Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ионов кальция в механизмах действия ацетилхолинана энергетический обмен в митохондриях печени крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов кальция в механизмах действия ацетилхолинана энергетический обмен в митохондриях печени крыс"

ЛІ§:і®ЬКМ(^ЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ІВАНА ФРАНКА

На правах рукопису

ВАТАМАНЮК МАРКО ЗІНОВІЙОВИЧ

РОЛЬ ЙОНІВ КАЛЬЦІЮ В МЕХАНІЗМАХ ДІЇ АЦЕТИЛХОЛІНУ НА ЕНЕРГЕТИЧНИЙ ОБМІН В МІТОХОНДРІЯХ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

. Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Львів - 1996

Дисертщією є рукопис Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин . Львівського державного університету ім. Івана Франка

Наукові керівники: •

доктор медичних наук, професор, академік АН ВШУ доктор біологічних наук Офіційні опоненти: член-кореспондент Академії медичних наук, професор академік УА МБН,

доктор біологічних наук, професор

Шостаковська І.В. Доліба М.М.

Березовський В.Я.

Тимочко М.Ф.

Провідна установа - Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, науково-дослідний інститут фізіології

годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К. 04.04.09 з б: ологічних наук при Львівському університеті імені Івана Франк; Адреса: 290005, Львів-5, вул. Грушевського, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського державного університету ім. Івана Франка

Автореферат розіслано "_____" ______________ 1996 року

Вчений секретар

спеціалізованої ради К 04.04.0°

Захист дисертації відбудеться "З "ЛипнЯ 1996р. о

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дія багатьох нейротрансміттерів на внутрішньоклітинні процеси реалізу5ться через підвищення цитоплазматичної концентрації йонів кальцію (Williamson et al., 1981), а це, в свою чергу, призводить до збільшення концентрації катіону в мітохондріях (MX) (Denton, McCormack, 1981).

Мітохондріальні ферменти, такі як «-кетоглутарат дегідрогеназа (КГД), піруват дегідрогеназа (ПДГ), ізоцитрат дегідрогеназа (Halestrap, 1985; Denton, 1980) та дегідрогеназа бурштинової кислоти (ДБК) (Ezawa,' Ogata 1979) активуються при підвищенні цитоплазматичної і мітохондріальної концентрації йонів Са2+. Взаємодія ацетилхоліну (АХ)/з холінорецептором призводить до підвищення цитоплазматичної концентрації Са2+ (Rubin, 1970; Rasmussen, Goodman, 1977; Kidokoro, 1982) і одночасного збільшення його вмісту в MX (Rasmussen et al., 1975). Виявлено стимулюючий ефект АХ на дихання і окисне фосфорилювання в MX серця і печінки при окисненні а-кетоглутарату (КГ) та чинники, що впливають на виявлення цього ефекту (Шостаковская и др., 1986; Дбаг Мрван и др., 1991; Доліба та ін., 1994).

Відомо про вплив адрено- і холіноміметиків на енергетичні параметри MX, виділених з різних органів тварин. Так, ін’єкція тваринам адреналіну призводить до підвищення окиснення одного з субстратів циклу Кребса - бурштинової кислоти (БК) (Бабский и др., 1985), а ін’єкція АХ - до окиснення КГ (Долиба, 1986). Стимуляція окиснення КГ супроводжується зниженням -окиснення БК за рахунок активації субстратного фосфорилювання і синтезу ГТФ (Доліба та ін., 1994). Показано також вплив" адреналіну та АХ на

транспорт йонів кальцію та окисне фосфорилювання в MX (Шостаковская, Бабский, 1984; Гордий и др., 1985).

Описане вище наводить на думку про взаємозв’язок між меха нізмами дії нейротрансміттерів та процесами перерозподілу йоні кальцію в МХ. Однак безпосередні дослідження по виявленню рол йонів кальцію в механізмах дії немедіаторного АХ не проводилися Виясненню цього питання і присвячена дана робота.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи, було вияв лення ролі йонів кальцію в механізмах дії АХ на дихання і окисн фосфорилювання МХ печінки за умов активації холінергічної систем введенням АХ і прозерину та природнього підвищення холінергічног статусу за умов адаптації організму до гіпоксійних умов середови ща. Для вияснення цієї проблеми ми дослідили:

- роль йонів кальцію в реалізації регулюючого впливу веєдє ного в організм АХ на дихання та окисне фосфорилювання в МХ пе чінки щура; залежність ефекту введеного АХ від різної концентра ції кальцію в середовищі інкубації МХ; роль йонів кальцію в ефек тах АХ на енергетичний обмін в ізольованій перфузованій печінці швидкість транспорту катіону в органели та чутливість ефектів А до ^дії блокаторів кальцієвих каналів в перфузованому органі вплив адаптації тварин до гіпоксичної гіпоксії на процеси дихан ня, окисного та субстратного фосфорилювання, а також транспор йонів кальцію в МХ печінки щурів.

Наукова новизна. Виявлено, що дія введеного в організм АХ яка призводить до вибіркової активації окиснення одного з інтер медіатів ЦТК - КГ і пов’язана із ефективнішим використанням кисн через підвищення спряженості дихання і окисного фосфорилювання залежить від йонів кальцію. Виявлено вплив різних концентраці йонів кальцію в середовищі інкубації МХ на швидкість дихання ь за умов окиснення КГ та її залежність від попереднього введень АХ. Максимальний ефект проявляється при концентрації катіону

- з - .

ередовищі інкубації в межах ІхіСҐ9- 5хіо-8М. Показана роль йонів альцію в активації окиснення КГ на ізольованій перфузованій пе-інці за умов дії АХ та зняття цього ефекту блокаторами кальціє-их струмі,в верапамілом та ніфедипіном. Показано, що поряд із мінами в диханні і окисному фосфорилюванні в МХ за умов адапта-,ії до гіпобаричної гіпоксії змінюється і кальцієва ємність МХ.

(е підтверджує роль йонів Са2+ у змінах енергетичного обміну в МХ умовах пристосування організму до недостачі кисню. На основі роведених досліджень зроблено висновок про реципрокні відносини ііж АДФ-стимульованим та Са2+-активованим диханням в МХ печінки [урів за умов адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії під час ікиснення БК і КГ.

Науково-практична цінність роботи. Отримані дані є вкладом і «ним з багаточисельних підтверджень концепції дії первинних мес-:енджерів на метаболічні процеси в клітинах. Виявлено, що АХ реа-:ізує свій ефект в МХ печінки щура завдяки підвищенню циркуляції юнів кальцію через мітохондріальну мембрану та збільшенню спо-іідненості КГД до свого субстрату - КГ. На основі даних, отрима-іих в умовах пристосування організму до нестачі кисню, відмічена іеципрокність АДФ-стимульованого та Са2+-активованого дихання в (X печінки щура.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи бу-іи представлені в матеріалах доповідей на: XIV з’їзді Укр. фізі-

>л. т-ва (Київ, 1994) та науковій конференції 'біологічного ф-ту Іьвівського ун-ту ім.і. Франка (1996)..

Структура дисертації. Дисертація складається зі Еступу, ог-іяду літератури, опису методів досліджень та отриманих результате,їх обговорення, висновків і списку літератури (249 назв). Ро-іота викладена на 138 сторінках, містить 5 таблиць та 11 малюнків.

Декларація особистого внеску дисертанта. Експериментальні дані, статистичне опрацювання, інтерпретування результатів та їх аналіз проведено самостійно та з допомогою наукових керівників.

' МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЬ

В роботі використовували щурів-самців вагою 180-220 г. Ацетилхолін вводили внутрішньочеревно в дозі 50 мкг на 100г маси щура за 15 хв. до декапітації тварини, через 5 хв. після введення інгібітора ацетилхолінестерази - прозерину (Долиба, 1986). Введення АХ і прозерину ( 5мкг/100г маси) контролювалось введенням таких самих'об'ємів 0,9%-го розчину NaCl. У випадку вияснення ролі кальцію в середовище інкубації МХ додавали ЕГТА-Са2+ - буфер, моделюючи різні концентрації цього йону (Denton, McCormack,1980).

Для перфузії тварин анестезували за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції тіопенталу натрію (Юмг/ЮОг маси). Ізольовану печінку щура перфузували за методом Міллера (1973) в модифікації Доліби (Iwao Ikai et al., 1991). AX для перфузії використовувався у дозі 1хіо~®М, а верапаміл і ніфедипін у 5.5хЮ_5м та 357 мкг/л, відповідно.

В дослідженнях пов’язаних з адаптацією тварин до гіпоксії тварин попередньо розділяли на високо- і низькорезистентних до дії цього чинника (Березовський, 1975). В дослідах використовували високорезистентних до гіпоксії щурів. Тварин поміщали в барокамеру і створювали в ній парціальний тиск кисню 52 мм рт.ст., що відповідає висоті 7000м. Тривалість перебування тварин в барокамері становила щоденно 4 год. Тварин адаптували до гіпобаричної гіпоксії протягом 12-16 днів.

МХ печінки виділяли за методом диференційного центрифугування згідно до загальноприйнятих схем та модифікацій, що забезпечують краще збереження їх до нативного стану (Кондрашова, Григорен-

ко, 1985). Дихання MX печінки реєстрували полярографічним методом з допомогою відкритого платинового електроду. Транспорт кальцію в МХ вимірювали потенціометрично (Nishimura, 1962). Субстратне фосфорилювання реєструвалось полярографічно за методом (Olson, Allgyer, 1972) в модифікації Доліби (1986).

Як субстрати окиснення використовували - від 0.02мМ до 5мМ КГ та 0.35 мМ БК, дихання стимулювали АДФ і СаСІг по 200 мкМ.

Вміст білка визначали за Лоурі (1951). Результати експериментів аналізували методом варіаційної статистики (Деркач та ін., 1977; Гублер, Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ Залежність ефектів введеного ацетилхоліну на окиснення ct-кетоглутарату від концентрації йонів кальцію в середовищі Інкубації мітохондрій Ми промоделювали вплив нейротрансміттера парасимпатичної нервової системи АХ на дихання і окисне фосфорилювання в МХ печінки щура, залежність цього ефекту від концентрації йонів Са2+і субстрату окиснення - КГ. Попередньо тваринам вводився АХ, а виділені (ИХ печінки інкубуЕалися протягом реєстрації дихання е полярографічній комірці з різними концентраціями кальцію.

На рис. 1 А-Г представлені діаграми швидкостей дихання МХ контрольних (суцільна лінія) та дослідних (внутрішньочеревинне уведення АХ в дозі 50мкг/100г маси; час дії - 15 хв.) тварин (пунктирна лінія) в середовищах інкубації, концентрацію вільних йонів кальцію в яких змінювали використовуючи ЕГТА-Са2+- буфер (Denton et al., 1980). З рисунка видно, що АХ викликає виражену активацію АДФ-стимульованого дихання МХ печінки за окиснення КГ при концентраціях кальцію від 1*10_9М до 1.2*10_7M. Стимулюючий дихання ефект АХ зменшується при збільшенні концентрації йонів

кальцію. Це проявляється за умов додаткового внесення в середови ще інкубації йонів кальцію, що призводить до стимуляції диханн тільки МХ контрольних тварин, тоді як дихання МХ дослідних твари залишається фактично незмінним (рис.1 А,Б). Враховуючи наші попе редні дані про стимулюючий вплив АХ на транспорт йонів кальцію т, кальцієву ємність МХ (Доліба та ін., 1994), можна припустити, щі

уведення тваринам АХ призводить до акумуляції МХ йонів кальцію стимуляції кальцій-залежних дегідрогеназ (КГД, ПДК, ізоцитрат дегідрогенази) і на момент виділення МХ з організму тварини швидкість дихання за умов окиснення відповідних вказаним ферментаї субстратів досягає максимального значення. Очевидно, внаслідої цього не спостерігається приросту швидкості дихання в МХ дослідних тварин при внесенні в середовище інкубації йонів кальцію. Подальше збільшення концентрації вільних йонів кальцію в середовищ: до 1.2хЮ“7М (В) та 2.2хЮ-7М (Г) призводить до зниження швидкості фосфорилюючого дихання МХ як контрольних так і дослідних тварин в метаболічному стані Уз (СЬапсе, Иііііатз, 1956), а також де явища зворотнього дихального контролю - відсутності стимуляції дихання при додаванні АДФ е МХ дослідних тварин (Г). Зниженні швидкості дихання МХ при високих концентраціях кальцію співпадає із зниженням ефективності використання кисню (АДФ/ДО), що вказує на роз'єднання спряження дихання і фосфорилювання. Ці дані корелюють із даними Шгееіз, Вашпгискег, 1982) про роз’єднання дихання і фосфорилювання в МХ при високих концентраціях йонів кальцію. Слід відмітити, що в МХ дослідних тварин описані зміни відбуваються швидше, ніж в контрольних, що є свідченням більшої попередньої завантаженості їх цим катіоном, очевидно, як результат впливу введеного внутрішньочеревинно АХ.

иг-ат.О ь.кг білка

120-

20-

АД»

Є"

А**

»

її

60с

1x10

А

і--.

9

АД*

І

Г'І

А»

і.

Вх1(Г

і.ало*7

в

2.2ХІ0*7

г

Коядоятрація Лотів Са2*в середпвщі інкубації .

Рис.1 Вплив АХ і різних концентрацій йонів Са2+ в середовищі нкубації МХ печінки щурів на окиснення КГ.

Доза АХ - 50 мкг на 100 г маси, прозерину - 5 мкг на 100 г зси. Час дії 15 хв. Суцільна лінія - контроль, пунктирна - 15 хв ісля введення АХ. Субстрат окиснення - КГ (ІмМ).

Достовірно за парним критерієм Вілконсона (р<0.05).

. Залежність ефектів введеного ацетилхоліну на окиснення різних концентрацій «-кетоглутарату від різних концентрацій йонів Са2+в середовищі інкубації Ми виявили залежність ефекту введеного в організм тварини АХ

* дихання МХ печінки в середовищах інкубації з АДФ (1.5мМ) і моїми • Са2+. У дослідах використовували оптимальну концентрацію °+ •

г для виявлення максимальної швидкості дихання і окисного фос-рилювання МХ, що становила 5х10~8 - 1*10-9М та середовище з мі-мальною концентрацією цього катіону (Са2+<<1СҐ9М). Як субстрат иснення використовували КГ (табл.1).

Табл. 1 Залежність АДФ-стимульованого дихання (нг.ат. 0/хв.мг білка^ від дії ацетилхоліну (50мкг/Ю0г) при окисненні різних концентрацій а-кетоглутарату в кальцієвому (5мМ ЕГТА)

1 безкальцієвому (ЮмМ ЕГТА) середовищах інкубації мітохондрій печінки щура (М±ш), п=5.

Концентрація а-кетоглутарату Контроль 10 мМ ЕГТА Ацетилхолін 10 мМ ЕГТА Дослід/ Контр. Контроль 5 мМ ЕГТА Ацетилхолін 5 мМ ЕГТА Дослід/ Контр.

0.ОбшМ 89.25±2.74 99.54+0.50* 12 % 95.71 (87.5-106.7) 100.32 ** (99.7-101. 1) 5 %

0. ІщМ 92!24 (85.4-100.9) 103.63 •• (101.4-105.5) 12 У. 105.23±3. 75 114.8910.6* 9 -А

0. ЗтИ 99.23 (94.3-105.7) 113.50 •* (107.2-127.4) 14 % 108.58±3. 80 126. 7015. 2* 17 %

0.5шМ • 99.37 (96.7-102. 1) 109.85 ** (104.5-120.6) 11 % 107.95 (100.4-112.0) 122.20 ** (11?.9-130.8) 13'7?

1. ОшМ 85.29 (61.4-101.2) 115.17 ** (109.2-127.8) 35 % 107.13 (97.8-116.1) 120.70 “ (114.5-131.4) 13 %

5. ОшМ , 93.11 (89. 3-97.8) 112.60 ** (104.6-124.6) 21 % 100.27+3.75 121.2714.9* 21 55

* різниця в порівнянні з контролем статистично достовірна за Стьюдентом (р<0.05)

** достовірно за парним критерієм Вілконсона (р<0.05).

На рис. 2 представлена залежність ефекту введеного в організм тваринам АХ на дихання MX печінки від концентрації субстрату окиснення - КГ в кальцієвому (10~9-1СҐ8М) та безкальцієвому (ЮмМ ЕГТА) середовищах.. У всіх випадках швидкість дихання досягає максимального значення при досить низьких концентраціях КГ, що очевидно відповідають фізіологічним концентраціям субстрату в MX. Видно, що в кальцієвому середовищі показники дихання MX контрольних тварин (Б) майже ідентичні до показників дихання MX дослідних гварин в безкальцієвому середовищі (В). Із рисунка видно також, що як кальцій так і АХ зсувають криву залежності швидкості дихання від концентрації КГ в сторону нижчих концентрацій субстрату.

иг-ат.О хв.нг б їжа

Рис.2 Залежність ефекту введеного в організм АХ на дихання і экисне фосфорилювання від різної концентрації КГ в кальцієвому та безкальцієвому середовищах інкубації ИХ печінки щурів.

Доза АХ - 50 мкг на 100 г маси, прозерину - 5 мкг на 100 г <іаси. Час дії 15 хв. А - контроль, безкальцієве середовище інку-5ації МХ; Б - контроль, кальцієве середовище інкубації МХ; В -цослід, безкальцієве середовище інкубації МХ; Г - дослід, кальцієве середовище інкубації МХ.

Відомо, що йони кальцію знижують Km мітохокдріальних дегідрогеназ до субстрату (Denton et al., 1980; Ezawa, Ogata, 1979). Враховуючи, що дія АХ пов’язана з підвищенням цитоплазматичної концентрації йонів кальцію (Kidokoro, 1980; Rasmussen, Barrett, 1984), можна припустити, що вплив АХ на окиснення КГ в МХ опосередковується через йони кальцію, які підвищують спорідненість КГД до субстрату.

Вплив ацетилхоліну та блокаторів кальцієвих струмів мембрани тепатоцитів на транспорт йонів Са2'1’, дихання 1 окисне фосфорилювання у МХ, виділених з ізольованої перфузованої печінки щура ' Відомо, що АХ, введений внутрішньочеревно, сприяє активації окиснення одного з субстратів циклу Кребса - КГ (Шостаковская и др., 1986). Щоб доказати специфічність дії АХ важливо було в екс-периментральних умовах виключити вплив різноманітних чинників, які могли 0 призводити до реалізації впливу введеного АХ через вищі рівні регуляції організму, а саме провести дослідження на ізольованому органі. В процесі пошуку оптимальної концентрації для виявлення активації окислення КГ та можливого гальмування окиснення БК в ізольованій перфузованій печінці щура ми використовували наступні концентрації АХ - 1х10-7М, 5хіо-8М, 1хіо_8М. Для вияснення ролі йонів кальцію в механізмі дії АХ використовувалися блокатори кальцієвих струмів - верапаміл та ніфедипін.

На рис. З представлені діаграми дихання МХ в різних метаболічних станах за Чансом при стимуляції дихання АДФ і Са2+ за умов окиснення в МХ КГ (А) та БК (Б). Із рисунку видно, що АХ (1хіо_8М) активує АД<&- та Са2+-стимульоване дихання (пунктирна лінія) у порівнянні з контролем (тонка лінія) як при окисненні КГ так і БК. Так, наприклад, АДФ-стимульоване дихання зростає на 33% та 35%, відповідно, за умов окиснення КГ і БК, має місце досто-

вірне підвищення як інтенсивності (АДФ/ДЬ) так 1 ефективності (АДФ/ДО) окисного фосфорилювання.

кг-ат.О

Рис.З Вплив введеного в перфузат АХ та блокаторів кальцієвих струмів верапамілу з ніфедипіном на АДФ- та Са2+-стимульоване дихання МХ, виділених з ізольованої перфузованої печінки щура.

АХ - дія 1хЮ_8М, верапаміл - 5.5х10"5М, ніфедипін - 357 мкг/л. Суцільна лінія - контроль, пунктирна - АХ; штрихована - АХ + верапаміл + ніфедипін. Субстрати окиснення: А - КГ (ІмМ), Б -

БК (0.35мМ). Добавки АДФ та СаСІг по 200 мкМ.

* Різниця в порівнянні з контролем статистично достовірна за Стькдентом (р<0.05).

Стимуляція дихання кальцієм пропорційна швидкості транспорту цього йону в МХ (КопсІгазЬоуа еі аі., 1982), а ефект дії АХ на енергетичні процеси в МХ більш виражений при активації дихання йонами Са2+ ніж АДФ (Шостаковская и др.,.1986). Отримані нами дані на перфузованій печінці корелюють з цими ефектами, виявленими на цілісному організмі. Так, швидкість Са2+-активованого дихання при окисненні КГ і БК в цих умовах зростає на 77% і 51%, а інтенсивність транспорту йону в МХ, відповідно, на 64% і 76%.

Блокада кальцієвих каналів верапамілом та ніфедипіном (штри-

хована лінія) повністю знімає ефект АХ на АДФ-стимульоване та частково Са2+-стимульоване дихання МХ печінки щура під час окис-нення КГ та БК.

Виявлений факт . зняття ефектів АХ блокаторами кальцієвих каналів вказує на участь йонів кальцію в регуляції енергетичних процесів в МХ печінки щура, а механізм цієї дії, можливо, аналогічний із дією багатьох гормонів і медіаторів і полягає в активації рецепторів мембрани гепатоцита, збільшенні цитоплазматичної концентрації кальцію, наступним підвищенням мітохондріальної концентрації катіону і (для АХ) зростанням спорідненості КГД до свого субстрату - КГ.

Зміна АДФ-стимульованого дихання мітохондрій печінки щурів в умовах адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії

Продовженням досліджень по виявленню ролі йонів кальцію в механізмах дії АХ були експерименти, проведені за умов адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії. Відомо, що можливо створити модель природнього підвищення холінергічного статусу організму, де вміст АХ в тканинах печінки, серця і підшлункової залози змінюється в залежності від тривалості адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії (Доліба, 1993).

Нами виявлено, що в перший день адаптації щурів до гіпоксії спостерігається активація окиснення БК (23% в порівнянні з контролем), що проявляється у підвищенні АДФ-стимульованого диханш МХ печінки щурів (рис. 4). Змін в окисненні КГ та інших субстратів циклу Кребса в цих умовах не відмічалося.

На 12-й день адаптації спостерігався наступний ефект активації окиснення цих двох субстратів, а саме - значне підвищенн:

' АДФ-стимульованого дихання МХ.при окисненні КГ (40%) та недосто

и—ат.О і.мг білка

Рис.4 Вплив одноденної адаптації щурів до гіпобаричної гі-іоксії на окиснення БК і КГ в МХ печінки щура. '

Суцільна лінія - контроль, пунктирна - одноденна гіпоксія. Іубстрати окиснення: А - БК (0.35мМ), Б - КГ (ІмМ). Добавки АДФ -ю 200мкМ.

Представлений приклад типового досліду.

ірне під час окиснення БК. Підвищення АДФ-стимульованого дихання ри окисненні КГ на 7, 12 і 16-й день адаптації становить, відпо-ідно, 16, 40 і 46% в порівнянні з контролем. В МХ печінки адап-ованих до гіпоксії щурів значно зменшений час фосфорилювання до-аної АДФ за умов окиснення КГ. Так, наприклад, показник АДФ/ДЬ а 12-й день адаптації збільшується на 78% в порівнянні з контро-ем. Спостерігається також значне підвищення коефіцієнта спряжен-я дихання і окисного фосфорилюваня, на що вказують підвищення фективності фосфорилювання АДФ/ДО (22%, 12-й день) та зростання

ихального контролю (Уз/У4) на 7, 12 і 16-й дні адаптації.

Очевидно, що підвищення холінергічного статусу в умовах гі-оксії корелює з активацією окиснення КГ, що проявляється при ак-

тивації холінергічного статусу введенням тварині АХ і прозерину звичайних умовах, як показано раніше (Долиба, 1986; Шостаковск; и др., 1986).

Зміна Са2+-стимульованого дихання мітохондрій печінки щурів в умовах адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії Стимуляція дихання йонами кальцію при додаванні СаСІг в п< дярографічну комірку пропорційна швидкості транспорту цього кат; ону через мітохондріальну мембрану (КопсІгаБЬоуа еі аі., 19821

Очевидно, що зміни в характеристиках транспорту цього йону буду: відображати картину змін енергетичного обміну в МХ печінки, і мають місце під час адаптації тварин до гіпоксійних умов середі вища.

На рис. 5 представлені дані по впливу 12-ти денної гіпобарет ної гіпоксії на Са2+-активоване дихання МХ печінки щурів. Як ви; но -з рисунка, в перший день адаптації до гіпобаричної гіпокс: при окисненні БК спостерігається тенденція до зниження Са2+-сті мульованого дихання (на 10%) та інтенсивності входу катіону в (

- Са/ДІ (на 24%), одначе підвищення Са2+-стимульованого дихані (на 26%), Са/ДЬ (на 40%) та ефективності використання кисню Са/ДО (на 26%) за умов окиснення КГ в порівнянні з контролем. І 7-12 дні адаптації картина змінюється, а саме - спостерігаєш зріст Са2+-стимульованого дихання (10% на 12-й день) і Са/ДО і умов окиснення БК та тенденції до зниження Са2+-активованого ді хання і Са/ДЬ за умов окиснення КГ. . •

Нами виявлені цікаві закономірності, які спостерігаються п: час окиснення субстратів ЦТК - БК і КГ протягом адаптації тварі до гіпоксії в МХ печінки щурів. Так, відмічено реципрокність окисненні КГ і БК за умов стимуляції дихання АДФ і СаСІ2, що пр< являється, відповідно, у зростанні на 40% АДФ-стимульованого ді

іння МХ при окисненні КГ та на 10% Са2+-активованого дихання при іисненні БК на 12-й день адаптації в порівнянні з контролем, ід відмітити і зміну реципрокності АДФ-стимульованого та Са2+-тивованого дихання в МХ печінки щурів, протягом адаптації тварин гіпоксії під час окиснення БК. Так, у 1-й день адаптації відчається зростання АДФ-стимульованого (24%), але гальмування 2+-активованого дихання (10%), а на 12-й день - стимуляція 2+-активованого дихання (10%) і недостовірне зростання АДФ-сти-льованого дихання під час окиснення цього субстрату в порівнян-з контролем. •

Описані факти свідчать про те, що, очевидно, викликані адап-цією до умов гіпобаричної гіпоксії зміни в клітинному перероз-цілі йонів Са2+ можуть по-різному впливати на окиснення різних 5стратів в ЦТК.

г-ат.О .кг біжа

<00-1 • _

20-

Са*

Са‘

1

1 1 А

► -І

ЄОс

Са*

г-

I

І

--І

1-й яеяь

Рис.5 Вплив 12-ти денної гіпоксії на Са2+-активоване дихання К печінки щурів.

Суцільна лінія - контроль, пунктирна - адаптація до гіпок-!ІЇ. Субстрати окиснення: А - КГ (ІмМ), Б - БК (0.35мМ), Добавки

'аСІг - по 200мкМ.

* Достовірно за парним критерієм Вілконсона (р<0.05).

- 16 -

Роль реакцій переамінування в механізмах адаптації тварин до гіпоксійних умов середовища Активація вибіркового окиснення одного з субстратів цикл) Кребса - КГ після введення дослідним тваринам АХ неможлива, згідно класичних уявлень про функціонування циклу як послідовної утилізації трикарбонових кислот. Одержані факти заставляють шукаті пояснень для виявленого феномену. Враховуючи дані про роль процесів переамінування в окисленні субстратів в МХ (Кондрашова, 1989 1991) та дані М.М. Доліби про вплив АХ на окиснення субстраті] переамінування в МХ (Коробов и др., 1993; Доліба та ін., 1994) мі допустили, що активація окиснення КГ в умовах адаптації до гіпо-баричної гіпоксії також пов'язана з активацією згаданих реакцій.

Для перевірки цього припущення ми використовували субстрати які вступають в процес переамінування з утворенням КГ - глутама і малат та піруват і глутамат. Для виявлення специфічності реакцій використовували інгібітор амінотрансфераз - амінооксиацета1 (Кондрашова, 1989; 1991). Амінооксиацетат повністю знімає ефек

активації АДФ-стимульованого дихання МХ печінки щурів за умо: окислення глутамату і малату та майже повністю - пірувату і глу тамату, що може бути підтвердженням ролі даних процесів в додат ковому утворенні КГ в гіпоксійних умовах.

Зміна кальцієвої ємності МХ печінки щурів в умовах адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії .

Про роль йонів кальцію в умовах природнього- підвищення холі нергічного статусу тварин свідчить зміна кальцієвої ємності М печінки щурів - можливого нагромадження максимальної кількост йонів Са2+ без видимих функційних змін цих органел в умовах адап тації до гіпобаричної гіпоксії. Відомо, що АХ, впливаючи на акти вацію окиснення КГ впливає і на підвищення кальцієвої ємності М

течінки щурів (Долиба, 1986). Ми дослідили зміни цього інформативного показника в умовах адаптації тварин до умов гіпобаричної ’ІПОКСІЇ.

На рис. б представлені результати вимірювання кальцієвої єм-гасті МХ під час 1, 7 і 12-го днів адаптації тварин до гіпоксії

за умов окиснення КГ і БК. Як видно з рисунка, у перший день адаптації до гіпоксії спостерігаються незначні зміни в кальцієвій змності МХ, виміряній під час окиснення БК та зменшення при вико-зистанні субстрату окиснення КГ (90Х від контрольної величини). Ситуація змінюється на 7-й день адаптації, коли кальцієва ємність іри окисненні КГ зростає, а при окисненні БК різко зменшується (“ 40% в порівнянні з контролем). На 12-й день адаптації під час

Дослід/контроль, І

1801 БО- 1

140120- -1 °°- т—» ] Т

80- .

6040- —т

20' А Б А Б А Б

0-|—І— 1 *——1----1 І 1 ■ ------------------------>

1-й день 7-й день 12-й день

Рис. 6 Зміна кальцієвої ємності МХ печінки щурів в процесі адаптації до гіпобаричної гіпоксії.

Субстрати окиснення: А - КГ (ІмМ), Б - БК (0.35мМ).

окиснення БК кальцієва ємність MX зростає незначно, а при окис ненні КГ збільшується приблизно в 1.5 раза в порівнянні з коні рольною величиною. '

Ці дані корелюють з даними про збільшення кальцієвої ємност МХ після введення тваринам АХ (Долиба, 1986), свідчать про акти вацію окиснення субстратів циклу Кребса в гіпоксійних умовах непрямо вказують на залежність вищеописаних процесів від концент рації йонів кальцію в МХ.

Вплив адаптації до гіпоксії на субстратне фосфорилювання МХ печінки щурів Для реєстрації процесу фосфорилювання на рівні субстрату м використали метод полярографічної реєстрації субстратного фосфо рилювання за автоінгібуванням неспряженого з фосфорилюванням ди хання МХ при окисленні КГ (Olson, Allgyer, 1972). Доказана рол: підвищення субстратного фосфорилювання в МХ тварин, яким попе редньо вводився АХ (Доліба, 1986; Шостаковская и др., 1986). Цікаво було перевірити даний факт і при моделюванні природнього хо-лінергічного статусу організму в умовах адаптації до гіпобарично' гіпоксії.

Нами було відзначено в умовах гіпоксії інтенсифікацію окиснення КГ, що призводить до посилення субстратного фосфорилюванш і синтезу ГТФ, необхідного для синтетичних анаболічних процесіє На рис. 7 зображені криві, що відображають зміну в процесі субстратного фосфорилювання протягом адаптації тварин до гіпобарично' гіпоксії. Як видно з рисунка, на перший день не спостерігаєтьсі очевидної зміни між контролем (1) і дослідом (2), одначе на 7-і день в дослідних тварин відмічається зріс автоінгібування окиснення ЬТ, який па 12-й день призводить до вираженого його збільшення в порівнянні з контролем. Ми вважаємо, що отримані резуль-

■ати корелюють із підвищенням холінергічкого статусу організму на ’-16 день адаптації до гіпоксійних умов, посиленням окиснення КГ і цих умовах та супроводжуючим це окиснення зростання синтезу ТФ. '

ЫХ

кх

(

т

100 яг-аг. 0 1

1-Я день

12-й день

Рис.7 Вплив процесу адаптації щурів до гіпоксії на субстрате фосфорилмвання в МХ печінки.

1 - контроль; 2 - дослід.

ВИСНОВКИ

1. Попередньо введений щурам ацетилхолін (50 мкг/ІООг маси) алізує свій активуючий вплив на окиснення ot-кетоглутарату в мі-хондріях печінки опосередковано через йони кальцію.

2. Реалізація ефектів ацетилхоліну на енергетичні процеси в гохондріях залежна від зовнішньоклітинної концентрації йонів іьцію в умовах in vitro, а саме: а) швидкість АДФ-стимульовано-дихання мітохондрій тварин, що їм попередньо вводився ацетил-іін, досягає максимального рівня при концентраціях кальцію ниж-

чих, ніж в контрольних тварин; б) як йони кальцію, так і попе редньо введений ацетилхолін, зсувають криву залежності швидкост дихання від концентрації сс-кетоглутарату в сторону нижчих кон центрацій субстрату.

3. На ізольованій перфузованій печінці щурів показано, щ блокатори кальцієвих струмів верапаміл (5.5хі0“5м) та ніфедипі (357 мкг/л) знімають ефект дії ацетилхоліну в концентраці 1х10-8М на енергетичні процеси в мітохондріях гепатоцитів, а сам відсутня ацетилхолін-залежна стимуляція окиснення сс-кетоглутарат та знижені показники інтенсивності та ефективності дихання т окисного фосфорилювання мітохондрій.

4. Одноразовий вплив гіпобаричної гіпоксії призводить . і зниження Са2+-активованого дихання і інтенсивності входу катіот в мітохондрії та підведення АДФ-стимульованого дихання за уме окиснення бурштинової кислоти в порівнянні з контролем.

5. Щоденна адаптація тварин протягом 12 днів призводить і

підвищення на 12-й день Са2+-активованого дихання мітохондрій пс чінки щурів за умов окиснення бурштинової кислоти в порівнянні контролем. • •

6. Виявлено реципрокність в окисненні КГ і БК за стимуляц

дихання АДФ і СаСІг в процесі адаптації тварин до гіпобаричні гіпоксії, а саме: а) підвищення АДФ-стимульованого та знижен

о .

Са - активованого дихання за умов окиснення бурштинової кисло у перший день адаптації; б) підвищення АДФ-стимульованого дихан за умов окиснення а-кетоглутарату та Са2+-активованого дихання умоЕ окиснення бурштинової кислоти на 12-й день адаптації.

7. На взаємозв’язок йонів кальцію з адаптаційними реакціям в яких бере участь ацетилхолін, вказує зміна кальцієвої ємнос мітохондрій печінки - зменшення під час окиснення бурштиної

слоти і збільшення під час окиснення а-кетоглутарату на 7-й нь адаптації до гіпобаричної гіпоксії в порівнянні з контролем.

8. Протягом адаптації тварин до гіпобаричної гіпоксії завдя-активації окиснення «-кетоглутарату в мітохондріях печінки щу-в підвищується синтез ГТФ. .

Список публікацій за темою дисертації:

1. Ватаманюк М.З. Ионы кальция в механизме действия ацети-лина на дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондри-

// Транспорт кислорода и механизмы антиоксидантной защиты: Ма-риалы международ. конф. -Гродно, 1993. -С.15-16.

2. Доліба М.М. Кургалюк Н.М., Горинь О.В., Абдула Лакаль, зика Ф.В., Ватаманюк М.З. Роль йонів кальцію в механізмі дії лінотропних речовин на енергетичний обмін в мітохондріях // На-зво-методичні аспекти фізіології: З'їзд західно-регіонального цділення Українського фізіологічного товариства. -Львів, 1993. .1. -С.27-28.

3. Доліба М.М., Ватаманюк М.З., Дбаг Мрван, ШостакоЕська

3., Кондрашова М.М. Механізм реципрокної дії ацетилхоліну на иснення ос-кетоглутарату і сукцинату в мітохондріях серця і пе-яки. Фактори, що впливають на виявлення ефекту ацетилхоліну // р. биох. журн. -1994. -66, N1. -С.41-49.

4. Доліба М.М., Лакаль Абдула, Ватаманюк М.З., Романик О.В., эгалюк Н.М. Підвищення спряженості дихання та окисного фосфори-вання мітохондрій за дії ацетилхоліну // Матеріали 1-го з’їзду

з. біофізичн. т-ва, 20-24 черв. 1994р. -Київ, 1994. -С.88-89.

5. Доліба М.М., Гордій С.К., Ватаманюк М.З., Горинь О.В.

5клітинні механізми реалізації впливу холіноміметиків на енер-гичні процеси в міокарді та травних залозах // XIV з’їзд Укр.

фізіол. т-ва, м. Київ, 1-4 листоп. 1994р.: Тез. доп. -Київ, 1994 -С. .

6. Горинь 0.В., Доліба М.М., Ватаманюк М.З. Порівняння ді ацетилхоліну на енергетичний обмін в ізольованій перфузовані печінці щура і в умовах in vivo // Експериментальна та клінічн фізіологія. 36. наук, праць. -Львів. -1995. -С.203-204.

7. Доліба М.М., Бабський А.М., Артим В.В., Кука О.Б., Вата манкж М.З. Можлива реципрокність АДФ-стимульоване-Са2+-активован дихання при окисненні бурштинової кислоти в мітохондріях печінк щурів за умов адаптації до гіпобаричної гіпоксії // Експеримен тальна та клінічна фізіологія. 36. наук, праць. -Львів. -1995 -С.145-146.

8. I.Shostakovs'ka, M.Doliba, A.Babsky, M.Vatamaniuk, O.Kuk V.Artym. Possible receprocity: ADP-stimulated-Ca2+-activated res piration during succinate oxidation in rats mitochondria ii hypoxic hypoxia conditions // Eur. J. of Phys. -Pflugers Arch -Suppl. to V.430, N4. -1995. -P.173.

Ватаманюк М.З. Роль ионов кальция в механизмах действия аде-тилхолина на энергетический обмен в митохондриях печени крыс Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологически, наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и животных Показано, что введение животным ацетилхолина (50мкг/100г веса ведет к активации дыхания и окислительного фосфорилирования в ми тохондриях печени крысы при окислении ot-кетоглутарата, а этот эф фект зависит от концентрации ионов кальция в среде инкубации ми тохондрий. Исследование зависимости эффекта ацетилхолина на дыха ние митохондрий от концентрации а-кетоглутарата в кальциевой безкальциевой среде инкубации показало, что полумаксимальный эф

5кт ацетилхолина в кальциевой среде наблюдается при меньшей кон-;нтрации субстрата, чем в безкальциевой, что указывает на повы-;ние сродства а-кетоглутарат дегидрогеназы к а-кетоглутарату в ’их условиях. Выявлено, что ацетилхолин (lxlO'^U) повышает ско-гсть АДФ- и Са2+-стимулированного дыхания митохондрий изолиро-шной перфузированной печени крысы, а совместное действие вера-[Мила и нифедипина снимает этот эффект. На • начальной стадии ;аптации животных к гипоксии при окислении янтарной кислоты отчается тенденция к снижению Са2+-стимулированного дыхания и ин-нсивности его входа в митохондрии, но тенденция к возрастанию 2+-стимулированного дыхания и эффективности использования кис-рода при окислении «-кетоглутарата в сравнении с контролем. На 12 день, адаптации (активация холинергического статуса организ-) отмечалось возрастание Са2+-стимулированного дыхания при ислении янтарной кислоты и тенденция к снижению Са2+-активиро-нного дыхания при окислении а-кетоглутарата. Предполагается зможность реципрокности АДФ-стимулированное-Са2+-активированное хание при окислении кетоглутаровой и янтарной кислоты в услови-адаптации животных к гипобарической гипоксии.

Vatamaniuk M.Z. Role of Са2+ ions in the mechanisms of ace-Lcholine action on the energetic exchange in rat liver mito-:>ndria. Thesis for Ph. D. degree in biological sciences by ?ciality: 03.00.13 - Man and Animals Physiology. Ivan Franko

ite University, Lviv, Ukraine, 1996.

It was shown that acetylcholine injection (50ug/100g weight) ids to stimulation of respiration and oxidative phosphorylation rat liver mitochondria under oc-ketoglutarate oxidation. The >t effect dependent on concentration of Ca2+ ions in the

- 24 - •

mitochondria's incubation solution. ADP-stimulated respirati rate of mitochondria of experimental animals reached maxirr level in solution with lower calcium concentrations, than mitochondria of control animals, investigations of acetylcholi dependence on the mitochondrial respiration on «-ketoglutars concentration in both of calcium and without one's solutions mitochondria incubation had shown, that half-maximal acetylchc ne effect in calcium solution observed under condition-with lo* concentration of a-ketoglutarate that indicated on the іпсгег of consistency of a-ketoglutarate dehydrogenise to cc-ketoglutar te. It was displayed that acetylcholine (lxio_8M) increased At stimulated respiration rate of mitochondria of isolated perfus rat liver and verapamil and nifedypin combined influence cancel this effect. In the initial days of adaptation tendency towai decrease of Ca2+-activated respiration and intensity of ior transport into mitochondria under succinate oxidation ; tendency towards increase of Ca2+-activated respiration un< a-ketoglutarate oxidation were observed. But on the 7th- 12th d; of adaptation (activation of cholinergic status of the organi; increase of Ca2+-activated respiration under succinate oxidat and tendency towards decrease of Ca2+-activated respiration uri oxidation of a-ketoglutarate were observed. We suggest, t decrease in Ca2+-activated oxidation connected with increasing ADP-stimulated oxidation under ketoglutarate and succin oxidation under hypoxia conditions.

Головні слова: а-кетоглутарат, ацетилхолін, йони кальи

мітохондрії печінки, окисне фосфорилювання, гіпобарична гіпокс