Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль биологических ритмов в реализации токсических эффектов химических веществ у млекопитающих в эксперименте
ВАК РФ 03.02.14, Биологические ресурсы
Автореферат диссертации по теме "Роль биологических ритмов в реализации токсических эффектов химических веществ у млекопитающих в эксперименте"
0046189,«
На правах рукописи
Мелешин Марат Игоревич
РОЛЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ РИТМОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
03.02.14 - биологические ресурсы
Автореферат
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 3 ДЕК 2010
Владикавказ 2010
004618933
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» на кафедре биологической и химической
технологии
Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ,
доктор биологических наук, профессор Чопикашвили Лидия Васильевна
Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки КБР, доктор
биологических наук, профессор Дзуев Руслан Исмагилович
Защита состоится "2? " декабря 2010 г. на заседании диссертационн совета Д 220.023.04 при ФГОУ ВПО «Горский государственный аграр! университет» по адресу: 362040, РСО-А, г. Владикавказ, ул. Кирова, Горский ГАУ, факультет биотехнологии и стандартизации, компьютерный: Тел./ факс: 8-(8672) 53-99-26.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Горе государственный аграрный университет», с авторефератом на официалы сайте: www.gorskigau.ru
Автореферат разослан "26 " ноября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор Василиади Георгий Кузьмич
Ведущая организация: ФГОУ ВПО "Южный федеральный
университет"
доцент
Гревцова С.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. В условиях масштабного антропогенного рязнения окружающей среды проблема сохранения биологических ;урсов приобретает первостепенную значимость. В настоящее время ивно пересматривается государственная природоохранная политика: в ее 10ву закладывается концепция экологического риска. Базис новой годологии оценки экотоксикантов должны составить принципы, ггывающие биоритмологический профиль живых существ, поскольку зцессы, протекающие в организме, в разные временные периоды могут ть как на подъеме, так и на спаде. Это обстоятельство определяет [ебания чувствительности (хронорезистентность) биосистем к стрессору зависимости от суммарной составляющей ритмических процессов, утекающих на всех уровнях организации живой материи. С другой стороны, при решении теоретических и прикладных проблем иска, изучения и рационального использования новых растительных и вотных ресурсов также необходимо учитывать биоритмологические номены. Использование существующих стандартных технологий и методик всегда позволяет корректно оценить свойства изучаемого объекта, вменение животных (в частности, лабораторных) в качестве биообъектов и изучении биологической активности тестируемых соединений, деленных из растительных или животных источников, без учета их ркадианных, сезонных, годовых и др. биоритмов может дать весьма каженные результаты.
Актуальность настоящей работы определяется недостаточной ценностью роли сезонных биоритмов в колебаниях степени токсичности мических веществ у млекопитающих, необходимостью научного основания практических рекомендаций и решений, направленных на ижение экологического риска.
Цель работы заключается в изучении возможного влияния сезонных оритмов на функциональную активность печени и кроветворной системы ыс и, как следствие, изменение хронотоксичности ряда химических ществ.
Идея работы состоит в разработке научных основ оценки и огнозирования биотоксичности химических веществ (загрязнителей ружающей среды - ОС) у млекопитающих с учетом хронобиологического дхода, расширении географии использования новых растительных ресурсов юры Центрального Кавказа.
Задачи исследования:
1. Изучить сезонную динамику гепатотоксичности тетрахлорметана (ТХМ) у крыс в эксперименте.
2. Создать модель оксидативного стресса у животных, адекватно воспроизводящую механизм действия химических экотоксикантов.
3. Выявить вариабельность гемотоксичности химических веществ (циклофосфамид, натриевая соль 4-дезокси-4-амино-ТЧ-10-метилфолиевой кислоты (метотрексат), 5-фторурацил) у крыс в условиях смены сезонов.
4. Изучить гепатозащитное действие экстракта плодов расторопши пятнистой («Карсила») в различные сезоны года.
5. С учетом биоритмологического профиля лабораторных животных (крыс линии Wistar) изучить гепатопротекторные свойства отдельных представителей флоры Центрального Кавказа.
На защиту выносятся:
- результаты изучения изменений гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в течение года с периодами в 2-3 недели;
- созданная на основе ряда фармакологических препаратов (циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил - CMF) модель, отражающая комплексное воздействие химических веществ на организм млекопитающих в аспекте цитогенетических, биохимических и гематологических изменений;
- данные об изменении гематотоксичности ряда химических веществ (CMF) в различные сезоны года;
- результаты изменения (обращения) гепатозащитных свойств экстракта плодов расторопш и пятнистой (¡Silybum marianum L., «Карсила») в модели экспериментального токсического гепатита в различные сезоны года;
- результаты испытаний новых (нефармакопейных) видов флоры Центрального Кавказа (манжетка шелковая (Alchemilla sericata R.), василек Фишера (Centaurea fischeri S.), клевер золотистый {Trifolium aureum Р.)), обладающих гепатозащитными свойствами.
Методы исследования включают цитогенетический и биохимический анализ (автоматический биохимический анализатор ChemWell 2902, США), гистологические исследования, гематологические исследования (автоматический гематологический анализатор Erma РСЕ-210, Япония), спектрофотометрию (PC UV-спектрофотометр Shimadzu, Япония), математический анализ (программный пакет Excel).
Объектами исследования служили крысы линии Wistar (410 самцов и 100 самок), растения, собранные в условиях высокогорья РСО-А: манжета, шелковая, василек Фишера, клевер золотистый.
Научная новизна:
- изучена вариабельность гепатотоксического действия тетрахлорметана рыс в течение года, оцениваемая биохимически (в плазме: аланин- и артаттрансаминазы (АлТ и АсТ соответственно), прямой и общий ирубин, холестерин, щелочная фосфатаза (ЩФ)) и морфологически веночные срезы, окраска азур-эозином);
- с помощью ряда доступных веществ (циклофосфан, метотрексат, 5->рурацил) создана модель, адекватно имитирующая изменения в анизме млекопитающих, обусловленные химическими загрязнителями ужающей среды; при этом у крыс в комплексе изучены следующие аметры: система «перекисное окисление липидов - антиоксидантная дита» (ПОЛ-АОЗ), цитогенетические (кластогенные) эффекты, жциональное состояние печени, гематологические показатели;
- выявлены различия в цитостатических эффектах препаратов СМР, ниваемых количественными и качественными изменениями в популяциях ток крови, в условиях смены сезонов года;
- показана возможность обращения гепатозащитного действия экстракта >дов расторопши пятнистой в модели СС14-индуцированного гепатита в личное время года;
- экспериментально доказана перспективность использования экстрактов зснове манжетки шелковой, выделенной из флоры Центрального Кавказа, ачестве гепатозащитного средства.
Научное значение работы состоит в создании теоретико-годологической базы для оценки риска биологическим ресурсам ;екопитающим) от химических загрязнителей окружающей среды с позиций »нобиологии. Экспериментально доказано, что в течение года токсичность юго и того же вещества, взятого в одной и той же концентрации, может яительно варьировать - в пределах одного порядка. Выявленная ономерность носит общий характер: изменения в функциональной ивности печени животных могут приводить к резкому ослаблению ращению) гепатозащитных свойств БАВ, выделенных из растительных очников. Данное обстоятельство должно явиться базисом современных годов изучения новых растительных ресурсов. Практическая значимость:
1. Полученные в ходе экспериментальных исследований результаты о мительной вариабельности токсичности химических агентов под действием сезонных биоритмов лягут в основу концепции оценки и эгнозирования негативного воздействия на организм млекопитающих гропогенных загрязнителей и продуктов их химических трансформаций.
2. Внедрение в практику Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по! здравоохранению и социальному развитию» (СОГМА, г. Владикавказ) разработанных методик оценки функционального состояния печени (АпТ, АсТ, прямой и общий билирубин) в условиях СС14- индуцированного токсического гепатита позволило реализовать скрининговые исследования по поиску новых гепатопротектооров, выделенных из флоры Центрального Кавказа.
3. Выявленные закономерности об изменении гемато- и гепатотропности веществ в течение года у лабораторных животных (крыс) найдут отражение в методических рекомендациях по изучению и поиску новых БАВ, выделенных из растительных источников.
4. Сравнительный анализ гепатопротекторной активности извлечений из манжетки шелковой, василька Фишера ri клевера золотистого в модели СС14-индуцированного токсического гепатита у крыс показал высокую биологическую активность манжетки шелковой, что является научно обоснованной рекомендацией для дальнейших исследований этого вида с целью создания нового гепатозащитноГо средства.
Обоснованность и достоверность научных положений, выводов и рекомендаций подтверждается высокой сходимостью экспериментальных данных, полученных различными (независимыми) методами анализа; результатами лабораторных исследований и испытаний, обработанными с применением методов ,математической статистики итеори] ошибок.
Апробация работы. Основные положения и результаты докладывалиа на II, III Всероссийских научных конференциях «Актуальные проблем! экологии и сохранения биоразнообразия», Владикавказ 2008, 2009 г.; ) Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», Москва 2009 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальны проблемы фармацевтической науки и практики», Владикавказ, 2009 г.
Внедрение результатов исследования. В практику Центрально] научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО СОГМА внедрен! оптимизированные методики определения аланин- и аспартатгрансамина; прямого и общего билирубина в плазме животных с модельным токсическиг гепатитом.
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликован! 6 печатных работ, отражающих основные результаты. В их числе 2 в журнале рекомендованном ВАК, одна в материалах международной конференцт остальные - во всероссийских.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех (из которых 3 главы включают результаты собственных исследований), ¡ючения, списка литературы, включающего 128 источников, в том числе а иностранных языках, и приложения. Основное содержание изложено 20 страницах машинописного текста, иллюстрированного 10 таблицами рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материалы и методы исследования
)бъектом исследования служили крысы линии Wistar (410 самцов и 100 эк) массой 250-270 г. Минимальное количество животных в опытных и грольных группах составляло 7 особей. Животные содержались на цтонарной диете вивария. За 7 дней до эксперимента из рациона тючались сочные корма. Бежим освещения: искусственное (с 9:00 до 0) в сочетании с естественным. Временная схема эксперимента: введение трактов (растворителя) в 10:00; тетрахлорметана, препаратов CMF зиологического раствора) в 11:00; кормление в 13:00; забой — спустя 24 i после последнего введения затравок.
Онтогенетический анализ проводили по стандартной методике ководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и церогенных веществ, 1989). Биохимический анализ крови осуществляли ютветствии с руководствами, изложенными в (Камышников B.C., 2003; авочник по лабораторным методам исследования, 2003). Определение пин- и аспартатгрансаминаз, прямого и общего билирубина в крови ютных с модельным токсическим гепатитом осуществляли с помощью гинальных методик, разработанных специально для автоматического химического анализатора. Суть их сводится к тому, что определяемые аметры находятся в зоне линейности градуировочного графика (в области щий, подчиняющихся кинетике первого порядка). Фиксацию образцов ени осуществляли 10% раствором формалина.
'астительный материал собран в окрестностях ледника Мидаграбин, в »гавской межгорной котловине (на высоте 1600 м над ур. м.) и в алесской межгорной котловине, среди лугово-степной растительности (на оте над ур. м. - 1000 м). Выделение комплекса БАВ осуществляли в арате Сокслета с использованием 70% этанола. Животным вводили ные растворы, полученные после отгонки этанола в вакууме.
2. Проявления токсичности химических веществ в условиях сезонных биоритмов Годовая динамика гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в перименте: Попадая в организм млекопитающих, поллютанты активно ючаются в обменные процессы. Центральным органом, осуществляющим
метаболизм химических веществ у животных, является печень. В результате биотрансформации (микросомального окисления, конъюгации с различными субстратами) ксенобиотиков могут иметь место не только процессы дезактивации (детоксикации), но и активации, а, в ряде случаев, -токсификации. Универсальным механизмом повреждения гепатоцитов является инициация перекисного окисления липидов, в результате чего образующиеся высокореактивные интермедиаты нарушают целостность клеточных структур. В этой связи удобной моделью для изучения базовых механизмов токсического поражения печени является ТХМ, метаболизм
сс,4+^МИ»0С0!Шсс1;+сГ
которого происходит с образованием свободных радикалов (Гепатоцит: функционально-метаболические свойства, 1985),
Данное обстоятельство обусловливает широкое применение четыреххлористого углерода для формирования токсического гепатита у лабораторных животных с целью поиска и изучения новых гепатопротекторов, преимущественно растительного происхождения (Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических средств, 2005).
С другой стороны, в литературе также встречаются примеры использования тетрахлорметана в качестве инсектицида и антигельминтного средства у сельскохозяйственных животных. Некоторые авторы (Seawright A.A. et al., 1972) отмечают, что в отдельные периоды года применение ТХМ приводило к высокой смертности в стадах овец (до 6%). Объяснение этому обстоятельству они видят в существовании сезонных ритмов. В этой связи изучение гепатотоксических свойств тетрахлорметана у млекопитающих в течение различных сезонов года является актуальной задачей.
Гепатотоксическое действие изучено на 248 самцах крыс линии Wistar, разделенных на группы по 8 особей (20 опытных и 11 контрольных групп). Опытным животным на протяжении года с интервалами в 2-3 недели вводили затравки 25% масляного раствора ТХМ per os из расчета 2 мл/кг в течени< 4 дней, контрольным - эквиобъемные количества оливкового масла. По; общим наркозом из сердца отбирали кровь в объеме 2-3 мл (антикоагулянт-гепарин). В плазме определяли следующие показатели: АлТ и АсТ, прямой i общий билирубин, холестерин, ЩФ. Результаты представлены на рис. 1.
Из представленных в графической форме результатов видно, чтс гепатотропность ТХМ в течение года резко меняется: в батифазе значенш наиболее информативного показателя - АлТ (характеризующей цитолитический синдром гепатоцитов) в крови опытных животны: отличаются от соответствующего контррля в 5,8 раз (22.04.10), а в акрофаз! (13.06.09) уже в 22,0 раза. При этом минимальное значение коэффициента д Ритиса, отражающее степень тяжести поражения печени, также приходит
—АЛТ опытные — •—АСТ опытные
- —- -АЛТ контрольные — -АСТ контрольные
•Опытные
-Контрольные
Билирубин
мкмоль/л
0)01010)0)010)0)0)0
ГЧ С") Р1
И Прямой билирубин. □ Непрямой билирубин
не. 1. Изучение колебаний степени токсичности ТХМ у крыс в условиях сезонных биоритмов: а - АлТ и АсТ; б - коэффициент де Ритиса; в -билирубин, опытные животные
на середину июля. Весьма интересен характер изменений активности трансаминаз: с начала мая и до середины июля гепатотоксичность четыреххлористого углерода линейно увеличивается, а затем отмечается резкий спад (конец июля), который составил порядка 50% от предыдущего максимального значения (р=0,01).
Аналогично трансаминазам изменяются в крови опытных животных уровни прямого и общего билирубина: положения максимумов (пиков) на графиках достаточно хорошо коррелируют (рис. 1 а, в).
Важно отметить тот факт, что биохимические показатели, характеризующие работу печени контрольных (фоновых) животных, также меняются в течение года (и вполне соответствуют значениям, приведенным в литературе). Однако амплитуда отмеченных изменений многократно меньше, чем у животных, подверженных токсическому воздействию ТХМ.
На рис. 2 представлена гистологическая картина печени животных, показатели которых имели экстремумы на графиках рис. 1 а, б и в.
га - / га . "' ,
Рис. 2. Микрофотографии срезов печени крыс (окраска гематоксилин -эозин а - контрольные животные; животные с модельным токсически гепатитом: б - 15.05.09; в - 13.06.09; г-13.03.10.
и
Во всех экспериментальных группах отмечены дистрофические изменения, однако их масштаб (умеренная - тяжелая степень) и характер проявления (вакуольно-жировойлибо белково-гидропический) взначительной (определяющей) мере зависели от времени введения токсина.
Таким образом, сезонные биоритмы обусловливают значительные колебания в восприимчивости животных организмов к действию токсикантов (хроночувствительность), что должно учитываться при оценке экологического риска в зонах с повышенной антропогенной нагрузкой, а также при разработке основных принципов системного анализа и моделирования в экологии.
Моделирование состояния оксидативного стресса у животных. В последнее время появилось много работ, в которых действие экотоксикантов на различные биосистемы (млекопитающих, насекомых, (астения) оценивают по степени изменений в системе ПОЛ-АОЗ. Достоинством данного подхода является хорошо разработанная методическая база биохимической оценки параметров указанной системы, которые адекватно отражают степень негативных (патологических) изменений организма, вызванных ксенобиотиками. Теоретически обосновано и экспериментально доказано, что вещества самых различных классов химических загрязнителей ОС (тяжелые металлы, пестициды, борорганические соединения, включая супертоксиканты и пр.) вызывают существенные изменения в системе ПОЛ-АОЗ, что определяет ее в качестве чувствительного и универсального индикатора для оценки риска 5иосистемам со стороны негативных антропогенных факторов.
Для разработки модели оксидативного стресса выбраны фармакологические препараты, обладающие цитостатическим эффектом -циклофосфан, метотрексат и 5-фторурацил. Эксперименты проведены на ;амках крыс линии \Vistar массой 250-270 г. Животные были разделены на *ве группы: опытную и контрольную, по десять в каждой. Экспериментальным крысам вводили внутрибрюшинно циклофосфан 100 мг/ л2 (один раз в день в течение двух недель), метотрексат и 5-фторурацил в лервый и восьмой день (40 и 600 мг/м2, соответственно), а контрольным кивотным - изотонический раствор хлорида натрия в соответствующих эбъемах. Спустя 29 дней был проведен повторный курс введения. Через 24 часа после последней инъекции у животных в крови определяли следующие показатели: уровень гидроперекисей (ГП), малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах, активность церулоплазмина (ЦП), эритроцитарных каталазы (КТ) и супероксиддисмутазы (СОД), гемоглобин (метод Drabk.ni), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), количество эритроцитов и лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, общий билирубин, холестерин, белок плазмы,
активность ЩФ. Цитогенетические исследования включали микроядерный тест на полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) крови. На каждую группу животных было проанализировано по 5000 ретикулоцитов (табл. 1).
Таблица 1
Комплексные исследования пролонгированного воздействия ряда химических веществ (СМБ) на организм животных
№ Изучаемый параметр Контрольная группа Опытная группа
Система ПОЛ-АОЗ
1 Концентрация ГП (мкмоль/л) 1,68±0,09 4,23±0,07*
2 Концентрация МДА (мкмоль/л) 21,28±1,4б 29,15±2,21**
3 Активность ЦП (мг/л) 217,4Ш 1,41 318,40±20,59**
4 Активность СОД (усл. ед./г НЬ) 0,88±0,04 0,93±0,08**
5 Активность КТ (хЮ"4, МЕУг НЬ) 6,83±0,31 7,60±0,15**
6 Содержание метгемоглобина (%) 1,31±0,14 2,17±0,16**
Биохимические показатели печени
7 Белок плазмы (альбумины) (г/л) 31,67±0,79 29,66±0,76
8 Щелочная фосфатаза (мккатал/л) 1,24±0,10 2,19±0,28**
9 Билирубин общий (мкмоль/л) 6,29±0,54 9,12±0,69**
10 Холестерин (ммоль/л) 2,14±0,18 3,88±0,24*
Гематологические показатели
11 Гемоглобин (г/л) 140,00±0,61 110,00±5,36*
12 СОЭ (мм/ч) 0,98±0,01 1,39±0,12**
13 Кол-во эритроцитов (млн/мкл) б,10±0,34 4,62±0,35*
14 Кол-во лейкоцитов (тыс/мкл) 6,30±0,53 2,26±0,50*
Лейкоцитарная формула
15 Аномальные клетки (%) 0 0,25±0,01*
16 Миелоциты (%) 1,00±0,65 2,00±0,65
17 Палочкоядерные нейтрофилы (%) 3,25±0,56 2,50±0,57
18 Сегментоядерные нейтрофилы (%) 16,75±0,75 48,13±5,15*
19 Эозинофилы (%) 1,25±0,45 2,25±0,70**
20 Моноциты (%) 5,5040,57 4,62±1,19**
21 Базофилы (%) 1,13±0,40 3,00±0,93*
22 Лимфоциты (%) 71,12±4,61 37,25±4,55*
Цитогенетические исследования
23 | Содержание микроядер в ПХЭ (%) 0,08±0,05 1,04±0,17**
*р<0,001; **р<0,05; не отмечено - недостоверные отличия.
По результатам, представленным в табл. 1, видно, что комплекс /чаемых препаратов (CMF) обладает широким спектром биологической гивности, вызывая множественные негативные изменения в организме у ытных крыс. (Показатели у животных контрольной группы хорошо зрелируют с литературными данными (Schlorf Е.С. etal., 1999; Руководство краткосрочным тестам..., 1989; Chattopadhyay К. et al., 2008; Западнюк П. и соавт., 1983)). Можно отметить значительную активацию рментативного звена системы АОЗ (достоверное увеличение активности >Д, КТ, ЦП), которая, однако, не способна эффективно компенсировать <сические соединения, образующиеся в результате интенсификации эцессов свободнорадикального окисления: уровень первичных продуктов )Л достоверно повысился в 2,5 раза в сравнении с контрольной группой, а )ричных продуктов (МДА) - в 1,4 раза. Вследствие исчерпания эндогенных гстановительных эквивалентов клетки (глутатиона, NADH и пр.), условленного ростом концентрации активных форм кислорода (АФК), мечено увеличение содержания в крови опытных животных ггемоглобина- нефункционального пигмента.
В показателях, характеризующих состояние печени, также можно метить четкую тенденцию к патологическим изменениям, которые, однако, 1годаря мощным резервам данного органа, незначительно выходят за гделы физиологической нормы.
Наибольшие изменения отмечены в гематологической картине опытных [вотных. Резкое снижение количественных показателей (численности лкоцитов, эритроцитов, содержания гемоглобина) фиксируется на фоне /боких изменений качественного состава в популяциях клеток белой и асной крови (появление аномальных клеток, выраженное состояние мфопении).
Цитогенетически выявлено резкое увеличение числа мутаций в магических клетках организма, что может быть связано с блокированием ятеза ДНК (циклофосфан, как и некоторые загрязнители ОС (Environmental dcogy, 2005), является алкилирующим агентом и приводит к образованию перечных сшивок ДНК, а введение синергистов - метотрексата и 5-орурацила - влечет за собой ингибирование ключевых ферментов, нтезирующих пиримидины и пурины). Все это в сумме обеспечивает сокий уровень кластогенеза.
Таким образом, показано, что введение препаратов CMF ведет к развитию гидативного стресса у крыс. В условиях данной модели изучены ответные акции организма млекопитающих на комплексное пролонгированное йствие химических веществ (включающих в себя и алкилирующий агент)
в отношении системы гемопоэза, функций печени, системы антирадикальнс защиты и генетического аппарата соматических клеток.
Сезонные колебания гематотоксичности соединений СМ Известно, что многие соединения (в том числе приоритетные загрязните; ОС - тяжелые металлы) способны весьма негативно воздействовать 1 гемопоэз. Установленно также (Экологический мониторинг: шаг за шаго 2003), что гематотоксическими свойствами (опыты на животных) обладай метаболиты бензола, который входит в состав не только сырой нефти, бензи! (от 5 до 16%), но и широко используется в химической промышленное Факт сезонных колебаний основных параметров крови животных являет давно установленным (Западнюк И.П. и соавт., 1983), поэтому интер представляет изучение аналогичной динамики на фоне патологическ! состояний.
Исследования проведены на 42 крысах линии ЖШаг (самцы), по сег животных в каждой группе. Опытная группа получала внутрибрюшин]
Таблиц*
Сезонные колебания гематотоксичности соединений СМР у крыс
Дата 1 Стат. показатель Лейк., ТЫС./МКЛ. Лимф., % Мон., % Гран.. % Эритр., МЛН./МКЛ. Гемогл., г/дл. Гематокрит, % Средн. объем эитр., фл Содерж. гемогл. в эритр., г/дл Распредел. эритр. по объему, % Тромбоц., тыс./мкл.
Контрольные животные
02/ М± 6,8 68,4 9,3 ' 22,3 7,2 13,7 38,0 53,1 35,9 15,0 458,0
10 т ±0,4 ±2,6 ±0,7 ±3,2 ±0,1 ±0,1 ±0,4 ±0,5 ±0,3 ±03 ±32,8
04/ Мк 6,4 66.1 8,4 25.5 7Д 13,1 38,4 55,1 33,0 15,0 439,4
10 т ±1,1 ±3,1 ±0,9 ±3.7 ±0,1 ±0,2 ±0,6 ±0,5 ±03 ±0Д ±143
0& Мь 6,1 76,0 8.6 15,4 7,3 13,0 41,4 56,6 31,1 14,9 398,8
10 т ±1.2 ±4.5 ±10 ±32 ±0,0 ±0,2 ±0,5 ±0,6 ±0,2 ±0,2 ±9,1
Опытные животные
02/ Мь 1,6 69,9 10.5 19,6 6,9 13,7 38,2 55,3 35,9 15,6 412,4
10 т ±0,3 ±5,1 ±1,2 ±5,2 ±0,1 ±0,2 ¿0,5 ±0,7 ±0,1 ±0,4 ±72,4
Р* 0,000 0,749 0,453 0,646 0,191 1,000 0,983 0,039 0,961 0,157 0,416
04/ № 1,8 67,5 7,3 25,2 6,6 13,2 35,8 54,5 36^5 15,8 543,0
10 т ±0,1 ±3,2 ±1,1 ¿3,4 ±0Д ±0,7 ±0,3 ±0,1 ±03 ±24,2
Р* 0,021 0,328 0,568 0,178 0,002 0,536 0,002 0,024 0,000 0,190 0,001
Об/ №Ь 1,4 65,4 11,4 23,2 5,8 9,7 32,8 56,7 29,5 20,4 514,8
10 т ±0.4 ±5,2 ±2.0 ±3,4 ±оз ±0,5 ±1,1 ±1,1 ±041 ±0,8 ±58,0
Р* 0,016 0,164 0,415 0.141 0,004 0,001 0,001 0,952 0,050 0,002 0,126
Примечание: шрифтом выделены достоверные отличия
<лофосфан (100 мг/м2, один раз в день в течение недели), метотрексат (40 'м2) и 5-фторурацил (600 мг/м2) в первый день; контрольные животные -зиологический раствор (в соответствующих объемах). Образцы крови 1тикоагулянт - гепарин) анализировались на автоматическом патологическом анализаторе ex tempore (во избежание агрегации змбоцитов). Результаты представлены в табл. 2. Из представленных данных видно, что гематотоксические проявления мических агентов весьма существенно зависят от сезонных биоритмов, вдифицирующее действие последних значительно флуктуирует, вплоть до лного нивелирования патологических проявлений (отличия между опытной юнтролыгой группой недостоверные).
3. Модель токсического гепатита у крыс как основа изучения (поиска) новых гепатопротекторов растительного происхождения Флора РСО-А чрезвычайно богата растительными ресурсами. В стоящее время в республике выявлено свыше 2300 видов сосудистых стений (Комжа, 2000). В данной работе предпринята попытка поиска и учения растений, обладающих лекарственными свойствами и, в частности, патозащитными.
Предпринятый скрининг основывался на двух положениях:
1) анализ современных литературных данных по гепатопротекторам;
2) сбор информации по растениям, использовавшимся в народной :дицине народов Кавказа вообще и осетин в частности, с целью выявления ; возможных гепатопротекторных свойств.
Как отмечают литературные источники (Маркович, 1906) осетины авнительно хорошо лечили раны и редко практиковали применение растений :рорально. Поэтому при отборе растений народной медицины в первую ¡ередь учитывались растения, обладающие ранозаживляющими юйствами.
В ходе скрининга изучена манжетка шелковая (Alchemilla sericata eichenb. ex Bus.). В Осетии произрастает 16 видов манжеток, ^имущественно в среднегорье и высокогорье. По литературным данным шжетки широко применяются в народной медицине Европы и Кавказа как {утреннее средство и как ранозаживляющее (Растительные ресурсы СССР, >87).
Изученный вид манжетки широко распространен в горной части Осетии обладает ресурсной базой. Растение небольшое, розеточное, с шелковисто лущенными листьями (откуда и происходит название). Произрастает в /старниках, на субальпийских и альпийских лугах, на скалах и осыпях.
Материал собран в окрестностях ледника Мидаграбин, в Даргавской межгорной котловине на высоте 1600 м над ур. м. Растения находились в конце фазы цветения и в начале плодоношения. Были собраны листья и, меньшем количестве, облиственные цветоносы.
В РСО-А произрастает 29 видов клевера. В работе изучен клеве золотистый (Trifolium aureum Poli.), собранный в фазе окончания цветени на субальпийских лугах Даргавской межгорной котловины, на высоте 16001 над ур. м. Собиралась полностью надземная часть растения. Массовый вид
В РСО-А известно 22 вида васильков. По устной информации местны жителей западной части Осетии (ущелье р. Урух), листья василька Фишер (Centaurea fischeri Schlecht.) обладают сильным ранозаживляющи1 действием. Для работы собраны прикорневые листья василька в начале фаз) плодоношения в Задалесской межгорной котловине среди лугово-степно растительности. Высота над ур. м. - 1000 м. Вид широко распространен горной части Осетии.
Исследования растительного сырья проводились в сравнении с эталонны! средством, имеющим также растительное происхождение - экстракта плодов расторопши пятнистой - лекарственный препарат «Карсил». О представляет собой смесь следующих флавонолигнанов: силибинина, изс силибинина, силидианина и силикристина. В обзоре, посвященно использованию данных веществ в медицине (Pradhan S.C., Girish С., 2006 отмечается, что указанные флавоноиды обладают антиоксидантным свойствами (эффективно подавляют образование АФК, цепные реакци переокисления липидов), мембраностабилизирующим эффектом (резк снижают процессы цитолиза), активируют процессы синтеза белке (ферментов печени), конкурируют с токсинами за связывание с рецепторам на мембране гепатоцитов, оказывают противовоспалительный эффеь (подавляют 5-липооксигеназный путь), препятствуют образованию фибрознс ткани.
Таким образом, цель настоящей работы сводилась к поиску новы гепатопротекторов растительного происхождения с построение методологической основы эксперимента на биоритмологическом подходе.
Гепатопротекторные свойства «Карсила» в условиях сезонны биоритмов. Исследования проводились на 144 самцах крыс линии Wista Животные были разделены на группы по 8 особей в каждой. Схема введет гепатопротектора (внутрижелудочно): минимальная концентрация -30 м кг, максимальная - 150 мг/кг (водная суспензия). Негативный контроль растворители (вода, через час масло оливковое), позитивный контроль - вод через час раствор ТХМ в масле: 25% раствор в течение 4 дней в объеме мл/кг - схема 1; и 50% раствор ТХМ однократно в объеме 4 мл/кг - схеи
Результаты отражены в табл. 3.
Анализируя данные, представленные в таблице, следует отметить, что дель токсического гепатита сформирована во всех опытных группах >стоверные отличия от негативного контроля в биохимических сазателях). В отношении гепатозащитных свойств "Карсила" выявлена чительная вариабельность действия в зависимости от времени и схемы ;дения. Схема 1: можно с уверенностью утверждать, что [атопротекторный эффект, оцениваемый биохимически, отсутствует: гговерных отличий между группами позитивного контроля и леченных вотных (особенно в показателях АлТ и АсТ) не выявлено, а активность D в группе животных, получавших "Карсил", в феврале 2009 г оказалась ке на 26% выше (р=0,01), что может свидетельствовать об енсификации процессов свободнорадикального окисления, обусловленного ¡ствием ТХМ (ЩФ расположена на внешней поверхности каналикулярной мбраны гепатоцитов, которая, разрушаясь, высвобождает фермент трацеллюлярно).
Схема 2 (является альтернативной схеме 1 при изучении гепатозащитных >йств (Руководство по экспериментальному..., 2005)): отсутствие эффекта еврале сменяется протекгивным действием в марте и апреле: активность Т (маркера цитолиза гепатоцитов) в сравниваемых группах достоверно шчается.
Таким образом, макроритмы (с периодами более 20 дней) существенным эазом влияют на физиологические функции организма млекопитающих, казано, что в условиях смены сезонов года могут иметь место гественные (начинает проявляться гепатопротекторное действие) и [ичественные (коэффициент защиты "Карсила", рассчитанный на основании Т, в марте составил 26%, а в апреле возрос до 36%) изменения. Изучение гепатопротекторных свойств Alchemilla sericata ichenb. ex Bus., Trifolium aureum Poll, и Centaurea fischeri Schlecht, модели СС14-токсического гепатита у крыс. Исследования эводились на самцах и самках крыс линии Wistar (80 самок и 32 самца). 1Вотные были разделены на группы по 8 особей в каждой. Схема :перимента: негативный контроль (вода, через час масло оливковое), 5итивный контроль (вода, через час 25% раствор ТХМ в объеме 2 мл/кг), ытные группы: водная суспензия гепатопротектора (в двух различных щентрациях), через час - гепатотоксин. Период введения - 4 дня, способ ;дения - per os.
Приготовление экстрактов: траву высушивали, измельчали и помещали в парат Сокслета для экстракции. Экстрагент - 70% этиловый спирт, шощийся хорошим растворителем для флавоноидов. Извлечения из травы
Таблица 3
Гепатозащитный эффект расторопши пятнистой плодов экстракта («Карсила») в условиях сезонных биоритмов
Дата Группа животных Бкл. прям, мкмоль/л Бил. общ, мкмоль/л Холестер. ммоль/л ЩФ.Ел/л ЛлТ, мккэт/л АсТ. мккэт/л КдеРитиса
Схема 1
Негат. к-гь 0,90+0,19 1,88 ±0,34 1,43 ±0,07 248,8 ±22,7 029 ±0,07 0,38 ±0,08 1,31 ±0,11
Февраль 2009 Позит. к-ль 3,09 ±0.32 4,17±0,24 1.06 + 0,11 708,4 ±542 624 ±0,85 2,06 ±029 0,34 ±0,02
р* (отн. негэт.к-ля) 0,00 0,01 0,02 0,00 0,00 0,00 0,03
Карсилмин 2,56 ±0,25 4,13 ±0,42 1,61 ±0,12 955,1 ±842 6,74 + 0,90 2,49 ±0,36 0,37 ±0,01
р" (отн. позит. к-пя) 0,50 0,93 0,00 0,01 0,68 0,39 026
Негат. к-ль 0,95 ±0,24 1,48±0,18 1,30 ±0,08 175,8+9,9 020±0,00 0,21 ±0,00 1,07 ±0,03
Май 2009 Позит. к-ль 2,59±0,15 3,91 ±029 1,61+0,14 885,1 ±80,7 2,05 ±0,55 1,03 ±0,19 0,55 ±0,06
Р* 0,00 0,00 0,06 0,00 0,02 0,01 0,00
Карсилмин 3,40 ±026 8,48 ±0,44 1,56 ±0,05 632,3 ±39,6 2,85+0,53 1,00 ±023 0,67 ±0,14
Р** 0,34 0,00 0,56 0,05 0,19 0,55 0,40
Негат. к-ль 1,12±0,11 2,38 ±0,45 1,54+0,10 571,6±73,8 0,30 ±0,02 0,31 ±0,02 1,07 ±0,06
Декабрь 2009 Позит. к-ль 3,86 ±0,36 4,52 ±0,42 1,80±0,12 790,6 ±33,3 120±0,13 1,54 ±0,08 1,49 ±0,18
Р* 0,00 0,02 0,04 0,06 0,02 0,00 0,09
Карсилмин 4,53 ±0,43 6,00 ±0,59 1,94 ±0,09 661,5 ±30,6 1,06+0,06 . 1,12±0,18 1,10±0,41
Р" 0,15 0,19 0,42 0,00 0,61 0,05 0,10
Схема 2
Негат. к-ль 1,14±0,16 1,29 ±0,17 1,98 ±0,06 432,0± 13,8 0,15 ±0,02 020±0,02 1,34 ±0,04
Февраль 2010 Позит. к-ль 9,38 ±2,1 10,67 ±2,81 2,04 ±0,19 6852±67,6 6,48 ±0,58 2,46 ±021 0,38 ±0,01
Р* 0,00 0,06 0,81 0,04 0,00 0,00 0,00
Карсилмакс 1.57±129 2,68 ±0,49 1,90±0,18 6292±39,5 4,78 ±0,47 1,92 ±0,16 0,41 ±0,02
р" 0,00 0,07 0,96 0,74 020 0,16 0,44
Негат. к-ль 0,79 ± 0,12 1,18±0,14 1,73 ±0,05 422,5 ±34,8 0,15 ±0,01 0,19 ±0,01 128 ±0,03
Март 2010 Позит. к-ль 20,82 + 3,4 26,07 ±2,87 2,51 ±0,09 668,4±47,0 8,36 ±0,37 2,80 ±0,37 0,33 ±0,03
Р* 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Карсилмакс 17,36 ±0,17 22,90 ±120 2,16±0,12 707,1 ±37,7 6,18 ±0,72 226 ±0,17 0,38 ±0,03
Р" 0,79 0,38 0,16 0,64 0,01 0,19 0,38
Негат. к-пь 0,61 ±0,11 0,75 ±0,16 1,54 ±0,04 417>6±71,5 0,1510,01 0,18 ±0,01 126±0,06
Апрель 2010 Позит. к-ль 7,41 ±0,23 9,53 ±2,44 2,07±0,12 476,7± 18,5 5,38 ±0,65 2,38 ±023 0,50 ±0,08
Р* 0,00 0,03 0,03 0,69 0,00 0,00 0,00
Карсилмакс 3,41 ±0,16 5,82 ± 1,47 1,63 ±0,18 497,0 ±56,0 ЗДЗ±0,51 1,59 ±022 0,43 ±0,04
п** П1К ПГй 0.13 0.80 0Д5 0,13 0,62
учали экстракцией в аппарате Сокслета 70% раствором этилового спирта течение 2,5 - 3,5 часов. Полноту экстрагирования определяли кгрофотометрически по остаточному содержанию суммы флавоноидов иоате (ГФ X). Спирт из полученного экстракта удаляли под вакуумом, в [ной суспензии определяли сумму экстрактивных веществ, что юльзовали при расчете дозировок.
Первый этап эксперимента: изучение воздействия ТХМ на животных и можность модификации токсических эффектов "Карсилом" (в тендерном екте).
Второй этап: изучение гепатопротекторной активности извлечений из тигельного сырья на основании результатов исследований первого этапа. Согласно результатам, полученным в экспериментах на первом этапе (табл. самки явились более адекватным объектом исследования: снижение :сического проявления тетрахлорметана "Карсилом" носило озависимый эффект.
Основным недостатком при работе с самками в области гепатологии яется зависимость токсического эффекта от фазы эстрального цикла. В юте Якобсон С.Г. с соавт., (1978) показано, что максимальный атотоксический эффект у животных наблюдался при введении ТХМ в ¡е позднего диэструса (при последующем забое на стадии раннего эструса). мое обстоятельство учитывалось в методике проводимого эксперимента: дение ТХМ в течение четырех дней (с забоем на пятый) с высокой долей юятности проходило через все фазы эстрального цикла (все группы вотных были рандомизированными), длительность которого составляет в >ме 4-5 дней, что нивелировало пик токсичности. Подтверждением этой ютезы могут служить данные табл. 4: стандартная ошибка среднего по м анализируемым параметрам не превысила соответствующие величины амцов. С другой стороны, короткопериодичные эстральные циклы могут шостью сглаживать колебания токсичности, связанные с действием шнопериодических циклов, что является позитивной стороной работы с 1ками. Данное обстоятельство послужило основанием к проведению ледований гепатозащитного действия новых, неизученных видов флоры игрального Кавказа на самках (табл. 5).
Из таблицы видно, что введение экстрактов сопровождалось «зависимым снижением токсических эффектов, обусловленных ТХМ. Это жет быть связано с химическим составом тестируемых растений, [ержащих в своем составе множество флавоноидов (судя по батохромному юту в электронных спектрах поглощения) - рис. 3. Расчеты показали, что (ержание флавоноидов наибольшее в манжетке - 2,51% (в пересчете на ;ин), в васильке Ф. - 2,13, а в клевере золотистом -0,31%. Наибольшую активность также проявили экстракты на основе манжетки лковой. В максимальной концентрации коэффициент защиты составил 51 % I показателям АлТ).
Таблица 4
Изучение модифицирующего действия Карсила в модели СС14-индуцированного токсического гепатита в
тендерном аспекте
№ Параметр Стат. показатель Билирубин прямой, мкмалУл Билирубин обший, мкмапь/л Хал., ммаль/л ЩФ, U/л АлТ, мккат/л АсТ, мккат/л Кде Pimica
Самиы
1 Контроль негатив. Mim 0,90 ±0,19 1,88 ±0,34 1,43 ±0,07 248,8 ±22,7 0,29 ±0,07 0,38 ±0,08 1,31 ±0,11
2 Контроль Mfcm 3,09 ±0,32 4,17 ±0,24 1,06 + 0,11 708,4 ±54,2 6,24 ±0,85 2,06 ±0,29 0,34 ±0,02
позитив. Р* 0,00 0,01 0,02 0 0 0 0,03
3 Карсил Mtm 2,56 ±0,25 4,13 ±0,42 1,61 ±0,12 955,1 ±84,2 6,74 ±0,90 2,49 ±0,36 0,37 ±0,01
(ЗОмг/кг) р** н/д н/д 0,00 0,01 Ufa н/д Н/Д
4 Карсил Mtni 2,1 ±0,67 3,82 ±0,32 1,45 ±0,09 1214±83,1 8,12 ±0,93 3,84 ±0,29 0,47 ±0,02
(150мг/кг) n** н/д н/д 0,00 0,00 н/д н/д н'д
Самки
Контроль негапю. Miin 0,85±0,15 l,94iß,34 1,42*0,07 354,8*31,5 0,26±0,01 0,30±0,02 1,15 ±0,02
6 Контроль Mfcm 2,69*0,38 4,41 ±0,40 1,39Я),21 1014,0198,37 3,07±0,34 1,99Ю,21 0,65 ±0,04
позигов. P* 0,05 0,05 н>д 0 0 0 0
1 Карсил Mtm 1,9&±0,23 2,95±0,3 1,05±0,20 865,2152,06 1,32±1,11 1,60±0,09 1,22 ±0,03
(ЗОмг/кг) p** н'д 0,03 н^д н'д 0,01 н/д 0,01
8 Карсил Mfcm 1,68*0,80 2,84±0,28 1,11±0,12 715,6±99,8 1Д5ЮД2 0,87±0,07 0,70 ±0,03
(150мг/кг) p** 0.03 тУд н'д 0,04 0,05 0,03 н/д
* - относительно негативного контроля
** - относительно позитивного контроля
Гепатозащитное действие ряда экстрактов, полученных из растений Центрального Кавказа
№ Параметр Стат. показатель Билирубин прямой, мкмоль/л Билирубин общий, мкмоль/л % конъюгир. Хол., ммоль/л ЩФ, Ед/л АлТ, мккат/л АсТ, мккат/л Кде Ритиса
1 Контроль негатив. М±т 0,85±0,15 1,94±0,34 45 1,42±0,07 354,8±31,5 0,26±0,01 0,30±0,02 1,15
2 Контроль позитив. М±т Р* 2,69±0,38 0,05 4,4 Ш,40 0,05 61 1,39±0,21 н/д Ю14,0±98,37 0 3,07±0,34 0 1,99±0,21 0 0,65
3 Клевер золот. (60 мг/кг) М±т р** 2,25±0,34 н/д 2,95±0,57 н/д 76 1,03±0,04 н/д 601,5±68,5 0,01 3,33±0,04 н/д 1,85±0,25 н/д 0,56
4 Клевер золот. (300 мг/кг) М±т р** 1,46±0,26 0,01 2,79±0,47 0,02 52 0,85±0,08 0,05 503,6±39,26 0,001 1,93±0,30 0,02 1,38±0,23 0,07 0,72
5 Василек Фишера (60 мг/кг) Mtm р** 1,90±0,16 н/д 3,30±0,22 0,05 58 0,83±0,09 н/д 798.5±65,5 н/д 1,94±0,30 0,07 1,07±0,16 0,01 0,55
6 Василек Фишера (300 мг/кг) М±т р** 1,38±0,37 0,05 3,70±0,84 н/д 37 0,93±0,10 н/д 608,0±41.0 0,05 2,18±0,37 н/д 2,17±0,32 н/д 1,00
7 Манжетка шелков. (60 мг/кг) М±т р** 1,7!±0,14 0,03 3,28±0,30 0,03 52 0,84±0,07 0,04 625,2±64.2 0,02 2,71±0,44 н/д 1,57±0,22 н/д 0,58
8 Манжетка шелков. (300 мг/кг) М±т р** 1,16±0,25 0,01 2,6±0,19 0,001 45 0,74±0,03 0,02 577,4±38,70 0,01 1,49±0,29 0,02 1,12±0,03 0,03 0,75
* - относительно негативного контроля (фон)
** - относительно позитивного контроля (модельный токсический гепатит)
% конъюгированного билирубина и коэффициент де Ритиса рассчитаны по средним значениям соответствующих величин
Таким образом, испытания на животных показали высокую биологическую активность экстрактов на основе растительного сырья, что доказывает перспективность даль нейшего углуб ленного изучения состава, свойств, также практическог использования раста тельных ресурсо Центрального КаЕ каза.
264.73 300.00 3501)0 400.00 450.00 467.31
щи.
Рис. 3. Электронные спектры поглощения извлечений из манжетки шелковой, клевера золотистого и василька Фишера, снятые в дифференциальном режиме
ВЫВОДЫ
В диссертации на базе теоретических и экспериментальных работ использованием биохимического, гематологического, цитогенетическоп гистологического анализов, экотоксикологических исследований, построенны на принципах хронобиологии, физико-химических методов анализа растительног сырья, предложены перспективные решения актуальной проблемы защит ресурсов биосферы. Основные научные выводы и практические результат работы заключаются в следующем:
1. В модели СС14-индуцированного токсического гепатита у крыс показан! что гепатотропность химических соединений в течение года может peз^ варьировать: в пределах одного порядка, что закладывает новые теоретик* методологические принципы оценки экологического риска с позици хронобиологии.
2. Установлено, что наибольшая гепатотоксичность тетрахлорметан выявляемая биохимически, проявляется в весенне-летний период года (мар август) с острым максимумом, приходящимся на июнь.
3. Показано, что применение ряда фармакологических препарате (циклофосфан, метотрексат и 5-фторурацил) ведет к формировани патологических состояний, схожих по картине с действием широкого класс э кото кс и кантов, что явилось удобной моделью изучения цитогенетически биохимических и гематологических изменений в организме экспериментальнь животных во взаимосвязи.
4. Изучены особенности роли сезонных биоритмов в проявлен!' гематотоксичности модельных препаратов (циклофосфан, метотрексат, фторурацил). Депрессивный эффект проявился сезонными флуктуация\ качественных и количественных характеристик в системах лейкона и эритро-
5. Жесткий биоритмологический каркас в виде астральных циклов эосновывает необходимость использования рандомизированных групп самок рыс линии Wistar при изучении (поиске) новых гепатопротекторов в моделях жсического гепатита, предполагающих введение токсина в течение не менее -5 дней.
6. Выявлено высокое содержание биологически активных веществ -лавоноидов в манжетке шелковой (Alchemilla sericata R.), васильке Фишера Centaurea fischeri S.), клевере золотистом {Trifolium aureum Р.) - 2,51; 2,13, и ,31% соответственно, что доказывает целесообразность широкого изучения эстава и свойств флоры Центрального Кавказа.
7. Показано, что среди изученных видов растений наибольшей гпатопротекторной активностью (сопоставимой с оффицинальным видом -асторопшей пятнистой {Silybum marianum L.)) обладает манжетка шелковая.
8. Экспериментально доказана возможность изменения (вплоть до бращения) гепатопротекторного действия экстракта плодов расторопши ятнистой в модели токсического гепатита, вызванного введением етрахлорметана, в различное время года.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
1. Мелешин М.И., Лавриненко Ю.В., Скупневский С.В. Изучение епатопротекторных свойств экстрактов на основе клевера лугового (Trifolium retense L.)//Тез. докл. II Всерос. научн. конф. "Актуальные проблемы экологии сохранения биоразнообразия". Владикавказ, 2008. С. 153-157.
2. Скупневский С.В., Мелешин М.И., Чопикашвили Л .В. Мутагенный эффект ; изменения в системе ПОЛ-АОЗ под действием комплекса цитостатиков циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил) // Вестник Международной академии [аук экологии и безопасности жизнедеятельности. С.-Пб. 2008. Т. 14. №3.
48-50.
3. Скупневский С.В. МелешинМ.И., Джиоев И.Г. Комплексное исследование юследствий полихимиотерапии по схеме CMF (циклофосфан, метотрексат, 5-)торурацил) // Вестник Международной академии наук экологии и безопасности шзнедеятельности. С.-Пб. 2008. Т. 14. №3. С. 50-53.
4. Скупневский С.В., Мелешин М.И., Гаев В.В., Николенко И.П., Николаев 1.А. Сравнительный анализ гепатопротекторной и антитоксической активности увлечений из растительного сырья в модели ССк-индуцированного оксического гепатитау крыс//Тез. докл. III Всерос. научн. конф. "Актуальные фоблемы экологии и сохранения биоразнообразия". Владикавказ, 2009.
57-61.
5. Мелешин М.И., Скупневский С.В, Чопикашвили Л.В. Сезонные колебания епатотоксичности тетрахлорметана у крыс в эксперименте // Тез. докл. X у!еждунар. конгресса "Здоровье и образование в XXI веке", Москва, 2009. 11189-1190.
6. Скупневский С.В., Мелешин М.И. Методические аспекты в изучении гепатозащитной активности новых фармакологических средств в модели СС U-токсического гепатита //Тез. докл. Всерос. научно-практич. конф. "Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики", Владикавказ, 2009. С. 291-293.
Подписано в печать 18.11.2010. Усл.п.-л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 169. Издательство Северо-Осетинского государственного университета имени К.Л. Хетагурова, 362025, г. Владикавказ, ул. Ватутина, 46.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мелешин, Марат Игоревич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. БИОРИТМЫ КАК ОСНОВА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ (состояние вопроса).
1.1. Адаптивное значение биологических ритмов.
1.2. Научно-методические проблемы оценки риска биоресурсам (млекопитающим) с позиций биоритмологии.
1.3. Теоретико-методологические проблемы изучения растительных ресурсов с целью поиска новых фитоадаптогенов.
Выводы.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Планирование эксперимента с позиций временной организации биосистем.
2.2. Приготовление экстрактов.
2.3. Экспериментальная модель токсического гепатита.
2.4. Оптимизированные методики определения биохимических показателей печени на фоне острых патологий.
2.4.1. Алании- и аспартаттрансаминазы.
2.4.2. Холестерин.
2.4.3 Прямой и общий билирубин.
2.5. Стандартные методики биохимического контроля.
2.5.1. Методика анализа активности щелочной фосфатазы.
2.5.2. Определение концентрации общего гемоглобина в крови.
2.5.3. Определение гидроперекисей по Гаврилову.
2.5.4. Определение малонового диальдегида в эритроцитах.
2.5.5. Методика анализа активности супероксиддисмутазы.
2.5.6. Методика анализа активности каталазы.
2.5.7. Методика анализа активности церулоплазмина.
2.5.8. Определение метгемоглобина.
2.6. Гистологические исследования.
Глава 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ РИТМЫ - ОСНОВА МЕТОДОЛОГИИ ОЦЕНКИ РИСКА БИОРЕСУРСАМ ОТ АНТРОПОГЕННЫХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.
3.1.1 Годовая динамика гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в эксперименте: биохимический аспект.
3.1.2 Годовая динамика гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в эксперименте: гистологический аспект.
3.2. Модель оксидативного стресса у животных (циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил — СМР): комплексные исследования биологического действия.
3.3. Сезонные колебания гематотоксичности соединений СМБ.
Выводы.
Глава 4. ХРОНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД В МЕТОДИКАХ ИСПЫТАНИЙ НОВЫХ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.
4.1. Изменения гепатозащитных свойств экстракта плодов расторопши пятнистой («Карсила») в течение года.
4.2. Опыт изучения новых гепатопротекторов, выделенных из флоры
Центрального Кавказа.
Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль биологических ритмов в реализации токсических эффектов химических веществ у млекопитающих в эксперименте"
Актуальность исследования. В условиях масштабного антропогенного загрязнения окружающей среды проблема сохранения биологических ресурсов приобретает первостепенную значимость. В настоящее время активно пересматривается государственная природоохранная политика: в ее основу закладывается концепция экологического риска. Базис новой методологии оценки экотоксикантов должны составить принципы, учитывающие биоритмологический профиль живых существ, поскольку процессы, протекающие в организме, в разные временные периоды могут быть как на подъеме, так и на спаде. Это обстоятельство определяет чувствительность (резистентность) биосистем к стрессору в зависимости от суммарной составляющей ритмических процессов, протекающих на всех уровнях организации живой материи.
С другой стороны, при решении теоретических и прикладных проблем поиска, изучения и рационального использования новых растительных и животных ресурсов также необходимо учитывать биоритмологические феномены. Использование существующих стандартных технологий и методик не всегда позволяет корректно оценить свойства изучаемого объекта. Применение животных (в частности, лабораторных) при изучении биологической активности тестируемых соединений, выделенных из растительных или животных источников, без учета воздействия циркадианных, сезонных, годовых и др. биоритмов может дать весьма искаженные результаты.
Актуальность настоящей работы определяется недостаточной изученностью воздействия сезонных биоритмов на изменения токсичности химических веществ у млекопитающих, необходимостью научного обоснования практических рекомендаций и решений, направленных на снижение экологического риска.
Цель работы заключается в изучении влияния сезонных биоритмов на функциональную активность печени и кроветворной системы у крыс и как следствие — обусловленные ими изменения токсичности ряда химических веществ.
Идея работы состоит в разработке научных основ оценки и прогнозирования биотоксичности химических веществ (загрязнителей окружающей среды) у млекопитающих с учетом хронобиологического подхода, расширении географии использования новых растительных ресурсов флоры Центрального Кавказа.
Задачи исследования:
1. Изучить годовую динамику гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в эксперименте.
2. Создать модель оксидативного стресса у животных, адекватно воспроизводящую механизм действия химических экотоксикантов.
3. Выявить вариабельность гемотоксичности химических веществ (циклофосфамид, натриевая соль 4-дезокси-4-амино-М-10-метилфолиевой кислоты (метотрексат), 5-фторурацил) у крыс в условиях смены сезонов.
4. Изучить гепатозащитное действие экстракта плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum L., «Карсила») в различное время года.
5. С учетом биоритмологического профиля лабораторных животных (крыс линии Wis tar) изучить гепатопротекторные свойства некоторых представителей флоры Центрального Кавказа.
На защиту выносятся:
- результаты изучения изменений гепатотоксичности тетрахлорметана у крыс в течение года с периодами в 2-3 недели; созданная на основе ряда фармакологических препаратов (циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил) модель, отражающая комплексное воздействие химических веществ на организм млекопитающих в аспекте цитогенетических, биохимических и гематологических изменений;
- данные об изменении гемотоксичности ряда химических веществ (CMF) в различные сезоны года; результаты изменения (обращения) гепатозащитных свойств экстракта плодов расторопши пятнистой («Карсила») в модели экспериментального токсического гепатита в различное время года;
- результаты испытаний новых (нефармакопейных) видов флоры Центрального Кавказа (манжетка шелковая (Alchemilla sericata R.), василек Фишера {Centaurea fischeri S.), клевер золотистый (Trifolium aureum Р.), обладающих гепатозащитными свойствами.
Методы исследования включают цитогенетический и биохимический анализ (автоматический биохимический анализатор ChemWell, США), гистологические исследования, гематологические исследования (автоматический гематологический анализатор Erma, Япония), спектрофотометрию (PC UV-спектрофотометр Shimadzu, Япония), математический анализ (программный пакет Excel).
Объектами исследования служили половозрелые крысы линии Wistar (410 самцов и 100 самок), растения, собранные в условиях высокогорья РСО-А: манжетка шелковая, василек Фишера, клевер золотистый.
Научная новизна: изучена вариабельность гепатотоксического действия тетрахлорметана у крыс в течение года, оцениваемая биохимически (в плазме: аланин- и аспартаттрансаминазы, прямой и общий билирубин, холестерин, щелочная фосфатаза) и морфологически (окраска азур-эозином);
- с помощью ряда доступных веществ (циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил) создана модель, адекватно имитирующая изменения в организме млекопитающих, обусловленные химическими загрязнителями окружающей среды; при этом у крыс в комплексе изучены следующие параметры: система «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» (ПОЛ-АОЗ), цитогенетические эффекты, функциональное состояние печени, гематологические показатели;
- выявлены различия в цитостатических эффектах препаратов CMF, оцениваемых количественными и качественными изменениями в популяциях клеток крови, в условиях смены сезонов года;
- показана возможность обращения гепатозащитного действия экстракта плодов расторопши пятнистой («Карсила») в модели СС14-индуциторванного гепатита в различное время года; экспериментально доказана перспективность использования экстрактов на основе манжетки шелковой {А1скетШа яег1сШа И.), выделенной из флоры Центрального Кавказа, в качестве гепатозащитного средства.
Научное значение работы состоит в создании теоретико-методологической базы для оценки риска биологическим ресурсам (млекопитающим) от химических загрязнителей окружающей среды с позиций хронобиологии. Экспериментально доказано, что в течение года токсичность одного и того же вещества, взятого в одной и той же концентрации, может значительно варьировать - в пределах одного порядка. Выявленная закономерность носит общий характер: изменения в функциональной активности печени животных могут приводить к резкому ослаблению (обращению) гепатозащитных свойств БАВ, выделенных из растительных источников. Данное обстоятельство должно явиться базисом современных методов изучения новых растительных ресурсов.
Практическая значимость:
1. Полученные в ходе экспериментальных исследований результаты о значительной вариабельности токсичности химических агентов под воздействием сезонных биоритмов лягут в основу концепции оценки и прогнозирования негативного воздействия на организм млекопитающих антропогенных загрязнителей и продуктов их химических трансформаций.
2. Внедрение в практику Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (СОГМА, г. Владикавказ) разработанных методик оценки функционального состояния печени (АлТ, АсТ, прямой и общий билирубин) в условиях ССЦ- индуцированного токсического гепатита позволило реализовать скрининговые исследования по поиску новых гепатопротекторов, выделенных из флоры Центрального Кавказа.
3. Выявленные закономерности об изменении гемато- и гепатотропности веществ в течение года у лабораторных животных (крыс) найдут отражение в методических рекомендациях по изучению и поиску новых БАВ, выделенных из растительных источников.
4. Сравнительный анализ гепатопротекторной активности извлечений из манжетки шелковой, василька Фишера и клевера золотистого в модели СС14-индуцированного токсического гепатита у крыс показал высокую биологическую активность манжетки шелковой (А1скетШа яепсШа Я.), что является научно обоснованной рекомендацией для дальнейших исследований этого вида с целью создания нового гепатозащитного средства.
Обоснованность и достоверность научных положений, выводов и рекомендаций подтверждается высокой сходимостью экспериментальных данных, полученных различными (независимыми) методами анализа; результатами лабораторных исследований и испытаний, обработанными с применением методов математической статистики и теории ошибок.
Апробация работы. Основные положения и результаты докладывались на II, III Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы экологии и сохранения биоразнообразия», Владикавказ 2008, 2009 г.; X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2009 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики», Владикавказ, 2009 г.
Внедрение результатов исследования. В практику Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО СОГМА внедрены оптимизированные методики определения аланин- и аспартаттрансаминаз, прямого и общего билирубина в плазме животных с модельным токсическим гепатитом.
Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ, отражающих основные результаты. В их числе 2 в журнале, рекомендованном ВАК, одна в материалах международной конференции, остальные - во всероссийских.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 128 источников, в том числе 69 на иностранных языках, и приложения. Основное содержание изложено на 120 страницах машинописного текста, иллюстрированного 10 таблицами и 16 рисунками.
Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Мелешин, Марат Игоревич
ВЫВОДЫ ОБЩИЕ
В диссертации на базе теоретических и экспериментальных работ с использованием биохимического, гематологического, цитогенетического, гистологического анализов, экотоксикологических исследований, построенных на принципах хронобиологии, физико-химических методов анализа растительного сырья, предложены перспективные решения актуальной проблемы защиты ресурсов биосферы. Основные научные выводы и практические результаты работы заключаются в следующем.
1. В модели СС14-индуцированного токсического гепатита у крыс показано, что гепатотропность химических соединений в течение года может резко варьировать: в пределах одного порядка, что закладывает теоретико-методологические принципы оценки экологического риска с позиций хронобиологии.
2. Установлено, что наибольшая гепатотоксичность тетрахлорметана, выявляемая биохимически, проявляется в весенне-летний период года (март-август) с острым максимумом, приходящимся на июнь.
3. Показано, что применение ряда фармакологических препаратов: циклофосфана, метотрексата и 5-фторурацила ведет к формированию патологических состояний, схожих по картине с действием широкого класса экотоксикантов, что явилось удобной моделью изучения цитогенетических, биохимических и гематологических изменений в организме экспериментальных животных во взаимосвязи.
4. Изучены особенности воздействия сезонных биоритмов на проявления гематотоксичности модельных препаратов (циклофосфан, метотрексат, 5-фторурацил). Депрессивный эффект проявился сезонными флуктуациями качественных и количественных характеристик в системах лейкона и эритрона.
5. Жесткий биоритмологический каркас в виде эстральных циклов делает обоснованным использование рандомизированных групп самок крыс линии Wistar при изучении (поиске) новых гепатопротекторов в моделях токсического гепатита, предполагающих введение токсина в течение не менее 4-5 дней.
5. Высокое содержание биологически активных веществ - флавоноидов в манжетке шелковой (Alchemilla sericata R.), васильке Фишера (Centaurea fischeri S.), клевере золотистом (Trifolium aureum Р.) - 2,51; 2,13, и 0,31% (соответственно) доказывает целесообразность широкого изучения состава и свойств флоры Центрального Кавказа.
7. Показано, что среди изученных видов наибольшей гепатопротекторной активностью (сопоставимой с оффицинальным видом -расторопшей пятнистой (Silybum marianum L.)) обладает манжетка шелковая.
8. Экспериментально доказана возможность изменения (вплоть до обращения) гепатопротекторнного действия экстракта плодов расторопши пятнистой в модели токсического гепатита, вызванного введением тетрахлорметана, в различное время года.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проблема охраны ресурсов биосферы может быть решена лишь с использованием интегрального подхода, объединяющего различные научные дисциплины, включая, прежде всего, экологию, генетику, биохимию, токсикологию и новое научное направление - хронобиологию. Необходимость использования комплексного подхода в решении отдельных задач охраны биоресурсов диктуется с одной стороны непрерывным ростом (как в качественном, так и в количественном аспекте) различных химических поллютантов, между которыми возможны синергетические эффекты, а с другой - сложной организацией самих биообъектов, в том числе, используемых в качестве модельных для изучения и прогнозирования негативных эффектов ксенобиотиков. Таким малоизученным аспектом, в частности, является временная организация биосистем, пронизывающая все уровни живой материи: от субклеточного (молекулярного) до популяционного и биосферного.
В работе отражены три направления, имеющих существенное научно-практическое значение в решении проблем охраны и изучения свойств биоресурсов.
Первое направление посвящено изучению роли сезонных биологических ритмов в реализации токсического эффекта модельного гепатотоксина - тетрахлорметана. Экспериментально доказано, что токсический эффект (при неизменной дозировке) является функцией от времени. В весенне-летний период гепатотоксичность тетрахлорметана резко возрастает. Пик максимальных повреждающих эффектов, оцениваемых биохимически и морфологически, приходится на июнь. Это обстоятельство определяет необходимость введения в методологию токсикологических исследований, являющихся основой для разработки нормативных природоохранных актов, новых хронобиологических принципов. Тетрахлорметан, используемый в качестве модели, имитирующей воздействие на живые организмы полихлорированных углеводородов, представляющих серьезную экологическую опасность, широко используется также в работах по изучению (поиску) новых гепатопротекторов, преимущественно на растительной основе. В этом ключе знания об особенностях механизмов гепатотропности тетрахлорметана являются важным условием корректной оценки свойств растительных объектов.
Второе направление в работе посвящено комплексной оценке на организм ряда доступных фармакологических препаратов СМР (циклофосфамид, натриевая соль 4-дезокси-4-амино-1чГ-10-метилфолиевой кислоты (метотрексат), 5-фторурацил), обладающих депрессивным эффектом в отношении системы гемопоэза, что явилось удобной моделью для оценки гематотропных ксенобиотиков. В исследованиях показано, что гематотоксический эффект регистрируется на фоне широкого спектра патологических изменений, затрагивающих различные системы организма. Прежде всего, это дисбаланс в ферментных системах, в частности, антиоксидантной защиты, что приводит к активации перекисно-направленных процессов. Наряду с этим фиксируются мутационные события в клетках организма. Высокая степень отмеченных кластогенных эффектов от препаратов может объясняться вкладом свободнорадикального мутагенеза. Отмеченные негативные изменения затрагивают также и функциональную активность важнейшего детоксикационного органа -печени.
Предложенная модель (циклофосфамид, натриевая соль 4-дезокси-4-амино-Ы-Ю-метилфолиевой кислоты (метотрексат), 5-фторурацил) использована для изучения роли биологических ритмов в реализации гематотоксических эффектов химических веществ. Доказана универсальность сезонных биоритмов: токсические эффекты в значительной степени оказываются подверженными модифицирующему действию длиннопериодичных ритмов, что должно войти в практические рекомендации по оценке гематотропных загрязнителей окружающей среды.
Третье направление — изучение состава и свойств растительных ресурсов Республики Северная Осетия - Алания. Теоретическим базисом к поиску биологически активных веществ флоры Центрального Кавказа явилось то обстоятельство, что изучаемые виды (манжетка шелковая (Alchemilla sericata R.), василек Фишера (Centaurea fischeri S.), клевер золотистый (Trifolium aureum Р.)) содержат в своем составе большое количество флавоноидов. Указанные вещества обладают не только выраженными антиоксидантными, антимутагенными свойствами, но также являются весьма эффективными гепатозащитными средствами, что широко используется в современной медицине. Применение хронобиологического подхода позволило не только рекомендовать к широкому использованию в практике по экспериментальному изучению (поиску) новых гепатопротекторных средств самок лабораторных крыс с обоснованием методических особенностей эксперимента, но и помогло корректно выявить наиболее перспективный вид — манжетку шелковую, внедрение которой в практику явится существенным вкладом в расширение географии растительных биоресурсов Северной Осетии.
Таким образом, использование комплексного междисциплинарного подхода позволило обосновать ряд прогрессивных теоретико-методологических рекомендаций и решений, направленных на сохранение качества биоресурсов и изучение их состава и свойств. К числу важнейших выводов следует отнести факт о существенном модифицирующем действии сезонных биоритмов в реализации токсических эффектов химических веществ, представляющих наибольший риск устойчивому развитию биосферы. Данное направление подлежит дальнейшему углубленному изучению и анализу.
107
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мелешин, Марат Игоревич, Владикавказ
1. Кремянский, В.И. Структурные уровни живой материи: теоретические и методологические проблемы / В.И. Кремянский. -М. : Наука, 1969. -295 с.
2. Хетагурова, Л.Г. Хронопатофизиология доклинических нарушений здоровья / Л.Г. Хетагурова, К.Д. Салбиев. Владикавказ : Проект-пресс, 2000. - 176 с.
3. Халберг, Ф. Временная координация физиологических функций / Ф. Халберг // Биологические часы. М. : Мир, 1964. - С. 475-509.
4. Алякринский, Б.С. Адаптация в аспекте биоритмологии / Б.С. Алякринский // Проблемы временной организации живых систем. М. : Наука, 1979. - С. 9-36.
5. Алякринский, Б.С. По закону ритма / Б.С. Алякринский, С.И. Степанова. -М. : Наука, 1985. 176 с.
6. Шульман, Г.Е. Физиолого-биохимические особенности годовых циклов рыб / Г.Е. Шульман. -М. : Пищевая промышленность, 1972. -369 с.
7. Ашофф, Ю. Биологические ритмы. В 2 т. Т. 1. / Ю. Ашофф. М. : Мир, 1984.-414 с.
8. Арушанян, Э.Б. Хронофармакология / Э.Б. Арушанян. Ставрополь : СГМА, 2000. - 422 с.
9. Агаджанян, H.A. Хронофизиология, хронофармакология и хрономедицина / H.A. Агаджанян, В.И. Петров, И.В. Радыш. М.Волгоград : МосГМУ, 2005. - 336 с.
10. Романов, Ю.А. Проблемы хронобиологии / Ю.А. Романов. М. : Знание, 1989.-64 с.
11. Комаров, Ф.И. Хронобиология и хрономедицина / Ф.И. Комаров. М. : Медицина, 1989. - 400 с.
12. Хильдебранд, Г. Хронобиология и хрономедицина / Г. Хильдебранд, М. Мозер, М. Лехофер. М. : Арнебия, 2006. - 144 с.
13. Комаров, Ф.И. Хронобиология и хрономедицина / Ф.И. Комаров. М. : Медицина, 1989.-400 с.
14. Бродский, В.Я. Ритм синтеза белка и возможность его модификации в клетках / В.Я. Бродский // Тез. всесоюзн. симп. «Биологические ритмы в механизмах компенсации нарушенных функций». М., 1973. - С. 47-49.
15. Klaassen, Curtis D. Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons (7th Edition) / Curtis D, Klaassen. - New York : McGraw-Hill Companies, 2008. - 1309 p.
16. Risk Management Handbook / Edit, by R. Carroll. San Francisco : Jossey-Bass, 2000. - 940 p.
17. Risk Management Handbook for Health Care Organization / Edit, by R.L. Carroll. San Francisco : Jossey-Bass, 2009. - 642 p.
18. Frank, C. Lu. Lu's Basic Toxicogy: Fundamentals, target organs and risk assessment / C. Lu Frank, K. Sam. London, New-York: Informa Healthcare, 2002. 394 p.
19. Корбакова А.И. Методы исследования функций нервной системы / А.И. Корбакова, И.П. Уланова // Методы определения токсичности и опасности химических веществ: сб. ст. М. : Медицина, 1970. - С. 142-166.
20. Evans, G.O. Animal Clinical Chemistry. A Primer for Toxicologist / G.O. Evans. New York : Taylor & Francis Group, 2005. - 224 p.
21. Evans, G.O. Animal Hematotoxicology. A Practical Guide for toxicologists And Biomedical Researchers / G. O. Evans. New York : Taylor & Francis Group, 2005. - 206 p.
22. Shayne, C.G. Animal Models in Toxicology / C. G. Shayne. New York : Taylor & Francis Group, 2007. - 934 p.
23. Ming-Ho, Yu. Environmental Toxicology. Biological and Health Effects of Pollutants / Yu. Ming-Ho. New York : CRC Press, 2005. - 339 p.
24. Елизарова, O.H. Пособие по токсикологии для лаборантов / O.H. Елизарова, JI.B. Жидкова, Т.А. Кочеткова. — М. : Медицина, 1974. -169 с.
25. In Silico Technologies in Drug Target Identification and Validation / Edit, by Andrew Carmen. Taylor and Francis Group, LLC, 2006. - 482 p.
26. In Silico: 3D Animation and Simulation of Cell Biology with Maya and MEL / Edit, by J. Sharpe et all. Morgan Kaufman Publishers. 2008. - 625 P
27. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery / Edit, by Mouldy Sioud. V. 1. Humana Press Inc., 2007. 346 p.
28. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Emerging Molecular Targets and Treatment Options / Edit, by Mouldy Sioud. V. 2. Humana Press Inc., 2007.
29. Tumor Models in Cancer Research (Cancer Drug Discovery and Development) / Edit, by Beverly A. Teicher. Humana Press, 2001. - 7081. P
30. Langdon, S.P. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine) / S.P. Langdon. Totowa : Humana Press, 2004. -368 p.
31. Camacho, J.P.M. В Chromosomes In The Eukaryote Genome (Cytogenetic & Genome Research) / J.P.M. Camacho. Switzerland : S. Karger AG, 2004. - 269 p.
32. Obe, G. Chromosome Aberrations / G. Obe, A. T. Natarajan. Switzerland : S. Karger AG, 2004. - 394 p.
33. High Content Screening / Edit, by D. Lansing Taylor et all. Humana Press Inc., 2007. 444 p.
34. Quantitative Structure Activity Relationships of Analgesics, Narcotic Antagonists, and Hallucinogens / Edit, by Gene Barnett et al.. NIDA Research Monograph. - 1978. - № 22. - 487 p.
35. Burns, E. R. Biological Time and In Vivo Research: A Field Guide to Piffals / E. R. Burns // The Anatomical Record (New Anat.). 2000. - V. 261.-P. 141-152.
36. Gareth, T. Medical Chemistry / T. Gareth. Chichester : Wiley&Sons, 2007. - 622 p.
37. Камышников, B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: справочник в 2 т. Т. 1 / В. С. Камышников. Минск : Интепрессервис, 2003. - 495 с.
38. Громова, Г.К. О некоторых недостатках унифицированного метода определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови / Г.К. Громова // Экспериментальная патология печени Рига : Зинатне, 1985.-С. 79-83.
39. Гаврилов, В.Б. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / В.Б. Гаврилов, М.И. Мешкорудная // Лаб. дело. 1983. - № 3. - С. 33-36.
40. Сирота, Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т.В.Сирота // Вопросы медицинской химии. -1999.-№31.-С. 3-14.
41. Beutler, Е. Red cell metabolism. A manual of biohemical methods / E. Beutler. Orlando : Grune and Stratton, 1984. - 188 p.
42. Zimmerman, H.J. Hepatotoxicity / HJ. Zimmerman. Philadelphia : Lippincott Williams&Wilkins, 1999. - 789 p.
43. Liver Immunology: principles and practice / Edit, by M. E. Gershwin, J.M. Vierling, M. Manns. Humana Press, 2007. - 488 p.
44. Watkins, P.B. Role of Cytochromes P450 in Drug Metabolism and Hepatotoxicity / P.B. Watkins // Seminars in Liver Disease. 1990. - V. 10. - №4. - P. 235-250.
45. Куценко, С. А. Основы токсикологии / С. А. Куценко. СПб. : ВМедА, 2002. - 569 с.
46. Гичев, Ю.П. Печень: адаптация, экология / Ю.П. Гичев. Новосибирск : Наука, 1993.- 152 с.
47. Колеснеченко, JI.C. Глутатионтрансферазы / JLC. Колеснеченко, В.И. Кулинский // Успехи современной биологии. 2000. - Т. 107. - № 2. -С. 179-194.
48. Deleve, L.D. Importance and Regulation of Hepatic Glutathione / L.D. Deleve, N. Kaplowitz // Seminars in Liver Desease. 1990. - V. 10. - № 4. -P. 251-266.
49. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М. : Медицина, 1972. -252 с.
50. Блюгер, А.Ф. Вирусный гепатит и его исходы / А.Ф. Блюгер. Рига : Зинатне, 1970.-545 с.
51. Шерлок, Ш. Заболевания печени и желчных путей / Ш. Шерлок, Дж. Дули. М. : Гэотар, 1999. - 864 с.
52. Smith, М.Т. The Role of Peroxidation in the Toxicity of Foreign Compounds to Liver Cells / M.T. Smith, H. Thor, S. Orrenius. // Biochemical Pharmacology. 1983. - V. 32. - №5. - P. 763-764.
53. Гепатоцит: функционально-метаболические свойства / П.В. Гулак и др.. М. : Наука, 1985. - 272 с.
54. Williams, А.Т. Carbon Tetrachloride Hepatotoxicity: An Example of Free Radical-Mediated Injury / A.T. Williams et al. // Seminars in Liver Diseases. 1990. - V. 10. - №4. - P. 279-283.
55. Костюк, B.A. Роль ковалентного связывания и перекисного окисления липидов в повреждении печени четыреххлористым углеродом / В.А. Костюк//Биохимия.-1991.-Т. 56.Ю.-С. 1878-1885.
56. Ming-Ho, Yu. Environmental Toxicology. Biological and Health Effects of Pollutants / Yu. Ming-Ho. New York : CRC Press, 2005. - 339 p.
57. Health effects of transport-related air pollution / M. Krzyzanovsky et al. -WHO, 2005.- 192 p.
58. Hodgson, E. A Textbook of Modern Toxicology / E. Hodgson. Hoboken, New Jersey : John Wiley & Sons, 2004. - 559 p.
59. Younes, M. Effect of Iron Overload of Spontaneous and Xenobiotic-induced Lipid Peroxidation in vivo / M. Younes, I. Eberhard, R. Lemoine // Journal of Applied Toxicology. 1989. - V. 9. - №2. - P. 103-108.
60. Блюгер, А.Ф. Моделирование патологических процессов в печени / А.Ф. Блюгер, О. Я. Карташева // Экспериментальная патология печени Рига : Зинатне, 1983. - С. 7-16.
61. Tsukamoto, Н. Experimental Models of Hepatic Fibrosis: A Review / H. Tsukamoto, M. Matsuoka, S.W. French // Seminars in Liver Desease. -1990.-V. 10. —№1. -P. 56-65.
62. Weber, L.W.D. Hepatotoxicity and Mechanism of Action of Haloalkanes: Carbon Tetrachloride as a Toxicological Model / L.W.D. Weber, M. Boll, A. Stampf// Critical Reviews in Toxicology. 2003. - V. 33. - №2. - P. 105-136.
63. Hepatotoxicity from Genomics to in vitro and in vivo Models / Edit, by S.C. Sahu. John Wiley & Sons, 2008. - 684 p.
64. Geerts, A.M. Comparison of three research models of portal hypertension in mice: macroscopic, histological, and portal pressure evaluation / A.M. Geerts et al. // International Journal of Experimental Pathology. 2008. -V. 89.-P. 251-263.
65. Preventive effect of neutropenia on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rats / Y. Ohta et al.. // Journal of Applied Toxicology. -2006.-V. 26.-P. 178-186.
66. Seawright A.A., Steele D.P., Menrath R.E. Seasonal Variations in Hepatic Microsomal Oxidative Metabolism in vitro and Susceptibility to Carbon Tetrachloride in a Flock Sheep // Australian Veterinary Journal. 1972. V. 48.-P. 488-494.
67. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. М. : Медицина, 2005. - 832 с.
68. Reichling, J.J. Clinical Use of Serum Enzymes in Liver Disease / J.J. Reichling, M.M. Kaplan // Digestive Diseases and Sciences. 1988. - V. 33.-№ 12. - P. 1601-1614.
69. Ленинджер, А. Основы биохимии в 2 т. Т. 2. / А. Ленинджер. М. : Мир, 1985.-368 с.
70. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л.А. Даниловой. СПб. : Питер, 2003. - 736 с.
71. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods / Edit, by R.A. McPherson, M.R. Pincus. Philadelphia: W.B. Saunders, 2007. -1472 p.
72. Evans, G.O. Animal Clinical Chemistry. A Primer for Toxicologist / G.O. Evans. New York : Taylor & Francis Group, 2005. - 224 p.
73. Камышников, B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: справочник в 2 т. Т. 1 / В. С. Камышников. Минск : Интепрессервис, 2003. - 495 с.
74. The Laboratory Rat / Edit, by M.A. Suckow et all. Academic Press, 2005. -912 p.
75. Shayne, C.G. Animal Models in Toxicology / C. G. Shayne. New York : Taylor & Francis Group, 2007. - 934 p.
76. The Laboratory Rat / Edit, by P.E. Sharp et all. CRC Press, 1998. - 206 p.
77. Zimmerman, T.J. Quantitative studies on fatty acid metabolism in isolated parenchymal cells from normal and cirrhotic livers in rats / T.J. Zimmerman et al. // Journal of Hepatology. 1992. - V. 15. - P. 10-16.
78. The Liver in Biology and Desease / Edit, by E.E. Bittar. V. 15. - Elsevier, 2004. - 609 p.
79. Caspary, W.F. Therapy von Leben- und Gallekrankheiten / W.F. Caspary, U. Leuschner, L.S. Zeuzem. Berlin : Springer Verlage, 2001. - 533 p.
80. Лопухин, Ю.М. Холестериноз / Ю.М. Лопухин, А.И. Арчаков, Ю.А. Владимиров, Э.М. Коган. -М. : Медицина, 1983. -352 с.
81. Oritz de Montellano, P.R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry / P.R. Oritz de Montellano. New York : Springer, 2005. -689 p.
82. Ioannides, C. Cytochromes P450: Role in the Metabolism and Toxicity of Drugs and other Xenobiotics / C. Ioannides. New York - Moskow : RCS Publishing, 2008. - 523 p.
83. Zbuzek, V.K. Seasonal variations in vasopressin secretion in rats / V.K. Zbuzek, W. Wu // Experientia. 1979. - №35. - P. 1523-1524.
84. Wolf, G.W. Annual Differences in Daily Variations in Hepatic Drug Metabolizing Enzyme Activity and Plasma Hormone Levels in the Rat / G.W. Wolf, R.C. Schnell // Pharmacology. 1979. - V. 19. - P. 116-120.
85. Скакун, Н.П. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе заболеваний печени / Н.П. Скакун // Врачебное дело. 1987. - № 10. -С. 86-91.
86. Скакун, Н.П. Сезонные особенности экскреторной функции печени при тетрациклиновых поражениях и коррекция нарушенийантиоксидантами / Н.П. Скакун, И.Т. Цилюрик, JI.A. Волкова, А.Т. Кудин // Антибиотики. 1983. - Т.28. - № 10. - С. 757-760.
87. Circaannual changes in antioxidants and oxidative stress in the heart and liver in rats / A. Bello-Klein et. al.. // Comparative Biochemistry and Physiology. 2000. - Part C. - №126. - P. 203-208.
88. Surekha, B. Seasonal Variations in Markers of Stress and Oxidative Stress in Rats / B. Surekha et al. // Indian Journal of Clinical Biochemistry. -2008.-V. 23.-№2.-P. 191-194.
89. Колесова, O.E. Перекисное окисление и методы определения продуктов липоперексидации в биологических средах / О.Е. Колесова, А.А. Маркин, Т.Н. Нефедова // Лабораторное дело. 1984. - №4. -540-546.
90. Reactive Oxygen Species in Biological Systems: An Interdisciplinary Approach / Edit, by Daniel L. Gilbert, Carol A. Colton. -New York Moscow : Academic Publishers, 2002. - 709 p.
91. Fridovich, I. Superoxide Anion Radical (02- ), Superoxide Dismutases, and Related Matters /1. Fridovich // The Journal of Biological Chemistry. -1997. V. 272. - № 30. - P. 18515-18517.
92. Plant Stress Tolerance: Methods and Protocols / Edit, by Ramanjulu Sunkarer. Humana Press, 2010.-365 p.
93. Minotti, G. The Role of Iron in Oxygen Radical Mediated Lipid Peroxidation / G. Minotti, S.D. Aust // Chemico-Biological Interactions. -1989.-V. 71.-P. 1-19.
94. Рогожин, B.B. Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов / В.В. Рогожин. СПб. : Гиорд, 2004. - 240 с.
95. Fruhwirth, G.O. Oxidized phospholipids: From molecular properties to disease / G.O. Fruhwirth, A. Loidl, A. Hermetter // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. - V. 1772. - P. 718-736.
96. Арнхольд, Ю. Свойства, функции и секреция миелопероксидазы человека / Ю. Арнхольд // Биохимия. 2004. - Т. 69. - № 1. - С. 8-15.
97. Rio, D.D. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress / D.D. Rio, A J. Stewart, N. Pellegrini // Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 2005. - V. 15.-№4. -P. 316-328.
98. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51. Женева : ВОЗ ООН, 1989. - 212 с.
99. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк и др.. Киев : Вища школа, 1984. -383 с.
100. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы патологии клетки. Курс лекций. / Ю.А. Владимиров. М: МГУ, 2007. - 100 с.
101. Lukyanenko, L.M. Activity of membrane-bound NADH-methemoglobin reductase and physical state of lipids in erythrocyte membranes / L.M KozlovaN.M., Slobozhanina E.I. // Bioelectrochemistry. 2004. - № 62. -P. 191- 193.
102. Бароненко, В. А. Эритроцит-мишень для стресса / В.А. Бароненко // Наука в СССР. 1988. - Т. 30. - № 1. - С. 95-97.
103. Шиффман, Ф. Дж. Патофизиология крови / Ф. Дж. Шиффман. М. : Бином, 2007. - 448 с.
104. Зюсс, Р. Рак: эксперименты и гипотезы / Р. Зюс, В. Кинцель, Дж. Д. Скрибнер. М. : Мир, 1977. - 360 с.
105. Fearon, E.R. A genetic model for colorectal tumorigenesis / E. R. Fearon, B. Vogelstein // Cell. 1990. - V. 61. - № 5. - P. 759-767
106. Lopez-Lazaro, M. A new view of carcinogenesis and an alternative approach to cancer therapy / M. Lopez-Lazaro // Molecular Medicine. -2010.-V. 16.-№3-4.-P. 144-53.
107. Атлас клеток крови и костного мозга / Под ред. Г.И. Козинца. М. : Триада-Х, 1998. - 168 с.
108. Marnett, L.J. Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde / L.J. Marnett // Mutation Research. 1999. - V. 424. - P. 83-95
109. Ревич, Б.А. Окружающая среда и здоровье населения / Б.А. Ревич, C.JI. Авалиани, Г.И. Тихонова. -М. : ЦЭПР, 2003. 149 с.
110. Evans, G.O. Animal hematotoxicology: a practical guide for toxicologist and biomedical researchers. CRC Press/Taylor & Francis, 2008. - 208 p.
111. Стожаров, A.H. Медицинская экология / A.H. Стожаров. Минск : Высшая школа, 2007. - 368 с.
112. Экологический мониторинг: шаг за шагом / Е.В. Веницианов и др.. -М. : РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003. 252 с.
113. Klein, G. Farewell to the Internal Clock / G. Klein. Sprimger Science, 2007.- 118 p.
114. Заславская, P.M. Хронодиагностика и хронотерапия заболеваний сердечно-сосудистой системы / P.M. Заславская М. : Медицина, 1991.-320 с.
115. Комаров, Ф. И. Хронобиология и хрономедицина / Ф.И. Комаров, А. П. Раппопорт. М. : Триада-Х, 2000. - 488 с.
116. Заславская, P.M. Легочные синдромы и проблемы терапии / P.M. Заславская, Г.В. Векленко, С.А. Сейимагомбетова. М. : Медпрактика, 2007.-207 с.
117. Арушанян, Э.Б. Уникальный мелатонин / Э.Б. Арушанян. Ставрополь : СГМА, 2007. - 398 с.
118. Хронопатология / Л.Г. Хетагурова и др.. М. : Наука, 2004. - 355 с.
119. Nelson, R.J. Seasonal patterns of stress, immune function, and disease / R.J. Nelson, G.E. Demas, S.L. Klein, L.J. Kriegsfeld. New York : Cambridge University Press, 2002. - 293 p.
120. Комжа, А. Л. Природная флора. Сосудистые растения / А.Л. Комжа // Владикавказ : Проект-Пресс, 2000. Т. 18. - С. 109-187.
121. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hydrangeaceae-Haloragaceae. -Ленинград, 1987. 326 с.
122. Pradhan, S.C. Hepatoprotective herbal drug, silymarin from experimental pharmacology to clinical medicine / S.C. Pradhan, C. Girish // The Indian journal of medical research. 2006. -V. 124. -№ 5. - P. 491-504.
123. Effects of Quercetin on Liver Damage in Rats with Carbon Tetrachloride-Induced Cirrhosis / A. Pavanato et al. // Digestive Diseases and Sciences.- 2003. V. 48. - № 4. - P. 824-829.
124. Sheweita, S.A. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants / S.A. Sheweita, M. A bd El-Gabar, M. Bastawy // Toxicology.- 2001. -№165. P. 217-224.
125. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность комбинаций лохеина и эплира / А.С. Саратиков и др.. // Хим.-фарм. журн. 2001.- № 6. С. 48-50.а) Акт внедрения
-
Мелешин, Марат Игоревич
-
кандидата биологических наук
-
Владикавказ, 2010
-
ВАК 03.02.14
- Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба
- Эколого-морфологическая характеристика репродуктивной активности рыжей полевки (Clelthrionomys glareolus Schreber, 1780) в зоне влияния Оренбургского газзавода
- Околочасовые клеточные ритмы белкового метаболизма в онтогенезе, при различных формах естественного гипобиоза, искусственной гипотермии и токсическом воздействии
- Структурно-функциональные особенности сообществ и популяций некоторых видов мелких млекопитающих в условиях техногенной нагрузки
- Морфометрические показатели функционального состояния надпочечников белых крыс и их изменение в условиях кадмиевой интоксикации при естественном и измененном фоторежиме
