМ MgCl2.

Выделение белков. Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц кролика (Spudich & Watt, 1971); тропомиозин выделяли из мускульных желудков курицы (Bretscher, 1984); Тяжелый меромиозин (ТММ) выделяли из мускульных желудков курицы (Seilers et al., 1981). Перед использованием препарат ТММ предварительно обессаливали и фосфорилировали 20 мин при 25°С в буфере МРВ киназой легких цепей миозина (КЛЦМ) в присутствии 0.5 мМ АТФ и 0.5 мМ СаС12 в молярном соотношении КЛЦМ : кальмодулин : ТММ = 1: 30 : 500. Препарат фосфорилированного ТММ (Ф-ТММ) диализовали, спектрофотометрически измеряли концентрацию и использовали в экспериментах в течение 6-10 часов после фосфорилирования.

Фосфорилирование Н22 фрагмента кальдесмона и его мутированных форм in vitro проводили 30 мин при 25°С в буфере РВ активированной GST-p44erkl-киназой в молярном соотношении GST-p44crkl-KHiia3a : Н22 (1 : 40) в присутствии 1 мМ АТФ и 5 мМ MgCl2.

Концентрацию белков определяли спектрофотометрически, используя известные коэффициенты экстинкции или по методу Шаффнера и Вайсмана (Schaffner & Weissmann, 1973) для оценки общего белка в клеточных лизатах.

Скорость актин-активируемой АТФазы Ф-ТММ оценивали по накоплению в пробе неорганического фосфата (Ф„) при гидролизе MgAT® растворимым фосфорилированным фрагментом миозина (Ф-ТММ). F-актин (12 мкМ) и тропомиозин

(2.8 мкМ) (1 :0.4 [w:w]), БСА (0.5 мг/мл) и соответствующие кефосфо и фосфофрагменты кальдесмона (0.5-24мкМ) инкубировали 15-30 мин в буфере Р (5 мМ PIPES, pH 7.1, ЮмМ KCl, 2.5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ NaN3) в объеме 180 мкл. В 90 мкл инкубационной смеси вносили до 5мМ MgATcI) (pH 7.0), инициировали реакцию добавлением Ф-ТММ (0.5 - 2 мкМ) и инкубировали 20 мин при 25°С (VK0He4H= 100 мкл). Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 10% ТХУ. В контрольную пробу, не содержавшую актина/тропомиозина, ТХУ вносили до добавления Ф-ТММ. В полученных пробах определяли количество неорганического фосфата (Taussky & Shorr, 1953).

Скорость актин-активируемой АТФазы Ф-ТММ (сек"') рассчитывали по формуле:

^АТФазы ~ (нмоль Ф„ в образце)*6/5*(1/время инкубации в сек)*(1/количество Ф-ТММ в реакционной смеси в нмоль), где (нмоль Ф„ в образце) = 325*(ОПх-7оо образца/ ОПг.70о стандарта Ф„).

Коседиментационный анализ связывания Н22 фрагментов кальдесмона с F-актином проводили в оставшихся 90 мкл инкубационной смеси. Объем пробы доводили до 100 мкл буфером Р, отбирали 40 мкл и смешивали их с 20 мкл Зх буфера для образцов по Лэммли и инкубировали 5 мин при 99°С. Оставшиеся 60 мкл центрифугировали 20 мин (110 000 g), из супернатанта отбирали 40 мкл и готовили образец для электрофореза по Лэммли аналогично. Одинаковые объемы образцов до и после центрифугирования подвергали электрофорезу в ПААГ по Лэммли и окрашивали гели красителем Кумасси R - 250. Количество Н22 фрагмента, связавшегося с актином, оценивали денситометрически (Bio-Rad, прогр. обесп. Quantity One), анализируя его количество в пробе до и после центрифугирования.

ДСН-Электрофорез. Препараты белков и лизаты клеток подвергали электрофорезу в пластинах 7.5 - 15% ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Культивируемые клетки промывали буфером ФСБ (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 4.3 мМ Na2HP04, 1.4 мМ КН2Р04, pH 7.4) и лизировали в Зх буфере для образцов по Лэммли с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Roche, США). Полученные лизаты клеток или препараты очищенных белков, растворенные в 1-2-кратном буфере нанесения образцов, инкубировали 5 мин при 99°С, и подвергали электрофорезу. После проведения электрофореза гелевые пластины использовали для последующего иммуноблоттинга или окрашивания 0.25% раствором Кумасси R - 250. Для окраски гелей Кумасси нагрузка дорожек составляла 0.5 - 3 мкг (очищенные препараты белка) и 20 - 30 мкг общего белка (лизаты клеток). Для последующего иммуноблоттинга наносили 3 - 200 нг очищенного белка, а количество образцов клеточных лизатов подбирали экспериментально. Компьютерную обработку электрофореграмм проводили при помощи программы Image J.

Иммуноблоттинг проводили по методу (Towbin, 1979). Электроперенос белков осуществляли 1 час (80В/350мА) на мембраны PVDF (Amersham, Великобритания). Инкубацию мембран, как с первичными, так и с вторичными антителами (коньюгаты с пероксидазой хрена) проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для выявления белковых полос использовали хеминилюминесцентную детекцию с помощью набора реактивов фирмы GE Healthcare.

Подавление экспрессии кальдесмона в клетках HeLa 1469 и фибробластах NIH ЗТЗ методом РНК-интерференции. Культивирование клеток HeLa 1469 и фибробластов мыши NIH ЗТЗ проводили в среде DMEM (Gibco, США) с 2 мМ L-глутамином, 100ед/мл пенициллином, 100мкг/мл стрептомицином, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Клетки HeLa 1469 трансдуцировали лентивирусными частицами, содержащими молекулярно-генетическую конструкцию pSIH-CopGFP-HlshRNA (SBI, California), кодирующую одновременно миРНК к участку гена кальдесмона (миРНК/Кад) (или гена люциферазы (миРНК/Люц) в случае контрольной конструкции) и белок GFP, разделенные IRES-последовательностью, но под регуляцией единого промотора. Все молекулярно-генетические конструкции и лентивирусные частицы были получены Шевелевым А.Я. и Руткевичем П.Н. в рамках сотрудничества с лабораторией клеточной инженерии ИЭК РКНПК. Было протестировано действие двух различных миРНК к последовательности мРНК кальдесмона (HI-САЗ ha и Н1-СА5 ha). Введение любой из них в клетки HeLa 1469 приводило к снижению уровня белка, однако, для дальнейшей работы мы выбрали последовательность Н1-СА5 ha, поскольку ее эффективность была несколько выше по сравнению с HI-САЗ ha. Последующие ключевые эксперименты по миграции клеток были продублированы с использованием HI-САЗ ha и показали сходные результаты, которые далее не приводятся в виду их идентичности.

Клетки NIH3T3 трансдуцировали лентивирусными частицами, содержавшими векторы для экспрессии только миРНК к кальдесмону pSIH3-CPHB-siCLDM21 (миРНК/Кад) или миРНК к белку GFP pSIH3-CPHB-siCop7 (миРНК/GFP) и не содержавшими кДНК белка GFP.

Для трансдукции клетки HeLa 1469 рассаживали в 24-луночные (30 тыс./лунка), а фибробласты NIH3T3 в 12-луночные планшеты (60 тыс./лунка). Через 24 часа отбирали среду, и вносили в каждую лунку вирусные частицы (15-75 мкл для HeLa 1469 и 100 мкл для NIH ЗТЗ) и среду с 10% инактивированной ЭТС и 5 мкг/мл полибрена (275 - 225 мкл для HeLa 1469 и 400 мкл для NIH ЗТЗ). Клетки инкубировали с вирусными частицами 48 часов, после чего заменяли среду на стандартную и культивировали как обычно. Уровень экспрессии кальдесмона определяли иммуноблоттингом с последующей количественной денситометрией. Для экспериментов использовали популяции клеток, где подавление экспрессии данного

белка составляло более 90% для HeLa 1469 и около 70% для фибробластов ЗТЗ. Эксперименты были проведены независимо с использованием двух популяций клеток дефицитных по кальдесмону, полученных в результате двух независимых трансдукций.

Хемотаксис клеток Hela 1469 на 10% сыворотку измеряли в 48-луночной камере Бойдена с использованием поликарбонатных мембран (8 мкм) (Neuro Probe, США), покрытых коллагеном I типа (0.1% на ФСБ). Клетки (80-90% конфлюэнтного монослоя) депривировали сутки в среде DMEM с 0.5% ЭТС или 0.5% БСА, суспендировали в среде с 0.5% ЭТС, и вносили в каждую лунку (40- 60) тыс. клеток. По истечении 14 часов инкубации при 37°С и 5% СО2, клетки на мембране фиксировали этанолом и окрашивали Diff Quick (США/Швейцария). Миграцию оценивали по интенсивности окраски промигрировавших клеток с помощью компьютерной программы Quantity One.

Измерение подвижности клеток методом зарастания экспериментальной раны. Клетки HeLa 1469 высевали на чашки Петри или на покровные стекла так, чтобы через 24 часа клеточная культура достигла состояния 95% конфлюентного монослоя. В монослое наносили царапины (0.5 мм), отмечали нужные участки зоны повреждения и фотографировали одни и те же участки через каждые 15 - 30 минут в течение 12 - 24 часов при 37°С и 5% COj, используя микроскоп Zeiss Axiovert 200М (Оберховен, Германия), оснащенный боксом для поддержания газовой смеси и температуры, камерой AxioCam CCD и прогр. обесп. Axiovision v. 3.1. Степень зарастания царапины клетками вычисляли как отношение площади царапины через 12/24 часа к площади через 0 часов после повреждения. В случае покровных стекол, клетки оставляли на 4 часа в инкубаторе после повреждения монослоя, затем фиксировали и окрашивали флуоресцентно-меченным фаллоидином на актин по протоколу производителя.

Фибробласты NIH ЗТЗ высаживали на 12-луночные планшеты (Costar Corning® CellBIND) (100 тыс./лунка), через 12-20 часов их депривировали 6 часов в среде с 0.1% ЭТС. Затем проводили царапину в монослое и вносили два ингибитора: U0126 (ингибитор р38 МАР-киназы до 10 мкМ) и SB202190 (ингибитор МЕК1,2 до 5 мкМ). В другие лунки вносили ДМСО до конечной концентрации 0.2%. Клетки инкубировали с ингибиторами/ДМСО 1 час, затем вносили PDGF (Юнг/мл) и далее проводили прижизненную цитраферную съемку движения клеток на микроскопе Leica DMI 6000В (Германия). Общая длительность составляла 16 часов, с частотой 1 кадр в 20 минут, съемку проводили паралельно в разных лунках, используя многопозиционный режим. Изменение координат ядра клеток, располагающихся на момент начала съемки непосредственно на переднем краю царапины, измеряли с помощью программы Image J: от изображения в tn (Xt„;Ytn) к изображению, снятому через 20 минут, tn+i (Xt^Y^). Затем высчитывали перемещение ядра (Р) в

пространстве за каждые 20 минут по формуле: P(tn: t„+1) = ^((Xtn+i-Xt,,)2 + (Yt„+1-Ytn)2). Скорость миграции рассчитывали как отношение суммы расстояний вычисленных покадровых перемещений P(t„: t„+1) ко времени, за которое клетка прошла этот путь.

Фиксацию клеток и их иммуноцитохимическое окрашивание проводили по методу описанному Кавериной (Kaverina et al., 1998).

Индукция образования актиновых стресс-фибрилл. Клетки HeLa 1469 с нормальной и сниженной экспрессией кальдесмона выращивали до 40 - 50% конфлюентного монослоя на покровных стеклах, депривировали в среде с 0.1% ЭТС (4 часа), после чего 30 минут инкубировали в среде с 30% ЭТС, промывали 1 раз ФСБ и фиксировали. Затем клетки окрашивали флуоресцентно-меченным фаллоидином на актин, фотографировали и проводили количественный обсчет данных в программе MetaMorph (США).

Статистический анализ результатов проводили с использованием программ Microsoft Excel v. 11.5.6 и программы Статистика 6.0 (StatSoft, USA). Для оценки достоверности различий использовали критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента; в последнем случае подтверждали нормальность распределения данных.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Фосфорилирование кальдесмона ослабляет его связывание с актином и нарушает ингибироваиие АТФазы актомиозина. Мы исследовали, in vitro, как изменяются свойства кальдесмона после его фосфорилирования по Сер789, часто регистрируемого при миграции клеток, и сравнивали его с эффектом фосфорилирования остатка Сер759. Для этого мы использовали полностью функциональный С-концевой фрагмент кальдесмона Н22 (рис.1), который содержит все участки взаимодействия кальдесмона с актином и оба участка фосфорилирования МАР-киназой. Помимо Н22, мы использовали полученные ранее в лаборатории точечные мутанты Н22 фрагмента, в которых соответствующий остаток серина (Сер759 или Сер789) был заменен на нефосфорилируемый аланин.

т-кальдесмон Рисунок 1. Схематическое

N' ^—■■ш——-Ц—— С' представление использованного в

работе С-концевого фрагмента кальдесмона Н22. Зеленым цветом обозначены области взаимодействия кальдесмона с актином. Отмечено g «СИЗ™ g ■■■ положение двух основных участков фосфорилирования МАР-киназами

Н22 фрагмент Сер'» и Сер7*9.

Мы экспрессировали, очистили и полностью фосфорилировали фрагменты Н22, получив нефосфорилированный фрагмент кальдесмона (Н22), монофосфорилированные по Сер759 (Н22р"759) или по Сер789 (Н22р"789) фрагменты, а

759 789

также дифосфорилированный одновременно по обоим сайтам фрагмент (Н22 ). Полнота и специфичность фосфорилирования была подтверждена с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях (Patchell et al., 2002) и иммуноблоттинга с фосфоспецифическими антителами к этим остаткам (D'Angelo et al., 1999). Далее мы одновременно измеряли эффективность связывания фрагментов с филаментами актин-тропомиозина и ингибирование ими АТФазы акто-Ф-ТММ. Мы установили, что фосфорилирование МАР-киназой Н22 фрагмента кальдесмона по Сер789 также как и по Сер759, одинаково, но незначительно, ухудшает его актин-связывающие свойства. При этом фосфорилирование оказывало дополнительный и независимый эффект на

7«Q 1ÜQ

способность Н22 ингибировать АТФазу актомиозина, одинаково для Сер и Сер .

Фосфорилирование любого одного из двух остатков Н22 в одинаковой степени ослабляет ингибирующее действие фрагмента на АТФазу актомиозина (рис.2Б) и его связывание с актином (рис.2А).

кН, ■

«ЙГ--—-. к::р1>

с- \JU__*________ JVj» А.

л '♦It ■ -J-L ~ г-о,р75'

i * »* Hi;

' ! уч 1 ■■ I 1 —1--1

2 4 6 8 10 12 Н22 фрагмент кальдесмона, мкМ

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Связанный Н22/актин, моль/моль Рисунок 2. Фосфорилирование Н22 фрагмента кальдесмона МАР-киназой по Сер789 или Сер 59 ослабляет его взаимодействие с F-актином (А) и способность ингибировать АТФазу акто-ТММ (Б). Скорость АТФазы акто-Ф-ТММ измеряли в присутствии возрастающих количеств фрагментов кальдесмона. Количество связанного фрагмента измеряли коседиментацией с актином, после чего делали перерасчет степени ингибирования АТФазы от количества связанного фрагмента. Таким образом, панель (А) показывает влияние фосфорилирования на связывание Н22 с актином, а панель (Б) - избирательный эффект фосфорилирования на ингибирующую активность Н22 при одинаковых стехиометриях связывания Н22. (Приведены результаты индивидуальных измерений, п=6).

При этом полностью исчезает кооперативность ингибирования. Если одна молекула Н22 ингибирует 7-14 мономеров актина (величина, обратная точке пересечения оси абсцисс с касательной к началу синей кривой ингибирования), то монофосфо-Н22 ингибирует только 2-3 актина, с которыми он непосредственно связывается (Foster et al., 2004). Дифосфорилирование практически полностью лишает Н22 ингибирующей активности, но не ведет к дальнейшему ухудшению связывания с актином (рис.2). Следует отметить, что представленные на рис.2 результаты показывают избирательное действие фосфорилирования на связывание с актином (А) и на ингибирование АТФазы (Б). Очевидно, что фосфорилирование оказывает два независимых эффекта.

Во-первых, оно незначительно (= в 2 раза) ослабляет связывание Н22 с актином (А), но, кроме того, полностью устраняет кооперативное ингибирование им АТФазы актомиозина (Б). Дифосфорилированный, но связанный с актином Н22 практически совершенно не ингибирует АТФазу актомиозина.

Таким образом, результаты экспериментов in vitro указывают на то, что фосфорилирование кальдесмона по остатку Сер789, характерное для мигрирующих клеток (Goncharova et al., 2002), может влиять как на динамику актинового цитоскелета (изменяя связывание кальдесмона с актином), так и его сократимость (влияя на АТФазу актомиозина). Эти два процесса характерны для псевдоподий переднего края и стресс-фибрилл тела мигрирующей клетки, соответственно. Поэтому в следующей части работы мы выяснили, влияет ли кальдесмон на скорость движения клеток в целом, и с каким из указанных компартментов клетки может быть связано его действие.

Разработка экспериментальных клеточных моделей с пониженным уровнем кальдесмона. Для того, чтобы определить как кальдесмон влияет на скорость миграции клеток, мы получили две линии немышечных клеток (фибробластоподобные НеЬа 1469 и фибробласты №Н ЗТЗ) с существенно сниженным содержанием эндогенного кальдесмона (рис.3).

д миРНК/К*д - + - - -- +- -.+ -- +£ - +-миРНК/Люц - .+ .. + . - - + -- +- ..+

контрольный

вектор

ос- кальдесмон

а-ГАФД

после трансакции (день)

12«

19м

120-

I tf

Н §

а а «ч

3 I 40200

12010080 60 40 20-

-1-•—-1-1-

HeLa 1469 ««ииУКад анРНК/Люц миР11К/Кад 5й лень 47й день

N1113 T3 миРНЮ'Кад xiiPIIIC'GFP

Рисунок 3. Подавление экспрессии кальдесмона в клетках НеЬа 1469 (А,В) и в фибробластах N111 ЗТЗ (Б,Г) с помощью РНК-интерференции. Репрезентативные иммуноблоты лизатов клеток (А, Б) и количественный анализ (В, Г) демонстрируют высокую эффективность снижения уровня кальдесмона в миРНК/Кад-экспрессирующих клетках (НеЬа 1469 и Ы1Н ЗТЗ соответственно) и восстановление уровня на 47й день в НеЬа 1469. Представлены ср. знач. ± ст. откл., п=3, *, **р<0.01,1-крит. Стьюдента.

Экспрессию этого белка подавляли с помощью РНК-интерференции, вводя в геном клеток- реципиентов генетические конструкции, кодирующие миРНК против гена кальдесмона (миРНК/Кад), или контрольную миРНК против гена люциферазы (миРНК/Люц) или гена GFP-белка (миРНК/GFP). Снижение уровня эндогенного кальдесмона контролировали вестерн-блоттингом. Уже на 5й день после трансдукции оно составило 90% от исходного в клетках HeLa 1469 и оставалось на низком уровне в течение Зх недель, но на 7-й неделе возвращалось к исходному уровню (рис.ЗА,В).

Подавление экспрессии кальдесмона в ЗТЗ фибробластах было менее эффективным, и содержание этого белка снижалось лишь на 75-80 % от исходного (рис.ЗБ,Г). В дальнейших экспериментах мы использовали оба типа клеток через 5-15 дней после трансдукции, уровень кальдесмона в них каждый раз составлял 5 - 25% от исходного.

Кальдесмон ингибирует миграцию NIH ЗТЗ фибробластов. Ранние исследования (Gabelt et al., 2006; Helfman et al, 1999) показали, что кальдесмон может регулировать прочность адгезивных контактов. Чтобы выяснить, может ли кальдесмон влиять на скорость миграции клеток по этому механизму, мы использовали фибробласты, тип движения которых существенно зависит от силы клеточной адгезии (Small et al., 1996).

Мы обнаружили, что подавление экспрессии кальдесмона в NIH ЗТЗ фибробластах вызывает лишь незначительное (<20 %) ускорение миграции клеток в зону повреждения монослоя (рис.4). Это косвенно говорит о том, что кальдесмон слабо влияет на адгезию клеток и, вследствие этого, на скорость миграции. Однако мы не можем исключить того, что такой слабый эффект связан с низкой эффективностью подавления экспрессии кальдесмона в фибробластах (75 - 80%).

Рисунок 4. Кальдесмон снижает скорость миграции ЗТЗ фибробластов. Скорость нестимулированной (контроль) и стимулированной (РйСР, Юнг/мл) миграции фибробластов повышается при снижении уровня кальдесмона. Ср. знач. ± ст. откл., п=6, *р<0.05, **р<0.01, крит. Стыодента.

контроль

PDGF

Кроме того, эффект подавления экспрессии кальдесмона на скорость миграции фибробластов не зависел от наличия РОйБ (рис.4). Этот факт указывает на то, что действие кальдесмона направлено скорее на сам цитоскелет, но не на рецептор-зависимую передачу сигнала при активации миграции. Чтобы проанализировать такую

возможность, мы выяснили роль МАР-киназ в фосфорилировании кальдесмона и в миграции фибробластов.

РОСР-стимулированная миграция фибробластов не зависит от фосфорилирования кальдесмона по остатку Сер789. Согласно ранним данным (ОопсЬагоуа е1 а1., 2002), активация миграции гладкомышечных клеток требует участия двух МАР-киназных каскадов (Егк1/2 и р38), и сопровождается фосфорилированием кальдесмона по остатку Сер789. Поэтому в данной работе мы использовали смесь ингибиторов 110126 и ЗВ202190 для одновременного подавления обоих МАР-киназных каскадов. Как показано на рис. 5 и б, соответственно, миграция ЗТЗ фибробластов под действием РОйР также зависит от активации МАР-киназ, а кальдесмон тоже фосфорилируется по остатку Сер789.

При ингибировании МАР-киназ скорость РООР-стимулированной миграции фибробластов снижается вдвое (рис.5) и исчезает 3-кратное увеличение степени фосфорилирования Сер789 кальдесмона (рис.6).

к 150

100

е, 50 §

РОСР

и+вв

Я миРНК/Кжд * *

+ +

Рисунок 5. РООР-сгимулиропанная миграция ЗТЗ фибробластов как с нормальным, так и с пониженным уровнем кальдесмона одинаково зависит от активации МАР-киназ. Скорость РОСЕ-стимулированной миграции фибробластов измеряли в присутствии ингибиторов МАР-киназ (Ш126 и БВ202190;. Ср. знач. ±дов. шт., п=6, *,**р<0.01, крит. Стыодента.

Выключение МАР-киназ одинаково подавляет миграцию контрольных и не содержащих кальдесмон фибробластов (рис.5). Кроме того, оно гораздо больше тормозит движение, чем просто устраняя различие в подвижности этих клеток (рис.5). Это говорит о том, что фосфорилирование кальдесмона вносит незначительный вклад в миграцию фибробластов и не является основным механизмом действия МАР-киназ.

Таким образом, результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что кальдесмон слабо влияет на адгезию клеток, так как его удаление из фибробластов, мало влияет на их подвижность, которая именно в данном типе клеток в сильной степени зависит от силы адгезии.

Фосфорилирование МАР-киназами не является ключевым для РБОР-зависимой миграции фибробластов. Тем не менее, нельзя полностью исключить значимости

Рисунок 6. Кальдесмон фосфорилируется МАР-киназами по остатку Сер789 при стимуляции фибробластов РОвР. миРНК/СРР-экспрессирующие клетки лизировали до (контроль) и после 16-часовой миграции в отсутствие (РййР) и в присутствии ингибиторов МАР-киназ (РВйР + и0126 + 5В202190), проводили иммуноблоттинг лизатов с использованием антител к Р-Сер169, общему кальдесмону (Б). Окрашенные иммуноблоты анализировали количественно (А). Представлены ср. знач.± ст. откл., п=3, *,**р<0.05. крит. Стъюдента.

фосфорилирования кальдесмона в других клетках, движение которых больше зависит от иных, чем адгезия, механизмов. К таким клеткам относятся эпителиальные и гематопоэтические клетки, характеризующиеся «амебоидным» типом подвижности (Ъаттегтапп & Б1х1, 2009).

Кальдесмон ингибирует миграцию клеток НеЬа 1469. Клетки НеЬа 1469 являются производными исходной линии эпителий-подобных клеток опухоли шейки матки НеЬа, претерпевшими частичный эпителиально-мезенхимальный переход в фибробластоподобный фенотип. Однако в плотной культуре они сохраняют боковые контакты и мигрируют единым пластом (см. рис.5), что характерно для эпителиальных клеток (УавШеУ, 2004). Для того чтобы установить, как влияет кальдесмон на миграцию этих клеток, мы сравнили скорость направленной миграции клеток НеЬа 1469 с нормальным и пониженным уровнем кальдесмона, используя два наиболее широко применяемых теста. В обоих случаях мы обнаружили, что кальдесмон значительно ингибирует скорость миграции этих клеток.

При хемотаксисе в камере Бойдена подвижность клеток НеЬа 1469, дефицитных по кальдесмону, была в 1.6 раза выше, чем скорость миграции контрольных клеток, экспрессирующих только йРР или вРР и миРНК к люциферазе (рис.7).

Как отмечено выше, при длительном культивировании клеток НеЬа 1469, трансдуцированньтх миРНК к кальдесмону, уровень экспрессии кальдесмона восстанавливался до исходного к 7-й неделе (см.рис.4А,В). Скорость хемотаксиса этих клеток также возвращалась к исходному уровню и практически не отличалась от таковой контрольных клеток (рис.7). Эти результаты свидетельствуют о том, что повышенная скорость миграции дефицитных по кальдесмону клеток НеЬа 1469 обусловлена именно снижением количества эндогенного кальдесмона.

9 о. л X

а -Р-Сер

1.5

1.0

р(1| ♦ *

(14

пЬ ■ВЦ

контроль И) С К ГОСГ+О+БВ

С( - кальдесмон

а-ГДФД

1) К

в 100

сЧ

п о

& 50

I 0

б" миРНК/Люц

Рисунок 7. Кальдесмон подавляет хемотаксис клеток НеЬа 1469.

Хемотаксис стимулировали 10% ЭТС в камере Бойдена. Представлены ср. знач. количества промигрировавших

клеток ± ст. откл., п=3, *,**р<0.001, крит. Манна-Уитни.

РР 1- миРНК/Кад-

снижена восстановлена экспрессия Кад экспрессия Кад

При помощи второго экспериментального подхода мы установили, что снижение уровня кальдесмона в клетках НеЬа 1469 вызывает ускоренное зарастание экспериментальной раны клеточного монослоя за счет повышения скорости движения клеток (рис.8).

миРНК/Люц

0 часов

миРНК/Кад

ЯН

I— ®

Щ"

шшж

миРНК/Люц миРНК/Кад

Рисунок 8. Кальдесмон снижает скорость миграции клеток НеЬа 1469. Клетки с пониженным уровнем кальдесмона (миРНК/Кад) быстрее заполняют зону повреждения монослоя (Б,Г) по сравнению с контрольными (миРНК/Люц) (А,Б) за 12 ч.

Д - ср. знач. отношения площадей раны через Ои 24 часа после повреждения монослоя ±ст. откл., п=6, *р<0.05, крит. Манна-Уитни.

В случае контрольных клеток площадь свободной зоны мало изменялась относительно исходных границ за 12 часов, но клетки с пониженным содержанием кальдесмона практически наполовину заполняли зону повреждения монослоя (рис.8). За 24 часа ситуация несколько выравнивалась, но различие по-прежнему было значимым и составляло 45 и 65 %, соответственно (рис.8) Оно было обусловлено именно повышением скорости миграции клеток, поскольку мы установили, что размер и скорость пролиферации клеток не изменяются при снижении уровня кальдесмона (данные не приведены).

* * *

Суммируя результаты проведенных нами экспериментов по миграции, можно заключить, что кальдесмон тормозит движение клеток, поскольку его удаление приводит к ускорению миграции (рис.5,7,8). Наиболее вероятно, что действие кальдесмона связано непосредственно с актиновым цитоскелетом и сильнее проявляется в клетках HeLa. В отличие от фибробластов, эффективность «амебоидного» типа движения этих клеток зависит от баланса протрузионной, адгезивной и сократительной активностей цитоскелета в соответствующих компартментах клетки, и моторной активности миозина II в составе стресс-фибрилл ламеллы и тела клетки (Lammermann & Sixt, 2009).Поэтому далее мы более подробно рассмотрели, как удаление кальдесмона изменяет структуру актинового цитоскелета в этих компартментах клетки и оценили, как оно сказывается на адгезии HeLa.

Кальдесмон способствует поддержанию пучков микрофиламентов в зоне ламеллиподии и повышает уровень полимеризованного актина. Поскольку динамика лидирующего края вносит существенный вклад в миграцию клеток, мы обратились к анализу этой части движущихся клеток HeLa 1469 с нормальным и пониженным уровнем кальдесмона. Прижизненный видеоанализ лидирующего края клеток, мигрирующих в зону свободного пространства раны, продемонстрировал, что снижение уровня кальдесмона вызывает практически двукратное (с 3.5 до 2 мин) уменьшение времени жизни ламеллиподий (данные не приведены). В связи с этим мы изучили структуру актинового цитоскелета лидирующего края и обнаружили, что снижение количества кальдесмона в клетках HeLa 1469 коррелирует с существенными изменениями в этой области (рис.9).

В зоне ламеллиподии большинства контрольных клеток детектируются короткие пучки акгиновых филаментов - микрошипы, располагающиеся перпендикулярно мембране (рис.9А, указано стрелками). Они располагаются относительно параллельно друг другу в зоне ламеллиподии, которая выдвигается клеткой в направлении движения и, возможно, являются предшественниками филоподий (Small et al., 1996, 2002).

В клетках, дефицитных по кальдесмону, таких структур практически не наблюдается, и актин располагается хаотично в зоне переднего края (рис.9Б). Зона ламеллиподии в этих клетках не ограничена так четко, как в случае контрольных. Эти различия характерны только для поляризованных клеток наружного слоя, но не для клеток внутренних слоев, которые не имеют свободного пространства для направленной миграции и со всех сторон образуют контакты с другими клетками. Таким образом, кальдесмон способствует формированию актиновых микрофиламентов в ламеллиподии (рис.9).

13%

миРНК/Люц миРНК/Кад

Рисунок 9. Изменение структуры микрофиламентов на переднем крае мигрирующих клеток НеЬа 1469,

дефицитных по кальдесмону. Клетки с нормальным (миРНК/Люц) (А) и пониженным (миРНК/Кад) (Б) уровнем калъдесмона, мигрирующие в свободное пространство раны фиксировали и окрашивали на Р-актин. В клетках находящихся непосредственно на границе раны высчитывали площадь, занимаемую полимеризованным актином и соотносили к площади всей клетки. В) Ср. знач. ±ст. откл.. п=3, *р<0.05.

После окраски и количественного анализа полимерного актина мы обнаружили, что его количество в дефицитных по кальдесмону клетках, располагающихся на краю поврежденного монослоя, составляет 13 % от всей площади клетки относительно 19 % в контрольных (рис.9В). Таким образом, можно предположить, что, связываясь продольно с несколькими мономерами актина в составе филамента, кальдесмон стабилизирует филаменты актина и снижает количество свободных мономеров, замедляя тредмиллинг актина и скорость выдвижения ламеллиподии (Ье СЛатсИе & СагНег, 2008). Кроме того, кальдесмон ингибирует активность белка Агр2/3 (Уатакйа й а1., 2003) и его удаление может способствовать образованию на переднем крае разветвленной структуры актина, необходимой для движения. Однако, в последнем

случае остается неясным, как это связано с повышением динамики и уменьшением времени жизни ламеллиподии.

Кальдесмон не влияет на адгезию клеток НеЬа 1469. Прикрепление ламеллиподии к субстрату является важным этапом перемещения клетки (А1ехапс1гоуа е1 а1., 2008). Мы исследовали распределение винкулина, основного белка-маркера фокальных контактов, в области лидирующего края клеток, мигрирующих направленно в зону экспериментальной раны монослоя. Мы не обнаружили существенных отличий между клетками НеЬа 1469 с нормальным и пониженным уровнем кальдесмона ни в количестве, ни в распределении винкулин-содержащих контактов (рис. 10).

Рисунок 10. Кальдесмон не влияет на распределение винкулина на лидирующем крае мигрирующих клеток HeLa 1469. Контрольные (А) и дефицитные по кстъдесмону (Б) клетки фиксировали в процессе движения в зону повреждения монослоя и окрашивали имунофлуоресцентно на винкулин.

Мы также оценили общую адгезию клеток HeLa 1469, измерив скорость их прикрепления и открепления от субстрата. Мы обнаружили, что клетки с нормальным и пониженным уровнем кальдесмона одинаково адгезируют на поверхность, покрытую коллагеном I типа, и с одинаковой скоростью открепляются в 0.5 и 0.025% растворе трипсина (данные не представлены).

Кальдесмон участвует в формировании стресс-фибрилл при стимуляции клеток. Поляризация клетки в процессе активной миграции включает образование сократительных актомиозиновых стресс-фибрилл, обеспечивающих подтягивание тела и хвостовой части клетки (Vicente-Manzanares et al., 2009). Поэтому на следующем этапе нашей работы мы проанализировали влияет ли кальдесмон на структуру и распределение стресс-фибрилл в клетках HeLa 1469 при их стимуляции к миграции.

С помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания мы сначала убедились, что кальдесмон колокализуется с актиновыми стресс-фибриллами в клетках НеЬа 1469 (данные не представлены).

Далее мы установили, что снижение внутриклеточного содержания кальдесмона не приводит к заметным изменениям в структуре, локализации и количестве актиновых фибрилл покоящихся депривированных клеток НеЪа 1469 (рис. 11 А,Б).

миРНК/Люц миРНК/Кад

8 В Я К

ез

30% этс

миРНК/Люц

миРНК/Кад

Рисунок 11. Снижение уровня кальдесмона приводит к нарушению формирования актиновых стресс-фибрилл в клетках НеЬа 1469 при стимуляции сывороткой.

Контрольные миРНК/Люц (А, В) и дефицитные по кальдесмону миРНК/Кад (Б, Г) клетки стимулировали сывороткой (30% ЭТС), фиксировали, окрашивали флуоресцентно-меченным фаллоидином на актин и определяли количество фибриллярного актина в отдельных клетках. Ср.знач. ± ст. откл., п=3, * р<0.05, крит. Манна-Уитни.

Как видно на представленных изображениях, актиновые филаменты распределены внутри клетки относительно равномерно и видны либо как длинные стресс-фибриллы внутри тела клетки (рис. 11 А,Б зеленые стрелки), либо как периферические, более короткие и кольцеобразные структуры (рис. 11 А,Б синие стрелки). Количественный анализ показал, что распределение фибриллярного актина в покоящихся депривированных клетках с нормальным и сниженным содержанием кальдесмона не различается и составляет 18 % от общей площади клетки (рис.ПД).

Стимуляция контрольных клеток эмбриональной телячьей сывороткой, которую мы использовали ранее в качестве хемоатграктанта (см. рис.4), вызывала образование множества стресс-фибрилл (рис.ПД), с тенденцией к периферическому кольцевому, но не радиальному, расположению (рис.11В, красные стрелки).

Однако в клетках с пониженным уровнем кальдесмона увеличения количества стресс-фибрилл не происходило (рис.11Г,Д). Их распределение до и после стимуляции также практически не изменялось и характерного перераспределения на периферию клетки не наблюдалось.

Таким образом, в заключительной серии экспериментов мы показали, что в клетках эпителиальной природы НеЬа 1469 кальдесмон регулирует структуру актинового цитоскелета, но не количество и силу адгезивных контактов. Кальдесмон участвует в поддержании морфологии переднего края мигрирующей клетки, полимеризации актина и образовании пучков филаментов. В теле клетки кальдесмон отвечает за формирование стресс-фибрилл при стимуляции клетки к движению. Эти структуры отвечают за сократимость и подтягивание тела и хвостовой части клетки в направлении движения.

Предполагаемый механизм действия кальдесмона. В данной работе мы установили, что актин-связывающий белок кальдесмон влияет на структуру актинового цитоскелета, замедляя движение клеток.

Результаты экспериментов с клетками различного типа движения свидетельствуют против функции кальдесмона в регуляции фокальных контактов и адгезии клеток. Мы предполагаем, что именно с отсутствием воздействия на адгезивную компоненту и связан незначительный эффект кальдесмона на подвижность фибробластов. Этот факт косвенно указывает и на то, что кальдесмон не влияет и на сократимость стресс-фибрилл, так как это отражается на силе адгезивных контактов (ВегеЬаскку е1 а1., 2006). Этот вывод противоречит данным Не1&пап е( а1. (1999), которые наблюдали снижение сократимости и уменьшение количества адгезивных контактов. Однако эти

авторы использовали трансформированные фибробласты и сверхэкспрессию кальдесмона, с чем могут быть и связаны такие различия.

Таким образом, по нашим данным, кальдесмон вряд ли функционирует на этапе подтягивания тела и хвостовой части движущейся клетки, как этого можно было бы ожидать по результатам экспериментов in vitro, где кальдесмон ингибировал моторную активность актомиозина (рис.2Б). Напротив, наши данные говорят о том, что кальдесмон способствует полимеризации актина и/или стабилизирует структуру филаментов актина на переднем крае (рис.9) и в теле клетки (рис.11), что отражает его главную актин-связывающую активность (рис.2А). Исходя из результатов наших экспериментов мы можем предположить следующий механизм регуляции кальдесмоном миграции клеток, представленный на рисунке 12.

Р-Кальдесмон + актин ti

Кальдесмон-актин

ЛИДИРУЮЩИЙ КРАЙ КЛЕТКИ ТЕЛО КЛЕТКИ

стабилизация сборка и стабилизация полимерного актина стресс-фибрилл

снижение количества мономеров актина и скорости полимеризации филаментов

замедление скорости миграции клеток

Рисунок 12. Предполагаемый механизм участия кальдесмона в регуляции скорости миграции немышечных клеток. Объяснения см. в тексте.

Мы предполагаем, что кальдесмон повышает долю полимерного актина при активации миграции за счет стабилизации филаментов актина в зоне лидирующего края, а также в теле клетки за счет сборки и стабилизации стресс-фибрилл. Таким образом, присутствие кальдесмона сдвигает равновесие между полимерным и мономерным актином, уменьшая число мономеров актина, доступных для тредмиллинга актиновых филаментов в зоне ламеллиподии (рис.12). Стабилизируя филаменты актина, кальдесмон может также ингибировать диссоциацию актина с минус-концов и дробление филаментов (ЬЫкам'а й а1., 1989). Кроме того, кальдесмон препятствует ветвлению филаментов актина, ингибируя Агр2/3 (Уатакка е1 а1., 2003), и, благодаря своей пучкующей активности (ОаЬгоугека е1 а1., 1985), объединяет их в

параллельные структуры, детектируемые как микрошипы (рис.9). Вместе, эти процессы упрочняют и делают менее динамичной сеть акгиновых филаментов на лидирующем крае и замедляют рост ее плюс-концов, необходимый для выдвижения псевдоподий (Le Clainche & Carlier, 2008).

Фосфорилирование частично нарушает актин-связывающую активность кальдесмона (рис.2А). Оно, как и сам кальдесмон, слабо сказывается на подвижности фибробластов, которая зависит, главным образом, от адгезии. Рецептор-зависимая активация МАР-киназных каскадов играет важную роль в ускорении миграции этих клеток, но реализуется, в основном, по кальдесмон-независимому механизму. Возможно, что фосфорилирование кальдесмона МАР-киназами вносит более существенный вклад в регуляцию миграции эпителиальных, эндотелиальных и гемопоэтических клеток, для движения которых полимеризация актина является основным механизмом. Анализ такой возможности является предметом дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1) Фосфорилирование остатка Сер789 кальдесмона МАР-киназой нарушает взаимодействие кальдесмона с актином и способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина in vitro.

2) Разработана клеточная модель с пониженным уровнем экспрессии кальдесмона, с помощью которой установлено, что кальдесмон в различной степени ингибирует миграцию эпителиальных клеток HeLa 1469 и ЗТЗ фибробластов.

3) Кальдесмон не влияет на адгезию клеток, но регулирует организацию актинового цитоскелета на лидирующем крае мигрирующих клеток и обеспечивает сборку стресс-фибрилл при стимуляции клеток.

4) Активация МАР-киназ вносит существенный вклад в миграцию фибробластов, который реализуется, в основном, по кальдесмон-независимому механизму.

5) Предложен механизм регуляции кальдесмоном скорости миграции немышечных клеток за счет стабилизации актинового цитоскелета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журнальные статьи:

1. Т.В. Кудряшова, П.Н.Руткевич, А.Я.Шевелев, Т.Н.Власик, А.В.Воротников (2008) Кальдесмон изменяет структуру актина на лидирующем крае и подавляет миграцию клеток, Биофизика, 53 (6), 978-85.

2. А.В. Воротников, О.В. Щербакова, Т.В. Кудряшова, О.С. Тарасова, В.П. Ширинский, Г. Пфнцер, В. А. Ткачу к (2009) Фосфорилирование миозина как основной путь сокращения гладких мышц, Росс, физиол. жур. им. КМ. Сеченова, обзор, 95 (10), 1058-73.

Тезисы конференций:

1. T.V. Kudriashova, О. Copeland, S.B. Marston, A.V. Vorotnikov (2006) Individual phosphorylation of Ser759 or Ser789 in caldesmon alters its actin binding and inhibition of actomyosin ATPase, Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice", Puschino, Russia, 80.

2. T.V. Kudriashova, P.N. Rutkevitch, I.N. Rybalkin, A.Y. Shevelev, A.V. Vorotnikov and T.N. Vlasik (2006) siRNA-mediated silencing of caldesmon expression in human nonmuscle cells, Abstracts of XXXVth European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, J. Muscle Res. Cell Motil., 27 (5-7): 510.

3. T.V. Kudriashova, O. Copeland, S.B. Marston and A.V. Vorotnikov (2006) Single phosphorylation at Ser-789 is sufficient to regulate actin binding and inhibition of actomyosin ATPase by caldesmon, Abstracts of XXXVth European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, J. Muscle Res. Cell Motil., 27 (5-7): 498.

4. T.V. Kudryashova, P.N. Rutkevitch, I.N. Rybalkin, A.Y. Shevelev, T.N. Vlasik and A.V. Vorotnikov (2007) Caldesmon controls cell chemotaxis by regulating actin filament structure and lamellipodial dynamics, Abstracts of 6th Abercrombie Symposium Cell Migration: from molecules to organisms, Oxford, Great Britain, 61.

5. T.V. Kudryashova, P.N. Rutkevitch, A.Y. Shevelev, T.N. Vlasik, A.V. Vorotnikov, V.A.Tkachuk (2008) Caldesmon controls cell chemotaxis by regulating actin filament dynamic, Abstracts of International Student Research Forum, Omaha, Nebraska, USA.

6. T.V. Kudryashova, P.N. Rutkevitch, I.N. Rybalkin, A.Y. Shevelev, A.V. Vorotnikov and T.N. Vlasik (2008) Actin filament dynamic and cell migration is controlled by caldesmon, Abstracts of XXXVIIth European Muscle Conference, Oxford, Great Britain, J. Muscle Res. Cell Motil., 29: 264.

7. T.V. Kudryashova, P.N. Rutkevitch, I.N. Rybalkin, A.Y. Shevelev, T.N. Vlasik and A.V. Vorotnikov (2008) Actin dynamic in nonmuscle cells is regulated by caldesmon, Abstracts of International Simposium "Biological Motility: Achievements and perspectives ", Puschino, Russia, 227.

Подписано в печать:

22.02.2011

Заказ № 5021 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудряшова, Татьяна Владимировна

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Направленная миграция немышечных клеток.

1.1. Связывание хемоаттрактанта с рецептором и поляризация клетки.

1.2. Внутриклеточная передача сигнала от активированного хеморецептора к цитоскелету.

1.3. Формирование псевдоподий на переднем крае.

1.4. Закрепление новосформированных протрузий.

1.5. Перемещение тела клетки и подтягивание хвостовой части клетки.

2. Структура и регуляция основных белков двигательного аппарата клетки.

2.1. Немышечный актин.

2.1.1. Структура мономерного немышечного актина.

2.1.2. Образование актиновых филаментов.

2.1.3. Роль малых ГТФаз семейства Шю в регуляции полимеризации актиновых филаментов.

2.2. Немышечный миозин.

2.2.1. Структура немышечного миозина.

2.2.2. Структура стресс-фибрилл.

2.3. Кальдесмон.

2.3.1. Локализация, изоформы.

2.3.2. Доменная организация кальдесмона.

2.3.3. С - концевой домен кальдесмона (Н22 фрагмент) функциональный аналог целого белка.

2.3.4. Фосфорилирование и регуляция свойств кальдесмона МАР-киназами.

2.3.5. Участие кальдесмона в регуляции цитоскелета и миграции клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

1. Биохимические и молекулярно - биологические методы.

1.1. Определение концентрации белка.

1.1.1. Спектрофотометрический метод.

1.1.2. Определение концентрации белка по методу Шаффнера и Вайсмана.

1.2. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН - электрофорез).

1.3. Иммуноблоттинг.

1.4. Электрофорез в присутствии мочевины и глицерола.

1.5. Приготовление образцов клеток для ДСН - электрофореза.

1.6. Выделение тропомиозина из мускульных желудков курицы.

1.7. Выделение актина.

1.8. Выделение тяжелого меромиозина.

1.9. Экспрессия рекомбинантных белков в бактериальной системе.

1.9.1. Трансформация бактериальных клеток.

1.9.2. Тестовая экспрессия рекомбинантных белков.

1.9.3. Препаративная экспрессия рекомбинантных белков.

1.10. Экспрессия и очистка рекомбинантного фрагмента кальдесмона Н и его мутированных форм H22S759A и H22S789A.

1.11. Экспрессия и очистка GST-p44erkI МАР-киназы.

1.12. Фосфорилирование белков in vitro.

1.12.1. Фосфорилирование рекомбинантных фрагментов Н22 кальдесмона МАР-киназой in vitro.

1.12.2. Фосфорилирование ТММ киназой легких цепей миозина in vitro.

1.13. Определение скорости актин-активируемой Mg-АТФазы тяжелого меромиозина и актин-связывающей способности фрагмента кальдесмона.

1.14. Определение неорганического фосфата.'.

1.15. Коседиментационный анализ связывания фрагментов кальдесмона с КаМ - сефарозой.

2. Клеточно - биологические методы.

2.1. Культивирование клеток линии HeLa 1469 и фибробластов линии NIH ЗТЗ.

2.2. Подавление экспрессии кальдесмона в немышечных клетках методом РНК - интерференции.

2.2.1. Подавление экспрессии кальдесмона в клетках HeLa 1469.

2.2.2. Подавление экспрессии кальдесмона в клетках NIH ЗТЗ.

2.3. Измерение подвижности клеток методом зарастания экспериментальной раны в клеточном монослое.

2.3.1. Прижизненная регистрация ламеллиподии клеток.

2.3.2. Измерение средней скорости движения клеток.

2.4. Измерение хемотаксиса клеток в камере Бойдена.

2.5. Измерение адгезии клеток.:.

2.6. Измерение скорости деадгезии клеток.

2.7. Измерение скорости роста культуры клеток.

2.8. Индукция образования актиновых стресс-фибрилл.

2.9. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток.

3. Количественная обработка изображений и статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение индивидуальной роли фосфорилирования остатков

Сер * и Сер кальдесмона р42/44 МАР-киназой на его свойства in vitro.

1.1. Фосфорилирование МАР-киназой ухудшает актин-связывающие свойства кальдесмона.

1.2. Способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина ослабляется при фосфорилировании МАР-киназой.

1.3. Влияние индивидуального фосфорилирования кальдесмона

МАР-киназой на его взаимодействие с кальмодулином.

2. Разработка экспериментальных клеточных моделей для выяснения роли кальдесмона в миграции.

3. Влияние кальдесмона на миграцию клеток.

3.1. Кальдесмон ингибирует миграцию NIH ЗТЗ фибробластов.

3.2. PDGF - стимулированная миграция фибробластов не зависит от фосфорилирования кальдесмона по остатку Сер789.

3.3. Кальдесмон ингибирует хемотаксис клеток HeLa 1469.

3.4. Кальдесмон ингибирует миграцию клеток HeLa 1469.

3.5. Кальдесмон участвует е регуляции динамики ламеллиподии и ее актинового цитоскелета.

3.5.1. Кальдесмон стабилизирует ламеллиподию мигрирующих клеток HeLa 1469.

3.5.2. Кальдесмон способствует поддержанию пучков микрофиламентов в зоне ламеллиподии и повышает уровень полимерного актина.

3.6. Кальдесмон не регулирует адгезивные свойства клеток HeLa 1469.

3.6.1. Снижение экспрессии кальдесмона не влияет на распределение винкулина в ламеллиподии мигрирующих клеток HeLa 1469.

3.6.2. Кальдесмон не регулирует адгезивные свойства клеток HeLa 1469.

3.7. Кальдесмон участвует в формировании стресс-фибрилл в клетках в покое и при стимуляции сывороткой.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток"

Способность эукарнотнческих клеток к направленной миграции и хемотаксису играет важную роль в процессах эмбриогенеза, ангиогенеза, нейрогенеза и репарации поврежденных тканей [Ridley et al., 2003]. Множество патологий и заболеваний, включая рак, атеросклероз и воспалительные реакции связаны с нарушением клеточной подвижности и, преимущественно, с повышением миграционной активности клеток. Поэтому установление механизмов регуляции двигательной активности клеток и определение основных ее регуляторов является важной задачей для понимания физиологии и патофизиологии этих процессов.

Связывание хемоаттрактанта с поверхностными рецепторами запускает направленную миграцию клетки. Сигнал от связывания хемоаттрактанта передается каскадным путем к окспрессируюгцемуся во всех клетках белку актину, который реализует двигательные, сократительные и адгезивные реакции клеток. Усиленная полимеризация актина в филаменты определяет формирование листообразных (ламеллиподий) и иглообразных (филоподий) протрузий на переднем крае клетки, что вносит существенный вклад в перемещение клетки [Theriot and Mitchison, 1991]. Другим важным фактором, контролирующим миграцию клеток, является сократимость актиновых стресс-фибрилл, содержащих моторный белок миозин II типа и обеспечивающих адгезию клетки и подтягивание ее тела и хвостовой части [Vicente-Manzanares and Horwitz, 20096]. Таким образом, баланс между протрузионной активностью переднего края, сократимостью тела клетки и степенью ее адгезивности и определяет скорость миграции клетки [Lammermann and Sixt, 2009].

К настоящему времени этот вопрос был частично исследован в разных клетках, но окончательного разрешения не получил. Сверхэкспрессия кальдесмона в культивируемых эндотелиальных и гладкомышечных клетках приводит к снижению их направленной миграции [Mirzapoiazova et al., 2005; Yokouchi et al., 2006], а в фибробластах оказывает двоякий эффект, как уменьшая, так и увеличивая скорость миграции [Surgucheva and Bryan, 1995]. Показано, что кальдесмон влияет на силу адгезии клеток [Helfman et al., 1999], образование подосом [Eves et al., 2006], организацию кортикального цитоскелета [Mirzapoiazova et al, 2005] и стабильность микрофиламентов актина [Warren et al., 1996]. Кальдесмон регулирует активность других актин-связывающих белков, таких как гельзолин и тропомиозин [Ishikawa et al., 1989], фасцин [Ishikawa et al., 1998], Arp2/3 [Yamakita et al., 2003], что опосредовано влияет на динамику внутриклеточного актина. Однако вклад этих изменений в скорость движения клеток остается неясным.

Аналогично, вопрос об участии и роли фосфорилирования в регуляции активности кальдесмона в клетках остается практически полностью открытым. Известно, что фосфорилирование регулирует связывание кальдесмона с актином in vitro. В немышечных клетках оно изменяет активность кальдесмона в подосомах, кортикальном цитоскелете и стресс-фибриллах [Gu et al., 2007; Eppinga et al., 2006; Kordowska et al., 2006]. В гладкомышечных клетках кальдесмон в основном фосфорилируют МАР-киназы, модифицируя два остатка (Сер д и Сер789), расположенные в С - концевом домене вблизи от участков связывания актина. Долгое время основным считался остаток Сер ' и последствия его фосфорилирования были детально исследованы in vitro [Redwood et al., 1993; Patchell et al., 2002]. Однако позднее стало ясно, что в клетках преимущественному фосфорилированию подвергается остаток Сер789, в том числе в процессе хемотаксиса [Goncharova et al., 2002]. Тем не менее, остается неясным, как фосфорилирование Сер789 влияет на активность кальдесмона in vitro, а также является ли оно необходимым для ускорения миграции клеток, или происходит параллельно и независимо.

Вследствие вышесказанного, целью данной работы было выяснить, какой вклад вносит кальдесмон и его фосфорилирование МАР-киназами в скорость миграции немышечных клеток, и определить, в каких клеточных компартментах реализуется его действие. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

4. Оценить влияние фосфорилирования кальдесмона МАР-киназами на скорость миграции фибробластов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кудряшова, Татьяна Владимировна

выводы

7RQ

1) Фосфорилирование остатка Сер кальдесмона МАР-киназой нарушает взаимодействие кальдесмона с актином и способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина in vitro.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю Воротникову Александру Вячеславовичу за постоянную поддержку и неоценимую помощь в проведении и написании данной работы, а также за проявленное им терпение.

Выражаю особую благодарность заведующему кафедрой биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Всеволоду Арсеньевичу Ткачуку и заведующему лабораторией клеточной подвижности НИИ ЭК РКНПК МЗ РФ Владимиру Павловичу Ширинскому за предоставленную возможность выполнить данную работу.

Искренне благодарю руководителя и сотрудников лаборатории клеточной инженерии НИИ ЭК РКНПК (МЗ РФ) Т.Н.Власик, А.Я.Шевелева, П.Н. Руткевича, И.Н. Рыбалкина за помощь в проведении экспериментов по РНК - интерфереции.

Сердечно благодарю своих коллег в лаборатории клеточной подвижности к.б.н. Хапчаева А.Ю., Филатову A.A., Щербакову O.A., к.б.н. Серебряную Д.В., к.б.н. Степанову О.В., Марченко A.B. за советы и помощь в проведении ряда экспериментов.

Также благодарю сотрудников и аспирантов и студентов кафедры биохимии и молекулярной медицины за советы и помощь: Тюрина-Кузьмина П.А., Агароняна K.M., Бунцеву O.A., Гмызину А.И.

Выражаю признательность всем бывшим и настоящим сотрудникам кафедры биохимии и молекулярной медицины и лабораторий молекулярной эндокринологии (особенно к.б.н. Белоглазовой И.Б.), клеточной подвижности и клеточной инженерии за доброжелательность и отзывчивость.

Благодарю своих родных и друзей за постоянную поддержку и помощь, оказанную при подготовке работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы установили, что актин-связывающий белок кальдесмон влияет на структуру актинового цитоскелета, замедляя движение клеток. На основании полученных нами данных можно сформулировать предполагаемый механизм действия кальдесмона в немышечных клетках.

Результаты экспериментов с клетками различного типа движения свидетельствуют против функции кальдесмона в регуляции фокальных контактов и адгезии клеток. Мы предполагаем, что именно с отсутствием воздействия на адгезивную компоненту и связан незначительный эффект кальдесмона на подвижность фибробластов. Этот факт также косвенно указывает и на то, что кальдесмон не влияет и на сократимость стресс-фибрилл, так как иначе это отразилось бы на силе адгезивных контактов [Bershadsky et al., 2006]. Этот вывод противоречит данным Helfman et al. (1999), которые наблюдали снижение сократимости и уменьшение количества адгезивных контактов. Однако, эти авторы использовали трансформированные фибробласты и сверхэкспрессию кальдесмона, с чем могут быть и связаны такие различия.

Таким образом, по нашим данным, кальдесмон вряд ли функционирует на этапе подтягивания тела и хвостовой части движущейся клетки, как этого можно было бы ожидать по результатам экспериментов in vitro, где кальдесмон ингибировал моторную активность актомиозина (рис. 14). Напротив, наши данные говорят о том, что кальдесмон способствует полимеризации актина и/или стабилизирует структуру филаментов актина на переднем крае (рис. 23, 24) и в теле клетки (рис. 30), что отражает его главную актин-связывающую активность (рис. 13). Исходя из результатов наших экспериментов мы можем преположить следующий механизм регуляции кальдесмоном миграции клеток, представленный на рисунке 31.

Мы предполагаем, что кальдесмон повышает долю полимерного актина при активации миграции за счет стабилизации филаментов актина в зоне лидирующего края, а также в теле клетки за счет сборки и стабилизации стресс-фибрилл. Таким образом, присутствие кальдесмона сдвигает равновесие между полимерным и мономерным актином, уменьшая число мономеров актина, доступных для тредмиллинга актиновых филаментов в зоне ламеллиподии (рис.31). Стабилизируя филаменты актина, кальдесмон может также ингибировать диссоциацию актина с минус-концов и дробление филаментов [Ishikawa et al., 1989]. Кроме того, кальдесмон препятствует ветвлению филаментов актина, ингибируя Arp2/3 [Yamakita et al., 2003], и, благодаря своей пучкующей активности [Dabrowska et al., 1985], объединяет их в параллельные структуры, детектируемые как микрошипы (рис. 24).

Вместе, эти процессы консолидируют сеть актиновых филаментов на лидирующем крае и замедляют рост ее плюс-концов, необходимый для выдвижения псевдоподий согласно общепринятому механизму [Le Clainche and Carlier, 2008].

Р-Кальдесмон + актин tl

Кальдесмон-актин

ЛИДИРУЮЩИЙ КРАЙ КЛЕТКИ ТЕЛО КЛЕТКИ стабилизация сборка и стабилизация полимерного актина стресс-фибрилл снижение количества мономеров актина и скорости полимеризации филаментов м

Ч/ замедление скорости миграции клеток

Рисунок 31. Предполагаемый механизм участия кальдесмона в регуляции скорости миграции немышечных клеток.

Объяснения см. в тексте.

Фосфорилирование частично нарушает актин-связывающую активность кальдесмона (рис. 13). Оно, как и сам кальдесмон, слабо сказывается на подвижности фибробластов, которая зависит, главным образом, от адгезии. Рецептор-зависимая активация МАР-киназных каскадов играет важную роль в ускорении миграции этих клеток, но реализуется, в основном, по кальдесмон-независимому механизму. Возможно, что фосфорилирование кальдесмона МАР-киназами вносит более существенный вклад в регуляцию миграции эпителиальных, эндотелиальных и гемопоэтических клеток, для движения которых полимеризация актина является основным механизмом. Анализ такой возможности является предметом дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудряшова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Воротников А.В., Крымский М.А., Ширинский В.П. (2002) Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц, Биохимия, т. 67 (12), с. 1309-28.

2. Воротников А.В., Щербакова О.В., Кудряшова Т.В., Тарасова О.С, Ширинский В.П., Пфитцер Г., Ткачук В.А. (2009) Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции сокращения гладких мышц, Росс, физиол. ж., т. 95 (10), с. 1058-73.

3. Минин А. А., Кулик А.В. (2004) Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции., Усп. биол. химии, т. 44, с. 225-262.

4. Хапчаев А.Ю., Ширинский В.П., Воротников А.В. (2003) Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина, Усп. биол. химии, т. 43, с. 365-420

5. Abercrombie М., Ambrose E.J. (1958). Interference microscope studies of cell contacts in tissue culture. Exp Cell Res 15 (2): 332-45.

6. Abercrombie M., Heaysman J.E., Pegrum S.M. (1970). The locomotion of fibroblasts in culture. II. "RRuffling". Exp Cell Res 60 (3): 437-44.

7. Adam L.P., Gapinski C.J., Hathaway D.R. (1992). Phosphorylation sequences in h-caldesmon from phorbol ester-stimulated canine aortas. FEBS Lett 302 (3): 223-6.

8. Adam L.P., Ilaeberle J.R., Hathaway D.R. (1989). Phosphorylation of caldesmon in arterial smooth muscle. J Biol Chem 264 (13): 7698-703.

9. Adam L.P., Hathaway D.R. (1993). Identification of mitogen-activated protein kinase phosphorylation sequences in mammalian h-Caldesmon. FEBS Lett 322 (1): 56-60.

10. Alahyan M., Webb M.R., Marston S.B., El-Mezgueldi M. (2006). The mechanism of smooth muscle caldesmon-tropomyosin inhibition of the elementary steps of the actomyosin ATPase. J Biol Chem 281 (28): 19433-48.

11. Albrecht K., Schneider A., Liebetrau C., Ruegg J.C., Pfitzer G. (1997). Exogenous caldesmon promotes relaxation of guinea-pig skinned taenia coli smooth muscles: inhibition of cooperative reattachment of latch bridges? Pflugers Arch 434 (5): 534-42.

12. Ammer A.G., Weed S.A. (2008). Cortactin branches out: roles in regulating protrusive actin dynamics. Cell Motil Cytoskeleton 65 (9): 687-707.

13. Arefieva T.L., Krasnikova T.L. (2001). Monocytic cell adhesion to intact and plasmin-modified fibrinogen: possible involvement of Mac-1 (CD1 lb/CD 18) and ICAM-1 (CD54). J Cell Physiol 188 (3): 403-9.

14. Arias M.P., Pacaud M. (2001). Macrophage caldesmon is an actin bundling protein. Biochemistry 40 (43): 12974-82.

15. Azuma T., Witke W., Stossel T.P., Hartwig J.H., Kwiatkowski D.J. (1998). Gelsolin is a downstream effector of rac for fibroblast motility. EMBO J 17 (5): 1362-70.

16. Bai C.Y., Ohsugi M., Abe Y., Yamamoto T. (2007). ZRP-1 controls Rho GTPase-mediated actin reorganization by localizing at cell-matrix and cell-cell adhesions. J Cell Sci 120 (Pt 16): 2828-37.

17. Bartegi A., Fattoum A., Derancourt J., Kassab R. (1990). Characterization of the carboxyl-terminal 10-kDa cyanogen bromide fragment of caldesmon as an actin-calmodulin-binding region. J Biol Chem 265 (25): 15231-8.

18. Baum B., Kunda P. (2005). Actin nucleation: spire actin nucleator in a class of its own. CurrBiol 15 (8): R305-8.

19. Bear J.E., Gertler F.B. (2009). Ena/VASP: towards resolving a pointed controversy at the barbed end. J Cell Sci 122 (Pt 12): 1947-53.

20. Bennett R.D., Mauer A.S., Strehler E.E. (2007). Calmodulin-like protein increases filopodia-dependent cell motility via up-regulation of myosin-10. J Biol Chem 282 (5): 3205-12.

21. Bershadsky A. (2004). Magic touch: how does cell-cell adhesion trigger actin assembly? Trends Cell Biol 14 (11): 589-93.

22. Blume-Jensen P., Hunter T. (2001). Oncogenic kinase signalling. Nature 411 (6835): 355-65.

23. Bogatcheva N.V., Vorotnikov A.V., Birukov K.G., Shirinsky V.P., Gusev N.B. (1993). Phosphorylation by casein kinase II affects the interaction of caldesmon with smooth muscle myosin and tropomyosin. Biochem J 290 ( Pt 2): 437-42.

24. Boyden S. (1962). The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med 115: 453-66.

25. Bremer A., Aebi U. (1992). The structure of the F-actin filament and the actin molecule. Curr Opin Cell Biol 4 (1): 20-6.

26. Bretscher A. (1984). Smooth muscle caldesmon. Rapid purification and F-actin cross-linking properties. J Biol Chem 259 (20): 12873-80.

27. Bretscher A., Lynch W. (1985). Identification and localization of immunoreactive forms of caldesmon in smooth and nonmuscle cells: a comparison with the distributions of tropomyosin and alpha-actinin. J Cell Biol 100 (5): 1656-63.

28. Buccione R., Orth J.D., McNiven M.A. (2004). Foot and mouth: podosomes, invadopodia and circular dorsal ruffles. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (8): 647-57.

29. Buchsbaum R.J. (2007). Rho activation at a glance. J Cell Sci 120 (Pt 7): 1149-52.

30. Bugyi B., Carlier M.F. (2010). Control of actin filament treadmilling in cell motility. Annu Rev Biophys 39: 449-70.

31. Bustelo X.R., Sauzeau V., Berenjeno I.M. (2007). GTP-binding proteins of the Rho/Rac family: regulation, effectors and functions in vivo. Bioessays 29 (4): 356-70.

32. Carlier M.F. (1991). Actin: protein structure and filament dynamics. J Biol Chem 266 (1): 1-4.

33. Carlier M.F., Pantaloni D., Korn E.D. (1986). Fluorescence measurements of the binding of cations to high-affinity and low-affinity sites on ATP-G-actin. J Biol Chem 261 (23): 10778-84.

34. Castellino F., Ono S., Matsumura F., Luini A. (1995). Essential role of caldesmon in the actin filament reorganization induced by glucocorticoids. J Cell Biol 131 (5): 1223-30.

35. Chalovich J.M., Sen A., Resetar A., Leinweber B., Fredricksen R.S., Lu F., Chen Y.D. (1998). Caldesmon: binding to actin and myosin and effects on elementary steps in the ATPase cycle. Acta Physiol Scand 164 (4): 427-35.

36. Chen H.C. (2005). Boyden chamber assay. Methods Mol Biol 294: 15-22.

37. Cho W. (2001). Membrane targeting by CI and C2 domains. J Biol Chem 276 (35): 32407-10.

38. Clark T., Ngai P.K., Sutherland C., Groschel-Stewart U., Walsh M.P. (1986). Vascular smooth muscle caldesmon. J Biol Chem 261 (17): 8028-35.

39. Coleman M.L., Marshall C.J., Olson M.F. (2004). RAS and RHO GTPases in Gl-phase cell-cycle regulation. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (5): 355-66.

40. Conrad P.A., Giuliano K.A., Fisher G., Collins K., Matsudaira P.T., Taylor D.L. (1993). Relative distribution of actin, myosin I, and myosin II during the wound healing response of fibroblasts. J Cell Biol 120 (6): 1381-91.

41. Cotton M., Claing A. (2009). G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cell Signal 21 (7): 1045-53.

42. Craig R., Smith R., Kendrick-Jones J. (1983). Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebrate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. Nature 302 (5907): 436-9.

43. Cuomo M.E., Knebel A., Piatt G., Morrice N., Cohen P., Mittnacht S. (2005). Regulation of Microfilament Organization by Kaposi Sarcoma-associated Herpes Virus-cyclin{middle dot}CDK6 Phosphorylation of Caldesmon. J Biol Chem 280 (43): 35844-35858.

44. D'Alessio S., Blasi F. (2009). The urokinase receptor as an entertainer of signal transduction. Front Biosci 14: 4575-87.

45. D'Angelo G., Graceffa P., Wang C.A., Wrangle J., Adam L.P. (1999). Mammal-specific, ERK-dependent, caldesmon phosphorylation in smooth muscle. Quantitation using novel anti-phosphopeptide antibodies. J Biol Chem 274 (42): 30115-21.

46. Dabrowska R., Goch A., Galazkiewicz B., Osinska II. (1985). The influence of caldesmon on ATPase activity of the skeletal muscle actomyosin and bundling of actin filaments. Biochim Biophys Acta 842 (1): 70-5.

47. Dabrowska R., Kulikova N., Gagola M. (2004). Nonmuscle caldesmon: its distribution and involvement in various cellular processes. Review article. Protoplasma 224 (1-2): 1-13.

48. Danson C.M., Pocha S.M., Bloomberg G.B., Cory G.O. (2007). Phosphorylation of WAVE2 by MAP kinases regulates persistent cell migration and polarity. J Cell Sci 120 (Pt 23): 4144-54.

49. Deguchi S., Sato M. (2009). Biomechanical properties of actin stress fibers of non-motile cells. Biorheology 46 (2): 93-105.

50. Deng M., Mohanan S., Polyak E., Chacko S. (2007). Caldesmon is necessary for maintaining the actin and intermediate filaments in cultured bladder smooth muscle cells. Cell Motil Cytoskeleton 64 (12): 951-65.

51. Dessy C., Kim I., Sougnez C.L., Laporte R., Morgan K.G. (1998). A role for MAP kinase in differentiated smooth muscle contraction evoked by alpha-adrenoceptor stimulation. Am J Physiol 275 (4 Pt 1): C1081-6.

52. Di Nardo A., Cicchetti G., Falet H., Hartwig J.H., Stossel T.P., Kwiatkowski D.J. (2005). Arp2/3 complex-deficient mouse fibroblasts are viable and have normal leading-edge actin structure and function. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (45): 16263-8.

53. DiMilla P.A., Barbee K., Lauffenburger D.A. (1991). Mathematical model for the effects of adhesion and mechanics on cell migration speed. Biophys J 60 (1): 15-37.

54. Drosten M., Dhawahir A., Sum E.Y., Urosevic J., Lechuga C.G., Esteban L.M., Castellano E., Guerra C., Santos E., Barbacid M. Genetic analysis of Ras signalling pathways in cell proliferation, migration and survival. EMBO J 29 (6): 1091-104.

55. Dugina V., Zwaenepoel I., Gabbiani G., Clement S., Chaponnier C. (2009). Beta and gamma-cytoplasmic actins display distinct distribution and functional diversity. J Cell Sci 122 (Pt 16): 2980-8.

56. Earley J.J., Su X., Moreland R.S. (1998). Caldesmon inhibits active crossbridges in unstimulated vascular smooth muscle: an antisense oligodeoxynucleotide approach. Circ Res 83 (6): 661-7.

57. Eddy R.J., Pierini L.M., Matsumura F., Maxfield F.R. (2000). Ca2+-dependent myosin II activation is required for uropod retraction during neutrophil migration. J Cell Sci 113 ( Pt 7): 1287-98.

58. Eppinga R.D., Li Y., Lin J.L., Mak A.S., Lin J.J. (2006). Requirement of reversible caldesmon phosphorylation at P21-activated kinase-responsive sites for lamellipodia extensions during cell migration. Cell Motil Cytoskeleton 63 (9): 543-62.

59. Erickson C.A., Trinkaus J.P. (1976). Microvilli and blebs as sources of reserve surface membrane during cell spreading. Exp Cell Res 99 (2): 375-84.

60. Eves R., Webb B.A., Zhou S., Mak A.S. (2006). Caldesmon is an integral component of podosomes in smooth muscle cells. J Cell Sci 119 (Pt 9): 1691-702.

61. Fernandez E.J., Lolis E. (2002). Structure, function, and inhibition of chemokines. Annu Rev Pharmacol Toxicol 42: 469-99.

62. Foster D.B., Huang R., Hatch V., Craig R., Graceffa P., Lehman W., Wang C.L. (2004). Modes of caldesmon binding to actin: sites of caldesmon contact and modulation of interactions by phosphorylation. J Biol Chem 279 (51): 53387-94.

63. Franklin M.T., Wang C.L., Adam L.P. (1997). Stretch-dependent activation and desensitization of mitogen-activated protein kinase in carotid arteries. Am J Physiol 273 (6 Pt 1): CI819-27.

64. Fraser I.D., Copeland O., Bing W., Marston S.B. (1997). The inhibitory complex of smooth muscle caldesmon with actin and tropomyosin involves three interacting segments of the C-terminal domain 4. Biochemistry 36 (18): 5483-92.

65. Friedl P., Wolf K. (2003). Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer 3 (5): 362-74.

66. Fujii T., Imai M., Rosenfeld G.C., Bryan J. (1987). Domain mapping of chicken gizzard caldesmon. J Biol Chem 262 (6): 2757-63.

67. Furst D.O., Cross R.A., De Mey J., Small J.V. (1986). Caldesmon is an elongated, flexible molecule localized in the actomyosin domains of smooth muscle. EMBO J 5 (2): 251-7.

68. Galazkiewicz B., Mossakowska M., Osinska H., Dabrowska R. (1985). Polymerization of G-actin by caldesmon. FEBS Lett 184 (1): 144-9.

69. Geiger B., Spatz J.P., Bershadsky A.D. (2009). Environmental sensing through focal adhesions. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (1): 21-33.

70. Glading A., Chang P., Lauffenburger D.A., Wells A. (2000). Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway. J Biol Chem 275 (4): 2390-8.

71. Goldstein A.L., Hannappel E., Kleinman H.K. (2005). Thymosin beta4: actin-sequestering protein moonlights to repair injured tissues. Trends Mol Med 11 (9): 421-9.

72. Gordon D.J., Yang Y.Z., Korn E.D. (1976). Polymerization of Acanthamoeba actin. Kinetics, thermodynamics, and co-polymerization with muscle actin. J Biol Chem 251 (23): 7474-9.

73. Graceffa P., Jancso A. (1993). Secondary structure and thermal stability of caldesmon and its domains. Arch Biochem Biophys 307 (1): 21-8.

74. Graceffa P., Wang C.L., Stafford W.F. (1988). Caldesmon. Molecular weight and subunit composition by analytical ultracentrifugation. J Biol Chem 263 (28): 14196-202.

75. Greenberg M.J., Wang C.L., Lehman W., Moore J.R. (2008). Modulation of actin mechanics by caldesmon and tropomyosin. Cell Motil Cytoskeleton 65 (2): 156-64.

76. Grosheva I., Vittitow J.L., Goichberg P., Gabelt B.T., Kaufman P.L., Borras T., Geiger B., Bershadsky A.D. (2006). Caldesmon effects on the actin cytoskeleton and cell adhesion in cultured HTM cells. Exp Eye Res 82 (6): 945-58.

77. Guo H., Wang C.L. (2005). Specific disruption of smooth muscle caldesmon expression in mice. Biochem Biophys Res Commun 330 (4): 1132-7.

78. Haeberle J.R., Trybus K.M., Hemric M.E., Warshaw D.M. (1992). The effects of smooth muscle caldesmon on actin filament motility. J Biol Chem 267 (32): 23001-6.

79. Hahn K., DeBiasio R., Taylor D.L. (1992). Patterns of elevated free calcium and calmodulin activation in living cells. Nature 359 (6397): 736-8.

80. Hayashi K., Yano H., Hashida T., Takeuchi R., Takeda O., Asada K., Takahashi E., Kato I., Sobue K. (1992). Genomic structure of the human caldesmon gene. Proc Natl Acad Sci US A 89 (24): 12122-6.

81. Hedges J.C., Oxhorn B.C., Carty M., Adam L.P., Yamboliev I.A., Gerthoffer W.T. (2000). Phosphorylation of caldesmon by ERK MAP kinases in smooth muscle. Am J Physiol Cell Physiol 278 (4): C718-26.

82. Heldin C.H., Westermark B. (1999). Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev 79 (4): 1283-316.

83. Hnath E.J., Wang C.L., Huber P.A., Marston S.B., Phillips G.N., Jr. (1996). Affinity and structure of complexes of tropomyosin and caldesmon domains. Biophys J 71 (4): 192033.

84. Hodgkinson JL M.S., Craig R, Vibert P, Lehman W. (1997). Three-dimensional image reconstruction of reconstituted smooth muscle thin filaments: effects of caldesmon. Biophys J. 72 (6): 2398-404.

85. Horwitz R., Webb D. (2003). Cell migration. Curr Biol 13 (19): R756-9.

86. Hosang M., Rouge M., Wipf B., Eggimann B., Kaufmann F., Hunziker W. (1989). Both homodimeric isoforms of PDGF (AA and BB) have mitogenic and chemotactic activity and stimulate phosphoinositol turnover. J Cell Physiol 140 (3): 558-64.i

87. Hosoya N., Hosoya H., Yamashiro S., Mohri H., Matsumura F. (1993). Localization of caldesmon and its dephosphorylation during cell division. J Cell Biol 121 (5): 1075-82.

88. Huang C., Jacobson K., Schaller M.D. (2004). MAP kinases and cell migration. J Cell Sci 117 (Pt 20): 4619-28.

89. Huang R., Cao G.J., Guo H., Kordowska J., Albert Wang C.L. (2006). Direct interaction between caldesmon and cortactin. Arch Biochem Biophys 456 (2): 175-82.

90. Huang R., Li L., Guo H., Wang C.L. (2003). Caldesmon binding to actin is regulated by calmodulin and phosphorylation via different mechanisms. Biochemistry 42 (9): 2513-23.

91. Huber P.A., Fraser I.D., Marston S.B. (1995). Location of smooth-muscle myosin and tropomyosin binding sites in the C-terminal 288 residues of human caldesmon. Biochem J 312 (Pt2): 617-25.

92. Humbert P.O., Dow L.E., Russell S.M. (2006). The Scribble and Par complexes in polarity and migration: friends or foes? Trends Cell Biol 16 (12): 622-30.

93. Humphrey M.B., Herrera-Sosa H., Gonzalez G., Lee R., Bryan J. (1992). Cloning of cDNAs encoding human caldesmons. Gene 112 (2): 197-204.

94. Hurley J.H., Misra S. (2000). Signaling and subcellular targeting by membrane-binding domains. Annu Rev Biophys Biomol Struct 29: 49-79.

95. Huxley A.F. (2000). Mechanics and models of the myosin motor. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355 (1396): 433-40.

96. Iden S., Collard J.G. (2008). Crosstalk between small GTPases and polarity proteins in cell polarization. Nat Rev Mol Cell Biol 9 (11): 846-59.

97. Ikebe M., Reardon S. (1990). Phosphorylation of smooth myosin light chain kinase by smooth muscle Ca2+/calmodulin-dependent multifunctional protein kinase. J Biol Chem 265 (16): 8975-8.

98. Ingram V.M. (1969). A side view of moving fibroblasts. Nature 222 (5194): 641-4.

99. Insall R.H., Machesky L.M. (2009). Actin dynamics at the leading edge: from simple machinery to complex networks. Dev Cell 17 (3): 310-22.

100. Ishikawa R., Yamashiro S., Kohama K., Matsumura F. (1998). Regulation of actin binding and actin bundling activities of fascin by caldesmon coupled with tropomyosin. J Biol Chem 273 (41): 26991-7.

101. Ishikawa R., Yamashiro S., Matsumura F. (19896). Annealing of gelsolin-severed actin fragments by tropomyosin in the presence of Ca2+. Potentiation of the annealing process by caldesmon. J Biol Chem 264 (28): 16764-70.

102. Izzard C.S., Lochner L.R. (1980). Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflexion study. J Cell Sci 42: 81-116.

103. Jin T., Xu X., Hereld D. (2008). Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine 44(1): 1-8.

104. Kasza K.E., Zallen J.A. Dynamics and regulation of contractile actin-myosin networks in morphogenesis. Curr Opin Cell Biol.

105. Katayama E., Horiuchi K.Y., Chacko S. (1989). Characteristics of the myosin and tropomyosin binding regions of the smooth muscle caldesmon. Biochem Biophys Res Commun 160 (3): 1316-22.

106. Katayama E., Scott-Woo G., Ikebe M. (1995). Effect of caldesmon on the assembly of smooth muscle myosin. J Biol Chem 270 (8): 3919-25.

107. Katoh K., Kano Y., Ookawara S. (2007). Rho-kinase dependent organization of stress fibers and focal adhesions in cultured fibroblasts. Genes Cells 12 (5): 623-38.

108. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J.V. (2002). Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. Int J Biochem Cell Biol 34 (7): 746-61.

109. Kaverina I., Rottner K., Small J.V. (1998). Targeting, capture, and stabilization of microtubules at early focal adhesions. J Cell Biol 142 (1): 181-90.

110. Keller R. (2005). Cell migration during gastrulation. Curr Opin Cell Biol 17 (5): 533-41.

111. Koestler S.A., Rottner K., Lai F., Block J., Vinzenz M., Small J.V. (2009). F- and G-actin concentrations in lamellipodia of moving cells. PLoS One 4 (3): e4810.

112. Konno K., Morales M.F. (1985). Exposure of actin thiols by the removal of tightly held calcium ions. Proc Natl Acad Sci U S A 82 (23): 7904-8.

113. Kordowska J., Hetrick T., Adam L.P., Wang C.L. (2006). Phosphorylated 1-caldesmon is involved in disassembly of actin stress fibers and postmitotic spreading. Exp Cell Res 312 (2): 95-110.

114. Korobova F., Svitkina T. (2008). Arp2/3 complex is important for filopodia formation, growth cone motility, and neuritogenesis in neuronal cells. Mol Biol Cell 19 (4): 1561-74.

115. Krymsky M.A., Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V. (2001). MAP-kinase phosphorylation sites in chicken smooth muscle caldesmon. J Muscle Res Cell Motil 22: 580a.

116. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259): 680-5.

117. Lamb N.J., Fernandez A., Mezgueldi M., Labbe J.P., Kassab R., Fattoum A. (1996). Disruption of the actin cytoskeleton in living nonmuscle cells by microinjection of antibodies to domain-3 of caldesmon. Eur J Cell Biol 69 (1): 36-44.

118. Lammermann T., Sixt M. (2009). Mechanical modes of'amoeboid' cell migration. Curr Opin Cell Biol 21 (5): 636-44.

119. Lauffenburger D.A., Horwitz A.F. (1996). Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell 84 (3): 359-69.

120. Le Clainche C., Carlier M.F. (2008). Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev 88 (2): 489-513.

121. Lehman W., Vibert, P., Craig, R., and Barany, M. (1996). Actin and the Structure of Smooth Muscle Thin Filaments. Biochemistry of Smooth Muscle Contraction, Academic Press Inc., San Diego.: 47-60.

122. Lehman W., Craig R. (2008). Tropomyosin and the steric mechanism of muscle regulation. Adv Exp Med Biol 644: 95-109.

123. Lehman W., Moody C., Craig R. (1990). Caldesmon and the structure of vertebrate smooth muscle thin filaments. A minireview. Ann N Y Acad Sci 599: 75-84.

124. Lehman W., Vibert P., Craig R. (1997). Visualization of caldesmon on smooth muscle thin filaments. J Mol Biol 274 (3): 310-7.

125. Lemmon M.A., Ferguson K.M., Abrams C.S. (2002). Pleckstrin homology domains and the cytoskeleton. FEBS Lett 513 (1): 71-6.

126. Li J., Zhang Y.P., Kirsner R.S. (2003). Angiogenesis in wound repair: angiogenic growth factors and the extracellular matrix. Microsc Res Tech 60 (1): 107-14.

127. Linder S., Kopp P. (2005). Podosomes at a glance. J Cell Sci 118 (Pt 10): 2079-82.

128. Machesky L.M., Hall A. (1997). Role of actin polymerization and adhesion to extracellular matrix in Rac- and Rho-induced cytoskeletal reorganization. J Cell Biol 138 (4): 913-26.

129. Mak A.S., Carpenter M., Smillie L.B., Wang J.H. (1991). Phosphorylation of caldesmon by p34cdc2 kinase. Identification of phosphorylation sites. J Biol Chem 266 (30): 19971-5.

130. Makuch R., Kulikova N., Graziewicz M.A., Nowak E., Dabrowska R. (1994). Polymerization of actin induced by actin-binding fragments of caldesmon. Biochim Biophys Acta 1206 (1): 49-54.

131. Malmqvist U., Arner A., Makuch R., Dabrowska R. (1996). The effects of caldesmon extraction on mechanical properties of skinned smooth muscle fibre preparations. Pflugers Arch 432 (2): 241-7.

132. Manes T., Zheng D.Q., Tognin S., Woodard A.S., Marchisio P.C., Languino L.R. (2003). Alpha(v)beta3 integrin expression up-regulates cdc2, which modulates cell migration. J Cell Biol 161 (4): 817-26.

133. Mannherz H.G., Mash, M., Nowak, D., Malicka-Blaszkiewicz, M., Mazur, A. (2007). Lamellipodial and amoeboid cell locomotion: the role of actin-cycling and bleb formation. Biophysical Reviews and Letters 2 (1): 5-22.

134. Margossian S.S., Lowey S. (1982). Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol 85 Pt B: 55-71.

135. Marston S., El-Mezgueldi M. (2008). Role of tropomyosin in the regulation of contraction in smooth muscle. Adv Exp Med Biol 644: 110-23.

136. Marston S.B., Fraser I.D., Huber P.A., Pritchard K., Gusev N.B., Torok K. (1994). Location of two contact sites between human smooth muscle caldesmon and Ca(2+)-calmodulin. J Biol Chem 269 (11): 8134-9.

137. Marston S.B., Redwood C.S. (1991). The molecular anatomy of caldesmon. Biochem J 279 (Pt 1): 1-16.

138. Marston S.B., Redwood C.S. (1993). The essential role of tropomyosin in cooperative regulation of smooth muscle thin filament activity by caldesmon. J Biol Chem 268 (17): 12317-20.

139. Marston S.B., Smith C.W. (1984). Purification and properties of Ca2+-regulated thin filaments and F-actin from sheep aorta smooth muscle. J Muscle Res Cell Motil 5 (5): 55975.

140. Marston SB., Gao Y., Evans J., Patchell V.B., El-Mezgueldi M., Fattoum A., Vorotnikov A.V. (2001). MAP kinase phosphorylation at serine 702 alters structural and actin binding properties of caldesmon. Biophys J 80 (1): 69a.

141. Matsumura F. (2005). Regulation of myosin II during cytokinesis in higher eukaryotes. Trends Cell Biol 31: 31.

142. Mazur A.J., Gremm D., Dansranjavin T., Litwin M., Jockusch B.M., Wegner A., Weeds A.G., Mannherz H.G. (2010). Modulation of actin filament dynamics by actin-binding proteins residing in lamellipodia. Eur J Cell Biol 89 (5): 402-13.

143. Mezgueldi M., Derancourt J., Calas B., Kassab R., Fattoum A. (1994). Precise identification of the regulatory F-actin- and calmodulin-binding sequences in the 10-kDa carboxyl-terminal domain of caldesmon. J Biol Chem 269 (17): 12824-32.

144. Miller A.F., Falke J.J. (2004). Chemotaxis receptors and signaling. Adv Protein Chem 68: 393-444.

145. Mirzapoiazova T., Kolosova I.A., Romer L., Garcia J.G., Verin A.D. (2005). The role of caldesmon in the regulation of endothelial cytoskeleton and migration. J Cell Physiol 203 (3): 520-8.

146. Mitchison T.J., Cramer L.P. (1996). Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell 84 (3): 371-9.

147. Moody C., Lehman W., Craig R. (1990). Caldesmon and the structure of smooth muscle thin filaments: electron microscopy of isolated thin filaments. J Muscle Res Cell Motil 11 (2): 176-85.

148. Moody C.J., Marston S.B., Smith C.W. (1985). Bundling of actin filaments by aorta caldesmon is not related to its regulatory function. FEBS Lett 191 (1): 107-12.

149. Mornet D., Harricane M.C., Audemard E. (1988). A 35-kilodalton fragment from gizzard smooth muscle caldesmon that induces F-actin bundles. Biochem Biophys Res Commun 155 (2): 808-15.

150. Mullins R.D., Heuser J.A., Pollard T.D. (1998). The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proc Natl Acad Sci U S A 95 (11): 6181-6.

151. Nakayama M., Amano M., Katsumi A., Kaneko T., Kawabata S., Takefuji M., Kaibuchi K. (2005). Rho-kinase and myosin II activities are required for cell type and environment specific migration. Genes Cells 10 (2): 107-17.

152. Novy R.E., Lin J.L., Lin J.J. (1991). Characterization of cDNA clones encoding a human fibroblast caldesmon isoform and analysis of caldesmon expression in normal and transformed cells. J Biol Chem 266 (25): 16917-24.

153. Olney J.J., Sellers J.R., Cremo C.R. (1996). Structure and function of the 10 S conformation of smooth muscle myosin. J Biol Chem 271 (34): 20375-84.

154. Otterbein L.R., Graceffa P., Dominguez R. (2001). The crystal structure of uncomplexed actin in the ADP state. Science 293 (5530): 708-11.

155. Owada M.K., Hakura A., Iida K., Yahara I., Sobue K., Kakiuchi S. (1984). Occurrence of caldesmon (a calmodulin-binding protein) in cultured cells: comparison of normal and transformed cells. Proc Natl Acad Sci U S A 81 (10): 3133-7.

156. Ozaki Y., Nishimura M., Sekiya K., Suehiro F., Kanawa M., Nikawa H., Hamada T., Kato Y. (2007). Comprehensive analysis of chemotactic factors for bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev 16(1): 119-29.

157. Pawson T., Kofler M. (2009). Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol 21 (2): 147-53.

158. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., Xu B.E., Karandikar M., Berman K., Cobb M.H. (2001). Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions. Endocr Rev 22 (2): 153-83.

159. Persechini A., Kamm K.E., Stull J.T. (1986). Different phosphorylated forms of myosin in contracting tracheal smooth muscle. J Biol Chem 261 (14): 6293-9.

160. Peskin C.S., Odell G.M., Oster G.F. (1993). Cellular motions and thermal fluctuations: the Brownian ratchet. Biophys J 65 (1): 316-24.

161. Pfitzer G., Fischer W., Chalovich J.M. (1993). Phosphorylation-contraction coupling in smooth muscle: role of caldesmon. Adv Exp Med Biol 332: 195-202; discussion 202-3.

162. Pfitzer G., Zeugner C., Troschka M., Chalovich J.M. (1993). Caldesmon and a 20-kDa actin-binding fragment of caldesmon inhibit tension development in skinned gizzard muscle fiber bundles. Proc Natl Acad Sci U S A 90 (13): 5904-8.

163. Pollard T.D. (1990). Actin. Curr Opin Cell Biol 2 (1): 33-40.

164. Pollard T.D. (2007). Regulation of actin filament assembly by Arp2/3 complex and formins. Annu Rev Biophys Biomol Struct 36: 451-77.

165. Pollard T.D., Blanchoin L., Mullins R.D. (2000). Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells, Annu Rev Biophys Biomol Struct 29: 545-76.

166. Pollard T.D., Borisy G.G. (2003). Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 112 (4): 453-65.

167. Pollard T.D., Cooper J.A. (1986). Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev Biochem 55: 987-1035.

168. Pollitt A.Y., Insall R.H. (2009). WASP and SCAR/WAVE proteins: the drivers of actin assembly. J Cell Sci 122 (Pt 15): 2575-8.

169. Ponti A., Machacek M., Gupton S.L., Waterman-Storer C.M., Danuser G. (2004). Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science 305 (5691): 1782-6.

170. Post P.L., DeBiasio R.L., Taylor D.L. (1995). A fluorescent protein biosensor of myosin II regulatory light chain phosphorylation reports a gradient of phosphorylated myosin II in migrating cells. Mol Biol Cell 6 (12): 1755-68.

171. Pritchard K., Marston S.B. (1989). Ca2+-calmodulin binding to caldesmon and the caldesmon-actin-tropomyosin complex. Its role in Ca2+ regulation of the activity of synthetic smooth-muscle thin filaments. Biochem J 257 (3): 839-43.

172. Redwood C.S., Marston S.B. (1993). Binding and regulatory properties of expressed functional domains of chicken gizzard smooth muscle caldesmon. J Biol Chem 268 (15): 10969-76.

173. Redwood C.S., Marston S.B., Gusev N.B. (1993). The functional effects of mutations Thr673~>Asp and Ser702~>Asp at the Pro-directed kinase phosphorylation sites in the C-terminus of chicken gizzard caldesmon. FEBS Lett 327 (1): 85-9.

174. Resnicow D.I., Hooft A.M., Harrison B.C., Baker J.E., Leinwand L.A. (2008). GFP fails to inhibit actin-myosin interactions in vitro. Nat Methods 5 (3): 212-3; author reply 213-4.

175. Ridley A.J. (2001). Rho GTPases and cell migration. J Cell Sci 114 (Pt 15): 2713-22.

176. Ridley A.J., Schwartz M.A., Burridge K., Firtel R.A., Ginsberg M.H., Borisy G., Parsons J.T., Horwitz A.R. (2003). Cell migration: integrating signals from front to back. Science 302 (5651): 1704-9.

177. Robinson M.J., Cobb M.H. (1997). Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr Opin Cell Biol 9 (2): 180-6.

178. Rodriguez L.G., Wu X., Guan J.L. (2005). Wound-healing assay. Methods Mol Biol 294: 23-9.

179. Ronnstrand L., Heldin C.H. (2001). Mechanisms of platelet-derived growth factor-induced chemotaxis. Int J Cancer 91 (6): 757-62.

180. Roux P.P., Blenis J. (2004). ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions. Microbiol Mol Biol Rev 68 (2): 320-44.

181. Schaffner W., Weissmann C. (1973). A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal Biochem 56 (2): 502-14.

182. Schlessinger J., Lemmon M.A. (2003). SH2 and PTB domains in tyrosine kinase signaling. Sci STKE 2003 (191): RE12.

183. Schneider I.C., Haugh J.M. (2006). Mechanisms of gradient sensing and chemotaxis: conserved pathways, diverse regulation. Cell Cycle 5(11): 1130-4.

184. Scholey J.M., Taylor K.A., Kendrick-Jones J. (1981). The role of myosin light chains in regulating actin-myosin interaction. Biochimie 63 (4): 255-71.

185. Scita G., Tenca P., Frittoli E., Tocchetti A., Innocenti M„ Giardina G„ Di Fiore P.P. (2000). Signaling from Ras to Rac and beyond: not just a matter of GEFs. EMBO J 19 (11): 2393-8.

186. Sellers J.R., Pato M.D., Adelstein R.S. (1981). Reversible phosphorylation of smooth muscle myosin, heavy meromyosin, and platelet myosin. J Biol Chem 256 (24): 13137-42.

187. Sen A., Chen Y.D., Yan B., Chalovich J.M. (2001). Caldesmon reduces the apparent rate of binding of myosin SI to actin-tropomyosin. Biochemistry 40 (19): 5757-64.

188. Shirinsky V.P., Yorotnikov, A. V., Gusev, N.B. (1998). Caldesmon phosphorylation and smooth muscle contraction. Molecular mechanisms and their disorder in smooth muscle contraction. TX: LANDES Bioscience.

189. Sithanandam G., Fornwald L.W., Fields J., Anderson L.M. (2005). Inactivation of ErbB3 by siRNA promotes apoptosis and attenuates growth and invasiveness of human lung adenocarcinoma cell line A549. Oncogene 24 (11): 1847-59.

190. Small J.V., Anderson K., Rottner K. (1996). Actin and the coordination of protrusion, attachment and retraction in cell crawling. Biosci Rep 16 (5): 351-68.

191. Small J.V., Herzog M., Anderson K. (1995). Actin filament organization in the fish keratocyte lamellipodium. J Cell Biol 129 (5): 1275-86.

192. Small J.V., Isenberg G., Celis J.E. (1978). Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature 272 (5654): 638-9.

193. Small J.V., Resch G.P. (2005). The comings and goings of actin: coupling protrusion and retraction in cell motility. Curr Opin Cell Biol 17 (5): 517-23.

194. Small J.V., Stradal T., Vignal E., Rottner K. (2002). The lamellipodium: where motility begins. Trends Cell Biol 12 (3): 112-20.

195. Sobue K., Muramoto Y., Fujita M., Kakiuchi S. (1981). Purification of a calmodulin-binding protein from chicken gizzard that interacts with F-actin. Proc Natl Acad Sci USA 78 (9): 5652-5.

196. Sobue K., Sellers J.R. (1991). Caldesmon, a novel regulatory protein in smooth muscle and nonmuscle actomyosin systems. J Biol Chem 266 (19): 12115-8.

197. Spudich J.A., Watt S. (1971). The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem 246 (15): 4866-71.

198. Stafford W.F., Jancso A., Graceffa P. (1990). Caldesmon from rabbit liver: molecular weight and length by analytical ultracentrifugation. Arch Biochem Biophys 281 (1): 66-9.

199. Sun H.Q., Yamamoto M., Mejillano M., Yin H.L. (1999). Gelsolin, a multifunctional actin regulatory protein. J Biol Chem 274 (47): 33179-82.

200. Surgucheva I., Bryan J. (1995). Over-expression of smooth muscle caldesmon in mouse fibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton 32 (3): 233-43.

201. Svitkina T.M., Borisy G.G. (1999). Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J Cell Biol 145 (5): 1009-26.

202. Svitkina T.M., Bulanova E.A., Chaga O.Y., Vignjevic D.M., Kojima S., Vasiliev J.M., Borisy G.G. (2003). Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol 160 (3): 409-21.

203. Svitkina T.M., Verkhovsky A.B., Borisy G.G. (1995). Improved procedures for electron microscopic visualization of the cytoskeleton of cultured cells. J Struct Biol 115 (3): 290303.

204. Swaney K.F., Huang C.H., Devreotes P.N. (2010). Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys 39: 265-89.

205. Szpacenko A., Dabrowska R. (1986). Functional domain of caldesmon. FEBS Lett 202 (2): 182-6.

206. Takashima S. (2009). Phosphorylation of myosin regulatory light chain by myosin light chain kinase, and muscle contraction. Circ J 73 (2): 208-13.

207. Tanaka J., Watanabe T., Nakamura N., Sobue K. (1993). Morphological and biochemical analyses of contractile proteins (actin, myosin, caldesmon and tropomyosin) in normal and transformed cells. J Cell Sci 104 (Pt 2): 595-606.

208. Taussky H.H., Shorr E. (1953). A microcolorimetric method for the determination of inorganic phosphorus. J Biol Chem 202 (2): 675-85.

209. Theriot J.A., Mitchison T.J. (1991). Actin microfilament dynamics in locomoting cells. Nature 352 (6331): 126-31.

210. Theriot J.A., Mitchison T.J. (1992). The nucleation-release model of actin filament dynamics in cell motility. Trends Cell Biol 2 (8): 219-22.

211. Tondeleir D., Vandamme D., Vandekerckhove J., Ampe C., Lambrechts A. (2009). Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton 66 (10): 798-815.

212. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76 (9): 4350-4.

213. Trybus K.M. (1991). Assembly of cytoplasmic and smooth muscle myosins. Curr Opin Cell Biol 3 (1): 105-11.

214. Ueki N., Sobue K., Kanda K., Hada T., Higashino K. (1987). Expression of high and low molecular weight caldesmons during phenotypic modulation of smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84 (24): 9049-53.

215. Umekawa H., Hidaka H. (1985). Phosphorylation of caldesmon by protein kinase C. Biochem Biophys Res Commun 132 (1): 56-62.

216. Urban E., Jacob S., Nemethova M., Resch G.P., Small J.V. (2010). Electron tomography reveals unbranched networks of actin filaments in lamellipodia. Nat Cell Biol 12 (5) 429-35.

217. Van Haastert P.J., Devreotes P.N. (2004). Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (8): 626-34.

218. Vandekerckhove J., Weber K. (1978). At least six different actins are expressed in a higher mammal: an analysis based on the amino acid sequence of the amino-terminal tryptic peptide. J Mol Biol 126 (4): 783-802.

219. Vasiliev J.M. (2004). Cytoskeletal mechanisms responsible for invasive migration of neoplastic cells. Int J Dev Biol 48 (5-6): 425-39.

220. Veltman D.M., Insall R.H. (2010). WASP family proteins: their evolution and its physiological implications. Mol Biol Cell 21 (16): 2880-93.

221. Veltman D.M., Keizer-Gunnik I., Van Haastert P.J. (2008). Four key signaling pathways mediating chemotaxis in Dictyostelium discoideum. J Cell Biol 180 (4): 747-53.

222. Verkhovsky A.B., Borisy G.G. (1993). Non-sarcomeric mode of myosin II organization in the fibroblast lamellum. J Cell Biol 123 (3): 637-52.

223. Verkhovsky A.B., Svitkina T.M., Borisy G.G. (1995). Myosin II filament assemblies in the active lamella of fibroblasts: their morphogenesis and role in the formation of actin filament bundles. J Cell Biol 131 (4): 989-1002.

224. Vibert P., Craig R., Lehman W. (1993). Three-dimensional reconstruction of caldesmon-containing smooth muscle thin filaments. J Cell Biol 123 (2): 313-21.

225. Vicente-Manzanares M., Choi C.K., Horwitz A.R. (2009). Integrins in cell migration—the actin connection. J Cell Sci 122 (Pt 2): 199-206.

226. Vicente-Manzanares M., Ma X., Adelstein R.S., Horwitz A.R. (20096). Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nat Rev Mol Cell Biol 10 (11): 778-90.

227. Vignjevic D., Kojima S., Aratyn Y., Danciu O., Svitkina T., Borisy G.G. (2006). Role of fascin in filopodial protrusion. J Cell Biol 174 (6): 863-75.

228. Vignjevic D., Yarar D., Welch M.D., Peloquin J., Svitkina T., Borisy G.G. (2003). Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. J Cell Biol 160 (6): 951-62.

229. Vorotnikov A.V., Krymskii M.A., Chibalina M.V., Kudriashov D.S., Shirinskii V.P. (2000). Differences in phorbol-dependent phosphorylation of regulatory proteins and contraction of phasic and tonic smooth muscle. Tsitologiia 42 (4): 378-91.

230. Vorotnikov A.V., Krymsky M.A., Shirinsky V.P. (2002). Signal transduction and protein phosphorylation in smooth muscle contraction. Biochemistry (Mosc) 67 (12): 1309-28.

231. Vorotnikov A.V., Marston S.B., Iluber P.A. (1997). Location and functional characterization of myosin contact sites in smooth muscle caldesmon. Biochem J 328 ( Pt 1): 211-8.

232. Vorotnikov A.V., Shirinsky V.P., Gusev N.B. (1988). Phosphorylation of smooth muscle caldesmon by three protein kinases: implication for domain mapping. FEBS Lett 236 (2): 321-4.

233. Wang C.L. (2008). Caldesmon and the regulation of cytoskeletal functions. Adv Exp Med Biol 644: 250-72.

234. Wang C.L., Coluccio L.M. (2010). New insights into the regulation of the actin cytoskeleton by tropomyosin. Int Rev Cell Mol Biol 281: 91-128.

235. Wang C.L., Wang L.W., Xu S.A., Lu R.C., Saavedra-Alanis V., Bryan J. (1991). Localization of the calmodulin- and the actin-binding sites of caldesmon. J Biol Chem 266 (14): 9166-72.

236. Wang Y.L. (1985). Exchange of actin subunits at the leading edge of living fibroblasts: possible role of treadmilling. J Cell Biol 101 (2): 597-602.

237. Wang Y.L. (1987). Mobility of filamentous actin in living cytoplasm. J Cell Biol 105 (6 Pt 1): 2811-6.

238. Wang Z., Chacko S. (1996). Mutagenesis analysis of functionally important domains within the C-terminal end of smooth muscle caldesmon. J Biol Chem 271 (41): 25707-14.

239. Wang Z., Horiuchi K.Y., Chacko S. (1996). Characterization of the functional domains on the C-terminal region of caldesmon using full-length and mutant caldesmon molecules. J Biol Chem 271 (4): 2234-42.

240. Wang Z., Yang Z.Q., Chacko S. (1997). Functional and structural relationship between the calmodulin-binding, actin-binding, and actomyosin-ATPase inhibitory domains on the C terminus of smooth muscle caldesmon. J Biol Chem 272 (27): 16896-903.

241. Waters C., Pyne S., Pyne N.J. (2004). The role of G-protein coupled receptors and associated proteins in receptor tyrosine kinase signal transduction. Semin Cell Dev Biol 153.: 309-23.

242. Wegner A. (1976). Head to tail polymerization of actin. J Mol Biol 108 (1): 139-50.

243. Welch H.C., Coadwell W.J., Stephens L.R., Hawkins P.T. (2003). Phosphoinositide 3-kinase-dependent activation of Rac. FEBS Lett 546 (1): 93-7.

244. Yamakita Y., Oosawa F., Yamashiro S., Matsumura F. (2003). Caldesmon inhibits Arp2/3-mediated actin nucleation. J Biol Chem 278 (20): 17937-44.

245. Yamakita Y., Yamashiro S., Matsumura F. (1990). Microinjection of nonmuscle and smooth muscle caldesmon into fibroblasts and muscle cells. J Cell Biol 111 (6 Pt 1): 248798.

246. Yamakita Y., Yamashiro S., Matsumura F. (1992). Characterization of mitotically phosphorylated caldesmon. J Biol Chem 267 (17): 12022-9.

247. Yamashiro S., Chern H., Yamakita Y., Matsumura F. (2001). Mutant Caldesmon lacking cdc2 phosphorylation sites delays M-phase entry and inhibits cytokinesis. Mol Biol Cell 12 (1): 239-50.

248. Yamashiro S., Yamakita Y., Hosoya H., Matsumura F. (1991). Phosphorylation of non-muscle caldesmon by p34cdc2 kinase during mitosis. Nature 349 (6305): 169-72.

249. Yamashiro S., Yamakita Y., Ishikawa R., Matsumura F. (1990). Mitosis-specific phosphorylation causes 83K non-muscle caldesmon to dissociate from microfilaments. Nature 344 (6267): 675-8.

250. Yamboliev I.A., Gerthoffer W.T. (2001). Modulatory role of ERK MAPK-caldesmon pathway in PDGF-stimulated migration of cultured pulmonary artery SMCs. Am J Physiol Cell Physiol 280 (6): C1680-8.

251. Yoshio T., Morita T., Kimura Y., Tsujii M., Hayashi N., Sobue K. (2007). Caldesmon suppresses cancer cell invasion by regulating podosome/invadopodium formation. FEBS Lett 581 (20): 3777-82.

252. Young D.M., Himmelfarb S., Harrington W.F. (1964). The Relationship of the Meromyosins to the Molecular Structure of Myosin. J Biol Chem 239: 2822-9.

253. Zhan Q.Q., Wong S.S., Wang C.L. (1991). A calmodulin-binding peptide of caldesmon. J Biol Chem 266 (32): 21810-4.

254. Zhang S., Guo D., Jiang L., Zhang Q., Qiu X., Wang E. (2008). SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2 signaling in vitro. BMC Cancer 8: 150.

255. Zhang S., Han J., Sells M.A., Chernoff J., Knaus U.G., Ulevitch R.J., Bokoch G.M. (1995). Rho family GTPases regulate p38 mitogen-activated protein kinase through the downstream mediator Pakl. J Biol Chem 270 (41): 23934-6.

256. Zhou C., Petroll W.M. Rho Kinase Regulation of Fibroblast Migratory Mechanics in Fibrillar Collagen Matrices. Cell Mol Bioeng 3 (1): 76-83.

257. Ziegler W.H., Liddington R.C., Critchley D.R. (2006). The structure and regulation of vinculin. Trends Cell Biol 16 (9): 453-60.

Информация о работе

Кудряшова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудряшова, Татьяна Владимировна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кудряшова, Татьяна Владимировна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудряшова, Татьяна Владимировна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кальдесмона в миграции немышечных клеток
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия