Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль фосфорилированного рибосомального протеина в механизмах митогенеза нормальных и онкотрансформированых клеток

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль фосфорилированного рибосомального протеина в механизмах митогенеза нормальных и онкотрансформированых клеток"

Український науковий гігієнічний центр

ОД

[/"'■" Ковальчук Ігор Петрович

УДК:616.006+618.19+612.014+616.006.6+576.352

РОЛЬ ФОСФОРИЛЬОВАНОГО 86 РИБОСОМАЛЬНОГО РОТЕЇНУ У МЕХАНІЗМАХ МІТОГЕНЕЗУ НОРМАЛЬНИХ ТА ОНКОТРАНСФОРМОВАНИХ КЛІТИН

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Київ-1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії МОЇ; України.

Науковий керівник:

д.м.н. професор Бариляк Ігор Романович, Українськш науковий гігієнічний центр, директор

д.б.н. професор Стародуб Микола Федорович Інститут біохімії імені О.В.Палладіна НАН України

завідувач відділом

д.м.н. професор Ганіна Калерія Павлівна Інститут експериментальної патології онкології і радіобіології НАН України провідний науковий співробітниь

Провідна установа:

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України

відділ генетики людини, м. Київ

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.604.01 Українського наукового гігієнічного центру, 253660 м. Київ-94, вул. Попудренка 50.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Українського науковогс гігієнічного центру, 253660 м. Київ-94, вул. Попудренка 50.

Офіційні опоненти:

Захист відбудеться “ 2.^" к!/(^ІМкМ 1998 р. о ^

годині

оъ <г

Автореферат розісланий “ __1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Селезньов Б.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми

Результати чисельних робіт в багатьох лабораторіях світу протягом останнього десятиріччя свідчать, що розвиток раку є наслідком ненормальної експресії або функції протоопкогенів (N. Hynes, 1992, Anderson, 1993, Masuko, 1989). Механізми онкогенезу можуть включати багато факторів, таких, як рецептори стимуляції росту (серед них протеїн-тирозин кінази), внутрішньоклітинні провідники сигналу (протеїн-тирозин та протеїн-серин/треонин кінази) та пуклеарні регулятори транскрипції.

Процес онкогенезу молочної залози с результатом накопичення таких генетичних пошкоджень: надекспресія тнрозинкіназного рецептору ЕгЬВ-2; мутація р53 туморсупресорного протеїну (N. Hynes, 1992).

Численні підходи були застосовані для виялення того, як вищезгадані пошкодження впливають на нормальний ріст та диференціацію клітин молочної залози. ЕгЬВ-2 (так само, як і ЕгЬВ-3,4) є членами EGF тирозин-кіназної родини рецепторів. Ці рецептори активуються за допомогою EGF (епідермальний фактор росту) maNDF (новий фактор диференціації) пеитидних факторів росту. Так, лінія НС11 клітин молочної залози проліферує у відповідь на стимуляцію за допомогою NDF, який також активує p44ERK-l таp42ERK-2 МАР(мітогенноактивні) кіназні ізоформи і p70S6k/p85S6k. Отже, стимуляція ЕгЬВ-2 рецептору призводить до фосфорилювання S6 протеїну шляхом р70/р85 кінази. Слід відзначити, що навіть активація ЕгЬВ-2 шляхом точкових мутацій або стимуляцій тАЬ викликає активацію як МАРК, так і S6k шляхів передачі сигналу (В. Marte, 1995).

Активація трансформаційної здатності, можливо, пов’язана із ампліфікуванням онкогенів. У хворих раком молочної залози та яєчників ампліфікування ЕгЬВ-2 було виявлено в 25% випадків. Існують також ознаки того, що онкогени можуть працювати як транскрипційні фактори. Наприклад, НгЬА -—один із двох онкогенів вірусу ерітробластозу птахів (другий — ЕгЬВ) — є членом сімейства генів стероідних рецепторів.

Для розуміння процесів, що призводять до активації росту аберантних клітин, які пов’язані з виникненням раку, необхідні знання проліферації нормальних клітин. Програма, яка контролює клітинний цикл починається на поверхні клітин шляхом взаємодії специфічних факторів росту і гормонів із специфічними рецепторами. Сигнал проводиться внурішньоклітинно шляхом каскаду фосфорилювання, що в кінцевому рахунку призводить до синтезу ДНК та поділу клітини. Одним з обов'язкових процесів у цій біохімічній програмі є ініціація та підтримка

високого рівня синтезу протеїнів на протязі G1 фази та всього клітинного циклу. Ці процеси індуковані фосфорилюванням необхідних трансляційних та ініціаційних компонентів, таких як еIF2, eIF-4F, eIF-4B та 40S рибосомальний протеїн S6. Тому вивчення фосфорилювання останнього приведе до розуміння процесів росту та диференціювання як нормальних, так і трансформованих клітин.

S6 протеїн — це рибосомальний протеїн, який с найважливішим у фосфорилюванні рібосом еукаріот. Він розташований на поверхні малої 40S субодиниці, де, ймовірно, бере участь у взаємодії з 60S субодиницею та мРНК. Під дією мітогєнного стимулювання клітин S6 стає численно фосфорильованим р70/85 кіназою, яка каталізує введення до 5 моль Р на один моль S6 in vitro. П’ять Ser нуклеотидів розташовані в 3’ кінці протеїну із спеціальною послідовністю із трьох R (аргенинів) для розпізнавання ділянки фосфориляції (G. Thomas, 1989). Можливо, фосфорилювання S6 дозволяє йому зв’язуватися з протеїнами або мРНК

і, якимось чином, прискорювати формування полісомного комплексу та впливати на синтез протеїнів та поділ клітини.

Для встановлення значення фосфорилювання S6 білку для синтезу протеїнів та прогресії клітинного циклу необхідно створити такі умови, за яких місця його фосфорилювання були б відсутні. Цього можна досягти відсутністю S6 гену або заміною сериновнх нуклеотидів на будь-які інші. Звичайно, немає сенсу робити це у всіх клітинах тварини, тому що це може бути летальним для неї. Тому було запропоновано вирізати S6 у певних клітинах, за відсутністю яких тварина може існувати, — у Т-клітинах. Схема схрещування мишей була розроблена та запропонована доктором Mary Stewart (1992). Спочатку була виведена миша, в якій CRE білок вирізав S6 ген саме в Т-клітинах в обидвох копіях. Після того були виконані наступні схрещування для створення миші, у якої дика або мутована S6 кДНК як трансген під контролем CD-2 промотора може замінити дію вирізаного гену в Т-клітинах.

Мета роботи: встановлення структури S6 гену та розробка моделей його вивчення in vitro та in vivo з наступним виявленням його значення в механізмах мітогенезу нормальних та онкотрансформованих клітин.

Основні завданні! роботи

і. Розробити in vitro модель для вивчення ролі S6 протеїну у процесах мітогенезу. Провести сайт-направлений мутагенез на мишиній S6 кДНК з метою створення п’яти різних форм протеїнів, які не можуть бути субстратами фосфорилювання. Експресувати кожен варіант у культурі фібробластів ссавців (Swiss ЗТЗ клітини) з метою виявлення ролі фосфорилювання S6 у мітогенезі.

- з -

2. Виділити та картуиати активний S6 ген миші, його рестрикціїїиі місця та місця клонування.

3. Розробити in vivo модель для вивчення ролі S6 протеїну. Провести мутації сайтів фосфорилювання з метою інактивації гена. Генерувати гетеро- та гомодефіцитні по S6 гену в Т-клітинах тварини із заміною його функції мутантними формами S6 кДІІК.

4. Провести стимулювання нормальних та онкотрансформованих епітеліальних клітин молочної залози різними факторами росту та визначити активність протеїн-кіназ, які беруть участь в процесі передачі мітогешюго сигналу, а також фосфорилювання S6 протеїну.

Наукова новизна

1. Вперше була виділена активна копія S6 гену миші, картовані рестрикційні місця та місця клонування, прочитана послідовність екзонів та 'нітронів, 5’ та 3’ кінців.

2. Вперше розроблена комплексна модель (in vitro та in vivo) для вивчення ролі S6 протеїну у мітотичній прогресії як нормальних, так і ракових клітин.

3. Вперше проведені сайт-наиравлені мутації місць фосфорилювання S6 кДНК та S6 гену миші.

Практичне значення роботи

1. Сконструйовані різні нлазміди, в які заклоновані різні мутантні форми кДПК, як під контролем ES-специфічного, так і Т-клітинно-специфічного промоторів, ідо дозволить використовувати їх як для мікроін’єкції бластоцистів псевдовагітних мишей, так і в інших біотехнологічних процесах.

2. Генеровані різні клони мишей, які можуть бути корисними при вивченні процесів мітогенезу як нормальних, так і ракових клітин.

3. Проведене трансформування епітеліальних клітин молочної залози із онкотично зміненою формою ЕгЬВ-2 рецептору, що дозволило скласти модель спонтанного онкотрансформування рецепторів та вивчити активність протеїн-кіназ у процесах мітогенезу ракових клітин.

4. Встановлено взаємозв’язок між мутаціями каталітичноїділянки ЕгЬВ-2, які приводить до онкотрансформування рецептору, та активацією мітогенних регуляторів.

5. Доведено, що фактори росту стимулюють активність фосфорилювання кіназ значно сильніше у ракових клітинах, ніж у нормальних епітеліальних клітинах молочної залози.

Основні положении роботи, що виносяться на захист

1. Знаходячись у активному стані, S6 рибосомальний протеїн бере участь у регулюванні мітотичного циклу нормальних клітин. Його активація забезпечується Ser нуклеотидами, що є місцями фосфорилювання. Мутації Ser дозволять інактивувати протеїн, та розробляти різні моделі (in vitro та in vivo) з неактивною формою протеїну, що дозволить вивчити його більш досконало.

2. В ембріональних стовбурових клітинах виявилося недостатньо однісї копії S6 для нормальної функції клітин, тому клітини відновлювали едогенну структуру S6 в обох алелях.

3. Дані інших досліджень, які показали можливість існування тварин без Т-клітин, дали нам змогу використати in vivo модель, в якій ендогенним S6 в Т-клітинах був замінений на мутантні форми. Ця модель дас можливість вивчати функцію S6 на протязі всього життя тварини.

Апробація роботи

Матеріали дисертації опубліковані в журналах '‘Цитологія і генетика” /1998/, в річних збірниках наукових праць інституту молекулярної біології ім. Фрідріха Мішсра /1995/, /1996/, /1997/, доповідались на щорічній науковій конференції інститу молекулярної біології ім. Фрідріха Мішера/Сант-Моріц, Швейцарія, /1994/, на засіданнях Вченої ради Івано-Франківської державної медичної академії, на засіданнях кафедри біології та генетики Івано-Франківської державної медичної академії, на міжлабораторному семінарі з молекулярної біології /Ніцца, Франція, 1994/

Реалізація роботи. Результати дослідження впроваджені в інституті молекулярної біології ім. Фрідріха Мішера, м. Ііазель, Швейцарія. Виділений та картований S6 ген та різні плазмиди з мутантними формами S6 кДНК використовуються в роботі багатьох лабораторій Швейцарії, CtUA, Франції та І Іімеччини.

За темою дисертації опубліковано 5 наукових робіт.

Об’см та структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 137 сторінках у вигляді 4 розділів і складається з вступу, огляду літератури, опису об’єкту та методик дослідження, 2 розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури. Дисертація містить 2 таблиці, 19 малюнків. Список литератури містить 289 джерел.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проведені як in vitro, так і in vivo.

Для роботи in vivo використовувалися такі клони клітин: ES — ембріональні стовбурові клітини мишей, Swiss ЗТЗ клітини — мишині

фібробласти, HCII —епітеліальні клітини молочної залози, T47D, AU565 —клітини карциноми молочної залози.

Для роботи in vivo використовувались різні лінії мишей пороли Agouti, клони 03 та Е14.

З 129SV геномної бібліотеки миші за допомогою геномного Саузерн Слот аналізу та використовуючи S6 кДНК в якості проби, був виділений ЛЗН клон, який містить у собі активний з інтронами S6 ген. 6.5 kb довжиною Xbal фрагмент із повним S6 геном, був клоновапий у вектор pBluescript KS, який надалі будемо називати p3HS6.

Для направлення дії білку CRE на Т-клітини ми використовували 'Г-специфічний промотор CD-2, який дозволяє експресувати дію будь якого гену саме в Т-клітинах внаслідок того, що він експресований у Т-клітинах від їх народження і до смерті та бере активну участь в їх диференціації та спеціалізації (Greaves D.R., 1989).

У роботі також використовувались такі вектори експресії: гілазмід рВЗІ із білком CRE; pBluescript KS; pKJ із ES специфічним промотором pjk; ртс CRE N із ES специфічним промотором hcv ТК; pgem 3 та pgemex в якості транзитних векторів.

Рестрикційні ензими (Boehringer Mannheim), Т4 ДНК лігази, Т4 полінуклеотид кінази, зворотні транскриптази, протеїнкінази К використовувались згідно рекомендацій виробників.

Вектори гомологічної рекомбінації були сконструйовані з використанням касет резистентності до різних антибіотиків (тетраміцнн, гентаміцин, ампіцилін, неомішш) та системи гомологічної рекомбінаціїCRE/loxp із системи бактеріофагу Р1. Було проведено заміну ендогенного S6 протеїну в ES клітинах, якими в подальшому були мікроіи’єковані бластоцисти псевдовагітних мишей.

Стабільне та транзитне трансфікування CRE білку було проведено за методиками, описаними в роботі Brian Sauer та ін., 1988.

Приготування геномної та кДНК як із бактеріального пулу, так і з біоматеріалу (кінчики хвостів) проводились за стандартними методиками (A laboratory manual of molecular cloning, Maniatis).

І ельелектрофорез, ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція, PCR), різні види блотінгів (Southern blot, Western blot. Northern blot, dot blot), методи виділення ДНК (CsCl інградієнт. gene cleane), зчитування послідовностей нуклеотидів (sequencing reaction) за допомогою різних праймерів проводились за стандартними методиками, які використовуються у м о л е кул я р н і й б і ол о гі ї.

Клони клітин підтримувалися у RPM1 1640 середовищі, збагаченому 8% фетальною сироваткою телят, яка була інактивована нагріванням з додаванням 5mgml-l бичого інсуліну та 10ng ml-і мишнного

EGF. Клопи клітин карциноми підтримувались за методом, запропонованим N.Hynes та ін., 1992. Перед стимуляцією NDF та EGF клітини голодували 24 години у середовищі без сироватки. Для вимірювання росту клітин використовувалась методика, яка була розроблена компанією Promega з використанням Cell Titer 96ТМ kit. Ріст клітин вимірювався після трьох діб (N. Hynes, 1992).

Для імунопреципітування був приготовлений лізат клітин, який був інкубований з преімунною сироваткою протягом двох годин при 4°С. Імунокомплекси були зібрані за допомогою протеїн А-сефарози. Повний лізат або імунопрсципітат клітин був аналізований за допомогою SDS — поліакріламідного гельслектрофорезу (SDS-PAGE). Протеїни були електроблотовані до PVDF мембрани (за методикою виробника, фірми МіІІіроге). Імуноблотінг був виконаний за стандартною методикою і протеїни були виявлені, використовуючи порокеидазні вторинні антитіла (Amersham).

МАРК ізоформні пептиди були синтезовані та активізовані за описаною методикою (Borner та ін., 1987). P70S6/p85S6 кінази були імунопреципітовані з 50 mg клітинного лізату, використовуючи М5 поліклональну антисироватку (Lane, та ін, 1993). Аналіз фосфорилювання S6 був проведений за методикою Lane та ін., 1992.

Результати дослідження і їх обговорення

Сайт-паправдетш мутагенез S6 кДНК миші

Перша частина роботи —дослідження ефекту S6 мутантів на G1 прогресію клітин, які культивуються. S6 кДНКа були модифіковані сайт-направленим мутагенезом з використанням ПЛР. З метою генерації клону повної довжини ці змінені продукти ПЛР були з’єднані з часткою модельної кДНК, в якої рестрикційна ділянка PstI відсутня. Були проведені реакції зчитування із всіх модифікованих клонів для того, щоби переконатися, що модифікації інкорпоровані та розташовані на правильних місцях.

Булиздійнені наступні 5 модифікацій:

1. Заміна R233 на Ala амінокислоту ефективно блокує здатність кінази утилізувати прогиеїн як субстрат фосфорилювання.

2. Заміна всіх п’яти Ser на Ala — з повним блокуванням їх фосфорилювання.

3. Заміна двох перших Ser (235, 236) на Ala для підтвердження більшої важливості фосфорилювання останніх трьох Ser.

4. Заміна п’яти Ser на D (аспартатну кислоту) з метою мімікрування позитивного заряду фосфорильованого протеїну (імітувати фосфорильовану форму протеїну).

5. Заміна двох перших Ser на D (аспартатну кислоту).

Потім змінена ДНК, так само як ДНК дикого типу, була вставлена в еукаріотпчний вектор (pSVK3) під контроль SV40 промотора.

Експресія мутантних форм S6 кДНК у культурі клітин ссавців

Плазміда, яка несе в собі S6 кДНК, була введена в ядра ембріональних фібробластів миші (REF52), або Swiss З'І'З клітин, які знаходяться у спокої, та позбавлені сироватки. Дикий, або мутантний, типи S6 кДНК були екснресовані у цих культивованих клітинах внаслідок гомологічної рекомбінації, шляхом якої змінені протеїни входять у геном. Якщо конкурентне заміщення ендогенного S6 гену відбулося, то майже весь S6 протеїн, ізольований з 40S субодиниці, яка експресує мутовану форму S6, буде виявлений в нсфосфорильованій формі (лише одна ділянка на гелі покаже наявність ЛТР). A 40S субодиниця з диким типом S6 показала повну фосфориляцію — міграцію 5 моль Р (рис. 1).

Рис.1. Фосфорпляція S6: а-е — п’ять фосфорильовапих серпнових нуклеотидів.

Одночасно проводився контрольний експеримент з клітинами, в які був введений лише буфер, а також з клітинами, в які взагалі нічого не вводилося. Результати цього експерименту порівнювалися з відносною кількістю загального введеного метионіну та з відносною кількістю введеного метионіну у специфічні протеїни (з клітин, які експресують змінені форми S6).

Гомологічна рекомбінація у стовбурових клітинах ембріона миті. In vivo експеримент.

Шляхом сайт направленого мутагенезу всі 5 мутацій, які були описані для S6 кДНК, були генеровані па S6 гені. Перед використанням S6 гену у нашому експсрімепті та створенням вектора направленої дії (''targeting vector"), ми провели зчитування обох ланцюгів цілого S6 гену,

щоби пересвідчитися у відсутності перестановок, делецій та інсерцій ДНК. Цілий ген було розбито на дві частини, прочитано та картовано. Це було зроблено для заміни ендогенного S6 шляхом гомологічної рекомбінації в ембріональних стовбурових клітинах.

Вектор направленої дії (“targeting vector”), який був генерований шляхом введення ртСІпео касети (касети резистентності до антибіотику) у ділянку З’ S6 транскрипційної частини та введення тимидін кінази (ТК) вірусу герпесу простого в 5’ кінець, був використаний для електропорації мишей породи Agouti клону D3 ES (ембріональних стовбурових) клітин. .

Для проведення гомологічної рекомбінації була використана CRE/ Іохр система рекомбінації, запозичена з бактеріофагу Р1. Було проведено порівняння активності S6 гену у трансфікованих клітинах та ендогенна активність S6reny. В обох випадках активність гену була ідентичною (рис.2).

1 2 З

Рис.2. 1 — вектор без S6, 2 — ендогенна S6 активність, 3 — активність S6 в заміненому векторі направленої дії.

Ендогенний S6 ген у ES клітинах був заміщений за допомогою гомологічної рекомбінації на векторі направленої дії. Резистентні до антибіотиків клони, які показали себе позитивними в процесах гомологічної рекомбінації (у них вона пройшла успішно), далі були культивовані. Було отримано 11 незалежних резистентних до неоміцину клонів ES клітин, позитивних за гомологічною рекомбінацією.

Хімеричні тварини були генеровані за допомогою стандартної методики ін’єктування ES клітин у C57BL/6 бластоцисти та імплантовані в псевдовагітну мишу. Внаслідок перехресного схрещення хімеричних нащадків із C57BL/6 мишою було виведено гетерозиготних мишей з рекомбінаційною алеллю, які усиадковали привнесену алелю. Для перевірки мишей, які успадкували мутантну алелю, був проведений Саузерн блот аналіз ДНК, яка була виділена з мишиних хвостік.

Було отримано 4 позитивних клони з фенотипом S61oxpNEO/S6wt. У мишей цих клонів у віці 4 тижнів були обрізані кінчики хвостів для приготування геномної ДНК, на якій проводився Саузерн блот для відбору тих митей, які успадкували конструкцію S61oxpNEO.

Гетерозиготні за привнесеною кострукцісю миші з генотипом S61oxpNEO/S6\vt наданому етапі повинні бути схрещені з CRE мишами:

ЯбІохрІМР.О

СО-2 Ббчуі СЯЕ 86уИ:

X

ЗбІохрІМЕО СР-2 86\\1 СЯН

Було виведено мишей, у яких одна з алелей у Т-клітинах позбавлена Яб білку, тому що СО-2 промотор направляє дію СЛЕ на Т-специфічні тканини.

Така сама конструкція (S6loxpNEO/S6vvt) в ЕБ клітинах була транзитно трансфіковапа з СКЕ білком, який вирізає білок Бб. Але ці клітини відновлювали свою структуру, і нам не вдалося отримати достатню кількість ДНК для подальшого клонування.

Внаслідок того, що ЕЯ клітини тину ЗбаГ/Бби-І не можуть існувати та є нежиттєздатними, нами запропонована альтернативна схема схрещування. Пропонується схрестити отриману мишу 861охрКТЕО/8буЛ: СЕ>-2/СІІЕ з одним із своїх родичів, мишою ЯбІохрКЕО/БбууІ, після чого було отримано такий результат:

У цьому випадку було виведено мишу, 86 ген якої специфічно вирізаний у Т-клітинах в обох алелях, в які СІІЕ направив свою дію.

Для перевірки, чи збереже ЗбкДНК активність вирізаного у Т-клітинах Я6. необхідно провести два таких схрещення:

ЗбІохрЖО СБ-2 І56\\ї ШГ X

БбЬхрЫЕО

86\М

86!охрКІЕО СО-2 561охрЪ’ЕО СЯЕ

86 кДНК

8б\М 86

861охр^О СО-2 X 86\уі СКЕ

\

S61oxpNEO CD-2 S6wt CRE

S61oxpNEO CD-2 S6 X "S6wt CRE кДНК

S6loxpNEQ CD-2 S6

S61oxpNEO CRE кДНК

Таким чином було виведено мишу, у якої всі тканини організму, за винятком Т-клітин, мають нормально функціонуючі S6 гени, а в Т-клітинах ці гени замінені на трансгенні S6 кДНК.Отже, якщо припущення щодо важливості фосфорилювання S6 для клітинної прогресії правильні, то у тварин, у яких S6 ген в Т- клітинах був замінений на мутантний, можливо, взагалі не буде Т-клітин. Тварини, у яких алель з S6 ендогенним протеїном було замінено на S6 кДНК дикого типу, можливо, будуть нормальними (за умови, що однієї копії S6 достатньо для існування та нормальної функції Т-клітин), і Т-клітини у них будуть присутні.

Виведення C.RE миші

Інший компонент системи гомологічної рекомбінації CRE/loxp був поміщений в іншу тварину', схрещення якої з мишею S6loxpNEO/S6wt призвело до вирізання S6 гену. Для того, щоби CRE ініціював вирізання S6 гіртеїну не у всієї тварини, а тільки у Т-клітинах, потрібно використовувати селективний Т-специфічний промотор, якиіі направить дію CRE на Т-клітини. Такий промотор, так званий CD-2 ген, існує в організмі людини. Він експресується лише в Т-клітинах (тімоцитах) на протязі всього життя клітини, від момента народження до її смерти. CD-2 промотор проявляє Т-специфічпу експресію пов'язаного із ним гену, залежну під кількості копій, а його експресія не залежить від місця інтеграції у геномі.

Плазмида pBlCD2CRE (CRE під контролем CD-2 промотора в векторі pBluescriptl) була введена у бластоцисти вагітних мишей. Після народження все покоління мишеіі було проаналізовано за допомогою “dot blot" та було отримано п’ять мишей зрізною експресією CRE. Трансгениа миша (CD-2 Sovvt/CRE S6\vt) була досліджена за допомогою Саузерн блоту.

H.Gu, 1992, у своїй роботі показав, що CRE ген, який знаходиться під контролем Т-специфічного промотора lek, позбавлений специфічного нуклеарного сигналу, каталізує вирізання роІВгену, обмеженого двома Іохр лише у 40% випадків. Хоча у його попередніх роботах при використанні нуклеарного сигналу, ефективність зростала більше, ніж у два рази (до

0%). Тому ми використовували цей нуклеарний сигнал для того, шоби осягти максимальної ефективності вирізання S6.

Поміщення кДНК під контроль CD-2 промотора

Для з’ясування того, чи збереже заміна вирізаного S6 гену ірансгенною S6 к ДІЇ К дикого (мутованого) типу під контролем CD-2 ромотора, потрібно вивести мишу, у якій S6 кДНК буде експресована ід контролем CD-2 промотора.

Після того, як всі кДНК були поміщені під контроль CD-2 ромотора, мишині ембріони було мікроін’сковано вищезгаданими знструкціямн з метою отримання тварин з S6 кДНК під контролем D-2 промотора. Ці миші були використані у подальших схрещуваннях.

Ізоляція активного S6 гену

Всі гени рібосомальних протеїнів ссавців, виділені до цього часу рисутні у геномі в одній активній копії, яка містить в собі інтрони, а акож у великої кількості псевдогенів, які їх не мають. Для визначення лькості експресованих транскриптів було застосовано Northern blot іаліз з мишиною кДІ ІК в якості проби. Присутність одного транскрипта -редбачає лише одну копію активного гену.

ПЛР була виконана на геномній ДІІК з використанням олігопуклео-идних праймерів з кДНК. Таким чипом, ДНК, отримана за допомогою ЛР, містить у собі ’’перериваючі’’ послідовності з активною ділянкою у :ні, яка відповідає кДЇ ІК.

Після виділення активного S6 гену з 129SV геномноїбібліотекі миші ляхом проведення Southern blot з використанням S6 кДІІК в якості іркерів було виявлено, що крім гену ІЛІЗ існує ще біля 12-15 копій S6 ну в геномі. Але подальші дослідження з використанням інтронів в якості юб довели, що всі виявлені копії S6 гену є лише одиничними, які не стять у собі інтронів. Таким чином, виділений S6 LH3 ген є єдиним :тивним геном, якій містить інтрони.

In vitro експеримент

Для вивчення ролі S6 у формуванні полісомного комплексу в :сперементі in vitro на ES-клітинах було використано S6 кДНК.

Всі кДНК були заклоновані у вектор pBluescript KS\ в подальшому ізваний pS6BS. Щоби помістити S6 кДНК в ES клітини, потрібно ікористовувати ES специфічний промотор. Було використано два юмотори: pjk та hcvTK.

Всі конструкції були створені та стабільно трансфіковаиі в ES :ітини для заміни функції ендогенного S6 гену, вирізаного за допомогою ІЕ/Іохр рекомбінаційної системи. У тих колоній, де S6 кДНК попала в

геном, її експресію було перевірено за допомогою двох різних реакцій: RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція за допомогою зворотньої транскриптази) та RNase protection —методпкі, якадозволяє перевірити наявність як ендогенної так і введеної ЇМ ІК. -

Для того, щоби отримати ES клітини, в яких ендогенний S6 ген в обох алелях вирізаний, та спробувати замінити їх на мутантні S6 кДНК або дику S6 кДНК, було застосовано методику, яка описана Mortensen та iff.( 1992). Згідно цісї методики, збільшеними концентраціями G418 (сильний клітинний інгибітор) можна індукувати гомозиготність. Внаслідок того, що дані ES клітини гетерозиготні за привнесеною конструкцією, можливо “примусити” клітину копіювати алеліє S61oxpNEO/S6wt, заміщуючи другу ендогенну алелю. Таким “примушуючим" агентом може бути G418, який активує цей процес : ефективністю до 10% (Mortensen та in., 1992).

S61oxpNEO G418 S6IoxpNEO

S6wt * S61oxpNEO

Падалі гомозиготна лінія, яка несе S6 ДІ1К з касетою NEO-резистентності до антибіотику неомицину та двома Іохр послідовностями, які обмежують S6 ген (5 екзонів), була перевірена за допомогою Southern blot та ПЛР для підтвердження структури S6 гену. Потім білої* CRE був транзитно трансфікований в ES клітини для того, щоби викликати вирізання обох алелей з S6 геном між двома Іохр послідовностями Потім клітини були проаналізовані на предмет життєздатності, можливості та швидкості проліферації.

З 15 проведених трансфекцій нам не вдалося отримати жодного клона, з якого можливо було би виділити ДНК та підтримати його життєдіяльність. У порівнянні з іншими клонами, трансфіковані клоні росли значно повільніше, та їх кількості» була у 5-7 разів меньиюю Нежиттєздатність ES клітин, у яких S6 ген був відсутній в обох алелях підтверджує, що S6 — лише один активний ген в геномі миші, тобто немає жодного спорідненого з ним гену, який міг би компенсувати функці' S6. Це ще раз доводить, що S6 є необхідним для функції клітин.

У співробітництві із Dr. Sara Kozma був поставлений подібній експеремент, в якому ES клітини були трансфіковані з CRE іш гігроміп.ином G418. Клітини, які містили гігроміціні та CRE, росли з присутності G418 внаслідок того, що CRE вирізав послідовність мія двома Іохр, та дозволяв ексиресуватися G418. Незважаючи на більш) складність цієї методики, вона займає набагато меньше часу, нія багаторазове проведення ПЛІ’. Після проведення такої трансфекції булі отримані декілька десятків колоній, які росли в присутності G418. Алі

зони росли луже повільно, та матеріалу з них було недостатні,о для іриготуваня ДНК та її клонування. Після приготування культури клітин ? цих колоній та виділення ДНК виявилося, що Б6 ген знаходився на місці з обох алелях, тобто клітини певним чином відновили свою попередню структуру. Ймовірно, що це відбулося внаслідок явища гомологічної рекомбінації, шляхом якої клітини часто відновлюють порушення у геномі.

Для вивчення функції Бб в Е5 клітинах та отримання гетеродсфі-дитних за Я6 геном тварин Е8-клітини були трансформовані з «інструкцією 561охр/ЫЕО та за допомогою нестабільної трансфекції з Зілком СЯЕ Б6 ген був вирізаний між двома Іохр місцями. Надалі планувалося иікроін’скувати ЕБ клітини в мишині бластоцисти з метою генерації пварини з 56<Ш\уі фенотипом, яка буде використана в подальших схемах :хрещення. Під час проведення експерименту було виявлено, що клони спітин з генотипом 86сШи4 не є стабільними та при культивації їх на Загачуючому середовищі з метою отримання ДНК клітини цього клону зідновлювали ендогенну структуру (86у*1/\\Ч) шляхом гомологічної рекомбінації в 100% випадків.

Дія І\'І)Г Ьоформ па епітеліальні клітини молочної залози

На клони клітин молочної залози (мишині та людські) діяли різними зоформами людського ЫОР. Всі ізоформи були активними мітогенними лшімуляторами як для неонкогенних НС11 мишиних епітеліальних клітин, пак і для клітин раку молочної залози Т47ГЗ. Після стимуляції клітин 5ули отримані такі результати:

Таб. 1. Вплив різних ізоформ іУД/7 на ріст епітеліальних клітин молочної залози.

Ізоформи пМ кратність стимуляції неп кратність стимуляції Т470

1 гН-ШР-аІ 5 1.24 1.57

2 гН-ШН-а2 5 1.25 1.82

3 гН-К'ОР-аЗ 5 1.14 2.11

4 гН-ШР-[И 5 1.74 2.42

5 гН-ШР-р2 5 1.77 1.94

6 гН-ШР-рЗ 5 1.92 2.47 ■

Клони клітин відповідають на стимулювання ізоформ ИОЕ одпако-;о— збільшенням кількості клітин. При оптимальних умовах росту :ількість клітин для клону НС11 збільшилась максимум у 1.9 разів, та дя Т57П клітин — у 2.5 рази. Клон ракових клітин ділився швидше і

продукував більшу кількість клітин у порівнянні з клоном нормальних епітеліальних клітин молочної залози, і при цьому у деяких ізоформ різниця досягала майже 100%. Підвищена мітогенна активність ракових клітин може бути пояснена декількома механізмами. По-перше, це збільшена спорідненість рецепторів клітини до факторів росту, що дозволяє клітині швидше і ефективніше реагувати на зовнішнє стимулювання. По-друге, можливо, що фактори передачі мітотичного сігналу — протеїн тирозин та протеїн серип/треонінові кінази, а також внутрішньоядерні регулятори транскрипції і трансляції набувають змін, які приводять до підвищення рівнів їх фосфорилювання.

Використання мЛт проти ЕгЬВ-2 та активаиія МАР кінази та p70S6k/p85S6k '

Моноклональні антитіла, спрямовані проти екстрацелюлярної ділянки ЕгЬВ-2, діють як часткові антогоністи (Harwerth та ін., 1992). Зв’язування моноклональними антитілами екстрацелюлярноїділяпки ЕгЬВ-

2 приводить до підвищеного вмісту фосфотирознну найбільш ймовірно завдяки крослінкуванню двох рецепторів (ilarvverth та ін., 1992, 1993;). При дії на клон ракових клітин T47D різними мАт, такими якРНР5, FSR16, FWP51 і FSF77, спостерігалося підвищеня фосфорилювання тірозину протеїну ЕгЬВ-2.

Вплив NDF на активацію р70/85 S6 кінази

P70S6k/85Sbk були імунопреципітовані із T47D і AU565 клітин, на які діяли гі 1-NDF-P2. їх кіназна активність була визначена за допомогою 40S рибосомального протеїну в якості екзогеного субстрату. Крім цього, була виміряна S6 кіназна активність в неочищеному лізаті. Обидва аналізи довели, що стимулювання клітин NDF веде до підвищеия фосфорилювання S6. При вимірюванні базальної активності було визпечено, що у AU565 клітин вона приблизно в три рази вища, ніж у Т47І) клітин. Фосфорилювання S6 підвищувалась у відповідь на стимулювання різними формами NDF та EGF.

Ймовірно, що обидві МАРК та S6 кінази відіграють дуже важливу роль під час росту та диференціювання епітеліальних клітин молочної залози. Обидва шляхи проведення сигналу с активними під час мітогенного стимулювання та диференціювання не тільки клітин молочної залози, але і клітин інших тинів. Необхідна роль p70Sa:'/p85S6k у фібробластах була показана іп’скуванням антитіл інгібіторів до S6k, що запобігало G1/S прогресії мітогенно стимульованих клітин (Lane та ін., 1993; Reinhard та ін., 1994). ■

При ді'1'NDF p70S6k/p85S6k стимулюється залежно віддози однаково в обох лініях клітин. Максимальна активність досягалася після 15 хвилин стимуляції. Активність S6 кінази залишалася підвищеною в T47D клітинах після двох годин стимуляції, так само, як це спостерігалося для МАРК, а

ктивність AU565 клона клітин досягала в цей час престнмуляціГіного івня. Результати дослідів з НС11 клоном клітин були схожі на результати ослідів 3T47D клітинам. В епітеліальних клітинах молочної залози NDF ктивує як МАРК, так і S6 кіназу незалежно від реакції клітин.

Активність МАРК таp70S6k/p85S6k в клітинах, трансформованих активованим ЕгЬВ-2

Точкова мутація (V659E) (заміна глутамінової кислоти на валін) у ірансмембранній ділянці людського ЕгЬВ-2 гену приводить до його остійної тірозин кіназної активності та викликає онкотрансформацію vlasuko та ін., 1989), можливо, в наслідок того, що вона приводить до осилення дімерізації рецептору (Weiner та ін., 1989; Samantama ін., 1994). уло проаналізовано активність ізоформ МАРК (ERK1, ERK2) та p70S6k/ 85S6k у чотирьох клонах мишиних НС11 клітин, трансфікованих з тіивованим людським ЕгЬВ-2.

R2 клони експресують різні рівні людського р 185, мутантної форми гЬВ-2 з точковою мутацією, що може бути визначено за допомогою AT FRP5, які розпізнають лише трансфікований ЕгЬВ-2. У порівнянні з тіьківськими клітинами вміст фосфотірозину в активованому р 185 /в підвищений. Базальна активність ERK1, ERK2 та S6k у ^стимульованих R2 клонах була підвищена у порівнянні з активністю С11 клітин. Підвищення активності спстерігалося у 2.5 — 5.0 рази ія МАРК ізоформ тау 2.0 — 3.2 рази для S6 кінази. Слід відзначити, що юн R2no.2, який показував найвищий рівень експресії ЕгЬВ-2 протеїну, акож мав найвищу конституційну активність МАРК та S6 кіназ.

У чотирьох клонах ПСІ 1 клітин, які ексиресували різний мутантні рівень І£гЬВ-2, базальна активність ERK1, ERK2 та p70'w7p85S6k була ачно підвищена у порівнянні з активністю контрольних НС11 клітин, иовірно, що підвищення активності МАРК та S6k с достатнім для дтримкп високого рівня мітогенної активності та доповнення до рансформації шляхом егЬВ-2 онкогену. •

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

І Іезважаючи на наявність наукових праць, які свідчать, що розвиток ку є наслідком ненормальної експресії або функції протоонкогенів . Hynes, 1992, Masuko, 1989), список відкритих онкогенів с неповним і требус подальшого розширення.

Вивчення процесів фосфорилювання та функції активної форми S6 ну як можливого онкогену дозволить пояснити процеси росту та ференціаціїяк нормальних, так і трансформованих клітин.

Одним з результатів роботи стало виділення та картування тивного S6 гену з геному миші за допомогою S6 кДНК в якості проб.

За допомогою полімсразної ланцюгової реакції викликані мутації місць фосфорилювання безпосередньо на гені та змодельована гнучка система для вивчення ролі Б6 протеїну у процесах мітозу. Цінність цісї моделі полягає в тому, що функція 86 протеїну може бути вивчена на будь-якій стадії клітинного циклу та на будь-якій стадії життя тварини.

Після ініціації мутацій са’йтів фосфориляції було проведено експеримент для порівняння активації різних мутантних форм Б6 надрегуляторними кіназами. Експеримент показав, що жодні мутовані серпневі нуклеотиди не підлягали фосфорилюванню. На гелі фосфорильованими виявилися лише незмінепі серинові залишки, а коли було змінено всі серинові нуклеотиди не було виявлено жодного випадку фосфорилювання. Така різниця у фосфорилюванні ендогенної та мутантних форм Б6 протеїну підтверджує важливість серинових нуклеотидів в процесі активації рибосомального протеїну.

Під час проведення експерименту було виявлено, що клони клітин із генотипом БбєІГ/ЧуІ (гстеродефіцитні за 56) не с стабільними, при культивуванні їх на збагачуючому середовищі з метою отримання ДІ ІК клітини цього клону шляхом гомологічної рекомбінації відновлювали ендогенну структуру (86ууі/\уі) у 100% випадків.

Ймовірно, що відновлення ендогенної структури та нестабільність гетеродефіцитних за 86 геном клонів клітин можна пояснити тим, що рибосомальний білок 86 є необхідним для процесів росту та життєдіяльності клітин. Саме тому клони клітин, у яких 86 був вирізаний, росли набагато повільніше, та після 16 годин вони були вдвічі менші за клони Е. сої і з ендогенним 86 генотипом. Слід підкреслити, іцо навіть однієї трансформації було достатньо для того, щоби Б6 дефіцитні клони відновили свою структуру. Приготування ДНК з наступної нічної культури показало, що ендогенний генотип було відновлено.

Зміна активності 86 під час стимуляції мітогеиезу клітин молочної залози

У даній частині роботи вивчалася дія різних факторів росту на епітеліальні клітини молочної залози. Дія N1^ на ПСІ 1 та Т47Э клони клітин приводила до стимуляції їх росту, причому темпи росту нормальних епітеліальних клітин підвищувався у 1.14 — 1.92 рази, а клону ракових клітин — у 1.57 — 2.47 разу. Така суттєва різниця у мітогенній активності може свідчити про те, що ракова трансформація клітин приводить до змін активності фактично всіх процесів, які відбуваються у клітині.

Підвищена мітогенна активність ракових клітин може бути пояснена декількома механізмами. По-перше, підвищена спорідненість рецепторів клітини до факторів росту дозволяє клітині швидше і ефективніше реагувати на зовнішнє стимулювання. По-друге, фактори

гредачі мітотичного сигналу — протеїн тирозин та протеїн серин/ реонинові кінази, а також внутрішньоядерні регулятори транскрипціїі рансляції набувають змін, які приводять до підвищення рівнів їх осфорплювання.

У даній роботі було вивчено активацію МАРК та S6 кіназ за іпомогою NDF. Обидва шляхи проведення сигналу с активними під час ітогепиого стимулювання та диференціювання не лише клітин молочної лози, але і клітин інших типів.

Необхідна роль p70S6k/p85S6k у фібробластах була показана ’єкуванням антитіл інгібіторів до S6k, яке приводило до запобігання 1/S прогресіїмітогенно стимульованих клітин (Lane та ін., 1993; Reinhard а ін., 1994).

У багатьох монографіях з проблем онкогенезу молочної залози візується на надзвичайно важливе значення ЕгЬВ-2 рецептору для :ханізмів онкотрансформації. Щоби показати, що стимулювання ЕгЬВ-с достатнім для активування МАРК та S6k, у даній роботі було пропоновано два методи. Заміна глутамінової кислоти на валін в рансмембранній ділянці ЕгЬВ-2 викликає незалежну від ліганда імеризацію, підвищену кіназну активність та онкогенну активацію Seiner та ін., 1989; Samanta та ін., 1994). У чотирьох клонах НС11 іітин, які експресували різний мутантний рівень ЕгЬВ-2, базальна тивність ERK1, ERK2 map70S6k/p85S6k була значно підвищена порівняно ікттшістю контрольних НС11 клітин.

Ймовірно, що зв'язування моноклональними антитілами екстра-ілюлярної ділянки ЕгЬВ-2 приводило до підвищеного вмісту фосфоти-ізину завдяки кросліпкуванню двох рецепторів (Harvverth та ін., 1992, *93). Дані нашої роботи свідчать, що активація ЕгЬВ-2 як шляхом зчкової мутації, так і шляхом використання антитіл, достатня для пуску тих самих фосфориляційних каскадів, які запускає NDF.

Висновки

1. Виділено та картовано активний S6 ген із геному миші, проведено 'тації місць фосфорилювання безпосередньо на ньому, та змодельована учка система для вивчення ролі S6 протеїну у процесах мітозу. Цінність □ моделі полягає в тому, що функція S6 протеїну може бути вивчена на дь-якій стадії життя тварини.

2. Різниця у фосфорилювані ендогенної та мутантних форм S6

іотеїну вказує на значимість Ser нуклеотидів в процесі активації босомального протеїну. ‘

3. В експерименті з ES клітинами було показано, що після вирізання цієї з копій S6, наступні покоління клітин не лише не успадкували цього нотипу. але і реставрували ендогенний генотип шляхом гомологічної

рекомбінації. Отриманий результат свідчить про те, що для нормальної клітинної прогресії клітині недостатньо однієї копії S6 гену.

4. Дія NDF на НС11 та T47D клони клітин приводить до стимулювання їх росту, причому темпи росту нормальних епітеліальних клітин підвищувались у 1.14 — 1.92 рази, а клону ракових клітин -— у 1.57 - - 2.47 рази.

5. Всі ізоформи NDF стимулюють кіназну активність МАРК та S6k як нормальних, так і трансформованих клітин.

6. Дані нашої роботи показують, що активація ЕгЬВ-2 як шляхом точкової мутації, так і шляхом використання антитіл достатня для запуску тих самих фосфориляційних каскадів, які запускає NDF.

Практичні рекомендації

1. Отримані моделі in vitro— ES клітини та in vivo'— Т-клітини мишей з заміненим на мутовані форми ендогенним S6 можуть бути використані для вивчення ролі S6 рибосомального протеїну в процесах росту та диференціювання клітин.

2. Визначення онкогеїшо-змінених рецепторів ЕгЬВ-2 дозволить виявляти онкотрансфомацію клітин молочної залози на початкових стадіях розвитку малігнізованих клітин.

3. Миші з генотипом CD-2 CRE S6vvt/S6wt можуть бути використані для вирізання будь якої послідовності нуклеотидів в їх Т-клітинах.

4. Всі плазміди, як з мутантними формами S6 протеїну, так і з

заклонованим S6 геном, можуть бути використані у генній інженерії та молекулярній біології. .

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Kovalchuk 1. Transgenic mice. CRE/loxp recombination system// Annual meeting, FMI, St. Moritz, Switzerland. 1994. — P. 11-14.

2. Thomas G., Berry C.O.A., Chatterjee M., Chen Y., Dennis P.B., I lan J.W., HoemannC., JefFeries H.B.J., Kovalchuk I., Kozma S.C., Landolt T., MingX.F., Moser B., Pearson R.B., Pullen N., Reimhard C., Stewart M.J., von Manteuffel S. S6 phosphorylation sites// Annual Report, FMI, Basel, Switzerland. 1995. — P. 92-94

3.. Hohn T., Burn L., Chapdclaine Y., Chen G., Corsten S., Dominguez D., Herzog E., He X., Hemmings-Mieszczak M.,! limmeibach A., Karsies A., Kirk D. W.P., Kovalchuk 1., Leclerc D., Lewetag D., Meier E., Mougeot J-L., MullerM., Rothnie FL, Pooggin M., Ryabova L.. Scharer-llermandez N., Schmidt-Puchta W., Zcenko V. Ribosome shunt. Proteins and RNAs involved in translational control//Annual Report, FMI, Basel, Switzerland. 1996. — P. 61-64

4.. Hohn B., Bravo Angel A.M., Broyer S., Crouzet P., Duckely M., GloeckerV., Kocher S., Kovalchuk I.. Kovalchuk O.. Lucht J.M., Ramos C.M.O.. Ries G.. Rossi L,

oki S., Y-Q Wu, Ziemienowicz A. /.Somatic homologous recombination// Annual eport, FMI, Basel, Switzerland. 1997. — P. 54-56

5. Ковальчук І.П. Механізми онкогпрансформаціїепітеліальних клітин олочноїзалози. Роль рибосомального протеїну S6 // Цитологія і генетика.-)98.-№1,—С.

Ковальчук І.П. Роль фосфорильованого рибосомального протеїну S6 в ;ханизмах мітогенезу нормальних та онкотрансформованих клітин.-Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата медичних наук з іеціальності 03.00.15 — генетика, Українский науковий гігієнічний центр, іїв, 1998.

Розроблені in vivo та in vitro моделі для вивчення функції рибосомального ютеїііу S6, який відіграє важливу роль в процесах мітогенной регуляції клітиі їй. ісця фосфориляції S6 протеїну були мутовані в S6 кДНК та S6 гені, який був ерше виділений та картований. Це зробило неможливимактивацію білка. In vo мутантні форми S6 були експресовані .піше в Т-клітинах мишей, догенный S6 був замінений па мутантні форми в ES (ембріональних стволових) ітинах і у фібробластах мишей (Swiss ЗТЗ клітини).

Клон нормальних епітеліальних клітин і два клони ракових клітин точної залози стимулювались EGF і NDF факторами росту. Вивчалась тивність різних протеїн-кіназ в шляхах проведення сигналу, який запускає оцеси поділу клітини та її дифференціації у відповідь на дію мітогенних гуляторів. При різних концентраціях факторів росту спостерігалась різна тивність ізоформ МАР кінази та p70S6 кінази, а також фосфориляція S6 отеїну. Стимуляція ЕгЬВ-2 рецептора приводила до активації як МАР, так і кінази. Ці результати підтверджують, що регуляція мітогенезу ракових ітин відбувається за таким самим механизмом, як і у нормальних клітин.

Ключові слова: S6 рибосомальний протеїн, мітотична активність, котрансформація.

Ковальчук И.П. Роль фосфорилированного рибосомального протейна в механизмах митогенеза нормальных и онкотрапсформированых клеток.-чопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук специальности 03.00.15 — генетика, Украинский научний гигиенический imp, Киев, 1998.

Разработаны in vivo и in vitro модели для изучения функции 5осомального протеина S6. играющего важную роль в процессах митогенной уляции клетки. Места фосфориляции S6 протеина были мутированы в :рвые выделенном и картированном S6 кДНК и S6 гене. Это сделало юзможным активацию белка. In vivo мутантные формы S6 были

экспресированы только в мышиных Т-клетках. In vitro эндогенный S6 был заменен на мутантные формы в ES (эмбриональных стволовых) клетках и в мышиных фибробластах (Swiss ЗТЗ клетки).

Клон нормальных эпителиальных клеток и два клопа раковых клеток молочной железы стимулировались EGF и NDF факторами роста. Изучалась активность разных протеип-киназ в путях проведения сигнала, запускающего процессы деления клетки и ее дифференциации в ответ на действие митогенных регуляторов. При разных концентрациях факторов роста наблюдалась разная активность изоформ МАР киназы и р7(Р киназы, а также фосфориляция S6 протеина. Стимуляция ЕгЫЗ^ рецептора приводила к активации как МАР, так и S6 киназы. Данные результаты подтверждают что регуляция митогенеза раковых клеток проходит по таким же механизмам, как и у нормальных клеток.

Ключевые слова: S6 рибосомальный протеин, митотическая активность, онкотрансформация.

Kovalchuk l.P. Role of phosphoiylated S6 ribosomal protein in the mechanism? of the normal and malignant cell mitogenesis.-Manuscript.

Theses for candidate of medical sciences degree on speciality 03.00.15 -genetics, Ukrainian national hygienic centre, Kyiv, 1997.

Normal mammary epithelial cclls clone and two breast cancer cells clones were stimulated by EGF and NDF growth factors. The activity of different protein-kinases in mitogenic signal transduction pathway was investigated. Protein-kinases lead tc the cell division and prolifiration in response to the mitogenic regulations. NDF isoforms in different concentrations activate МАРК and S6k with different level ol magnitude. ErbB-2 receptor stimulation leaded to the activation of MAP and S6 kinase. Obtained results can confirm the similarity in mitogenic regulation mechanism of normal and transformed cells.

For investigation of ribosomal protein S6 function two models in vivo and in vitro were introduced. S6 plays an important role in mitogenic cell regulation process The S6 phosphorylation sites were mutated in cDNA and in the gene, and this unabled the protein activation. This gene was obtained and mapped for the first time in mouse. Mutated S6 forms were expressed only in murine T-cells (in vivo). The endogenose S6 was replaced by mutants in ES and Swiss 3T3 cells in vitro.

Key words: S6 ribosomal protein, mitotic activity, onkotransfnrmation.