Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке

Павлов, Николай Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке"

Павлов Николай Александрович

РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ИЗМЕНЕНИИ РЕАКТИВНОСТИ И МИКРОРЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ИНТЕНСИВНОЙ МЫШЕЧНОЙ НАГРУЗКЕ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

г о июн 2013

005062047

Белгород - 2013

005062047

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Семенютин Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

Кулаченко Владимир Петрович,

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина», кафедра морфологии и физиологии;

Крапивина Елена Владимировна,

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», заведующая кафедрой эпизоотологии, микробиологии, паразитологии и ветсанэкспертизы.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита состоится «27» июня 2013 года, в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.004.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»

Адрес института: 308503, п. Майский, Белгородского района, Белгородской области, ул. Вавилова, 1, тел./факс (4722) 39-22-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В. Я. Горина»

Автореферат разослан «Л^» Л ¿¿"¿-^ 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета

Литвинов Юрий Николаевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важнейших макроэлементов, имеющихся во всех живых организмах, является кальций (Са2+). Кроме того, что Са2+ является строительным материалом для костей и зубов, он обладает высокой биологической активностью: влияет на проницаемость клеточных мембран, дифференцировку клеток, обеспечивает мышечные сокращения, в том числе сердечную деятельность, участвует в передаче сигналов в синапсах, свёртывании крови, деятельности желёз внутренней секреции и др. (G. N. Zimmerman, N. Fleischer, 1970; N. J. Rebecchi et al., 1982; S. A. Ronning, 1982; R. Wang, 1990; И. A. Држевецкая, T. H. Джандарова, 1992; E. A. Александрова, 2001; N. С. Foster et al, 2001; H. Wais, 2001).

Широко представленными к настоящему времени являются работы об участии ионизированного кальция в реакциях мышечного сокращения. Так, мышечная подвижность зависит транспорта ионов кальция (Е.А.Александрова, 2001; Д. Бендол, 1970; О. В. Есырев, 1983; В. Д. Романенко, 1975; М. Д. Курский, 1986; В.Л.Козловский, 1995; П. Б. Цывьян, 1987; F. Н. Braunewell, 2001; A. Fabiato, 1983, 1985; N.J. Rebecchi et al., 1982). Установлено, что функции всех разновидностей мышц контролируются при помощи ионов кальция, выступающих в качестве вторичного мессенджера (S. Ringer, 1882). Ионы кальция принимают участие в энергетическом контроле мышечной деятельности путём регуляции запасов АТФ (С. A. Täte, M. F. Hyek, G. E. Taflet, 1991). Основными причинами повреждения мышечной ткани при избыточной нагрузке являются прогрессирующая утрата способности мышц предотвращать изменения в уровне Са2+ (J. G. Cannon et al., 1991), сжатии митохондрий, вакуолизации саркоплазматического ретикулума (R. В. Armstrong et al., 1983; J. Friden et al., 1989), изменениях Z-линий саркомера, а также активности респираторного взрыва нейтрофилов (А. N. Beicastro et al., 1988; P. M. Clarkson, 1988; J. Peake et al., 2004, 2005).

В последние годы стало известно о широком спектре влияний ионов кальция на гемоциты. Установлено, что Са2+ снижает активность 5-липоксигеназы лимфоцитов, приводя к угнетению синтеза лейкотриенов (С. A. Rouzer et al., 1987), влияет на процесс фагоцитоза и миграцию нейтрофилов (T. Bengtsson et al., 1993; F. R. Maxfïeld, J. T. Mandeville, 1997), оказывает существенное влияние на структуру i: стабильность клеточных

мембран, кластеризацию кислых фосфолипидов (J.A.Scott, 1984;

G. Tettamanti, М. Masserini, 1987).

Ионизированный кальций также играет важную роль в стабилизации плазмалеммы и участвует в регуляции клеточного объёма (Н. J. Schatzman, 1966; 1969; P. Caroni, Е. Carafoli, 1981; П.Г.Косткж, 1984; Д.О.Левицкий,

1990; Н. Birgi, 1998).

Мышечные нагрузки высокой интенсивности приводят к изменению количества циркулирующих лейкоцитов в крови. В литературных источниках данные о влиянии интенсивной мышечной нагрузки на уровень лейкоцитов носят противоречивый характер (R. Harris et al., 1992; D. M. Nance et al., 2007; D. A. Henson et al., 1998). Известно, что первые минуты выполнения физических упражнений сопровождаются гиперкальциемией, оказывающей влияние на структуру мембран, а также на рецепгорный аппарат клеток

(Н. Н. Лиманский, 1978).

Проблема согласованности физиологических процессов при избыточном поступлении кальция в организм в сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой на сегодняшний день изучена недостаточно, в связи с чем и было предпринято данное исследование.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в изучении влияния ионов кальция на микрореологические и функциональные свойства лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие

задачи:

1. Изучить влияние повышенного содержания ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лейкоцитов в условиях

интенсивной мышечной нагрузки.

2. Исследовать влияние ионов кальция на функциональные и микрореологические свойства лейкоцитов: адгезию, миграцию, фагоцитоз, мембранный резерв и осморегуляторные реакции.

3. Оценить влияние ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лимфоцитов в опытах in vivo и in vitro в

сравнительном аспекте.

ионов кальция. Проведён сравнительный анализ морфометрических свойств лимфоцитов в условиях повышенной концентрации ионов кальция в опытах in vivo и in vitro. Впервые установлено, что повышенная концентрация кальция в опытах in vitro приводит к увеличению объёма клеток при уменьшении их распластанности.

Поступление ионов кальция повышенной концентрации приводит к изменениям, характерным для неспецифической реакции активации. Ионы кальция в повышенной концентрации при поступлении в организм с водой оказывают компенсаторное влияние на неспецифическую реакцию переактивации, вызванную действием интенсивной мышечной нагрузки. Сочетанное воздействие интенсивной мышечной нагрузки и употребления воды с повышенной концентрацией ионов кальция приводит к резкому увеличение хемотаксической активности лейкоцитов и более эффективному протекание осморегуляторных реакций лимфоцитов.

Теоретическая и практическая значимость. Данные, полученные при изучении влияния мышечной нагрузки высокой интенсивности на функциональные свойства лейкоцитов крови, дополняют имеющиеся в литературе сведения о физиологической роли ионов кальция. Полученные результаты могут быть использованы при оценке гипер- и гипокальциемических состояний, имеющих место при выполнении физических нагрузок высокой степени интенсивности.

Результаты настоящей работы могут служить основой для проведения дальнейших исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов изменений, происходящих в цитоскелете, а также рецепторном аппарате лейкоцитов, что необходимо для установления причин ряда патологий, возникающих в результате мышечных нагрузок высокой степени интенсивности. Знание ключевых моментов в изменениях реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов упростит поиск лекарственных препаратов, корригирующих данные параметры.

Результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании курсов «Физиология человека», «Физиология адаптационных процессов» и «Экологическая физиология» на кафедре анатомии и физиологии живых организмов Белгородского национального исследовательского университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8-й Международной Пущинской школе - конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XII Международном симпозиуме (Москва, 2007), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007), V Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения В. Н. Черниговского (С.-Пб, 2007), Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни» (Москва, 2008), XVI Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка, 2009), Международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке» (Тула, 2010), XVII Международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Ионы кальция в повышенной концентрации оказывают компенсаторное влияние при развитии неспецифической реакции переактивации, вызванной влиянием интенсивной мышечной нагрузки, тогда как в покое - вызывают изменения, характерные для неспецифической реакции активации.

2. Повышенная концентрация ионов кальция в сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой приводит к повышению эффективности осморегуляторных реакций лимфоцитов. Снижение величины использования мембранного резерва лимфоцитами после интенсивной мышечной нагрузки происходит в результате уменьшения морфометрических показателей клеток.

3. Увеличение объёма лимфоцитов при воздействии повышенной концентрации ионов кальция в опытах in vitro происходит в условиях компактизации клеток при уменьшении их распластанности.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 1 монография и 6 научных работ, 3 из которых находятся в перечне изданий ВАК, рекомендуемых для публикации диссертационных исследований.

Структур« и объём работы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 268 источников (60 отечественных и 208 зарубежных публикаций).

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований служили лейкоциты крови крыс (самцы) линии Вистар массой 350-400 г, содержащихся на стандартном рационе. Для проведения экспериментов животных делили на группы (табл. 1).

Таблица 1 - Схема опытов

Эксперименты in vivo Эксперименты in vitro

1. Контрольная группа 1. Контрольная группа

2. Группа животных после интенсивной мышечной нагрузки (ИМН)

3. Группа животных после интенсивной мышечной нагрузки на фоне употребления воды с повышенным содержанием ионов кальция (ИМН Са2+) 2. Группа животных, лейкоциты которых инкубировали с раствором, имеющим повышенную концентрацию ионов кальция (П Са2+)

4. Группа животных, употреблявшая воду с повышенным содержанием ионов кальция (П Са2+)

Исследуемые факторы воздействия:

1. Интенсивная мышечная нагрузка до полного утомления: животные плавали с грузом (масса груза составляла 10 % от массы тела) в воде температурой 30 °С в течение 40 минут (В. Я. Русин, 1976, V. I. Могогоу е1 а1„ 2006).

2. Употребление «жёсткой» воды подразумевало получение животными в течение 6 месяцев воды, содержащей повышенное количество ионов кальция. Содержание кальция в воде, потребляемой животными, находилось в пределах допустимых норм для СанПин 2.1.4.559-96 «Вода питьевая» (Са2+ = 66,5 мг/л, М§2+ = 1,91 мг/л). Концентрацию Са2+ в сыворотке крови определяли колориметрическим методом на полуавтоматическом анализаторе ФП 90 П «Лабсистемс» (С. В. Надеждин, М. 3. Фёдорова, Л. Ф. Перистая, 2007).

3. Изучение действия двух факторов (ИМН и П Са2+). Концентрация Са2+ = 66,5 мг/л.

Для оценки развития стресс-реакции проводили изучение морфологических изменений в надпочечниках крыс (В. В. Виноградов, 1998). Оценка миграционной способности лейкоцитов крови Для изучения локомоционной активности лейкоцитов использовали тест-систему миграции клеток под агарозой (С. Д. Дуглас, П. Г. Куи, 1983) в модифицированном варианте (М. 3. Фёдорова, В. Н. Левин, 1997). Оценка адгезионной активности лейкоцитов крови Для изучения адгезионной способности белых клеток крови за основу был взят метод .1-Ь. \iege (Л а1. (1989). В стеклянный капилляр (Т> = 4 мм, 1 = 47 мм) помещали Юмкл суспензии лейкоцитов и разбавляли 50 мкл физиологического раствора. Капилляр инкубировали во влажной камере в течение 60 минут при температуре 37 °С. После инкубации клетки смывали физиологическим раствором ЫаС1 (0,9 %) при напряжении сдвига ~ 30 Н/м2. Напряжение сдвига рассчитывалось по формуле: т=Р-0/41, где т -напряжение сдвига, Н/м2; Р - давление, действующее на клетки при смыве, Н/м2; Б - диаметр капилляра, м; 1 - длина капилляра, м. Вычисляли процент адгезировавших клеток; определяли число адгезировавших клеток на единицу объёма суспензии. Из лейкоцитарной суспензии готовили мазки, которые фиксировали этанолом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Подсчитывали соотношение лимфоцитов и гранулоцитов с целью выявления степени адгезионных свойств этих клеток и определения гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса (ГЛИ).

Оценка фагоцитарной способности лейкоцитов крови Изучение поглотительной способности лейкоцитов проводилось по методике С.Д.Дугласа, П.Г.Куи (1983). В пробирку объёмом 2мл помещали дрожжевые клетки, добавляли суспензию лейкоцитов и инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37 °С. По истечении времени инкубации готовили мазки, фиксировали метанолом и окрашивали азур-эозином по Романовскому. При помощи светового микроскопа подсчитывали количество фагоцитировавших нейтрофилов — фагоцитарную активность и количество дрожжевых клеток, поглощённых в среднем одним нейтрофилом — фагоцитарный индекс.

Оценка мембранного резерва, осмотической стойкости и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови

Осмотическая резистентность и осморегулггорные реакции клеток направлены на восстановление объема в средах с низкой осмолярностью. Для их изучения использовали методику гипоосмотического набухания лейкоцитов (М. 3. Федорова, В. Н. Левин, 1997). В опытах in vitro измерения морфометрических параметров осуществляли в полуконтактном режиме сканирования на атомно-силовом микроскопе. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента (LibreOffice Cale 3.4.3 и Gnumeric 1.10.13).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Вклад ионов кальция и интенсивной мышечной нагрузки в развитие неспецифической адаптационной реакции организма

В результате исследования трёх названных факторов установлено, что интенсивная мышечная нагрузка вызывала в организме изменения, характерные для неспецифической адаптационной реакции переактивации. Подтверждением этого являлось достоверное увеличение доли коркового вещества надпочечников на 4,2 % (75,0 ± 0,4 % против 70,8 ± 0,7 % в контроле, р<0,01), увеличение количества лимфоцитов на 22 %, снижение количества нейтрофилов на 21,5 %. Алиментарное поступление в организм воды с повышенным содержанием ионов Са2+ вызывало изменения, близкие к неспецифической адаптационной реакции активации. Об этом свидетельствовало увеличение на 15 % количества лимфоцитов в периферической крови (82 ± 1,5 % против 67 ± 1,6 % в контроле, р<0,01) и снижение на 15 % количества нейтрофилов (15 ± 1,5 % против 30 ± 1,7 % в контроле, р<0,01). Кроме того, наблюдалась тенденция к увеличению на 7,7% общего количества лейкоцитов в периферической крови (18,2 ± 0,5 тыс./мкл против 16,9 ±1,7 тыс./мкл, р<0,01).

При сочетанном воздействии (ИМН + П Са2+) наблюдался вклад ионов кальция в неспецифическую реакцию переактивации, вызванную интенсивной физической нагрузкой. Так, у животных данной группы отмеченные нами изменения носили более сглаженный характер по сравнению с группой ИМН. Так, доля коркового вещества надпочечников в данной группе увеличивалась на 3,4 % (74,2 ± 0,5 % против 70,8 ± 0,7 % в контроле, р<0,01), количество лимфоцитов возрастало на 21 % (88 ± 1,6%

против 67 ± 1,6 % в контроле, р<0,01), количество нейтрофилов снижалось на 20% (10 ± 1,2% против 30 ± 1,7% в контроле, р<0,01). Кроме того, прослеживалась тенденция к увеличению общего количества лейкоцитов относительно интактной ФУппы (17,8 ± 1,2тыс./мкл против 16,9 ± 1,7 тыс./мкл в контроле).

3.2. Этапы фагоцитарного процесса

3.2.1. Миграция

После выполнения ИМИ происходило увеличение плошади стимулированной миграции лейкоцитов на 36,5 % (11,3 ± 0,3 мм2 против 8,1 ± 0,4 мм2 в контроле, Р<0,01). Увеличение показателя хемотаксического дифференциала под воздействием интенсивной физической нагрузки указывало на усиление хемотаксической активности белых клеток крови в данной опытной группе (31,1 ± 1,9 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле, р<0,01). Известно, что первые минуты выполнения мышечной нагрузки сопровождаются ростом уровня кальция вплоть до гиперкальциемического состояния, что, вероятно, оказывает влияние на структуру мембран, а также на рецепторный аппарат лейкоцитов (Н. Н. Лиманский, 1974, 1978; Г. Г. Цыбизов, 1979; J. F. Aloia et al„ 1985; S. Ljunghall et al„ 1984;

H. Ф. Мишина, 1981; H. Ф. Мишина, Э. В. Миронова, 1981; N. M. Vora et al„

1983).

У животных из группы П Са2+ отмечалось увеличение площади спонтанной миграции клеток на 41,3 % (8,9 ± 0,3 мм2 против 6,3 ± 0,3 мм2 в контроле, р<0,01). Стимулирование самопроизвольной миграции лейкоцитов, вероятнее всего, происходит за счёт способности кальция в ионизированной форме вызывать изменения в клеточном цитоскелете, о чём свидетельствуют литературные данные (А.И.Григорьев, И.М.Ларина, 1992; B.F.Trump,

I. К. Berezedky, 1982). Снижение величины показателя хемотаксического дифференциала на 23 % свидетельствовало об уменьшении хемотаксической активности лейкоцитов (6,7 ± 1,8 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле, р<0,01).

Сочетанное влияние повышенной концентрации ионов кальция на фоне интенсивной мышечной нагрузки приводило к снижению площади спонтанной миграции лейкоцитов на 17% (р<0,01) относительно животных группы П Са2+, и к увеличению площади стимулированной миграции на 28,4 % (р<0,01) относительно контрольной группы.

Показатель хемотаксического дифференциала в группе с сочетанием двух нагрузок был наибольшим среди всех экспериментальных групп - (41,6 ± 1,5 % против 29,7 ± 3,9 % в контроле). На наш взгляд, это свидетельствует о стимулированном влиянии ионов кальция на хемотаксическую активность лейкоцитов на фоне неспецифической адаптационной реакции, вызванной действием ИМН, так как хемотаксический дифференциал характеризует отношение площади стимулированной миграции к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции лейкоцитов.

3.2.2. Адгезия

У всех животных опытных групп наблюдалась тенденция к снижению количества адгезировавших лейкоцитов по сравнению с контролем. После интенсивной мышечной нагрузки наблюдалось уменьшение данного показателя на 30 % (18,1 ± 4,0 % против 48,8 ± 12,2 % в контроле), тогда как в группе, употреблявшей «жёсткую» воду, данный показатель снижался лишь на 14 % (34,4 ± 10,1 % против 48,8 ± 12,2 % в контроле). Уменьшение показателя гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса свидетельствовало об увеличении адгезионных свойств нейтрофилов. После выполнения интенсивной мышечной нагрузки регистрировалось снижение ГЛИ на 95 % (0,02 ± 0,01 отн.ед. против 0,41 ± 0,10 отн.ед. в контроле, р<0,01). Следует отметить,' что многими авторами так же отмечалось снижение выработки лимфоцитарных интегринов LFA- 1 и VLA-4 после физической нагрузки высокой интенсивности (J.Jordan, R. Beneke et al„ 1997; M. Gleeson, 2000; J. Peake, G. Wilson et al., 2004). Уменьшение содержания данных рецепторов адгезии обусловливает отсоединение лимфоцитов от поверхности, в результате чего не происходит формирование адгезионного контакта. Кроме того, зарубежными исследователями показано, что интенсивная мышечная нагрузка либо не оказывает влияния на нейтрофильный интегрин МАС-1 (J.Jordan, R. Beneke et al., 1997), либо способствует увеличению его выработки (J.M.Peake, G.Wilson et al., 2004; M.J.Wiedeman et al., 1996;

S. F. Van Eeden, J. Granton et al., 1999).

Употребление экспериментальными животными воды с П Ca+ не приводило к столь выраженному изменению адгезионных свойств лейкоцитов в отличие от таковых у животных группы ИМН (0,29 ± 0 20 отн.ед. против 0,41 ± 0,10 отн.ед. в контроле). Изменения, происходящие в'группе с сочетанием двух нагрузок, так же, как и в остальных опытных

группах, характеризовались уменьшением адгезионных свойств лимфоцкгов на фоне увеличения адгезионных свойств нейтрофилов. Однако по сравнению с группой, подвергавшейся интенсивной мышечной нагрузке, изменения были менее выраженными.

3.2.3. Фагоцитоз

При изучении поглотительной способности лейкоцитов нами были отмечены: достоверное увеличение их фагоцитарной активности после ИМИ (на 29%, р<0,01); тенденция к увеличению фагоцитарной активности в группе П Са2+ и её увеличение на 21 % в группе с сочетанным воздействием (р<0,01). Показатель фагоцитарного индекса во всех опытных группах оставался без значительных изменений.

3.3. Основные морфометрические параметры лейког/итов при воздействии внешних нагрузок

Интенсивная мышечная нагрузка приводила к достоверному снижению диаметра лимфоцитов на 12 % (6,70 ± 0,04 мкм против 5,90 ± 0,07 мкм в контроле, р<0,01), тогда как увеличение диаметра нейтрофилов отмечено на уровне тенденции. В группе П Са2+ диаметр нейтрофилов, инкубированных в изотоническом растворе ЫаС1, был на 6,9 % меньше, чем в группе животных с двухфакторным воздействием. Употребление «жёсткой» воды не оказывало влияния на размеры лимфоцитов (КаС1 0,9 %). В то же время сочетанное воздействие двух нагрузок вызывало уменьшение диаметра лимфоцитов на 7,5 % по сравнению с группой П Са2+. Возможно, повышенное содержание ионов кальция в воде оказывает компенсаторное влияние на лимфоциты.

3.3.1. Оценка мембранного резерва

Лейкоциты млекопитающих обладают значительным резервом площади цитоплазматической мембраны, формирующей её складчатость. Мембранный резерв выявляется при набухании клеток в сильногипотонической среде (0,2 %). Известно, что наибольший резерв цитоплазматической мембраны характерен для лимфоцитов. В проведённом нами исследовании их мембранный резерв в интактной группе составил 36,4 %, а таковой нейтрофилов — 31 % от общей площади плазмалеммы. Для проведения сравнительного анализа резерва цитоплазматической мембраны был определён относительный мембранный резерв (отношение абсолютной величины мембранного резерва к исходному объёму клетки). Результаты представлены на рисунке 1.

39,3

34,1

Са Мышлир. Мышлагр. + С»

Группы животных

ПНыЬроф*™ □ Люнфвдасты

Рис. 1 - Относительный мембранный резерв лейкоцитов

Как видно из рисунка 1, после ИМН отмечалась наибольшая реализация резерва клеточной мембраны нейтрофилами в отличие от

лимфоцитарных клеток.

Употребление «жёсткой» воды также стимулировало использование мембранного резерва нейтрофилами, но не оказывало подобного воздействия на его реализацию лимфоцитами крови по сравнению с контролем. В группе ИМН + П Саг+мембранный резерв лимфоцитов использовался полнее по сравнению с группой ИМН. Воздействие ионов Са2' компенсировалось влиянием мышечной нагрузки, которая способствовала включению механизмов регуляции кальциевого гомеостаза в организме. После интенсивной мышечной нагрузки мембранный резерв полнее использовался нейтрофилами, тогда как у лимфоцитов отмечалось его более «экономное» использование. Незначительное использование мембранного резерва лимфоцитами в результате интенсивной мышечной нагрузки, вероятно, можно объяснить пониженной выработкой молекул АТФ. Кроме того, мышечная нагрузка до полного утомления приводила к уменьшению размера лимфоцитов в изотонической среде (диаметр был меньше, чем в контрольной группе), что также ограничивало их возможность реализации резерва плазмалеммы. Таким образом, по результатам наших исследований

нейтрофилы показали большую активность в отношении использования мембранного резерва, нежели лимфоциты, причём вне зависимости от условий эксперимента.

3.3.2. Осморегуляторные реакции лейкоцитов

Изучение осморегуляторных реакций, характеризующихся восстановлением размера клеток после длительной инкубации (1 час) в 0,45 % растворе ЫаС1, показало, что как после ИМН, так и двухфакторного воздействия лимфоциты способны, практически, полностью восстанавливать свой исходный объём (Рис. 2). В группе П Са2+ реакции осморегуляции как лимфоцитов, так и нейтрофилов были слабовыраженными по сравнению с контролем.

18-

Коктроль Са Мыш.кагр. Мыш.нагр. + С*

Группы животных

О Нейтрофилы П Лимфоциты

Рис. 2 - Относительное изменение объёма лейкоцитов по сравнению с изотоническим раствором ЫаС1 после часовой инкубации в умеренно-гипотоническом растворе

3.4. Влияние ионов кальция на функциональные и микрореологические свойства лимфоцитов

Объём лимфоцитов в опытной группе составлял 80,80±1,03 мкм3 (0,9% раствор ЫаС1) и 96,70±1,20 мкм3 (0,2% раствор ЫаС1), а в контрольной группе 54,90±0,90 мкм3 и 87,30±4,50 мкм3, соответственно. В опытной группе при

инкубации в 0,2% растворе №С1 объём увеличивается на 19,7%, тогда как в контрольной группе этот показатель составляет 59,0% (р<0,05) (Рис. 3).

Рис. 3 - АСМ изображение лейкоцитов, подверженных кальциевой нагрузке, при инкубации в 0,9% (А) и 0,2% (Б) растворе NaCl

Параметры высоты лимфоцитов опытной группы превышали значения, полученные в контрольной группе, на 36,4%. Значения коэффициента уплощённости лимфоцитов опытной группы свидетельствуют о снижении их распластанное™ в результате воздействия повышенной концентрации ионов кальция на 23% (0,9% раствор NaCl) и на 41% (0,2% раствор NaCl) (табл. 2).

Таблица 2 - Показатели высоты лейкоцитов крови (М±гп)

Группа Средняя высота клеток, мкм Коэффициент отн уплощённости, . ед.

Контроль NaCl (0,9%) NaCl (0,2%) NaCl (0,9%) NaCl (0,2%)

1,1 ±0,2 1,1 ±0,4 74,1 ±2,1 109,7 ± 3,7 b

Са2+ 1,5 ±0,1 а 1,5 ± 0,2 а 56,9 ± 1,1 а 64,8 ± 1,2 аЬ

ь _ достоверность различий по сравнению с изотоническим раствором (Р<0,05).

На основании полученных данных были рассчитаны значения абсолютного и относительного мембранного резервов, которые представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние кальция на мембранный резерв лейкоцитов

мембранный резерв, мкм2

Относительный мембранный резерв, %

Контроль

136,4

50,9

9,8

2,2

Как видно из таблицы 3, после инкубации клеток в растворе кальция доля используемого мембранного резерва снижалась на 48,7 % по сравнению с контролем. Интегральный анализ, полученных в данном эксперименте результатов, позволяет сделать вывод о том, что увеличение лейкоцитов в объёме при воздействии повышенной концентрации ионов Са2+ происходит в условиях компактизации клеток и уменьшении их распластанности.

1. Употребление воды с повышенным содержанием ионов кальция вызывает в клеточном составе крови изменения, характерные для неспецифической реакции активации: лимфоцитоз, нейтропению в периферической крови, тенденцию к увеличению доли коркового вещества надпочечников. Повышенное содержание ионов кальция в питьевой воде приводит к увеличению адгезионных свойств (снижение на 29 % величины гранулоцитарно-лимфоцитарного индекса) и фагоцитарной способности нейтрофилов, а также к снижению хемотаксической активности лейкоцитов (на 77,4 %). В сочетании с интенсивной мышечной нагрузкой происходит резкое увеличение хемотаксической активности лейкоцитов и более полное протекание осморегуляторных реакций лимфоцитов.

2. Интенсивная мышечная нагрузка вызывает неспецифическую реакцию переактивации, о чём свидетельствуют выраженный лимфоцитоз на 22 % и увеличение доли коркового вещества надпочечников на 4,2 %. Стимулирующее влияние интенсивной мышечной нагрузки на функциональные свойства лейкоцитов проявляется в увеличении их адгезионной, миграционной и поглотительной способностей.

3. Интенсивная мышечная нагрузка способствует наибольшей реализации мембранного резерва нейтрофилами (39,3 % против 29,7 % в контроле) по сравнению с двухфакторным воздействием и кальциевой нагрузкой. Отмеченная повышенная концентрация ионов кальция выступает

ВЫВОДЫ

в качестве компенсаторного механизма при действии интенсивной

мышечной нагрузки.

4. Употребление воды с повышенным содержанием ионов кальция не оказывает влияния на геометрические характеристики лимфоцитов и нейтрофилов. Интенсивная мышечная нагрузка приводит к уменьшению диаметра (на 11,9 %), площади поверхности (на 22,5 %) и объёма (на 31,7 %) лимфоцитов, что также отражается на снижении величины используемого

мембранного резерва лимфоцитами крови.

5. Показано, что в условиях in vivo осморегуляторные реакции как нейтрофилов, так и лимфоцитов незначительно выражены при кальциевой нагрузке. Тогда как при дополнительном воздействии мышечной нагрузки лимфоциты реагировали активнее нейтрофилов.

6. Показано, что в условиях in vitro увеличение объёма лимфоцитов при кальциевой нагрузке происходит в условиях компактизации клеток при уменьшении их распластанное™. Ионы кальция эквивалентной концентрации, поступающие с питьевой водой, не оказывают влияния на морфометрические характеристики лимфоцитов крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки адаптационных возможностей организма, а также выявления нарушений защитных реакций рекомендуется использование методик, характеризующих функциональные свойства и реактивность

лейкоцитов.

2. Изучение функциональных свойств и резервных возможностей лейкоцитов имеет важное прогностическое значение в связи с участием этого клеточного пула в обеспечении защитных реакций организма.

3. Полученные данные о морфофункциональных преобразованиях лейкоцитов в изменённых условиях существования позволят обеспечить изыскание и выбор корригирующих средств, направленных на сохранение

здоровья человека и животных.

4. При составлении схемы лечения заболевания и назначении лекарственных препаратов, содержащих кальций или влияющих на его баланс в организме, необходимо учитывать его непосредственное влияние на состояние мембраны лимфоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим перечнем ВАК

1. Федорова М.З., Павлов H.A., Зубарева Е.В., Надеждин C.B., Симонов

B.В., Забиняков H.A., Тверитина Е.С. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови // Биофизика, 2008, т. 53, вып. 6. - С. 1014-1018.

2. Павлов H.A., Надеждин C.B. Реакции лейкоцитов крови крыс на растворимые и нерастворимые формы металлов в опытах in vivo и in vitro // Научные ведомости БелГУ, 2010, № 21 (92), вып. 13. - С. 103-106.

3. Михайлова С.Г., Павлов H.A. Влияние кальциевой нагрузки на функциональные свойства лейкоцитов в опытах in vivo и in vitro // Научные ведомости БелГУ, 2011, № 15 (110), вып. 16. - С. 59-63.

Прочие публикации, содержащие основные научные результаты диссертации

4. Павлов Н. А. Адгезионные свойства лейкоцитов при адаптации организма к различным факторам среды // Сборник тезисов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006. -

C. 157.

5. Fedorova M. Z., Pavlov N. A., Zubareva E. V., Simonov V. V. Influence of ecological factors on the use of blood lymphocytes membrane reserve in the in vitro experiments // Journal of vascular research, 2008, v. 45, suppl. 2. - P. 96.

6. Надеждин С. В., Павлов H. А., Яржомбек И. О., Харченко А. И. Изменение свойств мембраны лимфоцитов под влиянием ионов кальция // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Сборник материалов конференции. - Курск, 2011. - С.335-336.

7. Павлов Н. А. Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при изолированном действии и в условиях интенсивной мышечной деятельности. — М.: АЛЬПЕРИЯ, 2012. - 94 с.

Подписано в печать 17.05.13. Печ.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 77 308503 п.Майский Белгородской области Типография БелГСХА им. В.Я. Горина

¡9

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлов, Николай Александрович, Белгород

Министерство образования РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия

им. В. Я. Горина»

На щ

04201359248

Павлов Николай Александрович

Специальность 03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Семенютин В. В.

Белгород - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................10

1.1. Роль ионов кальция в различных физиологических реакциях......................10

1.2. Участие ионов кальция в изменении функциональных свойств клеток крови...........................................................................................................................21

1.3. Влияние интенсивной мышечной деятельности на функциональные свойства лейкоцитов..................................................................................................27

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................35

2.1. Планирование эксперимента.............................................................................35

2.2. Оценка миграционной способности лейкоцитов............................................38

2.3. Оценка адгезионной активности лейкоцитов..................................................39

2.4. Оценка фагоцитарной способности нейтрофилов..........................................40

2.5. Оценка осмотической стойкости и осморегуляторных реакций лейкоцитов..................................................................................................................41

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................49

3.1. Вклад ионов кальция и интенсивной мышечной нагрузки в развитие неспецифической адаптационной реакции организма..........................................49

3.2. Изучение основных этапов фагоцитарного процесса........................................50

3.2.1. Исследование миграционной способности лейкоцитов..............................50

3.2.2. Оценка адгезионной активности лейкоцитов..............................................53

3.2.3. Оценка поглотительной способности нейтрофилов....................................54

3.3. Оценка использования мембранного резерва лейкоцитами крови...................55

3.4. Кинетика набухания и осморегуляторные реакции лейкоцитов....................63

3.5. Осмотическая резистентность лейкоцитов......................................................69

3.6. Влияние ионов кальция на использование мембранного резерва лимфоцитами..............................................................................................................70

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................86

ВЫВОДЫ....................................................................................................................99

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.....................................................................101

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших макроэлементов, имеющихся во всех живых

2+ 2-f-организмах, является кальций (Са ). Кроме того, что Са является

строительным материалом для костей и зубов, он обладает высокой

биологической активностью: влияет на проницаемость клеточных мембран,

дифференцировку клеток, обеспечивает мышечные сокращения, в том числе

сердечную деятельность, участвует в передаче сигналов в синапсах,

свёртывании крови, деятельности желёз внутренней секреции и др.

(G. N. Zimmerman, N.Fleischer, 1970; N. J. Rebecchi et al., 1982; S.A. Ronning,

1982; R. Wang, 1990; И. A. Држевецкая, T. H. Джандарова, 1992;

E. A. Александрова, 2001; N. С. Foster et al, 2001; H. Wais, 2001).

Широко представленными к настоящему времени являются работы об участии ионизированного кальция в реакциях мышечного сокращения. Так, мышечная подвижность зависит транспорта ионов кальция (Е.А.Александрова, 2001; Д. Бендол, 1970; О. В. Есырев, 1983; В. Д. Романенко, 1975; М. Д. Курский, 1986; В.Л.Козловский, 1995; П. Б. Цывьян, 1987; F. H. Braunewell, 2001; A. Fabiato, 1983, 1985; N. J. Rebecchi et al., 1982). Установлено, что функции всех разновидностей мышц контролируются при помощи ионов кальция, выступающих в качестве вторичного мессенджера (S. Ringer, 1882). Ионы кальция принимают участие в энергетическом контроле мышечной деятельности путём регуляции запасов АТФ (C.A.Tate, M. F. Hyek, G. E. Taffet, 1991). Основными причинами повреждения мышечной ткани при избыточной нагрузке являются прогрессирующая утрата способности мышц предотвращать изменения в уровне Са (J. G. Cannon et al., 1991), сжатии митохондрий, вакуолизации саркоплазматического ретикулума (R.B.Armstrong et al., 1983; J. Friden et al., 1989), изменениях Z-линий саркомера, a также активности респираторного

взрыва нейтрофилов (А. N. Belcastro et al., 1988; P. M. Clarkson, 1988; J. Peake et al, 2004, 2005).

В последние годы стало известно о широком спектре влияний ионов кальция на гемоциты. Установлено, что Са снижает активность 5-липоксигеназы лимфоцитов, приводя к угнетению синтеза лейкотриенов (С. A. Rouzer et al., 1987), влияет на процесс фагоцитоза и миграцию нейтрофилов (Т. Bengtsson et al., 1993; F. R. Maxfield, J. T. Mandeville, 1997), оказывает существенное влияние на структуру и стабильность клеточных мембран, кластеризацию кислых фосфолипидов (J. A. Scott, 1984; G. Tettamanti, М. Masserini, 1987).

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние повышенного содержания ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лейкоцитов в условиях интенсивной мышечной нагрузки.

3. Оценить влияние ионов кальция на функциональные и морфометрические свойства лимфоцитов в опытах in vivo и in vitro в сравнительном аспекте.

Научная новизна. Впервые с использованием наносенсорных датчиков атомно-силового микроскопа получены данные об изменении объёма лимфоцитов при физиологической и повышенной концентрациях ионов кальция. Проведён сравнительный анализ морфометрических свойств лимфоцитов в условиях повышенной концентрации ионов кальция в опытах in vivo и in vitro. Впервые установлено, что повышенная концентрация кальция в опытах in vitro приводит к увеличению объёма клеток при уменьшении их распластанности.

Результаты настоящей работы могут служить основой для проведения дальнейших исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов изменений, происходящих в цито скелете, а также рецепторном аппарате лейкоцитов, что необходимо для установления причин ряда патологий, возникающих в результате мышечных нагрузок высокой степени интенсивности. Знание ключевых моментов в изменениях реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов упростит поиск лекарственных препаратов, корригирующих данные параметры.

В. Н. Черниговского (С.-Пб, 2007), Международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни» (Москва, 2008), XVI Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твёрдых тел (Черноголовка, 2009), Международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке» (Тула, 2010), XVII Международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы, включающего 268 источников (60 отечественных и 208 зарубежных публикаций).

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Роль ионов кальция в различных физиологических реакциях

В последние десятилетия многие исследования в области физиологии были направлены на изучение влияния алиментарного поступления макро- и микроэлементов на защитные свойства организма. При этом особое внимание уделялось изучению поступления в организм ионов кальция (Са2+). Известно, что около 90% всего кальция сосредоточено в костных тканях, а концентрация внутриклеточного свободного (ионизированного) кальция, который не ассоциирован с белками и низкомолекулярными веществами, в десятки тысяч раз ниже концентрации таких катионов, как К+, Na+ или Mg2+. За счёт очень низкой концентрации ионизированного кальция в цитоплазме клеток, а также существования его высоких градиентов на клеточных мембранах этому иону отводится ключевая роль в жизнедеятельности практически всех животных. Функциональная роль ионов кальция заключается в его участии во многих физиологических реакциях, протекающих в организме. В литературе имеются данные об участии ионов кальция во взаимодействии электрических сигналов (П. Г. Костюк, 1984, 1986; R. R. Llines, 1988), секреторной деятельности экзо- и эндокринных желёз (В. Д. Романенко, 1975; И. А. Држевецкая, Ю. М. Држевецкий, 1983; И. А. Држевецкая, Т. Н. Джандарова, 1992; G. N. Zimmerman, N. Fleischer, 1970; R. J. Miller, 1991; F. Quanounou et al., 1999), депрессии генов (A. M. Szekely et al., 1990), коагуляционной системе крови (M. Rocco et. al., 2003), контроле метаболизма (J. G. McCormack et al., 1991). Кроме этого, ионы кальция принимают участие в становлении адаптивных реакций (Ф. 3. Меерсон, М. Г. Пшенникова, 1988; М. Г. Пшенникова, 1999), а также в запуске механизма мышечного сокращения (Е. А. Александрова, 2001; Д. Бендол, 1970; О. В. Есырев, 1983; В. Д. Романенко, 1975; М. Д. Курский, 1986; В.Л.Козловский, 1995; П. Б. Цывьян, 1987; F. Н. Braunewell, 2001;

A. Fabiato, 1983, 1985; N.C.Foster et al., 2001; N. J. Rebecchi et al., 1982; S. A. Ronning, 1982; R. Wang, 1990; H. Wais, 2001).

Уровень ионизированного кальция является одной из констант организма, регулирование его содержания в крови осуществляется точным динамичным процессом (Y. Mine et al., 2003). Концентрация ионов кальция в крови составляет в среднем 10 мг% (2,5 мМ), изменяется не более, чем на 3% и поддерживается, в основном, за счёт паратгормона, витамина D и тирокальцитонина, обеспечивающих адсорбцию данного катиона кишечником, выведение его из организма или отложение в костях. Основная масса кальция сосредоточена в костном скелете, который служит буфером для ионов, циркулирующих в кровотоке. Примерно половина кальция в крови связана с белками плазмы, главным образом с альбумином. Общее содержание кальция в клетках тканей может достигать 10 ммоль/кг, то есть уровня, превышающего его концентрацию во внеклеточной жидкости. Большая его часть связана внутри клеток с растворимыми лигандами (нуклеотидами, неорганическим фосфатом, цитратом, белками, например, кальмодулином) и клеточными мембранами или аккумулирована во внутриклеточных депо. Различают три состояния кальция в клетке: 1) Ca , локализованный внутри клеточных органелл, в том числе в сети эндоплазматического ретикулума, в ядрах, митохондриях, секреторных гранулах, лизосомах; 2) хелатированный Са2+, ассоциированный с анионом или молекулой цитоплазматического белка; 3) свободный (ионизированный) Ca , находящийся в равновесии с хелатированным Ca . Регулятором разнообразных внутриклеточных процессов является свободный (или ионизированный) кальций.

Концентрация ионизированного кальция в покоящихся клетках невысока и составляет около 0,01 - 0,1 мкмоль/л, тогда как во внеклеточной среде его концентрация достигает 1,5-2,5 ммоль/л. Мишенями для кальция внутри клеток являются белки, способные активироваться при изменениях его концентрации в диапазоне от 0,1 до 10 мкмоль/л. В настоящее время выявлено

по меньшей мере 100 Са -связывающих белков. Такими белками являются кальмодулин, парвальбумин (мышцы и нервная ткань), кальцинейрин (мозг), тропонин - С (поперечно-полосатые мышцы), миозин. Высоким сродством к кальцию обладают и ферменты биомембран, обеспечивающие удаление катионов кальция из внутриклеточного пространства. Высказано предположение о том, что ионы кальция выполняют функцию вторичного мессенджера. (Г. Расмуссен, 1989). Согласно данной концепции, механизм передачи сигнала через мембрану обеспечивается метаболизмом фосфоинозитидов в мембране и увеличением внутриклеточной концентрации кальция. Наиболее распространенным рецептором для кальция в большинстве клеток является низкомолекулярный белок - кальмодулин (Км). Кальмодулин содержит четыре Са2+-связывающих участка. В результате связывания Са2+ происходит изменение конформации белка и его активация. После этого комплекс Км - Са связывается с белками-мишенями, в том числе мембранными, стимулируя (аденилатциклаза, Са -АТФазы плазматической мембраны, киназа фосфорилазы, фосфолипаза А2, цАМФ- фосфодиэстераза) или ингибируя (15-оксипростагландиндегидрогеназа, гликогенсинтетаза) их активность. Рецептор форболовых эфиров - Са -активируемая, фосфолипидзависимая протеинкиназа была названа протеинкиназой С (У. Такш е1 а1., 1979). Она активируется Са , фосфатидилсерином, форболовыми эфирами и 1,2-диацилглицерином. Известно, что увеличение концентрации внутриклеточного Са , образование комплекса Км - Са и фосфорилирование соответствующих белков обеспечивают специфические ответы клеток.

Ионы кальция оказывают существен

Информация о работе

Павлов, Николай Александрович
кандидата биологических наук
Белгород, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль ионов кальция в изменении реактивности и микрореологических свойств лейкоцитов при интенсивной мышечной нагрузке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы