Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гликозилирования на примере секреторныхкарбогидраз Aspergillus awamori

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль гликозилирования на примере секреторныхкарбогидраз Aspergillus awamori"

п ь

ин

"7 шли «юз ■-

{ » | I V • I

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХШМ ИМ.А.Н.БШ

на правах рукописи

Неустроев Кирилл Николаевич

Роль гликозилирования на примере секреторных кврОогидраз Аэрег^Шиз аталгаг!

(ОЗ.ОО.СИ-Оиологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации нй соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мосжва-1993

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им.Б.П.Константинова РАН.

Научные руководители : доктор биологических наук,

В.Д.Щербухин

доктор биологических наук, Н.А.Тиунова

' ■ ' У

Официальные оппоненты: доктор бисиюгических наук, профессор

В.А.Пас-<ешниченко доктор химических наук, профессор . В.Н.Шибаев

Ведущая организация: С. -Петербургский государственный

университет, биологический факультет Защита состоится " 1993 г. в № час, на

заседании Специализированного совета-К 002.96.01 ш присуждению ученых степеней в Институте биохимии им А.Н. Ваха РАН, г. Москва С диссертацией мовио ознакомится - в библиотеке Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. -

Автореферат разослан мая 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М.Й. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гликозилирование присуще

значительному числу белков жз эукариотических организмов, а также ряду балков варусоз. На протяжении последних 30 лет число работ, посвященных вопросам гликозилированая продолхает неуклонно расти. Такой интерес вызван н& только широким распространением гликозилированая по сравнению с другими видами посттрансляционной •.годвфикации белков, но значительным и разнообразным влиянием, которое оказывает этот тип модификации на ковформацию и биологические функции белковой молекулы. Разнообразие строения углеводных компонент глихопротеинов и необходимость их детального изучения вызывает болызое число интересных методических работ, в которых примэнялтся практически все самые современные биофизические подходы для решения структурных задач. Но, несмотря на огромный фактический материал, полученный в рззулътате исследований большого числа гликопротэинов из различных источников, попытки широкого обобщения роли глнкозилирования белков оказывается,как правило, неудачными. Становится всэ более очевидным, что значение гликозияирования конкретно практически в каздсм отдельном случае. Поэтому можно с достаточной степень® уверенности утвэрадать, что изучение роли глнкозмьровавия имеет значимость всегда, когда мы рассматриваем это явление на новом объекте.

Основная цель' работы Цель» данной работа являлось изучение роли глЕкозилировання для секреторных карбогидраз из АпрегвШш аяапюг!: глвжоаишгазы, «-гликозидазы иа-галактозздэзы. .

Исходя из цели работа были поставлены еле душив задачи:

1) Выделение трех рассматриваемых гликозвдаз в гомогенном состоянии для ■хзрактериссаки их углеводной компоненты, разработка достаточно эффективных методов их выделения для возможности изучения изменений гликозилирования .- белков в экспериментах 1л 7170.

2) Характеристика типа гликозилированая ( О ели. Н.- типа)

рассматриваемых белков. Подробное структурное исследование 0-сахаров на пракере глажомилазы как наименее изученного типа гликанов.

3) Изученяе роли гликозилирования путей сравнения свойств нативного и различными методами дегликозилированного белка.

4) Исследование возможностей ферментативного отщепления 0-глвкоззльнкх связей рассматриваемого типа с целью получения исчерпывающе дегликозялированных белков.

5) Изучений роли гликозилирования в экспериментах in vivo путем получения балков с модифицированной в различной степени угле водкой компонентой.

6) Изучен® микрогетерогенЕостл гликозилирования для 0 -Сахаров, причин вызывающих эту микрогетерогенность и изучение измзнения свойств белков в результате микроизменений в структуре их углеводной компонент.

Научная нодизна работы. В ходе работы были охарактеризованы углеводные структуры глякоамилазы, о-галактозидазы и л-глпкозидазы, которые были выделены из культуральной жидкости A.awamorl в гомогенном состоянии.

Изучена как внутримолекулярная, так и мвхюлекулярвая роль гликозилирования для данных объектов.

Предзкшен путь метаболического расщепления 0 - гликозильных связей рассматриваемого типа.

Охарактеризована микрогетерогенность 0 - Сахаров и выявлены причины ее вызызаицке.

Практическая значимость работы. Штамма грибов рода Asperglllua широко используются для производства ряда чистых белков и ферментных препаратов, а рассматриваемые в работе три гликозидгзы широко пришняются в биотехнологии. На примере данных объектов наш разработаны метода модификации углеводной компоненты ln vivo с помощью изменения состава среды иле внесения в среду во время роста культуры ингибиторов углеводного процессинга. Это дает возможность подучить более рН- и теркостабильнне бежа. В представленном варианте предлагаемые подхода могут музптъ основой для проведения таких модифакаций з

условиях крупномасштаОного культивирования.

На защиту выносятся:

-результаты исследований типа и структуры глжозилирования глюкоамилазы, с.-галактозидазы и а-глюкозидазы;

-результаты исследований роли О-гликозилировани я как внутримолекулярной функции гликозилирования;

-результаты исследований взаимосвязи глнксэшшрования и секреции;

-определение биологической значимости и причин микрогетерогенности 0-гликозшшрования;

-результата исследований метаболического пуя расщепления

0-гликозильннх связей рассматриваемого типа;

Апробация работа и публикации. Результата работа были доложены на Советско-Итальянском симпозиуме "Вюмолекулы в функционирующей клетке", в. 1987 и на Всесоюзном сииюзиуме "Химия белка" в 1988 году. Основные материалы, включенные в диссертацию отражены в 12 работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав и заключения. Объем диссертации 168 страша, включая 36 рисунка, 17 таблиц и список литературы из 227 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава является обзорной. Рассматривается строение углеводной компоненты гликопротеинов, классификация гликопротеинов по типу углеводных цепей» Метаболические цути синтеза и процессинга углеводной компоненты ташкопротеинов. Изучение роли гликозилирования в экспериментах 1п тИто и 1л т!уо.

Материалы и метода исследования

Растворимый крахмал, мальтотриоза, мелибиоза, мальтоза, п-нитрофвнил -а- Ц-манношранозид . п-нитрофэнил- р-Ъ -манвширанозид , я-нитрофенил-а- Б - галактопиравозид метил о-

1-3-маннопиранозил-каннопиранозид, манноза, гааактоманнан ,

галактоза, пвпстатин, дрожгэвой маннан, 4 - аетнлумбеллш^эрил-a-D -машюшфанозвд , 4 - метилумбеллнферил -a- D галактопирадазпд фирмы "Sigma", США. Тунпкзыгсцкн, I-дезоксинаирижциз, I - дезоксиманнонаиржлицин, "Bochriziger Kanheim", Австрия.

Гликозидвзные активности измеряли стандартными методами, используя вышеуказанные субстраты.

Епс1о-/з-К-ацетилглЕхозаманадаза Р из yiavobacterluni menlngosepticuffl (Sndo F) - "Bochrlnger Manheim".

В работе использовался штамм Aspergillus awauurl var.XIOO Ш7 Культуру растили методом глубинного культивирования в теченье различных интервалов времени при 31 -ЗЗ^С без поддержания рН культурной среда. Состав стандартной среда из расчета на I литр, граммы: крахмал водорастворимый - 60, понтон - 5, моЕоаммонийфсгафат -24,6, хлористый натрий -0.5, хлористай калий -0.5, моЕокалий^осфат - 1.0, сульфат магния - 0.5, сульфат железа - 0.01.

В экспериментах по изучению мнкрогетерогенности углеводной компоненты в качестве основного источника углерода использовался галактоманнан 50 г/литр, крахмал 10 г/литр, галактоза 50 г/литр. Эксперименты во влияние глакезилированиа на секрецгп белков проводили по следующей схеме: культуру Asp. awamori внращивали предварите льве в течении 48 ч., мицеллай отделяли центрифугированием и переЕосши в среду стандартного состава, содержащую необходимый ингибитор. Инкубации проводили в течении 4-а ч.

Внутриклеточные белки выделяли согласно следующей ехэке: Для вскрытия мицаллий отделяли центрифугированием, промывали несколько раз 0,3 М NaCl в 0,2 М NH^HgPO^, затем инкубировали при перемешивании, при 30®С в течении 48 часов в 1,5 М натрий-ацетатвом буфере, рН 5,0, содергащам 3,5 М мочевину. Мицеллий отделяли центрифугированием и гомогенизировали в 1,5 .М натрий-ацетатном буферэ, рН 5,0 с 0,1 % тритоном XI00 в течении 10 мин ножеяга гомогенизатором, после чего центрифугировали. Супернатант использовали для выделения внутриклеточных

корбогидраз.

В качестве альтернативной процедуры вскрытия меток гриба для измерения внутриклеточной гликотрансфзрвзжй яктивяости применяли перэтяраяие мнцеллия з фарфоровой птулка с порошком окиси аязслзшя прк температуре жидкого азота. Г-тястротнфзрззтме активности измеряли, используя состава т ствухсгж

радгогкявно-мочэпЕке, моносахариды. кск доноры.

'КонцсЕфзчи? белю спрэдел.'?в? по ?етсду Лоури. зсполъзуя БСА а кзчвств'э стандарта.

Гомогенность иодучзЕных белков просеряж гнзлитической гелъфЕльтрацк^З .на колонке TSK GS 3000, (0,02 й вбтрй-ацетатвнй буфер, рН 4.5, 0,2 М КаС1), электрофорезом в присутствие додофялсульфата натрая по. метода Лазили Í99.1, изсзгоктрзчесним фокусщавазивм на пластинках "Sbrvalyt 3-10".

Для введения радиоактивной ?.?етки в утлеводнг» компоненту глнко'амйшйк "куль-гуру А. awatírí X1C0/D27 в^рапЕвалз в течении 48 ™эсг>ь\ а затем шосзлш соо^зетотвук^лй радиоажунвный сахар (,.;енкозу зли гслактозу) в культурагпьную сроду одаоврвмздао с рэсгворкжп лрзх-.апо::. Концентрация ргдаоияезьсго сахара в сред«» после дрба>ж:2ля составляв 0,8 ИВч/ыж, храхгзааа - 10 иг/мл. Шф/оацзв тгрэзодашт з твчвнех 8 - 10 ч, хюсйз чего рост останавливали а иракдези вкхзлэяае Се-лко.

A;-í3aoKHCJ!ovrtíi агщзга проведала на анализатора "Síoíronlír". Образу (1-2 ;д?) '.'идро^тзовэ.тш 2 вгкуу;.зроЕазах запаянннх ампулах в 6 а ИС1 пра Н0°С в течение 24, 48 и 7¿ часов. Числю остатков цястэкн? '"определяли как шетеяноэтя тсслоту после окислепия ótíjsa вддйу^.авьнной кйслотой. осатксв

трттофана .ниавграга зо w-юду Хорна.

/з-Эл^шЕзрованкэ проводили в I М IíaB34> 0-1 М КаОЫ в течение" 72-х часов при 30° Число О-сах^рая шределяли по гамзнэзгао в содзшанн& треоша и сэргпа сразнзнйен' дагЕокяслотннх

ЧЕ-ЕЕНОГО Я ГОДВПрГКу VOTO р-ЗШКЯЩЮгСВЗЗ Гроб бВЛКЗ.

Изменение количества Сахаров, соединенных с. белком 0-гл£козилкепли связями онрбдвлялг, лсбользуп С3Е) боргидрид натрия., Чколо Н-глякоьильно свизанвнл угхеводанх цегзй определяли

по следупцев схеме: белок обрабатывали Endo ? и количество свободных Сахаров анализировали после восстановления (3К1 боргздридом натрия. j

Обгцее содержание нейтральных Сахаров в ферменте определяли фенольным методом, используя маннозу в качества стандарта . Нейтральные сахара определяли как альдитолацетаты используя газоашдкостную хроматографию на колонке 0V-17 в градиенте температур от 100° С до 300°С, в качестве детектора использовался масс-спектрометр "Flnlgan MAI 90я, США.

Метилирование Сахаров, полученных после ^-элиминирования, проводили по методу Хакамори. йетиловие эфира Сахаров анализировали посредством ГЖХ - MC. Для уточнения полученных данных использовали следующий подход:

Лиофплазовавнув глюкоамалазу метилировали, как описано выше, после окончания метилирования белок диалпзовали против воды и гидролизовали в 2 Н HCl в течение 6 часов при 100°С. Затем без предварительной очистки образец лиофялизовали и проводила ацетилирование, как описано выше. Моносахарида анализировались посредством ПК-MC. Как альтернативный метод анализа Сахаров, полученных после ^-элиминирования, применялась их дериватизация посредством бензоилирования и разделения методом обращеннофазной хроматографии.

Изменения в гликозилировании белков, происходившие в результате модификаций In 7Ivo или In vitro, исследовали, применяя описанные ваше методы сравнением сахарных фрагментов нативного и модифицированного белка.

для уточнвния структуры углеводной компоненты гллкоамилазн применялся С-ЯМР-анзлиз нативного белка,используя прибор Bruker 250.

Дегликолизировгние а-меннозвдазой осуществляли в 0,02 11 натрий-ацетатном буфере, pH 4,5, 0,1 мИ ZnCl2, 0,U /з-меркаптоэтанол, 37®С , 24 . ч, 4-6 единиц а-маннозидазной активности на каждой миллиграмм белка. Дегликолизирование воздействием Bodo ? проводили в 0,02 М натрий-ацетатном буфере, pH 5,2, 28 , 24 ч. На 500-600 мкг белка использовали 1,4-1,5

единицы активности Eruto Р.

Для .оценки изменения конформации белка использовали спектры кругового длхроизма, полученные нэ дихрографе Marte 3 ("Jofcln Yvon", Франция) при концентрации белка 0,2 - I мг/мл.

Кглорвметричвские измерения проводили на дифференциальном сканирующем михрокалориметрэ ДАСМ-1М со скоростью прогрева I К/мин при концентрациях балка 0,5 - 2,0 tsr/m в 0,05 М нэтрий-ацетатвом буфере.

Электроспрни масс-спсктры били полутени на насс-спектроштре 70 BÍO-Q, VG BI0TEC3, АНГЛИЯ.

Результаты исследований а их обсугдэние

I. Выделение и очистка белков

Были отазены до гомогэнеэго состояния глюкоамилаза, а-галактозлдазз и а-гяжозйдрзз - балкк, используете для изучения роли глякоэилировання. А также о-машлзидаза, Л-кзипозидаза н 1скс-'"чп протошаза - оярменты, хсдаяьзуемь:е для вспомогательных методических целой.

Применянсе методов жк&сос/нгй Екетнозффективноа хрокртогргфаи (ЖВЭХ) позволило выполнять очпспп рассматриваемых белков с высоким выходом и зя малое крегл, что сязеотзенно для прозе дазпл этгег^ртметггоь из кзучегий рглн пгакозшюрозанЕЯ in VÍTO.

Типичная схема ивдел^няя приведена в качестве примера в

таблице I.

Выделенные Селей гомогенны по дагзым аналитической ионообменной хромотографал, аналитической гельЗетьтрацЕшксй хроматографии, алктрофорззг по метода Лаэша, изоолектрчческому

фокусированию.

Таблица I.

Результата выделения и очистки а-галактогидазы

Белок Активность Выход Степень

Стадия очистки _ по ак- очистки

общий (кг) общая удельн. тивы. (раз) (нг/мл) (Е) . (Е/мг {%) белка)

I. Культурная (0,5) 620

жидкость 5000 0,12 100 . I

Г.. Ультрафильт-

рация через

волокнистый

фильтр 1950 (5.6) 610 0.31 98 2.6

3. Обессоливанве 1

на сефадексз 1850 (4.6) 580 0.31 93 «5 2.6

4. Хроматографая

на колонке

ВЕДЬ 20УО?2Ш.

ТОУСБОМ 230 (4.7) 550 1.76 88 19

а. Ультрафзльтрс-

ция через кза-брану РМ-30 и

Еослвдухщее

обессоливанае

на сефгдексэ 240 (12) 470 1.96 76 19

6. Хроматография

на колонке

Мопо-в 12 0-5) 372 29 60 416

Изучение динамики появлзния нескольких форд глгкоашлазы в культуральной жидаоста показало, что на ранних стадиях роста гриба ( 1-2 суток) секретаруется одна форма, которую далее будем называть основной, а минорате форта в заметил. количествах появляются на 3-4 сутки инкубации. Отяетим , что. основная форма глпкоамилазы содержит каталитический домен и дополнительный субстратсвязыванцей центр, а у минорной формы дополнительный центр отсутствует.

Окончательным доказательством того, что данный процесс вызван ограниченным протаолизсм под воздействием собственной кислой протаазн являются эксперименты с добазлошюм пепстатина в культуральную среду во время роста. Пепстатин существенно

--------_ 1т _-----------------------------------------

подавляет процесс конверсии основной формы в мкаорада- Мальте за обычно представлена также двумя формами М1 и М2, не рзздаляадотся хромгтографич&ски и при изофокусировааик. Пр&ыеняя пепстатин и обработку формы Ш очищеной кистой протвазой удается раздельно ьвделять обе формы этого ф&рмента. В эксозршввтгтс 1л 7 о также было доказано, что механизм образовгеия тожественности форм мальтгзы аналогичен докезанпому для глшеакя-газн. Использование ингибитора кислой дротэиназы пепстатина позволило раздельно получать форка ДОУ^ этих ферментов.

2.Структура углеводной когаюнента расснатривэшж белков

*йш глякознлирования приведен в таблице 2, елкгомерпый еестав О-сатсвров приведен в табтада'З, гожая структура О-сзхарол ллп г.гжогэтмгц пркгадеза в та&чщз 4.

Таблиц? 2 Структура ГЛПКОЕ2'.'КрОР?НИЯ

©огмьнт чяоло ООяхарос чесло М-^зхарсз

на »..одекулу па ;.те<зкуху

тагсозияяаза •46 ?

а-галактозздзаа 30 3

<=-глшсзкдаза 20 о О

Таблица 3 Олигомарная структура 0-сахаров

Олигомзрная структура О-сахаров

а-галактозидаза

а-глшозидаза

мономзры

дамеры

тримеры

15 10

3 8 3

Таблица 4

Структура 0-гликознльно-связаннщ углеводов глпкоамзлазы

ЧИСЛО ССТАТКСЗ НА МОЛЕКУЛУ ФЕРМЕНТА

УГЛЕВОДУ натив -вый догликозглиро-занвый а-ман-нозидазой выращивание с маннонаЕршащи- ЕОМ

60 мкг/ил 10 мкг/ыд

В-манноза 19 37 4 • 12

2-0-В-манношранозил-В-маннопираноза 21 3 36 27

Б-маншпирансзял- (1 -6)-[Б-глпкопирашзил-(1-3)1 ыанвовираноза 3 1 3 3

В-маннопиранозил-(1-5)-[В-галактопиранозил (1 -3)1-маннопираноза 3 3 I 3 3

В-маннопирагозил- (1-6)-манпопнраноза - 2 - -

3. Ферментативное и химической дегликозилирование белков

Обработка дативной глюкоамклазы <*-маннозидазой приводит к отщеплению 24-26% суммарной манкозы (Табл 4). При увеличении концентрации а-манисзидазы и времени инкубации увеличения степени дагдаозиЕриБвния добиться не удается. Сметам, что общее число о-глпкозшьзых связей как при обработке натшяотп, так а денатурированного белка а-мавнозидазами, ge изменяется. Связи маннозн непосредственно с серлноч и треонином полипептидной цепи остаются недоступных для гидролиза.

Обработка катанной глюкоакилазы как е-галактозидазой из A.arararl, так и а-гэлактезвдазой из Trichodexm геезе! не приводит к о-щегиэнив галактозы. Обработка в-глнеозидазой нз A.awamori прзвода? к отщеплению нз более 25-30% суммарной глекозн- Увеличение холячестез в-глзкозидэзи и увеличение времени хлкубацрп не приводит к более значительному дегдштозилпрованию.

Обработка настегай глжоаг.лздгазы Ende ? приводит, к оттцешюша даух К- глгкозяльно-евкзяаныг углеводных цепей от каждой малэкулы оелка. Oíметим, ч-го при обработке проназного гздролизата рассматриваемых бэлков такхе отцепляется то же число К - углеводнах цепей, что и от езтивных. Это позволяет утверждать, что деглшсозигироЕэнпе натлвного белка имеет нечершваяадй характер.-

Модифицированный а-маннозвдазой белок менее pH- л тэркостабилек, чем натавннй. Белок, обработанный Endo также теряет рН-стабнльность и температурную стабильность, но в меньшей степени. Изменения в ферментативной активности нативиой и модифицированной фертантами дегликозалированил глшоамалазы не обнаружено. Так, значения К^ для мальтозы у нативного беляа и у обработанного а-у.анаозкдазой или Endo F совпадают и равны 0.2 х I0"3 М. Нет отличий и в значении Утя7- Для достагеняя полного дегликозэлироваЕия была применена обработка зативной гшюамнлазы T©JG арл 0° с в течении 2 часов. Полностью дегликозялярованный белок необратимо денатурировал.

Сравнение КД-спектроз в области пептидной связи (200-250 ни) и ароматической области (250-310 вм) показывает, что обработка «-мапнозвдэзой ведет к изменению третичной структуры фермента. КД-спектры вативной я дегликозшировапной Endo-? глюкоамялазы полностью совпадает.

Калориметрические измерения были прозедош для основной форму глюкоамилэзн, минорной фора и основной, ДвГЛЬЛОЗЕЛИрОВПЗНЭЙ о-манЕоаидазой.

Таблица 5

Параметры теидавой денатурации глгкоанвлвгы, определенные мткрокглорамэтргческам цзтодом

формы глхкоаааззы лНса1 н

С0 каад/ааяь ккал/кояь

основная форма VO.fii 0.8 dI5 - 35 ЮГ г I I 4.0 - ОИ

мшоркая форма 70.2- 0.4 343 - 3 80 i 6 . -1.1 - 0.3

основная фотак, даглЕкоззшфоьаплая с. -кяннозвдо?ой ■ 67.9± 0.4 302 ± 22 S2 - 6 ' 3.3 - 0.1

На основанд йс^до предполагать, что наиболее

значтым результатом О-глготзипфовшия С-кондатого фэагкевта, содержащего второй. дотюлагтельЕнЕ сэнтр стзпзыванЕЛ, является стабзышзацзя доданной, структуры "главной части" --молекулы глпсоеинкззн, содержащей основной каталЕтяческай центр.

Фзрмактгтивноо- двхчткозцлгровэЕЕЗ с-галектозядгзц и с-глкеюзейззы было нровэдззо аг пах-^взкх бзлках СОГЛЭСЕЭ процедура, при^няздай для' деглакозшшрования ваттной гликоамшшзы. В результате дегликозшшровашл било удалено 22% и 281 ыаэнозы с с- галзктозлдазы и с а-глпкозздазы соответственно. Полученный эффект в целом соотЕэтствузт аффекту, полученному в результате азглогичной кодафикации глшкоамилазы. Подобное уменьшение рН и термостабильности, как и в случаз рассмотренном

выше, является следствием изменений конформации белка, что било установлено методами ХД - спектроскопии Полное дегликозилирование галзктозщ».азн под действием ТФЯС вызывает необратимую двнатурадкэ фершнта.

4.Взаидасз?.зъ гликози^йрования и секреции ЕвгиОарование г1-гликозил?шзвашя в равной степени сказывается на всзх трах белках - включение глякозаминз уменьшается пряаерш одинаково (Табл.5). При ингибирозаэта К-г-шжозшсрозанзя т*нш?яшциеок наблвдалось снижение уровня содержания всэх трег гликсзядаз в культуральной жидкости (Табл.о). Для лодаверсадания достоверности этого явления были сделаны следующие контроля: Посла выделения и очистки каядото из рассматриваемых белков проверяли зк оезсвнае кинетические характеристика (Кщ и которез у Еатнвзнх и модифицированных

белков оказались оденэкозими. На основании этого можно утееггхдзть, ч%п падение сктавноюи связано действительно с уменьшением количества рэссмзтрлзаэтдк глнкрзидаз, а не с изменением из удельных ьктивностэа, происходящих з результате дэглгяозтзлйроганяя.

Применение 2-дьзокскглхасо»'л выянзает значительное пнгпбзрованш о-глйкозилироватая секреторшх болкоз. Так, при концентрации ¡шгпЗнтора SO даг/мл О-глико'оИлнроБанЕй подавляется на 203, при ксхщептрацЕЗ шстОшора ISO ¡¿кг/мл - за 40-55S. Но дахэ при столь значительных ЗЕкаэненвях в углеводной . структуре какого-либо поееейвня уровня секреции не кабвдалось (Табл-S). Это позволяет ушэркдатъ, что о-гликозилированЕв нз связано с сэкрациэй белков в рассматриваемом случае.

Таблица 6.

Включение манноза и глюкозамша б секреторные белки в присутствие ингибиторов (3 гликозилирования, без ингибиторов-ЮОЖ)

туникамяцан 36 мхг/мл 2-дезоксиглщоза 100 мкг/мп

манноза глвкозамин нгнноза глшозамин

суммарный 85 39 57 90

секреторный

белок

а-галактоэидаза 90 15 50 103

а-глюкозидаза 95 2Э 45 96

гликоамилаза 93 20 65 100

Таблица 7.

Влияние тунзкамнцана (ТМ) н дэзэкснгликозы (ДГ/ на секрецию глгасозадаз.

количество (в отпутстзиэ Евгпбкторов-1003

ТЛ 10 мкг/мл ТМ 50 мкг/мл ДГ 150 асг/мл ЛГ 50 мкг

суммарный белок

в культуралъаой 90 82 108 102 зщдкостч

глюкоамшшза 65 36 102 59

а -гагактоз лдаза 38 80 38 101

а-глюкозидаза 80 68 98 104

/?-мгпнозыдаза Т5 0 65 80

5. Один из путей расщепления О-гликозильных связей в гликэпротеинах.

Необходимость проведения как можно более исчерпывающего ферментативного дегликозилирования заставило более подробно рассмотреть этот процесс на модельных соединениях, имитирупцих данный тип 0-гликозильной связи.

В качества модельных соединений, в достаточно общем виде имитируидими фрагменты шлипептидвой цепи в местах их соединения с углеводной компанентой были синтезированы следующие гликоле птиды: метиламид трет-бутшюксикарбонил- O-a-D -маннопирэгозил- серил -глицина (e-Han-Ser), мэталвмид трат-бутидаксикарбонил- О -а-маннопиранозил-треонил- глицина (а-Мап-тьг), метиламид трет-бутилоксикарбояил

-O-a-D-галактопиранозил -серил - глицина (o-Gal-Ser).

Оказалось, что данные соединения являются субстратами для известных гликозидаз: а-ыаннозидазы и а-галактозидазн. Кинетические характеристики гидролиза модельных гликопептидов для коммерческой с-маннозкдазы из канавалии (Jack Beans), а-маннозидазы из женьшеня, а также а-галактозидази из A.awamori X100/В2? приведены в таблице 7.

Отметим, что после проте^татической обработки трех рассматриваемая глзкозидаз (образуется пептида с молекулярным весом 10-12 кДа) происходит полное элиминирование всех 0-сахароз под воздействием трех экзогликозидаз: а-маннозидазы, а-галактозидазы и а-глхкозидазы. Таким образом, одним аз возмознкх путей деградации О-гликопротеинов может являться отщепление Сахаров от полшептидной цепи под воздействием экзогликозидаз после протеолитической деградации белка.

Таблица 8

Кинетические характеристики карбогидрзз по гидролизу модальных глпкопешэдов

Фермент Гликопептдд КУ Усах

125 МКЗа/КЗН/МГ

а-маннозидэза а-Иап-Бег-Рер 0.5 2.5

из канавалии о-Кгл-ТЬг-Рер 1 3

а-мангозидаза а-Цш-Бег-Рер 0.5 2.7

из женьшеня а-йап-ТЬг-Рер 0.9 2.9

а-галактозидаза а-Са1-Бег-Рер 2 б.б

6-Микрогетерогенность О-сахаров

На таблице 8 представлены изменения в. составе ьюносахарвдов О-связашмх Сахаров как для ввд&зяекого йелкг "в цалса, _ аде а д ля отдельных карбопг^ргз - о-ташкозЕДзгн, «-гэлактогндазц ж глгиоамилазы. Эте данные гажазавазг, что ьрсоксго.^ст шстзпзнеое свизенае содержания глюкозы н галакток, по сравнэнив с содарканпем маннозн. Структурннз езмаебвия О-сьязакЕлХ сахароз подробно рассаэтренн на нрйдара глгкоамЕкагн. (Табл. 9) Такое измеЕониз в структуре во врэмя роста культуры скЕдетодьсизует о наличии мшсрорге терогехзю стк б 0-с?оапгнх сатарэх нсследуг»шх белков. В то зе врвта общез число О-связанг^х сагаров на шлекулу остается тэм ^ , как а гликоожяазе, та», н' в а-гашп?озвдазе и в а-глтасозцдазе. Это 1тешо объяснить преадэ . всего отсутствием ферментов, спрсобвых расцеплять а-Нап-Бег или а-йап-Тйг связи. Такое объяснение было цодгаэридего результатами экскериаеЕтоз, где использовались гэделъЕые соелжеэия ^-Иап-Бгг-Рер и а-Мап-ТЬг-Рер.

Для подтверждения предположения о наличии

микрогетерогвЕНссти в сахарных цепях О-типа было проведено несколько экспериментов. Так, глюкоамилаза, полученная из 24 часовой культуры инкубировалась с фракцией хультурэлъной алдкости, содержащей белок в 0,02 М йа-ацетатном буфере рН 4,5 в течение 28-30 чзсов. Оказалось, что после инкубации глюкоамилаза теряла 50-70 " глюкозе (высвобождаемой из трисахарэдов) и около 20 % маннсзы (из дисахаридов). То же щх>центное содержание гляхэзк осво'чтдралось после обработан глюкоамилаза, очищенной а-глшозддасой гриба (0,5 единицы активности а-глшгазпдазы на I мг глюкеамилазы). Освобождение глюкоза ингибировалось добавлением к фракции, содэряащей белок 1-деоксиноиримицина, ингибитора а-глыкозидаз. Отщеслениэ маннозных остатков ИЕГибЕровалгсь 1-дэ окснг.1ашоирзмацином, ингибитором а-маннозидаз. Добавление в культуральнуи жидкость 1-деоксиманноиримицином девало аналогичные результаты (Табл.4)

Изменение содержания . галактозы, приводящее к МЕкрогетзрогенгости, связано с изменениями

гзлактозилтрзЕСфзразной активности во время роста культуры.

Таблица 9

Изменение в мономеряой структуре 0-сахаров во время роста

культуры

244 724

Май 01с Мал в1с Оа1

% %

глюкоамилаза В3.5 6 10,5 90.6 2,8 6,7

а-галахтозкдаза 75 5 20 84 6 10

а-глюкозндаза 70 10 20 88 3 9

- 20 -Таблица 10

Структурные изменения в 0-сгхарах глюкоамилазы во время роста культуры

Число остатков на молекулу белка 724 484 244 внутриклеточная

с-манноза 19 18 6 6

2-о-1>-маннопиринозил-гнманнолиранноза 21 22 29 31

Б-маннопиринозил- [1>-глпкоо-пиранозил (1-зн-маннопвраноза 3 4 5 5

г>-маннопиразозил- го-галакто-пиранозил а-зи-маннопираноза 3 4 6 3

7. Протеолитичеекая устойчивость и гликозилирование белков.

Как ухе отмечалось выше глшоамилаза и а-глхкозидаза находятся в культуральной жидкости в виде набора изоформ, шлучащихся в результате ограниченного протеализа под действием собственной секретируемой протеиназой гриба. Как оказалось, образование минорных форм из основной формы, как у глшоашлазы, так и у мальтазы, зависит не только от изменения рН среда в процессе роста культуры,во и от степени гликозилирования белка. Глшоамилаза, полученная из культуры с 24-часовым периодом инкубации, не подвергается ограниченному протеолизу под действием кислой протеиназы даже при значении рН ниге 2,7. Однако, глюкоамилаза из двух-суточкой культур« гриба подвержена конверсии в минорнув форму при рй 3,0. Таким образом, становится очевидным, что частичное дегликозилирование секреторных балков, происходящее в результате как частичного постсекреторного дегликозилирования, так и изменения . внутри клеточной

гликозилтрвнсфзразной активности имеет вполне определенное значение, являясь рзгуляторшм механизмом для процесса ограниченного протеолиза.

Образование минорных форм ^-глюкозидазы так же "елосредствеяно связано с изменением гликозилировзния белка в процесса роста культуры. Для а-глжозидазы полученной из односуточной культуры не удается получить миноркой формы в экспериментах по обработке очищенной кислой протеиназой. Нормальный процесс конвэрсиа формы III в форму Ш, наступает после инкубации а-глакозидазы в течении 24 суток в хультуральной жидкости гриба. Углеводный анализ, проведенный после такой инкубации, показывает, что отщепляется 5-5% маннозн и 5091 глюкозы. Таким образом и в случае а-гликозидазы процесс ограниченного протеолиза находится под контролем системы гликозилировзния белков.

ВЫВОДЫ

1.Для рассматриваемых трех секреторных карбогидрзз характерен смешанный тип гликозплкровапия (глакозилированне 0 и N типа). Для 0-сахаров характерны авбсльше иэннозобогатые олягосахаридяые цепи.

2.М-гликозилированиб не сказывается на конформацик рассматриваемых белков и, по всей видимости, его роль состоит в мезмолэкулярной функции гликозклирования - является сигналом, обеспечиваниям нормэльнув секреция.

3.Одной из функций 0-сохаров является внутримолекулярная функция -обеспечение наиболее стабильной конформации белка.

4.0-сахярз выполняют также меаиолекулярнув функцию обеспечивай* опчжальвое прохождение ограниченного постсекреторного протеолиза.

5.Одним из возмоявкх путей катаболизма О-гликозальншс связей рассматриваемой структуры является зх последовательное расщепление пол дейстанем зндоглккозидаз посла протеоллтпческой

деградации полипептидной цепи.

6.Причиной, вызывающей формирование микрогетерогенности О-сахаров, является постсекреторный процессинг под воздействием собственных . секреторных карбогидраз гриба и изменения трансферазной активности в процессе рсста культуры.

Основные материалы диссертации опубликованы в следущих работах:

1. А.Я.Хорлин,А.С..К1КЛОв,К.Н.Неустроев,Л.М.ФЕрсов,0.Н.Аброскина,

И.В. Александрова, В.В. Насонов.

"а-маннозидаза из культивируемых In vitro клеток женьшеня". Биохимия, 1991, J62, 314-319.

2. Golubev A.M. and Neustroev K.N.

"Crystallization oi a-galactosidase Iron Trlcbodenna reesei", J. Mol. Biol. ,1993,229, II2-II4

3. Neustroev K.N., Golubev A.M., Ibatullln P.M., Protasevich I.I.

and Kakarov A.A.

"Eliect oi modllicatlon oi carbohydrate component on properties oi glucoamylase", ?iBS betters, 1993, JE, 157-160.

4. Hay строев K.H., ГолубевА.М., йбэтудшин Ф.М., Протасевич И.И.,

Макаров A.A.

"Влияние ферментативного и химического дегликозилирования на свойства глшоашлазч из Asp.awaaori", Биохимия, 1993, Ж, 562-573.

5. Неустроев К.Н., ГолубевА.М., Ебатуллин Ф.Ц.

"Влияние ингибиторов гликозилирования на секрецию гликозидаз из Asp.awamorl", Биохимия, 1933, JM, 574-579.

6. Ибатуллин Ф.М., Неустроев К.Н., Голубев A.M.

"Один из возможных путей расщепления 0-глгкозильных связей в белках", Биохимия, 1993,. JS6. (в печати)

7. Ibatullln P.M., Neustroev K.N. . Golubev А.И.

" A aodel' lor cleavage ol O-gly cosidle bonds In glycoproteins", Glyconjugate J. (1993), N5. (в печати)

8. Neustroev K.N.,' Golubev A.M., Ibatullin P.M.

Mlcroheterogenlty oi O-glycosidic bond. -Biocbem. and Hoi.

Biol. International, 1993. JS5. (в почати) 9. Neustroev K.N., Golubey А.И., Plrsov L.M., Hohlov S.E

Absorption ol glucoamllase irom Asp. Awamori on cell wall -Blochen, and Mol. Biol'. International, 1993, JS. (в печати) Ю.К.Н.Неустроев, Л.М.Фирсов, А.Я.Хорлин, К.И.Крылов, " Выделение и свойства а-галахстозидазы из A.awamorl", ВиопакЕЯ, 1991 ,J£3, стр. 447-455. 12. К.Н.Нэустроев , A.C. Крылов, Л.М. Фирсов, О.Н. Абросхина, А.Я. Хорлин "Выдалалив а свойства /?-мавнозидазы из А. awamorl". Биохимия, 1991, Яв, I406-I4II.

)