Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль белка HP1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика
Автореферат диссертации по теме "Роль белка HP1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster"
На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4.
САВИЦКИЙ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ
Роль белка НР1 в регуляции длины теломер у ИгозоркИа те1апо£а$1ег
Специальность 03.00 26 - молекулярная генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2003
Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН
Научный руководитель:
Чл.-корр. РАН, профессор, доктор биологических наук П.Г. Георгиев Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор А.И. Ким, кандидат биологических наук В.Е. Алаторцев.
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Защита диссертации состоится ноября 2003 года в ут часов на заседании Диссертационного совета Д 0020.37.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.
Автореферат разослан "_' октября 2003 года.
•I
Ученый секретарь Диссертационного совета канд.фарм.наук
-¡¿¡о&е*
Грабовская Л.С.
2.ооз-А,
I ¿Еоо
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Теломеры - это нуклеопротеиновый комплекс, который находится на концах линейных хромосом. Линейные хромосомы в результате неполной репликации постоянно укорачиваются, кроме гого, их концы по сути являются двуцепочечными разрывами, которые в норме должны подвергаться репарации. Таким образом, ключевые функции теломер заключаются в специфическом узнавании и защите терминальной ДНК от системы репарации, а также поддержании длины теломерных последовательностей, что обеспечивает стабильность хромосом и, следовательно, поддерживает целостность генома.
В большинстве случаев, новые последовательности ДНК на конец хромосомы добавляются РНК-зависимым ферментом теломеразой, которая действует как обратная транскриптаза. Такие теломеры состоят из огромного числа коротких тандемно повторяющихся повторов. При нарушении функций теломеразы происходит укорачивание терминальных последовательностей хромосомы, нарушается работа теломерного комплекса, концы хромосом начинают узнаваться репарационной системой, появляется ряд других нарушений, что, в конечном счете, приводит к гибели клеток. В некоторых случаях клетки выживают благодаря включению альтернативного механизма удлинения теломер. В основе этого механизма лежат процессы рекомбинации и терминальной конверсии. Организмы, утерявшие по каким-либо причинам в процессе эволюции теломеразу, также используют рекомбинацию/конверсию для поддержания длины теломер. Теломеры этих организмов состоят из повторяющихся субьединиц, но в отличие от коротких теломеразных повторов они большего размера. Кроме того, они сильно отличаются в пределах систематически близких групп, и даже на разных хромосомах одного вида. Терминальные последовательности хромосом Б melanogaster составляют повторы НеТ-А и ТАЛТ ретротранспозонов, которые перемещаются на конец хромосомы посредством обратной транскрипции, либо в результате рекомбинации или конверсии
Строение теломерных комплексов у организмов, имеющих теломеразо-зависимую регуляцию длины теломер, уже изучено достаточно детально. В тоже
РОС. ...............-
I
время известно только два белка, входящих в комплекс, юпирующий концы хромосом D.melanogaster. НР1 (heterochromatin protein 1) и HOAP(HPl/ORC associated protein). Утверждение об их кэп-функции базируется на следующих фактах: эги белки находятся на концах хромосом, и мутации в генах, кодирующих белки НР1и НОАР, приводят к многочисленным спайкам между теломерами разных хромосом (Fanti et al, 1998; Ccnci et al, 2003). Помимо этого, недавно были локализованы два фактора, находящиеся на третьей хромосоме и влияющие на длину теломер. Эти, пока еще неопределенные, гены получили названия Tel (Telomere elongation) (Siriaco et al, 2002) и E(tc) (Enchancer of telomere conversion) (Melnikova and Georgiev, 2002). Таким образом, до настоящего времени, не было известно ни одного белка, вовлеченного в регуляцию длины теломер у D. melanogaster.
Известно, что хромосомы D.melanogaster с делетироваными теломерными последовательностями, нормально передаются из поколения в поколение, если терминальная делеция не затрагивает функционально значимые гены. Ранее нами была разработана генетическая система, позволяющая оценивать частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией (Kahn et al, 2000). В основе этой системы лежит использование хромосомы с обрывом в гене yellow. Использование этой системы позволило прояснить роль белка НР1 в контроле длины теломер у D.melanogaster.
Цель и задачи исследования.
Основная цель данной работы состояла в изучении роли белка НР1 в регуляции длины теломер у D.melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Создать генетическую систему на основе локуса yellow для определения
коротких конверсионных трактов.
2. Определить влияние мутаций Su(var)2-5, гена кодирующего НР1, на частоту
присоединений к концу хромосомы с терминальной делецией, и на частоту
генных конверсий.
3. Изучить полученные присоединения НеТ-А и TART элементов с целью
установления природы их происхождения.
4. Определить влияние мутаций Яи(уаг)2-5 на транскрипцию НеТ-А элементов.
5. Оценить длину теломер в линиях В.те1апо£а.ч1ег, несущих мутантные аллели
8и(\<аг)2-5.
Научная новизна и практическое значение работы
В данной работе впервые показано, что ген 8и(тг)2-5 вовлечен в регуляцию длины теломеры. Различные мутации этого гена в гетерозиготе увеличивают частоту присоединений НеТ-А и ТАЯТ элементов к концам терминальных делеций более чем в 100 раз. Присоединения в данном случае происходят в результате транспозиций или рекомбинации. Роль белка НР1 в регуляции длины теломер подтверждается также тем, что линии с мутациями в гене Зи(уаг)2-5, поддерживаемые в течение ряда поколений несут длинные теломеры. Таким образом, НР1 играет существенную роль в поддержании длины теломер у О.
те1апо%а$1ег.
Методы и подходы, используемые в данной работе, позволяют адекватно оценивать изменения, происходящие на теломерах, что открывает возможности их применения для тестирования факторов, которые предположительно могут быть функционально значимыми для поддержания функций теломер.
Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на 41-й и 43-й ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Питсбург, 2000 г., Сан Диего, 2002 г.); на международной конференции "Молекулярная генетика эукариот" в Москве (2003), на межлабораторном семинаре ИБГ РАН, Москва, 2003 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах, включает Ч таблиц и20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя2&5" источников.
Результаты
На фоне мутаций Su(var)2-S возрастает частота присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делсцией. Белок НР1 является вероятным кандидатом на участие в контроле длины теломер у Drosophila melanogaster, поскольку он находится на теломерах, а мутации в гене Su(var)2-5, кодирующем НР1, нарушают нормальное поведение теломер, а именно: приводят к их слипанию "конец в конец" (Fanti et al., 1998). В лаборатории Пимпинелли (Pimpinelli) также было покачано, что мутации и Su(var)2-
505 нарушают взаимодействие НР1 с нативными теломерами, а также с хромосомами, несущими терминальные делеции.
Мы предположили, что уменьшив концентрацию функционального НР1 белка, путем введения Su(var)2-5 мутаций, возможно будет наблюдать за изменением длины теломер D.melanogaster, которые состоят из тандемно повторяющихся НеТ-А и TART ретротранспозонов. Нами было проверенно влияние Su(var}2-5 мутаций на частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией. Для этого вышеупомянутые Su(var)2-5 мутации были протестированы в описанной раннее (Mikhailovsky et al., 1999; Kahn et al., 2000), но несколько модифицированной, генетической системе. Для изучения частоты присоединений НеТ-А и TART элементов к нарушенному концу хромосомы мы использовали терминальные делеции Х-хромосомы с обрывом в гене yellow, обозначенные как yTD. Экспрессия гена yellow зависит от того, в каком месте гена находится обрыв. Присоединение последовательностей ДНК, будь то последовательности гена yellow (Mikhailovsky et al., 1999) или НеТ-А элемента (Kahn et al., 2000), закономерно изменяет характер его транскрипции. Поскольку ген yellow контролирует пигментацию в кутикуле, эти изменения легко наблюдать фенотипически, и таким образом учитывать частоту присоединений к терминальным последовательностям гена yellow.
Для экспериментов нами были отобраны пять линий с генотипом уто/у ас; If/CyO, терминальные последовательности которых находились в районе от-700 до -300 пн от начала транскрипции гена yellow. Далее самки yTD/y ас; If/CyO были
скрещены с самцами у ас; Su(var)2-5/CyO. Из потомства были отобраны самки yTD/y ac;Su(var)2-5/CyO и скрещены с самцами у ас, Su(var)2-5/CyO. Также из этого же скрещивания были отобраны самки уто/у ас; If/CyO и самцы у ас; IflCyO, линии, полученные в результате этого скрещивания, служили контролем. Мониторинг за появлением новых yellow фенотипов проводился в течение пяти-семи поколений. Поскольку частота терминальных присоединений была схожей для разных yTD линий результаты суммированы в Таблице 1.
Каждая из четырех Su(var)2-5 мутаций показала сильный доминантный эффект на частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к гену yellow (Таблица 1). В первом поколении частота НеТ-А присоединений в линиях ут/у ас; Su(var)2-5/CyO была сравнимой с таковой в контрольных линиях yTD/y ас; If/CyO. Однако, в последующих поколениях частота присоединений НеТ-А и TART элементов была в сто раз выше на фоне Su(var)2-5 мутаций. Отсутствие присоединений в первом поколении можно объяснить сильно выраженным материнским эффектом. Приблизительно одинаковые частоты HeT-A/TART присоединений вызывают все протестированные в нашей генетической системе Su(var)2-5 мутации, включая Su(var)2-505, ноль аллель, и Su(var)2-5m , мутация, которая не препятствует связыванию НР1 с теломерами и не вызывает теломер-теломерных слипаний (Fanti et al., 1998).
Используемые Su(var)2-5 мутации имеют различное происхождение, поэтому маловероятно, что наблюдаемый нами эффект зависит от какой-нибудь другой гипотетической мутации, случайно сцепленной в этих линиях с Su(var)2-5. Для исключения возможного влияния генотипа мы ввели в линии yTD/y ас; Su(var)2-501/CyO и в ут"/у ас; Su(var)2-505/СуО дупликацию Dp(2;2)P90, перекрывающую ген Su(var)2-5. Dp(2;2)P90 несет функциональную копию Su(var)2-5 гена. В присутствии Dp(2;2)P90 частота присоединений НеТ-А и TART элементов сильно уменьшается (Таблица 1), подтверждая роль мутаций гена Su(var)2-5 в активации присоединений НеТ-А и TART ретротранспозонов. Полученные результаты показывают, что протестированные Su(var)2-5 мутации в гетерозиготе приводят, по крайней мере, к стократному повышению частоты
Таблица 1. Частота HeT-A/TART присоединений на фоне мутаций Su{var)2-5
Sufvar) Поколение q(f2-f,),
мутации f, f2 f3 f4 f5 f6 f7 %
IF/CyO 1/ 2/ 0/ 1/ 0/ 2/ 1/ 0.06
1100 1320 1560 1820 1920 2440 1469
Su(var)2-5al 2/ 226/ 332/ 616 / 364/ 145/ 143/ 22
740 1253 1817 2211 1271 967 802
Su(var)2-5°2 6/ 140/ 303/ 171/ 108/ 43/ 62/ 20
800 983 1122 791 620 273 353
Su(var)2-5" 0/ 181 / 130/ 96/ 18/ 21
Su(var)2-f5 525 733 515 584 146
0/ 98/ 128/ 70/ 61/ 67/ 14
460 820 578 459 311 720
Su(var)2-5 - - - 80/ 9/ 2/ 4/ 0.35*
/Dp(2;2)P90 806 1457 1365 1417
Жирным шрифтом выделены цифры отражающие число мух с новым у фенотипом, обыкновенным шрифтом - общее число самок ута в каждом поколении. О, средняя частота видимых событий (в %). *В случае линий 5и(шг)2-5 /Вр(2;2)Р90 величина О подсчитывалась для поколений Из-И?.
присоединений НеТ-А и TART элементов к деградирующей последовательности гена yellow.
Скорость деградации концевых последовательностей не изменяется на фоне Su(var)2-5 мутаций. Хромосомы с терминальными делециями у D.melanogaster теряют в среднем около 70-75 пн за поколение в результате недорепликации концов хромосом при каждом клеточном делении (Biessmann and Maison, 1988; Biessmann et al., 1990, 1992). Для изучения скорости деградации концов хромосом в присутствии Su(var)2-5 мутаций, мы собирали мух в течение шести поколений из линий yw/y ас; Su(var)2-5/CyO и контрольных линий yTD/y ас: If/CyO и выделили из них ДНК. Для каждого поколения посредством Саузерн-блот анализа был определен размер терминальных фрагментов (рис. 1В). В линиях с Su(var)2-5 мутациями, как и в контрольных, потеря терминальных последовательностей ДНК происходила с одинаковой скоростью: 70-80 пн за поколение. Таким образом, Su(var)2-5 мутации не оказывают видимого влияния на стабильность конца хромосомы.
Возможные механизмы НеТ-А and TART присоединений к терминальным последовательностям гена yellow. Ранее нами было показано, что присоединение последовательностей НеТ-А к деградирующему концу хромосомы может осуществляться путем транспозиции, конверсии или в результате рекомбинации З'конца НеТ-А элемента с НеТ-А элементом на другой хромосоме (Kahn et al., 2000).
Чтобы определить природу HeT-A/TART присоединений, полученных на фоне Su(var)2-5 мутаций, мы поставили перед собой следующие задачи: определить длины новых ДНК присоединений, установить структуру мест стыка между геном yellow и новоприобретенными ДНК последовательностями.
Для определения длины присоединений мы использовали Саузерн-блот анализ (рис. 1С). В случаях присоединений длинных (более 7-10 тин) ДНК последовательностей, было возможно определить только минимальный размер, поскольку присоединившиеся последовательности обычно имеют добавочные сайты узнавания для используемых рестрицирующих эндонуклеаз. Размер новых присоединений варьировал от 1.4 тпн до более 20 тпн (рис. 1С, 3).
Чтобы обнаружить новые присоединения, которые не могли быгь отобраны по фенотипу (например: присоединения TART элементов к терминальной последовательности гена yellow, уже утерявшей промотор), мы также протестировали всех потомков (дочерей, несущих терминальную делецию), полученных от 10 самок, Саузерн-блот анализом. Все самки в потомстве одной из десяти отобранных самок приобрели новые последовательности ДНК (рис. 1D). У некоторых из них эти новоприобретенные последовательности имели идентичные рестрикционныс карты, указывающие на то, что эти события произошли в клетках полового пути на ранних премейотических стадиях. Однако в большинстве случаев рестрикционные карты различаются, что в свою очередь говорит о присоединениях, возникающих независимо на более поздних стадиях (рис. 1D). Таким образом, присоединения новых ДНК последовательностей на фоне Su(var)2-5 мутаций происходят на разных стадиях оогенеза.
Для определения точного места присоединений предполагаемые участки стыка между нуклеотидной последовательностью гена yellow и новыми
y2(A.) -► i'{А*)
присоединившимися элементами были амплифицированы с помощью ПЦР и отсеквенированы. Таким образом были определенны последовательности мест стыка для 43 событий.
Анализ точек стыка показал, что присоединения НеТ-А и TART элементов к терминальным последовательностям гена yellow не являются сайтспецифическими и носят случайный характер. Только в одно место гена yellow , а именно в сайт АААА в районе промотора, было заре! истрировано чешре независимых присоединения (-28 а, Ь, с, d). Во всех случаях, кроме одного (+84а), между геном yellow и НеТ-А последовательностями были адениновые основания. Последовательность 3' конца НеТ-А элемента (5' CCAGCAAAGTT 3') была консервативной в половине случаев присоединений (19 из 38). В других НеТ-А присоединениях часто отсутствовал последний Т (15 случаев) или 2-3 последних нуклеотида (4 случая). В некоторых из этих случаев между геном yellow и НеТ-А элементом появились короткие добавочные последовательности, которые оказались гомологичными последовательностям, расположенным в 3' конце (-981) или в 5' нетранслируемой области (-470) НеТ-А элемента. В двух случаях (-55 и -59) присоединения ДНК несли две тандемпые копии 3' конца НеТ А с поли-А трактом.
Рис. 1. Молекулярная структура хромосом с терминальными делециями в районе гена yellow.
(A) Схема локуса гена yellow в районе обрына хромосомы с указанием у фенотипов Черными прямоугольниками обозначена кодирующая часть гена yellow. Место начала транскрипции показано горизонтально расположенной стрелкой. Прерывистыми линиями обозначены области гена yellow, в которых различаются закономерности смены фенотипов при присоединении к ним НеТ-А или TART. Фра|менты Kpnl-EcoRV и HamH\-ErnR\, используемые в качестве зондов для Саузерн-блот гибридизации, показаны толстыми черными линиями внизу схемы. Маленькими стрелками отмечены места присоединений НеТ-А (внизу линии) и TART элементов (сверху). Номера присоединений соответствуют их месту прикрепления относительно сайта начала транскрипции гена yellow. Сайтспецифические эндонуклеазы обозначены следующим образом: В, BamHl; К, Крп\. Н, tfmrflll, Е, EcoRV; N, NruV, S, Spei.
(B) Эффект мутации Su(var)2-f на степень деградации конца хромосомы. ДНК была обработана рестриктаэой ЕсоЮ. В качестве зонда использовался фрагмент BamHl-ELoRl. Полосы более высокого молекулярного веса в F2 - F4 на фоне Su(var)2-50, мутации указывают на новые присоединения к деградирующему концу хромосомы.
(C) НеТ-А и TART присоединения к терминальной делеции в гене yellow. ДНК обработана следующими рсстриктазами: EcoRV (Е), Nru\ (N), Spei (S) В качестве зонда использовался фрагмент Kpn\-EcoR\.
(D) НеТ-А и TART присоединения, полученные в потомстве одной самки ут0/у ас: Su(var)2-50i/CyO у'-подобного фенотипа. ДНК для Саузерн-блот анализа была обработана рсстриктазами Kpnl (К) и ЕсоЮ/ (Е) В качестве зонда использовался фрагмент Kpnl-EcoRV.
Маленький размер присоединившейся ДНК последовательности, наличие олиго(А) и консервативный 3' конец указывают на присоединение НеТ-А элемента к деградирующему концу гена yellow путем транспозиции (Kahn et al., 2000). Этим критериям удовлетворяют 7 из 11 коротких ДНК присоединений. Напротив, большой размер ДНК присоединений, наличие всего нескольких адениновых оснований между последовательностями гена yellow и присоединенной ДНК, а также нуклеотидные замены в консервативном в норме 3' терминальном триплете свидетельствуют в пользу рекомбинации между деградирующим концом гена yellow и 3' концом теломерного НеТ-А элемента. В четырех случаях присоединения обладают всеми вышеперечисленными чертами, а в трех большой размер присоединенной ДНК сочетается с олиго(А) в гене yellow. Эти присоединения также могли возникнуть в результате рекомбинации. Однако, в большинстве случаев данные Саузерн-блот гибридизации и секвенирования не позволяют точно провести границу между двумя возможными механизмами присоединения НеТ-А элементов: транспозицией и рекомбинацией. Нам представляегся вероятным, что Su(var)2-5 мутации способны индуцировать оба механизма.
Su(var)2-S мутации не усиливают генную конверсию по матрице на гомологичной хромосоме. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что хромосомы с терминальной делецией могут частично восстанавливаться при помощи генной конверсии, используя в качестве матрицы гомологичную хромосому (Mikhailovsky et al., 1999). Поскольку частота таких событий сильно зависит от генетического фона соответствующей линии, мы проверили частоту концевых удлинений ДНК на фоне Su(var)2-5 мутаций.
В первой серии экспериментов, мы проверили способность Su(var)2-5 мутаций индуцировать длинные конверсионные тракты. С этой целью были отобраны две линии с терминальными делениями, концы которых находились приблизительно в районах 550 пн (у70'550) и -1100 пн (у70'"00) от начала транскрипции гена yellow. В качестве матрицы для генной конверсии использовался у' аллель (у w хромосома). Этот аллель несет точечную замену (ATG -> cTG) в первом кодоне гена yellow (Morris et al., 1998) и, следовательно, непродуктивную кодирующую часть, что
Таблица 2. Частота НеТ-А/ТЛЯТ присоединений и генных конверсий в линиях ут/у'на фоне мутаций 5и(шг)2-5
Поколение Su(var)2-5 мутации Общее кол-во Конверсии Присоединения
No o,% No Q, %
F, Su(var)2-5* 4522 12 0.27 2 0.04
Su(var)2-5°! 3067 14 0.45 1 0.03
Su(var)2-5°< 1290 3 0.23 0 <0.07
Su(var)2-5"s 2175 10 0.45 1 0.05
F2 Su(var)2-5* 3821 15 0.40 1 0.03
Su(var)2-50! 1246 3 0.24 162 13
Su(var)2-5" 1548 1 0.06 375 24
Su(var)2-5°s 1266 2 0.16 243 20
Fj Su(var)2-5* 2484 18 0.72 0 <0.04
Su(var)2-501 648 2 0.31 102 15
Su(var)2-5'" 984 1 0.10 162 16
Su(var)2-f 1690 2 0.12 281 17
N0 — общее число мух с новыми у фенотипами, получившимися в результате генных конверсий или в результате присоединений НеТ-А или ГЛЙГэлементов. Жирным шрифтом выделена средняя частота видимых событий <3 (в %,).
А
En-w
En-b
minimal detectable conversion track
___________£_______
y'
__^ H К ^^
ATATAAAA cTG AcccqgqA ATG
x-vV
fi&f
A
ytai
Рис. 2. Модельная система для изучения восстановления терминального конца гена yellow путем генной конверсии по матрице, находящейся на гомологичной хромосоме, на фоне мутаций Su(var)2-5. Схема, сопоставляющая yTD аллели с аллелями, которые использовались в качестве матрицы для генной конверсии. Показана молекулярная структураУ и/"" мутаций. Энхансеры крыльев (En-w) и тела (Fn-b) изображены п пиде овалов. Толстыми черными линиями показаны взятые в эксперимент yTD аллели, их левые концы соответствуют приблизительному месту обрыва в гене yellow. Линией, состоящей из точек, показан минимальный конверсионный тракт, который можно зафиксировать по изменению фенотипа yellow Пунктиром обозначена область гена yellow, приобретение хотя бы части которой в результате генной конверсии ведет к образованию нового / фенотипа. Толстые линии в верхней части рисунка отражают фрагменты, которые использовались как зонды для Саузерн-блот анализа. Сайтспецифическиеэндонуклеазы: A, Sail, С, С1а\. Другие обозначения такие же как на рис. 1.
фснотипически проявляется отсутствием кутикулярной пигментации у мух во всех частях тела. Важно отметить, что этот нуль аллель несет не измененную 5' регуляторную часть, что и было использовано в данном эксперименте. Присоединение НеТ-А или TART элементов к концу делетированной хромосомы в утй линии приводит к возникновению у2(А+) фенотипа. Добавление же хотя бы энхансеров тела (-1600 пн) в результате генной конверсии частично восстанавливает экспрессию гена yellow в теле (/- yellow revertant). Чем длиннее конверсионный тракт, тем больший участок 5' регуляторной области гена yellow приобретает yTD аллель, и тем ближе экспрессия гена yellow к дикому типу, что хорошо заметно по интенсивности пигментации крыльев и кутикулы тела. Таким образом, используя уТ0'!5П и yTD'um линии, мы могли фиксировать (рис. 2) конверсионные тракты длиной от 1050 пн и 500 пн соответственно.
Нами были синтезированы линии yTD/y w; Su(var)2-504/CyO and yTD/y w; Su(var)2-505/CyO. В течение трех поколений проводилось наблюдение за появлением мух с новым у фенотипом (Таблица 2). В результате генной конверсии появлялись самки у фенотипа, в то время как присоединения НеТ-А и TART элементов давали самок фенотипа у2(А+). В первом поколении линии, несущие Su(var)2-5 мутации, и контрольные линии имели сходную частоту присоединений и конверсионных событий. Однако в двух последующих поколениях частота НеТ-А и TART присоединений возросла в сто раз, в то время как частота конверсионных событий не изменилась.
Хотя полученные результаты свидетельствуют, что Su(var)2-5 мутации увеличивают только частоту присоединений HeT-A/TART элементов, остается вероятность существования коротких конверсионных событий, идентификация которых в вышеописанной системе была не возможна. Для проверки этой возможности мы разработали специальную генетическую систему, позволяющую фиксировать небольшие конверсионные тракты порядка 100-200 пн (рис. 2). Нами была отобрана линия yTD+250 с терминальной делецией, оканчивающейся в кодирующей части гена yellow. yTD*2,° хромосома была соединена с У" хромосомой, в которой ТАТА-промотор (ТАТААА) гена yellow заменен на CCCGGG (Morris et al., 1999). В результате этой замены мухи имеют желтые
щетинки. Раннее нами было показано, что промотор НеТ-А элемента способен активировать транскрипцию гена yellow, и химерная HeT-A-yellow мРНК дает функциональный продукт при условии сохранения стартового ATG кодона гена yellow (Kahn et al., 2000); 1акие мухи имеют ^-подобный фенотип. Таким образом, присоединение НеТ-А элементов восстанавливало бы yellow пигментацию в щетинках только в тех случаях, когда ATG кодон был бы введен на конец производных уто*2,° линии в результате произошедшей раньше генной конверсии по у""" матрице. Таким образом, учитывая 20% вероятность присоединения НеТ-А элемента (Таблица 1), мы были способны различать фенотипически каждое пятое конверсионное событие.
Нами были синтезированы семь независимых yTD*250/y""°w; Su(var)2-5/CyO линий с Su(var)2-504 или Su(var)2-5as мутантными аллелями. Все сконструированные линии в первом поколении несли делению с концом в районе +250 от начала транскрипции гена yellow. Таким образом, в этих линиях отсутствовал ATG старт-кодон гена yellow (+171). Полученные ут" линии наблюдались в течение трех поколений. В общей сложности нами были проанализированы фенотипы около 5000 самок, несущих делецию. В результате было найдено только две самки у2-подобного фенотипа. В обоих случаях НеТ-А элемент был присоединен к последовательности гена yellow перед ATG старт-кодоном, указывая на то, что частичное восстановление гена yellow произошло до присоединения НеТ-А элемента. Частота конверсий в данном случае составляет около 0,2%. Это значение не выходит за рамки значений, определенных предыдущим экспериментом (Таблица 2).
Таким образом, Su(var)2-5 мутации предпочтительно увеличивают частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу усеченной хромосомы, в то время как частота генных конверсий по ДНК матрице, находящейся на гомологичной хромосоме, не изменяется.
Линии Drosophila с Su(var)2-5 мутациями обычно содержат большое количество НеТ-А и TART элементов. Поскольку, полученные нами данные свидетельствуют о высокой частоте ДНК присоединений к концу терминальной делеции на фоне Su(var)2-5 мутаций, мы предположили, что линии, долгое время
А НеТ-А
QSP Т' TTTD
Рис. 3. Относительное содержание НеТ-А и ТАЯТ элементов в линиях с мутациями Зи(тк1г)2.5.
(A) Схемы строения НеТ-А и ТАЯТ элементов. Толстые черные линии под схемами обозначают зонды, использованные при Саузерн-блот анализе.
(B) Определение копийности НеТ-А и ТАКТ элементов Саузерн-блот анализом в линиях 5и(уаг)2-5. Использованные сокращения- * помечены линии, в которые мутации 5и&аг)2-5 введены относительно недавно (Ьи е! а1. 2000). Зи(\>аг)02* - Д/(7М у1™"'",-Зи(уаг)2-501/СуО, у ; 8и^аг)04" - 0/(1)к, у'к""\ Зи(уаг)2-504/СуО, у': Зи(шг)05* -ОГ(1)к, у'у/6"1'; 5и(тг)2-?ЧСуО. /. Зи(тг!01 - 1//СуО Зи(уаг)2-?'Ш1; Би(уаг)04 ■ у'к"с1': $и(уаг)2-5ы/СуО, у*; &1(}>шг)0} - Зи(уаг)2-5т/1п(2Ь)Су' 1п(2Я)Су, Ор(2,2)Р90 - у к, Ор(2;2)Р9()/СуО,у*. ДНК была обработана эндонуклеазами ВатН\ (В) или £соШ (Я).
развивающиеся на фоне Su(var)2-5 мутаций, должны обладать длинными теломерами. Чтобы определить относительную длину теломер Drosophila, мы оценили содержание НеТ-А и TART в разных линиях, несущих Su(var)2-5 мутации.
В качестве контроля нами использовались линии Oregon, у ас, и Gaiano. Известно, что линия Gaiano, полученная из природной популяции, имеет очень длинные теломеры (Mason et al., 2000; Siriaco et al., 2002). Для получения более объективной картины при гибридизации мы использовали зонды из разных частей НеТ-А и TART элементов (рис. ЗА).
Мы нашли, что ДНК, изолированная из Su(var)2-50', Su(var)2-5m и Su(var)2-505 линий, при гибридизации с меченными зондами из НеТ-А и TART элементов дает приблизительно одинаковый по интенсивности сигнал по сравнению с ДНК из линии Gaiano (рис. ЗВ) и значительно более сильный по сравнению с другими контрольными линиями, Oregon и у ас. Это означает, что хромосомы этих
Su(var)2-5 линий несут очень длинные теломерные повторы НеТ-А и TART элементов, близкие по длине к теломерам линии Gaiano.
Однако, в линиях у; Su(var)2-501/CyO, у*, у; Su(var)2-5M/CyO. у* и у; Su(var)2-5°!/CyO, у\ любезно предоставленных Джойлом Эйссенбергом (Joel Eissenberg), длина HeT-A/TART повторов была значительно меньше. Последние три линии были синтезированы недавно: около полутора лет назад относительно времени наших экспериментов (Lu et al., 2000). Линии же Su(var)2-5 поддерживались в течении многих лет. Можно предположить, что увеличение длины теломер на фоне Su(var)2-5 мутаций - процесс не настолько стремительный, чтобы его последствия было легко наблюдать при помощи Саузерн-блот анализа всего через полтора года после введения мутаций.
Su(var)2-S мутации активируют транскрипцию НеТ-А элементов. НеТ-А и TART элементы относятся к семейству ретротранспозонов, не содержащих длинные терминальные повторы. Их транспозиция в новое место происходит в результате обратной транскрипции. То есть, чем больше транскриптов, тем активнее ретротранспозоны перемещаются.
Белок НР1, как известно, вызывает транскрипционную репрессию (Eissenberg et al., 1990; Eissenberg and Elgin, 2000). Мы предположили, что белок НР1 также подавляет транскрипцию НеТ-А элементов, a Su(var)2-5 мутации ее восстанавливают, что увеличивает количество транскриптов и, как следствие, увеличивается частота транспозиций НеТ-А элементов.
Для проверки выдвинутого предположения, мы сравнили транскрипцию НеТ-А элементов в линии дикого типа и на фоне Su(var)2-5 мутаций. Было обнаружено, что линии с мутациями Su(var)2-y , Su(vof)2-5 , Su(vnr)2-5 и Su(var)2-5os, а также линия Gaiano содержат значительно больше НеТ-А транскриптов, чем контрольные линии Oregon и у ас (рис. 4А,В).
Чтобы исключить вклад высокой копийности НеТ-А элементов в увеличение числа транскриптов, мы также исследовали транскрипцию НеТ-А элементов в Su(var)2-5/CyO и lf/CyO самках, полученных в F, и F2 после скрещивания самок у ас; If/CyO с самцами Su(var)2-5 (рис. 4В). В самках Su(var)2-5/CyO и If/CyO из F,
Рис. 4. Анализ транскрипции ИеТ-Л элементов на фоне мутаций Su(var)2-S.
(A) Нозерн-блот анализ РНК из следующих линии: ln(l)w~"': Su(var)2-5'" /ln(2L)'In(2R)Cy Cy'Roi'pR'cn'. [Su(var)04/Cy]t Df(l)w. y'w6"2'; Su(mr)2-f2/CyO. / [Su(var)02/Cy]; Oregon R\ ln(l)W*k: Su(var)2-?'/In(2L)Cy' In(2R)Cy lSu(var)05/C]); Gaiano, у ас. В качестве зонда использовался фрагмент ДНК из открытой рамки считывания НеТ-А элемента. Длина основного детектируемого транскрипта составляет 6 тпн. Проба из гена ras2 гибридизусгся с транскриптом 1.6 тип; одинаковая интенсивность этих полос в разных пробах свидетельствует об одинаковом количестве тотальной РНК, взятой на Нозерн-блот анализ.
(B) Изменение транскрипции ИеТ-А элементов при введении мутаций Su(var)2-5. Линии Gaiano и lf/CyO использованы в качестве контроля, отражающего высокий и низкий уровень транскрипции соответственно.
отмечен приблизительно одинаковый невысокий уровень транскрипции НеТ-А элементов (рис. ЗВ), что коррелирует с низким уровнем НеТ-А присоединений к терминально делетированым хромосомам и может быть объяснено значительным вкладом материнского НР1 белка. Однако, в Рг мы наблюдали значительное повышение уровня транскрипции НеТ-А элементов у самок 8и^аг)2-5/СуО, в то время как экспрессия в контрольных самках ¡рСуО не изменилась.
Обсуждение результатов.
Белок НР1 участвует в контроле длины теломер у ОторИИа melanogasler.
НР1 первый из идентефицированных белков, который участвует в кепировании концов хромосом у D.melanogaster (РапП е1 а1. 1998а). На теломерах также присутствует белок НОАР. Мутации в генах, кодирующих эти белки, имеют
одинаковое фенотипическое проявление, и часто приводят к неправильному поведению хромосом (Cenci et al. 2003b). В результате образуются спайки между хромосомами. Особенно часто встречаются теломер-теломерные слияния так, что на препаратах митотических хромосом иногда видны цепочки слившихся конец в конец хромосом. Белки специфически взаимодействуют друг с другом и находятся на концах хромосом в составе теломерного белкового комплекса НР1/НОАР, отличного от комплекса HP1/ORC/HOAP, необходимого для инициации сборки гетерохроматина на ранних эмбриональных стадиях (Shareef et al. 2003;Shareef et al. 2001a).
В наших экспериментах мы использовали хромосомы с терминальными делециями, с обрывом, находящимся в гене yellow. Ранее на D.melanogaster было показано, что хромосомы с отсутствующими терминальными последовательностями благополучно передаются из поколения в поколение, не теряются и не приводят к значимым нарушениям в процессе развития (Biessmann et al. 1992;Biessmann ct al. 1990b;Biessmann et al. 1990a;Levis 1989), и это прямо указывает на то, что конец таких хромосом защищен кепирующим комплексом. Кроме того, на концах таких нарушенных хромосом, также как и на нормальных хромосомах, обнаружены белки НР1 и HOAP (Cenci et al. 2003a;Fanti et al. 1998c). Таким образом, белки кепирующего комплекса способны сиквенс-неспецифически связываться с концами хромосом, а терминальные делеции обладают свойствами нормальных хромосом и являются замечательной модельной системой для изучения теломер у дрозофилы.
Нами было обнаружено, что на фоне мутаций Su(var)2-5 частота присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией увеличивается более чем в сто раз. Также в нашей лаборатории было показано, что мутациями в гене Su(var)2-5 усиливается способность концов хромосом удлиняться путем генной конверсии, если матрица для синтеза ДНК находится на той же самой, а не на гомологичной хромосоме (Savitsky et al. 2002). Такой сильный доминантный эффект мутаций наводит на мысль, что для регуляции длины теломер важна концентрация белка НР1. Роль белка НР1 в регуляции длины теломер подтверждаетя также тем, что линии, которые в течении
многих лет велись на фоне мутаций Su(var)2-5, имели очень длинные последовательности НеТ-А и TART повторов.
Белок НР1 содержит два домена N-концевой CD (chromo domain) и С-концевой CSD (chromo shadow domain), которые соединены между собой линкерной последовательностью (Eissenberg and Elgin 2000). При помощи CSD осуществляются большинство белок-белковых взаимодействий, в которые может быть вовлечен НР1. Некоторые из эшх взаимодействий, возможно, важны для привлечения НР1 на теломеры. CSD в частности способен связываться с N-концевым пептидом гистона Н4 (Zhao et al. 2000), взаимодействовать с белком Ku70 (Song et al. 2001a), который входит репарационный комплекс, узнающий двуцепочечные разрывы ДНК и играет немаловажную роль в поддержании теломер у млекопитающих и дрожжей (de Lange 2002;Hopfner et al. 2002). Эти факты могут объяснить сиквенс-неспецифическое связывание НР1 стеломерами.
Мутация Su(var)2-501 , в отличие от других мутаций, не вызывает хромосомных аберраций. Однако, в наших экспериментах она имела такой же сильный эффект на удлинение хромосом как и мутация Su(mr)2-5os, которая является функциональным аналогом ноль-мутации гена Su(var)2-5. Таким образом, по-видимому, CD не критичен для связывания белка НР1 с теломерами и поддержания их защитных функций, но необходим для супрессии элонгации теломер. Мутация Su(var)2-502 приводит к образованию белка НР1 с заменой V26M в CD, что нарушает связывание НР1 с МеНЗК9 (Jacobs et al. 2001b;Jacobs and Khorasanizadeh 2002b;Nielsen et al. 2001 ¡Nielsen et al. 2002b) и приводит к значительному ослаблению репрессии в гетерохроматине. На тсломерах политенных хромосом D.melanogaster были обнаружены метил-трансферазы гистона НЗ Su(var)3-9 (Schotta et al. 2002b) и E(z) (Czermin et al. 2002), которые, метилируя лизин 9 гистона НЗ, создают сайты связывания для CD НР1 (Jacobs and Khorasanizadeh 2002a;Lachner et al. 2001 ¡Bannister et al. 2001 ¡Nielsen et al. 2002a;Jacobs et al. 2001a), a также белок Su(var)3-7 (Delattre et al. 2000), который является составной частью гетерохроматин-образующего белкового комплекса Su(var)3-9/HPl/Su(var)3-7 (Schotta et al. 2002a). Образование теломерного гетерохроматина можно рассматривать как один из механизмов негативной
регуляции длины теломер; репрессионный статус хроматина препятствует частым рекомбинациям, как это происходит в гетерохроматине у D.melanogaster (Westphal and Reuter 2002) или в субтеломерных районах у Saccharomyces cerevisiae (Wright and Zakian 1995;Wright ct al. 1992). В тоже время, рекомбинацией теломерных повторов может происходить удлинение теломер (Kahn et al. 2000;Roth et al. 1997;McEachern and Blackburn 1996;Pluta and Zakian 1989), а короткие теломеры у дрожжей проявляют повышенную рекомбинационную активность (McEachern and Iyer 2001). Таким образом, на теломерах дрозофилы, возможно, собирается репрессионный комплекс, который делает конец хромосомы менее доступным, в данном случае, для белков участвующих в транспозиции НеТ-А и TART элементов и белковых комплексов, осуществляющих репликацию и рекомбинацию, а роль CD, по-видимому, заключается в стабилизации этого комплекса.
Другое объяснение особым свойствам НР1 с нарушенным CD можно предложить, исходя из участия теломер в общей архитектуре ядра. Известно, что у S.cerevisiae теломеры расположены кластерами вблизи периферии ядра (Gotta et al. 1996;Laroche et al. 2000). Кроме того, у дрожжей нарушение локализации теломер на ядерной оболочке коррелирует с уменьшением теломерного сайленсинга (Galy et al. 2000;Tham and Zakian 2002;Dubrana et al. 2001). В частности, такие изменения происходят в штаммах мутантных по уКи70 и уКи80 (Gotta and Gasser 1996). В качестве кандидатов, способных участвовать в подобном процессе у дрозофилы, можно рассматривать белок LBR (Lamin В Receptor) и белок Ku70. То есть, нарушенный CD изменяет характер взаимодействия CSD НР1 с Ku70 (Song et al. 2001b) и модулирует их в составе комплекса HP1/(H3/H4)/LBR (Polioudaki et al. 2001). Нарушения локализации теломер на ядерной ламине с одновременным изменением репрессионного статуса в свою очередь приводит к тому, что конец хромосомы становится более мобильным, более доступным для других белков, вовлеченных в регуляцию длины теломер.
Осталась не освещена роль линкерного участка белка НР1, который соединяет CD и CSD. До недавнего времени считалось, что, будучи столь не консервативным среди разных организмов, он выполняет только связующую роль между доменами, обеспечивая их подвижность относительно друг друга. Сейчас уже показано, что
I
I
А
линкерный участок HP! у дрозофилы способствует его рекрутированию в гетерохроматин (Smothers and Henikoff 2001). Кроме того, интересные результаты были получены на Xenopus: при исследовании связывания HP 1а с хроматином in vitro, оказалось, что ни CD ни CSD самостоятельно не могут связываться с хроматином, тогда как линкер самостоятельно или вместе с CD делали это успешно (Meehan et al. 2003). Безусловно линкерная область НР1 также важна для создания комплекса НОАР/НР1 на теломерах, так как именно она определяет специфичность взаимодействия между этими белками (Badugu et al. 2003b). Более того, в белке НОАР имеется специальный PETEMNE мотив взаимодействующий исключительно с последовательностью линкера. Интересно, что именно в линкерном районе находятся 3 из б найденных в НР1 консенсусов для разных протеинкиназ, и поскольку особенности фосфорилирования НР1 сказываются на гетерохроматине (Eisscnberg et al. 1994;Zhao and Eissenberg 1999;Zhao et al. 2001), разумно предположить участие особых фосфорилированных форм НР1 в теломерном комплексе. К сожалению, пока не ясно как комплекс НОАР/НР1 привлекается на конец хоромосомы, но оба белка являются ключевыми в поддержании его стабильности.
Мутации в гене Su(var)2-5 способствуют удлинению хромосомы разными способами. Нами было показано, что мутации Su(var)2-5 увеличивают транскрипцию НеТ-А и TART элементов. Также известно, что НР1 находится на теломерных НеТ-А и TART элементах (Badugu et al. 2003а), что подтверждает роль НР1 в репрессии их транскрипции. С другой стороны, теломерные НеТ-А и TART последовательности не приводят к установлению сайленсинга на прилежащих последовательностях генов yellow и white (Kahn et al. 2000;Biessmann et al. 1992;Golubovsky et al. 2001;Savitsky et al. 2003). Это указывает скорее на специфическую репрессию белком НР1 промоторов НеТ-А элементов, которая влияе1 на их транскрипцию и, соответственно, отражается на частоте их транспозиций. Таким образом, повышение частоты транспозиций, происходящих в результате обратной транскрипции, можно объяснить изменением транскрипционной активности НеТ-А элементов.
Однако, наличие НР1 на теломерах и в особенности на терминальных делециях, плюс выполнение белком защитных функций, что обсуждалось в предыдущей главе, указывает на двоякую роль НР1 в процессе поддержания длины теломер. Ряд фактов указывает на то, что высокий уровень транскрипции НеТ-А элементов не обязательно сопутствует высокой частоте транспозиций. Так, некоторые мутации Su(var) при заметно более высоком уровне транскрипции НеТ-А элементов не показали значимого увеличения частоты транспозиций на конец хромосомы с терминальной делецией (Кравчук О, личное сообщение). Другой аналогичный результат был получен Т.Кан (личное сообщение). В этом случае были синтезированы специальные линии, которые несли Х-хромосому с терминальной делецией и хромосомы из линии Gaiano. Линия Gaiano происходит из природной популяции и обладает экстремально длинными теломерами. На третьей хромосоме в этой линии был локализован доминантный фактор, положительно влияющий на длину теломер и названный Tel (Telomere elongation) (Siriaco et al. 2002). Используя линию Gaiano в наших экспериментах в качестве контроля, нами был установлен высокий уровень транскрипции НеТ-А элементов в линии. Оказалось, что этого не достаточно для значительного повышения количества транспозиций на конец хромосомы. Иными словами, мутации в гене Su(var)2-5 повышают уровень удлинения терминальных последовательностей в такой степени, что объяснения только увеличением транспозиций в следствие изменения транскрипции НеТ-А элементов явно не достаточно.
Раннее нами было показано, что последовательность НеТ-А элемента, находясь на конце терминальной делеции, может восстанавливаться путем генной конверсии, если матрица находится на гомологичной хромосоме (Kahn et al. 2000). В данной работе мы продемонстрировали, что частота генных конверсии по гомологичной хромосоме на фоне мутации Su(var)2-5 не меняется. В тоже время в лаборатории Георгисва П.Г. были получены результаты, из которых следовало, что увеличение частоты конверсии на фоне мутаций Su(var)2-5 возможно при условии, если гомологичная матрица находится на конце той же самой хромосомы. В данном случае использовалась терминальная делеция с дуплицированной последовательностью гена yellow на конце. Терминальная последовательность
1000-1500 пн длиной (в зависимости от степени деградации конца хромосомы) проксимальнее имела свою копию, от которой была отделена 12 тпн фрагментом ДНК (Melnikova and Georgiev 2002). В данной генетической системе получилось, что при введении мутаций Su(var)2-5 не только увеличивается частота генных конверсий, но одновременно происходит и уменьшение числа присоединений НеТ-А и TART последовательностей, по сравнению с экспериментами, где использовались простые терминальные делеции (Savitsky et al. 2002). Эти результаты прямо подтверждают двоякую роль белка НР1 в регуляции длины теломер у D.melanogaster. Таким образом, при недостатке белка НР1 стимулируются разные механизмы удлинения терминальных последовательностей.
У млекопитающих, дрожжей, некоторых простейших теломерная ДНК может находиться в двух конформационных состояниях. Одна из них закрытая конформация - Т-петля, которая образуется в результате отжига 3' оверхенга, или как его еще называют G-хвоста, на предшествующих двуцепочечных теломерных повторах той же хромосомы. В результате инвазии одноцепочечного G-хвоста в двуцепочечную ДНК образуется D-петля, по строению напоминающая репликационную вилку. Подобная конформация называется закрытой, потому что конец теломеры спрятан и не доступен для теломеразы (Stansel et al. 2001;Greider 1999). Если же петля размыкается (открытая конформация), то конец становится доступным и происходит теломеразо-зависимое удлинение. Длина Т-петели варьирует у разных организмов от 300 пн у трипаносомы до 30 тпн в мышиных клетках (Munoz-Jordan et al. 2001;Murti and Prescott 1999;Gnffith et al. 1999). Такое разброс указывает на то, что сама Т-петля не является функциональной единицей, а функциональную нагрузку несет D-петля, стабильность которой и определяет доступность конца для теломеразы.
Возможность удлинения концевых последовательностей по матрице находящейся на той же хромосоме указывает, что структура подобная Т-петле образуется и у D.melanogaster. Возможно, НР1 принимает участие в стабилизации D-петли, и таким образом способствует образованию Т-петли. Под стабилизацией D-петли мы понимаем, что НР1 вероятно не только способствует поддержанию этой структуры, но и репрессирует инициацию репликации. В результате
уменьшения концентрации НР1 нарушается установившееся равновесие: причем в основном снимается запрет на репликацию, в то время как образование Т-петли остается возможным. Именно невысокая частота присоединений НеТ-А и TART элементов в данном случае говорит в пользу того, что конец "спрятан" в D-петле а теломера находится в закрытой конформации. Таким образом, наличие гомологической последовательности является определяющим для образования Т-петли и, соответственно, диктует способ, каким будет происходить удлинение концевых последовательностей. Поэтому в экспериментах с использованием простых терминальных делеций мы наблюдали высокую частоту именно транспозиций ИеТ-А и TART элементов. Поскольку теломеры дрозофилы состоят из НеТ-А и TART повторов, возможно, что такой механизм контроля длины теломер посредством конформационных модуляций реализуется и у D.melanogaster.
Хотя для понимания роли НР1 и других теломеросвязывающих белков в контроле длины теломер у D melanogatter требуется большая степень детализации На данном этапе, можно утверждать, что, по-видимому, несмотря на очевидные отличия организации и структуры теломерного хроматина у млекопитающих, дрожжей и D melanogaiter, всеми для контроля длины теломер используются сходные базовые механизмы.
Выводы
1. Создана генетическая система на основе локуса yellow для определения коротких
конверсионных трактов.
2. Впервые показано, что белок НР1 - негативный регулятор длины теломер у
D melanogaster. Мутаций Su(var)2-5 увеличивают частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией.
3. Удлинение конца хромосомы на фоне мутаций Su(var)2-5 может происходить
разными способами.
4. Показано, что НР1 репрессирует транскрипцию НеТ-А элементов.
5. Продемонстрировано, что линии D.melanogaster, несущие мутантные аллели
Su(var)2-5, имеют длинные теломеры.
Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи
1. Kahn Т., Savitskv М., Georgiev P. Attachment of НеТ-А sequences to chromosomal
termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol. Cell. Biol., 2000, Vol. 20, No. 20, p. 7634-7642.
2.Геор1иев П.Г., Мельникова JI.C., Кан Т.Г., Кравчук О.И., Михайловский С.С., Савицкий М.Ю. Различные механизмы регуляции длины теломер. Мол. Биол., 2000, т.34, №5, с.743-752.
3. Savitskv М. , Kravchuk О., Melnikova L., Georgiev P. Heterochromatin protein 1 is
involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol., 2002, Vol. 22, No.9, p. 3204-3218.
4. Savitskv M.. Kahn Т., Pomerantseva E., Georgiev P. Transvection at the end of
truncated chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics, 2003, 163, p. 13731387. Тезисы
1. Georgiev P., Kahn Т., Savitskv M.. Addition of telomere-associated HeT-a
DNAsequences to the chromosoma ends may occur either by transposition or by geneconversion in Drosophila melanogaster. 16,h European Drosophila Research Conference, September 29 to October 2,1999, Zurich, Switzerland., C-09, p.60
2. Georgiev P., Kahn Т., Savitskv M., Melnikova L.. Addition of telomere-associated
HeT-a DNA sequences to the chromosoma ends may occur by transposition or conversion/recombination in Drosophila. 41я Annual Drosophila Research Conference, March 22-26,2000, Pittsburgh, Pennsylvania, 239A, p. a84
3. Georgiev P., Savitskv M.. Kravchuk O., Melnikova L. Heterochromatin protein 1 is
involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. 43м Annual Drosophila Research Conference, April 10-14, 2002, San Diego, California, 314A, p. al09.
4. Savitskv M.. Kahn Т., Pomerantseva E., Georgiev P. Transvection at the end of
truncated chromosome in Drosophila melanogaster. International conference "Molecular genetics of eucanotes", Moscow, 4-7 February 2003, Russian Academy of Sciences Institute of Gene Biology, p. 30.
t
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 393 тираж 100 экз. Подписано в печать 13. 10. 2003 г.
1 ¿200 №16 8 0 0
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савицкий, Михаил Юрьевич
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Теломеры: структурное разнообразие
2.2. Организация теломер у почкующихся дрожжей и млекопитающих
2.3. Альтернативные пути удлинения теломер
2.4. НеТ-А и TART элементы, особенности строения
2.5. Ретротранспозоны и их участие в построении теломер
2.6. Известные факторы, связанные с функциями теломер у Drosophila melanogaster
2.7. Теломеры локализуются на ядерной оболочке
2.8. Теломерный эффект положения у D.melanogaster
2.9. Эволюционные аспекты особенностей теломер D.melanogaster
2.9.1. Теломеры дрозофилы утеряли теломеразу
2.9.2. Происхождение субтеломерных повторов D.melanogaster
2.9.3. Теломераза и non-LTR ретротранспозоны
2.10. HP 1 - структурные особенности
2.11. HP 1 и регуляция транскрипции
2.12. Роль метилирования К9НЗ в хромосомной локализации НР
2.13. Белки НР1, Su(var)3-9 и Su(var)3-7 действуют в комплексе, образуя прицентромерный гетерохроматин
2.14. Теломеры дрозофилы и комплекс HPl/Su(var)3-9/Su(var)3
2.15. Белковые комплексы HP 1 /ORC/HOАР и HP 1/НОАР
2.15.1. Комплекс HP 1/ORC/HOАР инициирует сборку гетерохроматина
2.15.2. Особенности межбелковых взаимодействий в комплексе
HP 1/ORC/HO АР
2.15.3. Белок НОАР сильно изменчив у разных видов Drosophila
2.15.4. На теломерах D.melanogaster находится комплекс HP 1/НОАР
2.16. НР1 взаимодействует с белком Ки
2.17. HP 1 взаимодействует с LBR 57 2.1В. Белок RB взаимодействует с НР
2.19. Белок RB вовлечен в контроль длины телом ер у млекопитающих
2.20. Фосфорилирование НР
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Генетические методы 63 3.1.1. Мутации и линии Drosophila melanogaster
3.2. Молекулярные методы
3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы
3.2.2. Саузерн-блот анализ 64 3.2.2.1. Рестрикция, электрофорез и мобилизация ДНК на мембрану
3.2.2.2. Гибридизация ДНК на мембране с радиоактивными зондами
3.2.3. Амплификация ДНК
3.2.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов
3.2.5. Работа с плазмидной ДНК
3.2.5.1. Трансформация бактериальных клеток плазмидами
3.2.5.2. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса 66 1 3.2.5.3. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
3.2.6. Выделение РНК из мух с протеиназой К
3.2.7. Электрофорез РНК и Нозерн-блот гибридизация
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 69 4.1. На фоне мутаций Su(var)2-5 возрастает частота присоединений НеТ-А и
TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией
4.2. Скорость деградации концевых последовательностей не изменяется на фоне Su(var)2-5 мутаций
4.3. Возможные механизмы НеТ-А and TARТприсоединений к терминальным последовательностям тепа, yellow
4.4. Su(var)2-5 мутации не усиливают генную конверсию по матрице на гомологичной хромосоме
4.5. Линии D.melanogaster с Su(var)2-5 мутациями обычно содержат большое количество НеТ-А и TART элементов
4.6. Su(var)2-5 мутации активируют транскрипцию НеТ-А элементов
5. ОБУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1. Белок НР1 участвует в контроле длины теломер у Drosophila melanogaster
5.2. Мутации в гене Su(var)2-5 способствуют удлинению хромосомы разными способами
6. ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль белка HP1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster"
Теломеры - это нуклеопротеиновый комплекс, который находится на концах линейных хромосом. Линейные хромосомы в результате неполной репликации постоянно укорачиваются, кроме того, их концы, по сути, являются двуцепочечными разрывами, которые в норме должны подвергаться репарации. Таким образом, ключевые функции теломер заключаются в специфическом узнавании и защите терминальной ДНК от системы репарации, а также поддержании длины теломерных последовательностей, что обеспечивает стабильность хромосом и, следовательно, поддерживает целостность генома.
В большинстве случаев новые последовательности ДНК добавляются на конец хромосомы РНК-зависимым ферментом теломеразой, которая действует как обратная транскриптаза. Такие теломеры состоят из огромного числа коротких тандемных повторов. Для большинства эукариот обычны 5-8 нуклеотидные повторы, так, например, у позвоночных это T2AG3 гексамеры, а у насекомых -T2AG2 пентамеры. При нарушении функций теломеразы происходит укорачивание терминальных последовательностей хромосомы, нарушается работа теломерного комплекса, концы хромосом начинают узнаваться репарационной системой, появляется ряд других нарушений, что, в конечном счете, приводит к гибели клеток. В некоторых случаях клетки выживают благодаря включению альтернативного механизма удлинения теломер. В основе этого механизма лежат процессы рекомбинации и терминальной конверсии. Организмы, утерявшие по каким-либо причинам в процессе эволюции теломеразу, также используют рекомбинацию/конверсию для поддержания длины теломер. Теломеры этих организмов состоят из повторяющихся субъединиц, но, в отличие от коротких теломеразных повторов, они большего размера. Кроме того, они сильно отличаются в пределах систематически близких групп и даже на разных хромосомах одного вида. Например, теломеры комаров Anopheles gambae несут повторы из 800 нуклеотидов, a Chironomus pallidmttatus — из 340, причем на разных хромосомах находятся разные семейства этих последовательностей. Эти черты разделяют и субтеломерные повторы Drosophila melanogaster. Терминальные последовательности хромосом D. melanogaster составляют повторы НеТ-А и TART ретротранспозонов, которые перемещаются на конец хромосомы посредством обратной транскрипции либо в результате рекомбинации или конверсии.
Строение теломерных комплексов у организмов, имеющих теломеразо-зависимую регуляцию длины теломер, уже изучено достаточно детально. В тоже время известно только два белка, входящих в комплекс, кэпирующий концы хромосом D.melanogaster: НР1 (heterochromatin protein 1) и HOAP (HP1/ORC associated protein). Утверждение об их кэп-функции базируется на следующих фактах: белки НР1и НО АР находятся на концах хромосом, и мутации в генах, кодирующих эти белки, приводят к многочисленным спайкам между теломерами разных хромосом (Fanti et а1, 1998; Cenci et al, 2003). Помимо этого, недавно были локализованы два фактора, находящиеся на третьей хромосоме и влияющие на длину теломер. Эти, пока еще не определенные, гены получили названия Tel (Telomere elongation) (Siriaco et al, 2002) и Eft с) (Enchancer of telomere conversion) (Melnikova and Georgiev, 2002). Таким образом, до настоящего времени не было известно ни одного белка, вовлеченного в регуляцию длины теломер у D.melanogaster.
Известно, что хромосомы D.melanogaster с делегированными теломерными последовательностями, нормально передаются из поколения в поколение, если терминальная делеция не затрагивает функционально значимые гены. Этот факт не тривиален, поскольку концы хромосом, не имеющие специфических теломерных последовательностей, должны были бы подвергаться репарации, что, в конечном счете, привело бы к аресту клеточного цикла. Жизнеспособность хромосом с терминальными делециями означает, что на их конце присутствует белковый комплекс, узнающий конец хромосомы и защищающий его от системы репарации. Кстати, кэпирующая функция белков НР1 и НО АР подтверждается их наличием на концах терминальных делеций.
Ранее нами была разработана генетическая система, позволяющая оценивать частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией (Kahn et al, 2000). В основе этой системы лежит использование хромосомы с обрывом в гене yellow. Использование этой системы позволило прояснить роль белка НР1 в контроле длины теломер у D.melanogaster.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Савицкий, Михаил Юрьевич
6. выводы
1. Впервые показано, что белок НР1 - негативный регулятор длины теломер у D.melanogaster. Мутации Su(var)2-5 увеличивают частоту присоединений НеТ-А и TART элементов к концу хромосомы с терминальной делецией.
2. Создана генетическая система на основе локуса yellow для определения коротких конверсионных трактов.
3. Установлено, что удлинение конца хромосомы на фоне мутаций Su(var)2-5 может происходить разными способами: транспозицией и рекомбинацией.
4. Показано, что НР1 репрессирует транскрипцию НеТ-А элементов.
5. Продемонстрировано, что линии D.melanogaster, несущие мутантные аллели Su(var)2-5, имеют длинные теломеры.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савицкий, Михаил Юрьевич, Москва
1. Ahmad, K. and S.Henikoff. 2002. The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mol. Cell 9:1191-1200.
2. Ainsztein, A.M., S.E.Kandels-Lewis, A.M.Mackay, and W.C.Earnshaw. 1998. INCENP centromere and spindle targeting: identification of essential conserved motifs and involvement of heterochromatin protein HP1. J. Cell Biol. 143:17631774.
3. Andrulis, E.D., A.M.Neiman, D.C.Zappulla, and R.Sternglanz. 1998. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. Nature 394:592-595.
4. Aparicio, O.M., B.L.Billington, and D.E.Gottschling. 1991. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. Cell 66:1279-1287.
5. Arkhipova, I.R. and H.G.Morrison. 2001. Three retrotransposon families in the genome of Giardia lamblia: two telomeric, one dead. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98:14497-14502.
6. Badugu, R., M.Shareef, Y.Yoo, and R.Kellum. 2003a. HP1/HOAP interaction in vitro and in vivo. 7th Int. Conf. on Drosophila heterohromatin. Ravello, Italy.
7. Badugu, R., M.M.Shareef, and R.Kellum. 2003b. Novel Drosophila HOAP repeat motif in HP 1/НОАР interactions and chromocenter associations. J. Biol. Chem.
8. Bailey, S.M., J.Meyne, D.J.Chen, A.Kurimasa, G.C.Li, B.EXehnert, and E.H.Goodwin. 1999. DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96:1489914904.
9. Ball, L.J., N.V.Murzina, R.W.Broadhurst, A.R.Raine, S.J.Archer, FJ.Stott, A.G.Murzin, P.B.Singh, P.J.Domaille, and E.D.Laue. 1997. Structure of the chromatin binding (chromo) domain from mouse modifier protein 1. EMBO J. 16:2473-2481.
10. Bannister, A.J., P.Zegerman, J.F.Partridge, E.A.Miska, J.O.Thomas, R.C.Allshire, and T.Kouzarides. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410:120-124.
11. Baumann, P. and T.R.Cech. 2000. Protection of telomeres by the Ku protein in fission yeast. Mol. Biol. Cell 11:3265-3275.
12. Baur, J.A., Y.Zou, J.W.Shay, and W.E.Wright. 2001. Telomere position effect in human cells. Science 292:2075-2077.
13. Bianchi, A. and T.de Lange. 1999. Ku binds telomeric DNA in vitro. J. Biol. Chem. 274:21223-21227.
14. Biessmann, H., S.B.Carter, and J.M.Mason. 1990a. Chromosome ends in Drosophila without telomeric DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87:1758-1761.
15. Biessmann, H., L.E.Champion, M.O'Hair, K.Ikenaga, B.Kasravi, and J.M.Mason. 1992a. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster HeT-A transposable elements to receding chromosome ends. EMBO J. 11:4459-4469.
16. Biessmann, H., F.Kobeski, M.F.Walter, A.Kasravi, and C.W.Roth. 1998. DNA organization and length polymorphism at the 2L telomeric region of Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 7:83-93.
17. Biessmann, H. and J.M.Mason. 1988. Progressive loss of DNA sequences from terminal chromosome deficiencies in Drosophila melanogaster. EMBO J. 7:10811086.
18. Biessmann, H. and J.M.Mason. 1997. Telomere maintenance without telomerase. Chromosoma 106:63-69.
19. Biessmann, H., J.M.Mason, K.Ferry, M.d'Hulst, K.Valgeirsdottir, K.L.Traverse, and M.L.Pardue. 1990b. Addition of telomere-associated HeT DNA sequences "heals" broken chromosome ends in Drosophila. Cell 61:663-673.
20. Biessmann, H., K.Valgeirsdottir, A.Lofsky, C.Chin, B.Ginther, R.W.Levis, and M.L.Pardue. 1992b. HeT-A, a transposable element specifically involved in "healing" broken chromosome ends in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 12:3910-3918.
21. Bilaud, Т., C.E.Koering, E.Binet-Brasselet, K.Ancelin, A.Pollice, S.M.Gasser, and E.Gilson. 1996. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res. 24:1294-1303.
22. Blasco, M.A., S.M.Gasser, and J.Lingner. 1999. Telomeres and telomerase. Genes Dev. 13:2353-2359.
23. Blasco, M.A., H.W.Lee, M.P.Hande, E.Samper, P.M.Lansdorp, R.A.DePinho, and C.W.Greider. 1997. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell 91:25-34.
24. Boivin, A., C.Gally, S.Netter, D.Anxolabehere, and S.Ronsseray. 2003. Telomeric associated sequences of Drosophila recruit polycomb-group proteins in vivo and can induce pairing-sensitive repression. Genetics 164:195-208.
25. Boulton, S.J. and S.PJackson. 1998. Components of the Ku-dependent nonhomologous end-joining pathway are involved in telomeric length maintenance and telomeric silencing. EMBO J. 17:1819-1828.
26. Braunstein, M., A.B.Rose, S.G.Holmes, C.D.Allis, and J.R.Broach. 1993. Transcriptional silencing in yeast is associated with reduced nucleosome acetylation. Genes Dev. 7:592-604.
27. Brehm, A. and T.Kouzarides. 1999. Retinoblastoma protein meets chromatin. Trends Biochem. Sci. 24:142-145.
28. Bryan, T.M., A.Englezou, L.Dalla-Pozza, M.A.Dunham, and R.R.Reddel. 1997. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines. Nat. Med. 3:1271-1274.
29. Casacuberta, E. and M.L.Pardue. 2003. Transposon telomeres are widely distributed in the Drosophila genus: TART elements in the virilis group. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100:3363-3368.
30. Cech, T.R., T.M.Nakamura, and J.Lingner. 1997. Telomerase is a true reverse transcriptase. A review. Biochemistry (Mosc.) 62:1202-1205.
31. Cenci, G., G.D.Raffa, G.Siriaco, L.Ciapponi, and M.Gatti. 2003a. Genetic and molecular analysis of Drosophila telomere capping. 7th Int. Conf. on Drosophila heterohromatin. Ravello, Italy.
32. Cenci, G., R.B.Rawson, G.Belloni, D.H.Castrillon, M.Tudor, R.Petrucci, M.L.Goldberg, S.A.Wasserman, and M.Gatti. 1997. UbcDl, a Drosophila ubiquitin-conjugating enzyme required for proper telomere behavior. Genes Dev. 11:863-875.
33. Cenci, G., G.Siriaco, G.D.Raffa, R.Kellum, and M.Gatti. 2003b. The Drosophila HOAP protein is required for telomere capping. Nat. Cell Biol. 5:82-84.
34. Chan, S.W., J.Chang, J.Prescott, and E.H.Blackburn. 2001. Altering telomere structure allows telomerase to act in yeast lacking ATM kinases. Curr. Biol. 11:1240-1250.
35. Cheutin, Т., A.J.McNairn, T.Jenuwein, D.M.Gilbert, P.B.Singh, and T.Misteli. 2003. Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HPl binding. Science 299:721-725.
36. Choi, E.S., H.S.Kim, Y.KJang, S.H.Hong, and S.D.Park. 2002. Two ubiquitin-conjugating enzymes, Rhp6 and UbcX, regulate heterochromatin silencing in Schizosaccharomyces pombe. Mol. Cell Biol. 22:8366-8374.
37. Chung, H.M., C.Shea, S.Fields, R.N.Taub, L.H.Van der Ploeg, and D.B.Tse. 1990. Architectural organization in the interphase nucleus of the protozoan Trypanosoma brucei: location of telomeres and mini-chromosomes. EMBO J. 9:2611-2619.
38. Cleard, F., M.Delattre, and P.Spierer. 1997. SU(VAR)3-7, a Drosophila heterochromatin-associated protein and companion of HP1 in the genomic silencing of position-effect variegation. EMBO J. 16:5280-5288.
39. Cleard, F. and P.Spierer. 2001. Position-effect variegation in Drosophila: the modifier Su(var)3-7 is a modular DNA-binding protein. EMBO Rep. 2:1095-1100.
40. Cockell, M. and S.M.Gasser. 1999. Nuclear compartments and gene regulation. Curr. Opin. Genet. Dev. 9:199-205.
41. Cohn, M. and J.E.Edstrom. 1992a. Chromosome ends in Chironomus pallidivittatus ^ contain different subfamilies of telomere-associated repeats. Chromosoma 101:634640.
42. Cohn, M. and J.E.Edstrom. 1992b. Telomere-associated repeats in Chironomus form discrete subfamilies generated by gene conversion. J. Mol. Evol. 35:114-122.
43. Couteau, F., F.Guerry, F.Muller, and F.Palladino. 2002. A heterochromatin protein 1 homologue in Caenorhabditis elegans acts in germline and vulval development. EMBO Rep. 3:235-241.
44. Cryderman, D.E., E.J.Morris, H.Biessmann, S.C.Elgin, and L.L.Wallrath. 1999. Silencing at Drosophila telomeres: nuclear organization and chromatin structure play critical roles. EMBO J. 18:3724-3735.
45. Danilevskaya, O., A.Lofsky, E.V.Kurenova, and M.L.Pardue. 1993. The Y chromosome of Drosophila melanogaster contains a distinctive subclass of Het-A-related repeats. Genetics 134:531-543.
46. Danilevskaya, O.N., I.R.Arkhipova, K.L.Traverse, and M.L.Pardue. 1997. Promoting in tandem: the promoter for telomere transposon HeT-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell 88:647-655.
47. Danilevskaya, O.N., KXowenhaupt, and M.L.Pardue. 1998a. Conserved subfamilies of the Drosophila HeT-A telomere-specific retrotransposon. Genetics 148:233-242.
48. Danilevskaya, O.N., C.Tan, J.Wong, M.Alibhai, and M.L.Pardue. 1998b. Unusual features of the Drosophila melanogaster telomere transposable element HeT-A are conserved in Drosophila yakuba telomere elements. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95:3770-3775.
49. Delattre, M., A.Spierer, C.H.Tonka, and P.Spierer. 2000. The genomic silencing of position-effect variegation in Drosophila melanogaster: interaction between the heterochromatin-associated proteins Su(var)3-7 and HP1. J. Cell Sci. 113 Pt 23:4253-4261.
50. Dernburg, A.F., K.W.Broman, J.C.Fung, W.F.Marshall, J.Philips, D.A.Agard, and J.W.Sedat. 1996. Perturbation of nuclear architecture by long-distance chromosome interactions. Cell 85:745-759.
51. Dionne, I. and RJ.Wellinger. 1998. Processing of telomeric DNA ends requires the passage of a replication fork. Nucleic Acids Res. 26:5365-5371.
52. Donaldson, K.M., A.Lui, and G.H.Karpen. 2002. Modifiers of terminal deficiency-associated position effect variegation in Drosophila. Genetics 160:995-1009.
53. Doye, V., R.Wepf, and E.C.Hurt. 1994. A novel nuclear pore protein Nupl33p with distinct roles in poly(A)+ RNA transport and nuclear pore distribution. EMBO J. 13:6062-6075.
54. Dyson, N. 1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev. 12:2245-2262.
55. Ehrenhofer-Murray, A.E., M.Gossen, D.T.Pak, M.R.Botchan, and J.Rine. 1995. Separation of origin recognition complex functions by cross-species complementation. Science 270:1671-1674.
56. Eickbush, Т.Н. 1997. Telomerase and retrotransposons: which came first? Science 277:911-912.
57. Eissenberg, J.C. 2001. Molecular biology of the chromo domain: an ancient chromatin module comes of age. Gene 275:19-29.
58. Eissenberg, J.C. and S.C.Elgin. 2000. The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev. 10:204-210.
59. Eissenberg, J.C., Y.W.Ge, and T.Hartnett. 1994. Increased phosphorylation of HP1, a heterochromatin-associated protein of Drosophila, is correlated with heterochromatin assembly. J. Biol. Chem. 269:21315-21321.
60. Eissenberg, J.C. and T.Hartnett. 1993. A heat shock-activated cDNA rescues the recessive lethality of mutations in the heterochromatin-associated protein HP1 of Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 240:333-338.
61. Eissenberg, J.C., G.D.Morris, G.Reuter, and T.Hartnett. 1992. The heterochromatin-associated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. Genetics 131:345-352.
62. Evans, S.K. and V.Lundblad. 1999. Estl and Cdcl3 as comediators of telomerase access. Science 286:117-120.
63. Fanti, L., D.R.Dorer, M.Berloco, S.Henikoff, and S.Pimpinelli. 1998a. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma 107:286-292.
64. Fanti, L., G.Giovinazzo, M.Berloco, and S.Pimpinelli. 1998b. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol. Cell 2:527-538.
65. Fischle, W., Y.Wang, S.A.Jacobs, Y.Kim, C.D.AUis, and S.Khorasanizadeh. 2003. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. 17:1870-1881.
66. Fox, C.A., A.E.Ehrenhofer-Murray, S.Loo, and J.Rine. 1997. The origin recognition complex, SIR1, and the S phase requirement for silencing. Science 276:1547-1551.
67. Fox, C.A., S.L00, A.Dillin, and J.Rine. 1995. The origin recognition complex has essential functions in transcriptional silencing and chromosomal replication. Genes Dev. 9:911-924.
68. Funabiki, H., I.Hagan, S.Uzawa, and M.Yanagida. 1993. Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast. J. Cell Biol. 121:961-976.
69. Galy, V., J.C.Olivo-Marin, H.Scherthan, Y.Doye, N.Rascalou, and U.Nehrbass. 2000. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomeric chromatin. Nature 403:108-112.
70. Garcia-Cao, M., S.Gonzalo, D.Dean, and M.A.Blasco. 2002. A role for the Rb family of proteins in controlling telomere length. Nat. Genet. 32:415-419.
71. George, J.A. and M.L.Pardue. 2003. The Promoter of the Heterochromatic Drosophila Telomeric Retrotransposon, HeT-A, Is Active When Moved Into Euchromatic Locations. Genetics 163:625-635.
72. Geyer, P.K., C.Spana, and V.G.Corces. 1986. On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J. 5:2657-2662.
73. Gilley, D., H.Tanaka, M.P.Hande, A.Kurimasa, G.C.Li, M.Oshimura, and D J.Chen. 2001. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. Л 98:15084-15088.
74. Gotta, M. and S.M.Gasser. 1996. Nuclear organization and transcriptional silencing in yeast. Experientia 52:1136-1147.
75. Gotta, M., T.Laroche, A.Formenton, L.Maillet, H.Scherthan, and S.M.Gasser. 1996. The clustering of telomeres and colocalization with Rapl, Sir3, and Sir4 proteins in wild-type Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 134:1349-1363.
76. Grandin, N., C.Damon, and M.Charbonneau. 2000. Cdcl3 cooperates with the yeast Ku proteins and Stnl to regulate telomerase recruitment. Mol. Cell Biol. 20:8397-8408.
77. Greider, C.W. 1999. Telomeres do D-loop-T-loop. Cell 97:419-422.
78. Greider, C.W. and E.H.Blackburn. 1989. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature 337:331337.
79. Greil, F., J.Delrow, I.van der Kraan, J.Smothers, R.van Driel, S.Henikoff, and B.van Steensel. 2003. Genomi-wide mapping of targets of Drosophila HPl, HPlc, and Su(var)3-9. 7th Int. Conf. on Drosophila heterohromatin. Ravello, Italy.
80. Griffith, J.D., L.Comeau, S.Rosenfield, R.M.Stansel, A.Bianchi, H.Moss, and T.de Lange. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97:503-514.
81. Haber, J.E. 1999. Sir-Ku-itous routes to make ends meet. Cell 97:829-832.
82. Hall, I.M., G.D.Shankaranarayana, K.Noma, N.Ayoub, A.Cohen, and S.I.Grewal. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297:2232-2237.
83. Hande, P., P.Slijepcevic, A.Silver, S.Bouffler, P.van Buul, P.Bryant, and P.Lansdorp. 1999. Elongated telomeres in scid mice. Genomics 56:221-223.
84. Henson, J.D., A.A.Neumann, T.R.Yeager, and R.R.Reddel. 2002. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells. Oncogene 21:598-610.
85. Herrera, E., E.Samper, and M.A.Blasco. 1999. Telomere shortening in mTR-/-embryos is associated with failure to close the neural tube. EMBO J. 18:1172-1181.
86. Herwig, S. and M.Strauss. 1997. The retinoblastoma protein: a master regulator of cell cycle, differentiation and apoptosis. Eur. J. Biochem. 246:581-601.
87. Higashiyama, Т., S.Maki, and T.Yamada. 1995. Molecular organization of Chlorella vulgaris chromosome I: presence of telomeric repeats that are conserved in higher plants. Mol. Gen. Genet. 246:29-36.
88. Higashiyama, Т., Y.Noutoshi, M.Fujie, and T.Yamada. 1997. Zepp, a LINE-like retrotransposon accumulated in the Chlorella telomeric region. EMBO J. 16:37153723.
89. Hiraoka, Y., D.A.Agard, and J.W.Sedat. 1990. Temporal and spatial coordination of chromosome movement, spindle formation, and nuclear envelope breakdown during prometaphase in Drosophila melanogaster embryos. J. Cell Biol. 111:28152828.
90. Horn, D. and G.A.Cross. 1995. A developmentally regulated position effect at a telomeric locus in Trypanosoma brucei. Cell 83:555-561.
91. Hsu, H.L., D.Gilley, S.A.Galande, M.P.Hande, B.Allen, S.H.Kim, G.C.Li, J.Campisi, T.Kohwi-Shigematsu, and D.J.Chen. 2000. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere to prevent end joining. Genes Dev. 14:2807-2812.
92. Huang, H., J.F.Smothers, E.A.Wiley, and C.D.AUis. 1999. A nonessential HPl-like protein affects starvation-induced assembly of condensed chromatin and gene expression in macronuclei of Tetrahymena thermophila. Mol. Cell Biol. 19:36243634.
93. Huang, H., E.A.Wiley, C.R.Lending, and C.D.Allis. 1998b. An HPl-like protein is missing from transcriptionally silent micronuclei of Tetrahymena. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95:13624-13629.
94. Hwang, K.K., J.C.Eissenberg, and HJ.Worman. 2001. Transcriptional repression of euchromatic genes by Drosophila heterochromatin protein 1 and histone modifiers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98:11423-11427.
95. Hwang, K.K. and H.J.Worman. 2002. Gene regulation by human orthologs of Drosophila heterochromatin protein 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293:12171222.
96. Ivanova, A.V., M.J.Bonaduce, S.V.Ivanov, and AJ.Klar. 1998. The chromo and SET domains of the Clr4 protein are essential for silencing in fission yeast. Nat. Genet. 19:192-195.
97. Jackson, J.P., A.M.Lindroth, X.Cao, and S.E.Jacobsen. 2002. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416:556-560.
98. Jacobs, S.A. and S.Khorasanizadeh. 2002. Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail. Science 295:2080-2083.
99. Jacobs, S.A., S.D.Taverna, Y.Zhang, S.D.Briggs, J.Li, J.C.Eissenberg, C.D.Allis, and S.Khorasanizadeh. 2001. Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3. EMBO J. 20:5232-5241.
100. James, T.C. and S.C.Elgin. 1986. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Drosophila melanogaster and its gene. Mol. Cell Biol. 6:3862-3872.
101. Jaquet, Y., M.Delattre, A.Spierer, and P.Spierer. 2002. Functional dissection of the Drosophila modifier of variegation Su(var)3-7. Development 129:3975-3982.
102. Kahn, Т., M.Savitsky, and P.Georgiev. 2000. Attachment of HeT-A sequences to chromosomal termini in Drosophila melanogaster may occur by different mechanisms. Mol. Cell Biol. 20:7634-7642.
103. Kamnert, I., L.Nielsen, and J.E.Edstrom. 1998. A concertedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere. J. Mol. Evol. 46:562-570.
104. Karpen, G.H. and A.C.Spradling. 1992. Analysis of subtelomeric heterochromatin in the Drosophila minichromosome Dpi 187 by single P element insertional mutagenesis. Genetics 132:737-753.
105. Kazazian, H.H., Jr. 2000. Genetics. LI retrotransposons shape the mammalian genome. Science 289:1152-1153.
106. Kellum, R. and B.M.Alberts. 1995. Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosome segregation in Drosophila embryos. J. Cell Sci. 108 ( Pt 4):1419-1431.
107. Kishi, S., X.Z.Zhou, Y.Ziv, C.Khoo, D.E.Hill, Y.Shiloh, and K.P.Lu. 2001. Telomeric protein Pin2/TRF1 as an important ATM target in response to double strand DNA breaks. J. Biol. Chem. 276:29282-29291.
108. Klobutcher, L.A., M.T.Swanton, P.Donini, and D.M.Prescott. 1981. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3' terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 78:3015-3019.
109. Kourmouli, N., G.Dialynas, C.Petraki, A.Pyrpasopoulou, P.B.Singh, S.D.Georgatos, and P.A.Theodoropoulos. 2001. Binding of heterochromatin protein 1 to the nuclear envelope is regulated by a soluble form of tubulin. J. Biol. Chem. 276:13007-13014.
110. Kourmouli, N., P.A.Theodoropoulos, G.Dialynas, A.Bakou, A.S.Politou, I.G.Cowell, P.B.Singh, and S.D.Georgatos. 2000. Dynamic associations of heterochromatin protein 1 with the nuclear envelope. EMBOJ. 19:6558-6568.
111. Kouzarides, T. 2002. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Dev. 12:198-209.
112. Krauskopf, A. and E.H.Blackburn. 1996. Control of telomere growth by interactions of RAP1 with the most distal telomeric repeats. Nature 383:354-357.
113. Laroche, Т., S.G.Martin, M.Gotta, H.C.Gorham, F.E.Pryde, E.J.Louis, and S.M.Gasser. 1998. Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr. Biol. 8:653-656.
114. Laroche, Т., S.G.Martin, M.Tsai-Pflugfelder, and S.M.Gasser. 2000. The dynamics of yeast telomeres and silencing proteins through the cell cycle. J. Struct. Biol. 129:159-174.
115. Larsson, J., J.Zhang, and A.Rasmuson-Lestander. 1996. Mutations in the Drosophila melanogaster gene encoding S-adenosylmethionine synthetase corrected. suppress position-effect variegation. Genetics 143:887-896.
116. Levis, R.W. 1989. Viable deletions of a telomere from a Drosophila chromosome. Cell 58:791-801.
117. Li, В., S.Oestreich, and T.de Lange. 2000. Identification of human Rapl: implications for telomere evolution. Cell 101:471-483.
118. Li, Y., J.R.Danzer, P.Alvarez, A.S.Belmont, and L.L.Wallrath. 2003. Effects of tethering HP1 to euchromatic regions of the Drosophila genome. Development 130:1817-1824.
119. Li, Y., D.A.Kirschmann, and L.L.Wallrath. 2002. Does heterochromatin protein 1 always follow code? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99 Suppl 4:16462-16469.
120. Liang, C., M.Weinreich, and B.Stillman. 1995. ORC and Cdc6p interact and determine the frequency of initiation of DNA replication in the genome. Cell 81:667-676.
121. Lindsley, D.L. and G.Zimm. 2003. The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press. New York. 1992.
122. Litt, M.D., M.Simpson, M.Gaszner, C.D.Allis, and G.Felsenfeld. 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293:2453-2455.
123. Loayza, D. and T.de Lange. 2003. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control. Nature 424:1013-1018.
124. Lohe, A.R. and P.A.Roberts. 1988. Evolution of satellite DNA sequences in Drosophila. In Heterochromatin: Molecular and Structural Aspects. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom. 148-186.
125. Lopez, C.C., L.Nielsen, and J.E.Edstrom. 1996. Terminal long tandem repeats in chromosomes form Chironomus pallidivittatus. Mol. Cell Biol. 16:3285-3290.
126. Lorentz, A., K.Ostermann, O.Fleck, and H.Schmidt. 1994. Switching gene swi6, involved in repression of silent mating-type loci in fission yeast, encodes a homologue of chromatin-associated proteins from Drosophila and mammals. Gene 143:139-143.
127. Lu, B.Y., P.C.Emtage, BJ.Duyf, A.J.Hilliker, and J.C.Eissenberg. 2000. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics 155:699-708.
128. Luan, D.D., M.H.Korman, J.L.Jakubczak, and T.H.Eickbush. 1993. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell 72:595-605.
129. Lundblad, V. and E.H.Blackburn. 1993. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues estl- senescence. Cell 73:347-360.
130. Lyko, F., B.H.Ramsahoye, and RJaenisch. 2000. DNA methylation in Drosophila melanogaster. Nature 408:538-540.
131. Ma, J., K.K.Hwang, HJ.Worman, J.C.Courvalin, and J.C.Eissenberg. 2001. Expression and functional analysis of three isoforms of human heterochromatin-associated protein HPl in Drosophila. Chromosoma 109:536-544.
132. Marshall, W.F., A.F.Dernburg, B.Harmon, D.A.Agard, and J.W.Sedat. 1996. Specific interactions of chromatin with the nuclear envelope: positional determination within the nucleus in Drosophila melanogaster. Mol. Biol. Cell 7:825-842.
133. Martin, S.G., T.Laroche, N.Suka, M.Grunstein, and S.M.Gasser. 1999. Relocalization of telomeric Ku and SIR proteins in response to DNA strand breaks in yeast. Cell 97:621-633.
134. Martinez, J.L., J.E.Edstrom, G.Morcillo, and J.L.Diez. 2001. Telomeres in Chironomus thummi are characterized by different subfamilies of complex DNA repeats. Chromosoma 110:221-227.
135. Mason, J.M., A.Haoudi, A.Y.Konev, E.Kurenova, M.F.Walter, and H.Biessmann. 2000. Control of telomere elongation and telomeric silencing in Drosophila melanogaster. Genetica 109:61-70.
136. Mason, J.M., A.Y.Konev, and H.Biessmann. 2003a. Telomeric position effect in drosophila melanogaster reflects a telomere length control mechanism. Genetica 117:319-325.
137. Mason, J.M., A.Y.Konev, M.D.Golubovsky, and H.Biessmann. 2003b. Cis- and trans-acting Influences on Telomeric Position Effect in Drosophila melanogaster Detected With a Subterminal Transgene. Genetics 163:917-930.
138. McEachern, MJ. and E.H.Blackburn. 1994. A conserved sequence motif within the exceptionally diverse telomeric sequences of budding yeasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91:3453-3457.
139. McEachern, MJ. and E.H.Blackburn. 1996. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. Genes Dev. 10:1822-1834.
140. McEachern, MJ. and S.Iyer. 2001. Short telomeres in yeast are highly recombinogenic. Mol. Cell 7:695-704.
141. Meehan, R.R., C.F.Kao, and S.Pennings. 2003. HP1 binding to native chromatin in vitro is determined by the hinge region and not by the chromodomain. EMBO J. 22:3164-3174.
142. Melnikova, L. and P.Georgiev. 2002. Enhancer of terminal gene conversion, a new mutation in Drosophila melanogaster that induces telomere elongation by gene conversion. Genetics 162:1301-1312.
143. Meloni, A.R., EJ.Smith, and J.R.Nevins. 1999. A mechanism for Rb/pl30-mediated transcription repression involving recruitment of the CtBP corepressor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96:9574-9579.
144. Mikhailovsky, S., T.Belenkaya, and P.Georgiev. 1999. Broken chromosomal ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma 108:114-120.
145. Miller, A.M. and K.A.Nasmyth. 1984. Role of DNA replication in the repression of silent mating type loci in yeast. Nature 312:247-251.
146. Mills, K.D., DA.Sinclair, and L.Guarente. 1999. MEC1-dependent redistribution of the Sir3 silencing protein from telomeres to DNA double-strand breaks. Cell 97:609-620.
147. Min, J., Y.Zhang, and R.M.Xu. 2003. Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27. Genes Dev. 17:1823-1828.
148. Mine, E., YAllory, J.C.Courvalin, and B.Buendia. 2001. Immunolocalization of HP1 proteins in metaphasic mammalian chromosomes. Methods Cell Sci. 23:171174.
149. Mine, E., YAllory, H.J.Worman, J.C.Courvalin, and B.Buendia. 1999. Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle in mammalian cells. Chromosoma 108:220-234.
150. Mine, E., J.C.Courvalin, and B.Buendia. 2000. HPlgamma associates with euchromatin and heterochromatin in mammalian nuclei and chromosomes. Cytogenet. Cell Genet. 90:279-284.
151. Mishra, K. and D.Shore. 1999. Yeast Ku protein plays a direct role in telomeric silencing and counteracts inhibition by rif proteins. Curr. Biol. 9:1123-1126.
152. Monson, E.K., D.de Bruin, and V.A.Zakian. 1997. The yeast Cacl protein is required for the stable inheritance of transcriptionally repressed chromatin at telomeres. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94:13081-13086.
153. Morin, G.B. and T.R.Cech. 1986. The telomeres of the linear mitochondrial DNA of Tetrahymena thermophila consist of 53 bp tandem repeats. Cell 46:873-883.
154. Morris, J.R., J.Chen, S.T.Filandrinos, R.C.Dunn, R.Fisk, P.K.Geyer, and C.Wu. 1999a. An analysis of transvection at the yellow locus of Drosophila melanogaster. Genetics 151:633-651.
155. Morris, J.R, P.K.Geyer, and C.T.Wu. 1999b. Core promoter elements can regulate transcription on a separate chromosome in trans. Genes Dev. 13:253-258.
156. Munoz-Jordan, J.L., G.A.Cross, T.de Lange, and J.D.Griffith. 2001. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20:579-5 88.
157. Murti, K.G. and D.M.Prescott. 1999. Telomeres of polytene chromosomes in a ciliated protozoan terminate in duplex DNA loops. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96:14436-14439.
158. Murzina, N., A.Verreault, E.Laue, and B.Stillman. 1999. Heterochromatin dynamics in mouse cells: interaction between chromatin assembly factor 1 and HP1 proteins. Mol. Cell 4:529-540.
159. Nakayama, J., J.C.Rice, B.D.Strahl, C.D.AUis, and S.I.Grewal. 2001. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292:110-113.
160. Natarajan, S. and MJ.McEachern. 2002. Recombinational telomere elongation promoted by DNA circles. Mol. Cell Biol. 22:4512-4521.
161. Nielsen, A.L., M.Oulad-Abdelghani, J.A.Ortiz, E.Remboutsika, P.Chambon, and R.Losson. 2001a. Heterochromatin formation in mammalian cells: interaction between histones and HP1 proteins. Mol. Cell 7:729-739.
162. Nielsen, L. and J.E.Edstrom. 1993. Complex telomere-associated repeat units in members of the genus Chironomus evolve from sequences similar to simple telomeric repeats. Mol. Cell Biol. 13:1583-1589.
163. Nielsen, P.R., D.Nietlispach, H.R.Mott, J.Callaghan, A.Bannister, T.Kouzarides, A.G.Murzin, N.V.Murzina, and E.D.Laue. 2002. Structure of the HP1 chromodomain bound to histone H3 methylated at lysine 9. Nature 416:103-107.
164. Nielsen, S.J., R.Schneider, U.M.Bauer, A.J.Bannister, A.Morrison, D.O'Carroll, R.Firestein, M.Cleary, T.Jenuwein, R.E.Herrera, and T.Kouzarides. 2001b. Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters. Nature 412:561-565.
165. Nimmo, E.R., G.Cranston, and R.C.Allshire. 1994. Telomere-associated chromosome breakage in fission yeast results in variegated expression of adjacent genes. EMBO J. 13:3801-3811.
166. Nugent, C.I., G.Bosco, L.O.Ross, S.K.Evans, A.P.Salinger, J.K.Moore, JJE.Haber, and V.Lundblad. 1998. Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks. Curr. Biol. 8:657-660.
167. Okazaki, S., H.Ishikawa, and H.Fujiwara. 1995. Structural analysis of TRAS1, a novel family of telomeric repeat-associated retrotransposons in the silkworm, Bombyx mori. Mol. Cell Biol. 15:4545-4552.
168. Рак, D.T., M.Pflumm, I.Chesnokov, D.W.Huang, R.Kellum, J.Marr, P.Romanowski, and M.R.Botchan. 1997. Association of the origin recognition complex with heterochromatin and HP1 in higher eukaryotes. Cell 91:311-323.
169. Palladino, F., T.Laroche, E.Gilson, A.Axelrod, L.Pillus, and S.M.Gasser. 1993. SIR3 and SIR4 proteins are required for the positioning and integrity of yeast telomeres. Cell 75:543-555.
170. Pandita, Т.К. 2002. ATM function and telomere stability. Oncogene 21:611-618.
171. Pardue, M.L., O.N.Danilevskaya, K.Lowenhaupt, F.Slot, and K.L.Traverse. 1996a. Drosophila telomeres: new views on chromosome evolution. Trends Genet. 12:4852.
172. Pardue, M.L., O.N.Danilevskaya, K.Lowenhaupt, J.Wong, and K.Erby. 1996b. The gag coding region of the Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, has an internal frame shift and a length polymorphic region. J. Mol. Evol. 43:572-583.
173. Pardue, M.L. and P.G.DeBaryshe. 1999. Telomeres and telomerase: more than the end of the line. Chromosoma 108:73-82.
174. Perrem, K., L.M.Colgin, A.A.Neumann, T.R.Yeager, and R.R.Reddel. 2001. Coexistence of alternative lengthening of telomeres and telomerase in hTERT-transfected GM847 cells. Mol. Cell Biol. 21:3862-3875.
175. Perrini, В., L.Fanti, M.Berloco, S.Pimpinelli, C.Turano, and A.Ferraro. 2003. The telomere capping protein HP1 directly bind telomeric DNA in Drosophila. 7th Int. Conf. on Drosophila heterohromatin. Ravello, Italy.
176. Peterson, S.E., A.E.Stellwagen, S.J.Diede, M.S.Singer, Z.W.Haimberger, C.OJohnson, M.Tzoneva, and D.E.Gottschling. 2001. The function of a stem-loop in telomerase RNA is linked to the DNA repair protein Ku. Nat. Genet. 27:64-67.
177. Piacentini, L., L.Fanti, M.Berloco, B.Perrini, and S.Pimpinelli. 2003. Heterochromatin protein 1 (HPl) is associated with induced gene expression in Drosophila euchromatin. J. Cell Biol. 161:707-714.
178. Pich, U. and LSchubert. 1998. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium сера. Chromosome. Res. 6:315-321.
179. Platero, J.S., T.Hartnett, and J.C.Eissenberg. 1995. Functional analysis of the chromo domain of HPl. EMBOJ. 14:3977-3986.
180. Pluta, A.F. and V.A.Zakian. 1989. Recombination occurs during telomere formation in yeast. Nature 337:429-433.
181. Polioudaki, H., N.Kourmouli, V.Drosou, A.Bakou, P.A.Theodoropoulos, P.B.Singh, T.Giannakouros, and S.D.Georgatos. 2001. Histones H3/H4 form a tight complex with the inner nuclear membrane protein LBR and heterochromatin protein 1. EMBO Rep. 2:920-925.
182. Queiroz-Machado, J., J.Perdigao, P.Simoes-Carvalho, S.Herrmann, and C.E.Sunkel. 2001. tef: a mutation that causes telomere fusion and severe genome rearrangements in Drosophila melanogaster. Chromosoma 110:10-23.
183. Rashkova, S., A.Athanasiadis, and M.L.Pardue. 2003. Intracellular targeting of Gag proteins of the Drosophila telomeric retrotransposons. J. Virol. 77:6376-6384.
184. Rashkova, S., S.E.Karam, R.Kellum, and M.L.Pardue. 2002a. Gag proteins of the two Drosophila telomeric retrotransposons are targeted to chromosome ends. J. Cell Biol. 159:397-402.
185. Rashkova, S., S.E.Karam, and M.L.Pardue. 2002b. Element-specific localization of Drosophila retrotransposon Gag proteins occurs in both nucleus and cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99:3621-3626.
186. Rea, S., FJEisenhaber, D.O'Carroll, B.D.Strahl, Z.W.Sun, M.Schmid, S.Opravil, K.Mechtler, C.P.Ponting, C.D.Allis, and TJenuwein. 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406:593-599.
187. Ricchetti, M. and H.Buc. 1996. A reiterative mode of DNA synthesis adopted by HIV-1 reverse transcriptase after a misincorporation. Biochemistry 35:1497014983.
188. Ritchie, K.B., J.C.Mallory, and T.D.Petes. 1999. Interactions of TLC1 (which encodes the RNA subunit of telomerase), TEL1, and MEC1 in regulating telomere length in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 19:6065-6075.
189. Romanowski, P., M.A.Madine, A.Rowles, JJ.Blow, and R.A.Laskey. 1996. The Xenopus origin recognition complex is essential for DNA replication and MCM binding to chromatin. Curr. Biol. 6:1416-1425.
190. Roth, C.W., F.Kobeski, M.F.Walter, and H.Biessmann. 1997. Chromosome end elongation by recombination in the mosquito Anopheles gambiae. Mol. Cell Biol. 17:5176-5183.
191. Rovira, C., W.Beermann, and LE.Edstrom. 1993. A repetitive DNA sequence associated with the centromeres of Chironomus pallidivittatus. Nucleic Acids Res. 21:1775-1781.
192. Roy, R., B.Meier, A.D.McAinsh, H.M.Feldmann, and S.PJackson. 2003. Separation-of-function mutants of yeast Ku80 reveal a Yku80p-Sir4p interaction involved in telomeric silencing. J. Biol. Chem.
193. Saiga, H. and J.E.Edstrom. 1985. Long tandem arrays of complex repeat units in Chironomus telomeres. EMBO J. 4:799-804.
194. Sambrook, J., E.F.Fritsch, and T.Maniatis. 2003. S Molecular cloning: a Laboratory Manual. Ed. 2. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N. Y. 1989.
195. Sanger, F., S.Nicklen, and A.R.Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74:5463-5467.
196. Sasaki, T. and H.Fujiwara. 2000. Detection and distribution patterns of telomerase activity in insects. Eur. J. Biochem. 267:3025-3031.
197. Savitsky, M., T.Kahn, E.Pomerantseva, and P.Georgiev. 2003. Transvection at the End of the Truncated Chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics 163:1375-1387.
198. Savitsky, M., O.Kravchuk, L.Melnikova, and P.Georgiev. 2002. Heterochromatin protein 1 is involved in control of telomere elongation in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 22:3204-3218.
199. Schmid, К J. and D.Tautz. 1997. A screen for fast evolving genes from Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94:9746-9750.
200. Schotta, G., A.Ebert, V.Krauss, A.Fischer, J.Hoffmann, S.Rea, T.Jenuwein, R.Dorn, and G.Reuter. 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. EMBO J. 21:1121-1131.
201. Schotta, G., A.Ebert, and G.Reuter. 2003. SU(VAR)3-9 is a conserved key function in heterochromatic gene silencing. Genetica 117:149-158.
202. Seeler, J.S. and A.Dejean. 1999. The PML nuclear bodies: actors or extras? Curr. Opin. Genet. Dev. 9:362-367.
203. Seeler, J.S., A.Marchio, D.Sitterlin, C.Transy, and A.Dejean. 1998. Interaction of SP100 with HP1 proteins: a link between the promyelocytic leukemia-associated nuclear bodies and the chromatin compartment. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95:7316-7321.
204. Seum, C., M.Delattre, A.Spierer, and P.Spierer. 2001. Ectopic HP1 promotes chromosome loops and variegated silencing in Drosophila. EMBO J. 20:812-818.
205. Shareef, M.M., R.Badugu, and R.Kellum. 2003. HP1/ORC complex and heterochromatin assembly. Genetica 117:127-134.
206. Sheen, F.M. and R. W.Levis. 1994. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91:1251012514.
207. Simos, G. and S.D.Georgatos. 1992. The inner nuclear membrane protein p58 associates in vivo with a p58 kinase and the nuclear lamins. EMBO J. 11:40274036.
208. Singh, P.B., J.R.Miller, J.Pearce, R.Kothary, R.D.Burton, R.Paro, T.CJames, and S.J.Gaunt. 1991. A sequence motif found in a Drosophila heterochromatin protein is conserved in animals and plants. Nucleic Acids Res. 19:789-794.
209. Siriaco, G.M., G.Cenci, A.Haoudi, L.E.Champion, C.Zhou, M.Gatti, and J.M.Mason. 2002. Telomere elongation (Tel), a new mutation in Drosophila melanogaster that produces long telomeres. Genetics 160:235-245.
210. Smith, S. and T.de Lange. 2000. Tankyrase promotes telomere elongation in human cells. Curr. Biol. 10:1299-1302.
211. Smothers, J.F. and S.Henikoff. 2000. The HP1 chromo shadow domain binds a consensus peptide pentamer. Curr. Biol. 10:27-30.
212. Smothers, J.F. and S.Henikoff. 2001. The hinge and chromo shadow domain impart distinct targeting of HP 1-like proteins. Mol. Cell Biol. 21:2555-2569.
213. Song, K., YJung, D.Jung, and I.Lee. 2001. Human Ku70 interacts with heterochromatin protein 1 alpha. J. Biol. Chem. 276:8321-8327.
214. Spofford, J.B. 1976. Position-effect variegation in Drosophila. In The Genetics and Biology of Drosophila. M.Ashburnerner and E.Novitski, editors. Academic Press Inc., Orlando, Florida. 955-1018.
215. Stansel, R.M., T.de Lange, and J.D.GrifFith. 2001. T-loop assembly in vitro involves binding of TRF2 near the 3' telomeric overhang. EMBO J. 20:5532-5540.
216. Stellwagen, A.E., Z.W.Haimberger, J.R.Veatch, and D.E.Gottschling. 2003. Ku interacts with telomerase RNA to promote telomere addition at native and broken chromosome ends. Genes Dev. 17:2384-2395.i
217. Strambio-de-Castillia, C., G.Blobel, and M.P.Rout. 1999. Proteins connecting the nuclear pore complex with the nuclear interior. J. Cell Biol. 144:839-855.1243. Sun, F.L., M.H.Cuaycong, C.A.Craig, L.L.Wallrath, J.Locke, and S.C.Elgin. 2000.
218. Tajul-Arifin, K., R.Teasdale, T.Ravasi, D.A.Hume, and J.S.Mattick. 2003. Identification and analysis of chromodomain-containing proteins encoded in the mouse transcriptome. Genome Res. 13:1416-1429.
219. Takahashi, H., S.Okazaki, and H.Fujiwara. 1997. A new family of site-specific retrotransposons, SART1, is inserted into telomeric repeats of the silkworm, Bombyx mori. Nucleic Acids Res. 25:1578-1584.
220. Tamaru, H. and E.U.Selker. 2001. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 414:277-283.
221. Tamaru, H., X.Zhang, D.McMillen, P.B.Singh, J.Nakayama, S.I.Grewal, C.D.Allis, X.Cheng, and E.U.Selker. 2003. Trimethylated lysine 9 of histone H3 is a mark for DNA methylation in Neurospora crassa. Nat. Genet. 34:75-79.
222. Teng, S.C., J.Chang, B.McCowan, and V.A.Zakian. 2000. Telomerase-independent lengthening of yeast telomeres occurs by an abrupt Rad50p-dependent, Rif-inhibited recombinational process. Mol. Cell 6:947-952.
223. Teng, S.C. and V.A.Zakian. 1999. Telomere-telomere recombination is an efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 19:8083-8093.
224. Tham, W.H., J.S.Wyithe, F.P.Ko, P.A.Silver, and V.A.Zakian. 2001. Localization of yeast telomeres to the nuclear periphery is separable from transcriptional repression and telomere stability functions. Mol. Cell 8:189-199.
225. Tham, W.H. and V.A.Zakian. 2002. Transcriptional silencing at Saccharomyces telomeres: implications for other organisms. Oncogene 21:512-521.
226. Triolo, T. and R.Sternglanz. 1996. Role of interactions between the origin recognition complex and SIR1 in transcriptional silencing. Nature 381:251-253.
227. Vassallo, M.F. and N.Tanese. 2002. Isoform-specific interaction of HP1 with human TAFII130. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99:5919-5924.
228. Vlcek, S., T.Dechat, and R.Foisner. 2001. Nuclear envelope and nuclear matrix: interactions and dynamics. Cell Mol. Life Sci. 58:1758-1765.
229. Volpe, T.A., C.Kidner, I.M.Hall, G.Teng, S.LGrewal, and R.A.Martienssen. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297:1833-1837.
230. Wakimoto, B.T. and M.G.Hearn. 1990. The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster. Genetics 125:141-154.
231. Wallrath, L.L. and S.C.Elgin. 1995. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev. 9:1263-1277.
232. Walter, M.F., C.Jang, B.Kasravi, J.Donath, B.M.Mechler, J.M.Mason, and H.Biessmann. 1995. DNA organization and polymorphism of a wild-type Drosophila telomere region. Chromosoma 104:229-241.
233. Weiler, K.S. and B.T.Wakimoto. 1998. Chromosome rearrangements induce both variegated and reduced, uniform expression of heterochromatic genes in a development-specific manner. Genetics 149:1451-1464.
234. Wellinger, R.J., K.Ethier, P.Labrecque, and V.A.Zakian. 1996. Evidence for a new step in telomere maintenance. Cell 85:423-433.
235. Westphal, T. and G.Reuter. 2002. Recombinogenic effects of suppressors of position-effect variegation in Drosophila. Genetics 160:609-621.
236. Williams, L. and G.Grafi. 2000. The retinoblastoma protein a bridge to heterochromatin. Trends Plant Sci. 5:239-240.
237. Wotton, D. and D.Shore. 1997. A novel Raplp-interacting factor, Ri£2p, cooperates with Riflp to regulate telomere length in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11:748-760.
238. Wright, J.H., D.E.Gottschling, and V.A.Zakian. 1992. Saccharomyces telomeres assume a non-nucleosomal chromatin structure. Genes Dev. 6:197-210.
239. Wright, J.H. and V.A.Zakian. 1995. Protein-DNA interactions in soluble telosomes from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 23:1454-1460.
240. Wright, W.E., V.M.Tesmer, K.E.Huffinan, S.D.Levene, and J.W.Shay. 1997. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. Genes Dev. 11:2801-2809.
241. Wustmann, G., J.Szidonya, H.Taubert, and G.Reuter. 1989. The genetics of position-effect variegation modifying loci in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 217:520-527.
242. Xie, W., X.Gai, Y.Zhu, D.CZappulla, R.Sternglanz, and D.F.Voytas. 2001. Targeting of the yeast Ty5 retrotransposon to silent chromatin is mediated by interactions between integrase and Sir4p. Mol. Cell Biol. 21:6606-6614.
243. Yamaguchi, K., S.Hidema, and S.Mizuno. 1998. Chicken chromobox proteins: cDNA cloning of CHCB1, -2, -3 and their relation to W-heterochromatin. Exp. Cell Res. 242:303-314.
244. Yamamoto, K. and M.Sonoda. 2003. Self-interaction of heterochromatin protein 1 is required for direct binding to histone methyltransferase, SUV39H1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301:287-292.
245. Ye, Q., I.Callebaut, A.Pezhman, J.C.Courvalin, and HJ.Worman. 1997. Domain-specific interactions of human HPl-type chromodomain proteins and inner nuclear membrane protein LBR. J. Biol. Chem. 272:14983-14989.
246. Ye, Q. and HJ.Worman. 1994. Primary structure analysis and lamin В and DNA binding of human LBR, an integral protein of the nuclear envelope inner membrane. J. Biol. Chem. 269:11306-11311.
247. Ye, Q. and HJ.Worman. 1996. Interaction between an integral protein of the nuclear envelope inner membrane and human chromodomain proteins homologous to Drosophila HPl. J. Biol. Chem. 271:14653-14656.
248. Yu, G.L., J.D.Bradley, L.D.Attardi, and E.H.Blackburn. 1990. In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature 344:126-132.
249. Zhao, Т. and J.C.Eissenberg. 1999. Phosphorylation of heterochromatin protein 1 by casein kinase П is required for efficient heterochromatin binding in Drosophila. J. Biol. Chem. 274:15095-15100.
250. Zhao, Т., T.Heyduk, C.D.Allis, and J.C.Eissenberg. 2000. Heterochromatin protein 1 binds to nucleosomes and DNA in vitro. J. Biol. Chem. 275:28332-28338.
251. Zhao, Т., T.Heyduk, and J.C.Eissenberg. 2001. Phosphorylation site mutations in heterochromatin protein 1 (HP1) reduce or eliminate silencing activity. J. Biol. Chem. 276:9512-9518.
252. Zhu, X.D., B.Kuster, M.Mann, J.H.Petrini, and T.de Lange. 2000. Cell-cycle-regulated association of RAD50/MRE11/NBS1 with TRF2 and human telomeres. Nat. Genet. 25:347-352.
253. Zhu, Y.f J.Dai, P.G.Fuerst, and D.F.Voytas. 2003. Controlling integration specificity of a yeast retrotransposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100:5891-5895.
-
Савицкий, Михаил Юрьевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2003
-
ВАК 03.00.26
- Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster
- Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспресии теломерных ретротранспозонов Drosophila melanogaster
- Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster
- Закономерности организации гетерохроматиновых районов политенных хромосом Drosophila melanogaster: цитогенетические аспекты
- Роль бeлкca НР1 в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster
