Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль апоптоза в патогенезе заболеваний печени различной этиологии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дмитриева, Елена Владиславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика апоптоза.

1.2. Характеристика хронических вирусных гепатитов В и С.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль апоптоза в патогенезе заболеваний печени различной этиологии"

Актуальность проблемы. В последние годы широким кругом специалистов ведется интенсивное изучение проблемы хронических вирусных гепатитов В и С (ХВГ В и С), которая приобретает социальную значимость ввиду широкого распространения этих заболеваний, роста заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, тяжести осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и отсутствия эффективных методов лечения. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (HBV, HCY). Так, установление факта репликации вирусов гепатита В и С помимо печени в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С объяснило природу ряда внепеченочных проявлений HBV- и HCV-инфекции [32, 100, 135, 161]. Вместе с тем, многие вопросы патогенеза вирусных гепатитов остаются неясными, в частности, механизмы повреждения гепатоцитов - основной мишени действия вирусов. Долгое время основной формой гибели клеток печени при различных заболеваниях считался некроз. Открытие апоптоза [76] стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что апоптоз может играть ведущую роль в развитии острых и хронических вирусных гепатитов [61, 96], а также ряда других заболеваний печени, включая аутоиммунные, лекарственные, алкогольные поражения печени.

При вирусном гепатите апоптоз может быть результатом как прямого повреждающего действия вирусной инфекции (цитопатическое действие), так и опосредованного, развивающегося в результате иммунных реакций. Цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в процессе вирусной репликации в клетке. Традиционно считалось, что вирусы вызывают гибель клеток в результате узурпации механизмов транскрипции и трансляции и разрушения клеточной мембраны, однако в настоящее время не вызывает сомнений, что большая часть вирусов индуцирует апоптоз инфицированной клетки [74, 152].^ Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых вирусы гепатита В и С активируют апоптоз: 1) путем непосредственного проапоптотического действия специфических вирусных белков, образующихся в процессе репликации вируса: X белка вируса гепатита В [77, 115] и кор-белка вируса гепатита С [63, 71]; 2) путем повышения на клеточной мембране тех рецепторов, через которые передается сигнал к индукции апоптоза, например, Fas [61], и увеличения чувствительности клеток к различным проапоптотическим стимулам, в частности, к TNF-a [137, 140, 159]. Таким образом, цитопатическая активность вирусов гепатита В и С проявляется в прямом или косвенном проапоптотическом действии вирусов на инфицированные клетки и вносит существенный 6 вклад в патогенез поражения печени при вирусных гепатитах.

Другой, и, по-видимому, наиболее существенный, механизм гибели инфицированных гепатоцитов - апоптоз в результате клеточного иммунного ответа, в особенности опосредованного цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Исследования последних лет подтверждают ведущую роль ЦТЛ не только в клиренсе вируса, но и в патогенезе повреждения печени при вирусных гепатитах [26, 80, 119]. ЦТЛ вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью перфорин-гранзимового комплекса и через систему Fas/FasL в результате взаимодействия растворимого или экспрессированного на поверхности активированных лимфоцитов FasL с Fas-рецептором клеток-мишеней, а также нарушают репликацию вируса и экспрессию вирусных белков в инфицированной клетке благодаря секреции ряда цитокинов, в частности интерферона-у и TNF-a [17]. Анализ литературы показал, что система Fas/FasL может играть ведущую роль в повреждении клеток печени при вирусных гепатитах [47, 108], о чем, в частности, свидетельствует обнаружение конститутивной экспрессии белка Fas гепатоцитами и обнаружение в печени пациентов с ХВГ В или С в зонах активного воспаления активированных лимфоцитов, экспрессирующих FasL [55]. Можно полагать, что активация системы Fas/FasL при ХВГ должна приводить к развитию апоптоза значительного числа клеток паренхимы печени. Для подтверждения этого предположения необходимо специальное изучение уровня апоптоза клеток печени в зависимости от уровня экспрессии белков Fas и FasL различными типами клеток в органе.

В понимании патогенеза вирусных гепатитов крайне важным явилось обнаружение репликации вирусов гепатита В и С в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) человека. Это позволило рассматривать ЛПК как дополнительную мишень действия вирусов и дополнительный резервуар инфекции. Персистенция HBV и НСУ в этих клетках может стать причиной их поражения в результате индукции апоптоза, что должно привести к нарушению функций иммунной системы. Данные о повреждении при вирусных гепатитах ЛПК как второй мишени действия вирусов практически отсутствуют.

Поэтому целью настоящего экспериментального исследования явилось изучение роли апоптоза гепатоцитов и системы Fas/FasL взаимодействий в патогенезе ХВГ различной этиологии, а также изучение уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови как показателя инактивации иммунокомпетентных клеток при ХВГ.

В связи с этим были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Исследование уровня апоптоза в ткани печени больных хроническим вирусным гепатитом В и С in situ.

2. Исследование уровня экспрессии белков Fas и FasL в ткани печени больных 7 хроническим вирусным гепатитом В и С.

3. Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени больных ХВГ В и С.

4. Исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХВГ В и С.

Научная новизна. Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С как двух независимых мишеней действия вирусов гепатита В и С.

Впервые изучен уровень апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внутрипеченочного инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоцитов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоцитами от апоптоз-индуцирующего действия ЦТЛ.

Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК у больных ХВГ В и С. Обнаружено, что у больных ХВГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК как при изучении апоптоза свежевыделенных клеток, так и спонтанного апоптоза, развивающегося при культивировании клеток in vitro в течение суток. При этом наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с виремией и повышенным уровнем сывороточного TNF-a.

Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНК свежевыделенных ЛПК с долей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культуральной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоптоза, но и клеток, коммитированных к нему.

Практическая ценность работы. Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХВГ В, и особенно ХВГ С, и появление экспрессии FasL на гепатоцитах могут быть использованы в качестве новых критериев для оценки эффективности проводимой противовирусной и иммуномодулирующей терапии ХВГ.

Обнаружено, что регистрация однонитевых разрывов ДНК является тестом для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Показано, что регистрация уровня повреждения ДНК и/или уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных ХВГ В и С является высоко информативным показателем повреждения иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях и может быть использована в клинической практике наряду с исследованием биоптатов печени для оценки тяжести течения ХВГ и оценки эффективности проводимой терапии.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на V-ой и VI-ой Российской конференции «Гепатология сегодня» (март 2000 г., март 2001 г., Москва), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, май-июнь 2000), на III Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, сентябрь 2000), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000 г., Санкт-Петербург), межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов (февраль 2001 г., Санкт-Петербург), на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, апрель 2001 г.), Пятой и Шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге » (май 2001 и май 2002 г., Санкт-Петербург), на 8-й Европейской Гастроэнтерологической Неделе (UEGW) (октябрь 2000 г., Брюссель), на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (октябрь 2001 г., Санкт-Петербург). Апробация работы состоялась на научно-практической конференции кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова 6 февраля 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 1 работа принята в печать.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дмитриева, Елена Владиславовна

выводы

1. У больных ХВГ В и С обнаружен апоптоз гепатоцитов, при этом доля клеток в состоянии апоптоза у отдельных больных составляет от 12 до 65%.

2. Показано, что уровень гепатоцитов и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в состоянии апоптоза у больных ХВГ С достоверно превышает значения такового в печени больных ХВГ В.

3. Гепатоциты здоровых людей и больных ХВГ В и С экспрессируют белок Fas в цитоплазме диффузно или в виде гранул, либо на мембране клеток. Количественных различий в уровне экспрессии белка Fas в гепатоцитах при ХВГ В и С не обнаружено.

4. В норме гепатоциты практически не экспрессируют FasL, но его экспрессия наблюдается при ХВГ В и С.

5. Обнаружено, что уровень апоптоза гепатоцитов при ХВГ В и С прямо пропорционален степени экспрессии FasL клетками лимфо-гистиоцитарного инфильтрата в печени и обратно пропорционален уровню экспрессии FasL гепатоцитами.

6. Показано, что уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови больных ХВГ В и С достоверно превышает уровень апоптоза этих клеток у здоровых добровольцев.

7. Установлено, что в периферической крови больных ХВГ В и С присутствуют не только клетки в состоянии апоптоза, но и клетки, коммитированные к апоптозу.

8. Обнаружено, что высокий уровень апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных ХВГ В и С коррелирует с наличием нуклеиновой кислоты вируса в крови (HBV ДНК, HCV РНК) и с повышенным содержанием сывороточного TNF-a.

3.3.Заключение.

В настоящем исследовании при изучении клеток печени и лейкоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В и С как двух независимых мишеней действия вирусов обнаружено значительное сходство в повреждении этих клеток при вирусной инфекции. В то же время, в повреждении клеток-мишеней при ХВГ В и С имеется ряд особенностей.

Прежде всего, следует остановиться на обнаруженных нами значительных различиях в тонких механизмах развития иммунно-опосредованных процессов между группами больных ХВГ В и С. При сравнении уровня экспрессии Fas и FasL на биоптатах печени больных ХВГ В и С основные отличия обнаружены в степени экспрессии исследованных маркеров на клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата: при ХВГ С степень экспрессии Fas и FasL внутрипеченочными лимфоцитами достоверно превышает степень экспрессии указанных маркеров клетками инфильтрата печени больных ХВГ В: 2,3±0,2 по сравнению с 0,9±0,2 для Fas и 2,5±0,2 по сравнению с 1,1±0,3 для FasL, соответственно (табл. 10).

Средний индекс TUNEL-положительных гепатоцитов - гепатоцитов в состоянии апоптоза - в биоптатах печени больных ХВГ С составляет 32±7,1%, что достоверно превышает количество таковых при ХВГ В (7,6±4,3%, р=0,01, табл. 8) и коррелирует с уровнем экспрессии FasL клетками лимфо-гистиоцитарного инфильтрата (г=0,5, р=0,04, рис. 14 А).

Полученные результаты подтверждают ведущую роль клеточного FasL-опосредованного иммунного ответа организма в повреждении гепатоцитов при данном заболевании. Нами обнаружено, что при ХВГ В обширный инфильтрат содержит мало лимфоцитов, экспрессирующих FasL, поэтому лимфоциты-киллеры практически "безоружны" в окружении инфицированных вирусом клеток. При этом надо отметить, что в таких случаях именно клетки инфильтрата часто оказывались TUNEL-положительными (табл. 8). При ХВГ С, как выяснилось, активированные лимфоциты обладают мощным цитотоксическим потенциалом в виде высокого уровня экспрессии FasL для уничтожения вирус-инфицированных клеток, которые в достаточных количествах экспрессируют белок Fas. Принципиальных различий в степени экспрессии Fas гепатоцитами больных обеих групп выявлено не было (табл. 10).

При хронических вирусных гепатитах, по-видимому, сами лимфоциты становятся объектом цитотоксического действия собственных ЦТЛ или FasL гепатоцитов. Это особенно вероятно, т.к. уровень экспрессии белка Fas на клетках лимфо-гистиоцитарного инфильтрата при ХВГ С оказался достоверно выше, чем при ХВГ В (2,3±02 и 0,9±0,2 усл. ед., соответственно, табл. 10), и это коррелирует с более высоким уровнем апоптоза этих клеток при ХВГ С (22,2±3,5 % при ХВГ С и 11,2±1,8 % при ХВГ В, табл. 8). Следует отметить, что мы также обнаружили более высокий уровень апоптоза лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови при ХВГ С по сравнению с ХВГ В.

При исследовании уровня апоптоза в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови обнаружено, что количество клеток обоих типов в состоянии апоптоза у больных хроническим гепатитом достоверно превышает значения такового в контрольной группе как непосредственно после выделения, так и после инкубации в течение суток. При этом доля свежевыделенных лимфоцитов в состоянии апоптоза составила 1,2+0,2% у здоровых доноров и 7,7±1,3% у больных вирусным гепатитом (р<0,05), а гранулоцитов - 9,2±1,6% и 15,3+1,8% (р<0,05), соответственно (табл. 15). Доля клеток в состоянии апоптоза после инкубации в течение 24 часов in vitro в питательной среде составила 3,6±0,7% и 15,4±2,4% (р<0,05) для лимфоцитов здоровых и больных, соответственно и 22,0±3,0% и 36,2±3,2% (р<0,05) для гранулоцитов здоровых и больных, соответственно (табл. 15). Достоверных отличий по уровню апоптоза ЛПК между группами больных с HBV- или HCV-инфекцией не было обнаружено, хотя, как уже отмечалось, при ХВГ С, также как и при исследовании уровня апоптоза лейкоцитов внутрипеченочного инфильтрата, наблюдались более высокие значения доли лейкоцитов периферической крови в состоянии апоптоза.

Полученные результаты свидетельствуют о повреждении при ХВГ наряду с гепатоцитами лейкоцитов периферической крови и поднимают вопрос о происхождении обнаруженных поврежденных клеток в периферическом русле. Являются ли эти клетки в действительности самостоятельными мишенями действия вирусов и/или иммунных факторов в лимфоидных органах или они мигрируют в периферическое русло из очага инфекции? Известно, что миграции клеток из очага воспаления препятствует локальный градиент хемокинов, тем не менее, пример дендритных клеток, которые мигрируют из инфицированного органа в лимфоузлы, позволяет допустить возможность появления в периферическом русле части клеток воспалительного инфильтрата. В то же время возможно и появление лимфоцитов в состоянии апоптоза из-за нарушения функций антиген-представляющих клеток под действием вирусов.

Как уже обсуждалось (см. раздел 3.2.8), обнаружение ЛПК больных ХВГ В и С в состоянии апоптоза или коммутированных к апоптозу свидетельствует о снижении функциональной активности иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях. Нарушение иммунологических функций ЛПК при ХВГ В и С может быть результатом инфицирования этих клеток вирусами гепатита В и С [48, 135]. Развитие недостаточного иммунного ответа на вирусные антигены может быть одним из основных факторов, способствующих вирусной персистенции. Несмотря на то, что вирусные гепатиты В и С вызываются гепатотропными вирусами с парентеральным механизмом передачи, характеризуются общими клинико-патологическими и морфологическими симптомами [31 ], имеются, по-видимому, существенные различия в характере взаимодействия этих вирусов с иммунной системой организма человека, что выражается в различной степени хронизации этих заболеваний (5-10% в случае вирусного гепатита В и более 70% - для гепатита С). Обнаруженное нами увеличение доли ЛПК в состоянии апоптоза у больных ХВГ С по сравнению с исследованными больными ХВГ В свидетельствует о более глубоком поражении иммунокомпетентных клеток при ХВГ С и может частично объяснить высокий процент развития хронического заболевания печени при инфицировании человека вирусом гепатита С в отличие от инфекции вирусом гепатита В.

Полученные результаты поднимают ряд новых вопросов. Во-первых, не ясно, являются ли обнаруженные клетки в состоянии апоптоза инфицированными вирусом или по механизму апоптоза в результате аутоиммунных процессов погибают неинфицированные клетки? Ответ на этот крайне важный вопрос может быть получен при одновременной детекции апоптоза и определении тканевой, клеточной и субклеточной локализации вируса и уровня его репликации с помощью in situ гибридизации (ISH) или ПЦР in situ в варианте с обратной транскрипцией (RT-PCR in situ). В обоих случаях происходит гибридизация зондовых молекул с вирусной мишенью, находящейся внутри клетки, причем при ISH мишенью является нативная нуклеиновая кислота вируса, а в случае RT-PCR in situ -амплифицированная ДНК вируса, что позволяет существенно повысить чувствительность гибридизации. Такие исследования позволят понять соотношение инфицированных клеток в состоянии апоптоза и клеток, погибающих по аутоиммунным механизмам.

Второй вопрос, возникающий при анализе полученных результатов, касается возможности разработки новой стратегии терапии ХВГ В и С, основанной на регуляции уровня апоптоза гепатоцитов. Экспериментальные исследования в этой области на животных уже проводятся. При этом исследуется как возможность подавления апоптоза с помощью ингибиторов каспаз - эффекторных белков в развитии апоптоза [82, 127], так и предотвращение Fas-зэвисимого апоптоза с помощью трансфекции гена bcl-2 [84, 124]. Решение вопроса о возможности воздействия на апоптоз в целях терапии ХВГ В и С напрямую зависит от обсуждаемого выше вопроса о природе гибели клеток при этих заболеваниях. Если при вирусных гепатитах по механизму апоптоза погибают инфицированные вирусом клетки, то индукция апоптоза способствовала бы элиминации этих клеток и искоренению инфекции. Напротив, если главной причиной апоптоза клеток при вирусных гепатитах являются аутоиммунные поражения, то наиболее целесообразным представляется скорее ингибирование апоптоза. Однако, вопрос о применении ингибиторов или индукторов апоптоза в качестве лекарственных средств еще далек от практического разрешения. Применение ингибиторов апоптоза, возможно, могло бы быть целесообразно только для лечения фулминантных гепатитов или острой печеночной недостаточности, когда польза от кратковременного употребления таких веществ превышает возможный вред их токсического действия и возможности развития злокачественных новообразований.

Третий вопрос, который возникает при анализе полученных результатов применительно к практике, связан с обнаруженными нами повреждениями ЛПК при ХВГ и заключается в том, насколько возможно использование периферической крови больных ХВГ в качестве материала для оценки степени тяжести состояния больных и/или для оценки эффективности проводимой терапии и какой из исследованных параметров (уровень апоптоза, степень повреждения ДНК ЛПК или уровень сывороточного TNF-a) может выступить в качестве косвенного свидетельства тяжести течения заболевания. К сожалению, в рамках проведенного исследования отсутствовала возможность одновременного изучения уровня апоптоза клеток крови и клеток печени у одних и тех же больных ХВГ. Проведение такого исследования в будущем позволило бы однозначно установить взаимосвязь (или ее отсутствие) между степенью повреждения клеток крови и клеток печени при ХВГ. Анализ литературных данных позволяет заключить, что не всегда измеряемые в периферической крови биохимические и другие лабораторные показатели отражают тяжесть гистологического процесса в печени [31]. Так, уровни сывороточного альбумина, билирубина и щелочной фосфатазы в крови больных ХВГ обычно нормальны (исключение -тяжелое течение ХГ). Уровни сывороточных трансаминаз могут использоваться для клинической оценки тяжести течения гепатита (легкое течение - 3 нормы от верхнего лимита, среднее - 10 норм, тяжелое - более 10 норм, соответственно), хотя значимая корреляция между этими параметрами и ИГА наблюдается не всегда [3]. В нашем исследовании обнаружена корреляция уровня активности сывороточных аминотрансфераз с ИГА в печени и отсутствие корреляции между уровнем активности этих ферментов и уровнем апоптоза лейкоцитов крови (рис. 8; табл. 20). Этот факт свидетельствует о том, что регистрация уровня апоптоза и/или уровня повреждений ДНК ЛПК у больных ХВГ В и С является новым высоко информативным показателем повреждения иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях, но не обязательно свидетельствует о повреждении гепатоцитов.

Таким образом, в результате проведенных исследований мы обнаружили, что при ХВГ В и С значительное количество клеток печени и клеток периферической крови находятся в состоянии апоптоза или коммитированы к нему. На рис. 27 представлена взаимосвязь различных механизмов индукции апоптоза в патогенезе хронических вирусных гепатитов по данным литературы и результатам собственных исследований. Прежде всего, следует еще раз подчеркнуть, что лейкоциты периферической крови больных ХВГ наряду с гепатоцитами являются, с одной стороны, основными мишенями действия вирусов и, с

МЕХАНИЗМЫ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА КЛЕТОК

ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ

ПРЯМОЕ ЦИТОПАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА ВИС

- прямое проапоптотическое действие белков рХ (HBV) и соге-белка (HCV);

- повышение чувствительности клеток к проапоптотическим стимулам;

- активация клеточных факторов транскрипции;

- повышение экспрессии Fas.

ИММУНООПОСРЕДОВАННОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ

ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ КЛЕТОК неспецифическое вирус-специфический звено иммунитета иммунный ответ

- система интерферона - перфорин, гранзим

- макрофаги, нейтрофилы - FasL

- АФК, медиаторы воспаления - TNF-a

ГЕПАТОЦИТЫ ГРАНУЛОЦИТЫ ЛИМФОЦИТЫ АПОПТОЗ I обширная гибель ослабление клеток паренхимы неспецифического печени I иммунного ответа ослабление вирус-специфического иммунного ответа элиминация инфицированных вирусом клеток

I I

ВЫЗДОРОВЛЕНИЕ ХРОНИЧЕСКИЙ ГЕПАТИТ, СНИЖЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ ОРГАНИЗМА I

ИЕРСИСТЕНЦИЯ ВИРУСОВ, ХРОНИЗАЦИЯ ИНФЕКЦИИ

ЦИРРОЗ

Рис. 27. Роль апоптоза в патогенезе хронических вирусных гепатитов В и С. другой стороны, эффекторными клетками иммунной системы в борьбе организма с вирусной инфекцией. В предыдущих разделах, завершая изложение результатов исследования уровня апоптоза лейкоцитов периферической крови (раздел 3.2.8.) и клеток печени больных ХВГ В и С (раздел 3.1.5), мы обсуждали возможные механизмы гибели исследуемых клеток. Оказалось, что они в основном совпадают. При этом три механизма индукции апоптоза клеток печени и крови при ХВГ представляются наиболее вероятными (рис. 27): во-первых, индукция апоптоза в результате прямого повреждающего действия вирусной инфекции на клетки; во-вторых, повреждение клеток, обусловленное иммунной реакцией организма на инфицированные вирусом клетки и, возможно, аутоиммунной реакцией; и, в-третьих, вторичные явления, обусловленные продолжительным воспалением в печени при хроническом гепатите (повреждение структуры ДНК под действием активных форм кислорода и др.).

На основании представленных результатов собственных исследований можно заключить, что при хронических вирусных гепатитах В и С глубоко страдают основные клетки-мишени действия вирусов гепатита. В печени происходит интенсивный апоптоз и гепатоцитов, и клеток лимфо-гистиоцитарного инфильтрата, кроме того, апоптозу подвергаются и лейкоциты периферической крови. Важнейшую роль в индукции апоптоза гепатоцитов играют цитотоксические Т-лимфоциты, осуществляющие свою функцию, в частности, через систему Fas/FasL-взаимодействий.

Обнаружение лимфоцитов и гранулоцитов в состоянии апоптоза и/или коммитированных к апоптозу, свидетельствует о появлении в периферическом русле погибающих, а значит, функционально неполноценных клеток. Следовательно, можно считать, что в такой период у больного наблюдается скрытая лимфо- и/или лейкопения, что, безусловно, будет приводить к недостаточности иммунологических функций независимо от фенотипической структуры иммунограммы.

Полученные результаты в сумме с литературными данными последних лет о прямом проапоптотическом действии белков вирусов гепатита В и С на клетки в процессе репликации позволяют сделать вывод о функциональном повреждении клеток иммунной системы у многих больных хроническим вирусным гепатитом. Так как HBV и HCV могут реплицироваться в лимфоцитах, апоптоз этих клеток может привести к элиминации тех самых клеток, которые активированы как часть вирус-специфического иммунного ответа, что приводит к нарушению противовирусной активности иммунной системы. Репликация HBY и HCV в моноцитах и гранулоцитах крови может приводить к ослаблению неспецифического иммунного ответа. Неадекватный иммунный ответ способствует персистенции вируса и хронизации инфекции. Кроме того, инфицированные лейкоциты периферической крови представляют собой дополнительный резервуар инфекции, что также способствует длительной персистенции вирусов в организме.

Роль апоптоза гепатоцитов при ХВГ неоднозначна (рис. 27). С одной стороны, апоптоз инфицированных вирусом клеток призван выполнять роль защитного фактора организма и блокировать распространение инфекции. Вместе с тем, индукция апоптоза большого числа паренхиматозных клеток, а в нашем исследовании у отдельных больных уровень TUNEL-положительных гепатоцитов достигал 60%, может приводить к невосполнимой утере популяции клеток, деструкции и нарушению функциональной активности печени (развитию цирроза в конечном счете).

Таким образом, виру с-индуцированная программированная гибель клеток печени и клеток иммунной системы играет важную роль в патогенезе хронических вирусных гепатитов В и С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриева, Елена Владиславовна, Москва

1. Антонова Т.В., Николаенко С.Н., Барановская В.Б. Роль прооксидантной и антиоксидантной систем в патогенезе вирусного гепатита В//Росс.журн.гастроэнтер., гепатол., колопроктол. -1995, N3, Т5, Прилож. N1. -С.8

2. Апросина З.Г. Последние достижения в изучении вирусных гепатитов: от молекулярной биологии к лечению вирусного гепатита В//Русс.мед.журн. 1996 Т4 N3, с. 174-177

3. Гастроэнтерология (справочник). Под ред. В.Т. Ивашкина, С.И. Рапопорта. М.: Издательский дом «Русский врач», 1998. -с.60-65

4. Змызгова А.В., Москалева Е.Ю., Максимов С.Л. и др. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -1999, №2, с. 16-19

5. Программированная клеточная гибель/Под ред. B.C. Новикова,- Санкт-Петербург, Наука, 1996.-276 с.

6. Проскуряков С.Я., Габай В,Л„ Коноплянников А,Г, Некроз активная управляемая форма программируемой клеточной гибели//Биохимия, 2002, т.67, вып. 4., с. 467-491

7. Abreu-Martin, М. Т., A. Vidrich, D. Н. Lynch, and S. R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF-alpha and ligation of Fas antigen. J. Immunol. 155:4147-4154, 1995

8. Adachi M, Suematsu S, Kondo T, et al: Targeted mutation in the Fas gene causes hyperplasia in peripheral lymphoid organs and liver. Nat Genet 11:294-300, 1995

9. Ando K, Guidotti L, Wirth S et al. Class I-restricted T lymphocytes are directly cytopatic for their targets in vivo. J Immunol 1994,152: 3245

10. Ando K, Hiroishi K, Kaneko T, et al. Perforin, Fas/Fas ligand, and TNF-alpha pathways as specific and bystander killing mechanisms of hepatitis С virus-specific human CTL. J Immunol 1997;158:5283-5291

11. Ashkenazi, А., У. M. Dixit. Death receptors: signaling and modulation. Science 281: 13051308, 1998

12. Attallah AM, Strong DM. Differential effects of interferon on the MHC expression ofhuman lymphocytes. Enhanced expression of HLA without effect on la. Int Arch Allergy Appl Immunol 1979;60:101-105

13. Barry MA, Eastman A Identification of deoxyribonuclease as an endonuclease II involved in apoptosis. Arch Biochem Biophys 300:440-450. (1993)

14. Bellgrau D, Gold D, Selawry H et al. A role for CD 95 ligand in preventing graft rejection. Nature 1995; 377: 630-2

15. Benedetti A., Jezaquel M, Orlandi F. Preferential distribution of apoptotic bodies in acinar zone 3 of normal human and rat liver. J. Hepatol, 1988; 7, 319

16. Berke G. Killing mechanisms of cytotoxic lymphocytes. Curr Opin Hematol 1997;4:32-40

17. Bernuau D, Feldmann G, Degott C, Gisselbrecht C. Ultrastructural lesions of bile ducts in primary biliary cirrhosis. Human Patol 1981; 12: 782-93

18. Bertoletti A, D'Elios MM, Boni C, et al. Different cytokine profiles of intrahepatic T cells in chronic hepatitis В and hepatitis С virus infections. Gastroenterology 1997; 112:193-199

19. Birnboim H.C., Jevcac 3J.//Cancer Res. 1981. - Vol. 41,N5- p. 1889-1892

20. Botarelli P., Brunetto M.R., Minutello M.A. et al. T-lymphocyte response to hepatitis С virus in different clinical courses of infection//Gastroenterology 1993, 104, 58-67

21. Brunner, Т., R. J. Mogil, D. LaFace et al. Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction mediates activation- induced apoptosis in T-cell hybridomas. Nature 373: 441444, 1995

22. Charlotte F, Hermine A, Martin N et al. Immunohistochemical detection of bcl-2 protein in normal and pathological human liver. Am J Pathol 1994; 144: 460-5

23. Chisari FY. Cytotoxic T cells and viral hepatitis//J Clin Invest 1997;99:1472-1477

24. Chisary F.Y. Viruses, immunity, and cancer: lessons from hepatitis B//Am.J.Pathol. 2000, 156 (4).-P.l 118-1132

25. Chizari FV, Ferrari C. Hepatitis В virus immunopathogenesis//Annu Rev Immunol 1995, 13. 29-60

26. Choo QL, Kuo G, Weiner et al. Isolation of a cDNA clone derived from bloodborne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1989, 244: 359- 362

27. Clarke B. Molecular virology of hepatitis С virus. J. Gen. Virol., 1997; 78: 2397-2410

28. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Boichem J. 1997, 326: 1-16

29. Cramp ME, Carucci P, Underhill J et al. Association between HLA class II genotype and spontaneous clearance of hepatitis С viraemia. J.Hepatol. 1998, 29: 207-213.

30. Crawford J.M. The Liver and the Biliary Tract// Robbins Pathologic Basis of Disease, 6th Edition/Cotran, 1999.-P.857-868

31. Crovatto M., Pozatto G., Zorat F. et al. Peripheral blood neutrophils from hepatitis С virus-infected patients are replication sites of the virus//Haematologica 85 (4), 356-361 (2000)

32. Darmon AJ: Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature 377:446, 1995

33. Dhein, J., H. Walczak, C. Baumler et al. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l/(Fas/CD95). Nature 373: 438-441, 1995.

34. Eddleston A., Mondelli M., Mieli-Vergaani G., Williaams R. Lymphocyte cytotoxic to autologous hepatocytes in chronic hepatitis В virus infection// Hepatology, 1982; 2: 122-127S

35. Ellis, R. E., J. Y. Yuan, and H. R. Horvitz. Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell Biol. 7: 663-698, 1991

36. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its ingibitor 1С AD. Nature 1998; 391: 43-50

37. Falek A., Madden J., Shafer D., Donahol R. Impact opiates on genetic damage and immunocompetence//Amer J. Hum. Genet. 1982, 34, N6 43 A

38. Fan X.G., Liu W.E., Li C.Z. et al. Circulating Thl and Th2 cytokines in patients with hepatitis С virus infection/Mediators Inflamm. 1998, 7, 295-297

39. Farber JL, et al: The mechanisms of cell injury by activated oxygen species. Lab Invest 62:670, 1990

40. Feldmann G. Liver apotosis.//J Hepatol 1997; 26 suppl 2: 1-11

41. Feng G., Kaplowitz N. Colchicine protects mice from the lethal effect of an agonistic anti-Fas antibody//J Clin Invest 2000, 105: 329-339

42. Ferrate A., Thong Y.H. A rapid one-step procedure for purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human blood using a modification of the hypaque-ficoll technique//J. of Immunol. Met, 24 (1978) 389-393

43. Fracker PJ, King LE, Lill-Elghanian D, Telfold WG. Quantification of apoptotic events in pure and heterogeneous populations of cells using the flow cytometer. In "Methods in Cell Biology", 1995, V.46, p. 57-76

44. Gale MJr, Korth M.J., Katze M.G. Repression of the PKR protein kinase by the hepatitis С virus NS5A protein: a potential mechanism of interferon resistance. Clin.Diagn.Virol. 1998, 10,157-162.

45. Galle PR, Hoffmann WJ, Walsczac H et al. Involvement of the CD 95 (APO-l/Fas) receptor and ligand in liver damage. J Exp Med 1995; 182: 1223-30

46. Gowans EJ. Distribution of markers of hepatitis С virus infection throughout the body//Semin Liv Dis. 20 (1), 85-102 (2000)

47. Gressner AM. Cytokines and cellular crosstalk involved in the activation of fat-storing cells. J Hepatol 1995;22:28-36

48. Griffith TS, Brunner T, Fletcher SM et al. Fas-ligand-induced apotosis as a mechanism of immune privilege. Science 1995; 270: 1189-92

49. Hagen T.M., Huang S., Curnutte J. et al. Extensive oxidative DNA damage in hepatocytes of transgenic mice with chronic active hepatitis destined to develop hepatocellular carcinoma//Proc .Natl. Acad. S ci. 1994.91, 12808-12812

50. Hahn CS, Cho YG, Kang BS. The HCY core protein acts as a positive regulator of Fas-mediated apoptosis in a human lymphoblastoid T cell line//Virology 2000, 276(1), 127-137;

51. Hansson BG, Purcell RH. Sites that bind polymerized albumin on hepatitis В surface antigen particles: detection by radioimmunoassay// Infect Immun 1979 0ct;26(l):125-30

52. Hardwick JM. Virus-induced apoptosis/Advances in Pharmacology 41, 295-326 (1997

53. Hayashi, N., E. Mita. Fas system and apoptosis in viral hepatitis. /. Gastroenterol. Hepatol. 12: S223-S226, 1997

54. Hengartner MO, Horvitz HR: Programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Genet Dev 4:581, 1994

55. Hengartner MO: Death cycle and Swiss army knives. Nature 391:441,1998

56. Heusel JW, et al: Cytotoxic lymphocytes require granzyme В for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells. Cell 76:977, 1994.

57. Higaki K, Yano H, Kojiro M. Fas antigen expression and its relationship with apptosis in human hepatocellular carcinoma and noncancerous tissues. Am J Pathol 1996; 149:429-37

58. Higami Y, Shimocava I, Tomita M et al. Aging accelerates but life-long dietary restriction supress apotosis-related fas expression on hepatocytes.Am J Pathol 1997; 515: 659-63

59. Hiramatsu N, Hayashi N, Katayama К et al. Immunohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patient with chronic hepatitis C. Hepatology 1994; 19: 1354-9

60. Hdhler T, Gerken G, Notghi A, et al. HLA DRB*1301 and *1302 protect against chronic hepatitis B. J Hepatol 1997;26:503-507.

61. Honda M, Kaneko S, Shimazaki T. et al. Hepatitis С virus core protein induces apoptosis and impairs cell-cycle regulation in stably transformed Chinese hamster ovary cells// Hepatology 2000, 31(6), 1351-1359,

62. Horvath J, Raffanti SP. Clinical aspects of the interactions between human immunodeficiency virus and the hepatotropic viruses//Clin Infect Dis 1994;18:339-347

63. Hsu H, et al: TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways. Cell 84:299, 1996

64. Hussain MJ, Kallas M, Yagita H. Levels of soluble Fas ligand, hepatocyte growth factor and proinflammatory citokines in children with fulminant hepatic failure. Hepatology 1997: 26:119

65. Isaacson AH, Nelson DR, Mizokami M et al. Elevated serum soluble Fas levels in chronic hepatitis C. Hepatology 1997; 26: 142

66. Ishii K., Rosa D., Watanabe Y. et. al. High titers of antibodies inhibiting the binding of envelope to human cells correlate with natural resolution of chronic hepatitis C//Hepatology 1998, 28, 1117-1120.

67. Jacobson MD, et al: Programmed cell death in animal development. Cell 88:347, 1997

68. Ju, S. Т., D. J. Panka, H. Cui et al. Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation. Nature 373: 444-448, 1995

69. Kalkeri G, Khalap N, Garry RF et al. Hepatits С virus protein expression induced apoptosis in HepG2 cells//Virology 2001, 282(1), 26-37

70. Kaplowitz N, Tsukamoto H. Oxidative stress and liver disease// Prog Liver Dis 14, 131, 1996

71. Kato N, Yoshida H, Kioko Ono-Nita S. et al. Activation of intracellular signaling by hepatitis В and С viruses: C-viral core is the most potent signal inducer//Hepatology 2000, 32(2), 405-412

72. Kawanishi M. Epstein-Barr vims induces fragmentation of chromosomal DNA during lytic infection//J. Virol. 67 (12), 7654-7658 (1993)

73. Kayagaki, N., A. Kawasaki, T. Ebata et al. Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand. J. Exp. Med. 182: 1777-1783, 1995

74. Kerr JF, et al: Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26:239, 1972

75. Kim H, Lee H, Yun Y. X-gene product of hepatitis В virus induces apoptosis in liver cells//J Biol Chem 1998, 273(1), 381-385,

76. Knodell RG et al. Formulation and application of numerical scoring system for assesing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis//Hepatology 1981; 1 (5): 4315

77. Kondo T, Suda T, Fukuyama H et al. Essential roles of the Fas ligand in the development of hepatitis. Nat Med 1997; 3: 409-13

78. Koziel MJ. The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis С virus infection//.! Viral Hepat 1997;4 Suppl 2:31-41

79. Koziel MJ., Dudley D., Afdhal N. et al. HLA class I-restricted cytotoxic T lymphocytes specific for hepatitis С virus. Identification of multiple epitopes and characterization of patterns of cytokine release//J.Clin. Invest. 1995, 96. 2311-2321,

80. Kunstle G, Leist M, Uhkig S et al. ICE-protease inhibitors block murine liver injury and apoptosis caused by CD95 or by TNF-a. Immunol Lett 1997; 55; 5-10

81. Labat-Moleur F., Guillermet C., Lorimier P. TUNEL Apoptotic Cell Detection in Tissue Sections: Critical Evaluation and Improvement// J Histochem Cytochem, Vol. 46, 327-334

82. Lacronique V, Mignon A, Fabre M et al. Bcl-2 protects from lethal hepatic apoptosis induced by anti-Fas antibody in mice/Nat Med 1996; 2: 80-6

83. Lascus T, Radkowski M, Wang LF et al. Detection and sequence analysis of hepatitis В virus integration in peripheral blood mononuclear cells//J Virol 1999, 73 (2): 1235-8

84. Lau GK, Davis GL, Wu SP. et al. Hepatic expression of hepatitis С virus RNA in chronic hepatitis C: a study by in situ reverse-transcription polymerase chain reaction//Hepatology 1996,23(6), 1318-1323

85. Leist M, Single A, Castoldi AF et al. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: A switch in the decision between apoptosis and necrosis//J Exp Med 185: 1481, 1997

86. Leithauser RF, Dhein J, Mechtersheimer G et al. Constitutive and induced expression of APO-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells. Lab Invest 1993; 69: 415-29

87. Li J., Billiar TR, Talanian RV et al. Nitric oxide reversibly inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosilation//Biochem Biophys Res Commun240: 419, 1997)

88. Li P, et al: Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91:479, 1997.

89. Liles W., Kiener P., Ledbetter J. Differential expression of Fas (CD95) and Fas Ligand on normal human phagocytes: implications for the regulation of apoptosis in neutrophils//J Exp Med. V. 184, P. 429-440, 1996

90. Livingston BD, Alexander J, Crimi C. et al. Altered helper T lymphocyte function associated with chronic hepatitis В virus infection and its role in response to therapeutic vaccination in humans//J. Immunol. 1999, 162, 3088-3095

91. Mandell: Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed., 2000 Churchill Livingstone, Inc. P. 3120

92. Maniatis T: Catalysis by a multiprotein IkappaB kinase complex. Science 278:828, 1997

93. Milich DR, Sallberg M, Maruyama T. The humoral immune response in acute and chronic hepatitis В virus infection//Springer Semin Immunopathol 1995;17, 149-166

94. Mita E, Hayashi N, Lio S et al. Role of fas ligand in apoptosis induced by hepatits С infection. Biochem Boiphis Res Commun 1994; 204: 468-474;

95. Mochizuki K, Hiramatsu N, Hayashi N et al. Fas antigen expression in in liver tissues of patient with chronic hepatitis B. J Hepatol 1996; 24: 1-7

96. Moriya K., Yotsuyanagi H., Shintani Y. et al. Hepatitis С virus core protein induces hepatic steatosis in transgenic mice//J. Gen. Virol.-1997.-Vol.78.-P. 1527-1531

97. Mosmann TR, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more. Immunology Today 1996;17:138-146

98. Muller HM, Pfaff E, Goeser T. et al. Peripheral blood leukocytes as a possible extrahepatic site for hepatits С replication. J. Gen. Virol., 1993, 74: 669-676)

99. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science 1995; 267:1449-56

100. Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell 88: 355-365, 1997

101. Napoli J., Bishop GA., McGuinness PH. Progressive liver injury in chronic hepatitis infection correlates with increased intrahepatic expression of Th 1-associated cytokines//Hepatology. 1996, 24. 759-765).

102. Natoli G., Janni A., Costanzo A. et al. Resistance to Fas-mediated apoptosis in human hepatoma cells. Oncogene 1995, 11:1157-1164

103. Nemes Z, et al: Expression and activation of tissue transglutaminase in apoptotic cells of involuting rodent mammary tissue. Eur J Cell Biol 70:125, 1996

104. Ni R, Tomita Y, Matsuda K. et al. Fas-mediated apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Exp Cell Res. 1884; 215: 323-7

105. Nicamoto Y, Guidotti LG, Pasquetto V et al. Differential target cell sensitivity to CTL-activated death pathways in hepatitis В virus trangenic mice. J Immunol 1997; 158: 5692-7

106. Ogasawara J, Watanabe-Fukunaga R, Adachi M et al. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice//Nature 1993 Aug 26;364(6440):806-9

107. Ohishi M, Sakisaka S, Koji T. et al. The localization of HCV and the expression of Fas antigen in the liver of HCV-related chronic liver disease. Acta Histochem Cytochem 1995, 28: 341-48

108. Okuda M, Li K, Beard MR. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced hepatitis С vorus core protein//Gastroenterology 2002, 122(2), 366-375

109. Osna N., Silonova G.,Vilgert N. et al. Chronic hepatitis C: T-helper 1/T-helper 2 imbalance could cause virus persistence in peripheral blood//Scand.J.Clin.Lab.Invest. 1997, 57, 703-710

110. Park DS, et al: Ordering the multiple pathways of apoptosis. Trends Cardiovasc Med 7:294, 1997

111. Penna A, Del Prete G, Cavalli A, et al. Predominant T-helper 1 cytokine profile of hepatitis В virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B//Hepatology 1997;25:1022-1027

112. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S. et al. Binding of hepatitis С virus to CD 81. Science, 1998, 282: 938-941

113. Pollicino Т., Terradillos О, Lecoeur H. et al. Pro-apoptotic effect of the hepatitis В vims X gene//Biomed Pharmacoter, 1998, 52 (9), 363-368;

114. Porter AG, et al: Death substrates come alive. Bioassays 19:501, 1997

115. Reed JC: Cytochrome c: can't live with it-can't live without it. Cell 91:559, 1997.

116. Reed JC: Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387:773, 1997

117. Rehermann B, Chang K, McHutchison JG. et al Quantitative analysis of the peripheral blood cytotoxic T lymphocyte response in patients with chronic hepatitis С virus infection//J.Clin.Invest. 1996. 98. 1432-1440

118. Rehermann B, Lau D, Hoofnagle JH, Chisari FY. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatits В virus infection//J.Clin.Invest. 1996. 97, 1655-1665

119. Rey-Cuille MA, Galabru J, Laurent-Crawford A et al. HIV-2 EHO isolate has a divergent envelope gene and induces single cell killing by apoptosis//Virology 202 (1), 471-476(1994)

120. Rieser M, Marousis CG, Nelson DR, et al. Serum interleukin 4 and interleukin 10 levels in patietns with chronic hepatitis С virus infection. J Hepatol 1997;26:471-478

121. Robinson W.S. Hepatitis В virus and hepatitis D virus. //Principles and Practice of Infectious diseases, 5th ed./ Mandell, 2000 P. 1652-1675

122. Rodriguez I, Matsuura K, Khatib K. A bcl-2 transgene expressed in hepatocytes protects mice from fulminant liver destruction but not from rapid death induced by anti-fas ahtibody injection. J Exp Med 1996; 183: 1031-6

123. Rodriguez-Inigo E, Bartolome J., de Lucas S. Histological damage in chronic hepatitis С is not related to the extent of infection in the liver//Am.J.Pathol. 1999, 154. 1877-1881

124. Rouquet N, Carlier K, Briand P et al. Multiple pathways of fas-induced apoptosis in primari cultured hepatocytes, Biochem Biophis Res Commun 1996; 229: 27-35

125. Rouquet N, Pages JC, Molina T. ICE inhibitor YVADcmk is a potent therapeutic agent against in vivo liver apoptosis. Curr Biol 1996; 6: 1192-5

126. Salvesen GS, Dixit VM: Caspases: intracellular signaling by proteolysis. Cell 91:443, 1997

127. Savill J: Recognition and phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Br Med Bull 53:491, 1997

128. Scaffidi, C, S. Fulda, A. Srinivasan et al. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways. EMBO J. 17: 1675-1687, 1998

129. Schulte-Hermann R., Grasl-Kraupp B, Bursch W. Tumor development and apotosis. Int Arch Allergy Immunol 105, 363-367

130. Searle J, Harmon BV, Bishop С J, Kerr JFR. The significance of cell death by apotosis in hepatobilary disease. J Gasroenterol Hepatol 1987; 2: 77-96

131. Shaw-Stiffel T.A. Chronic hepatitis //Principles and practice of infectious diseases/Mandell, 5th ed., 2000.-P.1298-1320

132. Shi ST, Polyak SJ, Tu H. Hepatitis С virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins//Virology 2002, 292(2), 198-210

133. Stoll-Becker S, Repp R, Glebe D et al. Transcription of hepatitis В virus in peripheral blood mononuclear cells from persistently infected patients//J. Virol 1997, 71 (7), 5399-407

134. Strand S, Hofmann WJ, Hug H et al. Limphocyte apotosis induced by CD95 (APO-1/Fas) ligand -expressing tumor cell a mechanisn of immune evasion? Nat Med 1996; 2: 1361-6

135. Su F., Schneider R.J. Hepatitis В virus HBx protein sensitizes cells to apoptotic killing by tumor necrosis factor alpha//Proc Natl Acad Sci 1997, 94(16), 8744-8749

136. Suzuki K, Takikawa Y, Iwai M et al. Serum levels of soluble Fas ligand and Fas in patients with acute and fulminant hepatitis. Hepatology 1997; 26: 609

137. Tanaca M, Suda T, Haze К et al. Fas ligand in human serum. Nat. Med. 1996; 2: 317-22

138. Terradillos O, Pollicino T, Lecoeur H. p53-independent apoptotic effects of the hepatitis В virus HBx protein in vivo and in vitro//Oncogene 1998, 17(16). 2115-2123

139. Terrault N.A., Wright T.L. Viral hepatitis A through G//Sleisinger and Fordtran's Gastointestinal and liver disease/Feldman, 6th ed, 1998.-P. 1123-1156

140. Thompson CB: Apoptosis in the pathogenesis and treatment of diseases. Science 267:1456, 1995

141. Thomberry, N. A., and Y. Lazebnik. Caspases: enemies within. Science 281: 13121316,1998

142. Thursz MR, Kwiatkowski D, Allsopp CE, et al. Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis В virus in the Gambia. N Engl J Med 1995;332:1065-1069

143. Tipples GA, Ma MM, Fisher KP et al. Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudin in vivo//Hepatology 1996, 24: 714-717

144. Trauth ВС, Klas C, Peters AMJ et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 1989; 245: 301-305

145. Trump BJ, Berezesky I: The reactions of cells to lethal injury: oncosis and necrosis— the role of calcium. In Lockshin RA, et al: When Cells Die—A Comprehensive Evaluation of Apoptosis and Programmed Cell Death. New York, Wiley-Liss, 1998, pp 57-96.).

146. Uckan D, Steele A, Cherry et al. Trophoblasts express Fas ligand: a proposed mechanism for immune privilege in placenta and maternal invasion. Mol Human Reprod 1997; 3: 655-62

147. Vaux DL: CED-4-the third horseman of apoptosis. Cell 90:389, 1997

148. Watanabe-Fukunaga R, Brannan C, Itoh M et al. The cDNA structure, expression, and chromosomal assignment of the mouse Fas antigen. J Immunol 1992, 148: 1274

149. Webb SJ, et al: Apoptosis. An overview of the process and its relevance in disease. Adv Pharmacol 41:1, 1997

150. White E. Regulation of apoptosis by transforming genes of the DNA tumor virus adenovirus//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993, 204(1), 30-39)

151. Woitas RP, Lechmann M, Jung G, et al. CD30 induction and cytokine profiles in hepatitis С virus core-specific peripheral blood T lymphocytes. J Immunol 1997; 159:10121018,

152. Wolf, В. В., and D. R. Green. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. J. Biol. Chem. 274: 20049-20052, 1999

153. Wyllie AH: Apoptosis: an overview. Br Med Bull 53:451, 1997.

154. Yang E, Korsmeyer SJ: Molecular thanatopsis: a discourse on the Bcl-2 family and cell death. Blood 88:386, 1996.

155. Yin, X. M., K. Wang, A. Gross et al. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis. Nature 400: 886-891, 1999

156. Zhu N, Ware CF, Lai MM. Hepatitis С virus core protein enhaces FADD-mediated apoptosis and suppresses TRADD signaling of TNFR1//Virology 2001, 283(20, 178-187

157. Zhu N., Khoshnan A, Schneider R. et al. Hepatitis С virus core protein binds to the cytoplasmic domain of TNF receptor 1 and enhances TNF-induced apoptosis// J.Virol. 1998, 72(5), 3691-3697

158. Zignego AL, Brechot C. Extrahepatic manifestations of HCV infection: facts and controversies. J. Hepatol. 1999, 31: 369-376

159. Zignego AL, Masshia D, Monti M. et al. Infection of peripheral mononuclear blood cells by hepatitis C. J.Hepatol., 1992, 15: 382- 386