Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гена WOX5 в контроле пролиферации и дифференцировки клеток на модели органогенеза клубеньков бобовых растений

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль гена WOX5 в контроле пролиферации и дифференцировки клеток на модели органогенеза клубеньков бобовых растений"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

00 4 С'13 ( 17 На правах рукописи

ОСИПОВА Мария Александровна

РОЛЬ ГЕНА У/ОХ5 В КОНТРОЛЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК НА МОДЕЛИ ОРГАНОГЕНЕЗА КЛУБЕНЬКОВ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

03.02.07 Генетика

03.01.05 Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-2 прн 2010

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

004615719

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном университете на кафедре генетики и селекции в лаборатории генной и клеточной инженерии растений и во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии РАСХН в лаборатории молекулярной и клеточной биологии растений

Научные руководители: кандидат биологических наук,

Долгих Елена Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ежова Татьяна Анатольевна кафедра генетики Московского Государственного университета

доктор биологических наук Шишова Мария Федоровна кафедра физиологии и биохимии растений Санкт-Петербургского Государственного университета

Ведущее учреждение: Всесоюзный институт растениеводства

(ВИР) имени Н.И.Вавилова

Защита состоится " ■/(>" 2010 г. в ^ часов на заседании совета

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан "/¿' НО&Л^ 2010г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

Актуальность проблемы. Изучение регуляции пролиферации и дифференцировки клеток является важной фундаментальной задачей биологии развития. В силу консервативности механизмов, регулирующих пролиферацию клеток у эукариот, многие данные о регуляции клеточных делений, полученные для животных, впоследствии проверяются и подтверждаются для растений. У животных лишь ограниченное число клеток взрослого организма способно делиться и обеспечивать формирование тканей и органов, эти клетки называют стволовыми. В отличие от животных, практически все живые клетки растений являются тотипотентными, и при определенных условиях способны дать начало целому организму. При этом активная пролиферация клеток свойственна особому типу клеток растений - клеткам меристем. У растений выделяют «регулярные» меристемы (такие как апикальные меристемы побега и корня) и «нерегулярные» (или дополнительные) меристемы, формирующиеся de novo при определенных условиях. К «нерегулярным» меристемам, можно отнести, например, меристемы специализированных органов, таких как клубеньки, образующиеся на корнях бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями.

Для обеспечения правильного развития растений необходима тонкая регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах. Пролиферация клеток растений регулируется различными системами. В первую очередь, непосредственными регуляторами пролиферации клеток являются комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ, кроме того, важную роль в регуляции пролиферации клеток играют гормоны, такие как ауксин и цитокинин. В последние годы было также показано, что ключевыми генами, определяющими баланс пролиферирующих клеток в меристеме побега, являются гены, кодирующие транскрипционные факторы. Среди них особое место занимают гены семейства WOX (от WUSCHEL-related homeobox), кодирующие транскрипционные факторы с гомеодоменом. Предполагается, что транскрипционные факторы WOX являются ключевыми регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток в так называемых «организующих центрах» апикальных меристем, функция которых заключается в стимулировании пролиферации прилежащих клеток и предотвращении их дифференцировки. Так, в организующем центре меристемы побега экспрессируется ген WUS (WUSCHEL), а в организующем центре меристемы корня (его называют «покоящимся» центром) - его паралог, ген XV0X5. Было показано, что активность именно генов WOX (WUS и WOX5) необходима для предотвращения дифференцировки и стимулирования пролиферации клеток меристемы (меристемы побега и корня, соответственно). Также известно, что гены семейства WOX экспрессируются в меристемах специализированных органов (например, при морфогенезе клубеньков бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями), однако их роль в формировании подобных меристем практически не изучена. Большинство данных о механизмах, за счет которых гены WOX регулируют пролиферацию клеток, получено для апикальной меристемы побега. В меристеме побега WUS вовлечен как в локальную, так и в системную регуляцию пролиферации клеток. Известно, что в меристеме побега такая регуляция осуществляется через взаимодействие транскрипционного фактора WUS с системой CLAVATA и компонентами каскада сигнальной транедукции, регулируемой цитокинином. Транскрипционный фактор WUS стимулирует деления клеток, непосредственно регулируя экспрессию генов, кодирующих регуляторы цитокининового сигнального каскада ARR (Arabidopsis Response Regulators) А-типа, обеспечивая локальное усиление действия цитокинина в тканях - гормона,

стимулирующего пролиферацию (Leibfried et. al. 2005). В то же время ген WUS взаимодействует с системой CLAV ATA, включающей гетеродимерный рецептор CLV1/CLV2, с которым связывается пептидный лиганд CLV3 - член семейства CLE-пептидов, недавно охарактеризованных регуляторных пептидов, которые рассматривают как новый класс пептидных гормонов растений. Связывание лиганда CLE запускает сигнальный каскад, приводящий к подавлению экспрессии WUS, и, как следствие, к ограничению пролиферации клеток в меристеме. Взаимодействие WUS-CLAVATA обеспечивает регуляцию тонкого баланса пролиферации и дифференцировки клеток в меристеме.

Для апикальной меристемы достаточно хорошо изучена роль WUS в регуляции пролиферации клеток. Однако роль паралога гена WUS, гена WOX5, экспрессирующегося в других типах меристем, и механизм его действия практически не исследован. Как показали исследования на модельном объекте, арабидопсисе, продукты генов WUS и WOX5 функционально эквивалентны (Sarkar et al., 2007): оба эти гена экспрессируются в «организующих центрах» меристем и обеспечивают поддержание пула стволовых клеток, стимулируя их пролиферацию и блокируя дифференцировку. На основании сходства выполняемых функций можно предположить схожий механизм действия регуляторов WUS и WOX5. Последние данные свидетельствуют о том, что WOXS может взаимодействовать с CLAVATA-подобной системой в меристеме корня: CLE-пептид (компонент системы CLAV ATA) CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5 в меристеме корня таким же образом, как CLV3 ограничивает область экспрессии гена WUS в меристеме побега (Stahl and Simon, 2009). Участие других компонентов системы CLAV ATA (гомологов рецепторного комплекса CLV1/CLV2) в ограничении экспрессии WOX5 в меристеме корня к настоящему времени не показано.

Таким образом, к настоящему времени накоплены данные о роли генов WOX в «организующих центрах» апикальных меристем, тогда как их роль при развитии других типов меристем - формирующихся у растений de novo, остается неизученной. Одним из примеров формирования такого типа меристемы является органогенез клубенька, образующегося на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями ризобиями. Формирование клубеньков у бобовых растений происходит в результате дедифференцировки и реактивации делений клеток корня. Этот процесс представляет собой уникальную модель для изучения механизмов регуляции деления и дифференцировки клеток у растений. Известны данные о том, что в процесс развития клубенька у бобовых растений может быть вовлечен ген WOX5 (Wan et al., 2005), однако функция и механизм действия гена WOX5 в развитии клубенька остаются неизученными. Кроме того, совсем недавно была показано, что компоненты системы CLAV ATA вовлечены в авторегуляцию клубенькообразования, с помощью которой растение контролирует численность клубеньков. В частности, одним из компонентов системы авторегуляции клубенькообразования является CLAVATAi-подобный ген, функционирующий в побеге у бобовых растений, имеющий большой процент сходства с геном CLAVATA1 у арабидопсиса (Searle et al., 2003). Мутация по этому гену приводит к нарушению системного контроля клубенькообразования, и как следствие - к формированию избыточного количества клубеньков (суперклубенькообразующему фенотипу). Кроме того, совсем недавно у бобовых были выявлены CLE- пептиды, специфичные для клубеньков, которые могут быть вовлечены в авторегуляцию с участием системы CLAV ATA (Mortier et al. 2008;

Okamoto et al. 2009). На основании данных, известных для меристемы побега, можно предположить, что мишенями таких пептидных регуляторов могут являться как раз гены семейства WOX. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о том, что в меристеме корня CLE-пептид CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5.

Использование модели развития клубенька у бобовых растений позволяет изучить роль гена XV0X5 при формировании меристем de novo, и позволяет исследовать взаимосвязь гена WOX5 с компонентами системы CLAV ATA (CLV1-подобный рецептор, CLE-пептиды) при развитии клубенька. Изучение особенностей регуляции экспрессии W0X5 при развитии клубенька позволит разрешить вопрос о существовании общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток в апикальных меристемах и при развитии специализированных органов -клубеньков.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучение роли меристемспецифичного гена WOX5 при развитии клубенька. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька

1.1. Идентификация гена WOX5 у гороха

1.2. Анализ экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании у растений дикого типа

1.3. Локальный анализ экспрессии гена WOX5 с использованием генетических конструкций

1.4. Изучение клубенькообразования у растений с искусственно подавленной экспрессией гена WOX5 путем РНК-интерференции (WOX5-RNAÍ)

2. Изучение взаимодействия WOX5 и комплекса CLAVATA при развитии клубенька

2.1. Изучение экспрессии WOX5 при развитии клубеньков у суперклубенькообразующих мутантов

2.1.1. Количественный анализ экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха.

2.1.2. Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 с нарушением системы CLAVATA

2.2. Анализ влияния CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у растений дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов

2.2.1. Определение последовательности гена, кодирующего специфичный для клубеньков CLE-пептид, у гороха.

2.2.2. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов по генам PsSYM29, PsSYM28 и PsNOD3.

2.2.3. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunrt'3.

Научная новизна диссертационной работы. В ходе выполнения данной работы были идентифицирован ген WOXS у гороха и впервые показано участие гена WOX5 в клубенькообразовании и изучена локализация гена WOX5 на различных этапах развития клубенька у бобовых растений. Изучена взаимосвязь между геном

W0X5 и компонентами системы CLAV ATA (CLVl-подобный рецептор, CLE-пептид) и показана общность механизмов регуляции генов WOX при формировании меристем de novo (клубенькообразование) и в апикальных меристемах растений.

Практическая ценность. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетика развития растений», читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей при работе с трансгенными растениями.

Апробация работы. По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: 9-ый европейский конгресс по азотфиксации Женева, Швейцария, 610 сентября 2010, V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009, Москва, школа-конференция для аспирантов AB-RMS («Агробиотехнология в корневых-микробных системах») в рамках программы NOVA University Network в 2007 (Санкт-Петербург, Россия) и 2008 (Тюне, Дания), 8-ой европейский конгресс по азотфиксации Гент, Бельгия, 30 августа- 3 сентября, конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века». Петрозаводск, XV Конгресс Федерации Европейского сообщества по биологии растений (FESPB), 17-21 июля 2006, Лион, Франция, 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - Наука XXI века". 17-21 апреля 2006, Москва.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (145 источников). Работа изложена на 139 страницах и содержит 43 рисунка и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе использовали горох (Pisum sativum L.) сортов Rondo, Frisson и SGE, а также полученные на основе сорта SGE мутантные линии SGENod'-8 (sym38), SGEFix'-2 (sym33), SGENod"-3 (sym35), мутантные линии P64 (sym.28), P88 (sym29), полученные на основе сорта Frisson, мутантную линию Р79 (nod3), полученную на основе сорта Rondo из коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (http://www.arriam.spb.ru/eng/lab9/collections.html). Кроме того, в работе использовали линию люцерны диплоидной Medicago truncatula Gaertn А17 и мутантную линию люцерны диплоидной sunn-3, любезно предоставленную коллегами из Университета г. Гента (VIB, UGent, Бельгия).

Условия выращивания растений. Семена стерилизовали с использованием концентрированной серной кислоты в течение 10 минут с последующей 5-кратной промывкой в стерильной воде. Семена высевали на 1% водный агар и проращивали в темноте в течение 4-5 дней. В экспериментах по изучению экспрессии генов проростки гороха переносили в горшки с вермикулитом, поливали жидкой средой Jensen (Jensen, 1942). Растения выращивали в фитотроне с режимом день/ночь 16/8 часов, 21°С, относительной влажности 75%, освещенности 30 тыс. люкс. Образцы корней для выделения РНК собирали на 5, 7, 9, 11, 15, 22 дни после инокуляции, корни 3-4 растений на вариант.

Штаммы микроорганизмов. Для инокуляции растений гороха Pisum sativum L использовали штамм Rhizobium leguminosarum bv. vicea CIAM 1026 (Safronova and

Novikova, 1996), полученный из коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (http://www.arriam.spb.ru/eng/lablО/). Для инокуляции растений люцерны М. truncatula использовали штамм Sinorhizobium meliloti 2011.

Клонирование фрагментов генов гороха и редиса осуществляли в клетках Е. coli DH5a. Для трансформации растений использовали штаммы Agrobacterium rhizogenes MSU440 и Arqua.

Векторы и генетические конструкции. Для клонирования фрагментов генов гороха использовали вектор pAL-TA (Евроген, Россия). Клонирование промотора гена осуществляли в векторе pENTR-D/TOPO (Invitrogen, США), с последующим переклонированием в вектор pBGFWS7.0 (VIB, UGent, Бельгия). Фрагмент для РНК-интерференции гена MtWOXS клонировали в векторе pDONR221 (Invitrogen, США) с последующим переклонированием в вектор pK7GWiWG2D (VIB, UGent, Бельгия).

Молекулярно-биологические процедуры. Выделение ДНК из растительного материала проводили с использованием ЦТАБ-буфера по модифицированному протоколу Rogers, Bendich, 1985. РНК выделяли с использованием реагента TRI© (Sigma, США) согласно протоколу производителя или с помощью метода с использованием горячего фенола и LiCl (Pawlowski et al. 1994). Плазмидную ДНК выделяли из ночной культуры клеток E.coli с помощью метода лизиса щелочью (Lee, Rasheed, 1990). Анализ последовательностей ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США) по протоколу производителя. Количественный анализ экспрессии генов проводили путем ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью системы Bio-Rad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием коммерческого набора iQ SYBR Green Supermix. При анализе экспрессии в качестве референсного гена использовали убиквитин (Ubi).

Трансформация растений с помощью Aerobacterium rhizosenes. Трансформацию растений люцерны диплоидной и гороха осуществляли с помощью Agrobacterium rhizogenes по протоколу, описанному Лимпенсом и соавторами (Limpens et al., 2004), путем нанесения суспензии бактерий на срез в области гипокотиля асептических проростков in vitro и культивирования проростков с агробактериями в течение 4-5 дней на твердой питательной среде Farhaeus.

Световая микроскопия. Детекцию активности репортерного гена GUS осуществляли с помощью субстрата X-Gluc (Sigma-Aldrich, США), инкубируя растительные ткани в буфере для GUS-окрашивания (Na-фосфатный буфер, pH 7,0; 0,5 мМ K3Fe(CN)6; 0,5 мМ K4Fe(CN)fi; 0,05% Triton Х-100; 0,5 мМ X-Gluc в диметилформамиде) при 37°С в течение 1,5-2 часов. Срезы тканей растений, заключенных в 4% агарозу, получали с использованием микротома с вибрирующим лезвием HM 650V (Microm International GmbH). Микроскопический анализ проводили с использованием микроскопа LSM 510 META NLO (Carl Zeiss). Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе. Для статистической обработки данных при анализе количества образующихся клубеньков использовали программу STATISTICA 6. Для выравнивания последовательностей нуклеиновых кислот применяли программу AlignX, использующую алгоритм Clustal W (Thompson et al., 1994), из пакета Vector NTI Advance 10 (InforMax, Inc http://www.informaxinc.com). Количественную оценку экспрессии анализируемых генов проводили с помощью программы BioRad IQ5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение экспрессии гена \VOX5 при развитии клубенька Идентификация гена \VOX5 у гороха

На основании взятых из базы данных СепВапк нуклеотидных последовательностей гена №0X5 Arabídopsis tha.lia.na (СепВапк АУ251396) и МесЧса§о ¡гипсаш1а (СепВапк ВР649819) были подобраны вырожденные праймеры к консервативным участкам, которые использовали для получения продукта на матрице кДНК гороха. Проведенный анализ выявил 88,3% сходства фрагмента кДНК с соответствующей последовательностью люцерны диплоидной Medicago [гипсаШ1а.

Анализ экспрессии гена \VOX5 при развитии клубеньков у гороха

Анализ экспрессии выявленного нами гена Ря№ОХ5 в различных органах гороха показал, что этот ген экспрессируется в кончике корня гороха, слабая экспрессия гена Р$№ОХ5 наблюдалась в тканях зрелого клубенька, однако его экспрессия отсутствовала в побеговой части растений (листья, стебли).

Экспрессия этого гена в тканях корня у гороха дикого типа усиливалась в ответ на инокуляцию ризобиями. Был проведен анализ экспрессии Рх№ОХ5 у мутантов гороха с нарушением развития примордиев/меристемы клубеньков -БСЕМосГ-З (¡ут35) и 8(¿ут38). У мутанта по гену Рз5УМ35 наблюдается ранний блок в развитии клубеньков: не происходит активации делений клеток коры, тогда как у мутанта хут38 образуются очень редкие примордии клубеньков, но меристема не формируется. У мутантов £уш35 и зут38 экспрессия гена PsWOX5 в ответ на инокуляцию нами не была выявлена. При этом у дикого типа и у мутанта уутЗЗ, у которого меристема клубенька формируется, но происходят нарушения на последующих этапах клубенькообразования, наблюдали экспрессию Р$У/ОХ5 в ответ на инокуляцию (см. рис. 1).

Анализ экспрессии Р$У/ОХ5 был проведен также на различных сроках после инокуляции ризобиями. В целом, после инокуляции уровень экспрессии РяХУОХЗ возрастал, достигал максимума к 9-11 дню после инокуляции (дпи), затем на 15 дпи происходило снижение экспрессии гена РзУ/ОХ5 (см. рис. 2). В неинокулированных контрольных образцах экспрессию гена РзУ/ОХ5 не наблюдали.

Относит, ед.

ivf sym38 sym3S sym33

Рисунок 1. Анализ экспрессии Рх\УОХ5 в корнях гороха дикого типа (\\1) и мутантов вут35, ьутЗН, яутЗЗ на 7 день после инокуляции ризобиями (7 дпи)

Полученные результаты указывают на участие гена У/ОХ5 в развитии симбиотического клубенька.

дни после инокуляции

Рисунок 2. Количественный анализ динамики экспрессии PsWOX5 при развитии клубенька гороха линии Frisson методом ОТ-ПЦР в реальном

Локальный анализ активности гена \V0X5 при органогенезе клубеньков

Подтверждением участия гена \VOX5 в развитии клубенька стал локальный анализ его экспрессии у растений, трансформированных генетической конструкцией, содержащей промотор гена люцерны 1УОХ5, соединенный с репортерным геном бета-глюкоронидазы (рМ1Ц?ОХ5::Си5). Полученная нами конструкция рМг]¥ОХ5::С1/5 оказалась эффективной для локального анализа экспрессии \УОХ5 как у люцерны, так и у гороха.

Рисунок 3. Локализация экспрессии гена \VOX5 на различных этапах развития клубенька люцерны

Установлено, что ген I¥ОХ5 начинает экспрессироваться на ранних этапах развития клубенька - при первых кортикальных делениях, и его экспрессия связана с зоной пролиферирующих клеток.

На последующих этапах клубенькообразования экспрессия гена наблюдается в делящихся клетках развивающегося примордия клубенька (рисунок 3, А. В). По мере развития клубенька, зона экспрессии \VOX5 смещается к периферической области клубенька (рис. 3, С). На более поздних этапах развития клубенька экспрессия \VOX5 сохраняется лишь в области окончаний проводящих пучков: в инициальных клетках проводящих пучков (рис. 3, О). На рис. ЗЕ представлена схема, иллюстрирующая локализацию экспрессии гена \VOX5 на различных этапах развития клубенька.

Данные по локализации экспрессии гена 1УОХ5 на различных этапах развития клубенька согласуются с данными по динамике экспрессии №0X5, полученными с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Локализация экспрессии \У0Х5 в клетках примордия клубенька согласуется с высоким уровнем экспрессии этого гена, определенном с помощью метода ОТ-ПЦР, на 5-11 дпи -сроках, когда происходит закладка примордиев клубеньков. Корреляция этих данных подтверждает наше предположение о важной роли транскрипционного фактора \VOX5 именно на ранних этапах развития клубенька - в процессе формирования примордия/меристемы клубенька. Наблюдаемое нами снижение экспрессии гена №0X5 на поздних этапах развития клубенька, выявленной с помощью количественной ОТ-ПЦР. соответствует ограничению зоны экспрессии гена \У0X5 в развивающемся клубеньке областями окончаний проводящих пучков.

Изучение клубенькообразования у растений с искусственным подавлением экспрессии \VOX5 (\VOX5-RNAi)

Для окончательного подтверждения роли WOX5 в клубенькообразовании, было проанализировано влияние подавления экспрессии гена \VOX5 на процесс формирования клубеньков. Для этого нами была получена конструкция для подавления активности WOX5 с помощью метода РНК-интереференции.

Как показал количественный анализ экспрессии гена IV0X5, в трансгенных корнях, содержащих конструкцию WOX5-RNAí, экспрессия гена \VOX5 была снижена в 1,7 раз, по сравнению с контролем (ОШ-ОЕ) (рис. 4).

Относит, ед. Кол-во клубеньков

GUS-OE \VOX5-RNAi

Рисунок 4. Экспрессия гена \VOX5 в корнях растений люцерны,

трансформированных конструкцией (Ш8-ОЕ (контроль) и \VOX5-RNAi

СШ-ОЕ \VOX5-RNAi

Рисунок 5. Количество клубеньков на корнях растений люцерны,

трансформированных конструкцией вШ-ОЕ (контроль) и \VOX5-RNAi

Представлены средние значения ± 95% ДИ.

Вместе с этим, на трансгенных корнях, содержащих конструкцию \VOX5-RNAi, наблюдали статистически значимое (Р<0,05) снижение клубенькообразования, по сравнению с контролем (снижение в 2,4 раза) (рис. 5). Это является прямым доказательством роли гена \VOX5 в контроле развития клубеньков.

2. Изучение взаимодействия гена \VOX5 и компонентов системы СЬАУАТА при

развитии клубенька

Количественный анализ экспрессии PsWOX5 у суперклубепъкообразующих

мутантов гороха

Следующим этапом работы было исследование механизмов действия транскрипционного фактора WOX5 при развитии клубенька и его взаимодействия с компонентами системы CLAVATA (CLV). Может ли WOX5 являться мишенью системы CLV, вовлеченной в авторегуляцию? Подходящей моделью для изучения взаимосвязи гена WOX5 и системы CLV при развитии клубенька являются суперклубенькообразующие мутанты с нарушением авторегуляции клубенькообразования. В авторегуляцию вовлечена CLV-1 подобная киназа, компонент побеговой системы авторегуляции, которая дистанционно (long-distance) подавляет формирование новых клубеньков, таким образом регулируя их численность. У гороха известно несколько суперклубенькообразующих мутантов, в том числе по генам PsSYM29, PsSYM28, PsNOD3. Суперклубенькообразующий мутант

гороха Р88 (sym29) имеет мутацию именно в гене С/Л7-/-подобной киназы. Другой мутант гороха - Р64 (sym28), также имеет нарушение в побеговой системе авторегуляции, ген PsSym28 еще не клонирован, но фенотипические особенности мутанта позволяют предположить, что он также может быть компонентом системы CLV (например, CLV2): у мутанта наблюдаются характерные для мутантов по генам CLV у арабидопсиса фасциации стебля (Sagan and Duc, 1996). Уникальным мутантом является мутант Р79 (nod3), имеющий нарушения в корневой системе авторегуляции (что было показано методом прививок). Такие мутанты редки у бобовых растений и на сегодняшний день еще не клонирован ни один ген, вовлеченный в корневую систему авторегуляции.

Был проведен анализ экспрессии гена PsWOX5 у суперклубенькообразукнцих мутантов sym28, xvm29 и nod3 на различных сроках после инокуляции с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (см. рис. 6). У мутантов максимум экспрессии наблюдается раньше (7-9 дпи), чем у дикого типа (11 дпи), кроме того у мутантов не наблюдается такого значительного снижения экспрессии PsWOX5 к 15 дпи, как у растений дикого типа (линия Frisson: дикий тип - в 6,2 раза, sym29 ~ в 2,5 раза; sym28 ~ в 1,3/1,7 раза; линия Rondo: дикий тип - в 2 раза, nod3 в 1,2/1,3 раза). У Rondo наблюдается другой характер динамики экспрессии PsWOX5 в ходе развития клубенька, по сравнению с линией Frisson.

Относит, ед. Относит, ед.

—ü—Frisson —sym29 —ж— sym28

—с— Rondo --a—notíl

Рисунок 6. Количественный анализ экспрессии гена PsWOX5 у

суперклубенькообразующих мутантов sym28, sym29 и nod3 методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Кроме того, у мутанта nod3 не наблюдалось такого значительного снижения уровня экспрессии PsWOX5, по сравнению с максимумом (снижение в —1,3 раза), как у других суперклубенькообразующих мутантов (sym29 ~ в 2,5 раза; sym28 ~ в 1,7 раз) (см. рисунок 6).

Таким образом, с помощью количественной ОТ-ПЦР были выявлены различия в динамике экспрессии гена PsWOXS у суперклубенькообразующих мутантов sym28, syrn.29 и nod3 и растений дикого типа. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между изменениями в системе CLAVATA и экспрессией ее предположительной мишени - гена WOX5.

Количественный анализ выявил более высокий уровень экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании у суперклубенькообразующих мутантов гороха, по

сравнению с растениями дикого типа. Одной из причин таких различий может быть большая численность примордиев/клубеньков на корнях у суперклубенькообразующих мутантов. Но, кроме того, причиной более высокого уровня экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов может также быть локальное изменение экспрессии этого гена в пределах одного примордия/клубенька. Для ответа на этот вопрос мы изучили локализацию экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-З, несущего мутацию в CLV1-подобном гене - ортологе SYM29 гороха.

Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-З с нарушением системы CLAVATA '

Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-З и растений люцерны дикого типа А17, растения трансформировали штаммом А. rhizogenes, содержащим конструкцию pMiWOX5::GUS. После инокуляции трансгенных корней таких растений штаммом ризобий S.meliloti 2011 исследовали локализацию активности GUS в образовавшихся примордиях/клубеньках на различных сроках (9, 12, 14, 21 и 27 дпи).

У суперклубенькообразующего мутанта sunn-З активность GUS в пределах примордия/клубенька была значительно более высокой, чем у растений дикого типа на всех проанализированных стадиях развития клубенька (см. рис. 7).

Рисунок 7. Локальный анализ экспрессии \VOX5 (рМIП'ОХ5::С6Л') в клубеньке люцерны дикого типа (А1-АЗ) и мутанта sunn-3 (В1-ВЗ) на 12 (А1, В1), 14 (А2, В2) и 21 (АЗ, ВЗ) день после инокуляции (толщина срезов 50 мкм)

В то время как у дикого типа активность \VOX5 в клетках формирующегося клубенька смещалась к периферии и сохранялась в основном в области проводящих пучков, у мутанта 5ипп-3 активность 1УОХ5 оставалась на очень высоком уровне и наблюдалась во всей внутренней зоне примордия клубенька. На более поздних этапах развития клубенька (к 21 дпи) активность \VOX5 у дикого типа сохранялась только в

области окончания проводящих пучков, тогда как мутанта ¡ипп-З зона активности IV0X5 смещалась к апикальной части клубенька (в область меристемы) и оставалась на значительно более высоком уровне, чем в клубеньках дикого типа.

Сравнительный анализ локализации экспрессии гена IV0X5 при развитии клубенька у суперклубенькообразующего мутанта люцерны ¡ипп-З и растений люцерны дикого типа А17 показал, что у мутантов яипп-З (несущих мутацию в С1У1-подобном гене) значительно увеличен уровень экспрессии \VOX5 и область его экспрессии в пределах примордия/клубенька, по сравнению с растениями дикого типа.

Полученный результат подтверждает высказанное ранее предположение о том, что экспрессия гена И'0X5 при развитии клубенька регулируется СЬУ1-подобным геном, причем ОЛЧ-подобный ген регулирует экспрессию IV0X5 не только системно (у мутантов по СЬУ1-подобному гену увеличено число сайтов закладки клубеньков), но и локально (поскольку у мутантов по СЬУ1-подобному гену значительно увеличен уровень экспрессии УУ0X5 в примордиях/клубеньках, по сравнению с диким типом).

Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-nenmuda на клубенькообразовапие гороха дикого типа

Было установлено, что ген WOX5 экспрессируется в клубеньках и является мишенью действия CLAVATA-подобной системы, работающей в побеге. Таким образом, в данном случае система CLV должна дистанционно подавлять экспрессию гена WOX5. Это отличает данную систему от регуляции экспрессии гена WOX в ПАМ, где компоненты системы CLAVATA и ее мишень - ген WUS - экспрессируюгся в одной ткани. Вместе с этим известно, что лигандом CLAVATA в ПАМ является CLE-пептид. У бобовых растений также был обнаружен специфичный для клубенькообразования CLE-пептид, регулирующий развитие клубеньков, который экспрессируется в меристеме клубенька (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Было

Кол-во клубеньков

GUS-OE CtE-OE GUS-OE CIE-OE FribSon Rondo

Рисунок 8. Влияние сверхэкспрессии гена MtCLE13 на количество образующихся клубеньков (CLE-OE - сверхэкспрессия гена MtCLE13, GUS-OE -сверхэкспрессия гена бета-гаюкоронидазы, контроль) Представлены средние значения ± 95% ДИ.

высказано предположение о том, что такой СЕЕ-пептид, специфично образующийся в клубеньках, способен

транспортироваться в побег и связываться со своим предполагаемым рецептором -компонентом СЬУ-подобной системы (ОкатоШ е! а1. 2009).

В нашей работе была исследована взаимосвязь между действием СЕЕ-пептидов,

клубенькообразованием и

экспрессией И'ОХ5. В частности, было изучено влияние сверхэкспрессии гена,

кодирующего специфичный на клубенькообразования СЬЕ-пептид (М1СЕЕ13), на проявление

суперклубенькообразующего фенотипа у мутантов гороха. У растений дикого типа Rondo и Frisson, трансформированных конструкциями CLE-OE или GUS-OE (контроль), проводили подсчет количества клубеньков на растение (рис. 8).

Сверхэкспрессия гена MtCLE13, кодирующего специфичный для клубенькообразования CLE-пептид, приводит к системному подавлению клубенькообразования у растений дикого типа (Frisson и Rondo). Таким образом, продемонстрировано, что ген люцерны MtCLEl3 функционирует в геноме близкородственного вида, гороха посевного, и оказывает влияние на процесс клубенькообразования у гороха.

Как известно по литературным данным, аналогичный эффект на процесс клубенькообразования у дикого типа оказывала сверхэкспрессия CLE-пептида у люцерны (MICLE13) и лядвенца (LjCLE-RSI, LjCLE-RS2) (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010).

Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на фенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха с нарушением побеговой системы авторегуляции Р88 (sym 29) и Р64 (sym 28) и с нарушением корневой системы авторегуляции Р79 (nod3)

Был проведен анализ влияния сверхэкспрессии MtCLEI3 на фенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym.28. Мутант sym29 имеет нарушения в CLW-подобном гене. Как предполагается в литературе на основании фенотипа мутанта sym28, в частности, наличия фасциации стебля (Sagan and Duc, 1996), мутант sym28 также содержит мутацию в CLV-подобном гене, возможно, кодирующем CLV2-no,io6nyfo киназу (Li et al., 2009). На основании результатов экспериментов с прививками известно, что мутант sym28 характеризуется нарушениями в побеговой системе авторегуляции (Sagan and Duc, 1996). Можно предположить, что продукт гена PsSYM28 (предположительно, CLV2-noflo6Hbiñ белок) функционирует в побеге совместно с CLV1-подобной киназой, кодируемой геном PsSym29, формируя СЕУ1/СЕУ2-подобный комплекс, по аналогии с комплексом CLV1/CLV2 в меристеме побега.

Если предположение о том, что CLE-пептид способен передвигаться в побег и взаимодействовать с CLAVATA-подобным рецепторным комплексом в побеге верно, то у мутантов с нарушением побеговой системы CLAVATA должна быть нарушена рецепция CLE - и следовательно, у таких мутантов сверхэкспрессия CLE (при которой CLE-пептид экспрессируется не только в клубеньках, но и в побеге) не должна оказывать ингибирующий эффект на клубенькообразование. Действительно, в отличие от растений дикого типа, сверхэкспрессия MtCLEl3 (CLE-OE) не оказывала никакого эффекта на клубенькообразование у суперклубенькообразующих мутантов гороха. Корни трансформированных растений характеризовались суперклубенькообразующим фенотипом как в контрольном варианте (GUS-OE), так и при сверхэкспрессии MtCLE13 (CLE-OE). Как показано на рис. 9, при сверхэкспрессии MtCLE13 трансгенные корни мутантов гороха sym29 и sym28, содержащих конструкцию CLE-OE (о чем свидетельствует свечение репортерного белка GFP (рис. 9j А2,В2), сохраняют суперклубенькообразующий фенотип. У суперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28 сверхэкспрессия специфичного для клубенькообразования CLE-пептида не приводила к изменению суперклубенькообразующего фенотипа. Отсутствие подавления

клубенькообразования у мутантов sym28 и sym29 при сверхэкспрессии CLE

подтверждает предположение о том, что CLV-система побега может участвовать либо непосредственно в рецепции CLE-пептида, либо в восприятии сигнала от CLE-пептида для подавления клубенькообразования.

Данные об отсутствии влияния сверхэкспрессии MtCLEI3 на суперклубенькообразующий фенотип мутанта sym29, несущего мутацию в CLV1-

подобном гене, согласуются с известными ранее в литературе данными, полученными для мутантов лядвенца и люцерны. несущих мутации в ортологичных генах (LjHARI, MtSUNN, соответственно) (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Это подтверждает наличие сходных механизмов авторегуляции клубенькообразования с участием CLE-пептидов у различных видов бобовых растений.

Особый интерес представляло изучение влияние сверхэкспрессии MtCLE13 на фенотип мутанта nod3 - у которого сохраняется функционирующая CLAVATA-подобная система в побеге - но нарушен корневой компонент авторегуляции. Как показано на рис. 9 С1,С2, при сверхэкспрессии MtCLE13 трансгенные корни мутанта nod3. содержащие конструкцию CLE-OE (подтверждением трансгенности корней является свечение репортерного белка GFP (рис. 9, С2)) сохраняют суперклубенькообразующий фенотип. Таким образом, ингибирующий сигнал от CLE-пептида не оказывает действия на процесс клубенькообразования у мутанта nod3.

В связи с тем. что у мутанта nod3 нарушена корневая система авторегуляции, мы предположили, что нарушения в системе авторегуляции могут происходить на этапе: 1) восприятия сигнала от CLE-пептида на уровне корня, в случае если CLE-пептид клубеньков не передвигается в побег, а взаимодействует с рецепторной системой (CLV-подобной), функционирующей в корне - одним из компонентов которой может являться продукт гена PsNOD3\ либо 2) передачи сигнала от CLE-пептидов из клубеньков в побег, в случае, если CLE-пептид сам непосредственно не является лигандом CLV-подобного рецепторного комплекса в побеге (компонентом которого является CLV1 -подобная киназа MtSUNN/PsSym29),

А1 А2

В1 В2

С, / С2

Рисунок 9. Суперклубенькообразующий фенотип трансгенных корней мутантов sym 29 (Al, А2), sym 28 (Bl, B2) и nod3 (Cl, C2) со сверхэкспрсссией MtCLE13

(CLE-OE).

Анализ влияния сверхэкспрессии СЬЕ-пептида на экспрессию гена \VOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны шпп-З

Нами было выявлено, что СЕЕ-пептид подавляет клубенькообразование. и для его действия необходимы две системы - 1) СЕУ-подобная система- компонент побеговой системы авторегуляции, и 2) корневая система авторегуляции. Остается нерешенным вопрос - действует ли СЕЕ-пептид на экспрессию гена IV0X5 при клубенькообразовании?

Относит, ед. "Г

GUS-OE CLE-OE

Рисунок 10. Экспрессия гена MtW0X5 у мутанта sunn-З при сверхэкспрессии гена MICLE13 (CLE-OE) и гена GUS (GUS-OE -контроль)на 5 дпи

Для изучения влияния CLE-пептида на экспрессию гена WOX5 был проведен анализ экспрессии гена WOX5 в трансгенных корнях люцерны со сверхэкспрессией MtCLE13. Поскольку у растений люцерны дикого типа сверхэкспрессия MtCLE13 полностью подавляла процесс клубенькообразования, мы не смогли проверить эффект сверхэкспрессии MICLE13 на экспрессию WOX5 при клубенькообразовании с использованием растений дикого типа. Напротив, у мутанта sunn-З на трансгенных корнях со сверхэкспрессией MtCLE13 клубенькообразование не подавлялось, поэтому анализ влияния CLE-пептидов на экспрессию WOX5 при клубенькообразовании проводили с

использованием этих мутантов. Кроме того, изучение влияния сверхэкспрессии MtCLE13 на экспрессию WOX5 у мутанта, содержащего мутацию в CLVl-подобном гене, позволяет понять, необходима ли функционирующая CLV-подобная система для регуляции экспрессии WOX5 с участием CLE-пептида. С этой целью было изучено влияние сверхэкспрессии гена MtCLE13 (35S::MtCLEI3) на экспрессию гена WOX5 у мутанта sunn-З. Для этого с помощью штамма A. rhizogenes Arqua, несущего конструкцию 35S::MtCLE13, трансформировали растения sunn-З. В качестве контроля проводили также трансформацию растений конструкцией GUS-OE. Наличие сверхэкспрессии MtCLE13 в трансгенных корнях, содержащих конструкцию 35S-.:MtCLEI3, было подтверждено с помощью количественного анализа экспрессии. У мутанта sunn-З в трансгенных корнях со сверхэкспрессией MtCLE13 мы наблюдали снижение экспрессии WOX5 в 3,25 раза, по сравнению с контролем (GUS-OE) (см. рис. 10). Таким образом, у мутанта sunn-З, имеющего нарушения в CLAVATA комплексе побега, по у которого при этом сохраняется нормально функционирующая корневая система авторегуляции, происходит частичное подавление экспрессии гена MtWOX5. Этот факт свидетельствует о том, что помимо CLV-подобной системы, функционирующей в побеге, которая нарушена у мутанта sunn-З, в восприятии сигнала от CLE-пептида задействованы другие рецепторные системы. Мы предполагаем, что такой рецепторной системой, участвующей в восприятии CLE-пептида, может быть другая CLAVATA-рецепторная система, функционирующая в корнях растений.

Таким образом, в совокупности, наши эксперименты подтверждают участие двух систем - CLV-подобной побеговой системы и корневой - в регуляции клубенькообразования, восприятии сигнала от CLE-пептида и подавлении экспрессии WOX5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленные особенности регуляции экспрессии №0X5 при клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов И'ОХ в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа - клубенька бобовых растений. Экспрессия гена №0X5 при клубенькообразовании также регулируется

СЬАУАТА-подобной системой и СЬЕ-пептидом, аналогично гомологу гена \VOX5-гену И'ОД работающему в побеге. Однако особенность регуляции экспрессии гена №0X5 при клубенькообразовании заключается в том, что она осуществляется как системно, так и локально с участием двух систем: побеговой (СЬУ-подобная система, функционирующая в побеге) и корневой системы авторегуляции.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлен ген WOX5 у гороха Pisum sativum L. Показано, что ген PsWOX5 вовлечен в контроль развития клубенька бобовых растений, что установлено на основании анализа динамики его экспрессии при клубенькообразовании и экспериментов по РНК-интерференции.

2. Экспрессия гена WOX5 регулируется CLV-подобной системой при клубенькообразовании как системно (регулируется число сайтов в тканях корня, в которых активируется экспрессия гена WOX5), так и локально (в переделах отдельного развивающегося клубенька).

3. Формирование клубеньков у гороха P. sativum регулируется с участием CLE-пептида, при этом для проявления ингибирующего действия CLE-пептида на клубенькообразование необходимы как побеговая система авторегуляции, компоненты которой кодируются генами PsSYM29 (CLVI-подобный рецептор) и PsSYM28, так и корневая система авторегуляции, компонентом которой является продукт гена PsNOD3.

4. Анализ действия CLE-пептида у близкородственного вида Medicago truncatula показал, что экспрессия гена WOX5 при клубенькообразовании также регулируется с участием двух систем авторегуляции - побеговой, компонентом которой является CLVl-подобный рецептор, кодируемый геном М. truncatula SUNN, и корневой.

5. Выявленные особенности регуляции экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов WOX в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа - клубенька бобовых растений.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Л. А. Лутова, Е. А. Долгих, И.Е. Додуева, М. А. Осипова, Е. Л. Ильина. Изучение системного контроля деления и дифференцировки клеток растений на примере опухолевого роста у редиса// Генетика. 2008. Т. 44, N 8. С. 1075-1083.

2. Осипова М.А., Долгих Е.А., Лутова Л.А. Роль транскрипционных факторов WOX и KNOX в развитии растений и опухолеобразовании // Экологическая генетика, 2006, T.IV, Вып. 4. стр. 3-9

3. Dolgikh Е.А., Leppyanen I.V., Osipova M.A., Tikhonovich I.A. Role of signal exchange in control of Rhizobium - legume symbiosis specificity. Ecological genetics. 2008. V. 6, N 2. P. 27-34.

Тезисы конференций:

1. Osipova М.А., Lutova L.A. and Dolgikh E.A. Role of WOX5 gene in nodule organogenesis. 9-th European Nitrogen Fixation Conference. Geneva, Switzerland. September 6-10,2010. P.103.

2. Осипова M.A. Изучение роли меристем-специфичных генов в регуляции клеточных делений в норме и при аномалиях развития. Сборник материалов XIV Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург, 2009. С.76.

3. Осипова М.А., Долгих Е.А., Лутова Л.А. Гены, контролирующие развитие клубенька гороха // Сборник материалов V Съезда ВОГИС. 21-28 июня, 2009. 4.1. С. 152.

4. Osipova М.А., Lutova L.A. and Dolgikh E.A. Genes Working out an approach to study factors involved in nodule meristem regulation // AB-RMS Conference. 2008. November 30 - December 5. P. 15.

5. Leppyanen I.V., Osipova M.A., Lutova L.A., Dolgikh E.A. Genes involved in nodule meristem formation. 8-th European Nitrogen Fixation Conference. Gent, Belgium. August 30 - September 3, 2008. P. 170.

6. Осипова M.A., Долгих E.A., Лутова Л.А. Меристем-специфичные гены в развитии клубенька гороха. Сборник материалов конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века". Петрозаводск, Россия. 23-26 сентября, 2008. Ч. 1. С. 288-289.

Подписано в печать 01.11.2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1782.

Отпечатано в ООО «Издательство "J1EMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Осипова, Мария Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Регуляция пролиферации клеток в регулярных (апикальных) меристемах растений.

1.1. Факторы, регулирующие пролиферацию клеток у растений.

1.2. Меристемы растений, стволовые клетки и принцип организации ниши стволовых клеток.

1.3. Транскрипционные факторы семейства WOX и их роль в развитии растений.

1.3.1. Ген WUS в регуляции активности меристемы побега.

1.3.1.1. Система WUS-CLV и ее роль в поддержании стволовых клеток растений.

1.3.1.2. Взаимодействие WJJS с цитокинином в меристеме побега.

1.3.2. Роль гена WOX5 в меристеме корня.

1.3.2.1. Покоящийся центр и стволовые клетки в меристеме корня.

1.3.2.2. Взаимодействие гена WOX5 и гормонов в меристеме корня.

1.3.3. Другие гены семейства WOXи их роль в развитии растений.

1.3.4. Роль рецепторных CLV1-подобных киназ и CLE-пептидов в развитии растений.

2. Регуляция пролиферации клеток в меристемах, образующихся de novo в постэмбриогенезе.

2.1. Развитие бокового корня.

2.2. Развитие азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений1.

2.2.1. Органогенез симбиотического клубенька.

2.2.2. Молекулярно-генетический контроль развития симбиоза.

2.2.3. Роль цитокинина и ауксина в развитии клубенька.

2.2.4. Авторегуляция клубенькообразования.

2.2.5. Связь программы развития клубенька и бокового корня.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гена WOX5 в контроле пролиферации и дифференцировки клеток на модели органогенеза клубеньков бобовых растений"

Изучение регуляции пролиферации и дифференцировки клеток является , важной фундаментальной задачей биологии развития. В силу консервативности механизмов, регулирующих пролиферацию клеток у эукариот, многие данные о регуляции клеточных делений, полученные для животных, впоследствии проверяются и подтверждаются для растений. У животных лишь ограниченное число клеток взрослого организма способно делиться и обеспечивать формирование тканей и органов, эти клетки называют стволовыми. В отличие от животных, практически все живые клетки растений являются тотипотентными, и при определенных условиях способны дать начало целому организму. При этом активная пролиферация клеток свойственна особому типу клеток растений — клеткам меристем. У растений выделяют «регулярные» меристемы (такие как апикальные меристемы побега и корня) и «нерегулярные» (или дополнительные) меристемы, формирующиеся de novo при определенных условиях. К «нерегулярным» меристемам, можно отнести, например, меристемы специализированных органов, таких как клубеньки, образующиеся на корнях бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями.

Для обеспечения правильного развития растений необходима тонкая регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах. Пролиферация клеток растений регулируется различными системами. В первую очередь, непосредственными регуляторами пролиферации клеток являются комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ, кроме того, важную роль в регуляции пролиферации клеток играют гормоны, такие как ауксин и цитокинин. В последние годы было также показано, что ключевыми генами, определяющими баланс пролиферирующих клеток в меристеме побега, являются гены, кодирующие транскрипционные факторы. Среди них особое место занимают гены семейства WOX (от WUSCHEL-related homeobox), кодирующие транскрипционные факторы с гомеодоменом. Предполагается, что транскрипционные факторы WOX являются ключевыми регуляторами пролиферации и дифференцировки клеток в так называемых «организующих центрах» апикальных меристем, функция которых заключается в стимулировании пролиферации прилежащих клеток и предотвращении их дифференцировки. Так, в о р ган изу ю щем центре меристемы побега экспрессируется ген WUS (WUSCHEL), а в организующем центре меристемы корня (его называют «покоящимся» центром) - его паралог, ген WOX5. Было показано, что активность именно генов WOX (WUS и WOX5) необходима для предотвращения дифференцировки и стимулирования пролиферации клеток меристемы (меристемы побега и корня, соответственно). Также известно, что гены семейства WOX экспрессируются в меристемах специализированных органов (например, при морфогенезе клубеньков бобовых растений при симбиозе с бактериями ризобиями), однако их роль в формировании подобных меристем практически не изучена. Большинство данных о механизмах, за счет которых гены WOX регулируют пролиферацию клеток, получено для апикальной меристемы побега. В меристеме побега WUS вовлечен как в локальную, так и в системную регуляцию пролиферации клеток. Известно, что в меристеме побега такая регуляция осуществляется через взаимодействие транскрипционного фактора WUS с системой CLAV ATA и компонентами каскада сигнальной трансдукции, регулируемой цитокинином. Транскрипционный фактор WUS стимулирует деления клеток, непосредственно регулируя экспрессию генов, кодирующих регуляторы цитокининового сигнального каскада ARR (Arabidopsis Response Regulators) A-типа, обеспечивая локальное усиление действия цитокинина в тканях — гормона, стимулирующего пролиферацию (Leibfried et. al. 2005). В' то же время ген WUS взаимодействует с системой CLAVATA, включающей гетеродимерный рецептор CLV1/CLV2, с которым связывается^ пептидный лиганд CLV3 — член семейства CLE-пептидов, недавно охарактеризованных регуляторных пептидов, которые рассматривают как новый класс пептидных гормонов растений. Связывание лиганда CLE запускает сигнальный каскад, приводящий к подавлению экспрессии WUS, и, как следствие, к ограничению пролиферации клеток в меристеме. Взаимодействие WUS-CLAVATA обеспечивает регуляцию тонкого баланса пролиферации и дифференцировки клеток в меристеме.

Для апикальной меристемы достаточно хорошо изучена роль WUS в регуляции пролиферации клеток. Однако роль паралога гена WUS, гена WOX5, экспрессирующегося в других типах меристем, и механизм его действия практически не исследован. Как показали исследования на модельном объекте, арабидопсисе, продукты генов WUS и WOX5 функционально эквивалентны (Sarkar et al., 2007): оба эти гена экспрессируются в «организующих центрах» меристем и обеспечивают поддержание пула стволовых клеток, стимулируя их пролиферацию и блокируя дифференцировку. На основании сходства выполняемых функций можно предположить схожий механизм действия регуляторов WUS и WOX5. Последние данные свидетельствуют о том, что WOX5 может взаимодействовать с CLAVATA-подобной системой в меристеме корня: CLE-пептид (компонент системы CLAVATA) CLE40 ограничивает область экспрессии WOX5 в меристеме корня таким же образом, как CLV3 ограничивает область экспрессии гена WUS в меристеме побега (Stahl and Simon, 2009). Участие других компонентов системы CLAVATA (гомологов рецепторного комплекса CLV1/CLV2) в ограничении экспрессии WOX5 в меристеме корня к настоящему времени не показано.

Таким образом, к настоящему времени накоплены данные о роли генов WOX «организующих центрах» апикальных меристем, тогда как их роль при развитии других типов меристем - формирующихся у растений de novo остается неизученной. Одним из примеров формирования такого типа меристемы является органогенез клубенька, образующегося на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями; ризобиями. Формирование'клубеньков; у бобовых растений происходит в результате дедифференцировки и реактивации делений; клеток корня. Этот процесс представляет собой уникальную модель .для ; изучения: механизмов; регуляции, деления и дифференцировки клеток у растений. Известны данные о том, что в- процесс развития клубенька может быть, вовлечен ген WOX5, однако функция и механизм; действия гена? WOX5 в развитии клубенька остаются неизученными. Кроме того ■. совсем недавно было показано;.что компоненты* системы CLAVATA вовлечены в авторегуляцию клубенькообразования, с помощью которой растение: контролирует численность клубеньков. В частности, одним? из компонентов системы^ авторегуляции клубенькообразования является , CLA VA ГЛ/-подобный ген, функционирующий в побеге у бобовых растений; имеющий; большой процент сходства; с. геном CLAVATA 1 у арабидопсиса (Searlë et: all, 2003); Мутация по этому гену приводит к нарушению- системного контроля: клубенькообразования; и: как следствие * — к формированию избыточного» количества клубеньков (суперклубенькообразующему фенотипу): Кроме того; совсем недавно у бобовых были выявлены CEE- пептиды; специфичные для?клубеньков, которые могут быть вовлечены в авторегуляцию с участием системы CLAVATA (Mortier et al. 2008; Okamoto et ait 2009)} На«основании данных, известных для меристемы; побега, можно: предположить, что мишенями таких пептидных, регуляторов могут являться как раз гены семейства WOX. В пользу такого предположения свидетельствуют данные о том, что в меристеме корня CLE-пептид CLE40 ограничивает область, экспрессии WOX5.

Использование модели развития клубенька у бобовых растений позволяет изучить роль гена WOX5 при формировании меристем de novo, и позволяет исследовать взаимосвязь гена WOX5 с компонентами системы CLAVATA (CLV1 -подобный рецептор, CLE-пептиды) при развитии клубенька. Изучение особенностей регуляции экспрессии WOX5 при развитии клубенька позволит разрешить вопрос о существовании общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток в апикальных меристемах и при развитии специализированных органов — клубеньков.

Цель и задачи работы

Цель работы - изучение роли меристемспецифичного гена WOX5 при развитии клубенька. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубенька

1.1. Идентификация гена WOX5 у гороха

1.2. Анализ экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании у растений дикого типа

1.3. Локальный анализ экспрессии гена WOX5 с использованием генетических конструкций

1.4. Изучение клубенькообразования у растений с искусственно подавленной экспрессией гена WOX5 путем РНК-интерференции (WOX5-RNAi)

2. Изучение взаимодействия WOX5 и комплекса CLAVATA при развитии клубенька

2.1. Изучение экспрессии WOX5 при развитии клубеньков у суперклубенькообразующих мутантов 2.1.1. Количественный анализ экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов гороха

2.1.2. Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у люцерны дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-З с нарушением системы CLAVATA

2.2. Анализ влияния CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у растений дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов

2.2.1. Определение последовательности гена, кодирующего специфичный для клубеньков CLE-пептид, у гороха

2.2.2. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептидов на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов sym28, sym29 и nod3 t

2.2.3. Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразование и экспрессию гена WOX5 у суперклубенькообразующего мутанта люцерны sunn-3.

Научная новизна диссертационной работы

В ходе выполнения данной работы был идентифицирован ген WOX5 у гороха и впервые показано участие гена WOX5 в клубенькообразовании и изучена локализация гена WOX5 на различных этапах развития1 клубенька у бобовых растений. Изучена взаимосвязь между геном WOX5 и компонентами системы CLAVATA (CLV1-подобный рецептор, CLE-пептид) и показана общность механизмов регуляции генов' WOX при формировании меристем de novo (клубенькообразование) и в апикальных меристемах растений. Практическая ценность

Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетика развития растений», читаемых на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей при работе с трансгенными растениями.

Апробация работы

По результатам работы были сделаны сообщения на конференциях: 9-ый европейский конгресс по азотфиксации Женева, Швейцария, 6-10 сентября 2010 г., V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009 г., Москва, школа-конференция для аспирантов AB-RMS («Агробиотехнология в корневых-микробных системах») в рамках программы NOVA University Network в 2007 г. (Санкт-Петербург, Россия) и 2008 г. (Тюне, Дания), 8-ой европейский конгресс по азотфиксации Гент, Бельгия, 30 августа- 3 сентября 2008 г., конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века», Петрозаводск, 23-26 сентября 2008 г., на конференции Научно-образовательных центров Pan-REC 2008 г, 20-21 октября, Нижний Новгород, XV Конгресс Федерации Европейского сообщества по биологии растений (FESPB), 17-21 июля 2006, Лион, Франция, 10-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - Наука XXI века". 17-21 апреля 2006 г., Москва.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Осипова, Мария Александровна

121 Выводы

На основании полученных результатов сформулированы следующие выводы:

1. Впервые выявлен ген WOX5 у гороха Pisum sativum L. Показано, что ген PsWOX5 вовлечен в контроль развития клубенька бобовых растений, что установлено на основании анализа динамики его экспрессии при клубенькообразовании и экспериментов по РНК-интерференции.

2. Экспрессия гена WOX5 регулируется CLV-подобной системой при клубенькообразовании как системно (регулируется число сайтов в тканях корня, в которых активируется экспрессия гена WOX5), так и локально (в переделах отдельного развивающегося клубенька).

3. Формирование клубеньков у гороха P. sativum регулируется с участием CLE-пептида, при этом для проявления ингибирующего действия CLE-пептида на клубенькообразование необходимы как побеговая система авторегуляции, компоненты которой кодируются генами PsSYM29 (CLV1-подобный рецептор) и PsSYM28, так и корневая система авторегуляции, компонентом которой является продукт гена PsNOD3.

4. Анализ действия CLE-пептида у близкородственного вида Medicago truncatula показал, что экспрессия гена WOX5 при клубенькообразовании также регулируется с участием двух систем авторегуляции - побеговой, компонентом которой является CLV1 -подобный рецептор, кодируемый геном М. truncatula SUNN, и корневой.

5. Выявленные особенности регуляции экспрессии гена WOX5 при клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов WOX в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа -клубенька бобовых растений.

Заключение

На основании полученных данных мы предлагаем следующую схему участия гена- ЖОХ5 в развитии клубеньков у бобовых растений (рис. 43). Выделяемые ризобиями 1Чос1-факторы активируют накопление в тканях растений флавоноидов, действующих как ингибиторы полярного транспорта ауксина. В результате этого происходит локальное изменение концентрации ауксина в инокулированных участках корня. Мы полагаем, что именно увеличение концентрации ауксина на ранних этапах развития симбиоза может приводить к активации экспрессии гена ЖОХ5. Мы полагаем, что ген 1¥ОХ5 играет особую роль на ранних этапах клубенькообразования, стимулируя пролиферацию клеток при формировании примордиев. На более -позднем этапе развития клубенька происходит подавление экспрессии \VOX5 за счет механизмов авторегуляции с участием СЬАУАТА-подобной системы, функционирующей в побеге. Кроме того, помимо побеговой СЬАУАТА-подобной системы, в подавление регуляцию экспрессии ЖОХ5 вовлечена корневая система авторегуляции (одним из компонентов которой, как мы полагаем, является продукт гена РбЫОВЗ): В зрелом клубеньке 1¥ОХ5 экспрессируется в ограниченной группе клеток - в окончаниях проводящих пучков. Можно предположить, что такая область экспрессии РГОХ5 в сформировавшемся клубеньке соответствует некоему «организующему центру» меристемы, необходимому для поддержания активности меристемы, по аналогии с организующими центрами апикальных меристем, в которых экспрессируются гены ЖОХ. передача активация экспрессии генов Цитокининовый ответ цитокинин пролиферация клеток локальное увеличение с концентрации ауксина

•\ЛГОХ5

I] О о\ со 2

I Оразвитие клубенька

Рисунок 43. Предполагаемое участие гена }УОХ5 в контроле развития клубенька

Выявленные особенности регуляции экспрессии ЖОХ5 при клубенькообразовании указывают на существование общих механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток с участием генов УУОХ в апикальных меристемах и при развитии специализированного органа -клубенька бобовых растений. Экспрессия гена №ОХ5 при клубенькообразовании также регулируется СЬАУАТА-подобной системой и СЬЕ-пептидом, аналогично его гомологу - гену ^РШ", работающему в побеге. Однако особенность регуляции экспрессии гена ¡¥ОХ5 при клубенькообразовании заключается в том, что она осуществляется как системно, так и локально с участием двух систем: побеговой (СЬУ-подобная система, функционирующая в побеге) и корневой системы авторегуляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Осипова, Мария Александровна, Санкт-Петербург

1. Ariel FD, Manavella PA, Dezar CA et al. The true story of the HD-Zip family // Trends Plant Sci. 2007. - V. 12. -N. 9. - P.419-26.

2. Ben А. В., Shaw S.L., Oldroyd G.E.D, et al. The NFP locus of Medicago trancatula controls an early step of Nod factor signal transduction upstream of a rapid calcium flux and root hair deformation // Plant J 2003 - V. 34.*- P.l-12.

3. Bowman J., Yuval E. Formation and maintenance of the shoot apical meristem // Trends in Plant Science.- 2000.- V. 5.- N. 3.- P. 110-115.

4. Brewin N.J. Development of the legume root nodule // Annu. Rev. Cell Biol. 1991.-V. 7.- P. 1-226.

5. Brand U., Fletcher J.C., Hobe M., Meyerowitz E.M., Simon R. Dependence of stem, cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity // Science. 2000. - V. 289. -P. 617-9

6. Bright L.J., Liang Y., Mitchell D.M. et al. Thq LATD gene of Medicago truncatula. is required for both nodule and root development // Mol. Plant-Microbe Interact 2005. - V.18. -P. 521-532.

7. Caetano-Anolles G, Gresshoff PM. Alfalfa controls nodulation during the onset of Rhizobium-induced cortical cell division // Plant Physiol. -1991. -V. 95. -N. 2. -P. 366-73.

8. Chabaud M., Boisson-Dernier A., Zhang J. et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation // The Medicago truncatula handbook. Mathesius U, Journet EP, Sumner LW (eds). 2006. ISBN 0-9754303-1-9. http://www.noble.org/MedicagoHandbook/

9. Chen S.-K., Kurdyukov S., Kereszt A. et al. The association of homeobox gene expression with stem cell formation and morphogenesis in culturedMedicago truncatula II Planta. 2009! - V. 230. - N. 4. - P. 827-840.

10. Cheng ZJ, Zhu SS, Gao XQ, et al. Cytokinin and auxin regulates WUS induction and inflorescence regeneration in vitro in Arabidopsis // Plant Cell Rep. -2010:-V. 29 N. 8: - P. 927-33.

11. Clark S.E., Williams R.W., Meyerowitz E.M. The CLA VATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls, shoot and floral meristem size in Arabidopsis II Cell. -1997. V. 16. -N. 89. -1. 4. -P. 575-85.

12. Clark S.E. Cell signaling at the shoot meristem // Nature Reviews. Molecular Cell Biology.- 2001.- V.2.- P. 276-284.

13. Dievart A, Clark SE. LRR-containing receptors regulating plant development and defense // Development. 2004. -V. 131. -N. 2. -P. 251-61.

14. DiDonato RJ, Arbuckle E, Buker S, Sheets J, Tobar J, Totong R, GrisafI P, Fink GR, Celenza JL. Arabidopsis ALF4 encodes a nuclear-localized protein required for lateral root formation // Plant Cell. -2010. -V. 22. -N. 8. -P. 2618-29.

15. Ding Z, Friml J. Auxin regulates distal stem cell differentiation in Arabidopsis roots // Proc Natl Acad Sci USA. -2010. V.107. - N.26. - P. 12046-51.

16. Due G., Messager A. Mutagenesis of pea (Pisum sativum L.) and the isolation of mutants for nodulation and nitrogen fixation // Plant Sci. 1989. -V. 60.-P. 207-13.

17. Ehrhardt D.W., Atkinson E.M., Long S.R. Depolarization of alfalfa root hair membrane potential by Rhizobium meliloti Nod factors // Science. 1992. V. 256. P. 998-1000.

18. Ehrhardt D.W., Wais R., Long S. R. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulation signals // Cell. —1996. -V. 85. P. 673-681.

19. Felle H.H., Kondorosi E., Kondorosi A. et al. Nod factors, modulate the concentration of cytosolic free calcium differently in growing and non-growing root hairs of Medicago sativa L. // Planta. 1999. - V. 209. - P. 207-212.

20. Ferguson B.J. and Reid J.B. Cochleata: Getting to the root of legume nodules // Plant and Cell Physiology. -2005. -V. 46. -N. 9. -P. 1583-1589.

21. Ferguson BJ, Indrasumunar A, Hayashi S, Lin MH, Lin YH, Reid DE, Gresshoff PM. Molecular analysis of legume nodule development and autoregulation // J Integr Plant Biol. 2010. -V. 52. - N. 1. -P. 61-76.

22. Ferraioli S., Tata R., Rogato A. et al. Development of ectopic roots from abortive nodule primordia // Mol Plant Microbe Interact. -2004. -V. 10. -P. 104350.

23. Frank M'., Schmulling T. Cytokinin cycles cells // Trends in Plant Science-1999.- V.4.-N.7.-P.243-244.

24. Gage DJ. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes // Microbiol Mol Biol Rev-2004—V. 68. -P. 280-300.

25. Gonzalez-Rizzo S, Crespi M, Frugier F. The Medicago truncatula CRE1 cytokinin receptor regulates lateral root development and early symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti II Plant Cell. 2006. -V. 18. - N. 10. -P. 2680-93.

26. Gonzali S., Novi G., Loreti E. et al. A turanose-insensitive mutant suggests a role for WOX5 in auxin homeostasis in Arabidopsis thaliana II Plant J. -2005. -V. 44.-P. 633-645.

27. Grunewald W., Van Noorden G., Van Isterdael G. et al. Manipulation of Auxin transport in plant roots during Rhizobium symbiosis and nematode parasitism// The Plant Cell. -2009. -V. 21. -P. 2553-2562.

28. Guilfoyle T. Plant biology: Sticking with auxin // Nature. -2007. V. 446. -P. 621-622

29. Haecker A., Gross-Hardt R., Geiges B., Sarkar A., Breuninger H., Herrmann M., Laux T. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana // Development- 2004.-V. 131.-P. 657-668.

30. Hagen G, Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors // Plant Mol Biol. 2002. -V. 49. -N. 3-4. -P. 373-85.

31. Harris J.M., Wais R., Long S.R. Rhizobium-induced calcium spiking in Lotus japonicus // Mol. Plant Microbe Interact. 2003. -V. 16. - P. 335-341.

32. Hartig K, Beck E. Crosstalk between auxin, cytokinins, and sugars in the plant cell cycle // Plant Biol (Stuttg). 2006. -V. 8. - N.3. -P. 389-96.

33. Higuchi M, Pischke MS, Mahonen AP, Miyawaki K, Hashimoto Y, Seki M, Kobayashi M, Shinozaki K, Kato T, Tabata S, Helariutta Y, Sussman MR,

34. Kakimoto T. In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. -V. 8. -N. 101. -1. 23. -P. 8821-6.

35. Hirakawa Y, Kondo Y, Fukuda H. TDIF peptide signaling regulates vascular stem cell proliferation via the WOX4 homeobox gene in Arabidopsis // Plant Cell. -2010. —V. 22.-N. 8.-P. 2618-29.

36. Hirsch A. M., Bhuvaneswari T. V., Torrey J. G. et al. Early nodulin genes are induced in alfalfa root outgrowths elicited by auxin transport inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. -1989. -V. 86. -N. 4. -P. 1244-1248.

37. Hirsch S, Kim J, Munoz A, Heckmann AB, Downie JA, Oldroyd GE. GRAS proteins form a DNA, binding complex to induce gene expression during nodulation signaling in Medicago truncatula // Plant Cell. -2009. -V. 21. N. 2. -P. 545-57.

38. Holmes D.S. and Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids // Anal Biochem.-1981.-V. 114,- P.193-197.

39. Horvath B., Heidstra R:, Lados M. et al. Lipooligosaccharides of Rhizobium induce infection related early nodulin gene expression- in pea root hairs // The Plant Journal. -1993. V. 4. -P. 727-733.

40. Huo X, Schnabel E, Hughes K, Frugoli J: RNAi phenotypes and the localization of a protein::GUS fusion imply a role for Medicago truncatula PIN genes in nodulation // J Plant-Growth Regul. -2006. -V. 25. -N. 2. -P. 156-165.

41. Hutchison C. E. and Kieber J. J. Cytokinin signaling in Arabidopsis II The Plant Cell. -2002.-V. 14. -P. 47-59.

42. Imin N., Nizamidin M., Wu T. et al. Factors involved in root.formation in Medicago truncatula II J Experimental Botany. 2007. -V. 58. -P. 439-451.

43. Ito Y, Nakanomyo I, Motose H, Iwamoto K, Sawa S, Dohmae N, Fukuda H Dodeca-CLE peptides as suPressors of plant stem cell differentiation // Science. -2006. -V. 313, -P. 842-845

44. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. -1990. -V. 96(1). -P. 23-8.

45. Jager S. Maughan S., Dewitte W., Scofield S., Murray J.A. The developmental context of cell-cycle control in plants // Seminars in Cell and developmental Biology.-2005.-V.16.- P.3 85-396

46. Jakoby M. Cell cycle and differentiation // Current Opinion in Plant Biology-2004-V.7.-1. 6.-Pi 661-669.

47. Jensen H. L. Nitrogen fixation in leguminous plants. // Proc. Int. Soc. NSW. 1942. -N. -66. -P. 68-108.

48. Jeong S, Trotochaud AE, Clark SE. The Arabidopsis CLAVATA2 gene encodes a receptor-like protein required1 for the stability of the CLAVATA1 receptor-like kinase // Plant Cell. -1999. -V. 11. -N. 10. -P. 1925-34.

49. Kamiya N., Nagasaki H., Morikami A. et al. Isolation and characterization of a rice WUSCHEL-type homeobox gene that is specifically expressed in the central cells of a quiescent center in the root apical meristem // Plant J. -2003. V. 35. -PJ 429-441.

50. Kurakawa T, Ueda N, Maekawa M, Kobayashi K, Kojima M, Nagato Y, Sakakibara H, Kyozuka J. Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme // Nature. 2007. -V. 445. -N. 7128. - P. 652-5.

51. Laplaze L., Benkova E., Casimiro I. et al. Cytokinins act directly on lateral root founder cells to inhibit root initiation // Plant Cell. -2007. -V. 19. -P. 38893900.

52. Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. -1990. -V. 9. N. 6. -P. 676-679.

53. Leibfried A, To J.P., Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J.J., Lohmann J.U. WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators // Nature 2005 - V — 438 - P. 11721175.

54. Lenhard, M. and Laux, T. Stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot meristem is regulated by intercellular movement of CLAVATA3 and its sequestration by CLAVATA1 // Development. -2003. V. 130. - P. 3163-3173.66.

55. Lewis E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila // Nature.-l978.-V. 276(5688). P. 565-70.

56. Limpens E., Franken C., Smit P. et al. LysM domain receptor kinases regulating rhizobial Nod factor-induced infection // Science. -2003. -V. 302. P. 630-633.

57. Limpens E., Ramos J., Franken C. et al: RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula II Journal of Experimental Botany. -2004. V. 55. - N. 399. - P. 983-992.

58. Lohar D.P., Sharopova N., Endre G. et al. Transcript analysis, of early nodulation events in Medicago truncatula II Plant Physiol. — 2006. —V. 140. -P. 221-234.

59. Lu SW, Chen S, Wang J, Yu H, Chronis D, Mitchum MG, Wang X. Structural and functional diversity of CLAVATA3/ESR (CLE)-like genes from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis // Mol Plant Microbe Interact. -2009.- V. 22. -N. 9. -P. 1128-42

60. Malamy JE, Benfey PN.Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana // Development. -1997. -V. 124. -N. 1. -P. 33-44.

61. Marcel M, Murray J.A.H. Cell cycle controls and the development of plant form II Curr Opin Plant Biol. 2001 .-V. 4. - P.-44-9.

62. Mathesius U., Schlaman H.R.M., Spaink H.P. et al. Auxin transport inhibition precedes root nodule formation in white clover roots and is regulated by flavonoids and derivatives of chitin oligosaccharides // Plant J. 1998. -V. 14. -P. 23-34.

63. Mathesius U., Weinman J.J., Rolfe B.J. et al. Rhizobia can induce nodules in white clover by "hijacking" mature cortical cells activated during lateral root development II Mol. Plant-Microbe Interact. 2000. -V. 13. -P. 170-182.

64. Mayer K., Schoof H., Haecker A., Lenhard M., Jurgens G., Laux T. Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem // Cell— 1998.-V.95.- P.805-815.

65. Meng L, Feldman LJ. CLE14/CLE20 peptides may interact with CLAVATA2/CORYNE receptor-like kinases to irreversibly inhibit cell division in the root meristem of Arabidopsis II Planta. -2010. -V. 232. -N. 5. -P. 1061-74.

66. Miller C. O., Skoog F., Okumura F. S., Von Saltza M. H., Strong F. M. Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division // J. Am. Chem. Soc. -1956. -V. 78. -N. 7.-P 1375-1380.

67. Miyawaki K, Matsumoto-Kitano M, Kakimoto T. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate // Plant J. 2004. -V. 37. - N. 1. -P. 128-38.

68. Mortier V., Den Herder G., Whitford R., Van de Velde W., Rombauts S., D'Haeseleer K., Holsters M., Goormachtig S. CLE peptides control Medicago truncatula nodulation locally and systemically // Plant Physiology. 2010. -V. 153—P. 222-237.

69. Muller R. Dynamic and compensatory responses of Arabidopsis shoot and floral meristems to CLV3 signaling // Plant Cell.- 2006 .-V. 18(5).- P. 1188-98.

70. Muller R, Bleckmann A, Simon R. The receptor kinase CORYNE of Arabidopsis transmits the stem cell-limiting signal CLAVATA3 independently of CLAVATA1 // Plant Cell. -2008. -V. 20. -N. 4. -P. 934-46.

71. Muller B, Sheen J. Advances in cytokinin signaling // Science. -2007. -N. 318.-V. 5847.-P. 68-9.

72. Murashige T., Skoog F. Revised medium for rapid bioassays with tobacco tissue cultures // Physiology of Plant.- 1962.- V.15 P.-473-479.

73. Murray J. D., Karas B. J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K. A cytokinin perception mutant colonized by Rhizobium in the absence of nodule organogenesis // Science. -2007. -V. 315. -N. 5808. -P.101-104.

74. Murray, M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight DNA // Nucleic Acids Res.-1980.-V.8.- P. 4321-4325.

75. Novak K. Early action of pea symbiotic gene NOD3 is confirmed by adventitious root phenotype //Plant Science. 2010. - V. 179. - P. 472-478.

76. Oelkers K., Goffard N., Weiller G.F., Gresshoff P.M., Mathesius U., Frickey T. Bioinformatic analysis of the CLE signaling peptide family // BMC Plant Biol. -2008. — V. 8:1.

77. Ogawa M., Shinohara H., Sakagami Y., Matsubayashi Y. Arabidopsis CLV3 peptide directly binds CLV1 ectodomain // Science. 2008. - V. 18. - N. 319.-I. 5861.-P. 294.

78. Ohyama K., Shinohara H., Ogawa-Ohnishi M., Matsubayashi Y. A glycopeptide regulating stem cell fate in Arabidopsis thaliana ll Nat Chem Biol. -2009. -N. 5. -V. 8. -P. 578-80.

79. Oka-Kira E, Kawaguchi M. Long-distance signaling to control root nodule number // Curr Opin Plant Biol. -2006. -V. 9. -N.5. -P: 496-502.

80. Okamoto S., Ohnishi E., Sato S. Takahashi H, Nakazono M, Tabatai S, Kawaguchi M. Nod factor/nitrate-induced CLE genes that drive HAR1-mediated systemic regulation of nodulation // Plant and cell physiology-2009. V. 50. —N. 1'. - P. 67-77.

81. Oldroyd G. E.D. and Downie A. J. Coordinating nodule morphogenesis with Rhizobial infection in legumes // Annu. Rev. Plant Biol: 2008. - V. 59. - P. 519546.

82. Peret B:, Larrieu A., Bennett M. J. Lateral root emergence: a difficult birth // J Exp Bot. -2009. -V. 60. -N.13. -P. 3637-43.

83. Peret B, De Rybel B, Casimiro I, Benkova E, Swarup R, Laplaze L, Beeckman T, Bennett MJ. Arabidopsis lateral root development: an emerging story // Trends Plant Sci. -2009. -V. 14. -P. 399-408.

84. Postma, J. G., Jacobsen, E., and Feenstra. Three pea mutants with an altered nodulation studied by genetic analysis and grafting // J. Plant Physiol. 1988. - V. 132.-P. 424-430.

85. Radutoiu S, Madsen LH, Madsen EB, Felle HH, Umehara Y, Granlund M, Sato S, Nakamura Y, Tabata S, Sandal N, Stougaard J. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases // Nature. 2003. - V. 425.-P. 569-570.

86. Riano-Pachon D.M., Ruzicic S., Dreyer I. et al. PlnTFDB: An integrative plant transcription factor database // BMC Bioinformatics. 2007. - V. 8. - P. 42.

87. Riely BK, Lougnon G, Ane JM, Cook DR. The symbiotic ion channel homolog DMI1 is localized in the nuclear membrane of Medicago truncatula roots // Plant J. -2007. V.49. -N. 2. -P. 208-16.

88. Riou-Khamlichi C., Huntley R., Jacqmard A., Murray J.A. Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through D-type cyclin // Science-1999 V. 283.-P. 1541-1544.

89. Sablowski R. Plant and animal stem cells: conceptually similar, molecularly distinct?//Trends Cell Biol.-2004.-V. 14.-I. 11.-P. 605-611.

90. Safronova V.I., Novikova N.I. . Comparison of two methods for root nodule bacteria preservation: lyophilization and liquid nitrogen freezing // J Microbiol Methods. 1996. -N. 24. -P. 231-237.

91. Sagan M., Due G. Sym28 and Sym29, two new genes involved in regulation of nodulation in pea (Pisum sativum L.) // Symbiosis. -1996.-V. 20. P. 229-245.

92. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase // J.Mol.Biol- 1975 V.94 - P. 441448.

93. Sarkar AK, Luijten M, Miyashima S, Lenhard M, Hashimoto T, Nakajima. K, Scheres B, Heidstra R, Laux T. Conserved factors regulate signalling in Arabidopsis thaliana shoot and root stem cell organizers // Nature. 2007. — V. 446.-P. 811-814.

94. Scheres B., Benfey P., Dolan L. Root Development. The Arabidopsis Book. American Society of Plant Biologists Press. 2002. P. 1-19.

95. Scheres B. Stem-cell niches: nursery rhymes across kingdoms // Nat Rev Mol Cell Biol. 2007. -V. 8. - N. 5. -P. 345-54.

96. Schoof H., Lenhard M., Haecker A., Mayer K.F., Jurgens G., Laux T. The stem cell population of Arabidopsis shoot meristems in maintained by a regulatory loop between the CLAVATA and WUSCHEL genes // Cell. 2000.'- V. 100.- N-6.-P. 635-44.

97. Searle I.R., Men A.E., Laniya T.S. et al. Long-distance signaling in nodulation directed by a CLAVATA 1-like receptor kinase // Science. 2003. - V. 299.-N. 5603.-P. 109-12.

98. Sharma V.K., Ramirez J:, Fletcher J.C. The Arabidopsis CLV3-like (CLE) genesi are expressed in diverse tissues and encode secreted proteins // Plant. Molecular Biology.- 2003.- V.51.- P. 415-425:

99. Shimizu R, Ji J, Kelsey E, Ohtsu K. et al. Tissue specificity and evolution of meristematic WOX3 function // Plant Physiol. 2009. - V. 149(2).-P. 841-50.

100. Stahl Y, Simon R. Is the Arabidopsis root niche protected by sequestration of the CLE40 signal by its putative receptor ACR4? // Plant Signal Behav. -2009. -V. 4. N. 7.-P. 634-635.

101. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of, genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzymcj invlra^/i/o/?^/^ tHaliana II The Journal of Biological Chemestry.- 2001.- V.276. -N.-28.- P. 26405-26410:;

102. Tirichine L., Sandal N., Madsen L.H. et al. A gain-of-function mutation in a cytokinin receptor triggers spontaneous root nodule organogenesis // Science. — 2007. -V. 315.-N. — 5808 —P. 104-7.

103. Tsyganov V.E., Voroshilova V.A., Priefer U.B., et,al. Genetic dissection of the initiation of the infection process and nodule tissue development in the Rhizobium~pea (Pisum sativum,L.) symbiosis // Annals of Botany. -2002. -V. 89. -P. 357-366.

104. Turgeon B. G. and Bauer W. D. Infrastructure of infection-thread development during the infection of soybean by Rhizobium japonicum II Planta. — 1985.-V. 163. -N. 3. P. 328-349i

105. Veit B. Determination of cell fate in apical meristems // Current Opinion in Plant Biology.- 2004-V.7.- P. 57-64.

106. Wall L.G. The Actinorhizal Symbiosis // J Plant Growth Regul. 2000. - V. 19.-N. 2.-P. 167-182.

107. Wan X. Analyses of nodule meristem persistence and ENOD40 functioning in Medicago truncatula nodule formation. Thesis Wageningen University, The Netherlands. 2007

108. Wang H. et al. ICK1, a cyclin-dependent protein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interacts with both Cdc2a and CycD3, and its expression is induced by abscisic acid // Plant J.- 1998.- V. 15,- P.501-510.

109. Wang G, Fiers M. CLE peptide signaling during plant development // Protoplasma. 2010. - V.240. -N.l-4. - P. 33-43.

110. Woodward AW, Bartel B. Auxin: regulation, action, and interaction // Ann Bot. 2005. - V.95. -N.5. - P. 707-35.

111. Wu X., Dabi T., Weigel D. Requirement of homeobox gene STIMPY/WOX9 for Arabidopsis meristem growth and maintenance // Current Biology 2005.-V. 15.- P. 436-440.

112. Zhu H., Choi H.-K., Cook D. R., Shoemaker R.C. Bridging model and crop legumes through comparative genomics // Plant Physiology. -2005. -V. 137. P. 1189-1196.1. Благодарности

113. Искренняя благодарность коллегам из лаборатории растительно-микробных взаимодействий университета г. Гента, в особенности ее руководителю Софи Гурмахтиг, за помощь и поддержку при выполнении работы и освоении новых методов в ходе научной стажировки.