Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов"

о

На правах рукописи Виханская Фаина Львовна

РОЛЬ БЕЛКОВ р53 и р73 В ОТВЕТЕ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩИХ АГЕНТОВ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ООЗиьоо^^

Санкт-Петербург 2007

003066853

Работа выполнялась в лаборатории молекулярной фармакологии Института фармакологии Марио Негри

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Воробьев Владимир Иосифович

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович

Институт экспериментальной медицина РАМН, Санкт-Петербург

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович

Институт онкологии им проф Н Н Петрова, Санкт-Петербург

Ведущая организация Российский онкологический научный

центр РАМН, Москва

Защита состоится 26 октября 2007 г в /3 часов на заседании диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , д 4 факс (812) 297-0341, се11Ью@та11 су1врЬ ги С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан _^(З' Р-9, 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Е В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Несмотря на существенные успехи в лечении опухолевых заболеваний, они продолжают занимать одно из первых мест среди болезней, приводящих к летальному исходу (Canmstra, 1993) Не вызывают сомнения данные о том, что в большинстве случаев на первых этапах лечения достигается положительный химиотерапевтаческий эффект Однако выздоровление наступает только у незначительной части больных (Berek et al, 1999) Поэтому усилия многих научных групп направлены на изучение молекулярно-генетических механизмов, ответственных за чувствительность и резистентность опухолей к фармакологическим препаратам, используемым в онкологической практике Идентифицирована большая группа генов, которые ответственны за чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам разного механизма действия Среди них особое место занимают гены, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК и апоптоза Внимание к ним закономерно, так как, с одной стороны, нарушение их экспрессии приводит к нежелательной пролиферации клеток, а с другой - они вовлекаются в ответ клеток на повреждающее или антипролиферативное действие лекарственных препаратов

Открытие супрессора опухолевого роста - белка р53, нарушение функции которого обнаруживается более чем в 50% опухолей человека (Harris, 1996), закономерно сделало первостепенным изучение его роли в ответе опухолевых клеток на химиотерапевтические воздействия Накоплен большой экспериментальный материал о связи статуса р53 (дикий или мутантный) в разных типах опухолей с их чувствительностью к цитостатикам разной природы, показанных для терапии данных типов опухолей Однако эти данные крайне противоречивы По-видимому, это связано с существованием множества различных типов мутаций в гене р53, а также наличием полиморфизма Наиболее распространенной и изученной является замена 347G/C, приводящая к замене 72 R/P в области, богатой пролином (Malashewski et al, 1987)

Показано, что чувствительность клеток к различным воздействиям зависит от сочетания полиморфизма и мутаций в гене

3

<V

р53, однако эти данные также противоречивы (Ве^атавсЫ е1 а1, 2003, Сопст е1 а1, 2005) Вероятно, что в некоторых типах опухолей сочетание 72/11 с мутациями в коровом домене приводит к большей резистентности, чем сочетание 72/Р с теми же мутациями Высоко вероятно, что это может быть следствием взаимодействия мутантного р53 с другим, открытым позже белком р73 (К^1ш1 е1 а1, 1997), продуктом гена, также принадлежащего семейству р53 Из первичного продукта транскрипции гена р73 в результате альтернативного сплайсинга 5'- и 3'-концов и альтернативного полиаденилирования формируется ряд изоформ р73, которые проявляют в отношении р53 разнонаправленную модулирующую активность (МеЬпо е1 а1,2002)

Анализ накопленных данных позволяет считать, что ответ опухолевых клеток является специфичным, как для данного типа клеток, так и для данного фармакологического вещества, и связан со специфическими факторами данной клетки, которые могут изменять функции белков семейства р53

Цель и задачи исследования.

Целью исследования было изучение роли белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих и противоопухолевых агентов, а также в регуляции событий клеточного цикла, апоптоза, репарации генетических повреждений и ангиогенеза

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи

1 Исследовать способность опухолевого-супрессора р53 в клетках, полученных из опухолей разного тканевого происхождения (яичников, кишечника, легких), блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз в ответ на генотоксический стресс

2 Изучить вклад полиморфизма гена р53 в сочетании с «горячими» точковыми мутациями р53 в реализацию ответа клеток на генотоксический стресс

3 Определить, в какой степени экспрессия транскрипционного фактора р73а в опухолевых клетках может влиять на экспрессию генов-мишеней р53, и какие новые гены вовлекаются в клеточный ответ при повышенной экспрессиир73а

4 Оценить вклад ключевых генов-мишеней, индуцируемых р73а, в репарацию генетических повреждений в клетках опухолей яичников при действии ДНК-повреждающих факторов

5 Установить роль р73 в регуляции генов, ответственных за ангиогенез и васкуляризацию опухолей in vivo Выяснить, каким образом изоформы р73, в частности DNp73a, не обладающие транскрипционной активностью, влияют на клеточные процессы, связанные с ангиогенезом

6 Использовать данные о статусе и экспрессии генов р53 и р73 в опухолях различного тканевого происхождения в качестве прогностического критерия при выборе наиболее адекватного и эффективного лечения онкологических заболеваний

Научная новизна. Впервые обнаружено новое свойство опухолевого супрессора р53 в контроле клеточного цикла клеток опухолей яичников, связанное со способностью р53 индуцировать блок в фазе G2/M, помимо известной ранее способности вызывать блок G1/S после действия повреждающих агентов Впервые показано, что описанная как р53-зависимая активация гена p21/wafl, может происходить на уровне транскрипции в отсутствие р53, в частности после обработки клеток ингибитором топоизомеразы 2а доксорубицином Впервые показано, что опухолевый супрессор р53 может ингибировать транскрипцию промотора гена топоизомеразы 2а Ингибирование транскрипции не связано с определенными специфическими последовательностями в промоторе гена Торо2а Показано, что р73 может конкурировать с р53 за специфические сайты связывания в промоторах генов, отвечающих после активации р53 повышением уровня транскрипции В связи с тем, что р73а, является более слабым активатором транскрипции, он может ингибировать транс-активирующее действие р53 Впервые выявлено плейотропное действие р73а на клетку Показано, что р73а способен индуцировать экспрессию генов ХРА, XPD и XPG, участвующих в эксцизионной репарации, усиливая, таким образом, защитные системы клетки С другой стороны, р73а может влиять на васкуляризацию опухолей посредством регуляции факторов ангиогенеза, таких как VEGF и TSP-I Повышенная экспрессияр73а способствует повышению содержания проангиогенного фактора VEGF и снижению антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к увеличению числа кровеносных сосудов in vivo Впервые

продемонстрирован новый механизм транскрипционной активации гена р73, который связан с вытеснением транскрипционного фактора- супрессора С/ЕВРа с промотора гена р73 при обработке клеток доксорубицином

Научно-практическое значение Данные о чувствительности и резистентности опухолевых клеток к ряду противоопухолевых препаратов, опосредованные генетическими модификациями генов семейства р53 и р73, могут быть использованы в клинической практике для разработки новых подходов в лечении опухолей Проведенные нами исследования показали, что присутствие активного р53 в клетках опухолей яичников может приводить к большей их резистентности к ингибитору топоизомеразы 2а -доксорубицину, что открыло принципиально новые свойства р53, ранее не описанные в литературе Это позволяет говорить о сложной зависимости окончательного эффекта действия химиотерапевтических препаратов этой группы от экспрессии р53 Сходные выводы были сделаны нами при исследовании повреждающего действия таксола, ингибитора веретена митоза, широко применяемого в клинике Впервые было обнаружено, что инактивация р53 приводит к большей лекарственной чувствительности клеток Эти данные предполагают возможность успешного лечения группы опухолей, которые лишены нормальной экспрессии р53 Цисплатина - агент, широко использующийся при лечении опухолей и вызывающий повреждения ДНК, может быть одинаково активен независимо от статуса р53 Показано, что мутантный р53 меняет ответ клетки на стресс в зависимости от типа мутации в ДНК-связывающем домене и от вида полиморфизма Pro/Arg в кодоне 72 Кроме того, эффективность повреждающего действия зависит от типа химиотерапии

В клетках опухолей яичников экспрессия р73а приводит к повышеннию эксцизионной репарации Это свойство повышает резистентность клеток к обработке цисплатиной и УФ Таким образом, присутствие р73а, в некоторых типах опухолей может служить в клинике индикатором резистентности клеток Помимо этого, нами показано, что усиленная экспрессия р73а в опухолях может способствовать ангиогенезу и предполагает возможность эффективного лечения с помощью ингибиторов ангиогенеза

Имеют большое научно-практическое значение данные, что изоформа р73а, не имеющая домена, ответственного за транскрипционную активацию и являющаяся репрессором р53 и р73 (так называемая доминантно-негативная форма р730Иа), присутствующая во многих опухолях, не снижает чувствительность клеток к действию повреждающих агентов Изоформа р 75£>Мх сама по себе не достаточна для формирования резистентного фенотипа В целом, наши данные предполагают, что ответ опухолевых клеток специфичен, однако зависит от многочисленных клеточных факторов Результаты работы свидетельствуют о необходимости индивидуального подхода при лечении опухолей и могут быть использованы в лекционных курсах в различных институтах РАН, РАМН и университетах

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Одна из основных функций опухолевого супрессора р53 заключается в его способности регулировать транскрипцию широкого спектра генов, продукты которых участвуют в регуляции событий клеточного цикла, вызывая блоки С1 /Я и 02/М клеточного цикла после действия повреждающих агентов

2 р53 является репрессором промотора гена Топоизомеразы 2а, вовлеченного в изменения топологии ДНК и играющего критическую роль во время митоза р53 контролирует цикл не только путем активации, но и путем репрессии генов

3 Ингибитор циклин-зависимых киназ р21/\уаП, являющийся основной мишенью р53 и принимающий участие в реализации блока в 1/8 после действия повреждающих агентов, может индуцироваться в опухолевых клетках по р53-независимому механизмы

4 Экспрессия р53 может быть причиной резистентности опухолевых клеток к ДНК-повреждающим агентам различного механизма действия, таким как к доксорубицин и таксол Р53 не может расцениваться, как решающий клеточный фактор, определяющий программу гибели опухолевых клеток при стрессе

5 Мутации гена р53 не исчерпывают всех изменений белка, так как р53 существует по-крайней мере в двух полиморфных формах р53 72Рго/А^ Клетки, экспрессирующие р53 72/11 и несущие мутацию Я2498, могут обладать повышенной резистентностью к доксорубицину

6 р73а конкурирует с р53 за гены-мишени, причем экспрессияр73а может быть причиной резистентности опухолевых клеток к некоторым типам химиотерапии р73а индуцирует ангиогенез путем активации проангиогенного фактора VEGF и репрессии антиангиогенного фактора TSP1, что приводит к повышенной васкуляризации опухолей ra vivo р73а может при некоторых условиях повышать онкогенез клетки

7 ДНК-повреждающие агенты индуцируютр73 на уровне мРНК и белка В промоторе р73 выявлен сайт негативной регуляции гена фактором С/ЕВРа, который при обработке клеток доксорубицином меняет ядерную локализацию на цитоплазматическую

8 Доминантно-негативная форма р73а, представляющая собой изоформу р73а с делетированным транс-активирующим доменом, не меняет ответ клетки на обработку противоопухолевыми препаратами

Апробация работы. В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на лабораторных семинарах фармакологического института "Марио Негри", а также на многочисленных международных симпозиумах на международном Симпозиуме «In vitro Cytotoxicity Mechanisms», Рим, 1999, на VII международной конференции по клинической фармакологии и терапии, Флоренция, 2000, на зимнем митинге EORTC, Лейчестер, 2000, на международных конференциях AACR в Новом Орлеане, 2001 и в Бостоне в 2003, на Международных митингах по р53 Крит, 1998, Барселона, 2002 и Дундин, 2004, на конференции по р73/р63, Рим 2002 и 2004 Апробация диссертации была на совместном семинаре нескольких лабораторий в Институте цитологии РАН (декабрь 2006 г)

Работа проводилась при финансовой поддержке Итальянской Ассоциации Исследования рака (AIRC), Национальным Советом Рима, проектом CNR, финансируемым АСРО, фондом Nerina and Mario Mattioti, грантом Итальянского Министерства Здоровья, Фондом CARIPLO и другими Итальянскими грантами

Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 9 докладов на международных конференциях и съездах

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 41 рисунок Диссертация содержит 167 наименований цитируемой литературы

Материалы и методы исследования

Клеточные линии и их культивирование. В работе использованы человеческие линии опухолей яичников, кишечника, молочной железы, карциномы легкого из коллекции Института Марио Негри, такие как А2780, IGROV-1, Ра-1, SKOV-3, НСТ116, MCF7, Н1299 Клетки выращивали на среде RPMI-1640, DMEM, Iscove 's с добавлением L-глютамина и 10% фетальной сыворотки Химические реагенты в основном были получены из Sigma (St Louis, МО) и были использованы в соответствии с инструкциями Стабильная трансформация. Клоны получены с помощью трансфекции плазмидной ДНК методом Са-фосфатной преципитации или липосомного переноса с помощью липофектамина-2000 (Invitrogene) с последующей селекцией на соответствующих антибиотиках Для трансфекции использовали плазмиды, содержащие интересующие гены, а также селективные маркеры к антибиотикам G418, гигромицин В или пуромицин Экстракция РНК и ОТ-ПЦР. мРНК выделяли с помощью TRIZOL (Invitrogene), ОТ-ПЦР проводили с праймерами, специфичными к интересующим генам после ретротранскрипции РНК Нозерн-гибридизация. Для количественной оценки специфической РНК, образцы разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с 32Р-меченной к-ДНК интересующего гена ОТ-ПЦР в реальном времени Для оценки малых количеств специфической РНК проводили анализ со сецифическими праймерами Реакцию проводили с SYBR GREEN Master Mix (Applyed Biosystems) Вестерн-блоттинг Белки, выделенные из клеток, разгоняли на SDS-PAGE, затем переносили на нитроцеллюлозу В качестве первичных антител использовали антитела Santa Cruz Biotechnology, Oncogene Research и другие Связывание антител детектировали методом ECL (Amersham) Люциферазную активность промоторов определяли с помощью

Dual Luciferase Sestem (Promega, Milan, Italy) с использованием внутреннего контроля экспрессии ренилы pRL-SV40 САТ-анализ проводили путем оценки превращения |4С-меченного хлорамфеникола в ацетилированную форму с использованием тонкослойной хроматографии, в качестве внутреннего контроля служила активность плазмиды CMVß-gal Направленный мутагенез в промоторных участках ДНК проводили с использованием набора Stratagene, наличие мутаций проверяли секвенированием ДНК Анализ задержки подвижности олигонуклеотидов в геле (EMSA) проводили путем связывания белков экстрактов с мечеными специфическими последовательностями ДНК Специфические и неспецифические олигонуклеотиды метили [32Р], инкубировали с белками и разделяли в неденатурирующем геле Связывние оценивали по количеству радиоактивности, включившейся в комплекс с белком Иммунофлуоресценция. Для анализа внутриклеточной локализации белков использовали метод иммунофлуоресценции Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали, делали проницаемыми и инкубировали с антителами Флуоресценцию наблюдали во флуоресцентном микроскопе (Carl Zeiss, Germany) Чип-гибридизация (microarray). Оценку экспрессии генов проводили с помощью гибридизации на микрочипах (Clonteck, ATLAS) РНК ре-транскрибировали в присутствии [32Р ]dATP (Amersham, Milan, Italy) Одинаковое количество меченной ДНК гибридизовали на фильтрах, содержащих 588 генов (Clonteck, ATLAS human cancer) Экспрессию оценивали, используя ATLAS IMAGE Software 10 (Clonteck) МТТ-тест. Цитотоксичность лекарственных препаратов оценивали по выживаемости клеток, которую регистрировали с помощью МТТ-теста (оценка на митохондриальную активность) Живые клетки превращают МТТ в нерастворимый осадок, который растворяют и затем измеряют интенсивность на спектрофотометре) Оценка клоногенности клетки высевали на низкой плотности на 6-луночные планшетки После 24-72 ч обрабатывали ДНК-повреждающими агентами и оставляли на 7-14 дней Колонии окрашивали кристал-виолетом (Merck) и анализировали на анализаторе (Immagini &Computor, Milan, Italy) Для определения апоптоза использовали Аннексин-V Клетки инкубировали с FITC-связанным Аннексии V (BD Biosciences, San Diego, CA) Реактивация поврежденной плазмиды клеткой «хозяином». Очищенную плазмиду,

содержащую ген люциферазы, обрабатывали in vitro цисплатиной, осаждали, промывали этанолом и трансфецировали в интересующие клетки В качестве внутреннего контроля использовали необработанную плазмиду P-Gal, либо pRL-SV40

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. р53 и контроль клеточного цикла.

После открытия гена р53 как опухолевого супрессора, достаточно длительное время исследователи не могли выяснить его роль в контроле клеточного цикла, поскольку не было адекватных клеточных моделей Первые попытки ввести в клетку и экпрессировать р53 не удавались из-за выраженной неспособности клеток к пролиферации в присутствии р53 дикого типа В 1990 году Михайлович применил для введении р53 термочувствительный мутант, который экспрессировал мутантную форму р53 при 37°С и нормальный р53 при 32° С Трансфекция р53 в клетки сопровождалось индукцией блока клеточного цикла в фазе G1 (Michailovitz et al, 1990) Наши исследования показали, что помимо G1 р53 вызывает блок G2 и это явление характерно, в частности для клеток опухолей яичников

1.1. р53 вызывает блок а.

Мы обнаружили, что введение термочувствительного мутанта р53 в клетки опухолей яичника приводит к блоку клеточного цикла и накоплению клеток в фазе й2 (рис 1) С\Лк±1ашкауа е1 а1, 1994, 1996)

во

20

SKOV3

«г г«

зкгза

зв

ев 40

го

о «%

801 tsof

«Л

4в

SKN

12 1 SK9

Время инкубации при 32 С (ч)

Рис 1 Цитофлюориметрический анализ распределения в клеточном цикле клеток БКОУЗ, 8К23а и БК9, культивируемых сначала при 37°С, а

затем при 32°С указанное время (•) 01, (■) Э, (А) С2-М вКОУЗ - исходная линия, БКЫ - клетки, содержащие пустой вектор, вК23а и 8К9 - клетки, содержащие температуро-чувствительный мутант р53

Как видно на рисунке 1, в присутствии р53 не наблюдалось накопления клеток в фазе Б или в фазе 01 Это были первые данные о том, что в определенных экспериментальных условиях р53 может преимущественно вызывать 02 блок На этом рисунке представлены два клона, содержащие трансфецированный р53 8К23а и 8К9 Действие р53 на структуру клеточного цикла был наиболее выражен в первом из них Одновременно, в аналогичных работах, проведенных в ряде лабораторий, также было показано, что и в других экпериментальных системах экспрессия р53 приводит к блоку 02 (А§ауга1 е! а1, 1995) Механизм регуляции клеточного цикла опухолевым супрессором р53 базируется на представлении об индукции гена-мишени р21/м>а/1 — ингибитора активности циклин-зависимых киназ (Е1-Бе1гу е! а1, 1993) Сам по себе р53 в отсутствии этого гена не способен вызывать блок в фазе 01 Позже был открыт ген 14-3-35 (Негтекн^ е! а1, 1997), который, как оказалось, вовлечен в формирование р53-зависимого блока 02 Следует отметить, что наши исследования были проведены за 5 лет до клонирования этого гена, а молекулярные механизмы формирования блока были расшифрованы существенно позже

1.2. Транскрипция гена р21Ма/1 может регулироваться р53-независимым способом.

р21/\¥а/1 был первым геном, который клонировали как мишень р53 Обработка клеток противоопухолевыми агентами вызывает накопление р53, его стабилизацию и активацию, которая приводит к индукции транскрипции гена р21/м>а/1 Однако, оказалось, что не только р53 может регулировать ген р21/И/а/'1, существуют и другие факторы его активации Так, в р53-негативных клетках опухолей яичников активация транскрипции гена р21/ма/1 наблюдается после действия противоопухолевого агента доксорубицин (рис 2) (ХЛкИашкауа е1 а1, 1995) Таким образом, р21/шаП может останавливать пролиферацию р53-негативных опухолевых клеток

Позже было показано, что р21ЛуаП участвует в блоке клеточного цикла не только в фазе 01, но и в фазе 02

доксорубицин СООР Рис 2 днализ экспрессии р21/у\>а/1 по

(Ч> ° 3 6 2ф:- I 24 Р21Л«ап Нозерн-гибридизации в линии ЭКОУ-З

«Ж* • • (р5.3-гш11) после обработки

доксорубицином и цисплатиной актин Время обработки указано в часах

Это означает независимую от р53 возможность остановки клеточного цикла в различных фазах

1.3. р53 подавляет транскрипцию промотора гена Топоизомеразы 2а

Будучи транскрипционным фактором, р53 обладает большими потенциальными возможностями для активации и репрессии генов Репрессия может осуществляться за счет прямого связывания с промоторными участками генов, но таких примеров немного В основном, р53 связывается с помощью белок-белковых взаимодействий с супрессорами, которые и подавляют транскрипцию Помимо этого, р53 может подавлять транскрипцию с помощью индукции белка р21/шаП Мы исследовали появление блока 02, вызванного эктопической экспрессией р53, и обнаружили новую мишень гена р53

Р53 1 4 6 Ю 15 Рис 3 Ингибирование

промотора гена ЯР в* ' Топоизомеразы 2а с

¡Яш Ощ, ,,, т

помощью р53 Концентрация

ФШФШт т репортера 2 цг

- Трансфекцию проводили в

клетки БКОУЗ Активность 100 85 61 58 20 4 _ . _

промотора оценивали САТ-

Эффективность превращения хлорамфеникола анализом через 48 Ч после в его ацетилированную форму, % трансфекции

Установлено, что одним из механизмов формирования 02 блока может быть активация гена 14-3-38, который препятствует ядерной локализации комплекса циклин В/сс1с2 после повреждения ДНК

Удаление из клетки 14-3-35 путем гомологичной рекомбинации приводит к летальному исходу после облучения Но регуляцию событий клеточного цикла, в том числе и в фазе G2, определяет не только активация генов посредством р53 Мы показали, что в клетках опухолей яичника, р53 может подавлять транскрипцию гена топоизомеразы 2а (рис 3) (Sandri et al, 1996) Позднее такие же результаты были описаны на клетках фибробластов мыши, что говорит в пользу универсальности механизма р53-зависимой регуляции транскрипции гена Топоизомеразы 2а (Wang et al, 1997)

1.4. р53 и ответ клеток на действие противоопухолевых препаратов.

Ответ клетки на стресс связан с быстрыми пост-транляционными модификациями р53, в частности его ацетилированием и фосфорилированием При этом увеличивается стабильность р53, он начинает накапливаться в клетке и активирует гены-мишени Такие же процессы могут происходить и после действия противоопухолевых препаратов Принято считать, что наличие нормального р53 в клетке может существенного влиять на чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам Важность повышения чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам трудно переоценить Мы изменяли изначальный статус р53, и затем сравнивали чувствительность исходной и модифицированной клеточных линий Тем самым, мы хотели проверить гипотезу о способности р53 изменять чувствительность различных клеточных моделей В процессе работы была создана панель изогенных клеточных линий, экспрессирующих р53, который менялся при изменении температуры с 37°С на 32°С, описанную в главе 1 1 Нормальный р53 дикого типа в клетках А2780 опухолей яичников инактивировали с помощью введения района Е6 вируса папилломы HPV16, который способствует усиленной деградации белка р53 Аналогичный подход был применен для клеток опухоли кишечника НСТ116, которые, так же как и А2780, содержат нормальный р53 Эти клеточные модели были использованы для выяснения роли р53 при обработках, типичных для данного типа опухолей, которые применяются в клинике Использование изогенных линий позволяет сравнивать клетки, имеющие одинаковый генетический материал и

различающиеся только по одному конкретному параметру — экспрессии гена р53 (дикий или мутантный)

1.4.1. Роль р53 в ответе клеток на обработку доксорубицином.

При использовании температурочувствительного мутанта р53 оказалось, что присутствие активного р53 при 32°С (Табл 1) приводит к большей резистентности клеток к ингибитору Топоизомеразы 2 доксорубицину Эта резистентность не была связана с уменьшением внутриклеточного накопления доксорубицина или его быстрым выведением из клетки Цитотоксичность доксорубицина при 32°С в клетках, не экспрессирующих р53, была значительно выше, чем в клетках, экспрессирующих р5Ъ, что снимало вопрос о возможном влиянии низкой температуры на эффекты, связанные с метаболизмом агента Мы не обнаружили изменения в токсичности при исследовании других лекарств, в частности цисплатины (Vikhanskaya et al, 1995) Исследуя распределение клеток в цикле, экспрессию циклинов и киназ (Vikhanskaya et al, 1996), причины повышенной устойчивости клеток к агенту, пока выяснить не удалось (Vikhanskaya et al, 1996) Существуют метаболические и сигнальные пути, которые зависят от присутствия р53 и вовлечены в доксорубицин-резистентность Позднее аналогичные данные были получены при исследовании действия доксорубицина на клетки опухоли кишечника (Bunz et al, 1999) Недавно показано, что при обработку доксорубицином р53 индуцирует ген TIGER, снижающий чувствительность к этому агенту в целом ряде опухолевых клеток (Bensaad et al, 2006) Наши данные ставят под сомнение концепцию о зависимости повышенной чувствительности клеток от присутствия р53 дикого типа, как универсального явления, и предполагают, что в определенных эпигенотипах, чувствительность может даже снижаться

На системе термочувствительного р53 была проверена токсичность клеток к ряду ДНК-повреждающих агентов, применяемых в клинике при обработке опухолей данного типа (Табл 2) В отличие от доксорубицина, присутствие р53 дикого типа не меняло ответ клеток на другие агенты

Таблица 1 Цитотоксичность к доксорубицину и цисплатине в клонах, экспрессирующих температурочувствительный р53 (ингибирование в %)

БКМ 8К23а 23а

37°С 32 °С 37°С 32°С

доксорубицин

0 25дМ' 25 + 8 25+3 26 + 9 0

0,25цМ 31 +6 24+4 33 + 5 4 + 3

0 50(|М' 69 + 9 63+15 86 + 5 25 + 13

050цМ 56 + 1 32 + 2 58 + 15 13 + 6

100||М 74 + 4 58 + 4 82 + 1 48 + 4

цисплатина

10 ц^ш! 62+4 74 + 4 58 + 1 70 + 5

Значения представляют собой среднее + стандартное отклонение в 3-х экспериментах, за исключением обработки доксорубицином (О 25 рМ) Использован метод подсчета с помощью МТТ-теста за исключением экспериментов, отмеченных1, где ингибирование оценивали путем подсчета клеток в счетчике клеток

Таблица 2. Чувствительность к фармакологическим препаратам клонов, экспрессирующих температуро-чувствительный р53 при 32°С и мутантный р53 при 37°С (цитотоксичность представлена в дозах, подавляющих жизнеспособность клеток на 50% - 1С50).

ЗГС SKN 32°С Отношение 32 37 вК23 37°С вК23 32°С Отношение 32 37

доксорубицин 0 29±0 08 0 76°±0 11 26 014« 05 1 6°±0.39 11 3

цисплатина 16 67±63 19 67±9 3 12 7 67±2 00 11 67±53 15

Ь-РАМ 19 34±5 6 27 54±10 14 15 08±2 3 28 52±7 9 19

\1NNG 77 5±2 9 60 6±0 06 08 68 2±9 0 68 2±19 10

УР-16 4 08±1 02 9 86±1 02 2.4 3 23±1 03 10 71±2 0 33

т-АМБА 0 55±© 2 0 57±015 10 0 40±0 11 0 5Ш07 13

мтх 0 47±0 09 0 62±0 12 13 0 40±0 11 0 49±0 13 12

ТАХ 7 0±0 6 69±0б 10 71±0 2 9 4±2 1 13

СРТ 0 48±0 10 0 56±0 16 12 048±0 12 0 58±0 12 12

РСЕ2451 73 04±0 3 4 07±0 07 12 2 02±0 12 3 08±0 41 15

1С50 (в рМ) рассчитывались по трем экспериментам Обработку проводили в течение 24 ч, затем через 72 ч определяли жизнеспособность клеток по МТТ

1.4.2. р53 и действие таксола.

Таксол является противоопухолевым агентом, который связывается с тубулином и действует на микротрубочковый аппарат клетки на стадии митоза Таксол широко применяется в клинике при лечении опухолей яичников В связи с этим, была исследована роль р53 в определении признака устойчивости клеток к этому агенту Для этой цели использовали изогенную систему клеток опухолей яичников А2780, содержащую нормальный р53, и линию, полученную введением продукта вируса НРУ Е6, в которой р53 был почти полностью деградирован (Л^кЬапБкауа е! а1, 1998) Известно, что таксол может вызывать накопление р53 путем стабилизации белка р53 (ВкдовЫоппу et а1, 1996) Правомерно было ожидать, что присутствие р53 при обработке таксолом может внести изменения в ответ клеток При проверке распределения клеток по циклу (рис 4), было обнаружено, что в исходной линии А2780 таксол практически не вызывает изменений в распределении клеток В тоже время, после инактивации р53, накопление клеток в фазе С2/М после действия таксола увеличивается с 9% до 62% Это событие приводит к увеличению чувствительности клеток к таксолу (рис 5)

Таксол ЮОпМ

Содержание ДНК

Таксол 100пМ_

Содержание ДНК

Рис 4 Распределение по клеточному циклу после обработки таксолом (1 ч) и при дальнейшей инкубации в течение последующих 24 ч

Рис 5 Ингибирование роста при обработке таксолом А2780 (о) и А2780/Е6 (•) МТТ-тест проводили через 72ч после обработки клеток (24ч)

Концентрация таксола (пМ)

По-видимому, накопление клеток в G2/M в отсутствии р53 является в определенной мере причиной повышения чувствительности опухолевых клеток яичника к таксолу Таким образом, таксол может проявлять противоопухолевое действие более эффективно в отсутствии р53, и линия А2780/Е6 является одним из таких примеров Для того чтобы убедиться в правомочности такого вывода, были исследованы другие линии клеток опухолей яичника, не подвергавшиеся дополнительной модификации и были получены клоны, экспрессирующие р53 под контролем тетрациклин-зависимого промотора в линии SKOV3 (Таблица 3) (Debernardis et al, 1997)

В этой серии экспериментов не наблюдалось положительной корреляция между присутствием р53 и повышенной чувствительностью к таксолу Скорей наоборот, наблюдалась повышенная устойчивость линии А2780, несущей нормальный р53, к таксолу Введение гена р53 под контролем тетрациклинового промотора в линию SKOV3 /?JJ-null, не меняло существенно IC50 Линии, содержащие мутантный р53, и р53-тх\\ линии, такие как SW626, OVCAR-3, OVCAR-5, OVCAR-8 и SKOV-3, не отличались повышенной резистентностью по сравнению с линией А2774, содержащей р53 дикого типа

Для понимания механизмов чувствительности клеток к таксолу, была проведена оценка апоптотической гибели клеток методом ДНК фрагментации по связыванию ДНК на фильтрах и с использованием окрашивания методом TUNEL Уровень апоптотической гибели был очень низок Вероятно, отсутствие апоптоза в клетках опухолей яичников и является причиной отсутствия влияния р53 на чувствительность клеток Таким образом, р53 может играть существенную роль в ответе клеток на повреждение, по крайней мере, в опухолях яичников, только в том случае, когда может быть запущена программа апоптоза

Таблица 3.

Чувствительность к таксолу различных клеточных линий, полученных из опухолей яичников (1С50 ).

Статус р53 1С,,, (пМ)

OVCAR-3 мут (248И >0) 40

OVCAR-5 мут (вставка ЗЬр в 224) 60

OVCAR-8 мут (дел 126-132 70

SW626 Мут (262 С-> V) 35

SKOV-3 делеция 46

А2774 дикии тип 63

А2780 дикий тип 387

РА-1 дикии тип 35

IGROV-1 дикий тип 82

SK4T+ тет делеция 62

SK4T - тег дикии тип 45

SK23a 37°С мут (135 С-> V) 72

SK23a 32°С дикии тип 92

SKN 37°С делеция 72

SKN 32°С делеция 70

Статус р53 определяли в каждой клеточной линии с помощью PCR-амплификации и последующего секвенирования экзонов 5-8 1С50 -концентрация таксола, вызывающая 50% гибели клеток после обработки 24 ч Гибель клеток оценивали после инкубации в течение 72 ч Клетки культивировали в присутствии (+) и отсутствии (-) 1 (.и /мл тетрациклина

Наши данные о зависимости чувствительности клеток от статуса р53, полученные на клетках опухолей яичников, совпадают с выводами другой группы, авторы также элиминировали р53 с помощью продукта HPV Е6 и анализировали чувствительность к таксолу (Wahl et al, 1996)

1.4.3. Р53 и ответ клеток на обработку цисплатиной.

Цисплатина является противоопухолевым агентом, вызывающим формирование моно-аддуктов и межцепочечных сшивок Обработка цисплатиной, повреждая ДНК, стимулирует накопление в клетках

р53 (рис 6) В этой части работы также было исследовано функциональное значение индукции р53 в определении клеточной чувствительности к обработке цитостатиком С использованием модели, несущей термо-чувствительный мутант р53, было обнаружено, что присутствие р53 при обработке цислатиной (Таблица 1) не вызывает изменений ответа клеток

Рис 6 Активация р53 и р21АуаП в ответ на обработку цисплатиной

(25 |дМ, 1 ч) Белки тестировали через указанное время с помощью Вестерн-блоттинга

HCT 116

Время, ч 0 24 48 72 96

„и ....... ■■—''■' .

рол ■ Ч™ "W1-1"

p21/waf1 atmm

Кроме клеток опухолей яичника, действие цисплатины было исследовано на клетках опухоли кишечника HCT 116, содержащей нормальный р53, инактивированный затем с помощью введения продукта вируса HPV Е6 (рис 8) Оказалось, что инактивация р53 приводит к сенсибилизации клеток (рис 7)

Рис 7 Действие цисплатины на клетки опухоли кишечника, содержащие дикий тип р53 НСТ116 (□) и клетки клона НСТ116/Е6, в которых р53 был инактивирован (■) Цитотоксическое действие цисплатины оценивали по клоногенной выживаемости Результаты представляют собой среднее трех независимых экспериментов

м

in

—I— »

Цисплатина рМ

HCT116 и HCT116/Е6

Р53

Рис 8 Инактивация р53 в клетках линии НСТ116 при стабильной трансфекции продукта вируса НРУ16Е6 Обработка цисплатиной 24 ч 25 цМ Контроль (-), обработка цисплатиной (+)

Сходные результаты были получены на линии клеток опухоли груди МСР-7 (Тип е1 а1, 1995) Введение экзогенного продукта вируса папилломы может неспецифически менять ответ клетки на повреждение В связи с этим была проведена проверка зависимости чувствительности клеток, полученных из опухолей яичников и не подвергшихся дополнительным модификациям, от статуса р53 Оказалось, что и в случае неизогенных клеток чувствительность к цисплатине не определяется статусом р53 (Бе Реискв е1 а1, 1997) Наши результаты по сенсибилизации клеток могут быть связаны с отсутствием репарации ДНК, во многих случаях опосредованной р53 Однако, следует отметить данные, которые существуют в литературе и отличаются от наших В частности, показано снижение чувствительности к цисплатине в линиях, несущих мутантный р53 по сравнению с линиями, экспрессирующими р53 дикого типа (Реге§о е1 а1, 1996) Эти противоречия до настоящего времени не объяснены, и являются свидетельством того, насколько трудно прогнозировать результаты лечения

1.4.4. Полиморфизм р53 72Рго/А^ в сочетании с "горячими" точковыми мутациями в ДНК-связывающем домене и чувствительность к ДНК-повреждающим агентам.

Мутации гена р53 представляют основные модификации белка, проявляющиеся при развитии опухолей Помимо мутаций в р53 имеется полиморфный сайт в кодоне 72 экзона 4, который кодирует либо аминокислоту аргинин 72/11, либо пролин 72/Р Полиморфизм по гену р53 зависит в сильной мере от этнического происхождения и варьирует в разных популяциях Полиморфизм связан с областью р53, богатой по пролину, которая участвует в регуляции пролиферации и апоптоза Полиморфные формы обладают различными биохимическими и биологическими свойствами Мы исследовали, как полиморфизм в сочетании с мутациями в гене р53 может менять ответ клеток опухолей легкого на обработку агентами, применяемыми при лечении Были сконструированы векторы, несущие 6 «горячих» мутаций гена р53 в сочетании с разными полиморфными формами либо 72/Рго, либо с 72/А^ (Я175Н, 0245Б, Я248\У, 112498, Я273Н, К282\¥) и получены поликлональные линии из клеток Н1299 легочной карциномы, имеющих исходный генотип />55-пи11 Все клеточные линии

экспрессировапи мутантный р53, который обладал различной подвижностью при электрофорезе в зависимости от присутствия пролина или аргинина в кодоне 72 (рис 9)

I .175 845 248 Я49 273 Я82

Ars Pro Arg Р™ Pro PK* АЗ-8 Pro

Рис 9 Анализ поликлональных популяций, полученных после трансфекции клеток Н1299 векторами, несущими 6 «горячих» мутаций гена р53 в ДНК-связывающем домене в сочетании с одним из полиморфизмов в позиции 72 аргинином или пролином Поликлональная линия, содержащая пустой вектор, использована в качестве контроля Для выявления р53 использовали моноклональные антитела DOl

Обработка цисплатиной, этопозидом и гемцитабином не зависела от типа полиморфизма, однако обработка доксорубицином была более эффективна в случае сочетания мутации R249S р53 с полиморфной формой 72/Рго, чем с 72/Arg (Рис 10)

вектор — ~~72р - 72R

175Н Jiüü 2dJtW ШЯ 77ЯН 9B7W

Доксорубицин (рМ)

Рис 10 Чувствительность к доксорубицину линий HI299, содержащих 6 «горячих» мутаций в сочетании с р53 полиморфизмом 72 P/R Анализ проводили с помощью МТТ теста В случае мутации 249S наблюдали достоверные различия в чувствительности между 72Р и 72R вариантами (72R>72P)

Очевидно, что полиморфизм может играть роль в ответе клеток на повреждение Тем не менее, наблюдается зависимость от типа мутации и характера обработки, и эффект не всегда

предсказуем, поскольку он еще зависит от вида опухоли, те от эпигенотипа (У1кЬапзкауа е1 а1, 2005) Это же явления описано в работе, проведенной на опухолях головы и шеи (Ве^атавсЫ е1 а1, 2003) Однако, при исследовании опухолей этого типа, авторы пришли к выводу, что присутствие 12А.Щ приводит к резистентности в сочетании со всеми мутациями р53, и при любых типах обработки Наконец, существуют данные, которые говорят что полиморфизм в мутантном р53 в опухолях яичника (Сопсш й а1, 2005) не определяет связь между резистентностью клеток и полиморфизмом в кодоне 72 Наши данные предсказывают, что ответ может определяться целым набором факторов, включающих не только наличие мутаций в р53 и полиморфизм 72Рго/Ащ, но и другие генетические характеристики опухолей Резистентность может объясняться способностью мутантного р53 + 72Ж связываться с другим членом семейства - р73 и инактивировать его гораздо более эффективно, чем в случае мутантного р53 + 72/Р В клетках Н1299, использованных в нашей работе, это различие отсутствовало (УМтшкауа е1 а1, 1995)

Глава 2. р73 - второй член семейства р53.

Ген р53 был открыт в 1979 г, и долгое время считалось, что р53 уникален Однако через 18 лет семейство р53 было дополнено открытием генов р73 и рбЗ (Ка§Ьас1 е1 а1, 1997) Ген р73 имеет 63% гомологии в ДНК-связывающем домене, 38% гомологии с доменом тетрамеризации и 29% гомологии с трансактивирующим доменом р53 С последовательности гена р73 транскрибируются С-концевые сплайсинговые формы (р73 а, р, у,8, е, 'С) Помимо этого, возможен альтернативный сплайсинг в 14-концевой части р73 и существует альтернативный промотор в 3-ем интроне, что в результате приводит к синтезу белка, не имеющего трансактивирующего домена (доминантно-негативная форма - БИ р73) (Уоввю й а1, 2002) Наиболее существенная разница между двумя членами семейства состоит в том, что для р73 до настоящего времени нет точных данных о том, что он является опухолевым супрессором (МагаЬеве е! а1, 2007) Мыши с нокаутом по р73 не формируют опухолей и, кроме того, р73 может быть гиперэкспрессирован в ряде опухолей без остановки их пролиферации Мутации в гене р73 встречаются крайне редко

Р73 активирует многие р53-зависимые гены, хотя эффективность активации отличается от индукции в сравнении с р53 В частности,

многие р53-зависимые гены, такие как р21/м>а/1, Ъах, РЮЗ активируются значительно слабее

2.1. Взаимодействие между р53 и р73.

Поскольку р73 экспрессируется практически во всех нормальных и опухолевых клетках, представлялось важным понять, как р73 может взаимодействовать с р53 Этот вопрос особенно актуален для опухолей, содержащих нормальный р53 В результате экспериментов по иммунопреципитации, мы не выявили физического взаимодействия белков р73 и р53 (Vikhanskaya et al, 2000) Аналогичные данные были получены в других работах (Davison et al, 1999) Тем не менее, были поставлены эксперименты по выявлению функциональной связи между двумя белками (рис 11) Для этого в клетки трансфецировали р53 и р73 вместе с репортерной плазмидой, содержащей канонический сайт связывания для р53

Рис 11 Подавление транскрипционной активности р53 в линии БКОУЗ при ко-трансфекции р73а вместе с диким или мутантным р53 Концентрация р53 вариировала, тогда как концентрация р73а всегда составляла 1 мкг В качестве репортера использовали плазмиду рС13-Ьис, содержащую в промоторе 13 копий сайта связывания р53, и ген люциферазы

По-видимому, р73а, связываясь с теми же последовательностями в промоторе, что и р53, но, обладая более низкой способностью активировать гены, таким образом, может ослаблять эффект р53 Р73 может влиять на активацию /?53-зависимых генов не только в

рТЗ <ЦВ) |>S3 <jig>

mat <(ДВ)

* »

1

I

I S

случае стресса, но и в нормальных условиях жизни клеток Недавно были открыты изоформы р53 (Bourdon et al, 2005), которые могут экспрессироваться в опухолевых клетках и также могут конкурировать с нормальным р53 В целом, конкуренция между всеми членами семейства р53 представляет собой сложную картину По-видимому, существование опухолей, развивающихся в клетках с р53 дикого типа, может объясняться снижением активности белка в присутствии р73 В экспериментах по ко-трансфекции р53 и р73 активность р53 значительно подавлялась Оказалось, что это связано со снижением связывания р53 с последовательностью, являющейся каноническим (CON) сайтом связывания для р53 Этот результат был получен на ядерных экстрактах из клеток клонов, экспрессирующихр73а (рис 12)

компетиторы

Р53комп -лексы

сз о со

Чел

А?780/р73 4

Рис 12 ДНК-связывающая активность р53 в лизатах клеток, экспрессирующих р53 мыши и человека, в присутствии р73а (А2780, р73 4,5) и в его отсутствии (А2780) (А) - контроль и (Б) -обработка цисплатиной (15 р.М)

2.2. р73 и гены репарации ДНК.

В клонах, экспрессирующих р73а (УЖЬашкауа Ы а1, 2000), было изучено его влияние на экспрессию генов с использованием техники гибридизации транскриптов с 588 генами, иммобилизованными на фильтре (микро-эррей) В двух независимых клонах, с высокой экспрессией р73а (А2780/р73 4 и А2780/р73 5) по сравнению с клетками, экспрессирующими вектор, наблюдалось значительное усиление экспрессии генов, участвующих в эксцизионной репарации ДНК (табл 4) (У^апвкауа е1 а1, 2001)

Данные, полученные с помощью гибридизации на микрочипах (тюгоаггау), были подтверждены методом Нозерн-гибридизации (рис 13) Повышенная экспрессия генов репарации ХРВ, ХРО и ХРО наблюдалась в клонах и не увеличивалась после обработках ДНК-повреждающими агентами, что заметно отличалось от экспрессии гена ОАОВ45, который дополнительно индуцируется при воздействиях, повреждающих ДНК

Таким образом, установлено, что р73 усиливает транскрипцию генов ХРО, ХРО и ХРВ, принимающих участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ)

Таблица 4.

Количественные изменения экспрессии генов в клонах, содержащих р73 (А2780р73.4, А2780р73.5) по сравнению с контролем.

Индуцируемые гены Супрессируечые гены

Гены/клоны А2780 р73 4 А2780 р73 5 Гены/клоны А2780 р73 4 А2780р735

Р73 10 11 Ш)оС 0.41 135

ВАХ 21 23 Со11а|еп III 062 042

вА0045 3 45 28 Ое$тор1акЗ 04 154

Р1СЗ 1.45 2.« ММР2 034 042

РГСИ 1 1.8 ростр 031 1.04

Ь-ЯАР 24 08 РаиНт 0.49 179

ША-РК 5 6 $1готе1у$1п1 024 0.2

АТМ 32 23 Т1МР-2 071 0 29

Х1К'С6 2.2 3.5 МЕККЗ 067 057

ХРС 23 205 СсШепп14 032 04

ХРО 39 44

ХРВ 45 33

ХШХ1 25 1

мсмт 27 26

НМЬН1 17 26

РЮ12 2 26 18

УФ цисплатина

CDNA3 р?3 4 р73 5 CDNA3 р73 4 р73 5 - +-+- + - + - + - +

GADD45

ХРВ

XPD

XPG

актин

Рис 13 Анализ генов репарации в клонах А2780, содержащихр73а после УФ (слева) и обработки цисплатиной (справа) СОИАЗ - клон, содержащий пустой вектор, р73 4, 5 -клоны, экспрессирующие р73а Экспрессию белков определяли по Вестерн-блоттингу

Используя реактивацию поврежденной плазмиды клеткой «хозяина», был исследован вопрос о влиянии гиперэкпрессии генов эксцизионной репарации на репарационный потенциал клеток Для этой цели, плазмиду, кодирующую ген люциферазы, обрабатывали in vitro цисплатиной и затем трансфецировали в клетки, экспрессирующие либо р73а, либо вектор (рис 14) Для оценки эффективности трансфекции вводили необработанную плазмиду Remlla В этих экспериментах репарация в трансфицированных плазмидах должна проходить за счет внутриклеточных факторов, и эффективность работы этих факторов оценивается по уровню люциферазной активности

Рис 14 Реактивация клеткой «хозяина» плазмиды, обработанной in vitro цисплатиной, и затем трансфецированной в клетки A2780/pCDNA3 (и) контроль, А2780/р73 4 (•) и А2780/р73 5 -генр73 (о) Данные представляют среднее 3-х независимых экспериментов

50 100 150

Цисплатина (мкм)

В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что репарация плазмиды осуществлялась быстрее в клонах, содержащих р73а, что согласуется с данными по экспрессии этого гена

2.3. р73а и ангиогенез.

2.3.1. р73а регулирует TSP-1 и VEGF.

Васкуляризация опухолей контролируется балансом между проангиогенными и антиангиогенными факторами (Hanahan and Folkman, 1996) Эти факторы индуцируются или подавляются онкогенами и антионкогенами (Mukhopadahyaya et al, 1995, Dameron et al, 1994) В связи с этим, было исследовано влияние р73а на экспрессию факторов васкуляризации опухолей Оказалось, что экспрессия антиангиогенного фактора TSP-1 подавлена в клонах, гиперэкспрессирующих р73а по сравнению с линией, несущей вектор Это подавление наблюдалось как на уровне РНК, так и на уровне белка В то же время, оба клона, экспрессирующие р73а, продуцировали повышенный уровень проангиогенного фактора VEGF (рис 15 а, б, в) (Vikhanskaya et al, 2001а) Исследование секреции этих факторов в среду показало, что секреция TSP-1 снижена, тогда как VEGF повышена (даты не представлены) Тем не менее, точный механизм регуляции этих событий пока неизвестен, поскольку р73а не может действовать на уровне промоторной активности обоих факторов

TSP-1 VEGF

Рис 15 Экспрессия про- и антиангиогенных факторов (УЕСБ и Т8Р1) в клонах А2780, экспрессирующих вектор рСТЖАЗ и р73а р73 4 и р73 5 А, В - РНК-гибридизация, Б - ОТ-ПЦР

Возможно также, что существуют другие регуляторные последовательности этих генов, выходящие за границы участков промоторов, которые были использованы нами в люциферазных экспериментах Влияние р73 на время полужизни РНК

исследованных про- и антиангиогенных факторов обнаружено не было (данные не представлены)

2.3.2 р73 и васкуляризация опухолей in vivo.

Кроме эффектов р73 т vitro, была исследована его роль процессе ангиогенеза in vivo Клетки клонов, экспрессирующих р73а или пустой вектор, вводили под кожу бесстимусных nude мышей и после образования опухолей в них была исследована плотность сосудов (рис 16)

J б

Рис 16 Иммуногистохимия СО-31 Анализ васку ляризации опухолей, полученных из клонов, экспрессирующих вектор (а) либо р73а р73 4 (б) и р73 5 (в)

Таким образом, в результате экспрессии р73а ангиогенез в опухолях усиливается, что выражается в увеличении плотности кровеностных сосудов Не исключено, что агенты, снижающие ангиогенез, могут быть эффективны при повышенной экспрессии р73а

2.4. Регуляция экспрессии р73 после действия ДНК-повреждающих агентов.

2.4.1. Индукция РНК и белка.

Уже в первой работе, описывающей функции нового белка р73, было показано, что р73, в отличие от р53, не может активироваться при действии клеточных стрессов Тем не менее, впоследствии стали появляться данные, что р73 также может накапливаться в клетках после генотоксических стрессов в результате пост-трансляционных модификаций белка, таких как ацетилирование и фосфорилирование

Мы исследовали возможность активации р73 ДНК-повреждающими агентами на уровне транскрипции В клетках нейробластомы линии SH-SY5Y после обработки доксорубицином накопление р73 выявлялось как на уровне РНК, измеряемой количественно методом real-time ОТ-ПЦР, так и на уровне белка, оцениваемого по Вестерн-блоттингу (рис 17)

р73 Р53 Р21

E2F1 актин

доксорубицин (рМ) О

Рис 17 Индукция РНК р73 (А) и белка р73 (Б) в клетках SH-SY5Y

2.4.2. Активация промотора генар73 после обработки доксорубицином.

Несмотря на то, что промотор р73 был клонирован (Ding et al, 1999), регуляция его не была исследована Для понимания механизмов активации транскрипции гена р73 после действия доксорубицина, была проанализирована активность полного промотора р73 и его делеционных мутантов после обработки доксорубицином Оказалось, что активность полноразмерого промотора р73 (2 7 тпо) увеличивается при обработке доксорубицином Этот фрагмент гена содержал три E2F1-связывающих последовательности и гипотетическую р53 последовательность Мы проконтролировали способность

промотора отвечать активацией на введение E2F1 и убедились, что он активируется при котрансфекции с плазмидой, несущей ген E2F1, как это было описано в других работах (Irwin et al, 2000) (данные не представлены) Оказалось, что фрагмент меньшего размера - 18 тпо отвечает на доксорубицин (рис 18) В этом фрагменте отсутствовал потенциальный сайт для связывания р53 и один из трех E2F1 сайтов Этот фрагмент промотора активировался доксорубицином более чем в два раза сильней по сравнению с ' контролем

Д2444 а 2713 ■ -1817

__ И

"THL. LUC _JUr LUC

-1210 -883

-friLUC Ц Ц^ис НН.ШС

-220 . «ЦЗ^ис ве|стор

1 2 3 4 5

Относительная люциферазная активность

Рис 18 Действие доксорубицина на активность промотора р73 Конструкции, содержащие различные 5'-делеции промотора, были клонированы в векторе рОУВ2 и трансфицированы в клетки 8Н-8У5У нейробластомы После трансфекции клетки обрабатывали доксорубицином в течение 24 ч и анализировали люциферазную активность Белые столбики - контроль, черные столбики - обработка доксорубицином

2.4.3. Участие транскрипционного фактора С-ЕВРа в регуляции промотора р73.

При дальнейшем уменьшении длины промотора до 1 2 кВ, начиная с места старта транскрипции (фрагмент содержал два сайта связывания Е2Р1), индукция доксорубицином уже не наблюдалась Мы предположили, что в области размером 0 6 т п о , находящейся между 1 8 тпо и 1 2 тпо, имеется последовательность, которая может отвечать за индукцию доксорубицином Секвенирование этого фрагмента выявило два сайта связывания с факторами С/ЕВРа и \УТ Мутационные замены в одном из этих сайтов - С/ЕВРа приводят к активации промотора (рис 19) Это позволяет предполагать, что С/ЕВРа может быть фактором супрессии

промоторной активности гена, который диссоциирует при обработке доксорубицином (МагаЬеве е! а1, 2003) Свойства С/ЕВРа, как транскрипционного репрессора, в литературе уже описаны (Бкншапу е! а1,2000)

Рис 19 Люциферазная активность фрагмента промотора р73 (1 8 т п о) после мутации сайтов связывания С/ЕВРа и \¥Т Анализ активности без обработки (А) и после обработки доксорубицином (Б)

Эксперименты продемонстрировали новый, неописанный ранее механизм регуляциир73 на уровне регуляции транскрипции

2.5. Гиперэкспрессияр73а в клетках опухолей яичников и чувствительность к обработкам ДНК-повреждающими агентами.

При изучении р73а был обнаружен ряд его свойств, таких как конкуренция с р53 (рис 11 и 12), увеличение количества белка в ответ на повреждающие агенты (рис 17), регуляция генов репарации (Таблица 3, рис 13) и непосредственное участие в

репарации, показанное в клонах, гиперэкспрессирующих р73а (рис 14) Это позволяло предполагать, что р73а принимает участие в ответе клеток на повреждения В связи с этим, была исследована роль р73а в модуляции ответа клетки на обработку цисплатиной (рис 20 а) р73а снижал чувствительность к цисплатине, а также к УФ облучению, вызывающему образование пиримидиновые димеров в ДНК (рис 20 б ) Оба типа повреждений восстанавливаются способом эксцизионной репарации с участием продуктов генов ХРА, ХРВ.ХРС

А Б

Рис 20 Цитотоксический эффект ДНК-повреждающих агентов различного механизма действия на клетки А2780, содержащие вектор (■) (рис 20, б) или ген р73а клоны р73 4 (о) и р73 5 (□) Эффект оценивался по клоногенной выживаемости

MNNGpM

топотекан мм

По данным гибридизации с 588 генами (микроэррэй) в клонах, экспрессирующих р73а был увеличен уровень экспрессии генов MMR (Таблица 3) Известно, что эта система репарации может влиять на активность агентов, метилирующих ДНК Действительно, чувствительность к метилирующему агенту MNNG была понижена (рис 20 в), учитывая, что клоны имели одинаковую чувствительность к ингибитору Топоизомеразы 1 Топотекану (рис 20 г) Таким образом, наши данные предсказывают резистентность к цисплатине в тех типах опухолей яичников, которые имеют повышенный уровень р73а

2.6. Изоформы р73 и их роль в регуляции ответа опухолевых клеток на повреждающие агенты.

Р73 экспрессируется в виде многочисленных изоформ, представляющих собой альтернативный сплайсинг С-концевых и

1М-концевых последовательностей ]М-делетированные изоформы (БКр73, ОМ'р73, БЕхр73и БЕх2/Зр73) представляют собой продукты альтернативного сплайсинга в Ы-концевой части р73 Все они не имеют трансактивирующего домена Интересно, что одна из этих изоформ ОЫр73 образуется за счет использования альтернативного промотора, находящегося в третьем интроне ОЫр73 присутствует в достаточно большом количестве в опухолях, и вероятность того, что эта форма может играть роль в ответе клеток на ДНК-повреждающие агенты, очень велика Кроме того, было показано, что ОЫр73 может ингибировать активность р73 и р53 (Бйеше е1 а1, 2002) Мы создали тетрациклин-индуцируемую форму БНр73а в клетках НСТ116 (клетки опухоли кишечника) В работе были использованы клоны, содержащие вектор и два клона, индуцирующие ЭЫр73а (рис 21)

НСТ116/8а НСТ116ЮЫЗ НСТ116/РЫ14

УФ дж/т2

УФ дж/та

УФ дж/та " *

Цисплатина рм

—-.

а -е .

Цисплатина рм

О » М » »

ЦисллатинарМ

Доксорубицин и"

Доксорубимин рМ ......

Доксорубицин рМ

& ада «в он «во иим 139а о мв <«й «м> ао® и»в в аз» воо ото 1ш 1ш

Рис 21 Цитотоксический эффект ДНК-повреждающих агентов различного спектра действия на клоны НСТ116, индуцибельно экспрессирующие ОЫр73а (НСТ116/8а и НСТ116ЛЖ14) и клетки, несущие пустой вектор - НСТ1160Ю Клетки высевали в 6-луночные планшеты на нормальную среду, затем индуцировали в течение ночи доксициклином (2 мкг/мл) и обрабатывали ДНК-повреждающими агентами Эффективность действия оценивалась по клоногенной выживаемости

Для того, чтобы установить роль БЫр73а в ответе на повреждение, клетки обрабатывали различными ДНК-повреждающими и антипролиферативными агентами Обработки

проводили в условиях, когда экспрессировалась DNp73a изоформа Присутствие DNp73a не изменяет ответ клетки на повреждение Это означает, во-первых, что экспрессия DNp73a не влияет существенно на хеморезистентность и, во-вторых, ингибирование эндогенного р53 DNp73a не вносит существенный вклад в окончательный ответ клетки на повреждение

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе была поставлена задача выяснить, в какой мере р53 и члены семейства р53 р73а и изоформа p73ADNa могут определять ответ клеток на химиотерапию опухолей Выбор семейства р53 произошел не случайно, поскольку к моменту начала работы казалось, что с помощью активации р53 можно решать все вопросы, связанные с ответом клетки на стресс, и в том числе опухолевой клетки на обработку химиотерапевтическими агентами Но, несмотря на многочисленные исследования во многих лабораториях и наши данные, представленные в автореферате, очень трудно однозначно ответить на этот вопрос По нашим наблюдениям в целом ряде случаев присутствие функционально активного р53 может повысить резистентность клеток Наше заключение не кажется совершенно неожиданным после открытия нового гена-мишени р53 - TIGER, который индуцируется р53 и в то же самое время снижает чувствительность многих опухолевых клеток к доксорубицину Белок р73, экспрессирующийся на высоком уровне во многих опухолях, также может быть фактором, повышающим резистентность Более того, появляются все новые и новые данные о противоречивой роли р73 в онкогенезе Недавно нами было продемонстрировано, что р73 способствует росту клеток в присутствии c-jun, активируя АР-1-зависимые гены Особенно трудно сделать заключение об увеличении чувствительности в результате экспрессии дикого типа р53 при анализе результатов, полученых на опухолях яичников Этот тип новообразований отличается очень низким уровнем апоптоза по сравнению с другими видами новообразований Отсутствие апоптоза и присутствие р53 может усилить репарационные процессы и увеличение резистентности В целом "реставрация " апоптозного фенотипа может кардинально усилить чувствительность опухолевых клеток Пути реставрации апоптоза интенсивно изучаются Опираясь на

наши данные можно придти к заключению, что в некоторых случаях инактивация р53 и р73 может снизить репарацию и увеличить чувствительность

Комбинирование классических химиотерапевтических лекарств с агентами, которые могут изменить сигнальные пути, нарушенные в клетках опухолей яичников, является очень перспективным подходом Поиск генетических дефектов и характеристика новых генов может помочь в определении более эффективной стратегии, принимающей во внимание генетические изменения. Исследования экспрессии генов на различных стадиях развития опухолей на клиническом оперативном материале с применением техники микроэррэй и ОТ-ПЦР в реальном времени, а также выявление новых мишеней в настоящее время является одним из самых многообещающих подходов Это позволяет выявить более широкий спектр изменений, применение статистики дает объективную оценку

Очевидно, что определение статуса р53 и р73 в опухолях не является само по себе достаточным для прогноза и выбора лечения В самое последнее время стало очевидно, что семейство р53 содержит множество изоформ, которые проявляют антагонизм по отношению к дикому типу р53 Очевидно, требуется индивидульный подход в каждом особом случае и необходимы дальнейшие поиски специфических препаратов

ВЫВОДЫ

1 Опухолевый супрессор р53 участвует в регуляции клеточного цикла, вызывая блоки и С2 при действии ДНК-повреждающих агентов Будучи транскрипционным фактором, р53 активирует гены, негативно регулирующие клеточный цикл, такие как р211¥а/1, и репрессирует транскрипцию генов, участвующих в репарации повреждений ДНК, таких как топоизомераза 2а Установлено, что активация р21 \Vafl может происходить по р53-независимому механизму

2 В определенных условиях р53 может не только сенсибилизировать клетки к повреждающим агентам, но и повышать их резистентность Экспрессия транскрипционно-

активного р53 в клетках различных опухолей приводит к повышению резистентности клеток к доксорубицину - ингибитору топоизомеразы 2а, таксолу - агенту, действующему на митотический аппарат и цисплатине - агенту, вызывающему повреждения ДНК

3 Наличие полиморфизма в пролин-богатой области белка р53 72P/R в сочетании с определенными «горячими» точковыми мутациями в ДНК-связывающем домене р53 может существенно менять ответ клеток на действие ДНК-повреждающих агентов

4 Белок р73, относящийся к семейству р53 и имеющий большую степень гомологии с р53, может обладать онкогенными свойствами Как транскрипционный фактор, р73 способен конкурировать с р53 за регуляторные последовательности, находящиеся в промоторных участках ¿?53-зависимых генов-мишеней, и снижать их транскрипцию

5 Установлено, что р73 усиливает транскрипцию генов XPD, XPG и ХРВ, принимающих участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ) р73 усиливает процесс васкуляризации опухолей, повышая экспрессию VEGF и репрессируя антиваскулярный фактор TSP-I

6 Впервые показано, что транскрипционный фактор С/ЕВРа связывается с промотором гена р73, вызывая подавление его транскрипции При обработке клеток доксорубицином С/ЕВРа диссоциирует от промотора р73, что приводит к активации промоторной активности

7 Изоформа р73 - DNp73a, образующаяся при инициации транскрипции с альтернативного промотора и не имеющая транс-активирующего домена, не обладает вследствие этого транскрипционной активностью Данная изоформа обладает способностью подавлять трансактивирующий потенциал как р53, так и р73 Поскольку DNp73a экспрессируется во многих типах опухолей, предполагалось, что уровень экспрессии DNp73a может модулировать клеточный ответ на действие различных

противоопухолевых препаратов По нашим данным оказывается, что БИр73а не является существенным детерминантом резистентности

Список цитируемой литературы:

1 Agawal ML, Agawal A, Taylor WR, Stark GR 1995 Proc Natl Acad Sci, 92 8493-8497

2 Bensaad К, Tsuruta A , Selak M A , et al, 2006, Cell, 126, 107-120

3 BerekJS 1999 Ann Oncol ,10 (suppl 1) 87-92

4 Bergamaschi D , Gasco M, Hiller L et al 2003, Cancer Cell, 3 387402

5 Blagosklonny MV, Shulte TW, Nquyen P et al 1995 Cancer Research, 55 4623-6

6 Bourdon JC, Fernandes К, Murray- Zmyewski F Liu G , Xirodimas DP, Saville MK, Lane DP 2005 Genes Dev , 19 2122-37

7 Bunz F, Hwang PM, Torrance C, Waldman T et al 1999 J Clin Invest, 104 263-269

8 Cannistra S A 1993 Cancer of the ovary N Eng J Med, 329 15501559

9 Concm N , Hoffstter G, Berger A , Gehmacher A et al, 2005 Clinical Cancer Res , 11 8372-83

10 Dameron KM, Volpert OV, Tamsky MA, Bouck N 1994 Science, 265 1582-1584

11 De Feudis P , Debernardis D , Beccaglia P , et al, Br J Cancer, 76 474-479

12 Davison T S , Vagner С , Kaghad M et al 1999 J Cell Biol, 274 18709-18714

13 Ding Y , Inoue T, Kamiuma J et al 1999 DNA Res , 6 347-352

14 el Deiry W Tokino W S , Velculescu V E , Levy V E et al 1993 Cell, 75 817-825

15 Fun S, Smith ML, Rivet DJ et al, 1995 Cancer Research, 55 1649-1654

16 HanahanD andFolkmanJ 1996 Cell, 86 353-364

17 Hams С С 1996 Br J Cancer, 73 261-269

18 Hermeking H, Lengauer C, Polyak K, Zhang L et al 1997, Mol Cell, 1 3-11

19 Irwin M, Mann M С , Philips А С 2000 Nature, 407 645-648

20 Kaghad M, Bonnet H, Yang A et al, 1997 Cell, 90 809-819

21 LaneD 1992 Nature, 358 15-16

22 Matlashewsky GJ, Tuck S, Pim D, Lamb P, Schneider J, Crawford LV 1987 Mol Cel Biol, 7 961-963

23 Melino G , De L ,Vousden K H 2002 Nat Rev Cancer, 2 605-615

24 Michalovitz D, Halevy O, Oren M 1990 Cell, 62 671-680

25 Mukhopadhyay D , Tsiokas L , Sukhatme VP 1995 Cancer Res , 55 6161-6165

26 Perego P , Giarola M , Righetti S C etal 1996,56 556-562

27 Slomiany BA, D'Arigo KI, Kelly MM, Kutz DT 2000 Mol Cell Biol, 20 5986-5997

28 Stiewe T, Theseling CC, Putzer BM 2002 J BiolChem, 277 141777-14185

29 Vossio S, Palescandolo E, PediconiN et al 2002 Oncogene, 21 3796-3803

30 Wahl A F , Donaldson K L , Fairchild C , Lee et al 1996 Nature Med, 2 72-79

31 Wang Q , Zambetti G P , Suttle D P 1997, Mol Cell Biol, 17 389397

Список публикаций по теме диссертации:

1 Vikhanskaya F.L. 1983 Repair of DNA and chromatin structure Review Mutagenesis and repair in virus-cell system Moskva, Nauka, 72-83

2 Ф.Л.Виханская, T В Поспелова, И В Волков, А Н Кукушкин, С Б Светликова, В А Поспелов 1991 Продукт гена р53 вовлечен в регуляцию активности промотора протоонкогена c-fos Доклады Академии наук СССР 321(4) 846-849

3 Vikhanskaya F, Erba Е, D'Incalci М, Broggim М 1994 Introduction of wild-type p53 in a human ovarian cancer cell line not expressing endogenous p53 Nucleic Acids Res 22 1012-1017

4 Vikhanskaya F, D'Incalci M, Broggim M 1995 Decreased cytotoxic effects of doxorubicin in a human ovarian cancer-cell line expressing wild-type p53 and WAF1/CIP1 genes Int J Cancer 61 397-401

5 Gramela Sire E A , Vikhanskaya F , Broggim M 1995 Sensitivity and cellular response to different anticancer agents of a human ovarian

cancer cell line expressing wild-type, mutated or no p53 Ann Oncol 6 589-593

6 Debernardis D , Gramela Sire' E A , De Feudis P , Vikhanskaya F , Valenti M, Russo P , Parodi S , D'Incalci M , Broggini M 1997 P53 status does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel Cancer Res 57 870-874

7 Sandri M I, Isaacs R J , Ongkeko W M , Harris A L , Hickson ID , Broggini M , Vikhanskaya F. 1996 p53 regulates the minimal promoter of the human topoisomerase Ila gene Nucleic Acids Res 24 4464-4470

8 Vikhanskaya F., Clerico L , Valenti M, Stanzione M S , Broggini M , Parodi S and Russo P 1997 Mechanism of resistance to cisplatm in a human ovarian carcinoma cell line selected for resistance to doxorubicin Possible role of p53 Int J Cancer 72 155-159

9 Colella G , Vikhanskaya F , Codegoni A M , Bonazzi C , D'Incalci M, Broggini M 1998 hMLHl and hMSH2 expression and bax frameshift mutations in ovarian cancer cell lines and tumors Carcinogenesis 19 691-694

10 Vikhanskaya F , Vignati S , Beccaglia P , Ottobom C , Russo P , D'Incalci M , Broggini M 1998 Inactivation of p53 in a human ovarian cancer cell line increases the sensitivity to taxol by inducing G2 arrest andapoptosis Exp Cell Res 241 96-101

11 Vikhanskaya F , Colella G , Valenti M , Parodi S , D'Incalci M , Broggini M 1999 Co-operation between p53 and hMLHl in a human colocarcmoma cell line in response to DNA damage Clin Cancer Res 5 937-941

12 Vikhanskaya F, Broggini M 2000 p53 transfectants in ovarian cancer IN Methods in Molecular Medicine Ovarian Cancer Humana Press, Totowa, N J, USA 187-192

13 Vikhanskaya F, D'Incalci M, Broggini M 2000 P73 competes with p53 and attenuates its response in a human ovarian cancer cell line Nucleic Acids Res 28 513-519

14 Damia G, Filiberti L, Taya Y, Vikhanskaya F, D'Incalci M, Broggini M 2001 Different p53 amino terminal phosphorylation induced by cisplatinum and taxol in human cancer cells Neoplasia 3(1) 10-6

15 Vikhanskaya F, Marchini S, Marabese M, Gallien E, Broggini M 2001 p73 alpha overexpression is associated with resistance to treatment with DNA damaging agents m a human ovarian cancer cell line Cancer Res 61 935-938

16 Vikhanskaya F, MR Bam, P Borsotti, C Chilardi, RCeruti, G Ghislem, M Marabese, R Giavazzi, M, Broggini and G Taraboletti

2001 p73 overexpression increases VEGF and reduces thrombospondin-1 production implications for tumor angiogenesis Oncogene 20(50) 7293-300

17 F.Vikhanskaya and M Broggini 2002 Genetic alterations in Ovarian cancer Cell that might Account for Sensitivity to Chemotherapy inpatients International Review of Cytology Vol 219 157-197

18 M Marabese, F. Vikhanskaya, C Rainelli, T Sakay, M Broggini 2003 DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C/EBPa Repression on E2F1 Nucleic acid Research 31(22) 1-9

19 F. Vikhanskaya, MM Siddique, MKLee, M Broggini, K Sabapathy 2005 Evaluation of the combined effect of p53 codon 72 polymorphism and hot-spot mutations in response to anticancer drugs Clinical Cancer Res 11(12) 4348-4356

20 Marabese M, Marchim S, Sabatmo M A Polato F, Vikhanskaya F, Marazzo E, Riccardi E, Scanziani E, Broggini M 2005 Effect of inducible overexpression of DNp73alfa on cancer cell growth and response to treatment in vitro and m vivo Cell Death Differ 12 (7) 805814

21 M Marabese, F.Vikhanskaya, M Broggini 2007 p73 a chiaroscuro gene in cancer Eur J Cancer 43(9) 1361-1372

22 Vikhanskaya F., Ming Kei Lee, M Mazzoletti, M Broggini, Kanaga Sabapathy 2007 Cancer-derived p53 mutants suppress p53-target gene expression-potencial mechanism for gain of function of mutant p53 Nucleic Acid Res 35(6) 2093-104

23 K Hettinger, F. Vikhanckaya, M K Poh, I de Belle, J-T Zhang, Sag Raddy and K Sabapathy 2007 c-Jun promotes cellular survival by suppression of PTEN Cell Death Differentiation 14,218-229

24 Vikhanskaya F., Toh Wen Hong, Iqbal Dullo, Wu Qiang, L Boominathan, Ng Huck Hui, Karen Vousden, Giannino Del Sal and Kanaga Sabapathy 2007 A novel role for p73 m supporting cellular growth through c-Jun-dependent AP-1 transactivation Nature Cell Biol 9(6) 698-706

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 12 09 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 2,0 Тираж 100 Заказ 1935b

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Виханская, Фаина Львовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Белок р53, открытие, структура и его мутации в опухолях

2.2. Функции р53 в регуляции клеточного цикла в нормальных условиях 12 и после действия ДНК-повреждающих агентов. Роль р53 в апоптозе и репарации ДНК.

2.3. Участие р53 в ответе опухолевых клеток на действие 21 противоопухолевых препаратов.

2.4. Белок р73, открытие, структура, р73 сплайсинговые изоформы, 24 экспрессия в опухолях.

2.5. Функции р73, как транскрипционного активатора. Специфические транскрипционные активности сплайсинговых вариантов р73, взаимодействие с р53 и другими клеточными белками. Роль р73 в развитии и туморогенезе на моделях мышей с нокаутом по гену р73 Участие р73 в ответе опухолевых клеток на противоопухолевые препараты.

2.6. Роль изоформ DNp73a и р53 в определении чувствительности клеток 34 к противоопухолевым препаратам.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клеточные линии и их культивирование

3.2. Обработка клеток ДНК-повреждающими агентами

3.3. Плазмиды, трансфекции, селекция клонов и популяций клонов

3.4. Оценка цитотоксического эффекта по методу МТТ

3.5. Оценка цитотоксичности по критерию клоногенности

3.6. Определение апоптоза с использованием Аннексина V

3.7. Нозерн и Саузерн блоттинг

3.8. ОТ-ПЦР

3.9. Определение экспрессии генов микроэррэй анализом

3.10. Определение белка с использованием иммуноблотинга. Антитела, 46 используемые в работе

3.11.Определение про моторной активности с использованием 46 люциферазного метода (Luc-assay) и метода ацетилирования хлорамфеникола (CAT-assay).

3.12. ОТ-ПЦР в реальном времени (real-time RT-PCR)

3.13 Ядер ные экстракты и гель-ретардация

3.14. Определение репарационной способности клеток с использованием метода реактивации поврежденной плазмиды клеткой хозяина

3.15. Иммунофлуоресценция. Иммуногистохимический анализ экспрессии генов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Р53 и контроль клеточного цикла

4.1.1. Создание модели, экспрессирующей температурочувствительный р53. р53 вызывает блок G2 клеточного цикла.

4.1.2. Транскрипция генаp21/wafl может регулироваться по р53 - 57 независимому пути

4.1.3. Р53 подавляет транскрипцию промотора гена Топоизомеразы 2а

4.1.4. Р53 и ответ клеток на действие противоопухолевых препаратов

4.1.4.1. Роль р53 в ответе на обработку доксорубицином

4.1.4.2. Р53 и действие таксола

4.1.4.3. Р53 и ответ на обработку цисплатиной

4.1.4.4. 72 Pro/Arg р53 полиморфизм в сочетании с «горячими» 76 точковыми мутациями в ДНК-связывакяцем домене и чувствительность к ДНК-повреждающим агентам

4.2. Р73 - второй член семейства р

4.2.1. Взаимодействие р73 и р

4.2.2. Р73 и гены репарации ДНК

4.2.3. Р73 и ангиогенез

4.2.3.1. Р73 и регуляция TSP-1 и VEGF

4.2.3.2. Р73 и васкуляризация опухолей in vivo

4.2.4.Регуляция р73 после действия ДНК-повреждающих агентов

4.2.4.1. Индукция р73 РНК и белка

4.2.4.2. Индукция активности промотора после обработки 103 доксорубицином

4.2.4.3. Участие транскрипционного фактора С/ЕВРа в индукции 104 промотора р

4.2.5. Р73а гиперэкспрессия в клетках опухолей яичников и 108 чувствительность к обработкам ДНК-повреждающими агентами

4.2.6. Изоформа DNp73a и ее роль в ответе опухолевых клеток при 111 действии противоопухолевых препаратов

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов"

Актуальность исследования

Несмотря на существенные успехи в лечении опухолевых заболеваний, эта патология продолжает занимать одно из первых мест среди болезней, приводящих к летальному исходу (Cannistra, 1993). Не вызывают сомнения данные о том, что в большинстве случаев на первых этапах лечения достигается положительный химиотерапевтический эффект. Однако выздоровление наступает только у незначительной части больных (Berek et al., 1999). Поэтому усилия многих научных групп направлены на изучение молекулярно-генетических механизмов, ответственных за чувствительность и резистентность опухолей к фармакологическим препаратам, используемым в онкологической практике. Идентифицирована большая группа генов, которые ответственны за чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам разного механизма действия. Среди них особое место занимают гены, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК и апоптоза. Внимание к ним закономерно, так как, с одной стороны, нарушение их экспрессии приводит к нежелательной пролиферации клеток, а с другой — они вовлекаются в ответ клеток на повреждающее или антипролиферативное действие лекарственных препаратов.

Открытие супрессора опухолевого роста — белка р53, нарушение функции которого обнаруживается более чем в 50% опухолей человека (Harris, 1996), закономерно сделало первостепенным изучение его роли в ответе опухолевых клеток на химиотерапевтические воздействия. Накоплен большой экспериментальный материал о связи статуса р53 (нормальный или мутантный) в разных типах опухолей с их чувствительностью к цитостатикам разной природы, показанных для терапии данных типов опухолей. Однако эти данные крайне противоречивы. По-видимому, это связано с существованием множества различных типов мутаций в гене р53, а также наличием полиморфизма.

Наиболее распространенной и изученной является замена 347G/C, приводящая к замене 72 R/P в области, богатой пролином, не нарушающего свойств нормального р53 (Matlashewski et al., 1987).

Возможно, что чувствительность клеток к различным воздействиям зависит от сочетания типа полиморфизма, который несет нормальный белок и мутаций в гене р53, однако эти данные также противоречивы (Bergamaschi et al., 2003; Concin et al., 2005). Вероятно, что в некоторых типах опухолей сочетание 72/R с мутациями в коровом домене приводит к большей резистентности, чем сочетание 72/Р с теми же мутациями. Высоко вероятно, что это может быть следствием взаимодействия мутантного р53 с другим, открытым позже белком р73 (Kaghad et al., 1997), продуктом гена, также принадлежащего семейству р53. Из первичного продукта транскрипции гена р73 в результате альтернативного сплайсинга 5'- и 3'-концов и альтернативного полиаденилирования формируется ряд изоформ р73, которые проявляют в отношении р53 разнонаправленную модулирующую активность (Melino et al., 2002).

Анализ накопленных данных позволяет считать, что ответ опухолевых клеток является специфичным, как для данного типа клеток, так и для данного фармакологического вещества, и связан со специфическими факторами данной клетки, которые могут 2.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Виханская, Фаина Львовна

выводы.

1. Опухолевый супрессор р53 участвует в регуляции клеточного цикла, вызывая блоки G1 и G2 при действии ДНК-повреждающих агентов. Будучи транскрипционным фактором, р53 активирует гены, негативно регулирующие клеточный цикл, такие как р21 Wafl, и репрессирует транскрипцию генов, участвующих в репарации повреждений ДНК, таких как топоизомераза 2а. Установлено, что активация p21Wafi может происходить по р53-независимому механизму.

2. В определенных условиях р53 может не только сенсибилизировать клетки к повреждающим агентам, но и повышать их резистентность. Экспрессия транскрипционно-активного р53 в клетках различных опухолей приводит к повышению резистентности клеток к доксорубицину - ингибитору топоизомеразы 2а, таксолу - агенту, действующему на митотический аппарат, и цисплатине - агенту, вызывающему повреждения ДНК.

3. Наличие полиморфизма в пролин-богатой области белка р53 72P/R в сочетании с определенными «горячими» точковыми мутациями в ДНК-связывающем домене р53 может существенно менять ответ клеток на действие ДНК-повреждающих агентов.

4. Белок р73, относящийся к семейству р53 и имеющий большую степень гомологии с р53, может обладать онкогенными свойствами. Как транскрипционный фактор, р73 способен конкурировать с р53 за регуляторные последовательности, находящиеся в промоторных участках р53-зависимых генов-мишеней, и снижать их транскрипцию.

5. Установлено, что р73 активирует XPD, XPG и ХРВ, принимающие участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК. Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ). р73 усиливает процесс васкуляризации опухолей, повышая экспрессию VEGF и репрессируя антиваскулярный фактор TSP-I.

6. С-ЕВРа, как впервые показано ингибирует активность промотора гена р73, что приводит к подавление его транскрипции. При обработке клеток доксорубицином С-ЕВРа диссоциирует от промотора р73, что приводит к активации промоторной активности.

7. Изоформа р73 - DNp73a, образующаяся при инициации транскрипции с альтернативного промотора и не имеющая транс-активирующего домена, не обладает вследствие этого транскрипционной активностью. Данная изоформа обладает способностью подавлять трансактивирующий потенциал как р53, так и р73. Поскольку DNp73a экспрессируется во многих типах опухолей, предполагалось, что уровень экспрессии DNp73a может модулировать клеточный ответ на действие различных противоопухолевых препаратов. По нашим данным оказывается, что DNp73a не является существенным детерминантом резистентности.

соответствующего типа. Мы наблюдали увеличение резистентности к доксоруб ицину в присутствии дикого типа р53 по сравнению с изогенной линией SKOV3, лишенной продукции р53. Многообразие генов, активируемых р53, становится все более и более очевидным. Наше заключение не кажется совершенно неожиданным после открытия в последнее время нового гена- мишени р53 TIGER (Bensaad et al., 2006). TIGER был открыт в микро-эррэй экспериментах при индукции дикого типар53. Экспрессия этого гена наблюдалась в целом ряде опухолевых клеток. Интересно, что элиминация экспрессии TIGER с помощью техники si-RNA приводила к сенсибилизации опухолевых клеток к доксорубицину. Аналогичные данные о сенсибилизации при удалении р53 к доксорубицину были получены на клетках, лишенных р53 в результате гомологичной рекомбинации в линии НСТ116, относящейся к опухолям кишечника (Bunz et al., 1999). При применении другого противоопухолевого агента - цисплатины, оказалось что в некоторых типах клеток инактивация р53 приводит к сенсибилизации при обработках, что по-видимому связано с неспособностью к репарации повреждений, вызываемых цисплатиной в отсутствии р53. Похожие данные и аналогичные выводы были сделаны в другой работе на клетках опухоли груди MCF7 при обработке цисплатиной (Fan et al., 1995) .Таксол, широко используемый при лечении опухолей яичников и действующий на митотический аппарат клеток, также был включен в наши эксперименты. Мы не обнаружили усиления действия таксола в опухолевых клетках, несущих р53. Как раз наоборот, инактивация р53 приводила к сенсибилизации к таксолу, аналогичные данные приводятся в литературе: элиминация р53 с помощью продукта HPV16 Е6 приводила к повышенной чувствительности к таксолу (Wahl et al., 1996). Мы объясняем наши данные отсутствием блока G1, что приводило к ускоренному вступлению клеток, лишенных р53, в митоз и последующей гибели. Таким образом, не получив данные о том, что присутствие р53 сенсибилизирует опухоли, мы тем не менее делаем важный вывод о том, что следует продолжать поиск важных детерминант, и не основываться только на статусе р53. В 1997 был открыт белок р73, что явилось важным событием для исследователей, исследующих р53. Открытие р73 практически образовало семейство р53, которое теперь все время продолжает увеличиваться и включает в настоящее время рбЗ и многочисленные изоформы р53. р73, имеющий большую гомологию с р53, практически очень редко приобретает мутации при опухолеобразовании.Но, если в нормальных клетках р73 экспрессируется на очень низком уровне, при развитии опухолей его количество сильно повышается. Существует мнение, что обладая структурой и транскрипционными свойства, очень схожими с р53, р73 может взять на себя роль р53 когда р53 больше не функционирует. При исследовании р73а в ответе опухолевых клеток мы применили тот же подход, как и в случае р53: получение изогенных линий. Введение р73а в клетки опухолей яичников А2780 не препятствовало росту клонов. Было логично предположить, что р73, может изменить гибель опухолевых клеток при обработках. Тем более закономерно стало это предположение после открытия того, что р73 может активироваться при действии повреждающих агентов, как и р53 (Yuan et al., 1999); (Costanzo et al., 2002).0казалось, что он активируется не только на уровне белка, но и на уровне промоторной активности (Marabese et al., 2003).Мы впервые показали в нашей работе, что промотор р73 находится под негативной регуляцией транскрипционного фактора СЕВР/а. При обработке доксорубицином происходит отсоединение СЕВР/а от промотора р73 , и происходит активации за счет связывания с позитивным регулятором E2F1. Мы начали наши исследования с целью понять, какую роль может играть р73 в ответе клеток. Мы обнаружили ряд новых свойств этого белка. Оказалось, что р73 может в некоторых типах опухолей конкурировать с р53 за регуляторные последовательности в генах (Vikhanskaya et al., 2000). Наши данные подтверждались и в других работах (Ueda et al., 1999а). Используя технику микроэррэй мы показали, что р73 индуцирует ряд генов, принимающих участие в эксцизионной репарации и может усиливать репарационные способности клеток. Этот факт привел к увеличению резистентности к обработке цисплатиной. В литературе позднее появились аналогичные данные (Nyman et al., 2005). Присутствие р73 активировало ангиогенез в нашей модели опухолей яичников как in vitro так и in vivo. Р73а подавлял продукцию антиангиогенного фактораТ8Р-1 и усиливал продукцию проангиогенного фактора VEGF. В присутствии экспрессии р73а васкуляризация опухолей ус ил ивалас b(Vikhan skaya et al., 2001). В другой работе, выполненной при исследовании миграции клеток,также оказалось, что р73а усиливал этот процесс (Sablina et al., 2003).

Недавно мы показали (Vikhanskaya et al., 2007b), что в присутствии c-jun р73 активирует целый ряд генов, имеющих в промоторе регуляторную последовательность АР-1. Одним из таких генов является циклин Д, способствущий пролиферации клеток. Роль р73 как антионкогена не является очевидной на существующем уровне исследований. В нашей работе мы посвятили особое место изучению одной из изоформ р73: DNp73a, которая присутствует в изобилии во многих опухолях. Эта изоформа была первоначально открыта в нейронах, и оказалось, что она обладает свойством ингибировать апоптозную активность р73 (Pozniak et al., 2000а). Позже высокий уровень ANp73a нашли в опухолях (Ishimoto et al., 2002а). Существуют клинические данные о том, что экспрессия этой формы является показателем плохого прогноза для пациентов, имеющих патологию опухолей яичников. Нами была создана тетрациклин- индуцируемая форма DNp73a в клетках опухолей кишечника и проверена чувствительность к различным химитерапевтическим агентам (Marabese et al., 2005). К сожалению, оказалось, что обладая способностью подавлять активность р53, изоформа DNp73a, исследованная в нашей работе, не влияет на окончательный ответ клетки, и не может являться определяющим детерминантом в чувствительности. Особенно трудно сделать заключение об увеличении чувствительности в результате экспрессии дикого типа р53 и р73 при анализе результатов, полученых на опухолях яичников. Этот тип новообразований отличается очень низким уровнем апоптоза по сравнению с другими видами новообразований. Отсутствие апоптоза, и присутствии р53 может усилить репарационные процессы и увеличение резистентности. В целом "реставрация " апоптозного фенотипа может кардинально усилить чувствительность опухолевых клеток. Пути реставрации апоптоза интенсивно изучаются. Следует ясно представлять, что если имеются опухоли, которые сохраняют дикий типр53, и таких примеров немало, в клетках в процессе карциногенеза произошли изменения, сделавшие р53 неспособным к своим обычным функциям. Вполне вероятно, что эти нарушения, которые могут быть как в трансактивационных путях, стоящих выше р53, так и на уровне передачи информации на гены мишени р53 и являются причиной того, что присутствие дикого типар53 не является фактором, способствующим гибели опухолевых клеток.

Комбинирование классических хемотерапевтических лекарств с агентами, которые могут изменить сигнальные пути, нарушенные в клетках опухолей яичников, является очень перспективным подходом. Нахождение генетических дефектов и характеристика новых генов может помочь в определении более эффективной стратегии, принимающей во внимание генетические изменения. Исследования экпрессии генов на различных стадиях развития опухолей на клиническом оперативном материале с применением техники микроэррэй и Реал тайм ОТ ПЦР и выявление новых мишений в настоящее время является одним из самых многообещающих подходов. Это позволяет выявить широкий спектр изменений, применение современных методов статистики дает объективную оценку результатов.

Очевидно, что определение статуса р53 и р73 в опухолях не является само по себе достаточным для прогноза и выбора лечения. Более того, в самое последнее время стало очевидно, что семейство р53 содержит множество изоформ, которые проявляют антагонизм по отношению к дикому типу р53 (Bourdon et al., 2005). Это еще большее усложняет картину. Становится ясно, что не одни мутации в р53, а даже члены того же семейства, экспрессирующиеся в некоторых типах опухолей, обладают доминантно-негативной активностью по отношению к р53. К настоящему времени еще не существует набор антител к р53, который бы позволил достоверно дифференцировать эти изоформы. Поиск генетических детерминант, которые могут надежно быть использованы в клиники для определения типа лечения все время продолжается. Очевидно, требуется индивидульный подход в каждом особом случае и необходимы дальнейшие поиски специфических препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Виханская, Фаина Львовна, Санкт-Петербург

1. Ф.Л.Виханская, Т.В.Поспелова, И.В.Волков, А.Н.Кукушкин, С.Б.Светликова, В.А.Поспелов. (1991).Продукт генар53 вовлечен в регуляцию активности промотора протоонкогена c-fos. Доклады Академии наук СССР. 321(4); 846-9.1. Reference List

2. Agarwal,M.L., Agarwal,A., Taylor,W.R., and Stark,G.R. (1995). p53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 8493-8497.

3. Ando,T., Kawabe,T., Ohara,H., Ducommun,B., Itoh,M., and Okamoto,T. (2001). Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage. J. Biol. Chem. 276,42971-42977.

4. Banin,S., Moyal,L., Shieh,S., Taya,Y., Anderson,C.W., Chessa,L., Smorodinsky,N.I., Prives,C., Reiss,Y., Shiloh,Y., and Ziv,Y. (1998). Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281,1674-1677.

5. Belloni,L., Moretti,F., Merlo,P., Damalas,A., Costanzo,A., Blandino,G., and Levrero,M. (2006). DNp73alpha protects myogenic cells from apoptosis.Oncogene. 25,3606-3612.

6. Benoit,V., Hellin,A.C., Huygen,S., Gielen,J., Bours,V., and Merville,M.P. (2000). Additive effect between NF-kappaB submits and p53 protein for transcriptional activation of human p53 promoter. Oncogene. 19, 4787-4794.

7. Bensaad,K., Tsuruta,A., Selak,M.A., Vidal,M.N., Nakano,K., Bartrons,R., Gottlieb,E., and Vousden,K.H. (2006). TIGAR, a p53-inducible regulator of glycolysis and apoptosis. Cell. 126, 107-120.

8. Bergamaschi,D., Gasco,M., Hiller,L., Sullivan,A., Syed,N., Trigiante,G., Yulug,I., Merlano,M., Numico,G., Comino,A., Attard,M., Reelfs,0., Gusterson,B., Bell,A.K., Heath,V., Tavassoli,M.,

9. Farrell,P.J., Smith,P., Lu,X., and Crook,T. (2003b). p53 polymorphism influences response in cancer chemotherapy via modulation of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell .5, 387-402.

10. Blagosklonny,M.V., Schulte,T.W., Nguyen,P., MimnaughJB.G., Trepel,J., and Neckers,L. (1995). Taxol induction of p21 WAF1 and p53 requires c-raf-1. Cancer Res. 55,4623-4626.

11. Bourdon,J.C., Fernandes,K., Murray-Zmijewski,F., Liu,G., Diot,A., Xirodimas,D.P., Saville,M.K., and Lane,D.P. (2005). p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19,2122-2137.

12. Braithwaite,A.W., Del Sal,G., and Lu,X. (2006). Some p53-binding proteins that can function as arbiters of life and death. Cell Death. Differ. 13,984-993.

13. Browder,T., Folkman,J., Hahnfeldt,P., Heymach,J., Hlatky,L., Kieran,M., and Rogers,M.S. (2002). Antiangiogenic therapy and p53. Science. 297,471.

14. Bunz,F., Dutriaux,A., Lengauer,C., Waldman,T., Zhou,S., Brown,J .P., Sedivy,J.M., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1998). Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science .282,1497-1501.

15. Bunz,F., Hwang,P.M., Torrance,C., Waldman,T., Zhang,Y., Dillehay,L., Williams,J., Lengauer,C., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1999). Disruption ofp53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents. J. Clin. Invest .104,263-269.

16. CaelIes,C., Helmberg,A., and Karin,M. (1994). p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation ofp53-target genes. Nature.57(9,220-223.

17. Carrassa,L., Broggini,M., Vikhanskaya,F., and Damia,G. (2003). Characterization of the 5'flanking region of the human Chkl gene: identification ofE2Fl Junctional sites Cell Cycle. 2,604-609.

18. Cassinelli,G., Supino,R., Perego,P., Polizzi,D., Lanzi,C., Pratesi,G., and Zunino,F. (2001). A role for loss ofp53 function in sensitivity of ovarian carcinoma cells to taxanes. Int. J. Cancer. 92, 738-747.

19. Codegoni,A.M., Bertoni,F., Patregnani,C., Marinetti,E., D'Incalci,M., and BrogginiJVL (1999). Allelic expression of p73 in human ovarian cancers Ann. Oncol. 10,949-953.

20. Colella,G., Vikhanskaya,F., Codegoni,A.M., Bonazzi,C., D'Incalci,M., and Broggini,M. (1998). hMLHl and hMSH2 expression and BAX frameshift mutations in ovarian cancer cell lines and tumors.Carcinogenesis. 19,691-694.

21. Dameron,K.M., Volpert,O.V., Tainsky,M.A., and Bouck,N. (1994). Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation ofthrombospondin-1. Science 265,1582-1584.

22. Damia,G., Filiberti,L., Vikhanskaya,F., Carrassa,L., Taya,Y., D'Incalci,M., and Broggini,M. (2001). Cisplatinum and taxol induce different patterns ofp53 phosphorylation. Neoplasia. 3,1016.

23. Davison,T.S., Vagner,C., Kaghad,M., Ayed,A., Caput,D., and Arrowsmith,C.H. (1999). p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interactions with each other but not with p53. J. Biol. Chem. 274, 18709-18714.

24. Debernardis,D., Sire,E.G., De Feudis,P., Vikhanskaya,F., VaIenti,M., RussoJP., Parodi,S., D'Incalci,M., and BrogginiJVL (1997). p53 status does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel. Cancer Res. 57, 870-874.

25. Di Como,C.J., Gaiddon,C., and Prives,C. (1999). p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 19,1438-1449.

26. Downes,C.S., Clarke,DJ., Mullinger,A.M., Gimenez-Abian,J.F., Creighton,A.M., and Johnson,R.T. (1994). A topoisomerase II-dependent G2 cycle checkpoint in mammalian cells/. Nature. 372,467-470.

27. El Deiry,W.S., Tokino,T., Velculescu,V.E., Levy,D.B., Parsons,R., Trent,J.M., Lin,D., Mercer,W.E., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1993). WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell .75, 817-825.

28. Eliyahu,D., Michalovitz,D., Eliyahu,S., Pinhasi-Kimhi,0., and Oren,M. (1989). Wild-type p53 can inhibit oncogene-mediated focus formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 8763-8767.

29. Fan,S., Smith,M.L., Rivet,D.J., Duba,D., Zhan,Q., Kohn,K.W., Fornace AJ-, Jr., and O'connor,P.M. (1995). Disruption ofp53 function sensitizes breast cancer MCF-7 cells to cisplatin and pentoxifylline. Cancer Res. 55, 1649-1654.

30. Fink,D., Aebi,S., and Howell,S.B. (1998). The role of DNA mismatch repair in drug resistance. Clin. Cancer Res. 4, 1-6.

31. Finlay,C.A., Hinds,P.W., and Levine,A.J. (1989). The p53 proto-oncogene can act as a suppressor of transformation. Cell .57,1083-1093.

32. Flores,E.R., Tsai,K.Y., Crowley,D., Sengupta,S., Yang,A-, McKeon,F., and Jacks,T. (2002). p63 and p73 are required for p53-dependent apoptosis in response to DNA damage. Nature.476, 560564.

33. Folkman,J. and Hanahan,D. (1991). Switch to the angiogenic phenotype during tumorigenesis. Princess Takamatsu Symp. 22,339-347.

34. Frazier,M.W., He,X., Wang,J., Gu,Z., Cleveland,J.L., and Zambetti,G.P. (1998). Activation of c-myc gene expression by tumor-derived p53 mutants requires a discrete C-terminal domain. Mol. Cell Biol. 18, 3735-3743.

35. Gatz,S.A. and Wiesmuller,L. (2006). p53 in recombination and repair. Cell Death. Differ. 13, 1003-1016.

36. Giannakakou,P., Sackett,D.L., Ward,Y., Webster,K.R., Blagosklonny,M.V., and Fojo,T. (2000). p53 is associated with cellular microtubules and is transported to the nucleus by dynein. Nat. Cell Biol. 2, 709-717.

37. Giono,L.E. and Manfredi,J.J. (2006). The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle checkpoints. J. Cell Physiol. 209, 13-20.

38. Gong,J.G., Costanzo,A., Yang,H.Q., Melino,G., Kaelin,W.G., Jr., Levrero,M., and Wang,J.Y. (1999). The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. Nature .399, 806-809.

39. Gonzalez,S., Prives,C., and Cordon-Cardo,C. (2003). p73alpha regulation by Chkl in response to DNA damage. Mol. Cell Biol. 23, 8161-8171.

40. Gottifredi,V., Kami-Schmidt,О., Shieh,S.S., and Prives,C. (2001). p53 down-regulates CHK1 through p21 and the retinoblastoma protein. Mol. Cell Biol. 21,1066-1076.

41. Graniela Sire,E.A., Vikhanskaya,F., and Broggini,M. (1995). Sensitivity and cellular response to different anticancer agents of a human ovarian cancer cell line expressing wild-type, mutated or no p53. Ann. Oncol. 6, 589-593.

42. Gregoiy,R.E. and DeLisa,A.F. (1993). Paclitaxel: a new antineoplastic agent for refractoiy ovarian cancer. Clin. Pharm. 12,401-415.

43. Gudkov,A.V. and Komarova,E.A. (2005). Prospective therapeutic applications ofp53 inhibitors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 726-736.

44. Harris,С .С. (1996). Structure and function of the p53 tumor suppressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1442-1455.

45. Haupt,Y., Maya,R., Kazaz,A., and Oren,M. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53.Nature. 387, 296-299.

46. Hermeking,H., Lengauer,C., Polyak,K., He,T.C., Zhang,L., Thiagalmgam,S., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1997). 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol. Cell i, 3-11.

47. Hochhauser,D., Stanway,C.A., Harris,A.L., and Hickson,I.D. (1992a). Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the human topoisomerase II alpha gene. J. Biol. Chem. 267, 18961-18965.

48. Hochhauser,D., Stanway,C.A., Harris,A.L., and Hickson,I.D. (1992b). Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the human topoisomerase П alpha gene J. Biol. Chem. 267,18961-18965.

49. Jost,C.A., Marin, M.C., and Kaelin,W.G., Jr. (1997). p73 is a simian correction of human. p53-related protein that can induce apoptosis. Nature. 389, 191-194.

50. Kastan,M.B., 0nyekwere,0., Sidransky,D., Vogelstein,B., and Craig,R.W. (1991). Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51, 6304-6311.

51. Kern,S.E., Kinzler,K.W., Baker,S.J., Nigro,J.M., Rotter,V., Levine,A.J., Friedman,P., Prives,C., and Vogelstein,B. (1991). Mutant p53 proteins bind DNA abnormally in vitro. Oncogene. 6, 131-136.

52. Kovalsky,0., Lung,F.D., Roller,P .P., and Fornace,A.J., Jr. (2001). Oligomerization of human Gadd45a protein. J. Biol. Chem. 276, 39330-39339.

53. Mai,M., Yokomizo,A., Qian,C., Yang,P., Tindall,D.J., Smith,D.I., and Liu,W. (1998). Activation of p73 silent allele in lung cancer. Cancer Res. 58, 2347-2349.

54. Maisse,C., Munarriz,E., Barcaroli,D., Melino,G., and De,L., V (2004). DNA damage induces the rapid and selective degradation of the DeltaNp73 isoform, allowing apoptosis to occur. Cell Death. Differ. 11, 685-687.

55. Maltzman,W. and Czyzyk,L. (1984). UV irradiation stimulates levels ofp53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol. Cell Biol. 4, 1689-1694.

56. Mantovani,F., Piazza,S., Gostissa,M., Strano,S., Zacchi,P., Mantovani,R., Blandino,G., and Del Sal,G. (2004). Pinl links the activities ofc-Abl andp300 in regulating p73 function. Mol. Cell 14, 625-636.

57. Marabese,M., Vikhanskaya,F., and Broggini,M. (2007). p73: A chiaroscuro gene in cancer. Eur. J. Cancer. ¥3(9):1361-72.

58. Marabese,M., Vikhanskaya,F., Rainelli,C., Sakai,T., and Broggini,M. (2003). DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPalpha repression on E2F1. Nucleic Acids Res. 31,6624-6632.

59. Melino,G., Bernassola,F., Ranalli,M., Yee,K., Zong,W.X., Corazzari,M., Knight,R.A., Green,D.R., Thompson,C., and Vousden,K.H. (2004). p73 Induces apoptosis via PUMA transactivation and Bax mitochondrial translocation. J. Biol. Chem. 279,8076-8083.

60. Michalovitz,D., Halevy,0., and Oren,M. (1990). Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature-sensitive mutant of p53. Cell.62,671-680.

61. Moll,U.M., Erster,S., and Zaika,A. (2001). p53, p63 and p73--solos, alliances and feuds among family members. Biochim. Biophys. Acta./5.52,47-59.

62. Moll,U.M., Wolff,S., Speidel,D., and Deppert,W. (2005). Transcription-independent pro-apoptotic functions ofp53. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 631-636.

63. MukhopadhyayJD., Tsiokas,L., and Sukhatme,V.P. (1995). Wild-type p53 and v-Src exert opposing influences on human vascular endothelial growth factor gene expression. Cancer Res. 55,6161-6165.

64. Murphy,M., Ahn,J., Walker,K.K., Hoffman,W.H., Evans,R.M., Levine,A.J., and George,D.L.1999). Transcriptional repression by wild-type p53 utilizes histone deacetylases, mediated by interaction with mSin3a. Genes Dev. 13,2490-2501.

65. Murphy,M.E. (2006). Polymorphic variants in the p53 pathway.Cell Death. Differ. 13, 916-920.

66. Ng,S.W., Yiu,G.K., Liu,Y., Huang,L.W., Palnati,M., Jun,S.H., Berkowitz,R.S., and Mok,S.C.2000). Analysis of p73 in human borderline and invasive ovarian tumor. Oncogene .19,18851890.

67. Nyman,U., Sobczak-Pluta,A., Vlachos,P., Perlmann,T., Zhivotovsky,B., and Joseph,B. (2005). Full-length p73alpha represses drug-induced apoptosis in small cell lung carcinoma cells. J. Biol. Chem. 280, 34159-34169.

68. O'connor,P.M., Jackman,J., Jondle,D., Bhatia,K., Magrath,L, and Kohn,K.W. (1993). Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines. Cancer Res. 53,4776-4780.

69. Offer,H., Zurer,I., Banfalvi,G., RehaT^M., Falcovitz,A., Milyavsky,M., Goldfinger,N., and Rotter,V. (2001). p53 modulates base excision repair activity in a cell cycle-specific manner after genotoxic stress. Cancer Res. 61, 88-96.

70. Oren,M. (1985). The p53 cellular tumor antigen: gene structure, expression and protein properties. Biochim. Biophys. Acta .823, 67-78.

71. Osada,M., Park,H.L., Nagakawa,Y., Begum,S., Yamashita,K., Wu,G., Kim,M.S., Trink,B., and Sidransky,D. (2006). A novel response element confers p63- and p73-specific activation of the WNT4 promoter. Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 1120-1128.

72. Petty,R.D., Cree,I.A., Sutherland,L.A., Hunter,E.M., Lane,D.P., Preece,P.E., and Andreotti,P.E. (1994). Expression of the p53 tumour suppressor gene product is a determinant of chemosensitivity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199,264-270.

73. Pozniak,C.D., Radinovic,S., Yang,A., McKeon,F., Kaplan,D.R., and Miller,F.D. (2000a). An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science. 289,304-306.

74. Pozniak,C.D., Radinovic,S., Yang,A., McKeon,F., Kaplan,D.R., and Miller,F.D. (2000b). An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science. 289,304-306.

75. Raycroft,L., Wu,H.Y., and Lozano,G. (1990). Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. Science. 249,1049-1051.

76. Roemer,K. (1999). Mutant p53: gain-of-function oncoproteins and wild-type p53 inactivators Biol. Chem. 380, 879-887.

77. Sablina,A.A., Chumakov,P.M., and Kopnin,B.P. (2003). Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration. J. Biol. Chem. 278, 27362-27371.

78. Sanchez-Prieto,R., Rojas,J.M., Taya,Y., and Gutkind,J.S. (2000). A role for the p38 mitogen-acitvated protein kinase pathway in the transcriptional activation ofp53 on genotoxic stress by chemotherapeutic agents. Cancer Res. 60,2464-2472.

79. Sandri,M.I., Isaacs,R.J., Ongkeko,W.M., Harris,A.L., Hickson,I.D., Broggini,M., and Vikhanskaya,F. (1996). p53 regulates the minimal promoter of the human topoisomerase Ilalpha gene.Nucleic Acids Res. 24, 4464-4470.

80. Scian,M.J., Stagliano,K.E., Ellis,M.A., Hassan,S., BowmanJVl., Miles,M.F., Deb,S.P., and Deb,S. (2004). Modulation of gene expression by tumor-derived p53 mutants. Cancer Res. 64, 7447.7454.

81. Sherr,C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science. 274,1672-1677.

82. Sigal,A. and Rotter,V. (2000). Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome. Cancer Res. 60, 6788-6793.

83. Slade,N., Zaika,A.I., Erster,S., and Moll,U.M. (2004). DeltaNp73 stabilises TAp73 proteins but compromises their function due to inhibitory hetero-oligomer formation. Cell Death. Differ. 11, 357-360.

84. SIomiany,B.A., D'Arigo,K.L., Kelly,M.M., and Kurtz,D.T. (2000). C/EBPalpha inhibits cell growth via direct repression of E2F-DP-mediated transcription. Mol. Cell Biol. 20, 5986-5997.

85. Stewart,N., Hicks,G.G., Paraskevas,F., and Mowat,M. (1995). Evidence for a second cell cycle block at G2/M by p53. Oncogene. 10, 109-115.

86. Stiewe,T. and Putzer,B.M. (2000). Role of the p53-homologue p73 in E2Fl-induced apoptosis. Nat. Genet. 26,464-469.

87. Stiewe,T., Zimmermann,S., Frilling,A., Esche,H., and Putzer,B.M. (2002). Transactivation-deficient DeltaTA-p73 acts as an oncogene. Cancer Res. 62, 3598-3602.

88. Sun,X., Shimizu,H., and Yamamoto,K. (1995). Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol. Cell Biol. 15, 4489-4496.

89. Sunahara,M., Ichimiya,S., Nimura,Y., Takada,N., Sakiyama,S., Sato,Y., Todo,S., Adachi,W., Amano,J., and Nakagawara,A. (1998). Mutational analysis of the p73 gene localized at chromosome lp36.3 in colorectal carcinomas. Int. J. Oncol. 13,319-323.

90. Tanaka,H., Arakawa,H., Yamaguchi,T., Shiraishi,K., Fukuda,S., Matsui,K., Takei,Y., and Nakamura,Y. (2000). A ribonucleotide reductase gene involved in a p53-dependent cell-cycle checkpoint for DNA damage. Nature. 404, 42-49.

91. Tanaka,Y., Kameoka,M., Itaya,A., Ota,K., and Yoshihara,K. (2004). Regulation of HSF1-responsive gene expression by N-terminal truncated form of p73alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 317, 865-872.

92. Taraboletti,G., Roberts,D., Liotta,L.A., and Giavazzi,R. (1990). Platelet thrombospondin modulates endothelial cell adhesion, motility, and growth: a potential angiogenesis regulatory factor. J. Cell Biol. Ill, 165-112.

93. Taylor,W.R., DePrimo,S.E., Agarwal,A., Agarwal,M.L., Schonthal,A.H., Katula,K.S., and Stark,G.R. (1999). Mechanisms of G2 arrest in response to overexpression of p53. Mol. Biol. Cell. 10, 3607-3622.

94. Toh,W.H., Siddique,M.M., Boominathan,L., Lin,K.W., and Sabapathy,K. (2004). c-Jun regulates the stability and activity of the p53 homologue, p73. J. Biol. Chem. 279,44713-44722.

95. Tomkova,K., El Rifai,W., Vilgelm,A., Kelly,M.C., Wang,T.C., and Zaika,A.I. (2006). The gastrin gene promoter is regulated by p73 isoforms in tumor cells. Oncogene. 25, 6032-6036.

96. Ueda,Y., Hijikata,M., Takagi,S., Chiba,T., and Shimotohno,K. (1999a). New p73 variants with altered C-terminal structures have varied transcriptional activities. Oncogene .18,4993-4998.

97. Ueda,Y., Hijikata,M., Takagi,S., Chiba,T., and Shimotohno,K. (1999b). New p73 variants with altered C-terminal structures have varied transcriptional activities. Oncogene. 18, 4993-4998.

98. Ventura,A., Kirsch,D.G., McLaughlin,M.E., Tuveson,D.A., Grimm,J., Lintault,L., Newman,J., Reczek,E.E., Weissleder,R., and Jacks,T. (2007). Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature .445, 661-665.

99. Vikhanskaya,F. and Broggini,M. (2002). Genetic alterations in ovarian cancer cells that might account for sensitivity to chemotherapy in patients. Int. Rev. Cytol. 219,157-198.

100. Vikhanskaya,F., Colella,G., Valenti,M., Parodi,S., D'Incalci,M., and Broggini,M. (1999). Cooperation between p53 and hMLHl in a human colocarcinoma cell line in response to DNA damage.Clin. Cancer Res. 5, 937-941.

101. Vikhanskaya,F., D'Incalci,M., and Broggini,M. (1995). Decreased cytotoxic effects of doxorubicin in a human ovarian cancer-cell line expressing wild-type p53 and WAF1/CIP1 genes.Int. J. Cancer .61,397-401.

102. Vikhanskaya,F., D'Incalci,M., and Broggini,M. (2000). p73 competes with p53 and attenuates its response in a human ovarian cancer cell line. Nucleic Acids Res. 28,513-519.

103. Vikhanskaya,F., Erba,E., D'Incalci,M., and Broggini,M. (1996). Changes in cyclins and cyclin-dependent kinases induced by DNA damaging agents in a human ovarian cancer cell line expressing mutated or wild-type P53. Exp. Cell Res. 227, 380-385.

104. Vikhanskaya,F., Lee,M.K., Mazzoletti,M., Broggini,M., and Sabapathy,K. (2007a). Cancer-derived p53 mutants suppress p53-target gene expression—potential mechanism for gain of function of mutant p53. Nucleic Acids Res. 35,2093-2104.

105. Vikhanskaya,F., Marchini,S., Marabese,M., Galliera,E., and Broggini,M. (2001b). P73a overexpression is associated with resistance to treatment with DNA-damaging agents in a human ovarian cancer cell line. Cancer Res. 61,935-938.

106. Vikhanskaya,F., Siddique,M.M., Kei,L.M., Broggini,M., and Sabapathy,K. (2005). Evaluation of the combined effect of p53 codon 72 polymorphism and hotspot mutations in response to anticancer drugs. Clin. Cancer Res. 11,4348-4356.

107. Vikhanskaya,F., Toh,W.H., Dulloo,I., Wu,Q., Boominathan,L., Ng,H.H., Vousden,K.H., and Sabapathy,K. (2007b). p73 supports cellular growth through c-Jun-dependent AP-1 transactivation. Nat. Cell Biol. 5,698-706.

108. Vikhanskaya,F.L., Khrebtukova,I.A., and Manuilova,E.S. (1985). Semi-conservative synthesis of DNA in UV-sensitive mutant cells of Chinese hamster after UV-irradiation Mutat. Res. 149, 271-273.

109. Viktorsson,K., De Petris,L., and Lewensohn,R. (2005). The role ofp53 in treatment responses of lung cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 868-880.

110. Vossio,S., Palescandolo,E., Pediconi,N., Moretti,F., Balsano,C., Levrero,M., and CostanzoA (2002a). DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene. 21, 3796-3803.

111. Vossio,S., Palescandolo,E., Pediconi,N., Moretti,F., Balsano,C., Levrero,M., and Costanzo,A. (2002b). DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene .21, 3796-3803.

112. Vousden,K.H. (2006). Outcomes of p53 activation-spoilt for choice. J. Cell Sci. 119,50155020.

113. Vousden,K.H. and Lu,X. (2002). Live or let die: the cell's response to p53. Nat. Rev. Cancer. 2, 594-604.

114. Wahl,A.F., Donaldson,K.L., Fairchild,C., Lee,F.Y., Foster,S.A., Demers,G.W., and Galloway,D.A. (1996). Loss of normal p53 function confers sensitization to Taxol by increasing G2/M arrest and apoptosis. Nat. Med. 2,72-79.

115. Wakasugi,T., lzumi,H., Uchiumi,T., Suzuki,H., Arao,T., Nishio,K., and Kohno,K. (2007). ZNF143 interacts with p73 and is involved in cisplatin resistance through the transcriptional regulation of DNA repair genes Oncogene.26,5194-203.

116. Waldman,T., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1995). p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res. 55, 5187-5190.

117. Wang,Q., Zambetti,G.P., and Suttle,D.P. (1997). Inhibition of DNA topoisomerase II alpha gene expression by thep53 tumor suppressor. Mol. Cell Biol. 17, 389-397.

118. Wang,X.W., Zhan,Q., Coursen,J.D., Khan,M.A., Kontny,H.U., Yu,L., Hollander,M.C., O'connor,P.M., Fornace,A.J., Jr., and Harris,C.C. (1999). GADD45 induction of a G2/M cell cycle checkpoint. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A .96,3706-3711.

119. Xue,W., Zender,L., Miething,C., Dickins,R.A., Hernando,E., Krizhanovsky,V., Cordon-Cardo,C., and Lowe,S.W. (2007). Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature .445,656-660.

120. Yaginuma,Y. and Westphal,H. (1992). Abnormal structure and expression of the p53 gene in human ovarian carcinoma cell linesCancer Res. 52,4196-4199.

121. Yuan,Z.M., Shioya,H., Ishiko,T., Sun,X., Gu,J., Huang,Y.Y., Lu,H., Kharbanda,S., Weichselbaum,R., and Kufe,D. (1999). p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature. 399, 814-817.

122. Zacchi,P., Gostissa,M., Uchida,T., Salvagno,C., Avolio,F., Volinia,S., Ronai,Z., Blandino,G., Schneider,C., and Del Sal,G. (2002). The prolyl isomerase Pinl reveals a mechanism to control p53 functions after genotoxic insults. Nature .419,853-857.

123. Zhou,J., Ahn,J., Wilson,S.H., and Prives,C. (2001). A role for p53 in base excision repair. EMBO J. 20, 914-923.

124. Zurer,!., Hofseth,L J., Cohen,Y., Xu-Welliver,M., Hussain,S.P., Harris,C.C., and Rotter,V. (2004). The role of p53 in base excision repair following genotoxic stress. Carcinogenesis. 25, 11-19.1. ЛИСТ СОКРАЩЕНИЙ

125. ГЩР полимеразная цепная реакция

126. ОТ-ПЦР обратной транскрипции- полимеразная цепная реакция1. АТР аденозин 5 'трифосфат

127. Aip4/Itch протеин из семейства ЕЗ лигаз

128. ASPP белки, стимулирующие апоптоз

129. BER эксцизионная репарация основанийп.о. пары основанийт.п.о. тысяча пар оснований

130. CAT хлорамфениколацетилтрансфераза

131. С/ЕВРа ССААТ/энхансер связывающий белок1. DMSO диметилсульфоксид

132. DNp73 доминантно-негативная форма р731. DTT дитиотритол

133. HAT гистон-ацетилтрансферазыhTERT человеческая теломер-обратная транскриптаза

134. EDTA этилендиаминотетраацетиловая кислота1. KJD тысяча килодальтон

135. NEDD8 убиквитин (иЬ)-зависимый посттрансляционныймодификатор1. OD оптическая плотность

136. PAGE электрофорез в полиакриламидном геле

137. PBS солевой изотонический раствор фосфатного буфера

138. PMSF фенилметилсульфонилфлуорид

139. PTEN фосфатаза и гомолог тензина

140. SDS додецил сульфат натрия

141. TGFp фактор роста опухолей

142. TSP-1 тромбоспондин-1- антиангиогенный фактор TEMED N ',N,N ',N 'тетраметилэтилендиамин

143. UbcH5B/С Убиквитин-коньюгированный энзим UbcH5B/C VEGF васкулоендотелиальный ростовый фактор YB1 транскрипционный фактор член Y- бокс семейства.

144. Y-бокс элемент (CYE), включает Y-бокс и прилежащую 3 'инвертированную последовательность Wt дикий тип