Экспрессия и функции генов семейства p53 в опухолях желудочно-кишечного тракта

Вильгельм, Анна Эдгартовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия и функции генов семейства p53 в опухолях желудочно-кишечного тракта
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия и функции генов семейства p53 в опухолях желудочно-кишечного тракта"

На правах рукописи

ВИЛЬГЕЛЬМ Анна Эдгартовна

ЭКСПРЕССИЯ и ФУНКЦИИ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА р53 в ОПУХОЛЯХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 ш 2010

Москва-2010

004615688

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и в Лаборатории хирургического отделения медицинского центра Университета Вандербилт.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Прасолов Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН Киселёв Фёдор Львович

доктор биологических наук, профессор Чумаков Пётр Михайлович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН

Защита диссертации состоится « » й-слХ2010 г. в 14 - ч на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «

2010 г

Ученый секретарь Диссертационного са

кандидат химических наук

А.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) являются одной из наиболее распространенных причин смерти в нашей стране. В России ежегодно регистрируется 126,5 тысяч новых случаев рака ЖКТ, что составляет около 30% от всех онкологических заболеваний. При этом среди всех злокачественных новообразований ЖКТ наиболее часто регистрируются рак желудка, колоректальный рак, а также рак пищевода и поджелудочной железы. Безусловно, проблемы лечения этой категории больных постоянно находятся в центре внимания онкологов. Несмотря на то, что достижения современной биомедицины позволили увеличить продолжительность жизни пациентов, химиотерапевтическое лечение опухолей ЖКТ остается по сегодняшний день недостаточно эффективным.

Опухолевый супрессор р53 играет существенную роль в ответе клеток на химиотерапевтическое воздействие. Активируясь в ответ на клеточный стресс, в частности, стресс, обусловленный действием химиотерапевтических препаратов, белок р53 регулирует транскрипцию генов, запускающих процессы апоптоза и/или ареста клеточного цикла. Существенно, что инактивация белка р53 в результате мутаций его гена обнаруживается примерно в половине всех случаев опухолей ЖКТ человека. Неудивительно поэтому, что опубликовано множество работ, в которых исследовали связь мутационного статуса р53 в разных типах опухолей с их чувствительностью к противоопухолевым препаратам. Однако данные этих исследований крайне противоречивы. Проведенный недавно статистический мета-анализ этих данных не выявил прогностической значимости мутационного статуса р53 для определения чувствительности опухолей к химиотерапии. Вероятно, это объясняется тем, что активность р53 - далеко не единственный фактор клеточного ответа на химиотерапию. В научной литературе накапливаются данные, свидетельствующие, что не только белок р53, но и другие члены семейства -белки рбЗ и р73 - могут играть роль в регуляции вызванного химиотерапией апоптоза и ареста клеточного цикла. В отличие от р53, функции белков рбЗ и р73 недостаточно полно изучены. В силу этого очевидна актуальность данного исследования, направленного на выяснение молекулярных механизмов функционирования белков рбЗ и р73.

Гены ТР63 и ТР73 направляют синтез множества белковых продуктов (изоформ) вследствие процессов альтернативного сплайсинга, наличия двух промоторов и альтернативной точки начала трансляции. В соответствии с наличием или отсутствием трансактивационного домена (ТАД) на N-конце изоформ рбЗ и р73 их подразделяют на Транскрипционно-Активные (ТА) изоформы и изоформы, у которых ТАД на N-конце отсутствует (ДТА или ДМ). В соответствии со строением С-конца белковой молекулы выделяют девять изоформ р73 (р73а, р, у, 5, е, 0, <р, q иг|1 ) и три изоформы рбЗ (рбЗа, Риу ). Изоформы рбЗ и р73 различаются по транскрипционной активности, а иногда даже противоположны по свойствам. Изоформы, содержащие ТАД (ТАрбЗ и ТАр73), сходны с р53 по активности и, вероятно, участвуют в опухолевой

супрессии. Изоформы без трансактивационного домена (ДЫрбЗ и ANp73) могут подавлять активность ТА изоформ и р53, т.е. имеют доминантно-негативное действие. По крайней мере для одной из них (ANp73a) описаны онкогенные свойства.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение роли всех генов семейства р53 в опухолевой прогрессии и в химиотерапевтической чувствительности злокачественных новообразований ЖКТ. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать экспрессию белков семейства р53 и ее ассоциацию с клинико-патологическими параметрами в первичных опухолях ЖКТ;

2. Выявить механизм регуляции синтеза про-опухолевых ANp73 изоформ в клетках ЖКТ;

3. Проанализировать влияние белков семейства р53 на доставку лекарственных препаратов в опухолевые клетки. В частности, оценить их роль в регуляции экспрессии гена mdrl - важного эффектора множественной лекарственной устойчивости;

4. Исследовать влияние белков семейства р53 и взаимодействий между ними на химиотерапевтический ответ опухолевых клеток;

5. Сравнить перспективность оценки мутационного статуса р53 и общей транскрипционной активности семейства р53 для прогнозирования химиотерапевтического эффекта.

Научная новизна. Данная работа является первым многоплановым исследованием роли генов семейства р53 в опухолях ЖКТ. Проведен подробный анализ более 350 образцов злокачественных и нормальных тканей ЖКТ человека, который показал, что характер экспрессии генов семейства р53 в опухолевом и в нормальном неопухолевом эпителии неодинаков. Наряду с мутациями гена ТР53, в опухолях ЖКТ часто наблюдается увеличение содержания ТА и AN изоформ р73, а также различных С-концевых вариантов сплайсинга мРНК р73. Впервые обнаружено, что высокое содержание белка ДЫр73 в клетках опухоли является неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов с аденокарциномой желудка.

Эти данные свидетельствуют о том, что увеличение синтеза белка ANp73 может значительно усложнить течение онкологического заболевания. Однако о механизмах, приводящих к увеличению синтеза белка ANp73 в опухолевых клетках, практически ничего не известно. В нашей работе впервые показано, что снижение экспрессии гена опухолевой супрессии Hid (Hypermethylated in

cancer 1, гиперметилированный в раке 1), характерное для злокачественных новообразований человека, может приводить к увеличению содержания мРНК ANp73.

Было установлено, что функции различных белков семейства р53 в регуляции клеточного ответа на химиотерапию взаимосвязаны. Под действием широко применяемого в химиотерапии опухолей ЖКТ препарата 5-фторурацил (5-ФУ) эндогенные белки р53 и р73 или рбЗ и р73 попарно связываются с промоторами генов-мишеней, белковые продукты которых активируют процессы апоптоза и ареста клеточного цикла. Эти данные являются первым свидетельством того, что под действием химиотерапевтических агентов белки семейства р53 взаимодействуют друг с другом на промоторах генов-мишеней. Также обнаружено, что чувствительность опухолевых клеток к воздействию химиотерапевтического агента 5-ФУ зависит от суммарной транскрипционной активности всех присутствующих в клетке белков семейства р53. Научно-практическая ценность работы. Опухолевый супрессор р53 - один из наиболее интенсивно изучаемых белков. В последние несколько лет в научной литературе стали появляться свидетельства того, что белки семейства р53 интенсивно взаимодействуют друг с другом. В соответствии с этим было выдвинуто предположение, что семейство р53 функционирует как единая интерактивная белковая сеть («р53 family network»). Наши экспериментальные данные подтверждают эту гипотезу, показывая, что все образующиеся в клетке белки этого семейства вовлечены в формирование ответа клеток на действие химиотерапевтических средств.

Ряд полученных в рамках представленной работы данных существенны для клинической онкологии. В частности, показано что суммарная транскрипционная активность всех белков семейства р53 гораздо лучше прогнозирует эффект химиотерапии, чем часто применяемый в клинике анализ мутационного статуса гена ТР53. Точное прогнозирование эффекта химиотерапии позволит подобрать наиболее действенную стратегию лечения и улучшить качество жизни онкологических больных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научном коллоквиуме Лаборатории биологии клетки ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта в 2010 году, на конференции аспирантов ИМБ РАН в 2007 году; на 98-ой ежегодной конференции AACR (American Association of Cancer Research, Американская Ассоциация Исследований Рака), Лос-Анджелес, Калифорния, США, 2007; на еженедельном научном семинаре GPA (Growth, Proliferation and Apoptosis; Рост, Пролиферация и Апоптоз) Университета Вандербилт в 2008 году; на ежегодной конференции DDW (Digestive Disease Week, Неделя заболеваний пищеварительной системы) 2009 года, Чикаго, Иллинойс, США; на ежегодной конференции DDW 2010 года, Новый Орлеан, Луизиана, США.

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и международных журналах, а также тезисы 3 докладов на международных конференциях и съездах.

Структура и объем работы.

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на J5& страницах машинописного текста и содержит 53 иллюстраций (фотографии, рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография включает наименований. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Образцы ткани человека. В данной работе было проанализировано более 350 образцов нормальных и опухолевых тканей ЖКТ человека, отобранных в Медицинском Центре Университета Вандербилт (США) и в Университете Барселоны (Испания). Клеточные линии. В работе использовали перевиваемые клетки карциномы толстого кишечника: НСТ8, LIM1215, Сасо-2, SW480, НСТ116, НСТ116 р53-/-, RKO и RKO р53-/-; пищевода: ТЕ1, ТЕ7 и ТЕП; желудка человека: Snul, MKN28, MKN75, AGS; а также ^трансформированные иммортализованные клетки эпителия пищевода человека (НЕТ-1А). Анализ содержания мРНК проводили методом ПЦР в режиме реального времени после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Данные нормализовали по содержанию кДНК гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы (HPRT). Определение содержания С-концевых изоформ белка р73 проводили с использованием гнездовой ПЦР. Содержание исследуемых белков в первичных опухолях определяли иммуногистохимическими методоми, а в клеточных линиях - методом иммуноблотинга. ДНК-белковые взаимодействия исследовали с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) или иммуноблотинга белков, аффинных к ДНК (DAI). Для анализа попарного связывания белков с одним участком ДНК использовали последовательный СЫР. В этом случае хроматин, осажденный одними антителами, подвергали повторной преципитации с другими антителами. Для анализа активности промоторов использовали репортерные плазмиды, в которых экспрессия репортерного гена люциферазы светлячка находилась под контролем исследуемых промоторов. Для контроля эффективности трансфекции и нормализации полученных результатов использовали контрольный репортер pRL-TK, экспрессирующий ген люциферазы морского беспозвоночного животного Renilla reniformis под контролем промотора тимидинкиназы. Апонтоз и распределение клеток по фазам клеточного цикла определяли методом проточной цитофлуориметрии, предварительно окрашивая клетки препаратом Annexin V, меченным фикоэритрином, в сочетании с 7-актиномицином D (7-AAD) или йодистым пропидием, соответственно. Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводили, как минимум, в трех повторах. Если не указано другого, количественные данные представлены как среднее + стандартное отклонение. Указанные в тексте, рисунках и таблицах значения р представляют уровень значимости. Зависимости или различия считали достоверными при уровне значимости р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Экспрессия генов семейства р53 в опухолях ЖКТ человека

Среди всех опухолей ЖКТ наиболее распространены опухоли желудка, колоректальный рак и рак пищевода. Поэтому мы начали нашу работу с изучения экспрессии генов семейства р53 в нормальных и опухолевых тканях этих органов. Мы провели анализ содержания белковых продуктов генов семейства р53 в образцах колоректальной аденокарциномы и нормального эпителия толстого кишечника методом иммуногистохимии. В большинстве случаев специфическое окрашивание на белки семейства р53 наблюдалось в клетках опухолей, а окружающие ткани не окрашивались (Рис. 1).

р53 ТАр73 \Np73 рбЗ рбЗ

Аленоклрцинома толстого кишечника Карцинома

пищевода

Рисунок 1. Образцы иммуногистохимического окрашивания белков р53, ТАр73,ДЫр73 и рбЗ в аденокарциномах толстой кишки (А, Б, В и Г, соответственно) и белка рбЗ в плоскоклеточных карциномах пищевода (Д).

В опухолевых клетках было отмечено увеличение содержания ТА А N изоформ белка р73 по сравнению с клетками нормального эпителия (Таблица 1). Иммуногистохимическое окрашивание выявило низкое содержание белка рбЗ в образцах колоректальных карцином и нормальных тканей толстого кишечника. В качестве позитивного контроля на окрашивание рбЗ мы использовали образец плоскоклеточной карциномы пищевода, поскольку для этого типа опухолей высокая экспрессия рбЗ была ранее продемонстрирована (Рис. 1Д). Яркое окрашивание ядер клеток опухолей антителами, специфическими к р53, обнаружили в 46 из 87 одразцов (Рис. 1А). Такое увеличение иммунореактивности указывает на наличие мутаций в гене ТР53.

Таблица 1. Результаты иммуногистохимического окрашивания белков семейства р53 в образцах нормальных и опухолевых тканей толстого кишечника. Значение р отражает достоверность увеличения содержания исследуемого белка семейства р53 в опухолях по

Специфическое окрашивание Нормальный эпителий Опухоль Значение р

ТАр73 1 из 12 (8%) 52 из 87 (60%) 0.00186

№рП Оиз 12 (0%) 23 из 87 (26%) 0.051

рбЗ 0 из 12(0%) 3 из 90 (3%) -

В дополнение, содержание про-опухолевого белка ДЫр73 определяли в 186 образцах аденокарцином желудка, пищевода и пищеводно-желудочного сочленения (ПЖС) и в 102 образцах неопухолевых тканей. Иммуногистохимическое окрашивание выявило высокий уровень белка ДЫр73 как в ядрах, так и в цитоплазме клеток карцином желудка, пищевода и ПЖС. В клетках нормального эпителия наблюдалось слабое окрашивание, которое имело в основном цитоплазматический характер (Рис. 2).

Аденокарнинома

желудка

Аденокарнинома пищевода

20х

Нормальный

желудок

Нормальный

Рисунок 2. Образцы иммуногистохимического окрашивания белка ДЫр73 в аденокарциномах желудка и пищевода и в образцах соответствующих неопухолевых тканей. Фотографии сделаны при 20-ти (20х) и 40-ка (40х) кратном увеличении.

Было отмечено, что высокое содержание белка ДЫр73 в опухолях коррелирует с неблагоприятным прогнозом для пациентов (логарифмический ранговый критерий, р=0.005). Если средняя продолжительность жизни после постановки диагноза для больных с низким уровнем белка ДЫр73 в опухоли составляла 47 месяцев, то для пациентов с высоким уровнем белка ДИр73 — всего 20 месяцев (Рис. 3).

Окрашивание на ANp73:

— Слабое/отсутствует ••■ Сильное

Рисунок 3. Корреляция интенсивности иммуногистохимического окрашивания белка ДМр73 в опухолях и выживания пациентов с аденокарциномами желудка. Показаны кривые выживания Каплана-Мейера.

Время, месяцы

Далее исследовали экспрессию генов семейства р53 на уровне мРНК в аденокарциномах толстой кишки (Рис. 4).

о я л

е; и

Г"

5 о с S

6п

в-

<и

=н

и •

ШЬ»

I усред. Т5 Т7 Т14 Т16 Т42 Т43 Т47 Т56 Т58 Т65

Опухолевые образцы

а (515 Ьр)Н В 422 bpU V 366 ЬрН 1 273 bp Н е. (227 Ьр)Н S(133 Ьр)Н

HPRT н

со Z

о о.

1Л N.

I- н

^■шсмог^шсою

T-T-'Tfxf-fl-lOiniD

I— I— I— I— 1— 1— 1— i—

ЩШ' *т ' ' ^ТЩЖ

• ■ - ~ >, ........

500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

Рисунок 4. А, Анализ содержания мРНК p53 и N-концевых вариантов р73 и рбЗ в первичных опухолях толстого кишечника (Т) методом ОТ ПЦР. Усредненное содержание мРНК изоформ рбЗ, р73 и р53 в нормальных образцах (N усред.) принимали за 1. Б, Анализ содержания мРНК С-концевых вариантов сплайсинга р73 в опухолях толстого кишечника методом гнездовой ПЦР. N8 - показательный образец нормальной ткани толстого кишечника. N pool - смесь 14-ти образцов нормальной ткани.

Аналогично данным иммуногистохимии, во многих опухолевых образцах обнаружили увеличение содержания мРНК ТАр73 и ANp73 по сравнению с соответствующей нормальной тканью. Содержание С-концевых изоформ р73 определяли методом гнездовой ПЦР. Анализ показал высокое содержание изоформ а и р в образцах опухолевых и нормальных тканей. Наряду с ними, в опухолях обнаружили мРНК других изоформ р73 (у, 5, tp и s) (Рис. 4Б). Уровень м РНК ТАрбЗ и ANp63 в опухолевых образцах был снижен по сравнению со средним уровнем мРНК изоформ рбЗ в образцах нормальной ткани (за исключением одного образца). Значительных изменений содержания мРНК р53 не обнаружили (Рис. 4А). Полученные данные отражают сложность профилей экспрессии генов семейства р53 в колоректальных опухолях. Изоформы белков и мРНК р73, р53, и, иногда, рбЗ, часто совместно обнаруживаются в этих новообразованиях. Важно отметить, что каждая опухоль характеризуется своим уникальным набором изоформ семейства р53.

Регуляция экспрессии ANp73

Транскрипция мРНК ÀNp73 находится под контролем промотора Р2 гена ТР73. О его регуляции известно исключительно мало. Поиск новых цис-регуляторных элементов промотора Р2 проводили с помощью компьютерного моделирования {in silico). Для этого использовали программу rVista, позволяющую визуализировать гомологические последовательности ДНК в геномах различных видов. В результате обнаружили короткую последовательность величиной около 250 пар нуклеотидов с высокой гомологией у человека, мыши, крысы, курицы и лягушки (Рис. 5). Дальнейший анализ этого участка выявил наличие в нем сайта связывания транскрипционного репрессора Hicl (Гиперметилированный в раке 1) или Hicl-респонсивного элемента (Hicl-RE) в позиции -80/-69 относительно точки начала транскрипции ANp73.

Далее исследовали, действительно ли белок Hicl является регулятором экспрессии ANp73. Для этого сконструировали репортерную плазмиду, экспрессирующую люциферазу под контролем промотора Р2 этого гена. Эктопическая экспрессия гена Hicl значительно снижала внутриклеточный уровень люциферазы (Рис. 6), а также уровень эндогенной мРНК ANp73 (рис 7 А). Трансфекция Hicl-специфической siRNA, напротив, вызывала увеличение содержания эндогенной мРНК ANp73 в клетках (Рис. 7Б). Эти результаты свидетельствуют о том, что белок Hicl действительно подавляет синтез мРНК ANp73.

Важно было установить, является ли ингибирующий эффект Hicl результатом его непосредственного взаимодействия с промотором ANp73 или он действует опосредованно. Связывание Hicl с промото^Шр73 определяли методом иммунопреципитации хроматина. Связывание белка р53 с промотором ANp73 было ранее продемонстрировано, поэтому в качестве положительного контроля проводили иммунопреципитацию с р53-

специфическими антителами. В результате мы обнаружили, что эндогенный белок №с1 взаимодействует с промотором Л^73 напрямую (Рис. 8).

Mus Musculus: Homo Sapiens

Rattus Norvegicus: Homo Sapiens

Gallus Gallus: Homo Sapiens

Xenopus Tropicalis: Homo Sapiens

Tp73 ген

/ /Hic1 BS2 \ \ Hic1 BS3\ - Hic1 BS1 -/ /(+123-+137)U(+255-+269)\ Человек -90 CCAACACATCACCGGGCAAGCTGAGGCCTGCCCCGGACT -51 Мышь CCAACACATCTCCGGGCAAGCTGAGGCCTGCCCTGAGTT

Крыса CCAACACATCTCCGGGCAAGCTGAGGCCTGCCCTGTGCT

Курица CTCGTCCATCACTGGGCAAGCTGGGGCCTGCCCTGCATT Лягушка CCAATACATCACTGGGCAAGCCTGGGCCTGCCTTGTGGT HIC1 консенсусный BS SNGSGGGCAMCC

Рисунок 5. Сравнение последовательностей промоторов Р2 у человека и мыши, крысы, курицы и лягушки. Высота пиков отражает сходство последовательностей. Ширина пиков соответствует длине гомологичных участков. Под гистограммами схематически изображен участок гена ТР73, содержащий промотор Р2. Стрелками показано расположение гипотетических участков связывания (BS) транскрипционного репрессора Hicl. Для HieI BS1 указаны нуклеотидные последовательности у исследованных видов. S - С или G; М - А или С; N - любой нуклеотид. +1 - точка начала транскрипции.

'У/.-/ ьУ^'Ъ-. Г)

.л

LA.

Экзон 3'

ATGÍ235)

Рисунок 6. Относительная активность люциферазы в клетках линий Snul и AGS, трансфицированных репортерной плазмидой, экспрессирующей люциферазу под контролем промотора Р2 гена ТР73 совместно с плазмидой, экспрессирующей ген Hicl, или неэкспрессирующей его контрольной плазмидой pcDNA3. Активность люциферазы в клетках, трансфицированных плазмидой pcDNA3, принимали за 1.

Snu1

AGS

ANp73мРНК

ANp73 мРНК

Snu1

AGS

Snu1

НЕТ

Рисунок 7. А, Относительное содержание эндогенной MPHKANp73 в клетках линий Snul и AGS, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей ген Hicl, или неэкспрессирующей его контрольной плазмидой pcDNA3. Содержание мРНК ANp73 в клетках, трансфицированных плазмидой pcDNA3, принимали за 1. Б, Относительное содержание эндогенной MPHKANp73 в клетках линий Snul и НЕТ1А, трансфицированных Hicl-специфической siRNA или контрольной неспецифической scrRNA. Содержание мРНК ANp73 в клетках, трансфицированных scrRNA, принимали за 1.

Особенности метода иммунопреципитации хроматина не позволяют определить точный участок связывания Hic 1 с промотором. Для более точной локализации Hicl-RE мы изучали взаимодействие Hicl с люциферазными репортерами, содержащими различные модификации гипотетического Hicl-RE, определенного ранее анализом in silico. В результате обнаружили, что изменение последовательности этого участка за счет мутации или его делеция нарушают транскрипционную репрессию промотс4Мр73 белком Hicl (данные не представленны). Таким образом, выявленный с помощью компьютерного анализа гипотетический Hicl-RE в действительности является цис-регуляторным элементом промоторANp73, обеспечивающим Независимую транскрипционную репрессию.

Антитела

Рисунок 8. Анализ связывания эндогенного белка Н1с1 с промотором Р2 гена ТР73 клетках линии 8пи1 Специфические методом СЫР с использованием Ню1-праймеры специфических антител. В качестве

Неспецифические положительного контроля праймеры использовали р53-специфические

антитела. В качестве отрицательных контролен использовали неспецифические антитела (н/с) или неспецифические праймеры.

Белки семейства р53 и эффективность противоопухолевой химиотерапии

Белок ANp73 активирует экспрессию гена mdrl

Один из механизмов развития лекарственной устойчивости - увеличение экспрессии гена mdrl (multidrug resistance 1, ген множественной лекарственной устойчивости 1). Его продукт, трансмембранный белок Р-гликопротеин (Pgp), активно выводит многие противоопухолевые препараты за пределы клетки. Ранее было показано, что белок р53 подавляет экспрессию гена mdrl. В данной работе исследовали влияние различных изоформ белка р73 на экспрессию этого гена (Рис. 9).

MDR1мРНК

Рисунок 9. Измерение содержания эндогенной мРНК MDR1 в клетках линии AGS, трансфицированных плазмидами, направляющими синтез белка р53 и различных изоформ белка р73. Уровень мРНК MDR1 в клетках, трансфицированных

контрольной, неэкспрессирующей генов семейства р53, пазмидой pcDNA3, принимали за 1.

pcDNA3 ТАр73(Х ТАр73() ANp73ct р53 ANp73a (L322H)

Мы обнаружили более чем 25-ти кратное увеличение содержания эндогенной мРНК MDR1 в клетках, синтезирующих эктопический белок ANp73a. TAp73a и ТАр73(3 не оказывали заметного влияния на уровень мРНК MDR1. Как и ожидалось, р53 подавлял экспрессию гена mdrl(Рис. 9). Трансфекдия ANp73a также способствовала накоплению в клетках белк а Pgp (Рис. 10).

Рисунок 10. Содержание эндогенного белка Pgp в клетках линии AGS трансфицированных плазмидой, направляющей синтез белка ANp73, или несинтезирующей его контрольной плазмидой peDNA3. В качестве положительного контроля клетки трансфицировали плазмидой, напраляющей синтез известного активатора Pgp -белка NF-Y.

pcDNA3 ANp73a NF-Y

Интересно отметить, что мутантная форма белка А1Мр73а (Ь322Р), которая, в отличие от белка АКр73а дикого типа, не способна подавлять активность р53, не оказывала влияния на уровень мРНК МОК1 (Рис. 9). Вероятно, в регуляции активности промотора MDR1 ключевую роль играют взаимодействия белков р53 и АЫр73а. Действительно, анализ методом СЫР показал, что эктопический белок АКр73а нарушает связывание эндогенного белка р53 с промотором гена mdrl (Рис.11 А, дорожки 3 и 4). Важно заметить,

что белок ДЫр73а также напрямую связывается с промотором (рис.11 Б, дорожка 3). Возможно, промоторные взаимодействия р53 А Мр73а обусловливают активацию транскрипции мРНК МТОЮ.

промотор MDR1

н/с конт.

Антитела

n/sp

р53 (DO-1)

§0-1)

р53 (DO-1)

Трансфекция pcDNA3 pcDNA3 pcDNA3 ANp73o. pcDNA3 ChIP I Input I

Б промотор MDR1 н/с конт.

Антитела n/sp ANp73a áNp73a ANp73a (Flag) (Flag) (tfag)

Трансфекция pcDNA3 pcDNA3 ANp73a ANp73a

ChIP I Input

Рисунок 11. А, Анализ связывания эндогенного белка р53 с промотором гена mdrl в клетках линии AGS, трансфицированных плазмидой, направляющей синтез белка ANp73a или контрольной несинтезирующей его плазмидой. ChIP проводили с использованием р53-специфических антител. В качестве отрицательных контролей использовали

неспецифические антитела (n/sp) или неспецифические праймеры (н/с конт.). Б, Анализ связывания эктопического белка ANp73a с промотором гена mdrl в клетках линии AGS.

Эндогенные белки семейства р53 и их взаимодействия определяют химиотерапевтическую чувствительность опухолевых клеток

р73 и рбЗ принимают участие в регуляции ответа опухолевых клеток на действие 5-фторурацила

Данные анализа in vivo показали, что каждая опухоль характеризуется уникальным набором изоформ белков семейства р53 (см. Рис. 4). Для того, чтобы отразить это многообразие в модели in vitro, использовали несколько перевиваемых линий клеток рака толстого кишечника и пищевода, различающихся экспрессией р53, рбЗ и р73 (Рис. 12А). В качестве химиотерапевтического агента применяли препарат 5-фторурацил (5-ФУ). Выбор 5-ФУ для экспериментов обусловлен широким применением этого препарата в клинической практике для химиотерапии опухолей ЖКТ.

Как и ожидалось, в клеточных линиях, содержащих белок р53 дикого типа (НСТ8, LIM1215, RKO и НСТ116), его уровень значительно увеличивался после воздействия 5-ФУ (Рис. 12А). Существенно, что обработка 5-ФУ вызывала увеличение содержания эндогенных белков ТАр73а и TAp73ß во всех проанализированных клеточных линиях, независимо от статуса р53. В клетках плоскоклеточной карциномы пищевода содержание эндогенных TAp¡61 ANp63a также возрастало под действием 5-ФУ.

Клетки рака толстой кишки

RKO RKO р53 -/- р53 +/+ 5-ФУ I i I i (2.5 мкМ) - + - + Р53-+-р53р~>

контроль

ТАр73</ -TAp73|í-

iNp73a-ANp73[S-

\Np63oc-ТАрбЗу -

.....«■>«»;,)

(1-акгин -

НСТ116 НСТ116 р53 -/■ р53 +/+

LIM1215 НСТ8 Wtp53 Wtp53

SW480 mtp53

тл 11Ш

пи

Клетки рака пищевода

ТЕ7 р53 nuil

- +

ТЕ11 ТЕ1 mtp53 mtp53

ITj |—--

HCT116 HCT116 -/- +/+

LIM1215 HCT8 SW480

Рисунок 12. А, Измерение содержания эндогенных белков семейства р53 в клетках указанных линий, подвергнутых действию 2,5 мкМ 5-ФУ (+) в течение 24 часов, или в необработанных 5-ФУ (-) клетках. Б, Измерение содержания белковых продуктов генов-мишеней р53 (PUMA, NOXA, р21, FasR и ВАХ) в контрольных необработанных клетках и в клетках, культивированных в течение 48 часов в присутствии 2.5 мкМ 5-ФУ.

Для определения влияния 5-ФУ на р53-зависимую транскрипцию в десяти различных линиях клеток карциномы ЖКТ сравнивали содержание белковых продуктов генов-мишеней транскрипционного фактора р53 в клетках, обработанных 5-ФУ, и в контрольных необработанных клетках (Рис. 12Б). Эти белки являются важными эффекторами р53-зависимого апоптоза (PUMA, NOXA, FasR и Вах) и ареста клеточного цикла (р21). Было обнаружено значительное увеличение уровня этих белков под действием 5-ФУ во всех клеточных линиях, синтезирующих р53 дикого типа. Важно отметить, что мы выявили увеличение экспрессии генов-мишеней р53 в ответ на 5-ФУ также в р53-дефицитных клетках (не синтезирующих р53 или содержащих мутацию в гене ТР53). Например, в клетках линии ТЕ7, в которых синтез белка р53 не осуществляется, зато существенно накапливаются ТАр73а, ТАр73(3, ТАрбЗу и ANp63a, обработка 5 -ФУ вызывала значительное увеличение уровней эндогенных белков PUMA, NOXA, FasR и Вах (Рис. 12Б). В дополнение, 5-ФУ

увеличивал экспрессию этих же генов-мишеней в клетках линии ЯКО р53-/- с нокаутом р53, однако в меньшей степени по сравнению с родительской изогенной линией 11КО р53+/+. Аналогично этому, активация некоторых генов-мишеней наблюдалась в НСТ116 р53-/-, ТЕ1, ТЕП и 8У/480 клетках. Эти данные свидетельствуют о том, что химиотерапевтическое воздействие на опухолевые клетки может активировать экспрессию генов-мишеней р53 в отсутствие функционального р53. Возможно, р73 и рбЗ, по крайней мере, частично, обеспечивают эту активацию.

Для оценки роли гена ТР73 в клеточном ответе на воздействие 5-ФУ, его экспрессию блокировали с помощью интерференции РНК: стабильная экспрессия р73-специфической эЫША заметно подавляла 5-ФУ-опосредованный апоптоз (Рис. 13А) и арест клеточного цикла в фазе 01 (Рис. 14) в клетках линии ЯКО (р53 дикого типа). Для того, чтобы оценить роль эндогенного рбЗ в химиотерапевтическом ответе клеток, его экспрессию блокировали за счет специфической эПИЧА в клетках линии ТЕ7, содержащей высокий уровень изоформ рбЗ (Рис. 13Б). Снижение синтеза белка рбЗ в этих клетках приводило к уменьшению их чувствительности к 5-ФУ-опосредованному апоптозу.

ТЕ7

Рисунок 13. А, Анализ 5-ФУ-опосредованного апоптоза в клетках линии ИКО, трансдуцированных лентивирусным вектором, направляющим синтез р73-специфической эИГША или контрольной неспецифической вЫША (н/с). Клетки обрабатывали 0.25 мМ 5-ФУ в течение 4 часов (5-ФУ). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, не подвергнутые воздействию 5-ФУ (-). Б, Анализ 5-ФУ-опосредованного апоптоза в клетках линии ТЕ7, трансдуцированных рбЗ-специфической бИУЧА или контрольной неспецифической з11УЧА (н/с). Клетки обрабатывали 0.25 мМ 5-ФУ в течение 18 часов (5-ФУ). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, не подвергнутые воздействию 5-ФУ (-).

•л

с §'

з.

о £

ЬЙ

Распределение по фазам клеточного цикла

п/с shRNA, - р73 shRNA, - и/с shRNA, 5-ФУ р73 shRNA, 5-ФУ

G1 52.6%

S 36.7%

G2/M 11.7%

52.6%

36.7%

i 4

Ь-

Интенсивность окрашивания PI Рисунок 14. Распределение по фазам клеточного цикла клеток линии RKO, трансдуцировапных лентивирусным вектором, направляющим синтез р73-специфической shRNA или контрольной неспецифической shRNA (н/с). Анализировали клетки, инкубированные в течение 48 часов в присутствии 25 мкМ 5-ФУ, и контрольные необработанные 5-ФУ клетки.

Белки р53, рбЗ и р73 попарно связываются с промоторами генов-мишеней р53 под воздействием химиотерапии

Для выяснения механизмов функциональных взаимодействий между белками р53, рбЗ и р73, мы определяли их связывание с промоторами генов ВВСЗ (PUMA) и CDKN1A (р21), играющих важную роль в регуляции апоптоза и ареста клеточного цикла. Чтобы определить, какие белки семейства р53 связываются с промоторами генов-мишеней, мы использовали метод DAI, в котором все взаимодействующие с ДНК-зондомами белки анализируются методом Вестерн Блоттинга.

Специфические ДНК-зонды соответствовали последовательностям ДНК промоторов генов ВВСЗ (PUMA) и CDKN1A (р21) человека, содержащих р53-респонсивные элементы (p53-RE). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические зонды: зонд, комплементарный интронной последовательности гена р21 (н/с), и зонд, комплементарный последовательности промотора PUMA, но содержащий мутацию в p53-RE (mtPUMA). Обнаружили специфическое связывание белка ТАр73ас промоторами генов PUMA и р21 в клеточных линиях НСТ116, ТЕ7 и ТЕ11 (Рис. 15А). В клетках линий ТЕ7 и ТЕ11 также наблюдалось связывание изоформ рбЗ со специфическими зондами (Рис. 15Б). Важно отметить, что количество связавшихся со специфическими зондами белков семейства р53 возрастало после воздействия на клетки 5-ФУ. Специфического связывания мутантного р53 и ANp73 не обнаружили.

Для того чтобы выяснить, присоединяются ли разные белки семейства р53 к участку промотора одновременно, мы использовали последовательную иммунопреципитацию хроматина. Обнаружили, что эндогенные белки р53 и ТАр73 связываются попарно с промоторами р21 и PUMA в клетках линии НСТ116 (Рис. 15В, дорожки 9 и 10). Также мы наблюдали совместное присоединение рбЗ и р73 к промоторам генов р21 и PUMA в клетках линии ТЕ7

(Рис. 15Г). Уровень попарно связавшихся с промоторами генов р21 и PUMA белков семейства р53 возрастал после обработки клеток 5-ФУ.

НСТ116р53+/+

5-FU р53-»-ТАр73а-+-Д1Чр73а-»-

Input

'- +

Проба: н/с - +

р21 - +

wtPJIVIA mtPUMA - + - +

z*]| -

г;

Input

ТЕ7 ТЕ11 Проба: н/с 5-FU - + - + - + pS3-*( (—

ТЕ7 ТЕП

-1 I-

i21 н/с

TE7 ГЕИ

"I Г

+ - +

|21 wtPUMAmtPUMA wtPUMA mlPUMA + - + - + - +

ANp63cx -ТАрбЗу -

TAp73a -

Антитела 2: р73 р73 н/с р53

Антитела 1 : Input н/с р53 + н/с t р53 р53 р53

5-ФУ III 1 - + - + 1 1 - + - + 1 1 - + - + 1 1 - +

p2ljg PUMA _ Г

12 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14

Антитела 2: ТЕ7 рбЗ н/с рбЗ н/с А р73

Антитела 1 : Input н/с р73 р73 р73 р73

5-ФУ 1 1 - + +1

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рисунок 15. А, Исследование связывания эндогенных белков семейства р53 с ДНК-зондамии, комплементарными участкам промоторов генов р21 и PUMA, в клетках линии НСТ116 р53+/+, инкубированных 24 часа в присутствии 2.5 мкМ 5-ФУ (+), а также в необработанных 5-ФУ клетках (-). Контроль Input показывает исходное содержание исследуемых белков в лизате клеток. Б, То же, что и в А, только для эксперимента использовали клетки линий ТЕ7 (р53 не синтезируется) и ТЕ 11 (мутантный р53) В, Анализ попарного связывания р53 и р73 с промоторами генов р21 и PUMA проводили методом повторной СЫР в клетках линии НСТ116. Клетки обрабатывали 10 мкМ 5-ФУ в течение 24 часов. Хроматин сначала преципитировали антителами, специфичными к р53 (Антитела 1), а затем антителами, специфичными к р73 (Антитела 2) (дорожки 9 и 10). В качестве отрицательного контроля Антитела 1 или 2 заменяли неспецифическими IgG (н/с) (дорожки 7, 8, 11 и 12). В качестве положительно контроля, антитела, специфичные к р53, использовали как для первой, так и для второй преципитации (дорожки 13 и 14). Г, То же, что и в В, только для эксперимента использовали клетки линии ТЕ7 и антитела, специфичные к р73 и рбЗ.

Суммарная активность белков семейства р53 определяет чувствительность клеток к воздействию 5-ФУ

Далее мы анализировали корреляцию активности семейства р53 с чувствительностью клеток к воздействию 5-ФУ. В качестве показателя чувствительности использовали значение IC50 (концентрация 5-ФУ, при которой жизнеспособность данной клеточной линии в МТТ-тесте составляла 50%). Для оценки общей транскрипционной активности семейства р53 использовали репортерные плазмиды PG13 и MG15, содержащие функциональные и инактивированные мутацией консенсусные последовательности p53-RE, соответственно. Нормализация измеренных показателей активности репортерной плазмиды PG13 по активности репортерной плазмиды MG15 позволяет исключить влияние несвязанных с семейством р53 факторов, влияющих на экспрессию репортеров. Поэтому, используя эту систему, мы можем сравнивать общую транскрипционную активность семейства р53 между разными клеточными линиями.

Проанализировав все клеточные линии, мы обнаружили статистически значимую зависимость чувствительности клеток к действию 5-ФУ от общей транскрипционной активности семейства р53 (однофакторный дисперсионный анализ, р=0.0016, Рис. 16). При этом, достоверной корреляции мутационного статуса гена ТР53 и чувствительности не выявили (р=0.073). Наши данные свидетельствуют о том, что прогностическая способность общей транскрипционной активности всего семейства р53 выше, чем у мутационного статуса гена ТР53. Это значит, что активность всех белков семейства р53 определяет химиотерапевтический ответ опухолевых клеток.

1од(1С50, мкМ)

Рисунок 16. Точечная диаграмма обратной зависимости значений 1С50, определенных для препарата 5-ФУ, (устойчивость) и отношения РО-13/МО-15 (общая транскрипционная активность) для 9 клеточных линий карцином ЖКТ. Коэф. кор. - коэффициент корреляции Спирмена.

выводы

1. Охарактеризована экспрессия генов семейства р53 в первичных опухолях ЖКТ. Обнаружено, что наряду с мутациями р53, в аденокарциномах желудка и пищевода и в колоректальном раке часто наблюдается увеличение синтеза ТА иАЫ изоформ белка р73. Показано, что каждая опухоль характеризуется уникальным набором изоформ мРНК и белков семейства р53. Выявлено, что высокое содержание белка ДКр73 в клетках опухоли коррелирует со сниженной выживаемостью пациентов с аденокарциномой желудка.

2. Определен новый механизм регуляции транскрипции мРНК АЫр73 в эпителиальных клетках ЖКТ. Показано, что снижение экспрессии опухолевого супрессора НЫ приводит к увеличению синтеза мРНК АКр73.

3. Установлено, что белок АКр73а увеличивает экспрессию гена тс1г] и уровень его белкового продукта Р-гликопротеина за счет подавления р53-зависимой транскрипционной репрессии.

4. Показано, что белки рбЗ и р73, наряду с р53, принимают участие в регуляции апоптоза и ареста клеточного цикла злокачественных клеток ЖКТ в ответ на воздействие 5-ФУ.

5. С помощью разработанного нами метода определения общей транскрипционной активности белков семейства р53 показано, что чувствительность злокачественных клеток ЖКТ к воздействию 5-ФУ находится в прямой зависимости от суммарной транскрипционной активности белков р53, рбЗ и р73.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Вильгельм А.Э., Чумаков С.П., Прасолов B.C. Интерференция РНК: биология и перспективы применения в биомедицине и биотехнологии. Молекулярная биология. 2006, Т. 40, №3, с. 387-403.

2. Vilgelm A., Wei J.X., Piazuelo М.В., Washington М.К., Prassolov V., El-Rifai W., and Zaika A. DeltaNp73alpha regulates MDR1 expression by inhibiting p53 function. Oncogene 2008, V. 27, no. 15, pp. 2170-2176.

3. Vilgelm A., El-Rifai W., and Zaika A. Therapeutic prospects for p73 and p63: rising from the shadow of p53. Drug Resist Updat. 2008, V. 11, no. 4-5, pp. 152163.

4. Vilgelm A.E., Washington M.K., Wei J., Chen H., Prassolov V.S., and Zaika A.I. Interactions of the p53 protein family in cellular stress response in gastrointestinal tumors. Mol Cancer Ther. 2010, V. 9, no. 3, pp. 693-705.

5. Vilgelm A.E., Hong S.M., Washington M.K., Wei J., Chen H., El-Rifai W., and Zaika A. Characterization of DeltaNp73 expression and regulation in gastric and esophageal tumors. Oncogene 2010, V. 29, no. 43, pp. 5861-5868.

Тезисы конференций

1. Vilgelm A., Hong S., Wei J., El-Rifai W., Zaika A. W1754 Role of p73 and Mechanisms of Its Regulation in Gastrointestinal Tumors. Gastroenterology. 2010, V. 138, no. 5, supplement 1, p. S-733.

2. Vilgelm A., Wei J., Washington K., El-Rifai W., Zaika A. W1921 Interactions Within the p53 Protein Family Play Critical Role in Cancer Chemotherapeutic Treatment: New Insights Into Chemotherapeutic Drug Response in Gastrointestinal Tumors. Gastroenterology. 2009, V. 136, no. 5, supplement 1, p. A-754.

3. Vilgelm A., El-Rifai W., Wei J., Zaika A. Overexpression of DeltaNp73alpha induces drug resistance in human gastric carcinoma cells through upregulation of the MDR1 gene. AACR Meeting Abstracts. 2007, April, p. 454.

'Заказ № 67-аЛ 1/10 Подписано в печать 08.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вильгельм, Анна Эдгартовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Цель и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Семейство р53.

Организация-генов семейства р53 и изоформы их белковых продуктов.

Транскрипционная активность белков семейства р53.

Роль белков семейства р53 в онкогенезе и опухолевой прогрессии.

Первичные опухоли.

Мышиные модели.

ТА изоформы белковрбЗ ир73 и опухолевая супрессия.

Дельт aN — онкоген.

Баланс TA/AN.

Белки семейства р53 и противоопухолевая терапия.

Семейство р53 - интерактивная система.

Множественная лекарственная устойчивость опухолей.

Р-гликопротеин: механизм действия и функции.

Регуляция экспрессии гена mdrl.

Опухолевый супрессор Hicl.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы.

Образцы ткани человека, получение МТП.

Линии эукариотических клеток и условия их культивирования, получение стабильных клеточных линий.49"

Плазмидные векторы.

Интерференция РНК.

Анализ содержания мРНК.

Выделение РНК.

Обратная транскрипция РНК.

ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Определение содержания мРНК р73, кодирующих белки с различным строением С-концов молекулы.

Анализ содержания исследуемых белков.

Определение содержания исследуемых белков в первичных опухолях.

Содержание исследуемых белков в культивируемых клетках, иммуноблоттинг.

Выделение белков из линейных клеток.

Электрофорез белков.

Перенос белков с геля на мембрану.

Гибридизагщя мембраны с антителами.

Анализ ДНК-белковых взаимодействий.

Иммуноблоттинг белков, аффинных к ДНК (DNA-affinity immunoblotting,

DAI).

Приготовление зондов для DAI.

Порядок проведения DAI.

Иммунопреципитация хроматина.

Последовательная иммунопреципитация хроматина.

Анализ активности Р-гликопротеина (Pgp).

Анализ регуляции промоторов.

Измерение общей транскрипционной активности эндогенных белков семейства р53.

Анализ способности клеток к неприкрепленному росту.

Оценка чувствительности клеток к действию 5-FU.

МТТ тест.

Детекция апоптоза.

Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла.

Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Экспрессия генов семейства р53 в опухолях ЖКТ человека.

Экспрессия генов семейства р53 в колоректальных карциномах.

Содержание белка и мРНК ANp73 в опухолях желудка и пищевода.

Белок ANp73 придает неопухолевым клеткам эпителия желудка способность к неприкрепленному росту.

Регуляция синтеза мРНК ANp73.

Анализ промотора Р2 in silico.

Белок Hicl подавляет синтез мРНК ANp73.

Белок Hicl связывается с промотором Р2 гена ТР73.

Белок Hicl блокирует активацию промотора Р2 гена ТР73 белками р53 и

ТАр73.

Регуляция транскрипции мРНК ANp73 in vivo.

Белки семейства р53 и эффективность противоопухолевой химиотерапии

Роль белка р73 в регуляции экспрессии гена mdrl.

Белок ANp7За активирует экспрессию гена mdrl.

Белок ANp7За увеличивает Pgp-опосредованный транспорт.

Белок ANp73a подавляет р53-опосредованную транскрипционную репрессию гена mdrl.

Белки семейства р53 и их взаимодействия определяют химиотерапевтическую чувствительность опухолевых клеток.

Белки р73 и рбЗ принимают участие в ответе клеток на воздействие противоопухолевого препарата 5-фторурацил (5-ФУ).

Белкир53, рбЗ ир73 попарно связываются с промоторами генов-мишеней р53 под действием противоопухолевого препарата 5-ФУ.

Суммарная транскрипционная активность белков семейства р53 определяет чувствительность клеток к воздействию 5-ФУ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Вильгельм, Анна Эдгартовна

Выводы

1. Охарактеризована экспрессия генов семейства р53 в первичных опухолях ЖКТ. Обнаружено, что наряду с мутациями р53, в аденокарциномах желудка и пищевода и в колоректальном раке часто наблюдается увеличение синтеза ТА и АИ изоформ белка р73. Показано, что каждая опухоль характеризуется уникальным набором изоформ мРНК и белков семейства р53. Выявлено, что высокое содержание белка АКр73 в клетках опухоли коррелирует со сниженной выживаемостью пациентов с аденокарциномой желудка.

2. Определен новый механизм регуляции транскрипции мРНК АМр73 в эпителиальных клетках ЖКТ. Показано, что снижение экспрессии опухолевого супрессора Ню1 приводит к увеличению синтеза мРНК ДЫр73.

3. Установлено, что белок АЫр73а увеличивает экспрессию гена тс1г1 и уровень его белкового продукта Р-гликопротеина за счет подавления р53-зависимой транскрипционной репрессии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние несколько лет в научной литературе стали * появляться свидетельства того, что белки семейства р53 интенсивно »взаимодействуют друг с другом. В соответствии с этим было выдвинуто1 предположение, что семейство р53 функционирует как единая интерактивная- белковая сеть («р53 family network»). Наши экспериментальные данные подтверждают эту гипотезу, показывая, что все образующиеся в клетке белки этого семейства вовлечены в формирование ответа клеток на действие химиотерапевтических средств.

Данная работа является первым многоплановым исследованием роли генов семейства р53 в опухолях ЖКТ. В рамках представленной работы был проведен подробный анализ более 350 образцов злокачественных и нормальных тканей ЖКТ человека, который показал, что характер экспрессии генов семейства р53 в опухолевом и в нормальном неопухолевом эпителии различается. Наряду с мутациями гена ТР53, в опухолях ЖКТ часто наблюдается увеличение содержания ТА и AN изоформ р73, а также различных вариантов 3'-концевого сплайсинга мРНК р73. Впервые ' обнаружено, что высокое содержание белка ANp73 в клетках опухоли является неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов с аденокарциномой желудка. Показано, что повышение содержания белка ANp73a в неопухолевых клетках эпителия желудка приводит к приобретению ими неопластического фенотипа, в частности способности к пролиферации независимо от прикрепления к внеклеточному матриксу. Эти данные свидетельствуют о том, что белок ANp73a может играть значительную роль в онкогенезе.

Также в нашей работе получены новые данные, указывающие на взаимосвязь белка ANp73a и важного эффектора множественной лекарственной устойчивости - гена MDR1. Было показано, что белок ANp73a связывается с промотором гена mdrl и активирует его экспрессию. При этом активирующий эффект ANp73a связан с его способностью блокировать р53-зависимую репрессию промотора MDR1. Таким образом, наши данные являются первым опубликованным примером того, что белок ANp73a подавляет активность р53 как транскрипционного, репрессора. Эти данные указывают на то, что увеличение синтеза белка ANp73 может значительно усложнить течение онкологического заболевания. Однако о механизмах, приводящих к увеличению синтеза белка ANp73 в опухолевых клетках, практически ничего не известно. В нашей работе впервые показано, что1 снижение экспрессии гена опухолевой супрессии Hid, характерное для злокачественных новообразований человека, может приводить к увеличению содержания мРНК ANp73.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вильгельм, Анна Эдгартовна, Москва

1. Аксель И.М., Давыдов М:И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 20001 году. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000. М.: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. 2002, с. 85-106.

2. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. Т. 65, №1, с. 5-33.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984.

4. Орлова Р.В. Лекарственное лечение опухолей желудочно-кишечного тракта. Практическая онкология. 2005, Т.6, №1.

5. Чумаков П.М., Иоцева B.C., Георгиев Г.П. Выделение плазмидного клона, содержащего последовательности мРНК для невирусного Т-антигена мыши. Доклады АН СССР. 1982, Т. 267, с. 1272-1275

6. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 2000. Т. 65, №1, с. 34-47.

7. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме. Успехи биологической химии. 2007, Т. 47, с. 3-52.

8. Штиль A.A. Развитие множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток при воздействии химиопрепаратов: биологические механизмы и возможности предотвращения. Российский биотерапевтический журнал. 2003, Т. 2, №1, с. 50-51.

9. Agami R., Blandino G., Oren M. and Shaul Y. Interaction of c-Abl and p73alpha and their collaboration to induce apoptosis. Nature. 1999, V. 399, no. 6738, pp. 809-813.

10. Bahr O., Wick W. and Weller M: Modulation of MDR/MRP by wild-type and mutant p53. J Clin Invest. 2001, V. 107, no. 5, pp. 643-646.

11. Barrera F. N., Poveda J. A., Gonzalez-Ros J. M. and Neira J. L. Binding of the C-terminal sterile alpha motif (SAM) domain of human p73 to lipid membranes. J Biol Chem. 2003, V. 278, no. 47, pp. 46878-46885.

12. Belyi V. A. and Levine A. J. One billion years of p53/p63/p73 evolution. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, V. 106, no. 42, pp. 17609-17610.

13. Brandt T., Petrovich M., Joerger A. C. and Veprintsev D. B. Conservation of DNA-binding specificity and oligomerisation properties within the p53 family. BMC Genomics. 2009, V. 10, no., pp. 628.

14. Briggs K. J., Corcoran-Schwartz I. M., Zhang W., Harcke T., Devereux W. L., Baylin S. B., Eberhart C. G. and Watkins D. N. Cooperation between the Hicl and Ptchl tumor suppressors in medulloblastoma. Genes Dev. 2008, V. 22, no. 6, pp. 770-785.

15. Briggs K. J., Eberhart C. G. and Watkins D. N. Just say no to ATOH: how HIC1 methylation might predispose medulloblastoma to lineage addiction. Cancer Res. 2008, V. 68, no. 21, pp. 8654-8656.

16. Briones V. R., Chen S., Riegel A. T. and Lechleider R. J. Mechanism of fibroblast growth factor-binding protein 1 repression by TGF-beta. Biochem Biophys Res Commun. 2006, V. 345, no. 2, pp. 595-601.

17. Chen W. Y., Wang D. H., Yen R. C., Luo J., Gu W. and Baylin S. B. Tumor suppressor HIC1 directly regulates SIRT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses. Cell. 2005, V. 123, no. 3, pp. 437-448.

18. Chen X., Zheng Y., Zhu J., Jiang J. and Wang J. p73 is transcriptionally regulated by DNA damage, p53, and p73. Oncogene. 2001, V. 20, no. 6, pp. 769-774.

19. Chin K. V., Ueda K., Pastan I. and Gottesman M. M. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. Science. 1992, V. 255, no. 5043, pp. 459-462.

20. Collavin L., Lunardi A. and DeF Sal G. p53-family proteins and their regulators: hubs andspokes in tumor suppression. Cell Death Differ. 2010, V. 17, no. 6, pp. 901-911.

21. Cui R., He J., Mei R., de Fromentel C. C., Martel-Planche G., Taniere P. and Hainaut P. Expression of p53, p63, and p73 isoforms in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of esophagus. Biochem Biophys Res Commun. 2005, no.

22. Dai J. M., Wang Z. Y., Sun D. C., Lin R. X. and Wang S. Q. SIRT1 interacts with p73 and suppresses p73-dependent transcriptional activity. J Cell Physiol. 2007, V. 210, no. 1, pp. 161-166.

23. Daschner P. J., Ciolino H. P., Plouzek C. A. and Yeh G. C. Increased AP-1 activity in drug resistant human breast cancer MCF-7 cells. Breast Cancer Res Treat. 1999, V. 53, no. 3, pp. 229-240.

24. Davison T. Si, Vagner C., Kaghad M., Ayed A., Caput D. and Arrowsmith C. H. p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interactions with each other but not with p53. J Biol Chem. 1999, V. 274, no. 26, pp. 18709^-18714.i A

25. Deltour S., Pinte S., Guerardel C., Wasylyk B. and Leprince D. The human candidate tumor suppressor gene HIC1 recruits CtBP through a degenerate GLDLSKK motif. Mol Cell Biol. 2002, V. 22, no. 13, pp. 4890-4901.

26. Deyoung M. P. and Ellisen L. W. p63 and p73 in human cancer: defining the network. Oncogene. 2007, V. 26, no. 36, pp. 5169-5183.

27. DeYoung M. P., Johannessen C. M., Leong C. O., Faquin W., Rocco J. W. and Ellisen L. W. Tumor-specific p73 up-regulation mediates p63 dependence in squamous cell carcinoma. Cancer Res. 2006, V. 66, no. 19, pp. 9362-9368.

28. Di Como C. J., Gaiddon C. and Prives C. p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol Cell Biol. 1999, V. 19, no. 2, pp. 1438-1449.

29. Dittmer D., Pati S., Zambetti,G., Chu S., Teresky A. K., Moore M., Finlay C. and Levine A. J. Gain of function mutations in p53. Nat Genet. 1993, V. 4, no. l,pp. 42-46.

30. Dohn M., Zhang S. and Chen X. p63alpha and DeltaNp63alpha can induce cell cycle arrest and apoptosis and differentially regulate p53 target genes. Oncogene. 2001, V. 20, no. 25, pp. 3193-3205.

31. Donehower L. A., Harvey M., Slagle B. L., McArthur M. J., Montgomery C. A. Jr., Butel J. S. and Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature. 1992, V. 356, no. 6366, pp. 215-221.

32. Femandes A. D. and Atchley W. R. Biochemical and functional evidence of p53 homology is inconsistent with molecular phylogenetics for distant sequences. J Mol Evol. 2008, V. 67, no. 1, pp. 51-67.

33. Fleuriel C., Touka M., Boulay G., Guerardel G., Rood B. R. and Leprince D. HIG1 (Hypermethylated in Cancer 1) epigenetic silencing in tumors. Int J Biochem Cell Biol. 2009,- V. 41, no. 1, pp. 26-33.

34. Flores E. R., Tsai K. Y., Crowley D., Sengupta S., Yang A., McKeon F. and Jacks T. p63 and p73 are required for p53-dependent apoptosis. in response to DNA damage. Nature. 2002, V. 416, no. 6880, pp. 560-564.

35. Frebourg T., Malkin D. and Friend S. Cancer risks from germ line tumor suppressor gene mutations. Princess Takamatsu Symp. 1991, V. 22, no., pp. 6170.

36. Garcia-Manero G., Daniel J., Smith T. L., Kornblau S. M., Lee Ml S., Kantarjian H. M. and Issa J. P. DNA methylation of multiple promoter-associated CpG islands in adult acute lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res. 2002, V. 8, no. 7, pp. 2217-2224.

37. Ghosh A., Stewart D. and Matlashewski G. Regulation of human p53 activity and cell localization by alternative splicing. Mol Cell Biol. 2004, V. 24, no. 18, pp. 7987-7997.

38. Gong J. G., Costanzo A., Yang H. Q., Melino G., Kaelin W. G. Jr., Levrero M. and Wang J. Y. The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. Nature. 1999, V. 399, no. 6738, pp. 806-809.

39. Gottesman M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 2002, V. 53, no., pp. 615-627.

40. Gottesman M. M., Ambudkar S. V., Xia D. Structure of a multidrug transporter. Nat Biotechnol. 2009, V. 27, no. 6, pp. 546-547.

41. Guo X., Keyes W. M., Papazoglu C., Zuber J., Li W., Lowe S. W., Vogel H. and Mills A. A. TAp63 induces senescence and suppresses tumorigenesis in vivo. Nat Cell Biol. 2009, V. 11, no. 12, pp. 1451-1457.

42. Hamer G., Gademan I. S., Kal H. B. and de Rooij D. G. Role for c-Abl and p73 in the radiation response of male germ cells. Oncogene. 2001, V. 20, no. 32, pp. 4298-4304.

43. Hamroun D.vKatoS., Ishioka C., Claustres Mi, Beroud G. and Soussi T. The UMD TP53 database and website: update and, revisions. Hum Mutat. 2006, V. 27, no. 1«, pp.- 14-20.

44. Hu Z., Jin S. and Scotto K. W. Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role of NF-Y and Spl. J Biol Chem. 2000, V. 275, no. 4, pp. 2979-2985.

45. Irwin M. S., Kondo K., Marin M. C., Cheng L. S., Hahn W. C. and Kaelin W. G. Jr. Chemosensitivity linked to p73 function. Cancer Cell. 2003, V. 3, no. 4, pp. 403-410.

46. Ishimoto O., Kawahara C., Enjo K., Obinata M., Nukiwa T. and Ikawa S. Possible oncogenic potential of DeltaNp73: a newly identified isoform of human p73. Cancer Res. 2002, V. 62, no. 3, pp. 636-641.

47. Joerger A. C. and Fersht A. R. Structure-function-rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants. Oncogene. 2007, V. 26, no. 15, pp. 2226-2242.

48. Johnson1 J., Lagowski J"., Sundberg A., LawsomS., Liu Y. and Kulesz-Martin-Mi. p73' loss triggers conversion« to squamous cell carcinoma; reversible upon? reconstitution-with TAp73alpha; CancerRes. 2007b, V. 67, no. 16, pp. 77237730; •

49. Johnson R* A., Ince T. A. and;-ScottotK. W. Transcriptional I repression? by p53 through direct binding to a novel DNA element. J Biol; Chem: 2001, V. 276, no. 29, pp. 27716-27720.

50. Johnson R: A., Shepard E. M. and Scotto K. W. Differential regulation of MDR1 transcription by the p53 family members. Role of the DNA binding domain. J Biol Chem. 2005, V. 280, no. 14, pp. 13213-13219.

51. Johnstone R. W., Cretney E. and Smyth M. J. P-glycoprotein protects leukemia cells against caspase-dependent, but not caspase-independent, cell death. Blood. 1999, V. 93, no. 3, pp. 1075-1085.

52. Kanai Y., Hui A. M., Sun L., Ushijima S., Sakamoto M., Tsuda H. and Hirohashi S. DNA hypermethylation at the D17S5 locus and reduced HIC-1 mRNA expression are associated with hepatocarcinogenesis. Hepatology. 1999, V. 29, no. 3, pp. 703-709.

53. Kartasheva N. N., Lenz-Bauer C.5 Hartmann O., Schafer 1-L, Eilers M. and Dobbelstein M. DeltaNp73 can modulate the expression of various genes in a p53-independent fashion. Oncogene. 2003- V. 22, no. 51, pp. 8246-8254.

54. Katoh E,. Aisaki K. I., Kurata S. I., Ikawa S. and Ikawa. Y. p51A (TAp63gamma), a p53 homolog, accumulates in response to DNA damage for cell regulation. Oncogene. 2000j V. 19, no. 27, pp. 3126-3130.

55. Keyes W. M., Wu Y., Vogel H., Guo X., Lowe S. W. and Mills A. A. p63 deficiency activates a program of cellular senescence and leads to accelerated aging. Genes Dev. 2005, V. 19, no. 17, pp. 1986-1999.

56. Khoury M. P. and Bourdon J. C. The isoforms of the p53 protein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010, V. 2, no. 3, pp. a000927.

57. Kim S. H., Hur W. Y., Kang C. D., Lim Y. S., Kim D. W. and Chung B. S. Involvement of heat shock factor in regulating transcriptional activation of MDR1 gene in multidrug-resistant cells. Cancer Lett. 1997, V. 115, no. 1, pp. 914.

58. Knezevic D. and Brash D. E. Role of E2F1 in apoptosis: a case study in feedback loops. Cell Cycle. 2004, V. 3, no. 6, pp. 729-732.

59. Lane D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 1992, V. 358, no. 6381, pp. 15-16.

60. Leong C. O., Vidnovic N., DeYoung M. P., Sgroi D. and Ellisen L. W. The p63/p73 network mediates chemosensitivity to cisplatin in a biologically defined subset of primary breast cancers. J Clin Invest. 2007, V. 117, no. 5, pp. 13701380.

61. Li Y. and Prives C. Are interactions with p63 and p73 involved in mutant p53 gain of oncogenic function? Oncogene. 2007, V. 26, no. 15, pp. 2220-2225.

62. Lin K. W., Nam S. Y., Toh W. H., Dulloo I. and Sabapathy K. Multiple stress signals induce p73beta accumulation. Neoplasia. 2004, V. 6, no. 5, pp. 546-557.

63. Lin Y. L., Sengupta S., Gurdziel K., Bell G. W., Jacks T. and Flores E. R. p63 and p73 transcriptionally regulate genes involved in DNA repair. PLoS Genet: 2009, V. 5, no. 10, pp. el000680.

64. Liu G. and Chen X. The C-terminal sterile alpha motif and the extreme C-terminus regulate the transcriptional activity of the alpha isoform of p73. J Biol Chem. 2005, no.

65. Liu G., Nozell S., Xiao H. and Chen X. DeltaNp73beta is active in transactivation and growth suppression. Mol Cell Biol. 2004, V. 24, no. 2, pp. 487-501.

66. Loots G. G. and; Ovcharenko I. rVISTA 2.0: evolutionary analysis of transcription factor binding sites. Nucleic Acids Res. 2004,. V. 32, no. Web Server issue, pp. W217-221.

67. Maisse C., Munarriz E., Barcaroli D., Melino G. and De Laurenzi V. DNA damage induces the rapid and selective degradation of the DeltaNp73 isoform, allowing apoptosis to occur. Cell Death Differ. 2004, V. 11, no. 6, pp. 685-687.

68. Makos M., Nelkin B. D., Lerman M. I., Latif F., Zbar B. and Baylin S. B. Distinct hypermethylation patterns occur at altered chromosome loci in human lung and colon cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, V. 89, no. 5, pp. 19291933.

69. Mantovani R. The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y. Gene. 1999, V. 239, no. 1, pp. 15-27.

70. McCoy C., McGee S. B. and Cornwell M. M. The Wilms' tumor suppressor, WT1, inhibits 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate activation of the multidrug resistance-1 promoter. Cell Growth Differ. 1999, V. 10, no. 6, pp. 377-386.

71. Melino G., De Laurenzi V. and Yousden K. H. p73: Friend or foe in tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 2002, Y. 2, no. 8, pp. 605-615.

72. Melino G., Lu X., Gasco M., Crook T. and Knight R. A. Functional regulation of p73 and p63: development and cancer. Trends Biochem Sci. 2003, V. 28, no. 12, pp. 663-670.

73. Menendez D., Inga A. and Resnick M. A. The expanding universe of p53 targets. Nat Rev Cancer. 2009; V. 9, no. 10, pp. 724-737.

74. Mills A. A., Zheng B., Wang X. J., Vogel H., Roop D. R. and Bradley A. p63 is ap53 homologue required for limb and'epidermal morphogenesis. Nature. 1999; V. 398, no. 6729; pp. 708-713.j

75. Moll U. M. and Slade N. p63 and p73: roles in development and tumor formation. Mol Cancer Res. 2004, V. 2, no. 7, pp. 371-386.

76. Muller M., Schleithoff E. S., Stremmel W., Melino G., Krammer P. H. and Schilling T. One, two, three~p53, p63, p73 and chemosensitivity. Drug Resist Updat. 2006, V. 9, no. 6, pp. 288-306.

77. Munro A. J., Lain S. and Lane D. P. P53 abnormalities and outcomes in colorectal cancer: a systematic review. Br J Cancer. 2005, V. 92, no. 3, pp. 434444.

78. Negrini S., Gorgoulis V. G. and Halazonetis T. D. Genomic instability—an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010, V. 11,, no. 3, pp. 220-228:

79. Nemajerova A., Palacios G., Nowak N. J., Matsui S. and Petrenko O. Targeted deletion of p73 in mice reveals its role in T cell development and' lymphomagenesis. PLoS One. 2009, Y. 4, no. 11, pp. e7784.

80. Oren M:, and Levine A. J. Molecular cloning of a cDNA specific for theinurine* p53 cellular tumor antigen Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, V. 80, no. 1, pp. 56-59.

81. Osbom M. T. and Chambers T. C. Role of the stress-activated/c-Jun NH2-terminal protein kinase pathway in the cellular response to adriamycin and other chemotherapeutic drugs. J Biol Chem. 1996, V. 271, no. 48, pp. 30950-30955.

82. Perez C. A., Ott J., Mays D. J. and Pietenpol J. A. p63 consensus DNA-binding site: identification, analysis and application into a p63MH algorithm. Oncogene. 2007, V. 26, no. 52, pp. 7363-7370. '

83. Perez C. A. and Pietenpol J. A. Transcriptional programs regulated by p63 in normal epithelium and tumors. Cell Cycle. 2007, V. 6, no. 3, pp. 246-254.

84. Peters M. A., Janer M., Kolb S., Jarvik G. P., Ostrander E. A. and Stanford J. L. Germline mutations in the p73 gene do not predispose to familial prostate-brain cancer. Prostate. 2001, V. 48, no. 4, pp. 292-296.

85. Petitjean A., Cavard C., Shi H., Tribollet V., Hainaut P. and Caron de Fromentel C. The expression of TA and DeltaNp63 are regulated by different mechanisms in liver cells. Oncogene. 2005, V. 24, no. 3, pp. 512-519.

86. Petrenko O., Zaika A. and Moll U. M. deltaNp73 facilitates cell immortalization and cooperates with oncogenic Ras in cellular transformation in vivo. Mol Cell Biol. 2003, V. 23, no. 16, pp. 5540-5555.

87. Pluta A., Nyman U., Joseph B., Robak T., Zhivotovsky B. and Smolewski P. The role of p73 in hematological malignancies. Leukemia. 2006, V. 20, no. 5, pp. 757-766.

88. Polager S. and Ginsberg D. p53 and E2f: partners in life and death. Nat Rev Cancer. 2009, V. 9, no. 10, pp. 738-748.

89. Riley T., Sontag E., Chen P. and Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008, V. 9, no. 5, pp. 402-412.

90. Rocco J. W., Leong C. O., Kuperwasser N., DeYoung M. P. and Ellisen L. W. p63 mediates survival in squamous cell carcinoma by suppression of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell. 2006, V. 9, no. 1, pp. 45-56.

91. Rosenbluth J. M., Mays D. J., Pino M. F., Tang L. J. and Pietenpol J. A. A gene signature-based approach identifies mTOR as a regulator of p73. Mol Cell Biol. 2008, V. 28, no. 19, pp. 5951-5964.

92. Sampath J., Sun D., Kidd V. J., Grenet J., Gandhi A., Shapiro L. H., Wang Q., Zambetti G. P. and Schuetz J. D. Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1. J Biol Chem. 2001, V. 276, no. 42, pp. 39359-39367.

93. Sarkadi B., Homolya L., Szakacs G. and Varadi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters: participation in a chemoimmunity defense system. Physiol Rev. 2006, V. 86, no. 4, pp. 1179-1236.

94. Schavolt K. L. and Pietenpol J. A. p53 and Delta Np63 alpha differentially bind and regulate target genes involved in cell cycle arrest, DNA repair and apoptosis. Oncogene. 2007, V. 26, no. 42, pp. 6125-6132.

95. Schwartz D. I., Lindor N. M., Walsh-Vockley C., Roche P. C., Mai M., Smith D. I., Liu W. and Couch F. J. p73 mutations are not detected^ in sporadic and» hereditary breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 1999, V. 58, no. 1, pp. 25-29.

96. Scotto, K. W. Transcriptional regulation of ABC drug transporters: Oncogene.2003; V. 22, no: 47, pp. 7496-7511.4

97. Senoo M:, Manis J. P., Alt F. W. and McKeon F. p63 and p73 are not required for the development and p53-dependent apoptosis of T cells. Cancer Cell. 2004, V. 6, no. l,pp. 85-89.

98. Sheps J. A. and Ling V. Preface: the concept and consequences of multidrug resistance. Pflugers Arch. 2007, V. 453, no. 5, pp. 545-553.

99. Speidel D. Transcription-independent p53 apoptosis: an alternative route to death. Trends Cell Biol. 2010, V. 20, no. 1, pp. 14-24.

100. Stanley L. A., Horsburgh B. C., Ross J., Scheer N. and Wolf C. R. Drug transporters: gatekeepers controlling access of xenobiotics to the cellular interior. Drug Metab Rev. 2009, V. 41, no. 1, pp. 27-65.

101. Stefansson I. M., Salvesen H. B. and Akslen L. A. Loss of p63 and cytokeratin 5/6 expression is associated with more aggressive tumors in endometrial carcinoma patients. Int J Cancer. 2006, V. 118, no. 5, pp. 1227-1233.

102. Stiewe T. and Putzer B. M. Role of p73 in malignancy: tumor suppressor or oncogene? Cell Death Differ. 2002, V. 9, no. 3, pp. 237-245.

103. Stiewe T., Theseling C. C. and Putzer B. M. Transactivation-deficient Delta TA-p73 inhibits p53 by direct competition for DNA binding: implications for tumorigenesis. J'Biol Chem. 2002, V. 277, no. 16, pp. 14177-14185.

104. Stiewe T., Tuve S., Peter M., Tannapfel A., Elmaagacli A. H. and Putzer B. M. Quantitative TP73 transcript analysis in hepatocellular carcinomas. Clin Cancer Res. 2004, V. 10, no. 2, pp. 626-633.

105. Szakacs G., Paterson J. K., Ludwig J. A., Booth-Genthe C. and Gottesman M. M. Targeting multidrug resistance in cancer. Nat Rev Drug Discov. 2006, V. 5, no. 3, pp. 219-234.

106. Talos F., Nemajerova A., Flores E. R., Petrenko O. and Moll U. M. p73 suppresses polyploidy and aneuploidy in the absence of functional p53. Mol Cell. 2007, V. 27, no. 4, pp. 647-659.

107. Tanaka Y., Kameoka M., Itaya A., Ota K. and Yoshihara K. Regulation of HSF1 -responsive gene expression by N-terminal truncated form of p73alpha. Biochem Biophys Res Commun. 2004, V. 317, no. 3, pp. 865-872.

108. Tannapfel A., John K., Mise N., Schmidt A., Buhlmann S., Ibrahim S. M. and Putzer B. M. Autonomous growth and hepatocarcinogenesis in transgenic mice expressing the p53 family inhibitor DNp73. Carcinogenesis. 2008, V. 29, no. 1, pp. 211-218.

109. Thottassery J. V., Zambetti G. P., Arimori K., Schuetz E. G. and Schuetz J. D. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, V. 94, no. 20, pp. 11037-11042.

110. Ueda Y., Hijikata M., Takagi S., Chiba T. and Shimotohno K. New p73 variants with altered C-terminal structures have varied transcriptional activities. Oncogene. 1999, V. 18, no. 35, pp. 4993-4998.

111. Uramoto H., Sugio K., Oyama T., Nakata S., Ono K., Morita M., Funa K. and Yasumoto K. Expression of deltaNp73 predicts poor prognosis in lung cancer. Clin Cancer Res. 2004, V. 10, no. 20, pp. 6905-6911.

112. Urist M. J., Di Como C. J., Lu M. L., Charytonowicz E., Verbel D., Crum C. P., Ince T. A., McKeon F. D. and Cordon-Cardo C. Loss of p63 expression is associated with tumor progression in bladder cancer. Am J Pathol. 2002, V. 161, no. 4, pp. 1199-1206.

113. Vayssade M., Haddada H., Faridoni-Laurens L., Tourpin S., Valent A., Benard J. and Aliomadegbe J. C. P73 functionally replaces p53 in Adriamycin-treated, p53-deficient breast cancer cells. Int J Cancer. 2005, V. 116, no. 6, pp. 860-869.

114. Vella V., Puppin C., Damante G., Vigneri R., Sanfilippo M., Vigneri P., Tell G. and Frasca F. DeltaNp73alpha inhibits PTEN expression in thyroid cancer cells. Int J Cancer. 2009, V. 124, no. 11, pp. 2539-2548.

115. Vilgelm A., El-Rifai W. and Zaika A. Therapeutic prospects for p73 and p63: rising from the shadow of p53. Drug Resist Updat. 2008, V. 11, no. 4-5, pp. 152-163.

116. Vincenzi B., Cesa A. L., Santini D., Schiavon G., Grilli C., Graziano F. and Tonini G. Predictive factors for response to chemotherapy in colorectal cancer patients. Crit Rev Oncol Hematol. 2004, V. 52, no. 1, pp. 45-60.

117. Vogelstein B. Cancer. A deadly inheritance. Nature. 1990,- V. 348, no. 6303, pp. 681-682.

118. Vossio S., Palescandolo E., Pediconi N., Moretti F., Balsano C., LevreroM. and Costanzo A. DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene. 2002, V. 21, no. 23, pp. 3796-3803.

119. Vousden К. H. Outcomes of p53 activation—spoilt for choice. J Cell Sci. 2006, V. 119, no. Pt 24, pp: 5015-5020.

120. Vousden, К. H. and Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 2009, V. 137, no. 3, pp. 413-431.

121. Wales M. M., Biel M. A., el Deiry W., Nelkin B. D., Issa J. P., Cavenee W. K., Kuerbitz S. J. and Baylin S. B. p53 activates expression of ШС-1, a new candidate tumour suppressor gene on 17pl3.3. Nat Med. 1995, V. 1, no. 6, pp. 570-577.

122. Wallner J., Depisch D., Gsur A., Gotzl M., Haider K. and Pirker R. MDR1 gene expression and its clinical relevance in primary gastric carcinomas. Cancer. 1993, V. 71, no. 3, pp. 667-671.

123. Wang J., Liu Y. X., Hande M. P., Wong A. C., Jin Y. J. and Yin Y. TAp73 is a downstream target of p53 in controlling the cellular defense against stress. J Biol Chem. 2007, V. 282, no. 40, pp. 29152-29162.

124. Wang S. and El-Deiry W. S. p73 or p53 directly regulates human p53 transcription to maintain cell cycle checkpoints. Cancer Res. 2006, V. 66, no. 14, pp. 6982-6989.

125. Yuan Z. M., Shioya H., Ishiko T., Sun X., Gu J., Huang Y. Y., Lu H., Kharbanda S., Weichselbaum R. and Kufe D. p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature. 1999, V. 399, no. 6738, pp. 814-817.

126. Zaika A. I., Kovalev S., Marchenko N. D. and Moll U. M. Overexpression of the wild type p73 gene in breast cancer tissues and cell lines. Cancer Res. 1999, V. 59, no. 13, pp. 3257-3263.

127. Zaika A. I., Slade N., Erster S. H., Sansome C., Joseph T. W., Pearl M., Chalas E. and Moll U. M. DeltaNp73, a dominant-negative inhibitor of wild-type p53 and TAp73, is up-regulated in human tumors. J Exp Med. 2002, V. 196, no. 6, pp. 765-780.

128. Zastawny R. L., Salvino R., Chen J., Benchimol S. and Ling V. The core promoter region of the P-glycoprotein gene is sufficient to confer differential responsiveness to wild-type and mutant p53. Oncogene. 1993, V. 8, no. 6, pp. 1529-1535.

129. Zeng Y. X., Somasundaram K. and el-Deiry W. S. AP2 inhibits cancer cell growth and activates p21WAFl/CIPl expression. Nat Genet. 1997, V. 15, no. 1, pp. 78-82.

130. Zhang B., Chambers K. J., Leprince D., Faller D. V. and Wang S. Requirement for chromatin-remodeling complex in novel tumor suppressor HIC1-mediatedtranscriptional repression and growth control. Oncogene. 2009, V. 28, no. 5, pp. 651-661.

131. Zhang Q., Wang S. Y., Fleuriel C., Leprince D., Rocheleau J. V., Piston D. W. and Goodman R. H. Metabolic regulation of SIRT1 transcription via a fflCl:CtBP corepressor complex. Proc Natl Acad Sci USA. 2007, V. 104, no. 3, pp. 829-833.1. БЛАГОДАРНОСТИ

132. Выражаю особую признательность Александру Ивановичу Заике за сотрудничество.

133. Благодарю всех сотрудников Лаборатории биологии гена ИМБ РАН за дружеское отношение, помощь и ценные советы.

Информация о работе

Вильгельм, Анна Эдгартовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Экспрессия и функции генов семейства p53 в опухолях желудочно-кишечного тракта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы