Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль активных форм кислорода в регуляции функций клетки

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гамалей, Ирина Акивовна, Санкт-Петербург

л / I

'Ч ../

РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КЛЕТКИ

Клеточная биология 03.00.25

Диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1999

О ■/. 3 Ь ¿¡О- ■)

ч/ - /ос. ^ ^

Институт цитологии Российской академии наук .

г 4

91 40 4999,

Гамалей - [9

л; / ¿'¿¿(¿¿:у

Ирина Акйвовна 4Ч

//' ^ _..........

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ 'БИБЛИОТЕКА

п

иш

00

В.Д. Жестяников, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Е. В.Розенгарт, Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М, Сеченова РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор О. Е. Лебедет чнкт-ГГ обургский госудаг 'ет

Ведущее учреждение:

Инстиг

экспер

Пушт

Защита состоится мая 1999 гол ; Диссертационного совета Д.002.73.01 ' -адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тих.'

С диссертацией можно ознакомиться в РАН

Автореферат разослан " 4 и'

Ученый секретарь Диссертационн доктор биологических наук , П

г

А*-

ОГЛАВЛЕНИЕ

Общая характеристика работы ............ . .......................2

Содержание работы

Глава 1. Образование АФК в клетке............................................5

Глава 2. Материалы и методы исследования..........................................8

Глава 3. Стимуляция КАОРН оксидазы..................................................10

Глава 4. Функциональные ответы клеток на действие АФК ................12

Глава 5. Ионные механизмы действия АФК............................................15

Глава 6. АФК-опосредованная активация клеток....................................16

Глава 7. Функциональная активность пролиферирующих

клеток в зависимости от фазы клеточного цикла........................31

Глава 8. АФК как сигнальные молекулы , ................................................33

Выводы...........................................................35

Список цитируемой литературы................................37

Список основных публикаций по теме диссертации................................39

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АФК - активные формы кислорода

СОД - супероксиддисмутаза

03 - опсонизированный зимозан

ФМА - форбол-12-миристат,13-ацетат

фМЛФ - К-формил-1-метионил-1-лейцил-1-фенилаланин

ФНОа - фактор некроза опухолей а

ЛПС - липоголисахарид

И Фу - интерферон у

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ЭФР - эпидермальный фактор роста

НоОСРЧЭА - диацетат 2',7'-дихлородигадрофлуоресцеина

-иВА-С4(3) - бис(1,3-дибутирилбарбитурат)триметиноксанол

<Д - хемилюминесценция

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. проблемы. Активные формы кислорода, к которым относятся, в частности, перекись водорода (Н202) и супероксиданион (02*"Х являются продуктами одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Начало исследований их биологической роли можно датировать 1969 годом, когда была открыта супероксиддисмутазная активность белка эритрокупреина [1] - белка, который катализирует дисмутацию супероксидных радикалов. С этим открытием появилась возможность регулировать количество АФК во внеклеточной среде и таким образом выяснять роль АФК в жизнедеятельности клетки. На протяжении многих лет биологическую роль АФК видели лишь в их токсическом действии; эти соединения рассматривали как химическое орудие, которьм профессионально фагоцитирующие клетки (макрофаги и нейтрофшш) защищают организм от инфекционного поражения.

Ряд открытий начала 1990-х годов вызвал активную дискуссию относительно другой, регуляторной роли, которую эти соединения (в узком диапазоне концентраций) могут играть во внутриклеточных процессах. Так, было показано, что параллельно с рецептор-опосредованной активацией транскрипционного фактора КРкВ в клетках образуются АФК [2], что привело к открытию посреднической роли молекулы Н202 в передаче сигнала от рецептора фактора роста к транскрипционному фактору №кВ в клетках гладкой мускулатуры [3]. Было обнаружено, что не только профессиональные фагоциты, но и клетки других типов имеют специальный механизм образования АФК (см. обзор: Клюбин, Гамалей, 1997), и, наконец, признали, что химический потенциал и Н202, и 02" недостаточен для некротического действия на клетки. Эти работы стимулировали многочисленные исследования новой роли АФК в клетке. Всплеск этих исследований (см. обзор: ОатаЬу, ЮуиЪш, 1999) окончательно утвердил проблему регуляторной роли АФК в функционировании клетки. Однако основной круг вопросов - механизмы возникновения в клетках АФК, физиологические условия для их образования, мишени на поверхности и внутри клетки, на которые действуют АФК, и, наконец, молекулярные механизмы действия АФК - пока не находит достаточного объяснения и является предметом пристального изучения.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - выяснить роль АФК в функциональных ответах клетки.

При исследовании проблемы решали следующие задачи. 1) Рассмотреть механизмы образования АФК в клетках. 2) Выяснить,

способны ли неиммунокомпетентные клетки отвечать образованием АФК при стимуляции. 3) Исследовать действие Н202 и 0'~ в малых (неповреждагопщх) дозах на функции макрофагов. 4) Изучить диффузию Н202 в условиях, приближенных к биологическим. 5) Исследовать ионную сигнализацию клеток (мембранный потенциал и концентрацию свободного Са2' ([Са2'],) в клетках при активации разными агонистами и самими АФК. 6) Сравнить ионные ответы клеток при стимуляции, идущей с промежуточным образованием АФК и без него. 7) Выяснить, участвуют ли АФК в пролиферативном ответе клетки.

Научная новизна полученных результатов. Проведено комплексное исследование действия на клетки АФК в малых (неповреждающих) концентрациях. Показано, что Нг02 в диапазоне концентраций 0,1-20 мкМ может быть активатором функций клетки.

Впервые показаны модулирующий эффект Н2О2 на фагоцитоз макрофагов и способность Н2О2 вызывать хемотаксис перитонеальных нейтрофилов мыши. Измерен коэффициент диффузии ИгОг в среде культивирования клеток. Обнаружено стимулирующее действие Н2О2 на окислительный взрыв макрофагов.

Впервые исследовано изменение [Са2+]; и мембранного потенциала макрофагов при действии Н202 в широком диапазоне концентраций. Впервые проведено сравнительное изучение ответов клеток на стимуляцию биологически активными соединениями, действие которых сопровождается и не сопровождается промежуточным образованием АФК. Впервые показано, что гаперцоляризация плазматической мембраны макрофагов и астроцитов, вызванная взаимодействием агониста с рецептором, связана с АФК-опосредованной активностью К+каналов.

Впервые показано, что у трансформированных фибробластов 1.929 внутриклеточный уровень АФК зависит от фазы клеточного цикла.

Продемонстрированы достоинства флуориметрических измерений одиночных клеток.

Научно-практическая значимость. Данные проведенного исследования об участии АФК в функциональных ответах клетки вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии - проблемы внутриклеточной и межклеточной передачи сигнала. Результаты исследования прямого действия АФК на функции клеток свидетельствуют о существенной роли баланса окислительно-восстановительных сил в жизнедеятельности клетки и важны для

выяснения механизмов, которые обеспечивают и сдвиг, и поддержание этого баланса в клетке на необходимом уровне.

Полученные данные о прямом действии АФК на функции клетки, об АФК-оносредованной активности ионных каналов и об активности АФК-генерирующего механизма в пролиферируюпдах клетках могут быть использованы в решении ряда проблем патологической физиологии (в частности, проблемы окислительного стресса и проблемы клеточной трансформации) и важны для выяснения возможных побочных эффектов различных лекарственных препаратов, включая антиоксиданты, при лечении различных заболеваний.

По изменению активности №АОРН оксидазы макрофагов под действием электромагнитного поля высокой частоты определены оптимальные частота и время действия поля, которое создавалось прибором, созданным в Германии в терапевтических целях (МесШше, Берлин, 1994-1995 гг.).

Полученные результаты могут быть также использованы в учебных целях.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всесоюзных конференциях "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1988; Санкт-Петербург, 1992, 1994, 1998), Всесоюзных конференциях "Физиология пептидов" (Ленинград, 1988), "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" (Горький, 1990), Симпозиуме стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" (Звенигород, 1993), Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), конференции НАБЕВ "Антиоксиданты в клеточной биологии" (Сакстон-Ривер, США, 1995), Международном конгрессе "Свободные радикалы: здоровье и заболевания" (Стамбул, Турция, 1995), на II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международном физиологическом съезде (Санкт-Петербург, 1997), на конференции Физиологического общества Великобритании (Кембридж, Англия, 1997), на конференции Биофизического общества США (Канзас-Сити, 1998, США), на Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998). Материалы также докладывались на семинарах и Научном собрании Иститута цитологии, на семинарах в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), в Институте химии Венгерской АН (Будапешт), в Институте молекулярной биотехнологии (Иена, Германия).

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме научного доклада на 41 стр. машинописного текста и иллюстрирована

двумя таблицами и 14-ю рисунками. Материалы диссертации отражены в 27 публикациях в отечественных и международных журналах, в том числе в двух обзорных работах и заказной главе в книге Int. Rev. Cytol. Личный вклад автора заключался в постановке цели и задач исследования, участии в проведении экспериментов, обработке, обсуждении и обобщении результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБРАЗОВАНИЕ АФК В КЛЕТКЕ

Молекулярный кислород (02) не вступает в прямые неферментативные реакции с органическим субстратом. Для участия в биохимических реакциях 02 должен активироваться, то есть восстановиться. Для полного восстановления 02 (образование Н20) требуется 4 электрона сразу. 4-электрошюе восстановление 02 происходит в процессе тканевого дыхания в митохондриях. Значительно более простым и повсеместным, распространенным и в неживой природе, и в клетке, является одноэлектрояное восстановление 02. Схема такого восстановления выглядит следующим образом:

°2~

ф 2 н+

ч но; н2о2 ОН' н2о

В результате одноэлектронного восстановления на пути от 02 до Н20 и образуются те самые промежуточные соединения, которые называют собирательным термином АФК. Все эти соединения являются окислителями по отношению ко всем компонентам клетки и в больших концентрациях губительны для нее. Применительно к живой клетке рассматривают три промежуточные формы кислорода: Н202, ее непосредственный предшественник 02*" и гидроксильный радикал ОН*.

02*~ неустойчив, мало реакционен, время его жизни 10"6 с, он самопроизвольно дисмутирует до Н202, способен диффундировать. Н202 -это довольно устойчивая молекула, но со временем она спонтанно разлагается до воды. В клетках эти процессы катализируются ферментами - СОД и катадазой (или пероксидазой). Соответствующие реакции протекают по следующим схемам:

2Н

О г +02" -> Н202 + 02; СОД

2Н202 2Н20 + 02.

пероксидаза

каталаза

В клетке есть немало других веществ, которые являются антиокислителями и препятствуют образованию АФК. Важнейшим из них является трипелтид глутатион (Gly-Cys-Ghi), SH-груллы которого при окислении образуют дасульфидные связи. Радикал ОН* - сильнейший окислитель, повреждает любую макромолекулу . Однако несмотря на это, в настоящее время предпринимаются попытки (пока малочисленные) показать и его регуляторную роль во внутриклеточных процессах. Подробно вопросы, связанные с некротическим повреждением при действии АФК и, главным образом, ОН", изложены в обзорной работе Гамалей и Клюбина (Gamaley, Klyubin, 1999).

Путей образования АФК много. В клетке они могут быть как побочными продуктами многих метаболических путей, так и продуктами деятельности специального механизма образования АФК - одной из оксидаз клетки, NADPH оксидазы. Работа этого ферментативного комплекса заключается в передаче электрона молекулярному кислороду (образование 02"): NADPH + 202NADP+ + 202" + Н+.

Таким образом, в клетке есть, с одной стороны, механизм образования АФК, а с другой, - набор соединений, прежде всего ферментов, создающих антаокислительную защиту клетки. Соотношение концентраций окисляющих и восстанавливающих эквивалентов определяют окислительно-восстановительный статус клетки или ее редокс-котенциал. Редокс-потенциал определяется скоростями образования и деградации АФК и зависит не только от типа клетки, но и от конкретного ее компартмента. Например, отношение восстановленного глутатиона к окисленному во всей клетке колеблется в пределах 30:1 -100:1, в то время как в эндоплазматическом ретикулуме это же соотношение составляет 1:1 - 3:1 [4]. Эндоплазматический ретнкудум и секреторные пути клетки нуждаются в окислителе. Существует ряд предположений относительно того, каким образом клетка поддерживает разный редокс-потенциал в разных компартментах. Среда этих предположений преимущество отдается механизму образования малых окисляющих молекул - NADPH оксидазе. NADPH оксидаза была и открыта, и достаточно детально к настоящему времени изучена в профессиональных фагоцитах - нейтрофилах и макрофагах (рис. 1; рисунки см. на стр. 17-27) (Клюбин, Гамалей, 1997).

Долгое время считалось, что только профессиональные фагоциты обладают комплексом NADPH оксидаза и было понятно зачем: для образования токсических АФК и неспецифической иммунной защиты

организма. С начала 1990-х гг., после того как N А ОР11 оксидаза, подобная МЛОРН оксидазе иммунокомпетенгных клеток, была обнаружена в фиброблзстах [5], ведется поиск этого ферментативного комплекса и изучается его структура и работа в различных типах клеток, включая растительные.

В табл. 1 представлены клетки, не являющиеся профессиональными фагоцитами и имеющие комплекс Ь'АБРН оксидазу, подобную ИАОРН оксидазе профессиональных фагоцитов. Вопрос же о физиологическом назначении МАЭРН оксидазы в непрофессиональных фагоцитах все еще остается предметом множества дискуссий. Механизмы образования АФК в клетках подробно изложены в обзорных работах (Гамалей, Клюбин, 1996; Клюбин, Гамалей, 1997; Схата1еу, ЫуиЫп, 1999).

Таблица 1. КЛЕТКИ, В КОТОРЫХ ОБНАРУЖЕНА \ADPH ОКСИДАЗА

Клетки Компоненты комплекса Источник

Субъединицы Цитозольные факторы цитохрома Ь__

Фибробласты р22 -ркох р47-ркох, ф(Л-ркох, Кас1 [5-8]

Эндотелий %р91-рИох, р22 -ркох р47-ркох, рЫ-ркох [9,10]

Гладкомышечные gp9 \-phox, р22-ркох Т [11-13]

Хондроциты «])91-ркох, р22-ркох •рМ-ркох, рЫ-ркох [14,15]

Остеокласты gp91 -ркох, р22-ркох р47 -ркох [16]

Мсзангиальные gp91 -ркох, р22-ркох р№-ркох, тр67-ркох [17, 18]

В-лимфоциты ¡д>9\-ркох, р22-ркох р47-ркох, трЫ-ркох, Яар 1А [19-21]

Каротидного тела gp91 -ркох, -рИ-ркох р47-ркох, рЫ-ркох [22-24]

Подоциты ^91 -ркох, р22-ркох р47-ркох, тр67-ркох [25]

Эпителий проке.

канальцев почки ? ? [26]

Адипоциты ? ? [27]

Тучные клетки ? р47-ркох [28]

Щитовидной ? ? [29,30]

железы

Кардиомиоциты ? ? ,[31]

Микроглия ? 7 [32]

Сперматозоиды ? ? [33]

а ? - неизвестно.

Заключение. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что, по-видимому, большинство типов клеток имеют КАБРИ оксидазу для специального образования АФК, хотя необходимо заметить, что клетка может иметь и другие механизмы образования этих соединений (см., например: [34])

Глава 2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали следующие клетки: резидентные и индуцированные перитонеальные макрофаги мышей линии CC57/W, перитонеальные нетрофилы мышей линии CC57AV, астроциты глиобластомы человека линии U118 "American Type Culture Collection " (США), клетки эпидермоидной карциномы А431, фибробласты линий L929 и NÏH3T3. Клетки N1H3T3 были трансфицированы плазмидой, которая содержала кДНК, кодирующую человеческий рецептор ЭФР полной длины. Клетки A43Î, L929 и NTH3T3 были взяты из Российской коллекции клеточных культур в Институте цитологии РАН.

Использовали следующие реактивы: СОД каталазу, ОЗ, ФМА. хемотактический пептид фМЛФ, ФНОа, ЛПС, ИФу, ФАТ, диацетат флуоресцеина (FDA) фирмы "Sigma", флуоресцентные зовды diBA-C4(3), Fura-2 AM и H2DCF-DA фирмы "Molecular Probes, Inc" (США). ЭФР выделяли из подчелюстных желез самцов мыши; компоненты комплемента С5а и СЗа выделяли из активированной зимозаном сыворотки крови человека методом иммуноаффинной хроматографии на моноюхональных антителах против СЗа (клон G10) и С5а (клон 561). Тетрапептад тафтсин был синтезирован в Институте органического синтеза АН ЛатвССР (Рига).

Потенциал плазматической мембраны одиночных клеток измеряли с помощью анионного флуоресцентного зонда diBA-C4(3). Гиперполяризация плазматической мембраны приводит к уменьшению, а деполяризация - к увеличению интенсивности свечения зонда (