Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию

Макаренко, Владислав Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию"

На правах рукописи

МАКАРЕНКО ВЛАДИСЛАВ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

РОЛЬ ЭНДОТЕЛИЯ В МЕХАНИЗМАХ ОТВЕТА НА ПРЕРЫВИСТУЮ НОРМОБАРИЧЕСКУЮ ГИПОКСИЮ

03.00.04 - биохимия 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Барнаул - 2009

003472114

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Алтайском государственном медицинском университете Росздрава (г. Барнаул)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ельчанинова Светлана Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович доктор медицинских наук, профессор Кривощеков Сергей Георгиевич

Ведущая организация: Государственное учреждение Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск)

Защита состоится «_» ___ 2009 г. в __часов на заседании

диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3833-33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «_»____ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Русских Г. С.

Подписано в печать 22.05.2009г. Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 524 Отпечатано в типографии «ГРАФИКС» Лицензия ПД №12-0150 от 14 ноября 2001 г. г. Барнаул, Ползунова 456/Красноармейский, 15 т./ф. 63-77-02, т. 65-98-14, e-mail: graphx@dsrnail.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Астуальность темы. Общепризнано, что продуцируемые эндотелием биологически активные вещества играют ведущую роль в регуляции функциональной активности, пролиферации и аггоптоза клеток сосудистой стенки, ее взаимодействии с форменными элементами и компонентами плазмы крови (Pohlman Т.Н., Harlan J.M., 2000; Galley H.F., Webster N.R., 2004; Marti H.H., 2005). Скорость синтеза и секреции эндотелиальных факторов, в свою очередь, регулируются множеством вазоактивных сигнальных молекул - ацетилхолином, брадикипином, ангиотензином II и другими, а также локальными изменениями скорости кровотока (Karimova A., Pinsky D.J., 2001; Michiels С., 2003). Одним из мощных факторов, модулирующих метаболизм эндотелиоцитов является гипоксия (Faller D.V., 1999; Michiels С. et al., 2000; Li J.M., Shah A.M., 2004; Jernigan N.L. et al., 2004; Fike C.D. et al., 2005).

Воздействие разными вариантами гипоксии и, в частности, прерывистой нормобарической гипоксией (ПНГ) уже долгие годы используется для профилактики и лечения многих хронических заболеваний, повышения неспецифической резистентности организма (Меерсон Ф.З., 1973; Караш Ю.М. и др., 1986; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001). Установлено, что иод влиянием курса ПНГ у здоровых людей развивается комплекс адаптивных изменений в различных системах организма, включающий возрастание потребления и эффективности использования кислорода, увеличение кислородной емкости крови, уменьшение реактивности симпатоадреналовой системы (Горанчук B.I3. и др., 2003; Кривощеков С.Г. и др., 2004; Serebrovskaya T.V. et al., 2005).

Показано изменение артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса резистивных сосудов при ПНГ у здоровых людей, а также возможность коррекции с использованием ПНГ дисфункции эндотелия, нарушений гемодинамики у больных с артериальной пшертензией и шяемической болезнью сердца (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001 ; Ельчанинова С.А. и др., 2002, 2008; Потиевская В.И., 2005). Анализ данных литературы позволил нам предположить, что механизмы адаптивных преобразований сердечно-сосудистой системы под воздействием ПНГ включают изменения функционирования эндотелия, его активацию с развитием устойчивости к действию повреждающих факторов.

Цель работы: Изучить роль эндотелия кровеносных сосудов в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей - концентрацию в крови эндотелиальных микрочастиц CD31+, большого эндотелина-1 1-38, васкулярного эндотелиального фактора роста.

2. Изучить влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели окислительного стресса и активность внутриклеточных антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы - у здоровых людей.

3. В первичной культуре эндотелиальных клеток человека оценить воздействие прерывистой нормобарической гипоксии на показатели состояния межклеточных контактов, участие в их изменениях активных форм кислорода.

4. Исследовать изменение продукции активных форм кислорода, накопления тиобарбитуратреактивных продуктов в первичной культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

5. Изучить динамику концентрации васкулярного эндотелиалыюго фактора роста в клеточной среде первичной культуры эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

6. Оценить влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов - Н1Р-1а и Н1Р-2а, в клетках первичной культуры эндотелиоцитов человека.

Научная новизна.

Впервые показано, что механизм воздействия ПНГ (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей включает снижение концентрации в крови маркеров повреждения эндотелия на фоне повышения концентрации васкулярного эндотелиалыюго фактора роста, активности внутриклеточных антиоксидантных ферментов и снижения концентрации продуктов перекисного окисления липидов.

На культуре эндотелиоцитов человека впервые показано, что ПНГ оказывает прямое влияние на эндотелиоциты: приводит к опосредованному активными формами кислорода кратковременному ослаблению межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, возрастанию продукции васкулярного эндотелиалыюго фактора роста, накоплению в эндотелиоцитах индуцируемых гипоксией факторов транскрипции НИМа иН1Р-2а.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты работы свидетельствуют об участии эндотелия в механизмах адаптации к прерывистой нормобарической гипоксии, о возможности формирования не опосредованного системными регуляторными факторами ответа эндотелиоцитов на это воздействие.

Установленные закономерности указывают на перспективность исследования применения ПНГ для первичной профилактики артериальной гипертензии и атеросклероза - заболеваний сердечно-сосудистой системы, центральным звеном патогенеза которых является дисфункция эндотелия.

Положения, выносимые на защиту.

1. У здоровых людей курс прерывистой нормобарической гипоксии вызывает транзиторную активацию эндотелия, которая проявляется увеличением в крови концентрации эндотелиальных СШ1+ микрочастиц, большого эндотелина-1 138, концентрации васкулярного эндотелиалыюго фактора роста, и сопровождается кратковременным усилением окислительного стресса и повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.

2. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования

воздуха с гипоксической газовой смесыо, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом между сеансами) вызывает формирование не опосредованных системными регуляторами приспособительных реакций эндотелиоцитов, включающих зависимое от активных форм кислорода кратковременное ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, ослабление индуцированного гипоксией окислительного стресса, прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста. 3. Механизм реализации эффектов прерывистой нормобарической гипоксии на эндотелиоциты включает активацию системы индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на III научной конференции «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003), VI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2004), VII научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), совместном заседании кафедр биохимии и физиологии (Барнаул, 2009), проблемной комиссии по физиологии и патофизиологии сердечно-сосудистой системы ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (Барнаул, 2009).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственного исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 204 литературных источников, из них 55 - на русском языке и 139 - на иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев (10 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 31 до 35 лет (средний возраст 33±2 год). Курс ПНГ, который проводили с использованием установки БиоНова-204 (Россия), включал 20 ежедневных сеансов продолжительностью 60 минут. Сеанс состоял из 6 циклов длительностью 10 минут, в которых вдыхание через маску гипоксической газовой смеси с содержанием кислорода 10-12 об.% чередовалось с вдыханием атмосферного воздуха в циклическом режиме. Длительность вдыхания гипоксической смеси в цикле увеличивалась от 1 до 5 мин в первые четыре дня курса, а затем составляла 5 мин. Согласно рекомендациям Минздрава СССР (Стрелков Р.Б. и др., 1985), длительность дыхания гипоксической газовой смесью в первые сеансы ПНГ назначали в зависимости от результатов пробы Штанге -продолжительности задержки дыхания на вдохе.

Для исследования эффектов ПНГ в эксперименте in vitro была использована первичная культура клеток эндотелия микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ,

HMVE-L), полученная от Lonza Walkersville, Inc. (США).* Культура ЭМСЛЧ выращивалась в пластиковых чашках Петри (диаметр 100 мм) с использованием стандартной жидкой среды для эндотелиоцитов Clonetics EGM-2-MV BulletKit (Lonza Walkersville, Inc., США) на основе базисной среды 2 для эндотелиальных клеток с добавлением гентамицина, амфотерицина-В, гидрокортизона, эмбриональной телячьей сыворотки и необходимых факторов роста. Клетки выращивались в атмосфере, содержащей 21 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа и 74 об.% азота. Для оценки эффектов ПНГ были использованы ЭМСЛЧ седьмого-девятого пассажа, достигшие 80-100% конфлюентности. Воздействие ПНГ проводили с использованием инкубатора "Steri-Cult 200 Incubator" (Thermo Scientific, США), в который помещали герметичную пластиковую камеру размером 20x25x15 см. Чашки с культурой ЭМСЛЧ располагали в центре камеры. Во время сеанса нагретая до 37°С газовая смесь постоянно поступала в камеру, отработанная смесь через выводящий клапан выводилась наружу. Объем и скорость поступления газовой смеси в камеру осуществлялась соленоидными клапанами автоматического дозатора газов «Flowmeter». Попеременно использовали готовые газовые смеси: нормоксическую (20 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 75 об.% азота) и гипоксическую (1 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 94 об.% азота). Воздействие включало три одночасовых сеанса ПНГ, каждый из которых состоял из б циклов чередования 5-минутной нормоксии и 5-минутной гипоксии. Повтор сеанса проводили после одночасового периода нормоксии.

При разработке схемы воздействия ПНГ in vitro ставилась задача максимально приблизить се параметры к схеме гипоксической тренировки in vivo. В конце периода вдыхания гипоксической газовой смеси в капиллярной крови здоровых участников исследования парциальное давление кислорода снижалось от 83-108 до 35-45 мм рт. ст. В культуральной среде в процессе ПНГ парциальное давление кислорода в течение 5 минут пропускания гипоксической смеси через камеру снижалась от 80 до 35-45 мм рт ст. Длительность нормоксии между сеансами была подобрана в предварительных экспериментах с учетом длительности сохранения жизнеспособности культуры, оцениваемой по восприятия красителя трепанового синего.

Уровень артериального давления (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли с использованием автоматического измеряющего устройства A&D М400 (Япония). Коныоктивальную биомикроскопию проводили с помощью щелевой лампы ЩЛ-2 (Россия), установленной горизонтально па подвижном штативе (увеличение в 16 раз). Оценку микроциркуляции проводили по методу B.C. Волкова и соавторов (1976) с вычислением конъюктивального индекса -суммы баллов признаков нарушения микроциркуляции. Выраженность окислительного стресса оценивали по общей прооксидантной активности (ОПА),

Эксперименты в культуре эндотелиоцитов выполнены при содействии гранта государственного фонда США имени сенатора 1IV. Ри1Ьг^Ы. Автор выражает благодарность профессору РгаЬЬакаг докторам Мапйиг1 У., У^-Ле N. и другим сотрудникам лаборатории прерывистой гипоксии Центра системной биологии университета Чикаго за помощь в освоении технологии работы с культурой кчеток.

которую оценивали по накоплению в модельной системе продуктов перекисного окисления ТВИН-80, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (Галактионова Л.П. и др., 1998), и концентрации в плазме крови тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) (Владимиров Ю.М., Арчаков А.И., 1972). Активность антиоксидантных ферментов исследовали в гемолизате эритроцитов и рассчитывали на единицу массы гемоглобина, определенного гемоглобинцианидным методом (Меньшиков В.В. и др., 1987). Активность супероксиддисмутазы определяли по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия супероксидом (Чевари С.И. и др., 1991); активность каталазы - по подавлению окисления молибдата перекисью водорода (Чевари С.И. и др., 1991); глутагионпероксидазы - по убыли восстановленного глутатиона при его окислении гидроперекисью третбутила (Моин В.М., 1986). Концентрацию в сыворотке крови васкулярного эндотелиалыюго фактора роста (vascular endothelial groth factor, VEGF) и большого эндотелина-1 1-38 определяли методом иммуноферментного анализа с реагентами и по протоколам процедур Cytimmune Sciences Inc. (США) и Biomedica Gruppe (Австрия) соответственно. Концентрацию эндотелиальных микрочастиц (ЭМ) определяли в бедной тромбоцитами плазме крови подсчетом CD31+ частиц размером 1,5-4,0 мкм методом проточной цитофлуорометрии с использованием мышиных моноклоналыгых ФИТЦ-меченых антител фирмы Coltag (США) на цитофлуоримстре «Epix XL» фирмы Coulter (Франция).

Для оценки проницаемости монослоя, образованного ЭМСЛЧ, применяли методику динамического измерения импеданса клеток (ECIS) (Giaever I., Kecse C.R.,1988). Монослой клеток формировали на микроэлектродах (Applied Biophysics, США), через которые пропускали переменный ток силой менее одного микроампера. Электролитом служила стандартная среда для эндотелиальных клеток. Регистрировали суммарный импеданс в системе электродов, изменения которого отражали изменения в межклеточных и адгезионных (с поверхностью микроэлектродов) контактах. Выраженность окислительного стресса в культуре ЭМСЛЧ оценивали по концентрации ТБРП в лизате эндотелиоцитов и усилению флуоресценции клеток, предварительно обработанных дихлорфлюоресцином, с использованием микроскопа Nikon Eclipse ТЕ 300. Количественный анализ изображений проводили с использованием программы Scion Image. Измерение концентрации VEGF в клеточной среде проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы и по протоколам процедур фирмы Santa Cruse Ltd. (США). Содержание HIF-la и HIF-2a в лизате ЭМСЛЧ проводили методом иммуноблота в 7,5% полиакриламидном геле с использованием первичных мышиных моноклональных антител (Novus, США) к HIF-la и HIF-2a и вторичных меченых псроксидазой хрена моноклональных антител (Chemicon Inc., США).

Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием программы Sigma Stat 3.1. (Systat Software Inc., 2004). Соответствие нормальному распределению оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. При проверке нормальности распределения не было выявлено различий между мужчинами и женщинами по использованным в работе показателям, поэтому анализ проводили без разделения участников исследования по полу. Для анализа выборок с

нормальным распределением были избраны параметрические методы статистики. Межгрупповую вариабельность оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа; множественные парные сравнения по критерию Стыодента-Ныомена-Кейлса с использованием пакета ANOVA. Анализ данных, не соответствующих нормальному распределению, проводили с использованием критерия Уилкоксона. Сравнение долей проводили с использованием критерия .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей. В исследованиях, проведенных с участием здоровых добровольцев, в ответ на ПНГ были выявлены изменения микроциркуляторного русла и гемодинамических показателей, которые указывали на участие системы кровообращения в комплексной реакции организма на это воздействие. Во время четвертого (пятого) сеанса ПНГ зарегистрировано повышение систолического АД от 122,3±4,7 до 127,8±7,2 мм рт. ст. (р<0,05) и ЧСС от 68,7±4,8 до 76,9±5,6 уд/мин (р<0,05). Эти изменения ограничивались временем сеанса и выявлялись не более, чем в пяти последующих сеансах. Значимых изменений диастолического АД в отдельных сеансах не выявлено, наблюдалось тенденция к его снижению (р<0,2) через 15 минут после последнего сеанса ПНГ относительно исходного уровня, что согласуется с данными других авторов (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Горанчук В.В. и др., 2003). Изменения АД и ЧСС не выходили за пределы физиологической нормы, и, вероятно, отражали процесс формирования адаптации к повторяющимся гипоксическим стимулам. Через сутки после последнего сеанса не выявлено изменений АД и ЧСС относительно их уровня до курса ПНГ.

После курса ПНГ по данным конъюктивальной биомикроскопии в микроциркуляторном русле происходило выравнивание калибра сосудов, увеличение артериоло-венулярного соотношения и уменьшение встречаемости зон запустевания капилляров и, как следствие, снижение конъюнктивального индексас 2,0±0,1 до 1,3±0,1 баллов (р<0,001).

Функциональные и морфологические изменения в кровеносной системе участников исследования, а также данные литературы об изменении продукции эндотелиальных факторов - васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), простагландинов, эндотелинов, оксид азота и других, при воздействии постоянной гипоксии (Minchenko A. et al., 1994; Liu Y. et al., 1995; № Z., 1998; Fryer R.M. et al., 2002; Semenza G.L., 2005) позволяли предполагать участие эндотелия в механизмах ответа на ПНГ. Для проверки этой гипотезы в плазме крови участников исследования был измерен уровень эндотелиальных факторов -большого ЭТ-1 1-38 и CD31+ эндотелиальных микрочастиц (ЭМ), а также VEGF, которые в настоящее время рассматриваются как маркеры активации/повреждения эндотелиоцитов и активации процессов регенерации эндотелия соответственно (Zachary I et al., 2000; Chong A.-Y. et al., 2003; Horstman L.L. et al., 2004; Marti H.H., 2005).

р<0,001

До ПНГ Первый день

после ПНГ

Второй день после ПНГ

ЭМ, 10 /л И большой ЭТИ 1-38,10"12 г/л П VEGF, 107г/л

rfl

Четвертый день Четырнадцатый после ПНГ день после ПНГ

Рис. 1. Изменения маркеров повреждения и регенерации эндотелия у здоровых людей под воздействием курса прерывистой нормбарической гипоксии (М + SD). р - уровень значимости различий по сравнению с результатами до курса ПНГ по критерию Нъюмена-Кейлса.

В первый день после курса ПНГ наблюдалось увеличение содержания ЭМ и большого ЭТ-1 1-38 в плазме крови участников исследования (рис. 1). Эти данные согласуются с данными об умеренном транзиторном повреждении неэндотелиальных клеток при интермиттирующей гипоксии (Prabhakar N., 2001). Нельзя исключить, что повышение плазменного уровня ЭМ связано с усилением их образования при так называемой активации эндотелиоцитов, которая рассматривается как адаптивная реакция этих клеток на возмущающие факторы и проявляется комплексом фенотипических изменений в отсутствии морфологических признаков повреждения (Zwaal R.F. et al, 1997; Sabatier F. et a!., 2002). Содержание как ЭМ, так и большого ЭТ-1 1-38 снижалось до исходного уровня ко второму дню после завершения курса ПНГ.

Повышение концентрации VEGF в первые сутки после курса ПНГ сменялось снижением ко вторым суткам, после чего на четвертые сутки отмечалось повторное возрастание (см. рис. 1). Снижение концентрации VEGF до исходных значений происходило к 14-м суткам после курса ПНГ. Две фазы ответа, вероятно, обусловлены разными механизмами, последовательно сменяющими друг друга: первый пик может быть следствием транзиторного слабовыраженного повреждения эндотелиоцитов активными формами кислорода (АФК) (Tsai W.C. et al., 2005), тогда как второй развивается вследствие усиления биосинтеза VEGF в ответ на это повреждение (Minchenko A. et al., 1994; Liu Y. et al., 1995; Sodhi A. et al.,2000).

Следует отметить, что выявленные после курса ПНГ изменения в плазменной концентрации эндотелиальных факторов у здоровых людей согласуются с данными об ослаблении повреждения эндотелия у больных эссенциальной артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца после воздействия ПНГ (Смагина И.В., 2002; Золовкина А.Г. и др., 2008).

Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели метаболизма активных форм кислорода у здоровых людей.

Многочисленные данные об усилении продукции АФК различными типами клеток при действии гипоксического стимула (Леденев А.Н. и др., 1985; Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Yang W. et al., 1995; Pearlstein D.P. et al., 2002; Schumacker Р., 2006) позволяли предполагать, что одним из повреждающих и/или активирующих эндотелиоциты факторов при действии ПНГ являются АФК.

В первый день после курса ПНГ, когда выявляется краткосрочная реакция на последний сеанс курса ПНГ, в сыворотке крови участников исследования были повышены общая прооксидантная активность (ОПА) и концентрация ТБРП относительно соответствующих значений этих показателей до курса ПНГ (табл. 1). В последующие дни наблюдалось снижение этих показателей окислительного метаболизма до уровня, соответствующего исходному состоянию.

Таблица 1

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на показатели оксидантного статуса здоровых людей (М ± SD)

Показатель До ПНГ После ПНГ

(11-30) Первый день (п=30) Четвертый день (п=30) Четырнадцатый день (п=30)

Общая прооксидантная активность, % 13,3+1,4 27,2 + 2,6 р< 0,001 17,1 ±2,1 14,4+ 1,7

Тиобарбитурат-реакгивные продукты, мкМ 3,7 + 0,2 7,6 ±0,4 р< 0,001 4,1 + 0,3 3,8 ±0,2

Суперокскд-дисмутаза, ед/мг IIb 78,0 ±4,3 68,8 ±3,3 р < 0,001 101,4 ±5,2 р < 0,001 80,2 ± 3,9

Глутатион- лероксидаза, ед/гНЬ 1910,0 ±46,1 1185,9 ±52,6 р< 0,001 2293,2 + 49,0 р< 0,001 1886,4 + 50,7

Каталаза, ед/гНЬ 248,0 ±11,2 198,6 ±14,1 р < 0,001 382,7+ 15,8 р< 0,001 293,3 ± 12,8

Примечание. р - уровень значимости различий по сравнению с результатами до курса ПНГ по критерию Ньюмена-Кетса

Таким образом, весьма вероятно, что выявленное нами увеличение концентрации ЭМ и большого ЭТ-1 1-38 в плазме крови в значительной степени обусловлено повреждением/активацией эндотелиоцитов АФК и свободно-радикальными метаболитами процесса перекисного окисления липидов. Это согласуется с данными о развитии умеренного транзиторного окислительного стресса, сопровождавшегося повышением концентрации комплекса маркеров повреждения эндотелиоцитов, у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями при действии ПНГ (Смагина И.В., 2002; Ельчанинова С.А. и др., 2004).

Можно полагать, что в механизм усиления продукции АФК при ПНГ вовлечены вызванный изменением парциального давления кислорода переход электронов с I и III комплексов дыхательной цепи на кислород и активация НАДФ-оксидазы (Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Лукьянова Л.Д., 2008; Schumacker Р., 2006; Rathore R. et al., 2008).

Одновременно с изменениями в оксидантном статусе участников исследования под воздействием ПНГ регистрировалось транзиторное снижение активности всех трех исследованных антиоксидантных ферментов в первый день после курса ПНГ с последующим возрастанием на четвертый день. Снижение активности могло быть связано с возрастанием функциональной нагрузки на ферменты и их инактивацией АФК, свободно-радикальными метаболитами в условиях нарастания выраженности окислительного стресса (Сазонтова Т.Г. и др., 2002; Comhair С.С.С. et al, 2005). Возрастание активности ферментов может объясняться как ослаблением этого инактивирующего эффекта, так и усилением экспрессии генов антиоксидантных ферментов. На возможность последнего механизма указывают данные экспериментальных исследований в культуре клеток и на животных, в которых показано накопление мРНК антиоксидантных ферментов и увеличение их активности под воздействием гипоксии (Franco A.A. eta!., 1999; Stroev S.A. etal., 2005).

Функциональные и биохимические признаки ответа эндотелиоцитов на ПНГ у здоровых людей позволяли предположить, что механизм этого воздействия на сердечно-сосудистую систему включает прямые эффекты гипоксии на эндотелий. Для проверки этой гипотезы были проведены исследования в культуре эндотелиальных клеток микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ).

Исследование изменений показателей межклеточных контактов в культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии. Известно, что выполнение эндотелием таких функций как взаимодействие с клетками крови, регуляция тонуса сосудистой стенки, активности систем гемостаза и других зависит от состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов (Killy D.G. et al., 1996; Gregg D. et al., 2004; Garrido-Urbani S. et al., 2008). Типовой реакцией эндотелиоцитов в ответ на воздействие постоянной гипоксии и других активирующих факторов является изменение межклеточных и адгезионных контактов (Usatyuk P.V., Natarajan V., 2005; Dehler М. et al., 2006). Согласно данным Partridge С. (1995), непрерывная гипоксия вызывает связанное с перестройкой межклеточных контактов изменение проницаемости монослоя эндотелиоцитов, зависящее от продолжительности и степени ограничения доступа кислорода к клеткам. В связи с этим, нами была проведена оценка состояния межклеточных контактов в культуре ЭМСЛЧ методикой ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing) по изменению импеданса монослоя клеток (Giaver I., Keese C.R., 1991). Дополнительно состояние межклеточных контактов оценивали методом световой микроскопии нативной культуры.

После первого сеанса ПНГ было выявлено снижение импеданса монослоя культуры ЭМСЛЧ примерно на 15% от исходного уровня (рис. 2А), что указывало на возрастание проницаемости монослоя клеток. Уже через 20 минут

после прекращения сеанса прерывистой гипоксии обнаруживалось полное восстановление проницаемости до исходного уровня. При первом сеансе ПНГ была выявлена также дезинтеграция клеток и изменение их морфологии -эндотелиоцигы принимали вытянутые, веретенообразные формы (рис. 2Б). Последнее, вероятно, связано не только с изменением структуры межклеточных контактов, но и перераспределением в клетках элементов цитоскелета, в частности, полимеризацией актина и образованием стресс-фибрилл, характерных при воздействии гипоксии (Г^уик Р.У., 2005; ОИаззегшГаг Я. е1 а1., 2006).

А)

1,4

1,3 1,2 -1,1 1

0,9 0,8 0,7

0,6

Нормализованный импеданс

р<0.001

без ПТПМ Ш О ПТПМ, 50 мкМ

до ПНГ

Б)

■ИИ ЯИИИЯИИ Ч'Л

: н

ШШШШШШШ* ............вдшг:;; И— ■ИНН

после 1 сеанса ПНГ после 2 сеанса ПНГ после 3 сеанса ПНГ

ШШ

..... .

¡»¿Г......г........3....... . х«:

IШШ

■ншн ■■■■

ЯВИМ

Г. ■ Я • -

До ПНГ

Сразу после 1 сеанса ПНГ

Сразу после 2 сеанса ПНГ

Сразу после 3 сеанса ПНГ

Рис. 2. Влияние сеансов прерывистой иормобарической гипоксии на проницаемость и структуру монослоя клеток в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека (М± вЭ), п=7

После второго сеанса ПНГ достоверного снижения импеданса ЭМСЛЧ не наблюдалось. Третий сеанс ПНГ вызывал 12%-ное увеличение импеданса, которое сохранялось в течение 20 мин после сеанса. Световой микроскопией нативной культуры ЭМСЛЧ после второго и третьего сеансов ПНГ существенных морфологических изменений выявлено не было.

Принимая во внимание данные об участии АФК в регуляции прочности межклеточных контактов эндотелиоцитов (КпгЬау 1.А. й а1., 2003; Г^уик Р.У.,

1Ча1:ага]ап V., 2005), можно предполагать, что появление такой резистентности культуры эндотелиоцитов к повторным воздействиям ПНГ может быть связано со снижением выраженности индуцированного гипоксией окислительного стресса и ослаблением влияиия АФК на белки межклеточных контактов.

Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов. Была проведена оценка окислительного стресса в культуре ЭМСЛЧ по уровню ТБРП в лизате эндотелиоцитов, а также накоплению АФК методом флуоресцентной микроскопии. После первого и второго сеансов ПНГ было обнаружено практически двукратное усиление генерации АФК в эндотелиоцитах и, одновременно с этим, повышение концентрации ТБРП в лизате эндотелиоцитов (табл. 2). После третьего сеанса ПНГ уровень этих показателей снижался до исходных значений, отражая, вероятно, процесс приспособления эндотелиоцитов к прерывистой гипоксии.

Таблица 2

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека (М ± БЭ)

Показатели

Продукция АФК, %

Флуоресцентная микроскопия ЭМСЛЧ с ДАДХФ

ТБРП,

мкг/мг белка

До ПНГ

(п=5)

После первого

сеанса ПНГ _ (11=5)

После второго

сеанса пнг . <"=5>

После третьего сеанса пнг

(п=5)

97,6 ± 14,3

5,5 ± 0,3

142,9 ±30,1 р< 0,001

139,1 ± 18,1 р< 0,001

108,1 ± 18,6 р* < 0,001 р**< 0,001

23,9 ± 0,7 Р1 < 0,001

19,1 +0,9 Р1 < 0,001

¡±1,1 р,*< 0,001 р,**< 0,001

Примечание. Уровень значимости различий по критерию Ушкоксона: р - с результатом до ПНГ, р* - с результатом после первого сеанса ПНГ, р** - с результатом после второго сеанса ПНГ. Уровень значимости различий по критерию Ньюмена-Кейлса: р] - с результатами до ПНГ; р1* - с результатом после первого сеанса ПНГ, р/** - с результатом после второго сеанса ПН! 1

Учитывая выявленное в наших исследованиях с участием здоровых добровольцев повышение активности антиоксидантных ферментов под воздействием ПНГ, наиболее вероятным механизмом этих изменений в культуре ЭМСЛЧ является усиление экспрессии и/или активация антиоксидантных ферментов.

Влияние активных форм кислорода на показатели состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов при прерывистой нормобарической гипоксии. Получив данные, подтверждающие изменение метаболизма АФК в культуре ЭМСЛЧ, была проверена гипотеза о непосредственном участии АФК в изменении межклеточных контактов ЭМСЛЧ при ПНГ. Для этого клетки были предварительно обработаны миметиком супероксидцисмутазы - пентахлорида тетракис (1-метил-4-пиридил)- порфирином марганца III (ПТПМ). Для оптимального накопления антиоксиданта клетками обработку культуры ЭМСЛЧ проводили за 30 мин до первого сеанса ПНГ. Следует отметить, что обработка эндотелиоцитов ПТПМ не оказывала существенного влияния на изменение проницаемости в контрольной культуре клеток в условиях нормоксии (рис. 2 А).

Измерение импеданса ЭМСЛЧ через 30 мин после обработки ПТПМ, а также после каждого из трех последующих сеансов ПНГ не выявило значимого изменения проницаемости по сравнению с контрольной группой клеток (рис. 2 А). Эти данные могут свидетельствовать о возможности непосредственного участия АФК в изменения проницаемости монослоя ЭМСЛЧ, что согласуется с результатами исследования Alexander J.S. et al. (2004), согласно которому АФК играют центральную роль в изменении проницаемости эндотелиоцитов при воздействии на них постоянной гипоксией в течение пяти часов. Примечательно, что в культуре клеток, обработанной ПТПМ, повышения суммарного импеданса после третьего сеанса ПНГ не наблюдалось, что может объясняться тем, что формирование АФК также играет определенную роль в процессе снижения проницаемости монослоя культуры эндотелиальных клеток при ПНГ.

Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию васкулярного эндотелиалыюго фактора роста в культуре эндотелиоцитов. Одним из мощных аутокринных регуляторов функций эндотелиоцитов при гипоксии признан VEGF (Sweiki D. et al, 1992; Marti H.H., 2005; Breen E.C., 2007). Учитывая эти факты и данные, полученные в нашем исследовании с участием здоровых добровольцев, мы предположили, что ПНГ может усиливать продукцию VEGF эндотелиоцитами.

При проверке этой гипотезы было установлено, что после второго и третьего сеансов ПНГ наблюдалось увеличение концентрации фактора в культуральной среде ЭМСЛЧ (табл. 3). Этот эффект может быть связан как с активацией биосинтеза, так и с усилением секреции VEGF при гипоксии (Sweiki D. et al., 1992; Ferrara N. et al.,1997; Maulik N., 2002). Примечательно, что увеличение конценграции VEGF после второго и третьего сеанса ПНГ было значительно выше, чем после сопоставимой по длительности воздействия непрерывной гипоксии на ЭМСЛЧ.

Таблица 3

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на концентрацию УЕСР в культуральной среде эндотелиошггов микрососудов легких человека (М ± БО)

Непрерывная До курса Показатель гипоксия, Г1НГ

б часов (п=4) (п=4)

После После После

первого второго третьего

сеанса ПНГ сеанса ПНГ сеанса ПНГ

(п=4) (п=4) (п=4)

VEGF, мкг/100 мг белка

871 ±88,8

р < 0,001

251 ±67,9 414 ±52,9

1422+ 166,0 990 + 129,7 р< 0,001 р< 0,001 pl< 0,001 р2< 0,001

Примечание. Уровень значимости различий по критерию Ньюмена-Кейлса: р - по сравнению с результатами до курса ППГ. р; - по сравнению со вторым сеансом ПНГ, р2 - по сравнению с непрерывной гипоксией.

Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов HIF-la и HIF-2a в эидотелиоцитах микрососудов легких человека. Согласно Semenza G.L. (1999), наиболее вероятным кандидатом на роль инициатора приспособительных реакций к гипоксии является группа индуцируемых гипоксией факторов - HIF-la и HIF-2a. В частности, было установлено, что в активации транскрипции генов VEGF, антиоксидантных ферментов и белков межклеточных контактов при воздействии непрерывной гипоксии на эндотслиоциты участвуют HIF-la и HIF-2a (Manalo D.J. et al., 2005; Semenza G.L. et al., 2006; Yeh W.L. et al., 2007). Поэтому представлялось важным оценить изменения в системе HIF при воздействии ПНГ на культуру эндотелиоцитов.

Иммуноблот лизата ЭМСЛЧ, обработанных диметилоксалоилглицином (DMOG) - специфичным ингибитором пролиновых оксидаз, участвующих в деградации HIF (Ratcliffe Р ct al., 2000), выявил накопление HIF-la в ЭМСЛЧ, проявлявшееся приблизительно трехкратным усилением флюоресцентного сигнала в области 120 кДа (рис. 3). Еще большее усиление сигнала в соответствующей области геля было обнаружено при проведении иммуноблота лизата ЭМСЛЧ после воздействия постоянной гипоксией с содержанием кислорода 1% в течение 6 часов (Semenza G.R. et al., 1999; Pialoux V. et al., 2009). Это подтверждало достаточную чувствительность выбранной методики и, следовательно, позволяло надежно определять HIF в лизате клеток в использованной экспериментальной системе.

Первый сеанс прерывистой гипоксии не изменял содержание HIF-la и HIF-2а в лизате ЭМСЛЧ (рис.3), что, вероятно, связано с недостаточным временем воздействия для накопления HIF, по крайней мере, в количестве, достаточном для чувствительности методики. Второй и третий сеансы ПНГ приводили к выраженному накоплению обеих изоформ этого фактора транскрипции.

А)

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 -1,5 1

0,5 -0

Интенсивность сигнала, у.е.

Нормоксия ОМвО Постоянная После 1 После 2 После 3 гипоксия, 6 сеанса ПНГ сеанса ПНГ сеанса ПНГ часов * р<0,001

120 к Ра

50 кРа тубулин

Б)

3 п

1,5 1

120 кБа

50 кйа тубулин

Интенсивность сигнала, у.е.

т * *

т т

Нормоксия Постоянная После 1 После 2 После 3

гипоксия, 6 сеанса ПНГ сеанса ПНГ сеанса ПНГ часов *р<0,001

МММ

Рис. 3. Изменение уровня Н1Р-1а (А) и Н1Р-2а (Б) в лизате культуры эндотелиоцитов микрососудов легких человека под воздействием прерывистой нормобарической гипоксии по результатам иммуноблота (М±80), п=5

ОМОО - димети.юксалошг.шцин

Можно полагать, что сочетанное накопление ЮТ-! а и ШР-2а в эндотелиоцитах после сеансов ПНГ вовлечено в механизмы усиления продукции УКОР и возрастания активности антиоксидантных ферментов, и, как следствие, формирования приспособительного фенотипа эндотелиоцитов,

характеризующегося снижением проницаемости их монослоя.

Таким образом, можно предполагать, что при ПНГ формируется комплекс приспособительных реакций сердечно-сосудистой системы, включающих развитие устойчивости эндотелия к повреждающему действию гипоксии, связанной с повышением активности антиоксидантной ферментной системы и ослаблением вызванного интермиттирующей гипоксией окислительного стресса, а также стимуляцию процессов пролиферации эндотелиоцитов. Прерывистая нормобарическая гипоксия оказывает не опосредованные системными регуляторами, прямые эффекты на эндотелиоциты, включающие активацию продукции УБОГ, снижение индуцированного гипоксическим стимулом окислительного стресса и укрепление межклеточных контактов. Эти изменения сопровождаются накоплением в эндотелиоцитах факторов транскрипции НПМа и Н1Р-2а.

ВЫВОДЫ

1. Курс прерывистой нормобарической гипоксии (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гигюксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей сопровождается выравниванием калибра сосудов микроциркуляторного русла, увеличением артериоло-венулярного соотношения, уменьшением зон запустевания капилляров по данным конъюктивальной микроскопии, а также в первые 5-10 сеансов возрастанием систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений, ограниченным временем сеанса.

2. После курса прерывистой нормобарической гипоксии в крови здоровых людей транзиторио повышается концентрация маркеров активации и повреждения эндотелия - эндотелиальных СС31+ микрочастиц, большого эндотелина-1 1-38, а также васкулярного эндотелиального фактора роста.

3. В первые дни после курса прерывистой нормобарической гипоксии в крови здоровых людей увеличивается общая прооксидантная активность и концентрация тиобарбитуратреактивных продуктов в сочетании с повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.

4. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования воздуха с гипоксической газовой смесью, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом между сеансами) вызывает ослабляющееся с повторением сеансов транзиторное усиление продукции активных форм кислорода, накопление в эндотелиоцитах тиобарбитуратреактивных продуктов и прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста.

5. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия вызывает зависимое от активных форм

кислорода изменение импеданса монослоя эндотелиоцитов, указывающее на ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии.

6. Прерывистая нормобарическая гипоксия сопровождается накоплением в эндотелиоцитах микрососудов легких человека индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.

7. В механизмы формирования адаптации организма человека к прерывистой нормобарической гипоксии вовлечены реакции эндотелиоцитов на это воздействие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кореняк H.A. Влияние интермиттирующей гипокситерапии па некоторые маркеры ангиогенеза / Кореняк H.A., Макаренко В.В., Павловская Л.И. // Материалы науч.-практ. конф. «Молодежь-Барнаулу». - Барнаул, 2002. -С. 171.

2. Ельчанинова С.А. Влияние интервальной гипоксической гипоксии на концентрацию в плазме крови васкулярного эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов /Ельчанинова С.А.. Макаренко В.В., Кореняк H.A., Павловская Л.И., Дрягина И.В. // Белки-маркеры патологических состояний: материалы Ш научной конференции молодых ученых. - Астрахань, 2003. - С.109-111.

3. Ельчанинова С.А. Механизмы адаптации к интервальной гипоксической гипоксии /Ельчанинова С.А., Кореняк H.A., Дрягина И.В., Павловская Л.И., Смагина И.В., Макаренко В.В. // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: материалы И Всероссийской конференции. - Новосибирск, 2004.- С.215.

4. Ельчанинова С.А. К механизму действия интервальной гипоксической гипоксии при лечении и профилактике артериальной гипертензии / Ельчанинова С.А., Кореняк H.A., Дрягина И.В., Макаренко В.В. ' // Естествознание и гуманизм / Сборник научных работ. - Томск, 2004. - Т.1. -№1,- С. 9-10.

5. Ельчанинова С.А. Васкулярный эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов в периферической крови: влияние интервальной гипоксической гипоксии / Ельчанинова С.А., Кореняк H.A., Павловская Л.И., Смагина И.В., Макаренко В.В. // Физиология человека. - 2004. - Т.30. - №6. -С. 93-95.

6. Макаренко В.В. Механизмы лечебного действия интервальной гипоксической гипоксии при артериальной гипертензии /Макаренко В.В, Дрягина И.В., Кореняк H.A. // Молодежь - Барнаулу: материалы VI научно-практической конференции молодых ученых. - Барнаул, 2004. - С. 227-228.

7. Ельчанинова С.А. К вопросу о механизмах гипотензивного эффекта прерывистой нормобарической гипоксии при артериальной гипертензии / Ельчанинова С.А.,. Кореняк Н.А, Павловская Л.И., Макаренко В.В.. Дрягина И.В., Симонова О.Г.// Прерывистая нормобарическая гипокситерапия / Доклады Международной академии проблем гипоксии. -Том IV // Под ред. Р.Б. Стрелкова., М.: Бумажная Галерея, 2005. - С.33-38.

8. Макаренко В.В. Эндотелины как маркеры повреждения эндотелия / Макаренко В.В., Дрягина И.В., Кореняк Н.А. // Молодежь - Барнаулу: материалы VII научно-практической конференции молодых ученых. -Барнаул, 2005. - С. 190.

9. Ельчанинова С.А. Динамика лабораторных маркеров повреждения эндотелия у больных артериальной гипертензией на фоне гипотензивной терапии / Ельчанинова С.А., Кореняк Н.А., Дрягина И.В., Макаренко В.В.. Золовкина А.Г.// Человек и лекарство: материалы XIII Российского национального конгресса. - Москва, 2006. - С. 128.

10. Elchaninova S.A. Mcchanisms of the adaptation to intermittent normobaric hypoxia in patiens with arterial hypertension /Elchaninova S.A., Korenyak N.A., Kalachev A.G., Makarenko V.V.. Dryagina I.V.// International society for adaptive medicine (ISAM) VIII world congress . - Moscow, 2006. - P. 200.

11. Ельчанинова С.А. Маркеры повреждения эндотелия как возможный критерий эффективности лечения артериальной гипертензии/ Ельчанинова С.А., Кореняк Н.А., Дрягина И.В., Макаренко В.В. // Клин. лаб. диаг. - 2007. - № 2. -С. 40-42.

12. Ельчанинова С.А. Экспериментальное обоснование влияния прерывистой нормобарической гипокситерапии на эндотелий микрососудов у больных артериальной гипертензией/ Ельчанинова С.А., Кореняк Н.А., Золовкина А.Г., Макаренко В.В. // Сибирское медицинское обозрение. - 2009. - №1. - С.35-38.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

АД - артериальное давление

ОПА - общая прооксидантиая активность

ПНГ - прерывистая нормобарическая гипоксия

ПТПМ - пентахлорнд тетракис (1-метил-4-пиридил)-порфирин

марганца III

САД - систолическое артериальное давление

ТБРП - тиобарбитуратреактивные продукты

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭМ - эндотелиатьные микрочастицы

ЭМСЛЧ - эндотелий микрососудов легких человека

ЭТ - эндотелии

DMOG - диметилоксалоилглицин

HIF - индуцируемый гипоксией фактор

VEGF - васкулярный эндотелиальный фактор роста

Соискатель

В.В. Макаренко

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Макаренко, Владислав Вячеславович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. (Обзор литературы)

Современные прёдставления о механизмах влияния прерывистой нормобарической гипоксии на сердечно-сосудистую систему.

1.1. Основные закономерности реакции организма на гипоксическую гипоксию.

1.2. Физиологические изменения в оганизме здорового человека при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

1.3. Реакции эндотелия на воздействие гипоксии

1.4 Клеточные механизмы ответа на гипоксию.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования

2.2. Воздействие.

2.2.1. Прерывистая нормобарическая гипоксия здоровых добровольцев

2.2.2. Прерывистая нормобарическая гипоксия в культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека.

2.3. Функциональные методы обследования добровольцев.

2.3.1. Исследование артериального давления и частоты сердечных сокращений.

2.3.2. Биомикроскопия конънюктивальных сосудов.

2.4. Схема лабораторного обследования здоровых добровольцев.

2.5. Лабораторные методы обследования здоровых добровольцев.

2.5.1. Измерение показателей оксидантного статуса организма.

2.5.2. Определение активности антиоксидантных ферментов.

2.5.3. Измерение концентрации большого эндотелина и васкулярного эндотелиального фактора роста в сыворотке крови.

2.5.4. Определение уровня эндотелиальных микрочастиц в плазме крови.

2.6. Методы исследования в культуре эндотелиальных клеток микрососудов легких человека.

2.6.1. Определение тиобарбитуратреактивных продуктов в лизате эндотелиальных клеток микрососудов легких человека.

2.6.2. Определение образования активных форм кислорода.

2.6.3. Измерение концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста в клеточной среде.

2.6.4. Оценка проницаемости монослоя культуры эндотелиальных клеток микрососудов легких человека.

2.6.5. Определение концентрации индуцируемых гипоксией факторов HIF-la, H3F-2a в лизате культуры эндотелиоцитов микрососудов легких человека.

2.7. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 3. Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей.

ГЛАВА 4. Исследование влияния курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели метаболизма активных форм кислорода у здоровых людей.

ГЛАВА 5. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на культуру эндотелиоцитов.

5.1. Исследование изменений межклеточных контактов в культуре эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

5.2. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в культуре эндотелиоцитов.

5.3. Влияние активных форм кислорода на показатели состояния межклеточных контактов эндотелиоцитов при прерывистой нормобарической гипоксии.

5.4. Исследование влияния прерывистой нормобарической гипоксии на продукцию васкулярного эндотелиального фактора роста сосудов в культуре эндотелиоцитов.

5.5. Влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов HIF-la и HIF-2a в эндотелиоцитах микрососудов легких человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию"

Актуальность темы. Общепризнано, что продуцируемые эндотелием биологически активные вещества играют ведущую роль в регуляции функциональной активности, пролиферации и апоптоза клеток сосудистой стенки, ее взаимодействии с форменными элементами и компонентами плазмы крови (Pohlman Т.Н., Harlan J.M., 2000; Galley H.F., Webster N.R., 2004; Marti H.H., 2005). Скорость синтеза и секреции эндотелиальных факторов, в свою очередь, регулируются множеством вазоактивных сигнальных молекул - ацетилхолином, брадикинином, ангиотензином II и другими, а также локальными изменениями скорости кровотока (Karimova A., Pinsky D.J., 2001; Michiels С., 2003). Одним из мощных факторов, модулирующих метаболизм эндотелиоцитов, является гипоксия (Faller D.V., 1999; Michiels С. et al., 2000; Li J.M., Shah A.M., 2004; Jernigan N.L. et al., 2004; Fike C.D. et al., 2005).

Воздействие разными вариантами гипоксии и, в частности, прерывистой нормобарической гипоксией (ПНГ) уже долгие годы используется для профилактики и лечения многих хронических заболеваний, повышения неспецифической резистентности организма (Меерсон Ф.З., 1973; Караш Ю.М. и др., 1988; Стрелков Р.Б., Чижов А .Я., 2001). Установлено, что под влиянием курса ПНГ у здоровых людей развивается комплекс адаптивных изменений в различных системах организма, включающий возрастание потребления и эффективности использования кислорода, увеличение кислородной емкости крови, уменьшение реактивности симпатоадреналовой системы (Горанчук В.В. и др., 2003; Кривощеков С.Г. и др., 2004; Serebrovskaya T.V. et al., 2005).

Показано изменение артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса резистивных сосудов при ПНГ у здоровых людей, а также возможность коррекции с использованием ПНГ дисфункции эндотелия, нарушений гемодинамики у больных с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца (Стрелков Р.Б., Чижов А .Я., 2001; Ельчанинова С.А. и др., 2002, 2005; Потиевская В.И., 2005). Анализ данных литературы позволил нам предположить, что механизмы адаптивных преобразований сердечно-сосудистой системы под воздействием ПНГ включают изменения функционирования эндотелия, его активацию с развитием устойчивости к действию повреждающих факторов.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на биохимические маркеры повреждения и активации процессов регенерации эндотелия у здоровых людей — концентрацию в крови эндотелиальных микрочастиц CD31+, большого эндотелина-1 1-38, васкулярного эндотелиального фактора роста.

2. Изучить влияние курса прерывистой нормобарической гипоксии на показатели окислительного стресса и активность внутриклеточных антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы — у здоровых людей.

5. Изучить динамику концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста в клеточной среде первичной культуры эндотелиоцитов при воздействии прерывистой нормобарической гипоксии.

6. Оценить влияние прерывистой нормобарической гипоксии на содержание индуцируемых гипоксией факторов - HIF-la и HIF-2a, в клетках первичной культуры эндотелиоцитов человека.

Научная новизна.

Впервые показано, что механизм воздействия ПНГ (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей включает снижение концентрации в крови маркеров повреждения эндотелия на фоне повышения концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста, активности внутриклеточных антиоксидантных ферментов и снижения концентрации продуктов перекисного окисления липидов.

На культуре эндотелиоцитов человека впервые показано, что ПНГ оказывает прямое влияние на эндотелиоциты: приводит к опосредованному активными формами кислорода кратковременному ослаблению межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, возрастанию продукции васкулярного эндотелиального фактора роста, накоплению в эндотелиоцитах индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.

Теоретическая и практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

1. У здоровых людей курс прерывистой нормобарической гипоксии вызывает транзиторную активацию эндотелия, которая проявляется увеличением в крови концентрации эндотелиальных CD31+ микрочастиц, большого эндотелина-1 1-38, концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста и сопровождается кратковременным усилением окислительного стресса и повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.

2. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования воздуха с гипоксической газовой смесью, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом между сеансами) вызывает формирование не опосредованных системными регуляторами приспособительных реакций эндотелиоцитов, включающих зависимое от активных форм кислорода кратковременное ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, ослабление индуцированного гипоксией окислительного стресса, прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста.

3. Механизм реализации эффектов прерывистой нормобарической гипоксии на эндотелиоциты включает активацию системы индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-la и HIF-2a.

Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на III научной конференции «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003), VI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2004), VII научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), совместном заседании кафедр биохимии и физиологии (Барнаул, 2009), проблемной комиссии по физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (Барнаул, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, - ■ обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственного исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает / 224 литературных источников, из них 65 - на русском языке и 159 - на иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Макаренко, Владислав Вячеславович

ВЫВОДЫ

1. Курс прерывистой нормобарической гипоксии (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей сопровождается выравниванием калибра сосудов микроциркуляторного русла, увеличением артериоло-венулярного соотношения, уменьшением зон запустевания капилляров по данным конъюктивальной микроскопии, а также в первые 5-10 сеансов возрастанием систолического артериального давления и частоты сердечных сокращений, ограниченным временем сеанса.

2. После курса прерывистой нормобарической гипоксии в крови здоровых людей транзиторно повышается концентрация .маркеров активации и повреждения эндотелия - эндотелиальных CD31+ микрочастиц, большого эндотелина-1 1-38, а также васкулярного эндотелиального фактора роста.

3. В первые дни после курса прерывистой нормобарической гипоксии в крови здоровых людей увеличивается общая прооксидантная активность и концентрация тиобарбитурагреактивных продуктов в сочетании с повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы.

4. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия (3 одночасовых сеанса чередования воздуха с гипоксической газовой смесью, содержащей 1 об.% кислорода с одночасовым перерывом между сеансами) вызывает ослабляющееся с повторением сеансов 1ранзиторное усиление продукции активных форм кислорода, накопление в эндотелиоцитах тиобарбитуратреактивных продуктов и прогрессивное возрастание продукции васкулярного эндотелиального фактора роста.

5. В первичной культуре эндотелиоцитов микрососудов легких человека прерывистая нормобарическая гипоксия вызывает зависимое от активных форм кислорода изменение импеданса монослоя эндотелиоцитов, указывающее на ослабление межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы в комплексе тренировок, профилактики и лечения заболеваний системы кровообращения все шире используются альтернативные методы, способствующие развитию адаптивного потенциала организма. К числу таких методов относятся разнообразные воздействия гипоксии. Внимание ученых к гипоксии обусловлено тем, что дефицит кислорода сопровождает воздействие на организм разнообразных экстремальных факторов, таких как температурные колебания, изменения атмосферного давления, физические нагрузки и другие. Поэтому считается, что способность переносить гипоксию относится к числу наиболее древних и совершенных средств адаптации (Агаджанян Н.А. и др., 1987). Это универсальное свойство гипоксии дает основание использовать ее в качестве эффективного тренировочного и лечебного воздействия (К Меерсон Ф.З., 1973; Агаджанян Н.А. и др., 1987; Колчинская А.З., 1992; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001).

Среди множества вариантов гипоксических воздействий особого внимания, по мнению специалистов, заслуживает прерывистая нормобарическая гипоксия (ПНГ), что связано с возможностью контроля и индивидуализации схем этого воздействия на основе особенностей резистентности организма к гипоксии (Стрелков Р.Б., Чижов А .Я., 2001). Несмотря на большое количество исследований, касающихся ПНГ, следует отметить дефицит сведений о клеточных механизмах этого воздействия. По-прежнему неизвестны реакции отдельных типов клеток, таких как эндотелий сосудов, хромофинные клетки надпочечников и каротидных тел, нейроны головного мозга и другие, которые могут иметь определяющее значение в комплексе регуляторных механизмов в процессе формирования адаптации. Так, в частности, правомерно предполагать, что реакции сердечно-сосудистой системы в ответ на ПНГ в значительной степени обусловлены изменением регуляторных воздействий на сосудистую стенку эндотелия. Основанием для такого предположения служат следующие общепризнанные научные факты. Эндотелий, продуцируемые им биологически активные вещества играют ведущую роль в комплексной регуляции функциональной активности и структурных изменений сосудистой стенки - контролируют метаболизм клеточных элементов кровеносного сосуда, их пролиферацию, взаимодействие с сосудистой стенкой клеток и компонентов плазмы крови (Gimbrone М.А., 1995; Michiels С., 2005). Более того, эндотелий является мишенью и опосредует эффект многих системных и локальных регуляторов сосудистой функции (Michiels С., 2005). Известно также, что при воздействии постоянной гипоксией изменяется продукция ряда эндотелиальных факторов - оксида азота, аденозина, эндотелина, VEGF, участвующих в регуляции приспособления сердечно-сосудистой системы к гипоксии, таких как изменение частоты сердечных сокращений, артериального давления и другие (Меерсон Ф.З.,

1973; Liu Y. et al., 1995; Giordano E. et al., 1999; Boron W.F., Boulpaep E.L., 2003; Semenza G.L., 2005; Fraigle M. et al., 2008).

Поэтому нам представлялось особенно важным провести оценку реакций эндотелия в ответ на ПНГ. Для этого на первом этапе были исследованы эффекты ПНГ на основные гемодинамические показатели -артериальное давление (АД), частоту сердечных сокращений (ЧСС), а также на состояние сосудов микроциркуляторного русла здоровых людей. Выбор в качестве участников исследования здоровых добровольцев был связан с тем, что в случае выявления изменений в указанных выше параметрах сердечнососудистой системы, будет правомерным сопоставление этих изменений с результатами экспериментов в культуре эндотелиоцитов, которые планировались на последующем этапе работы.

К четвертому-пятому сеансу ПНГ наблюдалось повышение • систолического АД и ЧСС. Эти изменения ограничивались временем сеанса и выявлялись не более, чем в пяти последующих сеансах. Важно, что изменение АД и ЧСС не выходило за пределы физиологической нормы, и, вероятно, отражало процесс формирования адаптации к повторяющимся гипоксическим стимулам (Горанчук В.В. и др., 2003). Примечательно, что в первые дни после завершения курса ПНГ не выявлено изменений АД и ЧСС относительно их уровня до курса. После курса ПНГ в системе микроциркуляции выявлено выравнивание калибра сосудов, увеличение артериоло-венулярного соотношения и уменьшение зон запустевания ' капилляров. Эти изменения гемодинамики и микроциркуляции указывали на участие системы кровообращения в комплексной реакции организма здоровых людей в ответ на ПНГ, что согласовывалось с данными о воздействии ПНГ на организм больных с хроническими сердечнососудистыми заболеваниями и позволяло считать целесообразным исследование биохимических изменений при гипоксической тренировке (Смагина И.В., 2002; Ельчанинова С.А. и др., 2004).

Как было уже отмечено, при воздействии постоянной гипоксии происходит изменение продукции эндотелиоцитами множества ' биологически активных соединений, участвующие в формировании адаптивного ответа стенки сосуда, таких как VEGF, простагландины, эндотелины и оксид азота (Minchenko A. et al, 1994; Liu У. et al, 1995; Ni Z., 1998; Fryer R.M., et al, 2002; Semenza G.L., 2005). Кроме того, ранее нашими коллегами было установлено, что при воздействии ПНГ на организм больных артериальной гипертензией ослабляется повреждение эндотелия, одновременно с уменьшением выраженности окислительного стресса при возрастании активности основных антиоксидантных ферментов (Смагина И.В., 2002; Павловская Л.И., 2004). В связи с этим, в плазме крови здоровых людей был измерен уровень эндотелиальных факторов, которые могут рассматриваться как маркеры повреждения эндотелиоцитов — большого ЭТ-1 1-38, эндотелиальные микрочастицы (ЭМ), а также маркер репарации эндотелия - VEGF (Chong A.-Y. et al., 2003; Horstman L.L. et al., 2004). Следует отметить, что способность VEGF тормозить апоптоз и активировать пролиферацию эндотелиоцитов позволяют рассматривать повышение его уровня в плазме крови как стимул для процессов регенерации эндотелия (Zachary I et al., 2000; Marti H.H., 2005; Breen E.C., 2007; Karamysheva A.F., 2008).

Выявленное повышение содержания ЭМ и большого ЭТ-1 1-38 в плазме крови участников исследования в первый день после завершения курса ПНГ согласуется с данными об умеренном транзиторном повреждении клеток при интермиттирующей гипоксии (Prabhakar N., 2001). Однако, нельзя исключить, что повышение плазменного уровня ЭМ может быть связано и с так называемой активацией клеток эндотелия, при которой усиливается их поступление в кровь в отсутствии морфологических признаков повреждения эндотелиоцитов (Zwaal R.F. et al., 1997; Sabatier F. et al., 2002).

Исследования показали, что после курса ПНГ в плазме крови участников регистрировалось два пика повышения концентрации VEGF. Возрастание VEGF, выявленное в первый день после ПНГ, можно считать следствием проходящего повреждения/активации эндотелиоцитов. Поскольку активация экспрессии гена VEGF в течение первых дней после гипоксии была отмечена в ряде экспериментальных работ (Sodhi A. et al.,

2000), можно полагать, что второй пик плазменной концентрации VEGF связан с усилением его биосинтеза эндотелиоцитами.

Принимая гипотезу о транзиторном повреждении эндотелиоцитов мы предположили, что одним из повреждающих и/или активирующих эндотелиоциты факторов при действии ПНГ могут быть активные формы кислорода. Об усилении продукции активных форм кислорода при действии гипоксического стимула свидетельствуют многочисленные данные (Леденев А.Н. и др., 1985; Меныцикова Е.Б. и др., 2006; Littauer A., de Groot Н. 1992; Yang W. et al., 1995; Zulueta JJ. et al., 1997; Pearlstein D.P. et al., 2002; Schumacker P., 2006), поэтому одной из задач исследования стала оценка влияния ПНГ на показатели оксидативного метаболизма здоровых людей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Макаренко, Владислав Вячеславович, Новосибирск

1. Агаджанян Н.А. Организм и газовая среда обитания / Н.А. Агаджанян. М.: Медицина, 1972.- 246 с.

2. Агаджанян Н.А. Адаптация к гипоксии и биоэкономика внешнего дыхания / Н.А. Агаджанян, В.В. Гневушев, А.Ю. Катков. М.: Изд. УДН, 1987.- 186 с.

3. Аулик И.В. Определение физической работоспособности в клинике и спорте / И.В. Аулик. М.Медицина, 1990. - 192 с.

4. Ахмедов К.Ю. Дыхание человека при высокогорной гипоксии / К.Ю. Ахмедов. Душанбе: Илим, 1971. - 182 с.

5. Барбашова З.И. Акклиматизация к гипоксии и ее физиологические механизмы / З.И. Барбашова. Л.:Изд-во АН СССР, 1960. - 256 с.

6. Барбашова З.И. Клеточный уровень адаптации к гипоксии и перспективы развития этой проблемы / З.И. Барбашова //

7. Актуальные вопросы физиологии и медицины. 1979. - Т.136. - с. 45-51.

8. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионныс повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения) / М.В. Биленко. М.:Медицина, 1989. - 368 с.

9. Бобылева О.В. Динамика показателей вегетативной реактивности и устойчивости к острой дозированной гипоксии и в курсе интервальной гипоксической тренировки / О.В. Бобылева, О.С. Глазачев // Физиол. Человека. 2007. - Т.ЗЗ. - №2. - с. 81 -89.

10. Бобылева О.В. Особенности микроциркуляции у практически здоровых людей при острой гипоксии и в курсе интервальной гипоксической тренировки / О.В. Бобылева, О.С. Глазачев // Физиол. Человека. 2008. - Т.34. - №6. - с. 92-99.

11. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Арчаков А.И. М., 1972. - 252 с.

12. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев. // Биофизика. 1991.- Том 29. - С. 211.

13. Войткевич В.И. Хроническая гипоксия. Приспособительные реакции организма / В.И. Войткевич. JI.,1973. - 191 с.

14. Волков B.C. Оценка состояния микроциркуляции методом коньюктивальной биомикроскопии / B.C. Волков, Н.Н. Высоцкий,

15. B.В.Троцюк, В.И. Мишин // Клин, медицина.-1976.-№ 7.-С. 115-118.

16. Гаркави Л.Х. Адаптационные реакции и резистентность организма / Л.Х. Гаркави, Е.Б. Квакина, М.А. Уколова. Изд. 3-е., доп. -М.,1990.- 224 с.

17. Голиков М.А. Применение метода прерывистой нормобарической гипокситерапии в комплексе методов экологически истого немедикаментозного лечения / М.А. Голиков, К.Ф. Закощиков // Докл. Академии проблем гипоксии РФ. М., 1997. - Т.1.1. C. 103-107.

18. Горанчук В.В. Гипокситерапия / В.В. Горанчук, Н.И. Сапова, Л.О. Иванов. Спб.: ООО «Элби-Спб», 2003. - 537 с.

19. Ельчанннова С.А. Активность внутриклеточных антиоксидантных энзимов у больных гипертонической болезнью / С.А. Ельчанинова, Л.П. Галактионова, Н.В. Толмачева, Б.Я. Варшавский // Тер. Архив.-2000. -№4.-С.51-53.

20. Ельчанинова С.А. Влияние интервальной гипоксической тренировки на процессы перикисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов / С.А. Ельчанинова, И.В. Смагина, Н.А. Кореняк // Физиология человека. 2003. -Т.29, №3.-С. 72-75.

21. Караш Ю.М. Волнообразные колебания внутриматочного давления в интервалах между схватками в родах / Ю.М. Карат // Бюл. Экспер. Биол. 1970,- Т.78 - №8. - С. 16-18.

22. Караш Ю.М. Нормобарическая гипоксия в лечении, профилактике и реабилитации / Ю.М. Караш, Р.Б. Стрелков, А.Я. Чижов. -М.:Мсдицииа, 1988.-351 с.

23. Колчинская А.З. Кислородный режим организма ребенка и подростка / А.З. Колчинская. Киев: Наукова думка, 1973. - 326 с.

24. Колчинская А.З. О классификации гипоксических состояний / А.З. Колчинская // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1981. - №4. -С.3-10.

25. Колчинская. А.З. Вторичная тканевая гипоксия / Под ред. А.З. Колчинской. Киев: Наукова думка, 1983. - 255 с.

26. Колчинская А.З. Интервальная гипоксическая тренировка (эффективность, механизмы действия) / А.З. Колчинская. К.: КГИФК, 1992.- 108 с.

27. Кошелев В.Б. Симпатические нервы контролируют процесс новообразования сосудов, индуцированный адаптацией к гипоксии / В.Б. Кошелев, М.В. Кондашевская, И.М. Родионов // Доклады АН СССР. 1990. - № 3,- С. 756-758.

28. Кривощсков С.Г. Системообразующая роль антигипоксических механизмов при адаптации организма к экстремальным условиям среды.//Физиология человека. 1998.- Т. 24,- №4.- С. 29-37.

29. Кривощеков С.Г. Влияние кратковременной прерывистой нормобарической гипоксии на регуляцию внешнего дыхания у человека / С.Г. Кривощеков, Г.М. Диверт, В.Э. Диверт // Физиол. Человека. 2002. - Т.28. - №6. - с. 45.

30. Кривощеков С.Г. Регуляция внешнего дыхания и газообмена организма при 20-дневном воздействии сеансами прерывистой нормобарической гипоксии / С.Г. Кривощеков, Г.М. Диверт, В.Э. Диверт // Физиол. Человека. 2004. - Т.ЗО. - №3. - с.88-94.

31. Кудряшева О.В. Эндотелиальный гемостаз: система тромбомодулина и её роль в развитии атеросклероза и его осложнений / О.В. Кудряшева, Д.А. Затейщиков, Б.А. Сидоренко // Кардиология. 2000. - 40. - №8. - С.65-70.

32. Лебединский А.В. Влияние пониженного барометрического давления на функции анализаторов / А.В. Лебединский, А.П. Попов. М.: Воениздат, 1953. - С. 125-154

33. Леденев А.Н. Генерация еупероксидных радикалов митохондриями сердца в условиях ишемии / А.Н. Леденев, Э.К. Руге // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1985.- №9 - С. 303-305

34. Лсутин В.П. Инверсия полушарного доминирования как психофизиологический механизм интервальнойгипоксической тренировки./ Платонов Я.Г., Диверт Г.М.// Физиология человека. -1999. Т. 25. - №3.- С. 65-70

35. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы, коррекция / Л.Д. Лукьянова // БЭБМ. 1997. - Т. 124. - №9. -с. 244-254.

36. Лукьянова Л.Д. Регуляторная роль митохондрий при гипоксии и их взаимодействие с транскрипционной активностью / Л.Д. Лукьянова, A.M. Дудченко, Т.А. Цыбина // БЭБМ 2007. - №12. - с. 644-651.

37. Лукьянова Л.Д. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации / Л.Д. Лукьянова // Патогенез. 2008. - №3. - с. 4-12.

38. Малкин В.Б. Острая и хроническая гипоксия / В.Б. Малкин, Е.Б. Гиппенрейтер. М.: Наука, 1977. - 319 с.

39. Манухина Е.А. Влияние адаптации к физической нагрузке на эндотелий опосредованные реакции изолированных сосудов и продукцию NO у крыс / Е.А. Манухина, К.К. Лапшин // Физиологический журнал им. Сеченова. - 1996. - т.82. - №7. -С.29-32.

40. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и профилактики.-М.,1973.-180 с.

41. Меерсон Ф.З. Адаптация, деадаптация и недостаточность сердца / Ф.З. Меерсон. М.: Медицина, 1978. - 344 с.

42. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981.-78 с.

43. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и профилактики / Ф.З. Меерсон. М:Медицина,1973.- 180 с.

44. Меерсон Ф.З. Феномен адаптации и стабилизации структур и защиты сердца / Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев. М.:Медицина, 1981. - 158 с.

45. Меерсон Ф.З. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам / Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенникова. М.: Медицина, 1988. -256 с.

46. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике./

47. B.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая. М., 1987.1. C. 107-108.

48. Миррахимов М.М. Адаптация сердечно-сосудистой системы человека к высокогорной гипоксии / М.М. Миррахимов // Кардиология. 1978. - Т. 18. - №10. - С. 11-18.

49. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах / В.М. Моин // Лаб. дело. 1986. - № 12. - С.724-727.

50. Молчанов А.В., Галактионова Л.П. Способ определения про оксид антной активности биологического материала // Патент на изобретение. № 97101937/14 (002066). - 1997.

51. Новиков B.C. Гипобарическая гипоксия как метод коррекции функционального состояния / B.C. Новиков, С.И. Лустин // Авиакосмическая и экологическая медицина. 1994. - Т.28. - №1. -с.40-44.

52. Павловская Л.И : Интервальная нормобарическая гипокситсрапия в комплексном лечении больных с хронической вертебральнобазилярной недостаточностью / Автореф. дис. .канд. мед. наук. -Барнаул, 2002. 22 с.

53. Петрищев Н.Н. Патогенетическое значение дисфункции эндотелия / Н.Н. Петрищев // Омский научный вестник. 2005. - №3. - С. 20-22.

54. Сазонтова Т.Г. Антиоксидантная защита и чувствительность миокарда к свободнорадикальному окислению у крыс Вистар и Август при ишемии и реперфузии / Т.Г. Сазонтова, А.Г. Жукова, Т.А. Зенина, JI.M. Белкина // Hypoxia Med. J. 2002. - №3-4.- с. 25-31

55. Серебровская Т.В. Чувствительность к гиперкапническому и гипоксическому стимулам как отражение индивидуальной резистентности организма человека / Т.В. Серебровская // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1985.- №5,- С.65.

56. Смагина И.В. Влияние интервальной гипоксической гипоксии на активность антиоксидантных ферментов у больных с дисциркуляторной энцефалопатией на фойе артериальной гипертонии: Автореф. дис. .канд. мед. наук. Барнаул, 2002. - 22 с.

57. Стрелков Р.Б. Метод повышения неспецифической резистентности организма с помощью нормобарической гипоксической стимуляции: Метод. Рекомендации / Р.Б. Стрелков, Ю.А. Караш, А .Я. Чижов. -М., 1985 10 с.

58. Стрелков Р.Б. Прерывистая нормобарическая гипоксия в профилактике, лечении и реабилитации / Р.Б. Стрелков, А.Я. Чижов. Екатеринбург: Уральский рабочий, 2001. - С. 177.

59. Чарный A.M. Патофизиология гипоксичсских состояний / A.M. Чарный. М.: Медгиз, 1961. - 343 с.

60. Чевари С., Андял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лаб. дело. 1991. - № 10. - С. 11-13.

61. Чижов А.Я. О механизмах адаптации организма к дозированной гипоксической гипоксии / А.Я. Чижов, А.В. Осипенко // Пат. физиол. 1980. -№1.- С. 69-72.

62. Чижов А.Я. Прерывистая нормобарическая гипоксия в профилактике и лечении гипертонической болезни / А.Я. Чижов, В.И. Потиевская. М.: Издательство Университета Дружбы Народов., 2002. - С. 9-19.

63. Улумбеков Э.Г. Гистология (введение в патологию) / Под ред. Э.Г. Улумбекова, Ю.А. Челышева. -М.: ГЭОТАР, 1997. С. 139

64. Acker Т. The good, the bad and the ugly in oxygen-sensing: ROS, cytochromes and prolyl-hydroxylases / T. Acker, J. Fandrey, H. Acker // Cardiovascular Research. 2006.-№71. - p. 195 - 207.

65. Alexander J.S. Reciprocal regulation of endothelial substrate adhesion and barrier function. / J.S. Alexander, Y. Zhu, J.W. Elrod, B. Alexander, L. Сое, T.J. Kalogeris // Microcirculation. №8. - 2001. - p.389^101.

66. Alexander J. S. Extracellular matrix, junctional integrity and matrix metalloproteinase interactions in endothelial permeability regulation / J. S. Alexander, J. W. Elrod // J. Anat. 2002. - №200. - p.561-574.

67. Alstrom T. Recomendations Concerning the collection of reference values in clinical chemistry and activity report / T. Alstrom, R. Grasbeck, M. Hjelm, S. Scandsen // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1975. - Vol.35. -Suppl.144.

68. Asano G. Pathogenesis and protection of ischemia and reperfusion injury in myocardium. / G. Asano, E. Takashi, T. Ishiwata, M. Onda, M.Yokoyama, Z. Naito, M. Ashraf, Y. Sugisaki // J. Nippon. Med. Sch. -№70(5).-2003.-p.384-92.

69. Antoniucci D. The vascular tree as an endocrine organ: Paracrine and autocrine effects of endothelin / D. Antoniucci, L. Fitzpatrick // Endocrinologist. 1996. - № 6. - P. 481-487.

70. Arthur P.G. Lack of oxygen sensing by mitochondria in platelets / P.G. Arthur, C.T. Ngo, P. Moretta, M. Guppy // Eur J Biochem. 1999. -№266(1).-p.215-219.

71. Barry O.P. Transcellular activation of platelets and endothelial cells by bioactive lipids in platelet microparticles / O.P. Barry, D. Pratico, J A. Lawson, G.A. Fitzgerald // J. Clin. Invest. №99. - 1997. - p.2118-2127.

72. Bazzoni G. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis / G. Bazzoni, E. Dejana // Physiol. Rev. -№84(3).- 2004. p.869-901.

73. Bellien J. Contribution of endothelium-derived hyperpolarizing factors to the regulation of vascular tone in humans / J. Bellien, C. Thuillez, R. Joannides // Fundam. Clin. Pharmacol. №22(4). - 2008. -p.363-377.

74. Berry C.E. Xantine oxidoreductase and cardiovascular disease: molecular mechanisms and pathophysiological implications // C.E. Berry, J.M. Hare // J. Physiol №55. - 2004 - p.5 89-606.

75. Bertuglia S. Intermittent hypoxia modulates nitric oxide-dependent vasodilation and capillary perfusion during ischcmia-reperfusion-induced damage / S. Bertuglia // Am J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. №294(4). -2008. -p.1914-1922.

76. Blokhina O. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review / O. Blokhina, E. Virolainen, K.V. Fagerstedt // Ann. Bot. (Lond). 2003 Jan; 91 Spec No: 179-94.

77. Boron W.F. Medical physiology / W.F. Boron, E.L. Boulpaep.- USA: Saunders, 2003. 674 p.

78. Boulanger C.M. Circulating microparticles from patients with myocardial infarction cause endothelial dysfunction / C.M. Boulanger, A. Scoazec, T. Ebrahimian, P. Henry, E. Mathieu, A. Tedgui, Z. Mallat // Circulation. -2001. №104(22). -p.2649-52.

79. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. - №72. - p.248-254.

80. Breen E.C. VEGF in biological control / E.C. Breen // J. Cell. Biochem. 2007. - №15(6). - p.1358-1367

81. Breen E. Skeletal muscle capillarity during hypoxia: VEGF and its activation / E. Breen, K. Tang, M. Olfert, A. Knapp, P. Wagner // High. Alt. Med. Biol.-2008. -№9(2).-p.158-166.

82. Brune B. Nitric oxide and superoxide: interference with hypoxic signaling / B. Brune, J. Zhou // Cardiovasc. Res. 2007. - №75(2). -p.275-282.

83. Burnstock G. Dual control of vascular tone and remodelling by ATP released from nerves and endothelial cells / G. Burnstock // Pharmacol. Rep. 2008.- №60(1) - p. 12-20.

84. Chong A.-Y. Assessment of endothelial damage and dysfunction: observations in relation to heart failure / A.-Y. Chong, A.D. Blann, G.Y.H. Lip // Q. J. Med. 2003. - №96. - p.253-267.

85. Crawford D.W. Arterial wall oxygenation, oxyradicals, and atherosclerosis / D.W. Crawford, D.H. Blankenhorn // Atherosclerosis. -1991.,-№89(2-3).-p.97-108.

86. Cummins E.P. Hypoxia-responsive transcription factors // E.P. Cummins, C.T. Taylor // Eur. J. Physiol. 2005. - №450. - p. 363-371.

87. Orleans-Juste et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. - № 85. - P. 9797-9780.

88. Dehler M. Hypoxia causes permeability oedema in the constant-pressure perfused rat lung / M. Dehler, E. Zessin, P. Bartsch, H. Mairbaurl // Eur. Respir. J. 2006. -№27. - p.600-606.

89. Dejana E. Organization and signaling of endothelial cell-to-cell junctions in various regions of the blood and lymphatic vascular trees / E. Dejana, F. Orsenigo, C. Molendini, P. Baluk, D.M. McDonald // Cell. Tissue. Res. 2009. - №335(1). - p. 17-25.

90. Dejana E. The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability / E. Dejana, F. Orsenigo, M.G. Lampugnani // J. Cell. Sci.-2008. -№121(Pt 13). p.2115-2122.

91. Eckardt K.U. Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease / K.U. Eckardt, W.M. Bernhardt, A. Weidemann, C. Warnecke, C. Rosenberger, M.S. Wiesener, C. Willam // Kidney Int. Suppl. 2005. - №99. - p.46-51.

92. Ellis A. Endothelium-derived reactive oxygen species: their relationship to endothclium-dependent hyperpolarization and vascular tone / A. Ellis,

93. C.R. Triggle // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2003. - №81(11). - p.1013-1028.

94. Epstein F.H. Mechanisms of disease / F.H. Epstein // New Engl J Med. 1995.-№333.-P. 356-363

95. D.L. Hamilton, P. Jaakkola, R. Barstead, J. Hodgkin, P.H. Maxwell,

96. C.W. Pugh, C.J. Schofield, P.J. Ratcliffe // Cell. 2001. - №107 -p.43-54.

97. Erzurum S.C. Higher blood flow and circulating NO products offset high-altitude hypoxia among Tibetans / S.C. Erzurum, S. Ghosh, A.J. Janocha, W. Xu, S. Bauer, N.S. Bryan, J. Tejero, C. Hemann, R. Hille,

98. D.J. Stuehr, M. Feclisch, C.M. // Beall. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2007. №6. -p. 104.

99. Escobales N. Oxidative-nitrosative stress in hypertension / N. Escobales, M.J. Crespo // Curr Vase Pharmacol. 2005. - №3(3). - p.231 -246.

100. Ellis A. Endothelium-derived reactive oxygen species: their relationship to endothelium-dependent hyperpolarization and vascular tone / A. Ellis, C.R. Triggle // Can J Physiol Pharmacol. 2003. - №81(11). -p.1013-1028.

101. Faigle M. ATP release from vascular endothelia occurs across Cx43 hemichannels and is attenuated during hypoxia / M. Faigle, J. Seessle, S. Zug, K.C. El Kasmi, H.K. Eltzschig // PLoS ONE. 2008. - №3(7). -p.44-48.

102. Faller D.V. Endothelial cell responses to hypoxic stress / D.V. Faller // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.- 1999. №26(1). - p.74-84.

103. Fike C.D. Cyclooxygenase-2 and an early stage of chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension in newborn pigs / C.D. Fike, M.R. Kaplowitz, Y. Zhang, S.L. Pfister // J. Appl. Physiol. 2005. - №98(3). -p.1111-1118.

104. Ferrara N. The Biology of Vascular Endothelial Growth Factor / N. Ferrara, D.-S. Terri // Endocrine Reviews. 1997.-V.18.-№1.- p.4-25.

105. Forster C. Tight junctions and the modulation of barrier function in disease / C. Forster // Histochem. Cell. Biol. 2008. - №130(1). -p.55-70.

106. Forsythe J.A. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1/ J.A. Forsythe, B.H. Jiang,

107. N.V. Iyer, F. Agani, S.W. Leung, R.D. Koos, G.L. Semenza // Mol. Cell. Biol. 1996. №16. - p. 4604-4613.

108. Franco A.A. Regulation of antioxidant enzyme gene expression in response to oxidative stress and during differentiation of mouse skeletal muscle / A.A. Franco, R.S. Odom, T.A. Rando // Free Radic Biol Med. -1999. №27(9-10). - p.l 122-1132.

109. Fryer R.M. Therapeutic receptor targets of ischemic preconditioning / R.M. Fryer, J.A. Auchampach, G.J. Gross // Cardiovasc. Res. 2002. -№55. — p.520-525.

110. Furchgott R.E. Nutrie oxide as a signaling molecule in the cardiovascnlar system / R.E. Furchgott, L.S. Ignore, F. Murad // Press Relcause: The 1998 Nobel Prize in Physiology of Mcdicinc.

111. Galley H.F. Physiology of the endothelium / H.F. Galley, N.R. Webster // Br. J. Anaesth. 2004. - №93(1). - p. 105-113.

112. Garrido-Urbani S. Vascular and epithelial junctions: a barrier for leucocyte migration / S. Garrido-Urbani, P.F. Bradfield, B.P. Lcc, B.A. Imhof // Biochem. Soc. Trans. -2008. №36. -p.203-211.

113. Giordano E. Molecular mechanisms of response to low oxygen tension in the vascular wall / E. Giordano, C. Guarnieri, C. Muscari, C.M. Caldarera // Cardiologia. 1999. - №44(9). -p.779-782.

114. Gregg D. Integrins and coagulation: a role for ROS/redox signaling? / D. Gregg, D.D. de Carvalho, H. Kovacic // Antioxid. Redox. Signal. 2004. - №6(4). -p.757-764.

115. Grover R.P. Pulmonary vasoconstriction in stress in high altitude / R.P. Grover // J. Appl. Physiol. 1963. - Vol. 18. - №3. - p.567-574.

116. Guzy R.D. Oxygen sensing by mitochondria at complexIII: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia / R.D. Guzy, P.T. Schumacker // Exp. Physiol. 2006. - №91. - p.807-819.

117. Hardie D. G. AMPK: a key sensor of fuel and energy status in skeletal muscle / D. G. Hardie, K. Sakamoto // Physiology. 2006. - №21. -p.48-60.

118. Henley W.N. Attenuation of alpha-adrenergic responsiveness in hypoxic SI-IR. / W.N. Henley, A. Tucker // Clin Exp Hypertens A. 1986. -№8(8). -p.1355-1371.

119. Heitzer T. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease / Heitzer Т., Schlinzig Т., Krohn K., Meinertz Т., Miinzel T. // Circulation. 2001. -№104(22).- p.2673-2678.

120. Hirsila M. Characterization of the human prolyl 4-hydroxylases that modify the hypoxia-inducible factor / M. Hirsila, P. Koivunen, V. Gunzler, K.I. Kivirikko, J. Myllyharju // J. Biol. Chem. 2003. - №278. -p.30772-30780.

121. Hladovec J. Circulating endothelial cells as a sign of vessel wall lesions / J. Hladovec // Physiol. Bohemoslov. 1978. - Vol.27. - p. 140-144.

122. Ho F.M. Nitric oxide prevents apoptosis of human endothelial cells from high glucose exposure during early stage / F.M. Ho, S.H. Liu, C.S. Liau, P.J. Huang, S.G. Shiah, S.Y. Lin-Shiau // J Cell Biochem. 1999. -№75(2). -p.258-263.

123. Holmquist-Mengelbier L. Recruitment of HIF-la and HIF-2a to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2a promotes an aggressive phenotype / L. Holmquist-Mengelbier // Cancer Cell. 2006. - № 10. - p.413^123.

124. Horstman L.L. Endothelial microparticles as markers of endothelial dysfunction / L.L. Horstman, W. Jy, J.J. Jimenez, Y.S. Ahn // Frontiers in Bioscience. 2004. - №9. -p.l 118-1135.

125. Howell К. Chronic hypoxia causes angiogenesis in addition to remodelling in the adult rat pulmonary circulation / K. Howell, R.J. Preston, P. McLoughlin// J. Physiol. 2003. - №15. - p. 133-145.

126. McQuillan L.P. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanisms / L.P. McQuillan, G.K. Leung, P.A. Marsden, S.K. Kostyk, S. Kourembanas // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1994. - №267. -p. 1921-1927.

127. Jackson R.M. Effects of hypoxia on expression of superoxide dismutases in cultured ATII cells and lung fibroblasts / R.M. Jackson, G. Parish, Y.S. Ho // Am J Physiol. 1996. - №271(6). - p.955-962.

128. Johnson G.D. Hydrolysis of peptide hor mones by indothelin-converting enzyme-1. A comparison with neprilysin / G.D. Johnson, T. Stevenson, K.H. Ahn // J Biol Chemestry. 1999. -№ 274. -P. 4053-4058.

129. Jung O. Inactivation of extracellular superoxide dismutase contributes to the development of high-volume hypertension / O. Jung, S.L. Marklund, N. Xia, R. Busse, R.P. Brandes // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2007. №27(3). -p.470-477.

130. Inoue A. The human pre-proendothelin-1 gene // A. Inoue, M.Yanagisawa, Y. Takuwa // J Biol Chem. 1989. - № 264. - P. 14954 -14959.

131. Kallio P.J. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor ID by the ubiquitin-proteasome pathway / P.J. Kallio, W.J. Wilson, S. O'Brien, Y. Makino, L. Poellinger// J. Biol. Chem. 1999. - №274. -p.6519-6525.

132. Kamura T. Activation of HIF1D ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor complex / T. Kamura, S. Sato, K.1.ai, M. Czyzyk-Krzeska, R.C. Conaway, J.W. Conaway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. №97. -p.10430-10435.

133. Karamysheva A.F. Mechanisms of Angiogenesis / A.F. Karamysheva // Biochemistry (Moscow). 2008. - Vol. 73. - №37. - p.751-762.

134. Karimova A. The endothelial response to oxygen deprivation: biology and clinical implications / A. Karimova, D.J. Pinsky// Intensive Care Med.-2001. -№27(1). -p. 19-31.

135. Kemp P.J. Detecting acute changes in oxygen: will the real sensor please stand up? / P.J. Kemp // Exp. Physiol. 2006. - №91.5. - p.829-834.

136. Keyhani E. Antioxidant enzymes during hypoxia-anoxia signaling events in Crocus sativus L. corm. / E. Keyhani, L. Ghamsari, J. Keyhani, M. Hadizadeh // Ann NY Acad Sci. 2006. - №1091. - p .65-75.

137. Killy D.G. Nitric oxide and cardiac function / D.G. Killy, S.L. Baffigand, T.W. Smith // Cireulat. Res. 1996. - V.79. - p.363-380.

138. LaManna J.C. Structural and functional adaptation to hypoxia in the rat brain / J.C. LaManna, J.C. Chavez, P.J. Pichiule // Exp. Biol. 2004. -№207.-p.3163-3169.

139. Lage R. AMPK: a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis / R. Lage, C. Dieguez, A. Vidal-Puig, M. Lopez // Trends Mol. Med. 2008. - №14(12). - p.539-549.

140. Leach R.M. Hypoxia, energy state and pulmonary vasomotor tone / R.M. Leach, H.S. Hill, V.A. Snetkov, J.P. Ward // Respir. Physiol. Neurobiol. -2002. №22. - p.55-67.

141. Li C. Reactive species mediated injury of human lung epithelial cells after hypoxia-reoxygenation / C. Li, M.M. Wright, R.M. Jackson // Exp. Lung. Res. 2002. - №28(5). - p.373-389.

142. Li J.M. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology / J.M. Li, A.M. Shah // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 2004. - №287(5). - p.1014-1030.

143. Liebner S. The multiple languages of endothelial cell-to-cell communication / S. Liebner, U. Cavallaro, E. Dejana // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006. - №26. -p.1431-1438.

144. Littauer A. Release of reactive oxygen by hepatocytes on reoxygenation: three phases and role of mitochondria / A. Littauer, H. de Groot // Am. J. Physiol. 1992. - №262. - p.233-239.

145. Liu Y. Hypoxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cells. Identification of a 5' enhancer / Y. Liu, S.R. Cox, T. Morita, S. Kourembanas// Circ. Res. 1995. - №77(3). -p.638-643.

146. Lundberg J.O. NO generation from nitrite and its role in vascular control arterioscler / J.O. Lundberg, E. Weitzberg // Thromb. Vase. Biol. 2005. -№24.-p. 155-157.

147. Manalo D.J. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1 / D.J. Manalo, A. Rowan, T. Lavoie, L. Natarajan, B.D. Kelly, S.Q. Ye, J.G.N. Garcia, G.L. Semenza // Blood. -2005. №105-2. - p. 659-670.

148. Marti H.H. Angiogenesis—a self-adapting principle in hypoxia / H.H. Marti// EXS. -2005. №94. -p.163-180.

149. Maulik N. Redox signaling in vascular angiogenesis / N. Maulik, D.K. Das // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol.15. - №33(8). - p. 1047-1060.

150. Mchta D. Signaling mechanisms regulating endothelial permeability / Mehta D, Malik A.B. // Physiol Rev. 2006 Jan;86(l):279-367.

151. Menger M.D. Role of oxygen radicals in the microcirculatory manifestations of postischemic injury / M.D. Menger, H.A. Lehr, K. Messmer// Klin. Wochenschr. 1991. - №69(21-23). - p.l050-1055.

152. Michiels С. Endothelial cell responses to hypoxia: initiation of a cascade of cellular interactions / C. Michiels, T. Arnould, J. Remacle // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - №1497(1). - p.1-10.

153. Michiels C. Endothelial cell functions / C. Michiels// J. Cell. Physiol. -2003.-№196.-p. 430-443.

154. Michiels C. Physiological and pathological responses to hypoxia / C. Michiels // American Journal of Pathology. 2004. - Vol. 164. - №6. -p.l 875-1882.

155. Mitchell J.A. Role of nitric oxide and prostacyclin as vasoactive hormones released by the endothelium / J.A. Mitchell, F. Ali, L. Bailey, L. Moreno, L.S. Harrington // Exp. Physiol. 2008. - №93(1). -p.141-147.

156. Minchenko A. Hypoxic stimulation of vascular endothelial growth factor expression in vitro and in vivo / A. Minchenko, T. Bauer, S. Salceda, J. Caro Lab. Invest. 1994. - №71(3). - p.374-379.

157. Mitra P. Electric measurements can be used to monitor the attachment and spreading of cells in tissue culture / P. Mitra., C.R.Keese, I. Giaever // Biotechniques.- 1991. №11(4). -p.504-510.

158. Nagy J.A. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis / J.A. Nagy, L. Benjamin, H. Zeng, A.M. Dvorak, H.F. Dvorak Angiogenesis. 2008. - №11(2). - p. 109-119.

159. Nanduri J. Transcriptional responses to intermittent hypoxia / J. Nanduri, G. Yuan, G.K. Kumar, G.L. Semenza, N.R. Prabhakar // Respir. Physiol. Neurobiol. 2008. - №164(1-2). -p.277-281.

160. Neufeld G. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors / G Neufeld., T. Cohen, S. Gengrinovitch, Z. Poltorak // FASEB J. -1999. №13(1). -p.9-22.

161. Ni Z. Role of endothelin and nitric oxide imbalance in the pathogenesis of hypoxia-induced arterial hypertension / Z. Ni, S. Bemanian, S.D. Kivlighn, N.D. Vaziri // Kidney Int. 1998. - №54. - p. 188-192.

162. Nilsson I. Differential activation of vascular genes by hypoxia in primary endothelial cells / I. Nilsson, M. Shibuya, S. Wcnnstrom // Exp Cell Res. 2004. - №299(2). - p.476-485.

163. Parfenova H. Cerebroprotective functions of HO-2 / Parfenova H., Leffler C.W.//Curr. Pharm. Des. 2008. - №14(5). -p.443-453.

164. Partridge C. Hypoxia and reoxygenation stimulate biphasic changes in endothelial monolayer permeability / C. Partridge // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 1995. -№13. -p.52- 58.

165. Pinsky D.J. Hypoxia and modification of the endothelium: implications for regulation of vascular homeostatic properties / D.J. Pinsky, S.F. Yan,

166. C. Lawson, Y. Naka, J.X. Chen, E.S. Jr. Connolly, D.M. Stern // Semin. Cell Biol. 1995. - №6(5). - p.283-294.

167. Prabhakar N.R. Carbon monoxide: a role in carotid body chemoreception / N.R. Prabhakar, J.L. Dinerman, F.H. Agani, S.H. Snyder//Proc. Natl. Acac. Sci. USA. 1995. - №92. - p. 1994-1997.

168. Prabhakar N. Invited review: oxygen sensing during intermittent hypoxia: cellular and molecular mechanisms / Prabhakar N. // J. Appl. Physiol. 2001. - №90. - p. 1986-1994.

169. Prabhakar N.R. Intermittent hypoxia: cell to system / N.R. Prabhakar, R.

170. D. Fields, T. Baker, E.C. Fletcher. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2001. - №281. - p.524—528.

171. Prabhakar N.R. 02 sensing at the mammalian carotid body: why multiple O2 sensors and multiple transmitters? / N.R. Prabhakar // Exp. Physiol. -2006. -№91.1- p. 17-23.

172. Pohlman Т.П. Adaptive responses of the endothelium to stress / Т.Н. Pohlman, J.M. Harlan // J. Surg. Res. 2000. - №89(1). - p.85-119.

173. Pugh C.W. Activation of hypoxia-inducible factor-1; definition of regulatory domains within the subunit / C.W. Pugh, J.F. O'Rourke, M. Nagao, J.M. Gleadle, P.J. Ratcliffe // J. Biol. Chem. 1997. - №272. -p.l 1205-11214.

174. Ratcliffe PJ. HIF-l and HIF-2: working alone or together in hypoxia? / P.J. Ratcliffe // J. Clin. Invest. 2007. - №117(4). - p.862-865.

175. Russell F.D. Evidence using immunoelectron microscopy for regulated and constitutive pathways in the transport and release of endothelin / F.D. Russell, J.N. Skepper, A.P. Davenport// J Cardiovasc Pharmacol. -1998. №31.-P. 424-430.

176. Ryter S.W. Mechanisms of cell death in oxidative stress / S.W. Ryter, H.P. Kim, A. Hoetzel, J.W. Park, K. Nakahira, X. Wang, A.M. Choi // Antioxid. Redox. Signal. 2007. - №9(1). - p.49-89.

177. Sabatier F. Type 1 and type 2 diabetic patients display different patterns of cellular microparticles / F. Sabatier, P. Darmon, B. Hugel, V. Combes, M. Sanmarco, J.G. Velut, D. Arnoux, P. Charpiot, J.M. Freyssinet, C.

178. Oliver, J. Sampol, F. Dignat-George I I Diabetes. 2002. - №51. -p .2840-2845.

179. Schiffrin E.L. Vascular biology of endothelin / E.L. Schiffrin // J Cardiovasc Pharmacol. 1998. - Vol. 32, № 3. - P. 2-13.

180. Schofield C.J. Oxygen sensing by HIF hydroxylases / C.J. Schofield, P.J. Ratcliffe // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - №5. - p.343-354.

181. Shpargel K.B. Preconditioning paradigms and pathways in the brain / K.B. Shpargel, W. Jalabi, Y. Jin, A. Dadabayev, M.S. Pcnn, B.D. Trapp // Cleve. Clin. J. Med. 2008. - №75. - p.77-82.

182. Shweiki D. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis / Shweiki D., Itin A., Soffer D., Keshet E. // Nature. 1992. - №359(6398). - p.843-845.

183. Semenza G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation / G.L. Semenza, G.L. Wang // Mol. Cell. Biol. 1992. -№12. - p.5447-5454.

184. Semenza G.L. Hydroxylation of HIF-1: Oxygen Sensing at the Molecular Level / G.L. Semenza // Physiology. 2004. - №19 -p. 176-182.

185. Semenza G.L. New insights into nNOS regulation of vascular homeostasis / G.L. Semenza // J. Clin. Invest. 2005. - №115(11). -p.2976-2978.

186. Serebrovskaya T.V. Intermittent Hypoxia: Cause of or Therapy for Systemic Hypertension? / T.V. Serebrovskaya, E.B. Manukhina, M.L. Smith, H.F. Downey, R.T. Mallet // Experimental Biology and Medicine. 2008. - №233. - p.627-650.

187. Solodushko V. Pulmonary microvascular endothelial cells form a tighter monolayer when grown in chronic hypoxia / V. Solodushko, J.C. Parker,

188. B. Fouty // AJRCMB Articles in Press. 2007. - №10. - p.l 165.

189. Steiner D.R. Interaction between rcactive oxygen species and nitric oxide in the microvascular response to systemic hypoxia / D.R. Steiner, N.C. Gonzalez, J.G. Wood // J Appl Physiol. 2002. - №93(4). - p. 14111418.

190. Strydom D. J. The angiogenins / D. J. Strydom // CMLS, Cell. МоГ. Life Sci.- 1998. -№54.-p.811-824.

191. Sims P.J. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane / P.J. Sims, T. Wiedmer,

192. C.T. Esmon, H.J. Weiss, S.J. Shattil // J. Biol. Chem. 1989. - №264. -p.17049-17057.

193. Steiner D.R. Interaction between reactive oxygen species and nitric oxide in the microvascular response to systemic hypoxia / D.R. Steiner, N.C. Gonzalez, J.G. Wood // J. Appl. Physiol. 2002. - №93(4). -p.1411-1418.

194. Ten V.S. Endothelial response to hypoxia: physiologic adaptation and pathologic dysfunction / V.S. Ten, D.J. Pinsky // Curr. Opin. Crit. Care. -2002. №8(3). - p.242-250.

195. Ileitzcr T. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease / T. Heitzer, T. Schlinzig, K. Krohn, T. Meinertz, T. Miinzel // Circulation. 2001. -№104.- p.2673.

196. Thomas S.R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities / S.R. Thomas, P.K. Witting, G.R. Drummond // Antioxid. Redox. Signal. 2008. - №10(10). -p.1713-1765.

197. Tkachuk V.A. Hypoxia and reactive oxygen species in regulation of vascular growth and remodeling / V.A. Tkachuk, N.I. Kalinina, E.V. Parfyonova // International society for adaptive medicine (ISAM) VIII world congress . Moscow, 2006. - P. 12-13.

198. Vestweber D. Adhesion and signaling molecules controlling the transmigration of leukocytes through endothelium / D. Vestweber // Immunol. Rev. -2007. №218. - p.178-196.

199. Van Slyke D.D. Oxygen physiology, normal and abnormal; the filth Edsel B. Ford lecture, 1956 / Van Slyke D.D. // Henry Ford Hosp. Med. Bull. 1957. - №5(1). - p.25-30.

200. Waltenberger J. Modulation of growth factor action: implications for the treatment of cardiovascular diseases / J. Waltenberger // Circulation. — 1997. №96(11). - p.4083-4094.

201. Wang G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension / G.L. Wang, B.-H. Jiang, E.A. Rue, G.L. Semenza // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. - №92. -p.5510-5514.

202. Williams S.E. Hemoxygenase-2 is an oxygen sensor for a calcium-sensitive potassium channel / S.E. Williams, P. Wootton, H.S. Mason, J. Bould, D.E. lies, D. Riccardi, C. Peers, P.J. Kemp // Science. 2004. -№306. -p.2093-2097.

203. Wilkie M.E. Hypoxia-induced von Willebrand factor release / M.E. Wilkie, C.R. Stevens, J. Cunningham, D. Blake // Miner Electrolyte Metab. 1992. - №18(2-5). - p. 141-144.

204. Wu M.H. Endothelial focal adhesions and barrier function / M.H. Wu // J. Physiol. 2005. - №569. - p.359-366.

205. Zwaal R.F.A. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells / R.F.A. Zwaal, A.J. Schroit // Blood. 1997. -Vol. 89. -№4. - p. 1121-1132.

206. Xie K. Constitutive and inducible expression and regulation of vascular endothelial growth factor / K. Xie, D. Wei, Q. Shi, S. Huang // Cytokine Growth Factor Rev. 2004. - №15(5). - p.297-324.

207. Yang W. Effect of hypoxia and reoxygenation on the formation and release of reactive oxygen species by porcine pulmonary arteryendothelial cells / W. Yang, E.R. Block // J. Cell. Physiol. 1995. -№164(2).-p.414-423.

208. Yuan G. Activation of HIF-2a by intermittent hypoxia requires CaMKII / G. Yuan, G. Adhikary, N.R. Prabhakar // FASEB J In press.

209. Yuan G. Role of oxidative stress in intermittent hypoxia-induced immediate early genes activation in rat PC 12 cells / G. Yuan, G. Adhikary, A.A. McCormic, J.J. Holcroft, J.K. Kumar, N.K. Prabhakar // J. Phyiol. 2004. - №557. - p.773-783.у I

210. Zhou X. Late ischemic preconditioning is mediated in myocytes by enhanced endogenous antioxidant activity stimulated by oxygen-derived free radicals / X. Zhou, X. Zhai, M. Ashraf // Circulation. 1996. -№94(11). - p.2992-2993.

211. Zhang L. Adaptation of pharmacomechanical coupling of vascular smooth muscle to chronic hypoxia / L. Zhang // Сотр. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 1998. - №119(3). -p.661 -667.

212. Zulueta J.J. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cells exposed to anoxia-reoxygenation / J.J. Zulueta, R. Sawhney, F.S. Yu, C.C. Cote, P.M. Hassoun // Am. J. Physiol. 1997. -p.897-902.

Информация о работе

Макаренко, Владислав Вячеславович
кандидата медицинских наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы