Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

НОВИКОВ Кирилл Николаевич

РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ

СРЕДЫ

Специальности: 03.00.16 - экология, 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории физико-химии биомембран Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова

Официальные оппопеиты:

Доктор биологических паук, профессор

Мария Николаевна Кондрашона

Доктор физико-математических наук, профессор

Всеволод Александрович Твердислов

Доктор биологических наук

Защита состоится "7" октября 2004 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.55 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова

Автореферат разослан "6" сентября 2004 г.

Сергей Елисеевич Плеханов

Ведущее учреждение:

Институт биохимической физики им. ILM. Эмануэля РАН

Ученый секретарь Совета Кандидат биологических наук

Н.В.Кгрташеза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Подавляющее большинство всех живых организмов, принадлежащих к сложным экологическим системам, в своей жизнедеятельности не Moiyr обходиться без потребления кислорода, за счет которого способны выполнять разнообразные энергоемкие метаболические функции, а также производить субстраты, богатые энергией, т.е. осуществлять реакции ассимиляции и диссимиляции, поддерживая устойчиво-неравновесное состояние гомеостаза (Бауэр, 1935).

На протяжении уже более, чем полувека внимание исследователей привлекает изучение окислительно-восстановительных процессов, протекающих в организме с участием активных форм кислорода (АФК). АФК - это высокореакционные химические частицы, возникающие в результате последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода и представляющие собой свободные радикалы (О2*, HO2*, HO*, NO*, ROO*). К АФК можно отнести и другие соединения, легко продуцирующие свободные радикалы (О3, 'О*2, ONOOH, Н2О2, НСЮ, ROOH, ROOR).

Однако долгое время считалось и до сих пор многие исследователи полагают, что АФК запускают цепные свободно-радикальные реакции, приводящие к химической модификации важных биологических структур таких, как нуклеиновые кислоты, белки, липиды (Richter, 1987; Patlison ct al, 2002). За эти модификации, как полагают, прежде всего ответственно перекисное окисление липидов (ПОЛ), радикальные и молекулярные продукты которого обладают выраженным повреждающим действием, приводящим к развитию патологических состояний (Harman, 1956; Beckman and Ames, 1998; Fridovich, 1999 и мн.др.). Однако еще в конце XIX века русский биохимик А.Н.Бах указал на важную роль перекисных соединений, именно, как продуктов реакций активного кислорода, в процессах. медленного окисления различных соединений, а также в нормальной жизнедеятельности организмов (Бах, 1897,1912).

К настоящему времени появилось значительное число экспериментальных работ, показывающих, что практически во всех клетках и тканях организмов присутствуют ферментные системы оксидазного типа, продуцирующие АФК (Babior, 1999; Jones et al, 2000) и что многие физиологические нормореакции организмов коррелируют с интенсификацией продукции АФК (Allen and Tresini, 2000; Sauer et al, 2001). АФК образуются при функционировании других типов ферментов, иммуноглобулинов, независимо от их класса (Wentworth et al, 2000), а также в ходе постоянно протекающих в организме неферментативных реакций (Mullarkey et al, 1990). По минимальным оценкам в состоянии покоя при дыхании у животных и человека на продукцию АФК уходит от 10 до 30% молекулярного кислорода (Лукьянова и др., 1982; Vlessis et al, 1995). Однако в норме стационарный уровень АФК в органах и тканях весьма низок (порядка 10"10 - 10*" М) за счет распространенности в них мощной ферментативной и неферментативной систем регуляции накопления и устранения АФК.

Обнаружение в каждом конкретном случае того порога, после которого кардинально меняется роль АФК в гомеостазе организма, как раз и представляет собой важную и одновременно весьма непростую задачу.

Биологические системы, В кптпрьту рр^уурпит пЯрячппянир супероксиданион радикала и других продуктов ответственны за

БИБЛИОТЕКА |

генерацию энергии электронно-возбужденных состояний (ЭВС) (Шляпинтох и др., 1966; Владимиров и Арчаков, 1972). Эта энергия может передаваться от мест генерации к местам реализации как с некоторой потерей в виде ихтучеиия, так и путем бсзызлучательного переноса и играть физиологическую роль. За счет накопления электронно-возбужденных частиц и молекул (например, карбонильных соединений) и освобождения энергии ЭВС при их релаксации в клетке, могут осуществляться энергоемкие процессы (Риль, 1948; Рид , 1960; Журавлев, 1972; Cilento, 1973; Campbell, 1988; Cilento and Adam, 1995; Баскаков и Воейков, 1996).

Таким образом, совершенно не умаляя возможных нежелательных последствий от возникновения свободных радикалов кислорода и ПОЛ в клетках и тканях, следует иметь в виду их положительную роль в функционировании живых организмов и адаптации к воздействию факторов окружающей среды. В связи с этим важно выяснить, в чем различие механизмов действия АФК в малых и больших дозах, когда наступает сбой в системах, отвечающих за гомеостаз в клетке и в организме в целом.

При решении этой проблемы важна сравнительная оценка свойств и механизмов действия АФК на биологические структуры и процессы, диагностика, тестирование и корректировка состояния живых объектов при их отклике на воздействие факторов окружающей среды на всех уровнях биологической организации - от субклеточных структур до сообществ разных видов, вплоть до человека. Основа всех этих проявлений заключается в инициации АФК различных жизненно важных или патологических процессов. Главную роль здесь играет супероксиданион радикал, как первоначальный продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Кроме того, как впервые установлено А.Л.Чижевским (1922), этот радикал кислорода в своей гидратировашюй форме содержится в невзначительных количествах в воздухе в виде так называемых отрицательных аэроинов. Как оказалось, без этого, хоть по концентрации и ничтожно малого (500 таких ионов в см3 против содержания кислорода в том же объеме в 1016 раз больше!), но очень важного фактора окружающей среды, невозможна жизнедеятельность (Чижевский, 1922; Васильев, 1960; Кондрашова и др., 1997; Kondrashova et al., 2000; Гольдштейн, 2000,2002).

Особую роль АФК играют при поддержании жизнедеятельности организмов в окружающей среде, в адаптивных реакциях, в обеспечении надежности работы защитных систем организма (иммунная система и система детоксикации), т.е. в процессах, которые обеспечивают гомеостаз, физиологический статус и взаимоотношения организмов в биоценозах (Fridovich, 1974; Bingham, 1991; Stepanova et al, 2000; Regoli, 2002 и др.).

Таким образом реакции с участием АФК в живых системах могут быть основой для оценки различных изменений физиологического состояния организмов, в том числе и после воздействий внешних факторов как физической (свет, ионизирующее облучение, электромагнитные поля, температура), так и химической природы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выяснение регуляторной роли АФК в биологических системах от мембранного до организменного уровня, а также исследование механизмов протекания и регуляции реакций с участием АФК при воздействии различных факторов окружающей среды. В связи с этим для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать протекающие в биологических системах разного уровня организации реакции с участием АФК в связи с конкретными условиями воздействия ряда факторов окружающей среды (свет, ионизирующее облучение, химическое

загрязнение и др.). В частности, выявить механизмы активации кислорода, образования свободных радикалов и регуляции процесса ПОЛ в сетчатке и мембранных образованиях фоторецепторов при действии света и температуры у пойкилотермных и гомойотермных животных, роль этих процессов в адаптации к световому и температурному режиму среды обитания.

2. Изучить механизмы инициирования АФК и НАДФН-зависимого ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) печени крыс и оценить взаимосвязь процессов ПОЛ и протеолиза в деградации цитохрома Р-450 в микросомной системе детоксикации ксенобиотиков.

3. Исследовать некоторые лекарственные средства по их прямому или непрямому антиокислительному действию на модели микросомной системы печени крыс в условиях преимущественного метаболизма субстратов цитохрома Р-450 (в присутствии НАДФН) и с последующей активацией ПОЛ.

4. Проанализировать состояние ферментных систем детоксикации и обосновать возможность использования микросомной фракции плацент рожениц среди населения районов Алтайского края и монооксигеназной системы печени рыб оз. Байкал, генерирующих АФК, как тест-систем для выявления и оценки действия факторов, приводящих к радиационному загрязнению некоторых районов Алтайского края (последствия испытаний ядерного оружия под г. Семипалатинск) и антропогенному химическому загрязнению оз. Байкал (промвыбросы Байкальского целлюлозно-бумажного комбината - БЦБК).

5. Изучить механизм действия фосфолипазы Аг и продуктов гидролиза фосфолипидов на функциональную активность продуцирующей АФК микросомной системы детоксикации ксенобиотиков в печени крыс и рыб и роль этого процесса в адаптации рыб к действию ксенобиотиков.

6. Оценить возможность применения изолированных клеточных систем в качестве биологических тест-систем в ответ на воздействие факторов окружающей среды. Изучить особенности устойчивости цитохрома Р-450 к активации ПОЛ в гепатощггах. Исследовать влияние ксенобиотиков метилхолантренового типа на активацию окислительного взрыва (ОВ) и микровязкость мембран нейтрофилов крови крыс in vivo.

7. Охарактеризовать протекающие в цельной крови человека процессы, связанные с АФК и сопровождающиеся генерацией ЭВС; оценить влияние на них некоторых факторов окружающей среды и физиологического состояния доноров.

Научная новизна исследований:

1. Впервые показана роль АФК в функциональном отклике биологических систем на воздействие факторов окружающей среды (свет, температура, ионизирующая радиация, химические загрязнения).

2. Обнаружена светозависимая активация кислорода и накопление в сетчатке и мембранах фоторецепторов продуктов ПОЛ, которое связано с нормальным световосприятием.

3. Впервые показана возможность использования тест-систем на основе генерирующих АФК ферментов детоксикации ксенобиотиков в микросомной фракции плаценты для выделения групп риска среди населения, подвергавшегося действию неблагопрятных факторов окружающей среды.

4. Изучена микросомная система печени байкальских рыб и проведен анализ изоформ цитохрома Р-450 в норме и после индукции монооксигеназ полициклическими углеводородами и компонентами сточных вод БЦБК.

5. Впервые показано, что лизофосфолипиды (ЛФ) являются ответственными за модификацию деалкилазной активности микросом при ограниченном гидролизе фосфолипидов фосфолипазой Аг. При действии ксенобиотиков разной природы на крыс микросомы из их печени обладают неодинаковой чувствительностью к ЛФ. Эти отличия определяются как индукцией определенных изоформ цитохрома Р-450, их разной субстратной специфичностью, так и видовой принадлежностью монооксигеназной системы печени (крысы или рыбы).

6. На модели изолированных гепатоцитов крыс показано, что эффективными протекторами цитохрома Р-450 от деструкции, вызываемой ПОЛ, могут быть фенольные продукты гидроксилирования ксенобиотиков, вступающих в реакции с АФК в монооксигеназной системе этих клеток.

7. Обнаружено увеличение микровязкости клеточных мембран и активности нейтрофилов (ОВ) крови крыс после воздействия на животных ксенобиотиками. При этом впервые показана интенсификация деалкилирующей активности нейтрофилов. Система предложена в качестве биомаркера для ряда ксенобиотиков.

8. В работе впервые применен метод регистрации хемилюминесценции (ХЛ) в режиме счета одиночных фотонов для изучения процессов в цельной неразведешюй крови человека, протекающих с участием АФК. Этот метод поззоляет следить за особенностями динамических процессов генерации АФК и ЭВС в крови, в том числе при изменении состояния окружающей среды.

9. Впервые обнаружено, что в цельной неразведенной крови человека непрерывно осуществляются реакции с участием АФК, сопровождающиеся генерацией ЭВС и собственным излучением. Это происходит в результате постоянного активного кислородного обмена между эритроцитами и лейкоцитами в цельной крови. Такие процессы играют важную роль в адаптации организмов к гипоксическим условиям.

Практическая значимость работы:

• Результаты работы по фотоиндуцированному ПОЛ в сетчатке и ее мебранных структурах послужили основой исследований, проводимых в 1980х годах в Институте химической физики АН СССР и Научно-исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца, по поиску фотопротекторов.

• Предложена тест-система анализа лекарственных средств прямого и непрямого антиоксидантного действия на модели микросомной фракции печени крыс по ее устойчивости к ПОЛ in vitro и in vivo.

• На основе изучения гидроксилирующих систем плаценты человека выявлены группы риска среди населения Алтайского края, испытывающего последствия испытаний ядерного оружия в 1949-1965 гг.

• На основе выявления механизмов реакций АФК в микросомах печени рыб оз. Байкал (гидроксилирование ксенобиотиков и ПОЛ) предложены тест-объекты для проведения биохимического мониторинга озера. Эти данные составили часть десятилетнего комплексного мониторинга экосистем южного Байкала и использовались для контроля токсического действия сточных вод, производственных потоков и эффективности работы очистных сооружений БЦБК.

• Обнаруженная неодинаковая чувствительность микросом разных видов животных к ЛФ после воздействия различных ксенобиотиков может служить дополнительным критерием ксенобиотической нагрузки в окружающей среде.

• Предложен способ слежения за состоянием пациентов с ИБС по собственной и люминол-зависимой люминесценции их неразведенной крови, позволяющий

проводить мониторинг эффективности лечения методом низкоинтенсивной лазеротерапии (защищено Патентом РФ № 2127881 от 20 марта 1999 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При нормальной интенсивности света в сетчатке и липидах фоторецепторных мембран (ФРМ) происходит генерация свободнорадикальных состояний, связанных с активацией кислорода. Сетчатка обладает уникальной способностью к потреблению больших количеств кислорода без накопления излишних количеств АФК в мембранных структурах фоторецепторов. В поддержании этого баланса основная роль принадлежит витамину Е, что является одним из важных механизмов адаптации зрительной системы к световому режиму.

2. В химической системе феназинметасульфат (Ф) -НАДН, генерирующей О2*, в присутствии ионов двухвалентного железа ОН" является непосредственным инициатором реакции ПОЛ. Генерация АФК и инициирование ПОЛ в мембранах ЭР печени осуществляется главным образом на начальном компоненте НАДФН-зависимой электронтранспортной цепи - НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе.

3. Реальный механизм разборки микросомных цитохромов имеет в своей основе протеолиз апоферментной части. Процесс ПОЛ может выступать в качестве фактора, повышающего эффективность протеолитической деградации детоксицирующих систем.

4. Метод регистрации монооксигеназных активностей и измерения активности ферментов И-ой фазы детоксикации ксенобиотиков в микросомах плаценты предлагается для диагностики скрытых мембранных патологий при комплексном анализе эпидемиологического состояния здоровья населения, подвергшегося действию радиоактивного или химического загрязнения.

5. На основе исследования параметров монооксигеназной системы печени байкальских рыб проведена комплексная оценка влияния промстоков БЦБК, их индивидуальных компонентов (в частности, фенольных соединений) и других воздействий на реакции с участием АФК. Установлен изоформентный состав цитохрома Р-450.

6. Гидролиз фосфолипидов микросомных фракций фосфолипазой А2 приводит к частичной инактивации деалкилазной активности микросом печени крыс и рыб за счет преимущественного действия ЛФ. Разная степень гидролиза фосфолипидов мембран моиооксигеназной системы рыб может быть основой поддержания механизмов их температурной адаптации и адаптации к действию ксенобиотиков.

8. В изолированных гепатоцитах устойчивость цитохрома Р-450 к действию продуктов ПОЛ обеспечивается образованием фенольных производных-антиоксидантов при гидролизе в монооксигеназной системе таких ксенобиотиков, как бенз(а)пирен (БП).

9. После введения крысам ксенобиотиков МХ-типа происходит кондиционирование нейтрофилов крови, что выражается в повышении их реактивности, увеличении микровязкости мембран и появлении 7-этоксикумарин (7-ЭК) -О-деэтилазной активности (ЭКОД).

10. В цельной неразведенной крови человека постоянно протекают реакции с участием АФК, в ходе которых генерируются ЭВС. Эти реакции играют важную роль в выполнении кровью своих физиологических функций, в частности, в освобождении кислорода эритроцитами и регуляции активности лейкоцитов — продуцентов АФК. Процессы, протекающие в крови с участием АФК, проявляют устойчивость к действию интенсивных внешних факторов и высокую чувствительность к действию

факторов низкой и свсрх-низкой интенсивности (например, действие лазерного излучения низкой интенсивности способствует коррекции таких заболеваний, как ИБС).

Апробация диссертационных материалов:

Основные результаты доложены и обсуждены за период с 1972г. по 2003г. более, чем на 60 симпозиумах, конференциях, конгрессах в СССР, России и за рубежом. Среди них Международные Биофизические Конгрессы (Москва, 1972, Копенгаген, 1975), "Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии" (Москва, 1976), "Структура, биосинтез и трансформация липидов в организме животных и человека" (Ленинград, 1977), "Фотобиология животной клетки" (Ленинград, 1977). Первый Всесоюзный Биофизический Конгресс (Москва, 1982), III Международный коллоквиум по физико-химическим механизмам регуляции репродуктивности и старения (Варна, 1980), Международные и Всесоюзные симпозиумы и конференции "Цитохром Р-450" (Москва, 1985; Новосибирск, 1987; Ялта, 1989), Международные симпозиумы: "Лекарствометаболизирующие системы" (Болгария, София, 1986, 1989), "Активные формы кислорода в биологических системах" (Болгария, Варна, 1986), "Регуляция свободно-радикальных реакций (биомедицинские аспекты)" (Болгария, Варна, 1989). I Всесоюзный симпозиум по экоонкологии "Канцерогены и экосистемы" (Киев, 1986), I Болгаро-советский симпозиум "Свободные радикалы и биосгабилизаторы" (Болгария, София, 1987), VII Международный симпозиум по биоиндикации (Финляндия, Куопио, 1992). Международные Гурвичевские конференции "Неравновесные и когерентные системы в биологии, биофизике и биотехнологии" (Москва, 1994, 1999), Международная конференция по клинической, хсмилюминесценции (Германия, Берлин, 1996), Международная конференция "Новые направления лазерной медицины" (Москва, 1996), IV конференция Московского общества гемафереза (Москва, 1996). Всероссийские конференции "Гипоксия. Механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 1997, 2002). Зарубежные конгрессы по биомедицинской оптике "BiOS Europe" (Австрия, Вена, 1996; Италия, Сан Ремо, 1997; Швеция, Стокгольм, 1998; Германия, Мюнхен, 2003), "BiOS" (США, 1997)". Симпозиум Болгарской липидной лиги "Свободные радикалы в биологии и медицине" (Болгария, София, 1997), Международные Конгрессы по Биоэлектрографии (С.-Петербург, 1998, 1999? 2004). II и III Съезды биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004). Симпозиумы "Dresden Chemiluminescence Days" (Германия, 2000, 2003). Конференция Международного Института Биофизики (Германия, Хамбройх, 2000), III Международная конференция по программе «Экополис» (Москва, 2000). Третья Интернет-конференция "Фотохимия и фотобиология", 2000. Всероссийская научно-практическая конференция "Современные возможности эффективной профилактики, диагностики и лечения артериальной гипертонии" (Москва, 2001). III Съезд фотобиологов России (Воронеж, 2001). Международные конференции "Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах" (Москва, 2002) и по квантовой электронике (Москва, 2002). Международный симпозиум "Активные формы кислорода и азота. Диагностика, профилактика и терапевтическое значение" (С.-Петербург-Кижи-С.-Петербург, 2002). Результаты работы регулярно обсуждались на научных семинарах лаборатории физико-химии биомембран и кафедры биоорганической химии Биологического факультета МГУ.

Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с сотрудниками лаборатории физико-химии биомсбран, кафедры биоорганической химии Биологического ф-та МГУ и другими подразделениями МГУ и институтами, а также студентами при выполнении ими курсовых и дипломных работ под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка планов исследований, методических подходов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 79 научных

работ, из них 60 статей, 3 главы в книгах, 5 патентов.

Объем я структура диссертации:

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, включающего в себя анализ состояния проблемы и постановку задачи, изложения результатов собственных исследований и их обсуждение, общего заключения, выводов, списка цитируемый литературы и указателя собственных публикаций. Раздел "Результаты исследований и их обсуждение" состоит из 7 глав, в каждой из которых присутствует соответствующий анализ литературы по локальной проблеме, частные методические аспекты, изложение собственно результатов работы, их краткое обсуждение и обобщение. В разделе "Общее заключение" обобщаются полученные данные на основании анализа механизмов реакций АФК в различных биологических системах при их отклике на воздействия факторов окружающей среды. Диссертация ихтожена на 275 страницах, в том числе содержит 43 рисунка и 27 таблиц. Список цитируемой литературы включает 176 отечественных и 394 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ,

Объекты исследования. Сбор материала проводили в ходе экспедиционных работ в заливе Петра Великого (Дальний Восток), на озере Байкал, в Алтайском крае. Глаза травяной лягушки Rana temporaries морской костистой рыбы минтаи (Theragra chalcogramma), а также глаза быка использовали для выделения целых сетчаток, наружных сегментов (НС) или внутренних сегментов (ВС) палочек. В качестве объектов исследования использовали также беспородных белых крыс-самцов, крыс-самцов линии Sprague-Dawley, пресноводных рыб озера Байкал: омуля (Coregonus autumnalis migratoriiisi), хариуса (Thymallus articus), ленка (Brachymystax lenok), сига (Coregonus lavaretus baikalensis), ельца (Leuciscus leuciscus baikdlensis), плотвы (Rutilus rutilus lacustris), гольяна (Phoxinus percnurus), окуня (Perca JIuviatilis) и эндемичных бычков - желтокрылки (Cottocomephorus greminskii) и подкаменки (Batrachocottus baicalensis), а также прудового карпа (Cyprinus carpio). Перед исследованием рыбу адаптировали в аквариумах с проточной байкальской водой или с ежедневной сменой половины воды 7-14 дней. Крыс и рыб использовали для выделения микросомной фракции печени, гепатоцитов и нейтрофилов крови.

Плаценту получали непосредственно в момент родов в родильных домах г. Барнаула и населенных пунктов различных районов Алтайского края, замораживали в жидком азоте и доставляли в Москву.

Во всех экспериментах использовали реактивы категории не ниже аналитической, приобретенных у известных фирм (Boehrmger, Chemapol, Gee Zawson, Merck, Serva, Sigma, Реанал, Реахим и др.)

ФРМ выделяли из сетчаток с помощью дифференциального центрифугирования с некоторыми модификациями методов (Kimura, 1952; Papermaster and Dreyer, 1974). Сетчатки и ФРМ подвергали темновой или световой инкубации. Освещение проводили лампой накаливания; использовали интерференционные фильтры для освещения светом с различными длинами волн. При этом получали равноквантовые световые потоки (6,5* 1014 квантов на 1 см2 за 1 сек). Исследование кинетики термоденатурации родопсина в НС проводили, как описано в работе (Тюрин и др., 1977).

Дтя индукции системы монооксигеназ печени (48 или 72 часа) применяли одноразовую внутрибрюшинную инъекцию ксенобиотиков в оливковом масле

(фенобарбитала - ФБ, 3-метилхолантрена - MX, ß-нафтофлавона - НФ от 40 до 80 мг на кг массы, арахлора 1254 - АХ или совола - СВ, 200 мг на кг). При работе с рыбами использовали также сточные воды БЦБК разных разведений в специально приспособленных ваннах.

Печень крыс или ткани плаценты рожениц перфузировали охлажденным раствором 0,15 М КС1 в фосфатном буфере и выделяли микросомную фракцию методом дифференциального центрифугирования (Арчаков и др., 1968; Де-Пьер и Дальнер, 1978).

Изучение ферментов микросомной фракции печени байкальских рыб выявило их высокую лабильность. В связи с этим стандартная процедура выделения микросом была модифицирована за счет внесения в среду выделения антиоксидантов, ингибиторов протеаз, комплексонов металлов и очищенной фракции сывороточного альбумина для связывания свободных жирных кислот (СЖК). В среду хранения микросом добавляли 20% глицерин, ЭДТА (105 М) и 4-метил-2,6-дитретбутилфенол (ионол) (10-4 М).

Фракцию микросом печени крыс, обогащенную цитохромом Р-450 или НАДФН-цитохром Р-450-редуктазой, получали путем инкубации нативных мембран в фосфатном буфере в присутствии детергентов тритона Х-100 и холата натрия. Получали переосажденные препараты микросом с повышенным содержанием цитохрома Р-450 или элюированные с колонки фракции солюбилизата с высокой НАДФН-цитохром с-редуктазной активностью (Williams and Kamin, 1962; Takashi ct al, 1981).

Концентрацию цитохрома Р-450 в микросомных препаратах печени крыс и плаценты человека определяли по методу (Omura and Sato, 1964), а в микросомной фракции печени рыб методом (Johannesen and de Piere, 1978). Содержание изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени рыб определяли методом иммуноблотинга (Thomas et al, 1981).

Обработку микросом из печени крыс проводили трипсином при концентрациях 10'6 и 2«10'5 М; протеолиз останавливали фенилметилсульфонилфторидом. Скорость гидролиза фосфолипидов микросом фосфолипазой А2 определяли методом рН-метрии. В качестве калибровочного раствора использовали этанольный раствор олеиновой кислоты (10 мМ). Применяли также препараты лизолецитина и олеиновой кислоты, как имитаторы продуктов гидролиза нативных микросомных фосфолипидов. Для выявления влияния лизолецитина на гидрофобные и микровязкостные свойства микросомных мембран использовали спиновый зонд 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1 гексил.

Гепатоциты выделяли из печени крыс по методу (Van de Werve, 1980) с некоторыми модификациями. Для получения клеток использовали раствор Тироде (мМ): 125,0 NaCI, 3,0 КС 1, 1,0 MgCl2, 1,2 NaH2PO4, 2,0 СаС12, 40 трис (рН 7,4) при температуре 37°С. Перфузию печени осуществляли in situ безкальциевым раствором, а затем in vitro в присутствии кальция и коллагеназы. Первичную суспензию гепатоцитов очищали путем фильтрации через нейлоновый фильтр и трехкратного центрифугирования (100g, 1-2 мин) в растворе Тироде. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 70-75% неповрежденных клеток (по тесту окраски трипановым синим).

Цельную кровь крыс получали из брюшной аорты в присутствии гепарина в лабораторных условиях. Венозную или кровь из пальца у людей отбирали в уловиях

клиники и стабилизировали гепарином (от 20 до 200 ед./мл в зависимости от условий эксперимента) или 3,5% цитратом натрия (1мл на 9 мл крови).

Нейтрофилы выделяли из свежей крови крыс (артериальная кровь из брюшной аорты) или из венозной крови человека по модифицированному методу (Boyum, 1968). Для регистрации изменения микровязкости клеточных мембран нейтрофилов использовали спиновый зонд 5-доксилстеарат.

Из мембранных препаратов извлекали липиды по методу (Folch et al, 1951). Определение, содержания фосфолипидов проводили методами одномерной и двумерной тонкослойной хроматографии (Wagner et al, 19 61 ; Vaskovsky and Kostetsky, 1968). Жирнокислотный состав мембранных фосфолипидов определяли методом газожидкостной хроматографии.

Содержание белка определяли с помощью биуретового реактива, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Gomall et al, 1949) или по методу (Lowryetal, 1951).

О НАДН- или НАДФН-зависимой генерации О}*" в суспензиях НС и ВС палочек сетчатки судили по образованию адренохрома из адреналина (Misra and Fridovich, 1972). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в гомогенатах сетчатки, ФРМ или в водно-этанольных вытяжках из мембран по методу (Fridovich, 1972), используя для генерации систему ксантиноксидаза - ксантин в присутствии тетранитротетразолия синего (НСТ).

Скорость образования продукта восстановления НСТ - диформазана в мембранных препаратах регистрировали спектрофотометр ически или определяли наличие его гранул в нейтрофилах при анализе мазков цельной крови.

Активность глютатиоЪероксидазы (ГПР) и глютатионредуктазы (ГР) в ФРМ определяли по методам (Ланкин и Гуревич, 1976; Hosoda and Nakamura, 1970). Активность глютатион S-трансферазы (ГТ) и УДФ-глюкуронозилтрансферазы (УДФ-ГТ) в микросомной фракции плацент определяли по стандартным методам (Habig et al, 1974; Isselbacher, 1956). Содержание токоферола в зтанол-гексановых экстрактах мембран определяли по характерным спектрам флюоресценции (Taylor and Lamden , 1976).

Для индукции ПОЛ к эмульсии линоленовой кислоты, ФРМ, микросомной фракции печени (или их липидным вытяжкам), суспензии гепатоцитов добавляли FeS04«6H20 (3*10"6 - Ю"3 M), а также, соответственно, ЭДТА или АДФ в эквимолярных концентрациях, аскорбат (2-5*1(Т М), НАДН или НАДФН (0,5 - 1*10" 3 М), Ф (10"7 M - 10"4 M), в некоторых случаях CCI4 (10 мкл/ мл in vitro, или 1 мл на 1 кг массы тела in vivo) и проводили инкубации в аэробных условиях в среде, содержащей 100 мМ NaCI, 50 мМ трис-HCl (или фосфатный) буфера (рН 7,2-7,4) при температуре 37°С в течение 15,30,45 или 60 мин. Выделенные фосфолипиды подвергали анализу на определение первичных продуктов ПОЛ — гидроперекисей (ГП) по образованию диеновых конъюгатов (Bolland and Koch, 1945). Общее содержание П1 определяли методом полярографии с ртутно-капельным электродом в системе органических растворителей (Данилов и др., 1972). Накопление малонового диальдегида (МДА) — регистрировали спектрофотометрически при образовании комплекса МДА в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Kohn and Liversedge M., 1944). Для обнаружения ОН* радикалов применяли спиновую ловушку С-фенил-М-/я/>е/и-бутилнитрон (II) (ФБН) (Emmons W.D.J, 1957). Помимо ионола в качестве ингибиторов ПОЛ использовали оксипиридин-6 (ОП-6), 1,2,3-триоксибензол (пирогаллол), другие фенолы, некоторые лекарственные формы.

Монооксигеназные активности ЭКОД и О-деэтилирования 7-этоксирезоруфииа (ЭРОД) (Ullrich and Weber, 1972), БП-гидроксилазную активность измеряли прямым флюориметрическим методом (Yang and Kisha, 1978), а последнюю и по скорости образования 3-гидрокси-БП (Nebert and Gelboin, 1968). Скорость О-деметилирования р-нитроанизола (НА) измеряли спектрофотометрически (Карузина и др., 1979).

Для определения интенсивности ОВ нейтрофилов крови крыс использовали люминометр ПХЛ-01. В среду измерения вносили люминол (0,1 мМ), нейтрофилы (0,5 • 103 клеток/мл), регистрировали интенсивность ХЛ при 37°С после добавления активатора ОВ форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА, 0,1 мкМ).

Детекцию сверхслабого излучения образцов цельной крови человека или суспензии нейтрофилов осуществляли в режиме счета одиночных фотонов с помощью фотоумножителей с фотокатодами S-11 и диаметром окна 5 см типа EMI 9750QB/1 (Англия), обладающих максимальной спектральной чувствительностью в диапазоне 380-490 нм и установленных на жидкостном сцинтилляциошюм счетчике радиоактивности "MARK-И" (Nuclear-Chikago, США). Для регистрации люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции (ЛМ-ХЛ и ЛЦ-ХЛ, соответственно) люминофоры вносили в кровь из растворов, приготовленных на ДМСО и физиологическом растворе, соответственно, до конечной концентрации 0,1 мМ. ОВ индуцировали в крови зимозаном (конечная концентрация 0,1 мг/мл) или ФМА (конечная концентрация 0,1 мкМ). Кровь для регистрации ее излучения помещали (если не указано особо) в стандартные флаконы для сцинтилляционного счета (стеклянные или пластиковые) или полипропиленовые пробирки типа "Эппепдорф".

Результаты обрабатывали статистически по критерию Стьюдента, в ряде случаев используя компьютерные пакеты программ "Statgraphics" и "Statislica". Достоверность различий опытных и контрольных результатов оценивали по парным критериям Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Действие света и реакции АФК в сетчатке и мембранных образованиях фоторецепторов. Одним из самых важных факторов среды является свет. В ходе эволюционного процесса у живых организмов появились органы и системы восприятия света: от фототаксиса у простейших, фототропизма и фотосинтеза у растений до сложнейшего физиологического процесса акцепции и анализа зрительной информации на сетчатке у высокоорганизованных животных организмов - процесса зрительной рецепции света. Сетчатка глаза - одна из наиболее аэрируемых тканей организма. В ней происходят события, которые наряду с передачей зрительного сигнала, приводят к генерации АФК. ФРМ относятся к типу метаболически активных жидких мембран, для которых характерно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в составе фосфолипидов. При взаимодействии АФК с ПНЖК активируется процесс ПОЛ. Свойства фоторецепторного комплекса напрямую зависят от ассоциироваЕпшх фосфолипидов, которые непосредственно участвуют в механизмах рецепции света. Следовательно, возникает большая вероятность протекания процесса ПОЛ при зрительной рецепции. Мы впервые на модели ФРМ глаз травяной лягушки, рыбы минтая и быка показали светозависимую генерацию свободнорадикалышх центров в липидной компоненте как этих мембран, так и сетчатки в целом (рис 1).

Рис. (.Спектрдействия фотоиндуцированного окисления липидов сетчатки и НС палочек (по данным спектр-ро фотометрии).

1 -освещенные сегменты; 2 - освещенные сетчатки; 3 -темноадаптированные сегменты; 4 - темноадаптирован-ные сетчатки. По оси абсцисс - длины волн освещения сетчаток и НС; по оси ординат - накопление диеновых конъюгатов: О/С - относительная оптическая плотность при Х^ - 232 нм (тц); С - концентрация : общей фракции липидов, мг/мл.

При освещении равноквантовыми световыми потоками различных длин волн максимальное количество ГП липидов накапливается в области 500 нм преимущественно в мембранах фоторецепторных клеток. Спектр действия светозависимого ПОЛ совпадает со спектром поглощения родопсина, что говорит о его вовлечении в этот процесс. Обнаружение центров генерации АФК в структурах сетчатки глаза, приводящих к такому результату, представляется важной задачей. Однако нам не удалось обнаружить фотоиндуцированные радикалы родопсина при действии видимого света в препаратах НС палочек сетчатки лягушки и экстрактах родопсина, используя метод ЭПР даже при температуре жидкого азота. Не исключено, что радикальные центры при фотолизе родопсина могут иметь очень малые времена жизни при этой температуре, а их регистрация окажется возможной лишь в области более низких температур (4-50°К). Образование фотоиндуцированных свободнорадикальных центров в зрительном пигменте может способствовать переходу кислорода в синглетное возбужденное состояние при

условии, если в процессе обесцвечивания родопсина образуются интермедиаты его фотолиза в триплетном возбужденном состоянии. Таковым является конечный продукт фотолиза зрительного пигмента - ретиналь, который способен активировать кислород до его синглет-возбужденного состояния. '0*2 может способствовать генерации перекисных радикалов в липидах ФРМ, что мы и обнаруживали при обесцвечивании сетчаток или суспензии НС (рис 1).

С другой стороны, мы не смогли обнаружить в НС палочек сетчатки лягушки и рыбы минтая НАДФН и НАДН-зависимые системы генерации АФК, о чем судили по отсутствию влияния на скорость окисления адреналина в адренохром при наличии этих восстановительных эквивалентов (рис 2 а). Но в структурах ВС палочек удалось обнаружить НАДН-зависимый механизм образования Ог*" (рис 26). Обнаруженная нами в сетчатке и ее ФРМ у лягушки и быка активность СОД (в пределах 0,14-0,18 ед. опт.пл. за 1 мин на 1 мг белка при 25 оС, исходя из 50% ингибирования скорости образования диформазана из НТС) была гораздо более слабая, чем в органеллах гепатоцитов и эритроцитах (РпЛэуюИ, 1972). Активность ГПР и ГР в НС и ВС палочек сетчатки лягушки и быка оказалась также очень низкой, хотя при этом во фракции ВС активность ГПР заметно выше, чем во фракции НС (в среднем нмоль восстановленного глютатиона за 1 мин на 1 мг белка: 0,3 против 1,5 у лягушки и 0,7 против 1,3 у быка, соответственно). Следует отметить, что отсутствие влияния НАДН или НАДФН на содержание перекисей характерно для НС как с полностью обесцвеченным, так и с необесцвеченным родопсином. Это, по-видимому, явилось приспособительным механизмом для функционирования фоторецепторной системы,

«»

. и

l» ¿V

I«

§«7 J» Qfi

i«

j«f

0

Ii

io го 4в у и » « ss m

«

i«; f U

•f w

Ii»

I« * »

4'

Рис. 2. Скорости окисления адреналина в адренохром в присутствии мембран фоторецепторов сетчатки минтая. Ре2*, восстановленных пиридиннуклеотидов и феназин-метасульфата (Ф). А - в присутствии мембран 11С сетчатки; Б - изменения во времени в спектре поглощения системы: НС + Ре3* + алреналин+НАДН+Ф; В - в присутстви мембран ВС палочек: 1,5- ре2* (10"5 М), 2,7 - и НАДЬ (5«10"' М); 3 - Те2\ НАДН и Ф (Ю-6 М), 4, 6 - Ре2* и НАДФН (5« 10"* М).

т.к.

позволяет исключить конкуренции за источники льных эквивалентов между реакциями

возможность восстановите-об-

разования ГП липидов и локализованной в НС НАДФН-зависимой ретинолдегидро-геназой, участвующей в темновой регенерации родопсина.

Следовательно, стационарный уровень генерации АФК и ГП липидов в ФРМ должен поддерживаться преимущественно не пиридиннуклеотид-зависимыми ферментными системами и ферментными системами СОД, ГПР или IT, a d,l,o> токоферолом (витамином Е), которого в сетчатке находится значительное количество - на 10 молекул родопсина приходится 1 молекула токоферола, что в 5-10 раз больше, чем в митохондриях и микросомах печени (Farnsworth and Dratz, 1976). Витамин Е выступает как в роли тушителя синглетного кислорода, так и обладает антирадикальной активностью. Поэтому в нормальных физиологических условиях процесс ПОЛ ограничивается по скорости, а стационарные концентрации его продуктов в структурах сетчатки не обеспечивают значимую степень повреждения. Эти положения подтверждаются еще и тем, что, как мы обнаружили, при дефиците витамина Е развивается дистрофия сетчатки, сопровождаемая интенсивным накоплением продуктов ПОЛ.

Все вышеперечисленные данные говорят о высокой степени приспособленности зрительной системы к регуляции баланса между необходимостью аэрируемости сетчатки и повышенным риском образования излишних концентраций АФК в мембранных структурах фоторецепторов.

Для того, чтобы представлять, какие последствия может вызывать активация кислорода в сетчатке глаза животных разной систематической принадлежности, мы провели серию исследований с использованием в качестве индуцирующего воздействия систему Ре+2+аскорбат. Оказалось, что скорость спонтанного и индуцированного ПОЛ в суспензиях НС изменяется при конформационных перестройках ФРМ, происходящих в результате обесцвечивания родопсина. В основе этого эффекта лежит изменение доступности ПНЖК фосфолипидов ФРМ для АФК, участвующих в реакции автоокисления.

Нами было установлено, что молекулярная организация ФРМ определяет степень подверженности модификации ее компонентов в результате активации процесса ПОЛ. Все изученные типы ФРМ резко отличаются количеством жидких липидов в бислое, а также количеством кластеризованных и иммобилизованных молекулами родопсина фосфолипидов. Последняя особенность может служить фактором, определяющим термостабильность зрительных пигментов в ФРМ. Мембраны фоторецепторов из-за высокой ненасыщенности липидов могут быть чувствительны к флуктуациям температуры, и их можно использовать в качестве тест-объектов для оценки термоустойчивости родопсина у животных, приспособленных к определенным температурам среды обитания.

Мы проводили сравнительное исследование зависимости термостабильности родопсина изучаемых животных от количества иммобилизованных зрительным пигментом липидов (метод спиновых зондов с использованием 2,2,2,6-тетраметил пиперидин-1-оксил (ТЕМПО) и спин-меченого производного пальмитиновой кислоты). Было показано, что термостабильность родопсина быка в области 40°С -60°С более высокая, чем минтая и лягушки, но в области физиологических температур (37°С - для быка, 0°С-10°С - для минтая и 0°С-20°С - для лягушки) как термостабильность родопсина и жидкостность липидного бислоя, так и количество иммобилизованных зрительным пигментом молекул липидов в ФРМ оказались очень близки. Таким образом, липидный состав мембран фоторецепторов играет существенную роль в индикации степени генерации АФК в том смысле, что по уровню ПОЛ можно судить об устойчивости этой мембранной системы к факторам, способствующим флуктуациям свободно-радикальных процессов в сетчатке. Среди таких факторов определяющим может оказаться изменение экологической обстановки в результате резкой смены светового и температурного режима, например, при нарушении целостности озонового слоя атмосферы ("озоновые дыры"). Такие нарушения, возможно, будут способствовать снижению термостабильности родопсина, а, следовательно, ухудшению функции зрения (ЛИ, 1975) у животных, не приспособленных к жизни в измененном температурном режиме.

2. Исследование реакций АФК на микросомной модели при различных воздействиях. Долгосрочная адаптация организмов к меняющимся условиям обитания под влиянием различных факторов окружающей среды сопровождается возникновением специализированных структур и механизмов, которые способствуют переходу организмов в новое качество своих адаптационных возможностей. Однако после прекращения действия какого-то побудительного фактора часто возникает необходимость устранения синтезированных de novo структур, чтобы создать условия для получения новых адаптационных возможностей (Месрсон, 1981). Отсюда очевидна важность механизмов, осуществляющих эту функцию, т.е. разборку синтезированных структур, участвующих в адаптации. Примером возникновения и

устранения таких структур является индукция системы оксигеназ со смешанной функцией, локализованной в мембранах ЭР печени, при попадании в организм ксенобиотиков и последующая разборка индуцированных структур (Арчаков, 1975; Ляхович и Цырлов, 1981). Изоформы цитохрома Р-450 являются ключевым звеном монооксигеназной системы, обладающие специфичностью к метаболизму ряда гормонов и большому разнообразию гидрофобных ксенобиотиков. Определенные классы химических соединений способны вызывать индукцию множественных форм цитохрома Р-450 и монооксигеназных активностей, катализируемых этими изоформами (Boobis et я1, 1977; Yang, 1978; Мишин и Ляхович, 1985; Lisitsa et я1, 2001). Последний процесс не может происходить без генерации АФК, благодаря которым и с помощью соответствующих ферментных компонентов и осуществляются акты детоксикации очень широкого круга чужеродных химических соединений (Головенко, 1981; Парк, 1973).

Результаты ряда исследований (Каган и др., 1974; Берия, 1976; Велиханова и др., 1981 и пр.) доказали, что индукция эндогенного ПОЛ является тем самым механизмом, который регулирует функциональную готовность системы монооксигеназ к новому циклу гидроксилирования ксенобиотиков за счет способности эффективного процесса разборки излишков мембранных компонентов и отработавших индуцированных форм цитохрома Р-450. С другой стороны важно было устанавливать наличие первичных агентов - производных АФК, инициирующих ПОЛ, необходимого для осуществления регуляции гидроксилирования гидрофобных субстратов-ксенобиотиков и их детоксикации. 2.2. Изучение механизмов инициирования АФК и ферментативного НАДФН-зависимого ПОЛ в мембранах ЭР печени крыс При исследовании природы радикалов, образующихся в системе ферментативного НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс мы использовали сочетание двух методов: метода спиновых ловушек (с использованием ФБН), позволяющий непосредственно изучать короткоживущие радикалы и следили за накоплением МДА*.

2.2.1. Механизм инициирования реакции переписного окисления линоленовой кислоты в химической системе феназинметасульфат-НАДН. Прежде, чем исследовать эту связь в микросомной системе, мы изучили роль АФК в реакциях инициирования процесса ПОЛ в модельной химической системе, содержащей аналог флавинов - Ф (феназинметасульфат) и НАДН и генерирующей супероксиданион радикал. В качестве субстрата перекисного окисления использовали линоленовую кислоту. В диссертации подробно изложены методические особенности и полученные с помощью этой модели результаты, свидетельствующие о том, что в процессе окисления линоленовой кислоты происходит как спонтанное образование МДА, так и идущее со значительно большей скоростью в присутствие ионов Fe2+ и ЭДТА. Каталаза резко снижала скорость накопления МДА, что свидетельствовало об участии Н2О2 и ОН-радикалов в реакциях инициирования процесса перекисного окисления линоленовой кислоты. Этот вывод подтверждался результатами изучения спиновых аддуктов радикалов, образующихся в изучаемой модели. Так введение в систему каталазы резко уменьшало стационарную концентрацию аддуктов гидроксиэтильных радикалов** в результате снижения концентрации Н2О2 и,

* Работу проводили совместно с сотрудниками каф.биофизики II Московского мединститута (ныне Медуниверситета) под руководством академика РАМН Ю-А-Владимирова.

"* Регистрация спектров ЭПР аддуктов ОН-радикалов затрудняется их невысокой стабильностью, а также низкой стационарной концентрацией ^ап/еп е! а1, 1973). Поэтому использовали промежуточный акцептор ОН-

следовательно, ОН-радикалов. Эти закономерности хорошо видны из основных результатов, представленных на рис 3.

Зависимости образования ФБН-СН3СНОН-радикалов и МДА от концентрации Ф и Fe2+ имеют сходный «колоколообразный» характер.

Рис. 3. Зависимость концентрации спиновых аддуктов (а) гидроксиэтильных радикалов (1) и МДА (2) от концентрации Ф (а), НАДН (б) и ионов Fe2* + ЭДГА (в).

Наибольшая скорость накопления этих продуктов наблюдалась при концентрациях Ф (10"5 М) и Fe2+ (10"4 М). При этом остаются каждый раз фиксированными концентрации других инградиентов реакции (Ф - 10'5 М, Fe2+ - 10"4 М, НДДН, - 10"4 М, соответственно). При увеличении концентрации НАДН в диапазоне КГМо*2 М обе зависимости линейно идут вверх. Наблюдаемое соответствие в изменении концентрации аддуктов гидроксиэтильных радикалов и скорости накопления МДА свидетельствует в пользу участия ОН-радикалов в реакциях инициирования перекисного окисления линоленовой кислоты.

22.2. Изучение механизма инициирования ферментативного НАДФН-зависимого ЛОЛ в мембранах ЭР печени. В момент выполнения этой части работы относительно НАДФН-зависимых реакций ПОЛ в мембранах ЭР не было единой точки зрения ни относительно механизмов элементарных стадий этого процесса, ни относительно его локализации в НАДФН-зависимой цепи переноса электронов. Для выяснения этих вопросов было проведено исследование по сопоставлению генерации АФК и индукции ПОЛ в нативных микросомных мембранах печени крыс, а также с различным содержанием НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы и цитохрома Р-450.

Нами было обнаружено одновременное образование устойчивых спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов с ФБН в микросомах и накопление МДА (аналогично химической модели). Добавление СОД весьма незначительно снижало амплитуду сигнала спиновых аддуктов и концентрацию МДА, а добавление каталазы резко тормозило их образование. При совместном действии СОД и каталазы ЭПР-сигнал спиновых аддуктов и содержание МДА практически не превышали фонового. Такой результат, очевидно, вызван как устранением Н2О2 - источника ОН-радикалов, так и О2**, участвующего в регенерации ионов железа (Cohen and Coderbaum, 1980).

радикалов - этанол, взаимодействующий с высокой скоростью с гидроксильными радикалами (к. = 10 М •€') (Осипов и др., 1981).

Следовательно, доминирующим путем индукции НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс представляется механизм, ключевым звеном которого являются ОН-радикалы, как это отражено на схеме:

Следующим этапом исследования было определение участка микросомной НАДФН-зависимой электронтранспортной цепи, на котором происходит образование инициирующих процесс ПОЛ АФК. Было обнаружено, что в присутствии ионов Ре2+ (10-4 М) во фракции микросом с повышенной концентрацией НЛДФН-цитохром Р-450 редуктазы (180% по сравнению с контролем) и полностью лишенной цитохрома Р-450 образование спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов происходит в 33,5 раза более эффективно, чем в нативных микросомах. С другой стороны, во фракциях микросомных мембран, практически лишенных активности НЛДФН-цитохром Р-450 редуктазы (15-20% по сравнению с контролем), наличие аддуктов почти полностью отсутствует.

Следовательно, участком, ответственным за генерацию АФК, можно считать НАДФН-цитохром Р-450 редуктазу. В соответствии с этим показано, что скорость НАДФН-зависимого ПОЛ, регистрируемого по накоплению МДА, в микросомах с разным содержанием НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы линейно зависит от редуктазной активности (рис 4).

Учитывая задачи биотестирования ния, эти результаты могут быть полезны при испытании, например, токсичности каких-либо веществ (загрязнителей окружающей среды, медикаментозных средств и т.д.)- Угнетение скорости генерации АФК в микросомной системе при этом может обуславливаться в первую очередь ингибирующим действием на НАДФН цитохром Р-450 редуктазу.

Проводя параллельно оценку степени НАДФН-зависимого ПОЛ можно устанавливать, насколько изменилась активность фермента под воздействием токсиканта. Безусловнл\о, используя микросом-ную систему печени как источник АФК

для анализа действия факторов окружающей среды, необходимо всегда помнить, что эта система в организме осуществляет функцию детоксикации ксенобиотиков, эффективность которой будет зависеть как от способности системы генерировать оптимальные количества АФК, так и от активности терминальной оксигеназы цитохрома Р-450, а вернее, его множественных форм, ответственных за гидроксилирование гидрофобных субстратов разной природы. Именно поэтому важным аспектом в функционирования этой системы является устойчивость цитохрома Р-450 к различным воздействиям, в том числе к АФК.

2.3. Взаимосвязь процессов ПОЛ и протеолиза в деградации цитохром Р-450-зависимой системы детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени.крыс

Известно, что ПОЛ в микросомах способно лишь вызывать конверсию цитохрома Р-450 в неактивную форму цитохром Р-420 (Каган и др., 1974; Schafer and Hultquest, 1980; Scheller et al, 1976). Вместе с тем при разборке цитохрома Р-450 in vivo, как правило, не удается обнаруживать ни цитохром Р-420, ни другие продукты его катаболизма (Wills, 1971). Это означает, что наряду с процессом ПОЛ в условиях in vivo в деградации цитохрома Р-450 участвуют и другие механизмы, например, протеолитическое разрушение цитохрома Р-450.

Нами было обнаружено, что ПОЛ и реакции протеолиза цитохрома Р-450 могут выступать в качестве двух взаимоусиливающих процессов, обеспечивающих в совокупности высокую активность разборки фермента (рис 5). Процесс трипсин-зависимой деградации цитохрома Р-450 двухфазен: в течение первых 1-3 мин происходит быстрое разрушение цитохрома Р-450 [V=0,03 нмоль*мг"'(белка) «мин*1], после чего скорость деградации уменьшается практически до 0 при действии трип-

рации

хрома r-4jU равна мг'(белка)«мин"'. При

сина в концентрации 10 М. При его концент-2*10"5М Р-450

скорость

деградации цито-0,08 и 0,0036 нмоль» выбранных условиях протеолиза около 81% общего пула цитохрома Р-450 оказывается недоступным для трипсина в концентрации 10"'Ми 60% - при кон-центрациитрипсина 2*10"5 М, даже после 10 10 мин протеолиза.

При комбинированном действии ПОЛ и трипсина отмечены два эффекта: ускорение быстрой реакции деградации пула цитохрома Р-450 для протеазы. В микросомных фракциях Из печени крыс после воздействия ФБ или MX НАДФН-зависимое ПОЛ ускоряло разборку и доступность цитохрома Р-450 для протеаз в большей степени, чем в интактных микросомах.

Следовательно, ПОЛ и протеолиз два взаимоусиливающихся процесса, в совокупности резко повышающих скорость деградации пулов цитохрома Р-450 и доступность их для разборки. Процесс ПОЛ может рассматриваться как триггерный механизм, делающий доступными те или иные формы цитохрома Р-450 для эндогенных протеаз. Мы обнаружили важный факт: устойчивость конститутивного пула цитохрома Р-450 к таким воздействиям, как ПОЛ и протеолиз, заметно выше, чем его индуцированных форм.

Участие перекисей липидов в регуляции активности монооксигеназных систем в мембранах ЭР in vivo, вероятно, не ограничивается их ролью в деградации индуцированных мембран. Наличие обратной корреляции между содержанием цитохрома Р-450 и стационарными концентрациями перекисей липидов характерно для целого ряда патологий и воздействий факторов окружающей среды. К ним можно

отнести, например, Е-авитаминоз (Comforti and Benedetti, 1972), лучевую болезнь (Лхалая и др., 1990), ишемию (Велиханова и др., 1981), токсическое действие СС14 (Rcknagel and Glende, Jr., 1974).

2.4. Антиокислительная активность некоторых лекарственных средств в микросомной системе печени крыс Установление последовательности реализации функционального ответа ферментного ансамбля ЭР гепатоцитов на воздействия факторов окружащей среды имеет важное значение для поддержания нормального гомеостаза организма. Каждая особь какой-либо популяции животных, являющаяся экологической единицей (Федоров и Гильманов, 1980), в случае нарушения устойчивости таких важных систем, как детоксицирующая система печени, либо выживает в своей экологической нише за счет мобилизации ресурсов организма, либо погибает. Если же рассматривать человека, с одной стороны находящегося в определенных экологических отношениях в окружающей его среде, а с другой стороны яатяющегося социальным существом, то при изменении его физиологического состояния или при возникновении какой-либо патологии, наряду с мобилизацией собственных ресурсов организма, часто требуется вмешательство медицины и применение лекарственных препаратов. Большинство из последних непосредственно вступает в метаболические отношения как раз с системой детоксикации печени организма человека. Нередко действующим лечебным началом являются их продукты, образующиеся в результате реакций гидроксилирования лекарств в монооксигеназной системе, и АФК в этих реакциях играют основную роль. Поэтому лекарственные средства можно считать действующими факторами окружающей среды по отношению к больному человеку. Понимание механизмов лечебного действия одних медикаментозных препаратов, не являющихся субстратами монооксигеназной системы, или производных других, образующихся в дстоксицирующей системе печени, представляется важной задачей.

Мы проверяли антиокислительное действие диэтилкарбамазина (ДЭКЦ), левамисола (ЛВ), дипиридамола (ДП) и лобензарита (ЛБ) в различных моделях микросомного НОЛ. Эти лекарственные препараты в общем своем лечебном действии являются иммуномодуляторами и обладают противовоспалительными свойствами. Работу проводили в 1988 году в рамках межвузовского сотрудничества между МГУ и Национальным центром научных исследований Кубы в его Биомедицинском отделе (зав. отделом проф. К. Паскуаль).

В экспериментах использовали микросомную фракцию из печени белых крыс-самцов линии Sprague-Dawley. Использовали также специальную систему преимущественного метаболизма лекарств, как субстратов цитохрома Р-450 (в присутствии НАДФН) с последующей добавкой Ре2+-АДФ для активации ПОЛ (следили по накоплению МДА), чтобы выявить лекарства - субстраты монооксигеназной системы и продукты их метаболизма с антиоксидантной активностью. Особо в экспериментах in vivo изучали протекторное действие исследуемых лекарств в условиях ССЦ - зависимого гепатогенеза. Такая постановка задачи была важна и потому, что ССЦ часто используется при разработке моделей действия низкомолекулярных органических загрязнителей окружающей среды. Как мы показали, активированный процесс ПОЛ полностью ингибировался в присутствии ДП. Это производное пиримидина с четырьмя гидроксиэтильными группами является антиоксидантом прямого действия, перехватывающим как АФК, так и перекисные свободные радикалы. ЛВ и ЛБ оказались слабыми антиоксидантами, достоверно не снижающими уровень накопления МДА.

Наибольший интерес из исследованных лекарств вызвал ДЭКЦ. До тех пор механизм его действия не был изучен достаточно глубоко. В молекуле ДЭКЦ содержатся две этильные группы карбамида (1-е положение пиперазинового кольца) и одна связанная с атомом азота метальная группа (4-е положение кольца), т.е. это вещество может проявлять антиоксидантные свойства после деалкилирования в монооксигеназной системе (рис 6).

В присутствии 11АДФН как с ДЭКЦ, так и без него происходило незначительное, практи чески одинаковое накопление МДА в течение 30 минут инкубации. После добавления Fe2+- АДФ в системе без ДЭКЦ скорость образования МДА резко возрастала (кривая 1), но в присутствии ДЭКЦ эта скорость была заметно более низкой (кривая 2). Такое различие указывает на то, что в первые 30 минут могли образовываться достаточные концентрации производных ДЭКЦ - ингибиторов ПОЛ, т. к. после добавления Fe2+- АДФ скоро- . сть накопления МДА замедлялась. В системе " оомин

без добавления Ре2+-АДФ исходно низкий Рис. 6. Динамика накопления МДА в микросо-уровень МДА не изменялся в течение всех 60 ма^ени крыс в условиях преимущественного

ттглт^тт метаболизма Д--ЖЦ: минут в независимости от присутствия ДЭКЦ

(кривые 3,4). бавкой Fe2* • АДФ, 2 - то же, что и I, в присутст-

твии ДЭКЦ, 3 - в присутствии НАДФН без до-

Далее изучали способность ДП и ДЭКЦ предотвращать в микросомах повреждающее вин ДЭКЦ.

действие ССЦ in vitro, которое прежде всего 100%-концентрация МДА в начальной точке из-выражается в индукции ПОЛ.

Рис.7. Чувствительность микросом печени крыс к индукции ПОЛ системой Fe^-АДФ-НАДФН in vitro после действия CCU и защиты ДЭКЦ in vivo: 1 - динамика накопления МДА в контрольных микросомах; 2,3,4 - после действия сответственио СС1<, ССЦ+ДЭКЦ, ДЭКЦ. 100% - концентрация МДА в начальной точке измерения.

Результаты опытов показали, что в присутствии ССЦ и НАДФН ДП более эффективно ингибирует накопление МДА, чем ДЭКЦ.

Чтобы подтвердить использование ДЭКЦ, как профилактического средства против токсического действия ССЦ in vivo, была проверена устойчивость к ПОЛ мембран из печени крыс, подверженных действию ССЦ и ДЭКЦ (рис 7).

Как видно из рисунка, мембраны микросом из печени крыс, подвергавшихся действию ССЦ, оказались затем чувствительными к НАДФН-зависимому ПОЛ in vitro (кривая 2).

Введение животным ДЭКЦ совместно с ССЦ значительно стабилизировало микросомальные мембраны (кривая 3). Введение ДЭКЦ контрольным животным приводило к тому, что устойчивость мембран к ПОЛ становилась выше, чем интактных микросом (кривые 1,4). Таким образом, ДЭКЦ хорошо защищает организм от действия ССЦ, является хорошим стабилизатором микросомных мембран, а продукты его метаболизма в монооксигеназной системе обладают

антиокислительными свойствами.

Итак, микросомная фракция печени крыс может быть хорошей мембранной тест-системой для оценки антиокислительной активности лекарственных веществ разнонаправленного действия, которая учитывает их возможную метаболическую трансформацию.

2.5. Применение тест-системы на основе монооксигеназных и конъюгирующих активностей плаценты для оценки развития желтухи новорожденных невыясненной этиологии Алтайского региона.. Микросомная фракция и се

монооксигеназная система может быть также использована, как мембранно-ферментный "датчик" воздействия повреждающих факторов окружающей среды таких, как радиоактивные и химические загрязнения. В настоящее время можно считать доказанным, что неблагополучная медицинская обстановка в некоторых районах Алтайского края связана с воздействием на население последствий наземных испытаний ядерного оружия, происходившими в период с 1949 по 1965 гг. (Шойхетидр., 1993).

Этот факт явился причиной проведения комплексных исследований изменений мембранных структур клеток крови новорожденных и рожениц в Алтайском крае, степени ПОЛ в крови, контроля на мутагенность и канцерогенность содержащихся в плаценте соединений с помощью теста Эймса (Ames, 1971).

Этот тест позволил также определять характер метаболической активации в мембранных системах цитохрома Р-450. При этом рассматривалась возможность модификации мембранных структур клеток крови, ЭР плаценты жительниц этих районов, не только у людей, непосредственно подвергавшихся действию ядерных испытаний, но и у их потомков.

При выявлении нарушений в функционировании тестируемых систем и при анализе результатов были выделены два основополагающих поражающих фактора: ионизирующая радиация в прошлом и возможность возрастающего токсического действия химических отходов производств в настоящее время. Алтайский край -территория с развитым промышленным и сельскохозяйственным производством является источником такого химического загрязнения. Причинами неблагоприятной медицинской обстановки может быть как воздействие радионуклидов на генетический аппарат родителей, так и действие химических загрязнителей на ход роста и развития детей.

Большинство гидрофобных загрязнителей (в особенности полициклические углеводороды (ПАУ) и полихлоринированные бифенилы (ПХБ)) являются субстратами цитохром Р-450-завиеимой системы и индукторами этой ферментной системы.

Помимо монооксигеназ в детоксикации ксенобиотиков принимают участие ферменты II-ой фазы детоксикации, осуществляющие реакции конъюгации. Промежуточные гидрофильные продукты, образующиеся в ходе моиооксигеназых реакций, являются субстратами ГТ и превращаются в безвредные продукты. ГТ также способна ковалентно связывать различные ксенобиотики, выполняя функции белка-нейтрализатора или транспортного белка. Плацентарная ГТ играет ключевую роль в защите плода от токсических соединений, повреждающих клетку, таких, как антибиотики, разнообразные гидрофобные лекарства, продукты химического синтеза и др. В плаценте важную роль играет УДФ-ГТ, осуществляющая конъюгацию ксенобиотиков с УДФ-глюкуроновой кислотой (Tephly and Burchell, 1990). Важность этого фермента заключена и в том, что он осуществляет метаболизм эндогенных соединений: тироксина, тетрагидрокортизола, стероидных гормонов и билирубина.

ГТ плаценты способна осуществлять транспорт билирубина и ингибироваться этим продуктом распада гемоглобина. Метаболизм гемоглобина происходит в ЭР печени после деструкции эритроцитов с помощью гемоксидазной системы, продуктами этой реакции как раз и является билирубин, а также СО (Meilin et al, 1996). Билирубин вступает в реакцию конъюгации с глюкуроновой кислотой. Повреждения мембраны ЭР могут привести к развитию гемолитической желтухи.

Мы провели исследование активностей моиооксигеназ и ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, осуществляющих их конъюгацию с глютатионом и глюкуроновой кислотой в плацентах рожениц, проживающих в ряде районов Алтайского края.

Для тестирования использовали 7-ЭК и 7-этоксрезоруфин (7-ЭР), как субстраты цитохрома Р-450. Концентрация общего пула цитохрома Р-450 в исследованных образцах плацент не превышала 0,2 нмоль/мг микросомного белка. Обнаруженные плацентарные деэтилазные активности практически во всех образцах были низкими, за исключением образцов микросомных фракций, полученных из плаценты рожениц, куривших в период беременности. Полученные результаты были представлены в виде групп, объединяющих матерей (кроме курящих), проживающих на территориях, подвергшихся влиянию ядерных испытаний. Кроме этого, группы были объединены с учетом поражения новорожденных гемолитической желтухой; в качестве контрольных учитывали детей, родители которых не проживали на территориях, подвергшихся сильному влиянию ядерных испытаний, и всех здоровых детей. Так например, обнаруживали снижение активности ЭКОД в плацентах матерей, проживавших на менее пораженных территориях и у рожениц из районов, наиболее пострадавших от испытаний ядерного оружия (рис 8).

Оказалось, что достоверных отличий между уровнями активностей монооксигеназной системы плацент в группах матерей, рожавших здоровых детей и с гемолитической желтухой новорожденных не существует (рис 9).

Подобные результаты были получены и для плацентарных УДФ-ГТ и цитозольной S-трансферазы.

Отсутствие изменений монооксигеназных активностей в плаценте матерей, проживающих па территориях, подвергавшихся воздействию ядерных испытаний,

позволяет говорить лишь об отсутствии на данной территории таких индукторов-ксенобиотиков, как ПХБ или ПАУ. Однако некоторые токсические ксенобиотики могут ингибировать монооксигеназные активности в плаценте, инициируя ПОЛ (Kulkarni and Kenel, 1987). Низкие активности плацентарных ферментов детоксикации могут быть также результатом накопления мутагенных соединений в плаценте.

Обнаруженные нами заметные, колебания показателей концентрации цитохрома Р-450 в микросомных фракциях плаценты, а также и монооксигеназных активностей могут быть связаны не только с этими причинами, а также, возможно, и не только с действием внешних химических-загрязнителей, но и с генетическими факторами.

Мы исследовали группы населения женского пола районов Алтайского края, которые родились значительно позже 1962 г. (последний срок испытаний ядерного оружия) и непосредственно не подвергались радиоактивному заражению. Те нарушения, которые наблюдали в монооксигеназных и конъюгационных реакциях в плацентах матерей и в состоянии здоровья новорожденных (гемолитическая желтуха и пр.), возникали - скорее. всего в результате аномалий генетического аппарата представителей более старшего поколения, проживавших непосредственно на территориях, загрязнявшимися радионуклидами в момент или вскоре после ядерных испытаний. До настоящего времени это положение остается гипотетическим и требует экспериментальной проверки.

Являясь частью комплексного анализа эпидемиологического состояния здоровья населения в районах, подвергшихся радиоактивному загрязнению, примененный нами метод измерения ферментов детоксикации в микросомах плаценты и регистрации соответствующих монооксигеназных активностей может быть рекомендован к дальнейшему применению в подобных мероприятиях для диагностики скрытых мембранных патологий, возникающих под воздействием повреждающих факторов окружающей среды.

3. Обоснование возможности использования системы микросом печени рыб как тест-системы для выявления действия антропогенных факторов на основе реакций с участием АФК (гидроксилирование и ПОЛ).

3.1. Исследование монооксигеназ со смешанной функцией е микросомах печени рыб оз. Байкал. На протяжении более, чем 10 лет мы проводили комплексное исследование влияния промвыбросов БЦБК - очищенных сточных вод и других факторов на микросомную систему печени байкальских рыб. Нам удалось разработать методы получения стабильных препаратов микросом из печени этих рыб и исследовать их свойства (мы определяли содержание цитохрома Р-450, активность НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы, БП-гидроксилазы, деэтилаз и т.д.).

Обнаружено, что уровень содержания цитохрома Р-450 и монооксигеназных активностей в печени рыб оз. Байкал зависел от вида, пола, периода репродуктивности, возраста рыб, периода их отлова (летне-осенние месяцы), но существенно не определялся местами отлова (южная и центральная часть озера).

Как видно из табл. 1, активность начального компонента системы оксигеиаз печени - НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы у изученных видов рыб существенно колебалась и оказалась в 50-100 раз меньшей, чем в микросомной фракции теплокровных животных. Содержание цитохрома Р-450 этой системы оказалось также низким (в 5-10 раз меньше, чем содержание цитохрома Р-450 в микросомах теплокровных животных). Для сравнения в табл. 1 приводили данные о содержании

неактивной формы цитохрома Р-420 и цитохрома Ь5 - компонента НАДН-зависимой электрон-транспортной цепи ЭР.

Озеро Байкал - один из наиболее чистых водоемов мира (Poliakova et в1, 2000). Поэтому обнаружение относительно низких концентраций цитохрома Р-450 и активностей НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы в микросомах печени рыб, выловленных в разных его районах, с одной стороны, является следствием исключительно низкого содержания в воде озера индукторов НАДФН -зависимой системы детоксикации, а с другой - позволяет считать выявленный

Таблица 1. Активность НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы содержание цитохромов Р-450 и Ь5 в микросомнон фракции печени рыб оз.Байкал.

Вид - рыб Активность редуктазы, нмоль цит.с*мг '»мин1 Содержание цитохромов, нмоль на 1мг белка: Р-450 Р-420 Ь$

Голъян(п=3) 2,49+0,99 0,08 0,07 0,04

Окунь(п=13) 0,60+0,20 0,19+0,07 одо+о,14 0,40+0,06

Плотва(п=14) 1,17+0,51 О,18±0,05 0,12+0,04 ОД 1+0,05

Хариус(п=15) 0,61+0,01 0,32+0,07 0,08+0.01 0,40+0,0«

Омуль(п=15) 0,58+0,07 0,37+0,07 0,07+0,01 0,42+0,05

Сиг(п=12) - 0,28±0,06 - 0,35+0,07

Ленок(п=15) - 0,24+0,05 0,05+0,01 0,34+0,04

Бычок подкаменка (п=21) 0,11+0,02 - 0,22+0,04

Бычок желтокрылка (п=21) - 0,12+0,03 - ОД 1+0,05

уровень развития системы оксигеназ со смешанной функцией конститутивным, используемым главным образом для метаболизма эндогенных субстратов с образованием стероидных гормонов и желчных кислот. Исследования деалкилазных активностей в течение длительного периода времени не выявляли достоверных отличий в их уровне в микросомах печени рыб, отловленных как в центральной части Байкала, так и вблизи от сброса сточных вод БЦБК. 3.2. Иммунохимический анализ индукции изоформ цитохрома Р-450 в печени пресноводных рыб - эффективная тест-система на воздействие ПАУи ПХБ. При исследовании микросом печени рыб после введения им ксенобиотиков - MX, AX (синтетической смеси ПХБ) или СВ (отечественного аналога АХ) происходила индукция изоформ цитохрома Р-450 и его монооксигеназных активностей, которая могла сохраняться в течение месяца (табл. 2). Соответствующие изменения были обнаружены в результате индукции цитохрома Р-450 теми же ксенобиотиками и методом ингибиторного анализа монооксигеназных активностей специфическими поликлональными эдггителами (ингибиторный анализ проводили с помощью антител к цитохромам CYTIA1 и CYT2B1 микросом печени крыс) (рис. 10).

Как видно из рисунка, антитела против цитохрома CYTIA1 эффективно ингибировали индуцированные активности в микросомах печени всех исследованных

рыб. Контрольные антитела (у-иммуноглобулин) и антитела к цитохрому CYT2B1 не оказывали достоверного влияния на монооксигеназные активности.

Индукция происходила и при затравке рыб сточными водами БЦБК, но достоверные отличия в изменениях монооксигеназных активностей наступали лишь через месяц инкубации рыб в очищенных сточных водах, разведенных до 20% от своего исходного состояния очистки.

Таблица 2. Содержание цитохрома Р-450 и моноооксигеназные активности в микросомной фракции печени рыб оз. Байкал в норме и после индукции ксенобиотиками.

Вид рыб Вариант Содержание цитохрома Р-450, нмом на 1мг белка: Активность: (аапирсн- 7-зтокаиу- 7-этоксире-гидроксмаш, маринЬети- зоруфинде-ота.ед.фл»- лазы, нмаль элшоы, оресценции 7-окапума- нмольрао-оксибензни- рина на 1мг руфина на ренана!мг белка е 1 мин / мг белка в белка * 1 мин 1 мин

Хариус (п=15) Контроль МХ АХ 0,32+0,07 0,67+0,09 0,34+0,0$ 0,03+0,003 0,26+0,05 0,001+0,0003 0,23+ОДЗ ОДО+0,05 1,54+0.02 0,61+0,01

Омуль (п=15) Контроль МХ АХ 0,37+0,07 0,77+0,11 0,30+0.05 0,04+0,00« 0^9+0,02 0,002+0,ооо: 0,20+0,04 0,004+о,ооо1 0,52+0,05 0,04+0,ооз

Ленок (п=15) Контроль МХ АХ 0,24+0,05 0,48+0,06 0,40+0,05 0,027+0,003 0,44+0,07 0,60+0,05 0,000 0,22+0,08 0,06±о,оз -

Бычок желто крыл-к (п=21) Контроль МХ АХ 0,12+0,03 0,29+0,05 0,008+0,003 0,17+0,003 0,000 0,11+0,009 0,08+0,005 -

Карп Контроль МХ АХ 0,21+0,03 0,41+0,02 ОД7+0.04 0,05+0,004 0,83+0,012 0,04+0,02 0,16+0,05 0,12+0,09 -

3.3, Изучение ферментных и неферментных систем ПОЛ в микросомах печени рыб о. Байкал. Роль фенолъных производных в регуляции процесса ПОЛ. При

изучении функционирования микросомной фракции печени рыб оз. Байкал нами была рассмотрена еще одна из сторон процесса генерации АФК - это их участие в инициировании ферментных и неферментных систем регуляции реакций ПОЛ.

Результаты исследований показали, что в присутствии ионов двухвалентного железа и НАДФН или НАДН в микросомных фракциях печени рыб накапливается МДА, а в отсутствие ионов железа либо восстановленных пиридиннуклеотидов МДА не накапливается.

Микросомы печени байкальских рыб, как мы обнаружили, обладают арил-гидроксилазной активностью, катализирующей образование фенольных производных из Г1АУ. Этим фенольным производным присущи антиоксидантные свойства. Вот почему добавление в среду инкубации БП - одного из основных представителей ПАУ - приводит к ингибированию НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах.

Образование фенольных антиокислительных производных в процессе реакций гидроксилирования может, по-видимому, ограничивать накопление продуктов ПОЛ, тем самым стабилизируя и поддерживая в активном состоянии прежде всего

изоформы цитохрома Р-450, ответственные за метаболизм ксенобиотиков продуцентов фенольных соединений.

I А " III Б I В II

Q '"Я" _I в m_:_1АШ_i i ч и - i . м г.га

12345 12 45 12 45 12 6 12 45

Рис 10. Ингибирование монооксигеназных активностей микросомной фракции печени хариуса (IX ленка (II) и бычка (Ш) поликлональными антителами к цитохрому CYT1A1 и цитохрому CYT2BI. Активности ЭКОД (А), ЭРОД (Б) и БП-гидроксилазы (В) в микросомах, выделенных из печени рыб, индуцированные MX (1,2,3) и АХ(4,5): 1,4 - без антител; 2,5 - после 5 мин инкубации с антителами к цитохрому CYTIAI (6,25мг на 1 мг белка); 3-е антителами к цитохрому CYT2B1 (6,25 мг на I мг белка); б - с у-иммуноглобулином (6,25 мг на I мг белка).

Мы исследовали также действие одно- и многоатомных фенолов -индивидуальных компонентов сточных вод БЦБК (пирогаллола, пирокатехина, гидрохинона, коричной и галловой кислот, резорцина и фенола) на эффективность реакций ПОЛ в микросомах печени рыб. Была выявлена пригодность использования этой модели, как тест-системы, которая характеризует как эффективность реакции монооксигеназной системы на загрязнители - индукторы цитохрома Р-450 или активаторы процесса ПОЛ, так и эффективность антиокислительных свойств загрязнителей или продуктов их метаболизма.

Определяли константы 50% ингибирования фенолами НАДФН-зависимого и аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомных фракциях печени омуля, хариуса, ельца,, плотвы, окуня. Во всех случаях константы лежали преимущественно в диапазоне 1 - 6 (*lg Сфгщлов)- На рис. 11 представлены эти константы для трех видов рыб и семи фенольных соединений. Очевидно, что фенолы яатяются высокоэффективными ингибиторами ПОЛ микросом печени рыб. Известно, что с ПОЛ, как нормопроцессом; связано обновление мембранных фосфолипидов при участии фосфолипаз типа А (Каган и др., 1978), имеющих адаптационное значение (Hasel, 1973; Хакачка и Семеро, 1977), а также синтез внутриклеточных гормонов (простагландинов, лейкотриенов) (Moneada and Vane, 1978; Carpenter, 1981). Можно полагать, что потенциально фенолы - токсиканты, оказывающие повреждающее действие, блокируют эти важнейшие для физиологии клетки, да и организма в целом, процессы.

Рис. 11. Эффективность ингибирования фенолами НАДФН - зависимого (А) и аскорбат-зависи-мого (Б) ПОЛ в микросомах печени ельца (I), плотвы (II), омуля (III): 1 - пирогаллол, 2- пирокатехин, 3 - гидрохинон, 4 - коричная кислота, 5 - галловая кислота, 6 - резорцин, 7 - фенол. Представлены величины логарифмов констант 30% -кого ингибирования.

Однако, концентрации фенол ьных производных в воде оз. Байкал и даже в очищенных сточных водах, значительно меньше величин, вытекающих из нашей оценки констант 50% ингибирования(10"9-10'" М против

10-1-10-6 М), поэтому вряд ли можно ожидать их токсического эффекта на метаболические структурно-функциональные системы байкальских рыб. Вместе с тем ПОЛ является универсальным триггерным механизмом, обеспечивающим разборку компонентов системы монооксигеназ печени. Ингибирующее действие фенолов на ПОЛ способствует снижению скорости распада цитохрома Р-450.

Стабилизирующее действие фенолов на цитохром Р-450 в случае возможного повышения их содержания в воде должно приводить к увеличению времени его полужизни. С другой стороны подавление распада цитохрома Р-450 в результате ингибирования фенолами ПОЛ должно поддерживать на более высоком уровне эффективность системы детоксикации, а, следовательно, и устойчивость гидробионтов к действию антропогенных загрязняющих веществ. 4. Исследование механизма действия продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2 на функциональную активность микросомной системы печени крыс и рыб. Система микросомного окисления требует для своего функционирования наличия фосфолипидов (Strobel et al, 1970; Дятловицкая и др., 1978, 1982, 1984; MUller-Enoch et al, 1984). Известно, что они играют важную роль в образовании активного комплекса НАДФН-цитохром Р-450-редуктаза - цитохром Р-450 (Strobel et al, 1970; Van der Hoeven and Coon, 1974). Одним из подходов для изучения роли липидов в этих процессах является использование фосфолипаз (Lang et al, 1975). С другой стороны, накопление продуктов гидролиза фосфолипидов - ЛФ и СЖК в мембранах клеток может приводить к структурным нарушениям, ингибированию ферментативных активностей, инактивации мембранных белков таких, как цитохрома Р-450.

Кроме того, наряду с гидролизом ацилов фосфолипидов биомембран (Sevantan Л. et al, 1988; McLean L.R. et al, 1993) важную роль в каскаде превращений арахидоновой кислоты в клетке (Nigam S. and Schewe Т., 2000) играют реакции с участием АФК.

И, наконец, при наличии в жирнокислотных остатках фосфолипидов гидроперекисных группировок, ускоряется процесс деацилирования и облегчается возможность репарации фосфолипидов с помощью ацилтрансфераз (Каган В.Е. и др., 1978). Этот механизм может быть существенным в процессе температурной акклиматизации рыб, когда увеличивается активность цикла деацилирования-реацилирования в мембранах микросом печени (Ncas and Hazel, 1984).

Таким образом фосфолипаза А2, являясь одним из важных мембранных модификаторов, может выступать и эффективным регулятором гидроксилирующей способности микросомных оксигеназ, как системы детоксикации ксенобиотиков. 4.1. Ипгибирование деалкилазной активности изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2. При изучении действия фосфолипазы Аг (ограниченный гидролиз) на ЭКОД в микросомах из печени интактных крыс нами было обнаружено эффективное ингибирование этой реакции, причем 50% ингибирование происходило при гидроксилировании 5% фосфолипидов и соответствовало накоплению 22,6+ 2,3 и 13,0+1,5 мкг ЛФ и СЖК на 1 мг белка за 5 мин. При добавлении у-миристоил- или у-пальмитоил лизолецитина (МЛЛ и ПЛЛ, соответственно) к суспензии микросом ЭКОД также ингибировалась, причем действие лизолецитина в пределах концентраций ЛФ, образующихся при гидролизе фосфолипидов фосфолипазой А2, оказывалось аналогичным действию самой фосфолипазы. Было показано, что ингибирующее действие МЛЛ или ПЛЛ ЛФ на О-деэтилирование 7-ЭК количественно было одинаковым и не зависело от состава освобождающихся при гидролизе фосфолипидов СЖК. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали преимущественно МЛЛ.

Чувствительность ЭКОД микросом из печени крыс исследовали после введения им ФБ (ФБ-микросомы) или MX (МХ-микросомы) к действию фосфолипазы Аг, МЛЛ и олеиновой кислоты. Глубина гидролиза фосфолипидов в ФБ-микросомах составляла 11,3%, а в МХ-микросомах - 25,0%, т.е. в 2,5 и 5 раз больше, чем в интактных микросомах. Однако, несмотря на различия в скорости гидролиза фосфолипидов, скорость реакции О-деэтилирования 7-ЭК в MX- и ФБ-микросомах снижалась одинаково. В МХ-микросомах образуется более устойчивая форма цитохрома Р-450, чем CYT2B1 в ФБ-микросомах по отношению к действию низких концентраций ЛФ на ЭКОД. При изучении концентрационной зависимости действия МЛЛ оказалось, что в интактных микросомах окисление 7-ЭК осуществляет изоформа CYT1A1. Полученные результаты могут иметь важное значение для изучения способов регуляции активности монооксигеназной системы как in vitro, так и in vivo. Регуляция гидролиза фосфолипидов в мембранах ЭР, по видимому, может воздействовать не только на активность монооксигеназной системы, т.е. на скорость генерации АФК и гидроксилирования конкретных эндогенных субстратов и ксенобиотиков, но может также играть важную роль в адаптации животных к температурным изменениям окружающей среды (см. ниже 4.3).

4.2.. Влияние лизофосфолипидов на -. монооксигеназные активности микросом печени крыс после индукции ксенобиотиками метилхолантренового типа. В ходе

выполнения работы исследована зависимость действия ЛФ на монооксигеназные реакции не только от способа индукции форм цитохрома Р-450, но и от их сродства к субстратам. На крыс воздействовали ксенобиотиками МХ-типа - MX, НФ и СВ, так как после их введения в ЭР печени наблюдается образование весьма сходных по электрофоретическим, хроматографическим и иммунохимическим параметрам форм цитохрома Р-450 (Цырлов и др., 1986). Среди них преимущественной формой является CYP1A1. Несмотря на это, кинетические параметры метаболизма одних и тех же субстратов отличались после введения этих однотипных индукторов в пересчете на содержание формы CYP1A1. Изучали действие ЛФ на скорости метаболизма субстратов БП, 7-ЭК и НА, учитывая, что вероятными причинами отличия могут быть как различные физико-химические состояния мембран

микросом, так и разные скорости генерации АФК в активном комплексе НАДФН-цитохром CYP1A1 редуктазы и их гидроксилирующая способность.

Действие МЛЛ на гидрофобные и вязкостные свойства микросомных мембран выявляли с помощью спинового зонда 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1 гсксил (рис 12). Параметр спектра ЭПР f = Н/Н + Р является приближенной мерой доли зонда, растворенного в мембране (Мак-Коннел,1979). Сооотношение амплитуд первых двух пиков А/А2 использовали как показатель микровязкости мембраны (Gennis, 1989). Обнаружили, что в отсутствии субстратов происходило снижение количества спинового зонда в практически всех видах мембран микросом, т.е. увеличение их гидрофильности. Микровязкость мембраны при этом практически не менялась или увеличивалась незначительно. В присутствии МЛЛ и 7-ЭК, как, впрочем, и других исследованных субстратов, уменьшение гидрофобности мембран в большинстве случаев сглаживалось, а микровязкость оставалась постоянной или незначительно увеличивалась. При взаимодействии субстратов с мембранами микросом в ряде случаев параметры f и Ai/Аг коррелировали между собой с достаточно высоким уровнем достоверности, что говорит о внедрении субстрата в мембрану с одновременным вытеснением молекул зонда из бислоя. Действие МЛЛ во всех типах микросомных мембран вызывало ингибирование гидроксилирования исследуемых субстратов. Но при этом было выявлено, например (рис. 13), что наибольшая устойчивость ЭКОД

Рис. 12. Спектры ЭПР нитроксильного радикала в мембранах микросом:

а - без воздействий; А, - амплитуда низкопольной компоненты; Аг-амплитуда центральной компоненты; б-в присутствии МЛЛ (40 мкг/мгбелка); в - изменения вкладов полярной (Р) и неполярной (Н) компонент спектров после действия МЛЛ.

наблюдалась в MX- микросомах при концентрациях МЛЛ от 2 до 20 мкг/мг белка. В то время, как вНФ- и СВ- микросомах эта реакция обладала большей чувствительностью при действии этих концентраций МЛЛ.

При более высоких концентрациях МЛЛ заметно ингибировал ЭКОД в интакт-ных микросомах и на 10 - 20% в других типах микросом. БП-гидроксилазная реакция показала высокую устойчивость во всех микросомных препаратах и во всем диапазоне концентраций лизолецитина (рис. 14).

При этом мы не наблюдали достоверно значимой коррелляции между параметрами гидрофильности и микровязкости, что, скорее всего, свидетельствует о меньшей зависимости реакции гироксилирования БП от влияния МЛЛ па свойства мембран по сравнению с реакциями деалкилирования 7-ЭК и НА. Самой чувствительной реакцией к действию МЛЛ оказалось деметилирование НА.

Хотя в ЭР печени всех животных после введения им MX, СВ или НФ происходит преимущественная индукция цитохрома CYPIA1, соотношение форм цитохрома Р-450 и фосфолипидов отличается.

f."»

•J

•х

л

V

'Лг^у-

Рис. 13. Концентрационная зависимость ингибирования ингибирования МЛЛ ЭКОД в интактных (1) микросо-Росомах печени крыс и после введения МХ (2), СВ (3) и НФ (4). Каждая точка на кривых является средней по результатам 5 — 20 экспериментов. На оси ординат за 100% принята скорость ЭКОД в отсутствие МЛЛ.

Рис. 14. Влияние МЛЛ на БП - гидроксилазную атив-ностъв интактных (I) микросомах и после введения крысам МХ (2), НФ (3) и СВ (4). Каждая точка на кривых является средней по результатам 4-12 экспериментов. На оси ординат за 100% приняты скорости ги-сти гидроксилирования БП в отсутствие МЛЛ.

Скорости монооксигеназных реакций зависят от этого фактора, а степень такой зависимости, вероятно, определяется как свойствами субстратов, так и специфическими особенностями ответственных за их метаболизм форм цитохрома Р-450. Модификация липидного микроокружения цитохрома ЛФ также может в разной степени оказывать влияние на скорости монооксигеназных реакций. Ввиду того, что характер модификации липидного бислоя существенно зависит и от концентрации ЛФ, то ингибирование реакций может либо определяться непосредственным их влиянием на цитохром, либо проявляться за счетах детергентных свойств ЛФ (^е^еп, 1979).

4.3. Сравнительное действие продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой Л; на деалкилазную активность изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени

крыс и карпа. Нами были проведены сравнительные эксперименты по действию фосфолипазы А2 на гидроксилазную активность микросом печени крыс и карпов. Известно, что продукты гидролиза фосфолипидов существенно влияют на биотрансформацию мутагенных и канцерогенных соединений (Абилев, 1986), а, в свою очередь, попадание в ткани рыб целого ряда ксенобиотиков приводит к активации эндогеных фосфолипаз, увеличению удельного содержания в тканях ЛФ (Сидоров, 1983). Кроме того фосфолипазы типа А в целом регулируют состав липидов в мембранах тканей рыб, приводя к изменению плавучести у рыб, что может быть весьма важным в условиях меняющегося экологического состояния водоема. Мы показали, что в микросомах из печени карпов под действием фосфолипазы Ал в расчете на 1 мг белка образуется в норме 84+3,5 мкг ЛФ за 5 мин, а после воздействия МХ - 107+0,6 мкг. За это же время в микросомах из печени крыс в норме накапливается 22,6+2,3 мкг ЛФ/мг белка, а в момент максимальной индукции МХ -105+0,5 мкг ЛФ/мг белка. При этом активность ЭКОД в расчете на 1 нмоль цитохрома Р-450 в микросомах печени карпа в норме и при индукции снижается на 45%, а в неиндуцированных микросомах из печени крыс - на ~50% и на ~70% - в индуцированных МХ.

По-видимому, различия в глубине гидролиза связаны не только с различием в фосфолипидном составе, но и с особенностями механизмов индукции монооксигеназ и сопряженного с ней синтеза de novo фосфолипидов в печени, а также в значительной разнице скорости обмена веществ у рыб и крыс. В работах (Neas and Hazel, 1984, 1985) было показано, что наличие в микросомной фракции печени радужной форели Salmo gairdneri разных форм фосфолипазы А2 связано с их ролью поддержания механизмов температурной адаптации этой рыбы. Фосфолипаза А2 печени форели, адаптированной к теплой воде (20°С), была более активна в гидролизе микросомных липидов, чем у рыб, акклиматизированных к воде при низкой температуре (5°С). Холодная вода всегда больше насыщена кислородом, чем теплая, и поэтому кислородзависимые процессы, протекающие в организме рыб, обитающих в более холодных водоемах (пример тому - оз. Байкал) могут активизироваться. Это касается прежде всего систем, ответственных за генерацию АФК, и связанных с нею реакции таких, как ПОЛ. В свою очередь такие процессы вызывают изменения в активности эндогенных фосфолипаз наряду с изменениями в составе фосфолипидов мембран в целом, что облегчает, в частности, происходит у рыб при температурной адаптацию рыб к изменению температуры водоемов.

Таким образом, роль фосфолипазы А2 оказывается важной как в регуляции ферментативной активности монооксигеназной системы печени, обусловленной генерацией АФК и гидроксилированием различных субстратов, так и в поддержании этих процессов при изменении такого важного фактора окружающей среды, как температура.

5. Модель изолированных гепатоцитов как биологическая тест-система для оценки устойчивости цитохрома Р-450. Одной из эффективных моделей для изучения роли АФК на клеточном уровне является первичная культура изолированных гепатоцитов. Модель гепатоцитов в некоторых случаях может быть предложена и как система-биосенсор, используемая для оценки чувствительности к повреждающим факторам. Важным местом в процедуре выделения гепатоцитов является сохранение их жизнеспособности, так как саму эту процедуру в некотором смысле уже можно считать повреждающим фактором. Нами было показано, что количество свежевыделенных гепатоцитов с нарушенной проницаемостью плазматической мембраны (% прокрашенных трипановым синим клеток) не коррелирует с начальным уровнем окисленности липидов, оцененным по содержанию МДА. Стимулом для повреждения гепатоцитов при их выделении могут быть различные причины. Они определяются индивидуальными особенностями животных и сезонными изменениями, условиями выделения гепатоцитов и совокупностью других моментов, которые бывает трудно оценить. Но с другой стороны модель гепатоцитов является более нативной, чем модель изолированной микросомной системы и в некоторых случаях лучше выявляет роль реакций АФК, например, при воздействии канцерогенных ксенобитиков, лекарственных средств, промышленных выбросов и т.д.

5.1. Механизмы деструкции цитохром Р-450-зависимой детоксицирующей системы в гепатоцитах. Мы оценивали условия спонтанного изменения устойчивости системы цитохрома Р-450 в процессе инкубации гепатоцитов, а также при активации ПОЛ в них. Кроме того исследовалась возможность предотвращения деструкции цитохрома Р-450, вызванной активацией кислорода и ПОЛ, используя ряд антиоксидантов. Было покзано, что в суспегаии гепатоцитов в процессе их

инкубации происходило спонтанное накопление МДА, которое способствовало деструкции цитохрома Р-450 с высокой степенью обратной корреляции (рис. 15, кривые 3,4).

Рис. 15. Динамика деградации цитохрома Р-450 (2,4) и изменение накопления МДА (1,3) в изолированных гепатоцитах крысы.

1,2- в присутствии ситсмы индукции ПОЛ Ре2*-АДФ (5*10 5 М) + НАДФН (10"* М); 3,4 - спонтанные деградация Р-450 и накопление МДА при инкубации гепатоцитов. Исходное содержание цитохрома Р-450 (МДА) принято за 100%.

В случае инкубации гепатоцитов в среде, содержащей систему инициирования РЮЛ(Ре2+-АДФ+НАДФН), такая корреляция сохраняется (рис. 15, кривые 1,2). Однако, в присутствии этой системы накопление МДА в первые 30 мин происходит приблизительно в 25 раз быстрее, чем в отсутствие инициатора ПОЛ.

Тот факт, что при индуцированном ПОЛ в суспензии гепатоцитов резко интенсифицируется накопление МДА, а деструкция цитохрома Р-450 не увеличивается столь значительно (всего в 2 раза), говорит в пользу триггерного механизма ПОЛ в разборке, цитохрома Р-450: не вся мощность процесса. ПОЛ используется в этом случае.

5.2. Антиоксиданты как стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах.

Дополнительные доказательства связи деструкции цитохрома Р-450 с активацией НАДФН-зависимого ПОЛ в гепатоцитах крыс были получены нами при исследовании действия ингибиторов ПОЛ на предотвращение этой декструкции. Мы использовали следующие ингибиторы ПОЛ: ОП-6, ионол, пирогаллол и БП, как потенциальный продуцент фенольных производных в процессе его гидроксилирования в ЭР гепатоцитов. Наиболее выраженное ингибирующее действие оказывал ионол; в меньшей, но заметной степени, пирогаллол; ОП-6 оказывал слабое воздействие. В диссертации обсуждаются причины различного действия фенольных антиоксидантов в силу их отличительных стереоэлектронных свойств. Уже рассматривалась выше возможность фенолов ингибировать ПАДФН-зависимое ПОЛ мембран микросом печени байкальских рыб. По-видимому, обе рассматриваемые модели - мембранная и клеточная - могут быть предложены не только для тестирования загрязнителей - индукторов монооксигеназной системы и активаторов ПОЛ, но и как тест-системы для проверки антиоксидантной способности ксенобиотиков фенольной природы у животных разной экологической принадлежности.

5.3.Продукты гидроксилирования бенз(а)пирена - стабилизаторы цитохрома Р-

450 в гепатоцитах. Как и в случае микросомной фракции печени рыб, при взаимодействии БП с гепатоцитами происходила защита цитохрома Р-450 от деградации в условиях активного гидроксилирования БП (рис. 16, кр. 1,2/0-30; 30-60 мин/). Причиной задержки деградации цитохрома Р-450 и уменьшения скорости накопления МДА через 30 минут гидроксилирования БП является образование его продуктов фенольной природы, являющихся антиоксидантами.

Было показано, что практически одинаковой способности фенола-антиоксиданата (пирогаллола) и субстрата оксигеназ БП ингибировать ПОЛ (50%

ингибирование накопления МДА) соответствует их одинаковая эффективность как стабилизаторов цитохрома Р-450.

Следовательно, защитный эффект бенз(а)пиреном цитохрома Р-450 определяется именно антиоксидантными свойствами фенольных продуктов его гидроксилирования.

Причем этот эффект не обусловлен конкуренцией за источники восстановительных эквивалентов в НАДФН-зависимой электрон-транспортной цепи. При инкубации гепатоцитов в отсутствие Fe2+—АДФ, но в присутствии НАДФН наблюдали незначительное накопление МДА в клетках (0,20+0,11 нмоль на 106 клеток) и, соответственно, стабилизацию цитохрома Р-450 (рис. 16, кр. .3,4/0-30 мин.). После добавления в суспензию гепатоцитов Fe2+—АДФ в последующие 30 минут не происходило ни накопления МДА, ни деструкции цитохрома Р-450 (кр. 3,4/30-60 мин). В суспензии гепатоцитов без БП и без Fe2+—АДФ, но с НАДФН накопление МДА в первые 30 минут было таким же, как в системе с добавленным БП, но в последующие 30 минут после добавления Fe2+—АДФ содержание МДА в этих условиях возросло в 1,5 раза.

Таким образом, эффективными протекторами цитохрома Р-450 в клетках печени от деструкции, вызываемой процессом ПОЛ, являются антиоксидапты фенольного типа, как экзогенные, так и продукты гидроксилирования, образующиеся в результате окислительного метаболизма гидрофобных субстратов. Причем, по-видимому, это явление универсально и присуще монооксигеназной системе печени представителей разных систематических групп животных.

6. Функциональный отклик нейтрофилов крови крыс на воздействие MX и СВ

in vivo. Монооксигеназная система детоксикации может быть тесно связана с другой системой защиты организма - иммуной (Ковалев и Полевая, 1985). Как известно, система монооксигеназ локализуется не только в гепатоцитах, но и в других клетках и тканях, в том числе иммунокомпетентных клетках (Головенко и др., 1984; Nisimoto et al, 1994). Обе системы принимают активное участие в защите организма от загрязнителей окружающей среды.

В основе первичных реакций клеточного иммунитета лежит активация окислительного взрыва в результате взаимодействия лейкоцитов крови и, прежде всего, нейтрофилов с чужеродным агентом или химическим соединением -активатором (Маянский А.Н. и Маянский Д.Н., 1989; Jones, 1993). OB обусловлен интенсификацией генерации АФК в оксидазных системах иммуиокомпетентных клеток крови. Известно, что нейтрофилы крови более активны, чем зрелые нейтрофилы костного мозга, а выход в кровяное русло способствует их

функциональному дозреванию. Повышенная люминесценция нейтрофилов крови сопровождает многие заболевания и, по-видимому, адекватно отражает степень функционального напряжения гомеостатических механизмов. Факторы, выводящие нейтрофилы на новый уровень активности, именуются кондиционирующими (Маянский, 1989). К таким опосредующим кондиционирование факторам, вероятно, можно относить и ксенобиотики.

Проблема взаимосвязи активности иммунокомпетентных клеток с индукцией монооксигеназной системы организмов ксенобиотиками интересна, как минимум, с двух сторон. Во-первых, если в фагосомных клетках присутствует цитохром Р-450 -зависимая монооксигеназная система, пусть достаточно специализированная (Bednar et al, 2000), она, по-видимому, может быть вовлечена в метаболизм ксенобиотиков, о чем говорит ряд работ (Plashne et al, 1974; Twerdok and Trush, 1988; Corbett et al, 1991).

Мы изучали, как меняется способность изолированной суспензии нейтрофилов крови крыс после воздействия на животных MX или СВ к активации ОВ. Через двое суток после введения крысам MX или СВ происходила эффективная индукция системы монооксигеназ печени. Параллельно регистрировали реакцию ОВ нейтрофилов. Обнаруживали повышенный уровень ОВ нейтрофилов, регистрируя хемилюминесцентный ответ суспензии этих клеток (рис. 17).

Рис. 17. Интенсивность ОВ нейтрофилов, полученных из крови крыс после воздействия МХ и СВ от-относител ьно интактных животных (контроль). 13 - контроль (интенсивность ОВ принята за 100%); воздействие МХ (2) и СВ (4).

if.O— 140- -12010080-Г.0- -4020-0 -

р*0.0003

f-0.04

1 2 п-15

J 4

л* 23

Отличие интенсивности ХЛ нейтрофилов после введения крысам MX и СВ может быть связано с различиями в свойствах этих индукторов моноокси-геназ. С другой стороны, популяция ней-трофилов гетерогенна и возможно воздействие ксенобиотиков на разные стадии дифференцировки этих клеток. Кондиционирование нейтрофилов также может происходить на различных стадиях их формирования. Во-первых, возможна прямая индукция ксенобиотиками монооксигеназной системы в костном мозге (Цырлова и др., 1986; Twerdok and Trush, 1988), за счет чего нейтрофилы, выходящие в кровяное русло, уже имеют повышенный уровень активности. Во-вторых, вероятен вклад в кондиционирование нейтрофилов их цитохром Р-450-зависимой системы, которая принимает участие в регуляции активности НАДФН-оксидазы, ответственной за генерацию АФК во время ОВ (Shak and Goldstein, 1984; Bednar et al, 2000 и др.). По-видимому, повышенная активация оксидазы в результате действия ксенобиотиков может быть связана с их способностью индуцировать избранные формы цитохрома Р-450 в нейтрофилах.

Нам впервые удалось зарегистрировать различную скорость О-деэтилирования 7-ЭК в суспензии нейтрофилов из крови крыс после воздействия MX и СВ. При этом активность ЭКОД в нейтрофилах крови интактных животных практически не наблюдалась (рис. 18). Для обнаружения ЭКОД в монооксигеназной системе нейтрофилов их суспензию мебрашютропного

агента аламетицина (0,03 мкг/мл) для облегчения доступа 7-этоксикумарина внутрь клеток.

5 1700 | 1690

2 1680

■з

§ 1670 з

¡}. 1660

| 1650 я

| 1640

I 1630 9

£ 1620 х -

S 1619

0 •'

1 1600

£ 120 ISO 180 210

° Время (сек) после добавления НАДФН, 0,1 мМ -

Рис.18. ЭКОД в суспензии нейтрофилов, выделенных из крови крыс после воздействия МХ (I) и СВ (2). Кинетика флюоресценции 7- оксикумарина (при = 460 нм), продукта О-деэтилирования 7 - ЭК.

Наряду с воздействием ксенобиотиков и их метаболитов на функциональный ответ нейтрофилов возможно и непосредственное их влияние на нейтрофилы in vivo, что может повлечь за собой, в частности, изменение физико-химических свойств плазматических мембран этих клеток. С помощью спинового зонда 5-доксилстсарата оценивали показатель изменения микровязкости мембран нейтрофилов по параметру 2АИ<)С{ спектра ЭПР зонда в мембране. Уменьшение микровязкости мембраны приводит к уменьшению параметра 2А,,,,,. На рис. 19 представлены средние величины значений грех серий экспериментов.

Рис. 19. Параметр 2\т спинового зонда 5-доксилстеарата в присутствии нейтрофилов крыс. 1 - интактные крысы; послс введения МХ (2) и СВ(3).

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что изменение параметра в присутствии различных нейтрофилов связано с нарушениями упорядоченности мембран этих клеток после введения крысам MX и СВ. Как видно из рис. 19, значение па-связывании 5-доксилстеарата с мембранами нейтрофилов из крови животных, подвергавшихся действию MX и СВ по сравнению с контрольными. Причем MX вызывал ббльшее повышение микровязкости мембран нейтрофилов, чем СВ.

Исходя из концепции иммунохимической функции гомсостаза (Ковалев и Полевая, 1985), можно полагать, что такие сильные ксенобиотики, как СВ и MX, приводят в процессе своего двухсуточного воздействия к заметным изменениям в гомеостазе организма крысы, которые, вероятно, приводят как к модификации пути формирования нейтрофилов, так и их морфофункциональных свойств.

раметра 2А„

повышалось при

Примечательно, что направленность изменений 2Атл1 аналогична таковой в активности ОВ нейтрофилов и деэтилазной активности их монооксигеназной системы.

Итак , возвращаясь к основной теме работы - к регуляторной роли АФК в биосистемах при воздействии факторов окружающей среды - , можно сказать, что использование системы изолированных нейтрофилов, как тест-системы для выявления воздействия чужеродных веществ in vivo, позволяет делать выводы не только о непосредственной модификации ксенобиотиками нейтрофилов, как клеточной системы, но и говорить об определенной направленности изменений иммунологического статуса этих клеток и, вероятно, организма в целом.

В последнее десятилетие все чаще применяют для диагностических целей не изолированные нейтрофилы, а разведенную от нескольких до десятков и сотен раз кровь (Allen, 1986; Kopprasch et al, 1996 и др.). При этом подходе влияние различных факторов среды на активацию АФК и развитие ОВ, характерное для изолированных нейтрофилов, в целом может сохраняться, однако активность нейтрофилов в составе цельной крови, пускай и в разведенной, проявляется иначе, чем в изолированной суспензии (Stevens et al, 1994). Это происходит прежде всего потому, что нейтрофилы вступают в многообразные взаимодействия с другими клеточными компонентами крови, прежде всего с эритроцитами, тромбоцитами и неклеточными компонентами плазмы. Такие факторы, конечно, должны выявлять новые грани реакции нейтрофилов на чужеродные воздействия, и именно нативная кровь может выступать здесь, как интегральная тест-система.

7. Роль АФК в функциональной активности цельной крови. У большинства видов позвоночных животных, а также у ряда видов беспозвоночных важнейшую роль в поглощении, переносе и передаче органам и тканям кислорода осуществляет кровь. В ней самой постоянно происходят многочисленные взаимодействия между клеточными и неклеточными компонентами. Особая роль в этих взаимодействиях принадлежит эритроцитам и лейкоцитам, между которыми постоянно осуществляется обмен кислородом, который активируется в лейкоцитах, как было нами показано непосредственно в цельной крови. Кровь - это жидкая ткань организма, представляющая собой сложную кооперативную систему и обладающая многими присущими только ей функциями, самой существенной из которых, пожалуй, является способность поддерживать гомеостаз организма.

Так как в живых системах постоянно протекают процессы, приводящие к непрерывному возникновению электронно-возбужденных частиц при протекании свободнбрадикальных окислительных реакций, то за счет их энергии в клетке могут осуществляться энергоемкие процессы. Непосредственным результатом релаксации ЭВС отдельных молекул биологических объектов является ССИ. Основной массив данных в области исследований ССИ биообъектов был накоплен при изучении ХЛ, сопровождающей генерацию АФК или ОВ в препаратах очищенных суспензий нейтрофилов и других лейкоцитов или на сильно разведенной крови.

Как показал наш опыт, несмотря на свою высокую оптическую плотность неразведенная кровь человека и животных может быть источником ихтучения, происходящего в результате вторичных процессов, обусловленных трансформацией энергии ЭВС в системе. Нам неоднократно удавалось регистрировать спонтанное излучение неразведенной крови, стимулированное или нестимулированнос активаторами ОВ, такими как зимозан, и даже без участия усилителей излучения -люминола (ЛМ) или люцигенина (ЛЦ), что отражено на рис 20.

Рис. 20. Люминесценция неразведенной крови (0,1 мл) человека в процессе развития индуцированного эимо-заном OB.

Нами впервые было показано, что люминесценция неразведенной крови здоровых доноров в присутствии ЛЦ (маркер образования О2*") всегда наблюдается без каких-либо дополнительных активаторов и может быть заметно более высокой, чем в присутствии ЛМ (маркер образования О2* Н2О2, ОН*, СЮ*) (Kalbhen, 1980; Allen R.C., 1986). Мы обнаружили, что на параметры ХЛ существенно влияют состояние здоровья доноров, объем образца, агрегатное состояние и время хранения крови до начала измерений и др. На наш взгляд, анализ ХЛ неразведенной крови позволяет судить не только о возникновении каких-либо патологий, но и о более тонких изменениях в гомеостазе, связанных, например, с влиянием на организм слабых воздействий, изменением потребления кислорода и его обмена и др.

Мы впервые обнаружили, что во время обострения ИБС у хронических больных выявляется выраженная интенсификация ХЛ неразведеиной крови в присутствии ЛМ без добавления к крови активаторов ОВ, которая, как правило, снижается в результате лечения. Подобная интенсификация ЛМ-ХЛ наблюдается также при разведении крови здоровых доноров физиологическим раствором, а интенсивность ЛЦ-ХЛ при этом резко падает (рис 21). В этом случае поведение разбавленной крови было похоже на поведение изолированных нейтрофилов в суспензии в присутствии ЛМ и ЛЦ. ЛЦ-ХЛ всегда слабее выражена у изолированных нейтрофилов в отличие от ЛМ-ХЛ при активации в этих клетках ОВ. Если в неразведенной крови создавать гипоксические условия, ЛМ-ХЛ сразу резко снижается, а ЛЦ- ХЛ остается на прежнем уровне или даже несколько возрастает, что еще раз подтверждает необходимость потребления нейтрофилами кислорода от эритроцитов для поддержания ими определенного уровня генерации О2*

Известно, что при развитии гипоксии в тканях, в том числе в тканях мозга и сердца, может активироваться образование АФК наряду с активацией гемоксигеназной системы. При конверсии билирубина из гема гемоглобина под действием гемоксигеназы всегда образуется в незначительных концентрациях монооксид углерода - СО, который может оказывать модулирующее действие на N0-cGMP сигнальную систему и таким образом способствовать усилению мозгового кровообращения при недостатке кислорода (Ingi et al, 1996), а также способствовать предотвращению повреждения миокарда при ишемии сердца (Maulik et al, 1996). По-видимому, одним из проявлений этого механизма является способность СО облегчать освобождение кислорода от эритроцитарного гемоглобина. В свою очередь, освобожденный кислород активнее потребляется лейкоцитами - продуцентами АФК в крови. Нам впервые удалось показать это экспериментально. Микроколичества СО, пропущенные через неразведенную кровь, вызывают быструю интенсификацию ЛЦ-ХЛ, которая резко снижается при разведении крови физраствором (рис. 22). Интенсификация ХЛ происходит и в процессе развития ОВ в крови в присутствии ЛМ.

1200 Z400 «400 4S00 «ООО 7200 »00 МОО «WO

Бремя, нимХО.1

Бремя, ими Вреия, мим

Рис. 21. ЛМ- и ЛЦ-зависимая люминесценция в цель- Рнс.22. Влияние монооксида углерода на ЛЦ-заной неразведенной крови человека и при ее разводе- висимую ХЛ неразведенной крови человека, нии разведении физраствором.

Таким образом наши исследования показали, что метод ХЛ неразведенной цельной является хорошим экспресс-тест-методом: для анализа можно использовать малое количество крови (50-200 мкл), что обеспечивает воспроизводимость результатов, получаемых на одном образце крови. Сам ХЛ анализ занимает несколько минут. Основываясь на этих результатах, мы использовали регистрацию ЛМ-ХЛ цельной крови для разработки метода слежения за ходом. низкоинтенсивной лазеротерапии хронических больных ИБС.

В ходе совместной работы с врачами госпиталя им. В.П.Мандрыка (д.м.н. Н.И.Сюч, к.м.н. В.И.Вакуев) оценивали интенсивность ЛМ-ХЛ у больных со стабильной стенокардией II и III степени в процессе внутривенной лазеротерапии. Кровь у больных отбирали сразу после поступления в клинику и через сутки после 3, 7(8) и 10 сеанса перед каждым последующим сеансом. В 16 случаях из 25 интенсивность ЛМ-ХЛ крови, взятой до начала лечения сразу возрастала до значений, превышающих фоновые в десятки и даже сотни раз. 5 случаев показали превышение фона в 20-30 раз, и только у 4 пациентов - не было превышения 5 фоновых значений. У больных с исходно высоким уровнем ЛМ-ХЛ после 3 сеанса лазеротерапии интенсивность ихчучения крови заметно снижалась, однако, у некоторых из них -возрастала после последующих сеансов. При исходно низкой интенсивности ХЛ крови у пациентов в ходе лазеротерапии наблюдали ее возрастание, без улучшения состояния больных.

Таким образом, измерение интенсивности ЛМ-ХЛ цельной крови позволяет оптимизировать применение лазеротерапии, а, вероятно, и других терапевтических процедур.

В "Заключении" диссертации обсуждаются полученные результаты в свете основных направлений собственных исследований и привлеченных нами литературных данных, посвященных универсальной роли АФК в функционировании биологических систем на разных уровнях их организации и экологической принадлежности. В работе проанализированы механизмы ответных реакций мембранных фракций фоторецепторной системы лягушки, рыбы минтая и быка, системы детоксикации микросом печени крыс и рыб, плаценты рожениц, клеточных систем гепатоцитов и нейтрофилов крови крыс, цельной крови животных и человека на воздействие факторов окружающей среды. Эти факторы с одной стороны являются облигатиыми для жизнедеятельности изучаемых нами объектов (прежде всего такие,

как кислород воздуха, отрицательные аэроионы - О2"(Н2О)т, свет, температура), а с другой стороны модифицируют (ПОЛ, фенольные соединения, лекарственные средства, активаторы ОВ), или даже повреждают биологические системы: например, ионизирующая радиация и химическое загрязнение (некоторые ксенобиотики, например, ПАУ и ПХБ, сточные воды).

Представленные в настоящей работе данные свидетельствуют, что генерация АФК в различных биологических системах играет основополагающую роль в осуществлении важных энергоемких реакций в организме, связанных с запасанием и реализацией энергии ЭВС. Эти реакции преимущественно развиваются по свободнорадикальному пути и обладают рядом особенностей. На наш взгляд, главными из них следует признать нелинейный, динамический, колебательный характер таких реакций, обеспечивающий большой диапазон регуляторных механизмов в процессе жизнедеятельности. Прежде всего - это формирование ответов на различные воздействующие на организм факторы окружающей среды по типу обратной связи, в результате чего формируются адаптационные механизмы и возможности к изменению светового, температурного и других климатических режимов.

В случае серьезных нарушений экологического равновесия необходимо разрабатывать соответствующие мероприятия, предотвращающие, например, загрязнение. окружающей среды. Важное место в подобного рода мероприятиях должны приобретать профилактические меры, ведение всестороннего мониторинга эколого-токсикологического состояния загрязняемых территорий, выработка эффективных методов биотестирования и биоиндикации. В нашей работе поставлены и частично решены и эти задачи.

В своих исследованиях мы старались придерживаться важного принципа, заключающегося в информационном единстве, биосферы, обеспечивающем целостность живых организмов. Это единство, на наш взгляд, во многом определяется наличием в атмосфере кислорода и его активных форм, наличием в организмах разнообразных систем, приводящих к генерации АФК и регулирующих реакции, которые они ведут и которые необходимы как для жизнедеятельности, так и для предотвращения возникновения патологических состояний при воздействии факторов окружающей среды. Полученные и обсужденные в работе конкретные экспериментальные и клинические материалы и результаты мы предлагаем к рассмотрению в качестве определенных моделей и методических подходов, позволяющих разрабатывать комплексные биологические тест-системы на основе реакций с участием АФК.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена активация кислорода и накопление в сетчатке и мембранах фоторецепторов продуктов свободнорадикального окисления липидов в относительно низких концентрациях при нормальных условиях евстовосприятия у животных разных видов. Выявлены механизмы регуляции этих процессов и температурной адаптации родопсина в сетчатке у пойкилотермных и гомойотермных животных. Показана высокая степень адаптации зрительной системы к регуляции баланса между необходимостью аэрируемости сетчатки и риском образования повышенных концентраций АФК. Основную роль в этом процессе играет витамин Е.

2. В системе детоксикации ксенобиотиков микросом печени крыс генерация (V" осуществляется главным образом на НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе. Восстановление Ог*" до перекиси водорода и далее до О^ является инициирующим звеном в реакциях ПОЛ. Процесс ПОЛ выступает в качестве фактора, способствующего протеолитической деградации цитохрома Р-450. Устойчивость конститутивного пула цитохрома Р-450 к таким воздействиям, как ПОЛ и протеолиз, заметно выше, чем его индуцированных форм после воздействия ксенобиотиков, загрязнителей окружающей среды.

3. Микросомная фракция печени крыс предложена, как мембранный биомаркер для оценки антиокислительной активности лекарственных веществ разнонаправленного действия, которая учитывает их возможную метаболическую трансформацию в организме.

4. Выявлено подавленное состояние ферментных систем детоксикации в микросомной фракции плацент рожениц среди населения районов Алтайского края, подвергавшихся действию ядерных испытаний и химическому загрязнению с развитием гемолитической желтухи новорожденных, связанное как с угнетением механизмов генерации АФК вследствие накопления токсичных соединений в тканях матерей и детей, так и с генетическими факторами.

5. На основе исследований детоксицирующей системы печени рыб оз. Байкал выявлены свойства ее ферментов, как весьма низкие по содержанию и активностям на конститутивном уровне. Полученные стабильные препараты микросом печени рыб предложены, как чувствительные биосенсоры к незначительным превышениям концентраций загрязнителей в байкальской воде. С другой стороны, обнаружено, что монооксигеназные системы всех исследованных видов байкальских рыб подвергаются как эффективной индукции ПАУ и ПХБ, так и влиянию промстоков БЦБК и их компонентов (фенольных соединений) на генерацию АФК, протыкание реакций ПОЛ и гидроксилирование ксенобиотиков. Предложена тест-система для биохимического мониторинга пресноводных экосистем.

6. Показано, что ограниченный гидролиз фосфолипидов фосфолипазой А2 в микросомах печени крыс и рыб приводит к частичной инактивации монооксигеназных активностей за счет преимущественного действия лизофосфолипидов. Эффективность воздействия лизофосфолипидов на монооксигеназные реакции зависит от их концетрации, типа индукции изоформ цитохрома Р-450 и сродства последних к субстратам. Установлены отличия в глубине гидролиза, определяющиеся фосфолипидным составом, особенностями механизмов индукции монооксигеназ и сопряженного с ней синтеза de novo фосфолипидов в печени рыб и крыс.

7. Предложена тест-система изолированных гепатоцитов для определения устойчивости цитохрома Р-450 к активации ПОЛ. Впервые на модели изолированных гепатоцитов крыс показано, что эффективными протекторами цитохрома Р-450 от деструкции, вызываемой процессом ПОЛ, могут быть фенол ьные продукты гидроксилирования, образующиеся в результате

окислительного метаболизма гидрофобных загрязнителей среды таких, как бенз(а)пирен.

8. Выявлен функциональный отклик нейтрофилов крови крыс при воздействии MX и СВ in vivo. После введения крысам этих ксенобиотиков происходит кондиционирование нейтрофилов крови, что выражается в повышении их реактивности (интенсификация генерации АФК - окислительного взрыва) и увеличении микровязкости плазматических мембран. Впервые обнаружено появление активности ЭКОД нейтрофилов, скорость которой зависит от природы действующего ксенобиотика. Система изолированных нейтрофилов предложена в качестве биомаркера для ряда загрязнителей окружающей среды.

9. В цельной неразведенной крови человека реакции с участием АФК протекают непрерывно и сопровождаются собственным ССИ в видимой области спектра при постоянном восстановлении аэробными лейкоцитами кислорода, поступающего от эритроцитов. Интенсивность излучения крови зависит от ее функционального состояния и от факторов окружающей среды, вызывающих инициирование нейтрофилов (развитие окислительного взрыва). Разработан способ контроля за состоянием больных ИБС в ходе лечения внутривенной иизкоинтенсивной лазерной терапией и защищен Патентом РФ (№ 2127881 от 20 марта 1999).

10. Функциональные ответы мембранных, клеточных и тканевых систем животных и человека, основанные на реакциях с участием АФК, при воздействии физических и химических факторов окружающей среды могут быть использованы как для обнаружения механизмов действия факторов на эти системы, как для выявления патологий внутренней среды организмов и их коррекции, так и для эколого-токсикологического анализа экосистем, выделения групп риска, а также прогноза развития (ликвидации) экологических нарушений на территориях, неблагополучных по состоянию окружающей среды.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каган В.Е., Шведова АЛ., Новиков KJL, Козлов Ю.П. Свободиорадикальнос окисление мембранных липидов фоторецепторов. // Доклады АН СССР, 1973, т. 210, № 5, стр. 1208-1210.

2. Kagan V.E., Schvedova A.A., Novikov K.N., Kozlov Yu.P. Licht-induced free radical oxidation of membrane lipids in photoreceptors of frog retina. // Biochim. biophys. acta, 1973, v. 330, № 1, p.76-79.

3. Новиков КЛ., Шведова A.A., Каган В.Е., koxiob Ю.П.,.Островский М.А. Изучение фотоиндуцированных изменений в фоторецепторной мембране и родопсине методом привитой сополимиризации. // Биофизика, 1974, т. 19, № 2, стр. 280-284.

4. Новиков KJL, Каган В.Е., Шведова АА., Козлов Ю.П. Белок-липидные взаимодействия при перекисном окислении липидов в фоторецепторной мембране. II Биофизика, 1975, т. 20, № 6, стр.1039-1042.

5. Каган В.Е., Шведова А.А., Новиков К.Н., Козлов Ю.П. Спонтанное и индуцированное автоокисление фосфолипидов при информационных перестройках мембран наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. // Биофизика, 1975, т. 20, № 6, стр. 1043-1048.

6. Сибельдина АА., Каган В.Е., Кобелев B.C., Шведова Аа., Новиков К.Н., Козлов Ю.П., Островский М.А., Каюшин Л.П. Изучение молекулярной организации фоторецепторной мембраны методом протонного магнитного резонанса. // Доклады АН СССР, 1975, т. 224, № I, стр. 228-231.

7. Kozlov Yu.P., Kagan V.E., Novikov K.N., Schvedova A.A., Kocherginskij N.M. Lipid-protein interactions and free radical oxidation of phospholipids in photoreceptor membrane. // In book: V

Intern. Biophys. Congress. Copenhagen, 1975, p-120.

8. Новиков KJL, Шведова А.А., Тюрин BA, Шуколюков СА., Каган В.Е. О роли липидного состава в кинетике свободнорадикального окисления липидов в мембранах фоторецептоов. // Биофизика, 1977, т. 22, № 5, стр. 942-944.

9. Каган В.Е., Барыбина Г.В., Новиков КЛ. Перекисное окисление липидов и дегенерация фоторецепторов в сетчатке крыс при Е-авитаминозе. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1977, т. 83, № 4, стр. 411-413.

10. Каган В.Е., Шуколюков СА., Тюрин ВА., Шведова А.А., Новиков KJL, Корчагин В.П. Влияние химической модификации липидов молекулярным кислородом на термоденатурацию родопсина в фоторецепторной мембране минтая. // Studia biophysica, Berlin, 1978, Band 72, № 1, ss. 51-58 (in Russian).

11. Kagan V.E., Novikov KJ4., Belousova L.V., Kozlov Yu.P. Damage to the visual cells under, lipid peroxidation of photoreceptor membranes. // XXIII Intern. Congr. Ophthaimol., Expcrta Medica, 1978, v. 444, p. 114.

12. Каган В.Е., Шведова АА., Новиков KJL Об участии фосфолиназ в "репарации" фоторецепторных мембран, подвергшихся перекисному окислению. // Биофизика, 1978, т. 23, № 2, стр. 279-283.

13. Клаан Н.К., Тюрин ВА., Каган В.Е., Шуколюков С.А., Новиков КЛ1,, Азизова ОА, Владимиров Ю.А., Козлов Ю.П. Исследование молекулярной организации липидов в мембранах фоторецепторов методом спинового зонда. // Биологические науки, 1978, № 11, стр. 39-44.

14. Каган В.Е., Ланкин В.З., Шведова АА., Новиков К.Н., Добрина С.К., Братковская Л.Б., Кулиев И.Я. Ферментные и неферментные системы защиты мембран фоторецепторов от активных форм кислорода и перекисей липидов. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1979, т. 88, № 8, стр. 164-166.

15. Schvedova A.A, Sidorov A.S., Novikov ICN., Galuschenko I.V., Kagan V.E. Lipid peroxidation and electric activity ofthe retina. // Vision Res., 1979, v.19, № 1, pp.49-55.

16. Tyurin VA., Kagan V.E., Shukolyukov SA, Klaan N.K., Novikov K.N., Azizova O.A. Thermal stability of rhodopsin and protein-lipid interactions in the photoreceptor membranes of homoiothermic and poikilothermic animals. // J. Therm. Biol., 1979, v. 4, pp. 203-208.

17. Tretjak A.G., Novikov KJ4., Limarenko I.M., Kagan V.E., Koz-Iov Yu.P. c-GMP-dependent synthesis of polyphosphoinosides in frog retina rod outer segments. // 3rd Intern.Colloqium on phys.chem.inf.transfcr in regulation of reproduction and ageing. Abstracts. Bulgaria, Varna, Sept. 2223,1980, p. 104.

18. Братковская Л.Б., Новиков K.IL, Шведова А.А., Полищук Р.Ф., Каган В.Е., Кохчов Ю.П. Пиридиннуклеотидзависимые системы индукции перекисного окисления липидов в фоторецепторах сетчатки. // Биологические науки, 1981, № 6, стр. 21 -26.

19. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Бейм A.M., Добрина С.К., Котелевцев СВ., Новиков К.Н., Савов В.М., Сербинова Е.А. Тест-системы для биомониторинга на основе мембранно-связанных ферментных комплексов. I. Иследование оксигеназ со смешанной функцией микросом печени эндемических видов рыб о.Байкал. // Биологические науки, 1983, № 1, стр. 20-24.

20. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Бейм A.M., Савов В.М., Новиков KJL, Минин А.А., Сербинова ЕА Тест-системы для биомониторинга на основе мембранно-связанных ферментных комплексов. II. Изучение ферментных и неферментных систем перекисного окисления липидов микросом печени эндемических видов рыб о.Байкал. // Биологические науки, 1983, № 5, стр. 18-23.

21. Новиков К.Н., Дудченко A.M., Уголев А.Т., Кузнецова З.И., Лукьянова Л.Д., Каган В.Е. Антиоксиданты как стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1983, т. 96, №11, стр. 50-52.

22. Каган В.Е., Савов В.М., Новиков K.HL, Сербинова ЕА., Кохпов Ю.П. Механизмы разборки системы оксигеназ со смешаноЙ функцией в ЭР печени. Роль перекисного окисления мембраиых фосфолипидов. // Биологические науки, 1984, № 3, стр. 21-32.

23. Новиков КЛМ Винер Р.И., Дудченко A.M., Уголев А.Т., Лукьянова Л.Д., Каган В.Е. Продукты гидроксилирования гидрофобных ксенобиотиков - стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1984, т. 98, № 9, стр. 294-296.

24. Козлов Ю.П., Каган В.Е., Будина Н.Б., Глазер В.М., Котелевцев СВ., Новиков К.Н., Ритов В.Б., Савов В.М., Степанова Л.И. Разработка основ эколого-токсикологической оценки промвыбросов предприятий целлюлозно-бумажной промышленности Восточно-Сибирского региона методами физико-химической биологии. // В кн.: Биологи МГУ - рыбному хозяйству. Под ред. Проф. СГ.Соина, М., МГУ, 1984, стр. 87-92.

25. Савов В.М., Осипов А.Н., Ожогина ОА, Новиков К.Н., Зубарев В.Е., Лзизова ОА., Каган В.Е. Механизмы индукции реакций перекисного окисления лигшдов в системе феназинметасульфат-Н АДН. // Биофизика, 1985, т. 30, № 4, стр. 598-601.

26. Каган В.Е., Сербинова ЕА., Минин А.А., Савов В.М., Новиков К.Н., Осипов А.И., Зубарев В.Е., Азизова О.А. Изучение механизма индукции ферментативного НАДФН-зависимого перекисного окисления липидов мембран эндоплазматического ретикулума. // Биохимия, 1985, т. 50, № 6, стр. 986-991.

27. Новиков К.Н. Перекисное окисление липидов в гепатоцитах. // В кн.: Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства. Москва, "Наука", 1985, гл. 6, стр. 146-169.

28. Novikov K.N., Kagan V.E. Stabilization of cytochrome P-450 in hepatocytes by free radical scavengers ofdifferent nature. // Acta physiol. et pharmacol., 1985, v. 11,№3, pp. 61-69.

29. Степанова Л.И., Котелевцев СВ., Комаров П.Г., Новиков К.Н., Глазер В.М., Бейм A.M., Козлов ЮЛ. Тест-системы для биомониторинга на основе мембранно-связанных ферментных комплексов. Y. Индукция монооксигеназ со смешанной функцией в микросомах печени байкальских рыб. // Биологические науки, 1985, № 9, стр. 27-32.

30. Kagan V.E., Novikov ICN., Bogdanova E., Prilipko L.L. The role of lipid peroxidation in cytochrome P-450 degradation in hepatocytes and lymphocytes and stabilizing effects of antioxidants. // In book: 2nd European Congr. on cell biology. Budapest, July 6-11,1986, p. 60.

31. Винер Р.И., Новиков К.Н., Архипенко Ю.В., Скрыпин В.И., Козлов Ю.П., Спиричев В.Б., Каган В.Е. Неантиоксидантный механзм стабилизации цитохрома Р-450 а-токоферолом: эффективность при авитаминозе Е. // Биохимия, 1986, т. 51, №9, стр. 1549-1554.

32. Винер Р.И., Новиков К.Н., Кохтов Ю.П., Каган В.Е. Ингибированис деалкилирующей активности изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени крысы продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой Aj. IIБиохимия, 1987, т. 52, № 3, стр. 459л68.

33. Винер Р.И., Пономарева Л.В., Лимаренко И.М., Новиков KJL, Котелевцев СВ. Сравнительное исследование действия фосфолилазы Аг на микросомы печени крыс и карпов в норме и при ицдукции монооксигеназ метилхолантреном. // В кн.: Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды. Всесоюзная конференция (27-31 июля 1987г.). Тезисы докладов, Новосибирск, 1987, стр. 89-90.

34. Котелевцев СВ., Степанова Л.И., Глазер В.М., Новиков К.Н., Пономарева Л.В., Бейм A.M., Козлов Ю.П. Метаболизм канцерогенных соединений в тканях пресноводных рыб. // В кн.: Применение научных разработок ученых-биологов в рыбном хозяйстве, М„ из-во МГУ, 1987, стр.121-130.

35. Бейм A.M., Новиков К.Н. Использование биомолекулярных тест-систем при эколого-токсикологическом мониторинге водоемов. // В кн.: Региональный мониторинг состояния оз. Байкал, Л., Тидрометеоиздати,1987, стр. 244-249.

36. Kagan V.E., Serbinova EA., Bakalova RA, Novikov ICN., Skrypin V.I., Evstigneeva R.P., Stoytchev Ts.S. Effects of a-tocopherol derivatives with different chain length on in vitro and in vivo lipid peroxidation in liver microsomes. // In book: Free radicals, oxidant stress and drug action. The Richelien Press, London, 1987, pp. 425-442.

37. Котелевцев СВ., Пономарева Л.В., Новиков К.Н., Винер Р.И., Козлов Ю.П., Хаценко О.Г., Митрофанов Д.В. Иммунохимический анализ индукции изоформ цитохрома Р-450 в печени пресноводных рыб 3-метилхолантреном, В-нафтофлавоном и арохлором 1254. // Биологические науки, 1990, № 5, стр. 23-29.

38. Новиков КМ., Эррера М, Паскуаль К., Гонзалес Р. Антиокислительная активность некоторых лекарств в микросомнойсистеме печени крыс.//Биологические науки, 1991,№ 12, стр. 19-27.

39. Новиков К.Н., Сумбалова Зч Тимофеев К.Н. Влияние лизолецитина на монооксигеназные активности микросом печени крыс после индукции ксенобиотиками метилхолантренного типа. // Биохимия, т.52, № 12, 1992, стр. 1815-1826.

40. Kotelevtsev S.V., Novikov ICN., Obraztsov V.V., Stepanova L.I., Ponomareva L.V. Monooxygenase and conjugating activities in placentae of mothers of new-born children suffering from hemolytic jaundices. // In book: 7th Intern. Bioindic. Symp. and Workshop Envir. Health. (Sept28-OctJ, 1992), Finland, Kuopio, 1992, L4.10, P37, p.46.

41. Орлов С.Н., Котелевцев СВ., Скрябин ГА, Новиков К.Н., Степанова Л.И., Образцов В.И., Брусованик В.И. Мембраны форменных элементов крови и ферменты дстоксикации ксенобиотиков. //Ядерные испытания, окружающая среда и здоровье населения Алтайского

края. Материалы научных исследований, Барнаул, т. 7., 1993, стр. 7-40.

42. Новиков K.IL, Асфарамов P.P., Тимофеев К.Н. Влияние индукции метилхолантреном и соволом на функциональную активность нейтрофилов крови крыс in vivo. // Бюлл. эксп. биол. мед., т. 120, № 11,1995, стр. 485-488.

43. Voeikov V.L., Novikov K-NA Popp F.-A. Interaction of two chemically uncoupled neutrophil suspensions in the process of respiratory burst In Biophotonics, eds. L.V.Beloussov & FAPopp. Moscow, Bioinform Service, 1995, pp. 457-469.

44. Kotelevtsev S.V., Stepanova L.I., Novikov C.N., Obraztsov V.V. Health environment of Altai territory and monooxygenase and conjugating activities in blood of newborn. // In book: "Molecular aspects of oxidative drug metabolizing enzymes: Their significance in environment toxilogy, chemical carcinogenesis and health." NATO ASI Series. Series H: Cell Biology, Vol. 90. E. Arinc et all ed. Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1995 pp. 533 - 549.

45. Viner R.I., Novikov K.N., Ritov V.B., Kagan V.E., Alterman M.A. Effect of different solubilizing agents on the aggregation state and catalytic activity of two purified rabbit cytochrome P-450 isozymes, CYPIA2(LM4) and CYP2B4(LM2). // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, v. 217, № 3, pp. 886891.

46. Kotelevtsev S.V., Obraztsov V.V., Novikov C.N., Stepanova L.I., Brusovanic V.I., Schoychet J.N., Hanninen O. Placental monooxygenase and conjugating activities of Altay newborns suffering from hemolyticjaundice. // In book: "Bioindicator ofEnvironmental Hcalth",eds. M.Munawar, O.Hanninen, S.Roy, N.Munawar, L.KarenIampi and D.Brown. Amsterdam: SPB Academic Publishing (The NetherIands).-III.-(Ecovision world monograph series), 1995, pp. 251-262.

47. Voeikov V.L., Novikov C.N. Chemiluminescent analysis of interactions of two optically coupled blood samples in the course of respiratory burst. In: ICCC-2. 2nd International Conference on Clinical Chemiluminescence. Kaiserin-Friedrich-Haus. Berlin. April 27-30. Abstracts book. 1996. P-31M.

48. Voeikov V.L., Novikov C.N. Evidence for Interaction of two optically coupled whole blood samples in the course of oxidative burst in one of them. // Progress in Biomedical Optics. EUROPTO Series. "Photon Propagation in Tissues II." Chs/Eds. DA Benaron, B.Chance, GJ.Miller, Austria, Vienna, 7-8 Sept. 1996. Proceedings ofSPIE-OSA Biomedical Optics, 1997, Vol. 2925, pp. 269-277.

49. Воейков ВЛ., Новиков К.Н., Сюч Н.И. Динамика изменений хемилюминесценции неразведенной крови в ходе лазеротерапии у больных ишемической болезнью сердца. // Междунар. конференция "Новые направления лазерной медицины", 25-27 ноября 1996г. Тезисы. Москва, 1996, стр. 287-288.

50. Фрунджан В.Г., Романова Н.А., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н., Новиков К.Н., Брусованик В.И., Кобялко В.О., Мешков НА Содержание АТФ в нейтрофилах и цельной крови у жителей районов Алтайского края, подвергшихся воздействию ядерных испытаний. // Радиобиология и радиоэкология, 1997, № 1, стр. 13-19.

51. Voeikov V. L., Novikov C N. Interaction of two optically coupled whole blood samples in the course of oxidative burst in one of them. // "Advances in Fluorescence Sensing Technology in Clinical Diagnostics HI." Chs/Eds. JALakowicz, and R.D.Thompson, San Jose, CA, SPIE Proc., 1997, Vol. 2980, pp. 470-478.

52. Voeikov V.L., Novikov CN. Relative independence of luminol - enhanced intensity of photon emission during-oxidative burst from non-diluted human blood on the volume and surface area of the sample. // "Optical Diagnostics of Biological Fluids and Advanced Techniques in Analytical Cytology". Chs/Eds. A.V. Priezzhev, T. Asakura, and R.C. Leit, San Jose, CA, SPIE Proc., 1997, Vol. 2982, pp. 65-75.

53. Voeikov V.L., Novicov C.N., Siuch N.I. Alterations in luminol-en-hanced chemiluminescense from nondiluted whole blood in the course of low-level laser therapy of angina pectoris patients. // "Ultrasensitive Biochemical Diagnostics II". Chs/Eds. G.E. Cohn and S.A. Soper, San Jose, CA, SPIE Proc., 1997, Vol. 2985, pp. 286-294.

54. Voeikov V.L., Novikov CN. Peculiarities of luminol- and lucigenin emission from nondiluted human blood. // "Photon Propagation in Tissues HI." Chs/Eds. D. A. Benaron, B. Chance, Italy, San Remo. SPIE Proc., 1997, Vol. 3194., pp.328-333.

55. Novikov C.N., Voeikov V.L. The peculiarities of luminol- and lucigenin-enchanced chemiluminescence of nondiluted human blood. // 3 rd International Symposium of Bulgarian Lipid League "Free Radicals in Biology and Medicine", Abstracts, Bulgaria, Sofia, 3-4 October, 1997,016, p. 62.

56. Voeikov V.L., Novikov CN. Dependence of chemiluminescence during the respiratory burst in nondiluted human blood on aerobic and hypoxic conditions. // 3rd International Symposium of Bulgarian Lipid League "Free Radicals in Biology and Medicine", Abstracts, Bulgaria, Sofia, 3-4 October, 1997,

Р83,р.91-92.

57. Воейков BJT., Новиков K.IL Окислительный взрыв в неразведенной крови: роль аэроионов. В сб.: Леонардо Да Винчи XX века. К 100-летию АЛ.Чижевского. Тезисы юбилейной сессии ГК РФ НТ, РАЕН, МГУ, 28 февраля 1997 г. М., 1997, стр. 49-50.

58. Воейков ВЛ., Новиков К.ПП Сюч Н.И. Изменение хемилюминесцснции неразведенной крови больных ишемической болезнью сердца в ходе лазеротерапии. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1998, т. 125, №6, стр. 680-683.

59. Novikov C.N., Vilenskaya N.D., Bulargina Y.S., Voeikov V.L. Chemiluminescence during respiratory burst in nondiluted human blood can be enhanced by back reflected photons.// Progress in Biomedical Optics. EUROPTO Series. "Effects of Low-Power Light on Biological Systems 1Y.", Chs/Eds. G.F.Bottiroli, T.I.Karu, R.Lubart, BOS Ed. A.Katzir, Sweden, Stockholm, 8-9 Sept. 1998. Proceedings of SPIE-OSA Biomedical Optics, 1998, Vol. 3569, pp.' 17-25.

60. Voeikov V.L., Novikov C.N., Vilenskaya N.D. Low-Level Chemiluminescent Analysis of Nondiluted Human Blood Reveals its Dynamic System Properties. // J. Biomedical Optics, 1999 Jan., v. 4, № 1, pp. 54-60.

61. Котелевцев СВ., Максимова Н.В., Новиков К.Н., Воейков BJL, Козлов Ю.П. Отклик мембранных систем форменных элементов крови рыб и рыбоядных птиц на воздействие антропогенных факторов окружающей среды. // II Съезд биофизиков России. 23-27 августа 1999г., Москва. Тезисы докладов, т. 2. Симпозиум YII: Биофизика мембран, YII.46cTp. 519-520.

62. Воейков ВЛ., Новиков К.Н. Низкоинтенсивная хемилюминесценция цельной крови человека отражает ее свойства как кооперативной биологической системы. // II Съезд биофизиков России. 23-27 августа 1999г., Москва. Тезисы докладов, т. 2. Симпозиум IX: Медицинская биофизика, IX.20, стр. 656-657.

63. Novikov C.N., Vilenskaya N.D., Asfaramov R. R.. O.A. Leontieva, - V.L. Voeikov. Low-level chemiluminescence reflects involvement of reactive oxygen species in the regulation of the blood cells interactions. Rivista di Biologia/Biological Forum. 2000, v. 93, № 1., pp. 152-154.

64. Stepanova L.I., Lindstrom-Seppa, HSnninen O.O.P., Koteievtsev S.V., Glaser V.M., Novikov C.N., Beim A.M. Lake Baikal: biomonitoring ofpulp and paper mill waste water. // Aquatic Ecosystem Health and Management, 2000, № 3, pp.259-269.

65. Novikov C.N., Asfaramov RR, Vilenskaya N.D., Bulargina Yu.S., Voeikov V.L. Enchancement of Chemiluminescence in Non-Diluted Human Blood with Back Reflected Photons or Carbon Monooxide Reveals Red and White Cells Interactions.//In: "Biophotonics and Coherent Systems", Proceedings of the 2nd Alexander Gurwitsch Conference and Additional Contributions, Moscow University Press. 2000, pp. 321-334.

66. Voeikov V.L., Asfaramov RR4 Bulargina Yu.S., Buravleva E.V., Kondakov S.E., Rosental V.M., Novikov ICN., Vilenskaya N.D. Life of Blood Outside an Organism: Fundamental Properties and Clinical Applications. In Proceedings of the 3rd International Multi-Conference. Information Society is'2000. New Science of Consiousness, I.Kononenko, cd., 17-19 October 2000, Ljubljana, Slovenija, pp. 21-24.

67. Voeikov V.L., Asfaramov R., Bulargina Yu.S.» Novikov GN., Vilenskaya N.D. Back reflected photons and Carbon Monoxide Enhance Chemiluminescence in non-diluted human blood: evidence in favour of red and white cells interactions. The Third Internet Photochemistry and Photobiology Conference Nov. 24 - Dec. 24,2000, http://www.photobiology.com/photobiologv2000/konstantin/index.htm

68. Novikov C.N., Voeikov V.L., Asfaramov RR, Vilenskaya N.D. Comparative Study of Peculiarities of Chemiluminescence in Nondiluted Human Blood and Isolated Neutrophils. In Book: Chemiluminescence at the Turn of the Millenium. An indispensible Tool in modern Chemistry, Biochemistry and Medicine, eds. S-Albrecht, Th.Zimmermann and H.Brandl. Schweba-Werbedruck GmbH, Druckerei & Verlag, Dresden 2001, pp. 130-135.

69. A.V. Priezzhev, G.P. Petrova, Yu. M. Petrusevich, A.M. Saletsky, A.Yu Tyurina, A.V. Boiko (Physics department), V.L. Voeikov, 1CN. Novikov, E.B. Buravliova (Biological department), V.B. Koshelev, O.E. Fadyukova (Department of fundamental medicine). Optics of blood and laser diagnostics of cardiological and oncology diseases. // Proceedings of International Quantum Electronics Conference, June 22-27,2002 (IQEC/LAT2002), Tuesday, June 25, JTUC2. p. 263.

70. Novikov K.N., Vilenskaya N.D., Bouravleva E.V., Fedorov M.V., Voeikov V.L. Analysis of Low-Level Photon Emission from Non-diluted Human Blood Points to the Regulatory Role of ROS in its Functional Activities. // In Proceedings of International Symposium "Reactive Oxygen and Nitrogen Species. Diagnostic, Preventive, and Therapeutic Values". St. Petersburg-Kizhi-St.Petersburg, Russia, July 8-12,

2002, pp. 105-106.

71. Voeikov V.L., Asfaramov R., Bouravleva E.V., Novikov C.N., Vilenskaya N.D. Biophoton research in blood reveals its holistic properties. // Indian J. of Experimental Biology, v. 41, May 2003, pp. 473-482.

72. Novikov С N.. Bouravleva E.V., Fadyukova O. E., Voeikov V. L., Koshelev V. B. Correlation between erythrocyte sedimentation rate (ESR) dynamics and blood luminescence studied using ofopto-electronic devices. // Progress in Biomedical Optics, Vol. 4, No. 27. "Photon Migration and Diffuse-Light Imaging.", Ch/Ed. D.A.Boas, Cermany, Munich, 22-23 June 2003. Proceedings of SPIE-OSA Biomedical Optics, 2003, Vol. 5138, Post. 47, pp. 331-341.

73. Новиков К.Н4 Бураалева Е.В., Воейков BJL, Кошелев В.Б., Фадюкова О.Е. Корреляция между динамикой скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и люминесценцией цельной крови. // Ш Съезд биофизиков России, Тезисы докладов, т. II, Симпозиум VI. Медицинская биофизика, VI.55,24-29 июня 2004 г., стр. 554-555.

74. Котелевцев СВ., Максимова Н.В., Новиков KJL, Полякова О.В., Твердислова ИЛ., Штсмберг О.Н. Тест-системы для анализа действия физико-химических факторов окружающей среды на живые объекты на основе биологических мембран. // Там же, Симпозиум VII. Действие физико-химических факторов на биологические системы. Экологическкая биофизика, VII.51, 24-29 июня 2004 г., стр. 669-670.

75. Воейков ВЛ., Вокуев И.А., Новиков KJL, Сюч Н.И. Способ контроля за состоянием больных ишемической болезнью сердцз в ходе лечения внутривенной низкоинтенсивной лазерной терапией.//Патент РФ на изобретение №2127881 от 20 марта 1999.

76. Баранчиков В.И., Воейков ВЛ., Волков А.В., Кийко Ю.И., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М. Способ диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам. Патент РФ на изобретение № 2152616 от 20 апреля 1999г.

77. Воейков ВЛ., Ватков А.В., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М. Средство для очистки воды от радикальных и ион-радикальных частиц. Патент на изобретение РФ № 2166991 от 20 мая 2001 г.

78. Воейков В Л., Ватков А.В., Кондаков С.Э., Калинин А.И., Новиков К.Н., Розекталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А. Способ очистки воды от радикальных и ион-радикальных частиц. Патент на изобретение РФ №2167101 от 20 мая 2001 г.

79. Воейков ВЛ., Волков А.В., Кондаков С.Э., Новиков KJL, Розенталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А. Устройство для очистки питьевой воды от радикальных и ион-радикальных частиц и ее кондиционирования. Патент на изобретение № 2179531 от 20 февраля 2002 г.

Выражаю искреннюю благодарность всем моим коллегам иученикам, работающим и работавшим в МГУи другихучебно-научныхучреждениях СССР, России и зарубежных стран, без постоянной помощи которых, плодотворного обсуждения с ними идей, планированияэкспериментов, полученныхрезультатов, сотрудничества вэкспедициях, их доброжелательной критики и товарищеского отношения комне, этамноголетняя работа не могла бы состояться: ~ ОЛЛзшовой, МЛЛльтерману, А.М.Еейму, Н.П.Белевичу, Л.В. Белоусовой, Л.В.Белоусову, Л.КБратковской, НД.Виленской, ВЛ.Воейкоеу, АВ.Волкову, ЮЛ.Владимирову, Я.Вычулковской, Ю.И.Гурфинкелю,Л.ФЛмитриеву,А.МДудченко, И.И.Иванову, В.Е.Кагану, Ю.П.Козлову, СЭ.Кондакову, АЛ.Конрадову, К.Г.Короткову, С.В.Котелевцеву, В.Б.Кошелеву, ВЗЛанкину, ЛЛЛукъяновой, СН.Орлову, А.Н.Осипову, МА.Островскому,Л.Г.Охнянскоп,ЛЛ.Пирузяну, К.Паскуалю, Н.ФМеревощикову, Ф. -А.Поппу, В.М.Розенталю, В.Б.Ритову, В.М. Савову, АЛ.Селищевой, ЕЛ.Сербиновой, Л.И.Степановой, Н.И.Сюч, К.Н.Тимофееву, АХ.Третьяку, ВЛЛюрину, АЛ.Уголеву, О.КФадюковой,М.КФедорову, О.Ханнинену, СФ. Чалкину, АЛ.Ш^ведовой, СЭ.Ш^нолю, СН.ШШуколюкову,

Р.РЛсфарамову, Ю. СБуларгиной, Е.В.Бураелееой, Р.И.Винер, З.Сумбаловой..

Благодарности:

Подписано в печать 31.08.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 3.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 125 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Новиков, Кирилл Николаевич

0 Список принятых сокращений.

РАЗДЕЛ I. ВВЕДЕНИЕ. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ПРОБЛЕМЫ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

РАЗДЕЛ II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА II.1. ДЕЙСТВИЕ СВЕТА И РЕАКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕТЧАТКЕ И МЕМБРАННЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ.

II.1.1. Условия, способствующие активации активных форм у, кислорода и свободнорадикальных реакций в структурах глаза.

П.1.2. Основные методы и материалы.

II. 1.2.1. Выделение и очистка фоторецепторных мембран. Условия освещения сетчаток, суспензии наружных сегментов палочек, экстрактов родопсина и условия его регенерациию.

II. 1.2.2. Условия анализа протекания реакций активных форм кислорода в сетчатке и фоторецепторных мембранах.

II. 1.3. Светозависимое свободнорадикальное окисление мембранных фосфолипидов фоторецепторов.

II.1.4. Возможные механизмы активации кислорода и ^ свободнорадикальных состояний в фоторецепторной системе.

II. 1.5. Ферментные и неферментные системы регуляции образования активных форм кислорода и перекисей липидов в мембранах фоторецепторов.

11.1.6. Влияние липидного состава на скорость свободнорадикальиого окисления липидов в мембранах фоторецепторов лягушки и минтая.

II. 1.6.1. О роли липидного состава в кинетике свободнорадикальиого окисления липидов в мембранах наружных сегментов палочек сетчатки лягушки и минтая.

II. 1.6.2. Влияние индукции перекисного окисления липидов мебран ^ фоторецепторов сетчатки минтая на термоденатурацию родопсина.

11.1.7. Термостабильность родопсина и белок-липидные взаимодействия в фоторецепторных мембранах гомойотермных и пойкилотермных животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды"

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ. Подавляющее большинство всех живых организмов, составляющих сложные экологические системы, в своей жизнедеятельности не могут обходиться без потребления кислорода, за счет которого они способны выполнять разнообразные энергоемкие метаболические функции, а также производить субстраты, богатые энергией, другими словами говоря, осуществлять реакции ассимиляции и диссимиляции, поддерживая устойчивонеравновесное состояние гомеостаза (Бауэр Э., 1930, 1935; Воейков В.Д., 2002, 2003).В отличие от практически всех известных молекул, как присутствующих в окружающей среде, так и входяыщх в состав живых организмов, обитающих в этой среде, молекула кислорода в основном электронном состоянии является триплетной, т.к. имеет на валентных орбиталях два электрона с параллельными спинами (Mattheus P.C.S., 1986). Молекулы в триплетном состоянии обладают избыточной энергией по сравнению с их синглетными формами в основном (невозбужденном) состоянии, когда все их электроны спарены. У молекулы кислорода в этом смысле есть уникальная особенность: она не имеет основного синглетного состояния, а может пребывать только в возбужденном синглетном состоянии.Как известно, гл^ным путем энергетического метаболизма считается окислительное фосфорилирование, которое происходит в митохондриях, когда в результате сложных ферментативных актов превращений моле1оглы глюкозы и трикарбоновых кислот в цикле Кребса окисляются до СО2 в цепи переноса электронов с высвобождением 32 моле10^л АТФ и 4 молекул ГТФ и образованием молекул воды (Chance В. and Williams G.R. 1956; Emster L.and Lindberg C , 1958; Green D.E., 1959; Green D.E. and Hatefi Y., 1961; Racket E., 1965; Ленинджер A.,1966; Рэкер Э., 1967; Boyer P.D., 1967; Кондрашова M.H., 1989; Скулачев В.П., 1962, 1971, 1989, 2000 и др.). Об участии кислорода в процессах окислительного фосфорилирования в данной работе речь идги не будет. Отметим лишь, что в митохондриях на определенном этапе этого сложного процесса образуется супероксиданион радикал (Oi*") [значок "*" обозначает неспаренный электрон] продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, а затем и перекись водорода (Boveris А. and Chance В., 1973; Boveris А. et al, 1976; Chance В. et al, 1979; Ksenzenko M. et al, 1983; Imlay J. A. and Fridovich I., 1991; Skulachev V.P., 2002). Их образование в митохондриях осуществляется в условиях высокой степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи, и ответственными за этот процесс считаются НАДН-дегидрогеназа и убихинон. Максимальная его активация происходит в присутствии сукцината.Реакции одноэлектронного восстановления кислорода относятся к типу окислительно-восстановительных реакций, в результате которых происходит последовательное восстановление молекулярного кислорода до его активных форм (АФК). Способов активации кислорода немного. Практически все доступные ему доноры электронов - синглетные молекулы, а прямая реакция триплетной молекулы с синглетной с образованием продукгов в синглетном состоянии невозможна (Eyring Н., 1935). Именно поэтому молекулы, которые могут отдавать кислороду электроны, не сгорают немедленно в его присугствии.Активации кислорода, например, способствует поглощенный соответствующий квант энергии, переводящий моле10'лу кислорода в возбужденное синглетное состояние. В этом состоянии ему уже легко взаимодействовать с синглетными моле10^ лами. Кислород также могут активировать металлы с переменной валентностью (наиболее изучаемыми в этом смысле являются ионы железа), в поле действия которых меняется спиновое состояние О2. Наконец, кислород легко взаимодействует со свободными радикалами - частицами атомной или молекулярной природы, имеющими нечетное число электронов. Свободные радикалы реагируют как с синглетными, так и с триплетными молекулами, а также с другими свободными радикалами. Эти реакции, как правило, сопровождаются освобождением больщих квантов энергии. Так как кислород, превращаясь в свободный радикал Ог*' или надперекисный радикал НОг*, приобретает дополнительный электрон, он намного легче может захватывать последующие электроны с освобождением на каждом этапе значительных порций энергии (Метелица Д.И., 1982). Из Ог*' (НОг*) может образовываться перекись водорода Н2О2, как продукт реакции дисмутации супероксида: 202*" + 2Н* = Н2О2 + ^ 0*2.Вторым продуктом этой реакции является как раз возбужденная молекула синглетного кислорода - *0*2 [значок "*" обозначает элекгронно-возбужденное состояние - ЭВС]). Константа скорости этой реакции - 5» 10^ NT^ c"' при рН 7,0.Следовательно, время жизни О2'" в водной среде, особенно в слабокислых условиях очень мало.К АФК также относятся гидроксил-радикал ОН*, нитроксильный радикал NO*, радикалы органических перекисей ROO* [R обозначает остаток органической молекулы], в специфических случаях гипохлорит ОСГ".К АФК можно отнести и другие соединения, легко продуцирующие свободные радикалы (озон - Оз, пероксинитрит - ONOOH, хлорноватистая кислота -HCIO, гидроперекись - ROOH, органическая перекись ROOR), а также монооксид углерода - СО. N0* и СО в настоящее время посвящено достаточно много работ, в которых им отводится роль сигнальных молекул в регуляции жизненно важных функций, связанных, в частности, с работой гемсодержащих белков таких, как гуанилатциклаза, цитохром Р-450, гемоглобин (Ingi Т. et ai 1996; Maulik N. et al, 1996a,b; Otterbein L.E., 2002; Vural C. and Girngor A., 2003). О некоторых аспектах этой проблемы будет сказано при изложении и обсуждении основного экспериментального материала рассматриваемой работы.По мнению ряда авторитетных ученых Ог'" представляет собой побочный, нежелательный продукг как цикла Кребса, так и других биохимических процессов (Нагтап D., 1956; Chance В. et al, 1979; Fridovich I., 1974; Голубев, 1996). От супероксиданион радикала и образующихся далее других АФК, как считают, клетке необходимо избавляться, чтобы не получить пагубных последствий. Такая досужая точка зрения сложилась на основе огромного фактического материала, указывающего на то, что АФК, генерация которых неизбежна в клетках и тканях организма, запускают цепные свободнорадикальные реакции, приводящие к химической модификации важных биологических структур - щ^клеиновых кислот, белков, липидов (Richter С, 1987; Pattison D.I. et al, 2002). Основным таким процессом считается перекисное окисление липидов (ПОЛ), радикальные и моле1оглярные продукты которого обладают выраженным повреждающим действием, нарушающим нормальный метаболизм и приводящим к развитию патологических состояний (Harman D., 1956; Beckman К.В., Ames B.N. et al, 1993; Liochev S.I. and Fridovich L, 1999; Fridovich I., 1999).Список работ, охватывающих проблему пероксидации липидных компонентов клеточных мембран, очень большой, трудно даже установить приоритет какой-либо из них в изучении основополагающих закономерностей протекания процесса ПОЛ в живой клетке.Однако, безусловно, вряд ли кто-нибудь из исследователей не отдаст предпочтение крупному русскому биохими!^ Алексею Николаевичу Баху, который более 100 лет назад (Bach А., 1897) впервые указал на важную роль образования перекисных соединений в процессах медленного окисления различных соединений неорганического и органического происхождения, в том числе и в живых системах. Одновременно, но независимо от него, перекисную теорию окисления предложил немецкий химик К.О. Энглер (Engler mid Wild.Е., 1897). С тех пор эта теория носит имя Баха-Энглера. В последующих своих работах А.Н. Бах продолжал развивать эту теорию (Chodat R. und Bach А., 1902; Бах А.Н., 1912; 1937; 1950). Одна из его главных заслуг, на наш взгляд, в том, что он уже в своих первых работах на тему химизма дыхательных процессов придавал основополагающее значение активированному кислороду в нормальном метаболизме пищевых веществ. А.Н. Бах писал: "Объяснить быстрое разрушение пищевых веществ в организме окислением можно ... только двояким предположением: или эти вещества расщепляются в организме на части, способные окисляться за счет недеятельного, молекулярного кислорода; или же организм обладает средством переводить свободный кислород из недеятельного состояния в деятельное. Так как известные нам продукты распада пищевых веществ в общем не легче окисляются свободным кислородом, чем сами эти вещества, то первое предположение приходится отвергнуть. Остается последнее, т.е. перевод кислорода из недеятельного состояния в деятельное или так называемое а к т и в и р о в а н и е кислорода." (Бах А.Н., 1912: стр. 1). И далее в этой же работе он пишет: "Переход кислорода из недеятельного состояния в деятельное мыслим лишь, как разрыв или ослабление связей, которыми удерживаются атомы в моле10^ле... при медленном сгорании первоначальная энергия, необходимая для выведения кислорода из его недеятельного состояния, может быть доставлена лишь самими окисляющимися телами.Субстратом ПОЛ в живой клетке прежде всего являются ненасыщенные жирные кислоты, как основные компоненты фосфолипидов, осуществляющих структурно-функциональную организацию биологических мембран (Козлов Ю.П., 1977; Кребс Е.М., 1981; Бергельсон Л.Д., 1982; Болдырев А.А., 1985; Кагава Я., 1985). Не представляется возможным обсудить здесь все многочисленные результаты исследований в этой области, но следует сказать о пионерских работах школы профессора Б.Н.Тарусова (Тарусов Б.Н., 1954, 1967, 1972; Тарусов Б.Н. и др., 1961, 1965, 1967; Журавлев А.И., 1965, 1972; Перелыгин В.В. и Тарусов Б.Н., 1966 и др.), последователи которой много сделали для понимании механизмов свободно - радикальных реакций в живых организмах, как в условиях нормальной жизнедеятельности, так и при развитии различных патологических состояний. Мы останавливаемся на этих работах в первую очередь потому, что на первой в мире кафедре биофизики Московского университета, основанной Б.Н.Тарусовым, с середины 50-х годов XX столетия начало развиваться направление исследований сверхслабых излучений (ССИ) биологических объектов. Именно здесь впервые удалось зарегистрировать эти излучения в видимом диапазоне электромагнитного спектра с помощью особо чувствительной аппаратуры, основанной на регистрации одиночных фотонов фотоэлектронными умножителями (ФЭУ). Эти ССИ являются результатом свободнорадикальных процессов в клетках и тканях живых организмов и, как было показано в исследованиях школы Б.Н.Тарусова, под воздействием ионизирующей радиации, опухолевого роста и некоторых других патологических процессов повышается интенсивность излучения, и основным субстратом, ответственным за него, являются липиды клеточных мембран.Именно в этих компонентах клетки и протекают процессы ПОЛ. Изучение реакций ПОЛ с использованием различных методов и в разнообразных объектах получило развитие на кафедре биофизики в созданной профессором Ю.П.Козловым лаборатории физико-химии биомембран, в которой и были получены все основные результаты настоящей работы. Ю.П.Козлову принадлежит заслуга в развитии метода привитой сополимеризации (Багдарасьян Х.С., 1966), который оказался очень чувствительным и позволял обнаруживать свободнорадикальные продукты в клетках и тканях в еще незначительных концентрациях, например, на начальных стадиях развития лучевого поражения, канцерогенеза (Козлов Ю.П., 1970), что было недоступно другим методам. В нашей лаборатории изучали различные механизмы протекания ПОЛ в мембранных образованиях зрительной, нервной, мышечной системах (Kagan V.E. et al, 1973; Каган В.Е. и др., 1977; Елуашвили И.А. и др., 1978; Shvedova А.А., 1979; Каган В.Е. и др., 1983), свободнорадикальные реакции в тканях при радиационном поражении организма животных, канцерогенезе, злокачественном росте и других патологических процессах при одновременном сочетании разных методов in vivo и in vitro (Данилов B.C. и др..1972; Козлов Ю.П. и др., 1972; Каган В.Е. и др., 1973), а также под влиянием повреждающих и загрязняющих факторов 01фужающей среды, приводящих к интенсификации ПОЛ (Козлов Ю.П. и др., 1984; Бейм А.М. и Новиков К.Н., 1987) и т.д. При этом, наряду с упомянугыми методами регистрации сверхслабой люминесценции и привитой сополимеризации, в лаборатории применяли другие адекватные методы обнаружения свободных радикалов и продуктов ПОЛ в тканях, клетках и мембранных образованиях. Основными из них были радиоспектроскопия, спекгрофото- и флюориметрия (регистрация диеновых и триеновых конъюгатов в липидных фракциях биомембран (Bolland J.L. and Koch Н.Р., 1945), шиффовых оснований (Bidlack W.R. and Tappel A.L., 1973)), определение концентрации гидроперекисей (ГП) с помощью полярографии с ртутно-капельным электродом (Данилов B.C. и др., 1972), определение содержания моле10^ лярного продукга ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) (Kohn H.Y., Liversedge М., 1944) и др.Специально следует остановиться на исследованиях в области свободнорадикальных процессов школы академиков Н.Н.Семенова и Н.М.Эмануэля в стенах института Химической физики АН СССР (ныне Институты Химической и Биохимической физики РАН). Особенно примечательны работы под руководством профессора Е.Б.Бурлаковой, посвященные раскрытию механизмов, ответственных за образование и трансформацию АФК, продуктов ПОЛ, за регуляцию свободнорадикальных процессов на разных уровнях организации живого (Бурлакова Е.Б. и др., 1965; Burlakova Е.В. et al, 1980; Burlakova E.B. et al, 1998 и др.). Наибольший интерес на наш взгляд представляют работы, выполняющиеся под руководством Е.Б.Бурлаковой в течение последних нескольких лет и связанных с влиянием малых и сверхмалых доз веществ антиоксидантной природы на протекание свободнорадикальных реакций и ряда других реакций, в частности, определяющих пути генерации и трансформации АФК и продуктов ПОЛ в организме (PalminaN.P. et al, 1997; Maltseva E.L. et al, 1998 и др.).Природа предусмотрела такие ферментные и неферментные защитные механизмы, которые осуществляют в клетках, тканях и организме в целом антиоксидантные функции (Ланкин В.З., 1985).В конце 1960-х годов было открыто семейство ферментов супероксиддисмутаз (СОД), которые ускоряют реакцию дисмутации Ог*' в тысячи раз (McCord, Fridovich, 1969). Весьма широкая распространенность СОД, многообразие ее форм, отличающихся и по структуре апофермента и по иону металла в активном центре (Мп, Zn или Fe) (Fridovich I., 1974) послужили веским доказательством того, что АФК образуются в живых системах регулярно.Именно с оттфытия СОД началась систематическая работа по изучению роли АФК в процессах жизнедеятельности. Поэтому СОД с самого начала стали рассматривать, как возникший в ходе эволюции главный инструмент защиты организма от "окислительного стресса", определяемого как совок>'пностъ разрушительных явлений, сопугствующих кислородному дыханию за счет неизбежного побочного образования АФК, как представлялось и представляется по сей день многим исследователям (Fridovich I., 1999). В катализируемой СОД реакции дисмутации продуктом является триплетный кислород, а не возбужденный синглетный, как при спонтанной дисмутации Ог*'. СОД чрезвычайно активный фермент: число ее оборотов (ксаО - одно из самых высоких для ферментов - порядка 10* с'^ а константа скорости (k^ at /Кщ) >10* М" 'с'' (Walsh С, 1979), следовательно, она должна практически немедленно устранять образующийся О2*' до ничтожно низкого стационарного уровня. По ряду имеющихся оценок, стационарный уровень Ог*' в клетках и тканях, несмотря на наличие многих и достаточно интенсивных источников его генерации, чрезвычайно низок,- порядка 10'*** -10'" М (Niviere V. and Fontecave М., 1995; Imlay J. A. and Fridovich I., 1991). Это как раз и способствует тому, чтобы в клетках и тканях не развивались повреждающие их структуры окислительные процессы, но в то же время, чтобы был некий достаточный "запас" этой АФК, необходимый для генерации ЭВС. Следующим ферментом, стоящим на пути превращений АФК, является каталаза. Она предотвращает неконтролируемое гемолитическое расщепление перекиси водорода и с громадной скоростью - число оборотов более 10^ с'', константа скорости 4х10' М"'с"' (Walsh С, 1979) превращает Н2О2 в кислород и воду. Поэтому даже в пероксисомах, где перекись водорода непрерывно продущ1руется в ходе ферментативных реающй, стационарный уровень Н2О2 не превышает 100 нМ, а в цитоплазме он оценивается в диапазоне 10'^ - 10•^ М (Oshino N. et al., 1973; Tyler D.D., 1975).Еще один широко распространенный фермент, который устраняет Н2О2 глютатионпероксидаза (ГПР) (Панкин В.З., 1985; Liu et al., 1993), катализирующая реакцию окисления восстановленного глютатиона пероксидами, превращая последние в спирты (или воду в случае Н2О2).Помимо ферментных защитных систем существуют неферментативные способы предотвращения чрезмерного развития свободнорадикальных процессов в живых организмах. Прежде всего к таким антиоксидантным системам следует отнести систему витамина Е, аскорбиновую кислоту, каратиноиды и др.В дальнейшем мы неодно1фатно будем возвращаться к вопросу о роли антиоксидантных систем в жизнедеятельности организмов, в частности, как различных биологических тест-систем, особенно на клеточном и мембранном уровнях, поэтому во введении мы останавливались только на общих современных представлениях об их структуре и механизмах действия. К сожалению, не все исследователи уделяли должное внимание именно регулирующей роли антиоксидантных систем в свободнорадикальных окислительных процессах. Действительно, ведь не только для полной элиминации "вредных" продуктов реакций свободнорадикального окисления они, вероятно, существуют, но и для поддержания динамического баланса, необходимого концентрационного уровня и скорости генерации тех же АФК. Мы остановились только на наиболее значимых направлениях исследований в области свободнорадикальных процессов в живых организмах, развивавшихся и развивающихся в нашей стране. Безусловно работами других отечественных ученых и зарубежных исследователей также внесен значительный вклад в выяснение механизмов протекания и проявления реакций с участием АФК в жизнедеятельности организмов. Среди них все больше и больше появляется работ, указывающих на двойственную роль АФК, продуктов их взаимодействия с биосубстратами, свободных радикалов другой природы в функщюнировании живого - с одной стороны, как факторов повреждающих, но и с другой стороны, как необходимых регуляторов многих процессов в организме (McCord, 1995; Гамалея И.А., Клыбин И.В. 1996; Воейков В.Л., 1998; Dalton Т.Р et al, 1999; Воейков В.Л., 2000, 2001; Allen R.G. and Tresini M., 2000; Meier В., 2001; Sauer H. et al, 2001; Voeikov V.L., 2001; Ermak G. and Davies K.J., 2002; Турпаев K.T., 2002). Интересно, что задолго до этих работ, еще в 1902 г. опять же А.Н.Бах в сотрудничестве с Р.Шода, экспериментально показал, что "...некоторые организмы (культуры низших грибов Penicillium glaucum, Rhizopus nigricans и Sterigmatocystis nigra - КНН) могут существовать в питательных средах, содержащих до 1% перекиси водорода. Присутствие перекиси таким образом не является несовместимым с жизнью протоплазмы" и далее: "Перекиси, образующиеся первично в клетке, используются двумя путями: как окислители в собственном смысле этого слова, для трудно окисляемых составных частей клетки и как переносчики химической энергии..." (Bach А., 1902; Бах А.Н., 1937).В связи с выше сказанным обратимся снова к работам школы профессора Б.Н.Тарусова и подчеркнем, что в 1950х - 1960х годах на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ активно велись исследования, посвященные роли свободнорадикальных состояний, в том числе и АФК, в процессах нормальной жизнедеятельности различных организмов (Журавлев А.И., 1982).Убедительные доказательства положительного влияния АФК на функционирование митохондрий были получены под руководством проф.М.Н.Кондрашовой в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино-на-Оке). В работе Саакян И.Р. с соавт. (1998) показано усиление индуцируемого перекисями освобождения ионов кальция из предварительно нагруженных катионом митохондрий. При продолжительном воздействии потока отрицательных аэроионов (супероксиданион радикалов) на гомогенаты, хранящиеся на льду, и последующей инкубации в средах, обработанных отрицательными аэроионами (т.е. О2*') , в них наблюдалось нарастание уровня продуктов ПОЛ при исходно низком их содержании и его снижение при исходно высоком уровне. Диапазон изменений концентраций продуктов ПОЛ в этих условиях оказался существенно ниже, чем при его патогенной интенсификации. Обнаруженная авторами мягкая активация процессов ПОЛ рассматривается как первичный физико-химический механизм благотворного действия отрицательных аэроионов. В другой работе (Temnov A.V. et al, 1997) показано, что под воздействием аэроинов происходит активизация фосфорилирования в митохондриях, что обусловлено более полным сохранением их нативной структурной организации in vitro.Здесь уместно отметить, что и сами АФК, по крайней мере, в виде отрицательных аэроионов, находящиеся в воздухе, являются полезными для жизнедеятельности факторами окружающей среды. Установлено, что отрицательно заряженные аэроионы - это гидратированные супероксид анион радикалы (02*')(Н20)т и что свое действие они оказывают благодаря тому, что представляют собой свободно-радикальные частицы, порождающие все другие формы АФК, а не за счет того, что несут электрический заряд (Гольдштейн Н.И., 2000). Важно подчеркнуть, что нормальный "свежий" воздух должен содержать, по меньшей мере, 500 таких ионов в см^, тогда как содержание кислорода в том же объеме в 10^ ^ раз больше.Еще в 20-30-е годы XX столетия А.Л. Чижевский установил, что воздух, содержащий не менее этого количества «легких» отрицательных ионов, действует на организмы благотворно, а при существенном превышении в нем содержания положительных аэроионов состояние здоровья ухудшается, замедляется рост, вес, падает аппетит, наблюдаются негативные изменения в поведении и внешнем виде животных (Чижевский А.Л., 1922, 1999). Если же воздух вообще лишен аэроионов, то животные в скором времени погибают с симптомами удушья. Если у животных, пребывающих в такой атмосфере, еще не произошли необратимые органические изменения, в первую очередь, в мозгу и нейроэндокринных органах (Goldstein N.l. et al, 1992), то при обогащении воздуха отрицательно заряженными аэроионами явления асфиксии у животных исчезают (Чижевский А.Л., 1960, Goldstein N.I. and Arshavskaya T.V., 1997), Аэроионизация воздуха отрицательно заряженными ионами сейчас используется довольно широко. Установлено, что при повышении содержания аэроионов в среде у многих больных с различной патологией нормализуется состояние, повышается устойчивость организма к неблагоприятным факторам (Васильев Л.Л., 1960; Каценович Р.А., 1966; Гольдштейн Н.И., 2002). В работах (Кондрашова М.Н. и др., 1997; Kondrashova M.N. et al., 2000) показано, что при воздействии отрицательных аэроинов, генерируемых люстрой Чижевского, выявляется физико-химические механизмы их благотворного эффекта на ассоциаты митохондрий, а именно, усиление структурной организации и интесификация энергетических процессов в митохондриях. В этих же работах продемонстрирована активация образования АФК в "ослабленных" нейтрофилах в среде, предобработанной аэроионами; активирование препаратов СОД после помещения их в растворы, обработанные аэроионами. Непосредственным активатором является перекись водорода, образующаяся в микромолярных концентрациях из супероксид аниона в этих растворах.Таким образом, совершенно не умаляя возможных нежелательных последствий от возникновения свободных радикалов в клетках и тканях, следует иметь ввиду и их положительную роль в жизнедеятельности организмов. В связи с этим возникает сложная задача выяснить, в чем различие механизмов действия АФК в малых и больших дозах, когда наступает сбой в системах, отвечающих за определенное сбалансированное состояние в организме, не позволяющее развиваться зависимым от свободных радикалов повреждениям и патологиям и др.Отвлекаясь от процессов, происходящих в митохондриях и зависящих от АФК, следует также отметить, что есть еще по краней мере три системы, довольно подробно изучаемые в настоящее время, где роль АФК, пожалуй, является главной в фз^нкционировании этих систем. Первая система - это монооксигеназная цитохром Р-450-зависимая система гепатоцитов, ответственная за метаболизм таких эндогенных субстратов, как, например. холестерин и стероидные гормоны (Колл.монография "Гепатоцит" /отв. ред.Л.Д.Лукьянова/, 1985; Goeptar A.R. et al, 1995; Peltola V. et al, 1996). Другая важная функция этой системы - это детоксикация чужеродных для организма химических гидрофобных веществ - ксенобиотиков (Арчаков А.И., 1975; Парк Д.В., 1973 и др.). Вторая система - это оксидазная система нейтрофилов и других лейкоцитов крови (Babior В.М. et al, 1973; Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П., 1989) и третья - NO-синтаза эпителиальной выстилки сосудов и других тканей (Beckman J.S. et al, 1990; Knowles R.G. and Moncada S., 1994; Silverton S.F. et al, 1995; Xia Y. et al, 1998; Зотова И.В. и др., 2002). О первых двух системах достаточно подробно будет сказано в соответствующих главах диссертации.Этот, далеко не весь перечень примеров систем указывает нам на важность оценки роли АФК в организме как минимум с двух сторон. К настоящему времени уже накоплен значт-ельный экспериментальный материал, показывающий, что практически во всех клетках и тканях животных организмов присутствуют ферментные системы оксидазного типа, образующие АФК (ВаЫог В.М., 1999; Jones R.D. et al, 2000).Показано, например, что многие другие ферменты в процессе выполнения своих прямых функций продуцируют АФК, что все иммуноглобулины независимо от их класса могут интенсивно продуцировать Н2О2 (Wentworth A.D. et al, 2000). Обнаружение в каждом конкретном случае того порога, после которого кардинально меняется роль АФК в гомеостазе организма, как раз и представляет собой важную и непростую биологическую задачу.При ее рещении необходима сравнительная оценка свойств и механизмов действия АФК на биологические структуры и процессы, диагностика, тестирование и корректировка состояния живых объектов при их функциональном отклике на воздействие определенных факторов овфужающей среды на всех уровнях биологической организации - от субклеточных структур до сообществ разных видов, вплоть до человека. В конечном итоге может быть выявлено влияние АФК и его последствий на экологические закономерности сосуществования живых организмов в биогеоценозе.По большому счету именно выше перечисленные проявления жизнедеятельности связаны с инициирующей ролью АФК в различных жизненно важных или патологических процессах. Главная роль принадлежит здесь супероксиданион радикалу, как первоначальному продукту одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода.В дальнейшем мы будем рассматривать биологические системы, ответственные за генерацию энергии ЭВС (Шляпинтох В.Я. и др., 1966; Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И., 1972), которая напрямую связана с образованием супероксид анион радикала и других продуктов восстановления молекулы кислорода. Эта энергия может передаваться от мест генерации к местам реализации как с некоторой потерей в виде излучения, так и путем безызлучательного переноса и играть важную роль в разнообразных физиологических процессах (Cilento G., 1973, 1975, 1988; Cilento G. and Adam W., 1995; Баскаков И. В. и Воейков В.Л., 1996). Бразильский физико-химик Джузеппе Чиленто, активно работавший в этой области, назвал такое явление "фотобиохимия без света" (Cilento О., 1988).За счет накопления электронно-возбужденных частиц и молекул (например, карбонильных соединений) и освобождения энергии ЭВС при их релаксации в клетке, могут осуществляться энергоемкие процессы (Риль Н., 1948; Рид С, 1960; Phillips G.O., 1965; Журавлев А.И., 1965, 1972; Adam W. et al, 1986; Campbell A.C., 1988; Cilento G. and Adam W., 1995; Баскаков И. В. и Воейков В.Л., 1996). Кроме того, создаваемые ансамблями возбужденных частиц электромагнитное поле и излучения, сопровождающие его осцилляции, могут, по-видимому, играть информационную роль в биосистемах (Giirwitsch A.G., 1924; Guillery, 1929; Гурвич А.А., 1968; Казначеев В.П. и Михайлова Л.П., 1981; Galantsev V.P. et al, 1993; Novikov K.N. et al, 1994; Кузин A.M., 1995, 2000; Белоусов Л.В. и др., 1997; Voeikov V.L. and Novikov C.N., 1997; Burlakov A.B., 1999; Бурлаков А.Б. и др., 2000). Все эти феномены в сово10^ пности реализуются для осуществления некоторых важных реакций в клетках, живых организмах, обеспечивая их целостность.Итак, к настоящему времени известен довольно широкий спектр систем, генерирующих АФК, и, следовательно, ЭВС, к которым прежде всего надо относить ферментные НАДФН- и НАДН-зависимые оксидоредуктазные комплексы, распространенные в различных клеточных и тканевых системах живых организмов: в соединительной ткани, эндотелии, фагоцитирующих клетках, гепатоцитах, клетках коры надпочечников, некоторых видах нервной и мышечной ткани и т.д. у животных (Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П., 1989; Babior В.М. et al, 1973; Babior В.М., 1999; Furukawa К. et al, 1992; Goeptar A.R. et al, 1995; Kalsi J.K. et al, 1993; Meier B. et al, 1991; O'Donnel V.B.and Azzi A., 1996; Jones S.A. et al, 1996; Peltola V. et al, 1996), a также у фотосинтезирующих водорослей, в зеленых листьях растений и в некоторых других растительных тканях (Доскоч Я.Е. и др., 1969; Honeycutt R.C. and bCrogmann D.W., 1970; Elstner E.F. and Heupel A., 1974; Шульцман Ф.М. и др., 1976; Dalton D.A., 1992; Hirayama S. et al, 1996; Самуилов В.Д. и др., 2001; Kasahara М. et al, 2002). Приведем один важный пример. Увеличение потребления кислорода с превращением его в АФК - событие, без которого невозможно оплодотворение сперматозоидом яйцеклетки (Klebanoff S.J. et al., 1979), а, значит, и развитие многоклеточного организма. Одно из первых событий при оплодотворении - резкая активация НАДФН-оксидаз обоих партнеров (Heinecke J.W. and Shapiro В.М, 1989; de Lamirande E. and Gagnon C, 1993).Оксидазные комплексы непосредственно локализованы в мембранных образованиях клеток (плазматическая мембрана, эндоплазматический ретикулум (ЭР), мембраны фагосом, граны хлоропласта и т.д.). Ответственными за генерацию АФК и в то же время чувствительными к их воздействию в организме животных являются также фотобиологические системы, такие как зрительная (фоторецепторные мембраны (ФРМ) палочек и колбочек сетчатки, хрусталик), светочувствительные пигментные системы кожи, в которых развиваются фотодинамические процессы (Kagan V.E. et al, 1973; Новиков К.Н. и др., 1974; Братковская Л.Б. и др., 1981; Островский М.А. и др., 1987; Донцов А.Е. и др., 1999; Kagan V.E. et al, 2002).На сегодняшний день разработано достаточно большое количество методов, позволяющих регистрировать образование АФК, различных продуктов их взаимодействия с клеточными структурами, другими субстратами молекулярного и надмолекулярного происхождения. Прежде всего к таким методам надо отнести метод ЭПР, хемилюминесценции (ХЛ), спектрофото- и флюориметрии, методы определения активностей ферментов, участвуюыщх в генерации или элиминации АФК (ксантиноксидазная, пероксидазная, гидроксилазная, супероксиддисмутазная, каталазная, глютатионпероксидазная и др. активности), гистохимические реакции, в которых участвуют АФК и т.д (см. ниже). В частности, с помощью этих методов идентифицированы радикальные и молекулярные продукгы последовательной окислительной деградации липидов (процесс ПОЛ), белков, пептидов, аминокислот и аминов, Сахаров (реакции неферментативного гликозилирования) (Maillard L.C., 1912; Richter С, et al, 1987; MuUarkey C.J. et al, 1990; Pattison D.I. et al, 2002). Прослежены возможные пути вовлечения АФК в регуляцию трансдукции сигнала в клетке, процессов экспрессии генов, клеточной дифференцировки, индивидуального развития, старения, апоптоза, некроза и др. (Allen R.G. and Balin А.К., 1989; Del Bello В. et al, 1999; Sauer H. et al, 2001; Воейков В.Л., 2002 и др.). Однако до сих пор еще не поняты до конца конкретные механизмы вовлечения свободнорадикальных производных и ЭВС в метаболические и патологические процессы.Особое место занимают процессы с участием АФК, отвечающие за поддержание жизнедеятельности организмов в окружающей среде, за их адаптивные реакции, за надежность работы защитных систем организма (иммунная, система детоксикации), короче говоря, такие процессы, которые могут обеспечивать определенный гомеостаз, физиологический статус и взаимоотношения организмов в биоценозах (Fridovich I., 1974; Bingham Е., 1991; Когелевцев СВ., 1997; Stepanova L.L et al, 2000; Regoli F. et al, 2002 и др.).Таким образом, реакции с участием АФК в живых системах могут быть основой для оценки различных изменений физиологического состояния организмов, в том числе и после воздействий внешних факторов физической /радиация, различные физические поля и излучения, среди которых особый интерес представляют слабоинтенсивные воздействия (Пресман А.С., 1997)/ и химической природы (токсические вещества, наркотические средства, канцерогенные агенты, отходы химических производств, промвыбросы других предприятий, в особенности, целлюлозно-бумажной промышленности).В настоящей работе представлены и обсуждены данные наших многолетних исследований (1972-2003гг), выполненные в основном в лаборатории физико-химии биомембран и на кафедре биоорганической химии Биологического факультета МГУ и охватывающие тот 1фуг проблем, на которых мы остановились во введении.Целью работы явилось выяснение регуляторной роли АФК в биологических системах от мембранного до организменного уровня, а также исследование механизмов протекания и регуляции реакций с участием АФК при воздействии различных факторов окружающей среды.На примере оценки многообразного проявления реакций с участием АФК в живых организмах был обобщен имеющийся в наших руках материал с целью предложения комплексного подхода к использованию различных биологических объектов как тест-систем на основе реакций АФК. Мы прежде всего ставили задачу показать, ш^кую качественно новую роль при биотестировании могут играть сочета1шые и не используемые в обычной практике разные подходы к оценке проявлений одного и того же процесса.Например, как неоднозначно действуют канцерогенные углеводороды и продукты их гидроксилирования фенольной природы, некоторые загрязнители этой же природы на работу монооксигеназной системы печени, иммунокомпетентных клеток животных, а также плаценты людей, обитающих и проживаюыщх в определенных зонах риска (район Байкальского ЦБК, Алтайский 1фай и др.). Мы применили ряд сравнительных подходов к выяснению механизмов действия этих и других веществ на природных и экспериментальных моделях живых организмов и их систем, где всегда выявляется мозаика последствий процессов активации кислорода.Основными объектами изучения явились лягушки, рыбы, лабораторные крысы, другие млекопитающие, включая человека. Часть работы была связана с кровью крыс, а также здоровых и больных людей.Мы охарактеризовывали эти объекты, как оптимальные биотест-системы для, например, идентификации загрязнителей окружающей среды, состояния внутренней среды животных и человека, для оценки антиоксидантного действия некоторых лекарственных препаратов и т.д. Для этого исследовали светозависимые и индуцированные реакции ПОЛ в мембранах фоторецепторов сетчатки, процессы генерации АФК, реакции гидроксилирования, ПОЛ, фосфолипаз типа Аг в монооксигеназной цитохром Р-450-зависимой системе микросом печени и плаценты, клеточных системах гепатоцитов и нейтрофилов in vivo и in vitro. Изучалась работа НАДФН -зависимой оксидазной системы на моделях изолированных нейтрофилов и цельной крови (окислт'ельный взрыв ОВ). Рассматривали нормально протекающие процессы при воздействии таких факторов окружающей среды, как аэрация и свет. Изучали возможные причины развития некоторых патологических состояний, в основном связанных с загрязнениями окружающей среды, недостаточностью кислорода.Полученные результаты позволили разработать ряд рекомендаций для использования реакций АФК в тестировании состояния организмов при воздействии факторов окружающей среды, а также для оценки динамики и последствий некоторых патологических процессов (ишемическая болезнь сердца - ИБС, желтуха и т.д.) в ходе их развития и лечения (действие лекарств и низкоинтенсивная лазеротерапия).В задачу данной работы входило не только получение и обсуждение кошфетных экспедиционных, лабораторных экспериментальных и клинических материалов и результатов, но и рассмотрение определенных моделей и методических подходов, позволяющих подойти к разработке комплексных биологических тест-систем на основе реакций АФК. Уделялось также серьезное внимание теоретическому обоснованию свойств этих реакций и процессов их реализации, и тех результатов, которые отражают последствия изменений в системах организмов при различных условиях воздействия на них внешних факторов, и если это было возможно, на экологические системы в целом.Основной принцип исследования, которому мы старались следовать, это принцип информационного единства биосферы, обеспечивающий целостность живых организмов. Это единство, на наш взгляд, определяется системой факторов окружающей среды, необходимых для жизнедеятельности.Одними из самых важных факторов этой системы, как теперь уже становится ясным, можно назвать находящиеся в воздухе в незначительных концентрациях отрицательные аэроионы. Мы пытались на основе анализа роли АФК в функционировании отдельных молекулярных, мембранных, клеточных систем и целых организмов в нормальных условиях их жизнеобитания, а также при неблагоприятных воздействиях или при моделировании подобных условий в эксперименте, сравнивать реакцию биологических систем разных уровней организации на идентичные воздействия, используя адекватные методы или наблюдение за их поведением. При таком анализе, в частности, выявлялись компоненты и свойства систем, определящие наиболее значимые адаптационные механизмы организмов в изменяющихся экологических условиях.Остановимся теперь подробнее на конкретных моделях исследования роли АФК в жизнедеятельности живых организмов и отклика их на различные факторы окружающей среды, в том числе неблагоприятные. Рассмотрим сначала мембранные модели, в которых непосредственно осуществляется активация кислорода и которые могут быть использованы как тесты для оценки степени воздействия внешних факторов.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Новиков, Кирилл Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена активация кислорода и накопление в сетчатке и мембранах фоторецепторов продуктов свободнорадикального окисления липидов в относительно низких концентрациях при нормальных условиях световосприятия у животных разных видов. Выявлены механизмы регуляции этих процессов и температурной адаптации родопсина в сетчатке у пойкилотермных и гомойотермных животных. Показана высокая степень адаптации зрительной системы к регуляции баланса между необходимостью аэрируемости сетчатки и риском образования повышенных концентраций АФК. Основную роль в этом процессе играет витамин Е.

2. В системе детоксикации ксенобиотиков микросом печени крыс генерация Ог*" осуществляется главным образом на НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе. Восстановление 02*" до перекиси водорода и далее до ОН* является инициирующим звеном в реакциях ПОЛ. Процесс ПОЛ выступает в качестве фактора, способствующего протеолитичекой деградации цитохрома Р-450. Устойчивость конститутивного пула цитохрома Р-450 к таким воздействиям, как ПОЛ и протеолиз, заметно выше, чем его индуцированных форм после воздействия ксенобиотиков, загрязнителей окружающей среды.

3. Микросомная фракция печени крыс предложена, как мембранный биомаркер для оценки антиокислительной активности лекарственных веществ разнонаправленного действия, которая учитывает их возможную метаболическую трансформацию в организме.

4. Выявлено подавленное состояние ферментных систем детоксикации в микросомной фракции плацент рожениц среди населения районов Алтайского края, подвергавшихся действию ядерных испытаний и химическому загрязнению с развитием гемолитической желтухи новорожденных, связанное как с угнетением механизмов генерации АФК вследствие накопления токсичных соединений в тканях матерей и детей, так и с генетическими факторами.

5. На основе исследований детоксицирующей системы печени рыб оз. Байкал выявлены свойства ее ферментов, как весьма низкие по содержанию и активностям на конститутивном уровне. Полученные стабильные препараты микросом печени рыб предложены, как чувствительные биосенсоры к незначительным превышениям концентраций загрязнителей в байкальской воде. С другой стороны, обнаружено, что монооксигеназные системы всех исследованных видов байкальских рыб подвергаются как эффективной индукции ПАУ и ПХБ, так и влиянию промстоков БЦБК и их компонентов (фенольных соединений) на генерацию АФК, протекание реакций ПОЛ и гидроксилирование ксенобиотиков. Предложена тест-система для биохимического мониторинга пресноводных экосистем.

6. Показано, что ограниченный гидролиз фосфолипидов фосфолипазой А2 в микросомах печени крыс и рыб приводит к частичной инактивации монооксигеназных активностей за счет преимущественного действия лизофосфолипидов. Эффективность воздействия на монооксигеназные реакции лизофосфолипидов зависит от их концентрации, типа индукции изоформ цитохрома Р-450 и их сродства к субстратам. Установлены отличия в глубине гидролиза, определяющиеся фосфолипидным составом, особенностями механизмов индукции монооксигеназ и сопряженного с ней синтеза de novo фосфолипидов в печени рыб и крыс.

7. Предложена тест-система изолированных гепатоцитов для определения устойчивости цитохрома Р-450 к активации ПОЛ. Впервые на модели изолированных гепатоцитов крыс показано, что эффективными протекторами цитохрома Р-450 от деструкции, вызываемой процессом ПОЛ, могут быть фенольные продукты гидроксилирования, образующиеся в результате окислительного метаболизма гидрофобных загрязнителей среды таких, как бенз(а)пирен.

8. Выявлен функциональный отклик нейтрофилов крови крыс при воздействии MX и СВ in vivo. После введения крысам этих ксенобиотиков происходит кондиционирование нейтрофилов крови, что выражается в повышении их реактивности (интенсификация генерации АФК - ОВ) и увеличении вязкости плазматических мембран. Впервые обнаружено появление активности ЭКОД нейтрофилов, скорость которой зависит от природы действующего ксенобиотика. Система изолированных нейтрофилов предложена в качестве биомаркера для ряда загрязнителей окружающей среды.

9. В цельной неразведенной крови человека реакции с участием АФК протекают непрерывно и сопровождаются собственным ССИ в видимой области спектра при постоянном восстановлении аэробными лейкоцитами кислорода, поступающего от эритроцитов. Интенсивность излучения крови зависит от ее функционального состояния и от факторов окружающей среды, вызывающих инициирование нейтрофилов (развитие ОВ). Разработан способ контроля за состоянием больных ИБС в ходе лечения внутривенной низкоинтенсивной лазерной терапией и защищен Патентом РФ.

10. Функциональные ответы мембранных, клеточных и тканевых систем животных и человека, основанные на реакциях с участием АФК, при воздействии физических и химических факторов окружающей среды могут быть использованы как для обнаружения механизмов действия факторов на эти системы, как для выявления патологий внутренней среды организмов и их коррекции, так и для эколого-токсикологического анализа экосистем, выделения групп риска, а также прогноза развития (ликвидации) экологических нарушений на территориях, неблагополучных по состоянию окружающей среды.

РАЗДЕЛ III. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В заключении настоящей работы необходимо представить обобщение полученных результатов в свете основных направлений собственных исследований и привлеченных нами литературных данных, посвященных универсальной роли активных форм кислорода в функционировании различных биологических систем с учетом их иерархической организации и экологической принадлежности.

Основное внимание в проведенной нами работе уделялось выяснению условий инициации и протекания процессов, связанных с участием АФК, на разных уровнях организации биосистем - молекулярном, клеточном и организменном и возникающих в ответ на воздействие разнообразных факторов окружающей среды. Важнейшими факторами внешней среды, необходимыми для жизнедеятельности изучаемых нами объектов, прежде всего являются естественные компоненты биосферы - кислород воздуха, отрицательные аэроионы - 02#"(Н20)т, свет, температура. Нарушающими или даже заметно повреждающими изучаемые нами биологические системы явились такие факторы окружающей среды, как ионизирующая радиация и химическое загрязнение.

Объектами проведенных исследований явились фоторецепторные мембраны сетчатки, микросомы печени и плаценты, клеточные системы (гепатоциты и нейтрофилы крови), цельная кровь рыб, земноводных и млекопитающих, включая человека, их реакции на воздействие факторов химической (ксенобиотики ПАУ и ПХБ, фенольные соединения, лекарственные средства, активаторы ОВ) и физической (свет, радионуклиды, слабоинтенсивное лазерное облучение с целью терапии ИБС) природы. Полученные нами результаты обсуждаются и с точки зрения адаптационных возможностей систем организмов животных и человека, их функционального отклика на воздействующие факторы среды. Под адаптационными возможностями мы понимаем, в частности, включение механизмов, обеспечивающих регуляцию образования АФК и протекания реакций с их участием в ответ на разнообразные воздействия со стороны окружающей среды.

Накопленные к настоящему времени многочисленные литературные данные в совокупности с результатами настоящей работы позволяют говорить о возможности проявления разнообразных свойств живого, связанных с трансформацией поступающего при дыхании жабрами, кожей или легкими кислорода в его активные формы и образующегося при этом электронного возбуждения, создающего в организме фонд энергии высокой плотности.

В организме энергии ЭВС запасается относительно немного, и она сама не может осуществлять какую-то работу, но может быть функционально важной для процессов жизнедеятельности - играть роль своеобразной искры (специфический сигнал), "свечи зажигания" (энергии активации биохимических реакций), запускающей другие источники энергии. В частности, эти своеобразные процессы "горения" не требуют затрат энергии АТФ. Напротив, как было показано уже в 90-ые годы прошлого столетия, без генерации АФК и образования ЭВС не могут быть осуществлены реакции освобождения энергии, запасенной в молекуле глюкозы, т.е. реакции гликолиза и цикла Кребса (Кондрашова М.Н., 1989 и др.). Безусловно, та биоэнергетика, которую связывают с окислительным фосфорилированием в митохондриальных структурах и синтезом в результате этого процесса макроэргических соединений (Chance В. and Williams G.R. 1956; Ernster L.and Lindberg O., 1958; Green D.E., 1959; Green D.E. and Hatefi Y., 1961; Racker E., 1965; Ленинджер A.,1966; Рэкер Э., 1967; Boyer P.D., 1967; Скулачев В.П., 1962, 1971, 1989,2000), играет важную роль в обмене веществ, но сейчас уже можно сказать, что не основополагающую.

До 1990-ых годов не было достаточно убедительных данных в литературе, доказывающих необходимость реализации в клетках и тканях живых организмов АФК, как сигнальных соединений (McCord, 1995; Гамалея И.А. и Клыбин И.В. 1996; Воейков В.Л., 1998; Dalton Т.Р et al, 1999; Воейков В.Л., 2000; Ermak G. and Davies K.J., 2002; Турпаев K.T., 2002 и др.). До этого времени в основном существовали представления о повреждающей роли АФК в биологических системах за счет инициации ПОЛ. При этом оставались незамечанными некоторые особенности ПОЛ. Так например, почти не обсуждалось, имеет ли физиологическое значение тот факт, что в липидах клеточных мембран, различных тканях и органах нормально функционирующего организма всегда можно обнаружить значимые количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ без выраженных нарушений гомеостаза. Не придавали должного значения возможной роли малонового диальдегида и других так называемых "ТБК-активных продуктов", как карбонильных соединений, в аккумуляции и трансформации энергии электронного возбуждения и таким образом поддержании процессов "горения" в организме (Cilento G., 1988; Cilento G. and Adam W., 1988, 1995; Баскаков И.В. и Воейков B.E., 1996). Наряду с реакциями дисмутации и распада перекиси, катализируемых СОД и каталазой, протекающими с выделением энергии (не менее 1-2 эВ), происходят реакции окисления карбонильных соединений. Эти реакции обладают еще более высоким энергетическим эффектом и катализируются пероксидазами, которые выступают здесь в роли оксидаз. Так, например, при катализировании пероксидазой (РОХ) окисления альдегидов образуется очень неустойчивый (а, значит, энергонасыщенный) диоксиэтан, который быстро распадается до ацетона в триплетном состоянии и муравьиной кислоты (Adam W. et al., 1986):

R о pox R o-H

II II

R-C-C-X + O,-► [ R-C-C-X 1-► R,C=0* + XC02H

I II н o-o

Такому окислению могут подвергаться многие природные органические соединения, в том числе, по-видимому, и МДА. При их переходе из триплетного возбужденного в основное синглетное состояние наблюдается люминесценция в области 375-420 нм, что соответствует энергии квантов 2,9-3,3 эВ (Shulte-Herbruggen Т., Sies Н., 1989).

На наш взгляд, определяющая роль любых биомембран, не только митохондриалъных, — это их энергетическая функция: при постоянно генерируемом уровне пероксидации жирнокислотных цепей фосфолипидов создается лабильный фонд ЭВС в фосфолипидном матриксе мембран. В литературе есть указания на такую возможность (Дмитриев Л.Ф., 1983, 2001а,б). Фонд ЭВС обеспечивается постоянной генерацией АФК, образованием ГП липидов, алкильных и алкоксильных радикалов (см. 11.2.1), вторичных продуктов ПОЛ карбонильной природы. Преобразования АФК и свободнорадикальных состояний в биомембранах позволяют осуществлять триггерные энергетические "посылы " для выполнения регуляторных функций, свойственных сложной мозаике мембранных компонентов. В частности, активирование реакций де- и реацилирования с участием фосфолипаз типа А может происходить эффективно только при условии наличия в жирнокислотных остатках фосфолипидов возбужденных алкильных или алкоксильных радикальных состояний, перекисных группировок.

По ходу изложения материала мы неоднократно упоминали, что следствием релаксации ЭВС, возникающих в ходе свободнорадикальных окислительно-восстановительных реакций, в частности, пероксидации молекулярных субстратов, является ССИ живых клеток и тканей (Владимиров Ю.А., 1966; Тарусов Б.Н. и др., 1967; Тарусов Б.Н., 1972; Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И., 1972; Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П., 1989). До настоящего времени большинство авторов считает, что ССИ - это побочное явление, не играющее функционально значимой роли в живых системах. Однако еще на основании исследований А.Г.Гурвича в 1920-30-ых годах и большого экспериментального материала, полученного им и другими авторами, можно утверждать, что электронное возбуждение в живых организмах закономерно возникает при обмене веществ и необходимо для их нормальной жизнедеятельности (Gesenius Н., 1930; Gurwitsch А., 1932).

Задолго до этих работ крупный русский биохимик А.Н.Бах в конце XIX -начале XX века, создав теорию перекисного окисления, в своих работах, посвященных химизму дыхательных процессов уже придавал основополагающее значение активированному кислороду в нормальном метаболизме пищевых веществ (Бах А.Н., 1897,1912).

Поскольку активация кислорода и генерация электронного возбуждения -это понятия одного порядка, можно считать, что в работах А.Н.Баха, А.Г.Гурвича и других авторов - их современников был заложен серьезный фундамент для будущих исследований роли АФК в функционировании организмов.

Логическим продолжением их исследований явились полученные в последнее время множество данных о том, что в биологических системах постоянно протекают процессы, приводящие к непрерывному возникновению электронно-возбужденных частиц с высвобождением порций энергии, эквивалентных квантам видимого и даже ультрафиолетового света (Voeikov V.L., 2001). При наличии в биологических системах субстанций, способных поглотить такие кванты, они возбуждаются. Энергия от одной возбужденной частицы к другой может передаваться "безызлучательным" путем практически мгновенно на большие расстояния в молекулярно-масштабном измерении. Эффективность использования этой энергиии определяется уровнем структурной организации биосистем (Bacchiocchi С. and Zannoni С., 1997; Воейков B.JL, 2003). Во внутренней организованной среде живых организмов существенно снижается вероятность перехода энергии ЭВС в тепло, но повышается вероятность ее накопления в макромолекулярных и надмолекулярных образованиях за счет безызлучательного переноса.

Довольно значительная доля восстанавливаемого в организме кислорода по одноэлектронному пути (15-20%, в исключительных случаях - до 30%) (Лукьянова Л.Д. и др., 1982; Heinecke J.W. and Shapiro В.М, 1989) влечет за собой высокую интенсивность генерации ЭВС. Но так как время жизни электронно-возбужденных частиц мало, то они, возвращаясь в равновесие, отдают организму энергию, которая используется им в необходимых в этот момент процессах. Происходить это может только в определенных условиях. Основа таких условий лежит в том, что ЭВС само по себе - колебание. Только когда колебания молекул организма совпадают с энергией ЭВС, тогда и возникает резонанс, запускающий всевозможные биохимические процессы (Баскаков И.В. и Воейков В.Л., 1996; Воейков В.Л., 2003).

Именно такие условия характерны для системы цельной крови. В наших исследованиях с цельной неразведенной кровью человека мы много раз получали длительную осцилляторную картину развития процесса люминесценции. Характер и длительность колебаний излучения могли зависеть от многих факторов. Но прежде всего излучение отражает степень кооперативности такой сложной биологической системы, как кровь, ее возможность реализовывать энергию ЭВС для поддержания своего физиологического состояния вне организма и, более того, может информировать нас и о состоянии организма в целом.

Мы установили, что в крови происходит постоянный обмен кислорода, генерация АФК и ЭВС за счет взаимодействия аэробных клеток крови -лейкоцитов (прежде всего нейтрофилов) с эритроцитами. Благодаря тому, что кислород практически полностью связан с возбужденным гемоглобином эритроцитов, он является субстратом для нейтрофилов, постоянно продуцирующими энергию ЭВС. За счет нее нейтрофилы активно потребляют кислород из эритроцитов и тем самым в крови, как целостной системе, поддерживается необходимый уровень как генерируемых АФК, так и энергии ЭВС, сопровождающийся фотонной эмиссией. Заметные нарушения поведения крови прежде всего в изменении осцилляторных режимов ее излучения при функциональной нагрузке (развитие окислительного взрыва), как правило, связаны с возникновением различных патологических состояний при воздействии на организм вредных факторов внешней среды.

Однако, такие экологические факторы, как свет, воздух и вода, продукты питания помогают организму, во-первых, все время поддерживать возникновение и утилизацию энергии ЭВС, а, во-вторых, корректировать функциональные нарушения в организме. При этом не надо забывать, что каждый организм имеет некий предельный запас адаптивных возможностей, позволяющих ему "подстраиваться" к изменениям в своем экологическом окружении.

Нами впервые была обнаружена светозависимая генерация свободнорадикальных состояний и активация кислорода в сетчатке и мембранах фоторецепторов, опосредованные фотолизом зрительного пигмента родопсина при нормальном световосприятии.

В этих условиях в липидной фазе сетчаток и ФРМ у животных разных видов накапливаются продукты ПОЛ в относительно низких концентрациях, причем спектр действия этого процесса совпадает со спектром поглощения родопсина. Непосредственно за накопление продуктов ПОЛ в сетчатке и в структурах фоторецепторов, содержащих родопсин, подвергающийся спонтанному обесцвечиванию, отвечает, скорее всего, конечный продукт фотолиза зрительного пигмента - ll-^wc-ретиналь. Последний находится в триплетном возбужденном состоянии и способен активировать кислород до его синглет-возбужденного состояния. '0*2 в свою очередь инициирует процесс ПОЛ в липидах ФРМ.

Обнаруженное нами характерное отсутствие зависимости накопления перекисей липидов в НС палочек сетчатки от наличия восстановительных эквивалентов (НАДН или НАДФН) говорит в пользу развитых приспособительных механизмов для функционирования фоторецепторной системы. Эти механизмы исключают возможность конкуренции реакций образования перекисей липидов в НС палочек сетчатки с участвующей в темновой регенерации родопсина ретинолдегидрогеназой за источники восстановительных эквивалентов - пиридиннуклеотиды.

Выявлены регуляторные механизмы не только образования АФК и свободно-радикальных продуктов в сетчатке, но и температурной адаптации родопсина у пойкилотермных и гомойотермных животных. В области физиологических температур исследованных нами объектов (0°С-10°С - для минтая, 0°С-20°С - для лягушки, 37°С - для быка) как термостабильность родопсина и жидкостность липидного бислоя, так и количество иммобилизованных зрительным пигментом молекул липидов ФРМ оказались очень близки.

Наряду с этими результатами мы установили, что сетчатка обладает особой способностью к потреблению в больших количествах кислорода, избегая образования излишних концентраций АФК в мембранных структурах фоторецепторов. В поддержании этого своеобразного баланса основная роль принадлежит витамину Е. С другой стороны, обнаруженный нами при нормальных условиях спектр действия образования в сетчатке продуктов ПОЛ в относительно низких концентрациях соответственно поглощенной энергии света свидетельствует, вероятно, о необходимости генерации энергии электронного возбуждения для осуществления зрительного акта. Нами предложена биосенсорная тест-система, в основе которой лежит чувствительность структур сетчатки к факторам окружающей среды, повышающим уровень их пероксидации как при нормальном световосприятии, так и при значительных интенсивностях поглощаемого сетчаткой света.

Надо полагать, что любой организм или система в определенных пределах способны к самонастройке, однако, если прессинг вредных воздействий чрезмерен, то адаптационные возможности могут быстро исчерпаться. В этой ситуации существуют пути преодоления неизбежных последствий вредных воздействий для организмов и экологических сообществ в целом, включая человека.

Один из этих путей, по-видимому, подразумевает разумное лечебное вмешательство в состояние здоровья человека, в его время от времени возникающие острые, а в большей степени - в имеющиеся хронические серьезные проблемы со здоровьем. К сожалению, далеко не всегда такое вмешательство будет иметь положительный эффект, если наряду с экстренной медикаментозной терапией не применять методы так называемой резонансной медицины.

Подобный подход был рассмотрен в нашей работе на примере применения низкоинтенсивной лазеротерапии у больных ИБС. Разработанный нами вместе с врачами Центрального военного госпиталя им. В.П.Мандрыка способ контроля за состоянием этих больных по ЛМ-ХЛ неразведенной крови в ходе проведения внутривенной низкоинтенсивной лазерной терапии позволял корректировать количество проводимых сеансов. По сути своей ХЛ метод является индикацией интенсивность генерации АФК и ЭВС в крови Фиксируя с помощью ФЭУ реальную потерю системой световой энергии, мы фактически можем судить о большей или меньшей потере энергии ЭВС. Таким образом, мы оцениваем, насколько слабы или сильны адаптационные возможности организма человека на данной стадии заболевания и даем возможность врачу подобрать или скорректировать терапию.

С другой стороны, при изучении воздействия на организм определенных лекарственных препаратов, необходимо хорошо представлять себе направленность их действия, а также идентифицировать их действующее начало. Подобного рода исследования мы проводили с рядом препаратов противовоспалительного и иммуномодуляторного действия. Мы показали, что микросомная фракция печени крыс является хорошей мембранной тест-системой для изучении прямой или непрямой антиокислительной активности исследуемых лекарственных препаратов in vitro и in vivo. Она позволяет оценивать эффективность антиокислительных свойств лекарственных препаратов разнонаправленного действия и учитывать их возможную метаболическую трансформацию.

В условиях постоянно меняющейся окружающей среды люди, попадающие в неблагоприятную экологическую обстановку, постоянно испытывают прессинг вредных воздействий и не могут полностью адаптироваться к ним. В результате серьезные воздействия антропогенных факторов, таких как присутствующие в окружающей среде радионуклиды (последствия испытаний ядерного оружия и аварий на АЭС), химические загрязнения (прежде всего промвыбросы предприятий), пагубно отражаются на здоровье людей. Кроме того, влияние этих вредоносных факторов может обнаруживаться через поколения в виде появления патологий неясного происхождения. В подобных случаях первостепенно необходимо выяснение причин и механизмов нарушений, приводящих к развитию патологии. Реально подобное положение существует в районах Алтайского края с гемолитической желтухой новорожденных невыясненной этиологии.

Участвуя в государственной программе по ликвидации последствий ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне (научный руководитель программы профессор Я.Н.Шойхет), мы впервые провели анализ воздействия патологических факторов окружающей среды на уровень активности монооксигеназ (1-ой и П-ой фазы детоксикации) в плаценте, взятой у рожениц сразу после родов. Это исследование явилось частью комплексной работы, в результате которой была обнаружена вариабельность содержания цитохрома Р-450 и возможность индукции монооксигеназ в плаценте женщин, работающих на вредных производствах (хлорорганика) и проживающих в неблагополучных по радиационной обстановке районах. Предпринятый нами подход измерения соответствующих активностей ферментов детоксикации в микросомах плаценты предлагается для диагностики скрытых мембранных патологий при комплексном анализе эпидемиологического состояния здоровья населения в районах, неблагоприятных по состоянию окружающей среды.

Детоксикация чужеродных организму химических гидрофобных веществ невозможна без участия специализированной цитохром Р-450 зависимой монооксигеназной системы и не может осуществляться без активации кислорода. Поскольку монооксигеназная система является одной из наиболее важных систем, ответственных за генерацию АФК в организме, мы уделяли особое внимание исследованию этой системы. Сравнение особенностей функционирования микросомных фракций печени животных разных экологических ниш (млекопитающие и рыбы) при воздействии различного качества факторов окружающей среды, как природного, так и антропогенного происхождения (температура, ксенобиотики-индукторы различных гидроксилаз, промвыбросы целлюлозно-бумажного производства - БЦБК), позволило нам выявить характерные сходства и различия в таком функционировании.

Так нами было установлено, что именно гидроксил-радикал ОН" является инициирующим звеном в реакциях ПОЛ в микросомах печени крыс. В мембранах ЭР печени генерация 02*" осуществляется главным образом на НАДФН-цитохром Р-450 редуктазе, а в присутствии экзогенных ионов железа на этом же участке происходит инициирование НАДФН-зависимого ПОЛ. В нативных микросомных мембранах и после воздействия ксенобиотиков-индукторов монооксигеназных активностей процессы ПОЛ могут выступать в качестве фактора, резко повышающего эффективность протеолитичекой деградации Р-450.

Изучая монооксигеназную систему печени рыб оз. Байкал, мы установили низкий конститутивный уровень содержания и активностей ее компонентов вследствие исключительно низкого содержания в воде озера индукторов НАДФН-зависимой системы детоксикации. Благодаря этому она чувствительна к незначительным превышениям концентраций загрязнителей в воде. Полученные данные позволили эффективно использовать измерение активностей монооксигеназ или анализ синтеза de novo в мембранах ЭР изоформ цитохрома Р-450 при эколого-токсикологической оценке состояния оз. Байкал, в том числе в месте выброса сточных вод БЦБК. Перечисленные свойства системы монооксигеназ печени рыб позволили нам рекомендовать их для биохимического мониторинга экологического состояния других пресноводных водоемов.

Прослежено также взаимодействие между АФК-зависимыми процессами ПОЛ и гидроксилирования в микросомной фракции печени рыб. Как оказалось, продукты гидроксилирования бенз(а)пирена фенольной природы способны "сдерживать" развитие процесса ПОЛ в силу того, что они проявляют антирадикальные свойства и тем самым стабилизируют цитохром Р-450 -зависимую систему детоксикации.

Мы установили, что фенолы, потенциально являющиеся компонентами сточных вод БЦБК и содержащиеся в незначительных концентрациях в байкальской воде, как продуценты биоты, способны ингибировать как НАДФН-зависимое, так и аскорбат-зависимое ПОЛ в микросомной системе печени байкальских рыб. На основе экспериментальной модели по выявлению концентрационных констант 50% ингибирования ПОЛ был сделан вывод о том, что фенолы, обладая антиокислительными свойствами, способны задерживать разборку цитохрома Р-450. Это особенно важно в связи с активированием монооксигеназной системы детоксикации при повышении уровня загрязнителей в окружающей среде.

Еще одним важным фактором, модифицирующим детоксикационную активность, является фосфолипаза А2 микросомных мембран печени крыс и рыб. Оказалось, что после воздействия ксенобиотиками разной природы микросомы печени крыс и рыб обладают неодинаковой чувствительностью к действию фосфолипазы А2 и продуктов гидролиза фосфолипидов (преимущественно лизофосфолипидов). Эти отличия обусловлены прежде всего видовой принадлежностью монооксигеназных систем и различными уровнями метаболизма ксенобиотиков в печени млекопитающих и рыб. Они выявляются при оценке глубины гидролиза различных по составу, видоспецифичных фосфолипидов в микросомах печени крыс и рыб, и в связи с особенностями механизмов индукции монооксигеназ и сопряженного с индукцией синтеза de novo фосфолипидов в печени.

Исходя из наших результатов и данных работ (Neas and Hazel, 1984, 1985) вытекает, что наличие разных форм фосфолипазы А2 у рыб (разной степени гидролиза фосфолипидов) обеспечивает поддержание температурной адаптации рыб.

Поставленная нами цель изучения воздействия факторов окружающей среды на разных уровнях организации биосистем обязала нас исследовать влияние ксенобиотиков на АФК-зависимые реакции не только на мембранных моделях, но и на изолированных клетках. Так при работе с изолированными свежевыделенными гепатоцитами и нейтрофилами крови крыс мы разработали условия исследования суспензии этих клеток in vitro, максимально приближенные к состоянию их in vivo в тканях - источниках (печень и кровь).

Нам удалось добиться таких условий подбором специальных методических процедур выделения, что подробно было описано в соответствующих главах диссертации. Стандартное определение целостности клеток в выделенной суспензии по проницаемости плазматических мембран для красителя трипанового синего и активности фермента лактатдегидрогеназы может быть недостаточным для оценки некоторых важных параметров для переживания изолированных клеток.

Мы показали, что одним из таких параметров является стабильность клеточных систем, ответственных за энергетический статус клеток в том числе образующих АФК и генерирующих ЭВС микросомной системы детоксикации в гепатоцитах и оксидазной системы в нейтрофилах крови. Развитие в клетках реакций с участием АФК таких, как гидроксилирование ксенобиотиков и ПОЛ, требует определенного контроля со стороны механизмов регуляции этих процессов, необходимого для поддержания более длительной жизнеспособности клеток in vitro.

Мы впервые провели анализ первоначального уровня продуктов ПОЛ в выделяемых нами гепатоцитах и установили, что жизнеспособность изолированных клеток и устойчивость системы цитохрома Р-450 не связана прямо с этим параметром.

Строго говоря, свойства изолированных клеток печени могут зависеть от индивидуальных особенностей животных и сезонных изменений, от других внешних причин и факторов, воздействавших на животных, а не только от причин, возникающих при выделении гепатоцитов.

Подобный контроль и аналогичные данные могут быть целесообразны, если задаваться целью использовать изолированные клетки как биотест-систему для анализа действия антропогенных факторов, загрязняющих окружающую среду.

Клеточная модель гепатоцитов в настоящее время используется, например, в исследованиях по влиянию ксенобиотиков ряда ПАУ на индукцию специфических форм цитохрома Р-450 в этих клетках у форели (Bailey G. et al, 1987; Scholz S. and Segner H., 1999; Segner H. and Cravedi J.P., 2001). Однако для выделения изолированных клеток требуются более сложные, чем для выделения мембранных фракций, методические условия, которые далеко не всегда можно обеспечить вблизи источника загрязнений (например, БЦБК) и для тестирования объектов, подверженных таким загрязнениям (рыбы оз. Байкал).

На моделях микросомной фракции печени рыб и изолированной суспензии гепатоцитов крыс нам удалось получить сходные результаты по механизмам стабилизации детоксикационной цитохром Р-450-зависимой системы в процессе гидроксилирования БП и при использовании антиоксидантов фенольной природы в обеих моделях.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об универсальности механизмов регуляции стабильности детоксикационной системы на разных уровнях ее организации (мембранном и клеточном) у различных видов животных и в разных экологических условиях.

Другой клеточной системой, составляющей предмет наших исследований явились изолированные нейтрофилы крови, которые являются важной частью иммунной системы организма; их функционирование напрямую связано с резким повышением потребления кислорода и развитием ОВ, обусловленного интенсификацией образования АФК.

Мы впервые показали, что под воздействием исследуемых ксенобиотиков - MX и СВ, одних из самых активных представителей ПАУ и ПХБ, происходит индукция не только печеночных монооксигеназ у крыс in vivo, но также обнаруживается и деалкилазная активность (ЭКОД) в нейтрофилах крови.

Примечательны также полученные одновременно результаты по однонаправленному изменению индукции ЭКОД в нейтрофилах, повышению активности нейтрофилов и изменению параметров микровязкости их плазматических мембран (там локализована НАДФН-зависимая оксидазная система этих клеток), которые позволили нам судить о заметной роли воздействия чужеродных химических агентов как на функциональное, так и на морфологическое состояние таких важных иммунокомпетентных клеток, как нейтрофилы.

При изложении результатов, связанных с ролью нейтрофилов, как продуцирующих АФК клеток, мы обращали внимание на значение их взаимодействия со всеми элементами цельной крови, которые обеспечивают определенное динамическое соотношение кислород-зависимых процессов, приводящих к генерации энергии ЭВС. Несомненно, положительной оценки заслуживают работы, в которых используют в качестве диагносцируемого объекта (или тест-объекта) не изолированные нейтрофилы, а цельную, пусть даже и разведенную кровь (Allen R. С., 1986; Bochev В. G. et al, 1993; Takeuchi S. et al, 1995; Kopprasch S. et al, 1996 и др.). Основные закономерности тестирования, а именно, результаты воздействия различных факторов среды на активацию АФК и развитие ОВ, характерные для изолированных клеток, могут при разведении крови сохраняться. Однако, к сожалению, до настоящего времени нет строгости методического подхода при работе с цельной кровью и степенью ее разведения.

Многие авторы, работающие с цельной, но разведенной кровью, не учитывают неизбежного нарушения кооперативных, целостных свойств крови при ее разведении, искажающего взаимодействие доноров (эритроциты) и акцепторов (лейкоциты и прежде всего нейтрофилы) кислорода в крови. В работе мы приводили ряд экспериментальных данных, прямо указывающих на важность такого взаимодействия, обеспечивающего процессы, ответственные за генерацию АФК и ЭВС в крови, и уже обсуждали значение некоторых из них.

В связи с вышесказанным следует специально отметить, что существенное облегчение в решении такой важной для экологии человека медицинской проблемы, как борьба с возникновением недостаточности кислорода в организме (гипоксические состояния, ИБС, инсульт, воспалительные заболевания) может быть достигнуто при экспресс-анализе поведения цельной неразведенной крови по ее излучательной способности в динамике развития заболеваний и в процессе их лечения.

Мы предложили метод XJI неразведенной крови, как хороший экспресс-тест-метод потому, что при анализе незначительного количества крови (несколько десятков микролитров) можно получать воспроизводимые результаты, как на разных порциях одного и того же образца крови, так и на нескольких образцах крови одного и того же донора или порциях крови, взятых от различных доноров. Такой анализ не требует больших затрат времени и материала и может быть высоко достоверным в оценке динамики физиологического состояния больных до, в процессе и после лечения.

Итак, генерация АФК в биологических системах играет основополагающую роль в осуществлении важных энергоемких реакций в организме, связанных с запасанием и реализацией энергии ЭВС. Эти реакции преимущественно развиваются по свободнорадикальному пути и обладают рядом особенностей. На наш взгляд, главными из них следует признать нелинейный, динамический, колебательный характер этих реакций, обеспечивающий большой диапазон регуляторных механизмов в процессе жизнедеятельности. Прежде всего - это формирование ответов на различные воздействующие на организм факторы окружающей среды по типу обратной связи, в результате чего формируются адаптационные возможности к изменению светового, температурного и других климатических режимов.

В случае серьезных нарушений экологического равновесия необходимо разрабатывать соответствующие мероприятия, предотвращающие загрязнение окружающей среды. Важное место в подобного рода мероприятиях должны приобретать профилактические меры, ведение всестороннего мониторинга эколого-токсикологического состояния загрязняемых территорий, выработка эффективных методов биотестирования и биоиндикации. Эта проблематика нашла отражение в нашей работе.

В своих исследованиях мы исходили из информационного единства биосферы, обеспечивающего целостность живых организмов и, на наш взгляд, во многом определяющегося наличием в атмосфере кислорода и его активных форм, а в клетках и тканях присутствием окислительно-восстановительных ферментных систем, приводящих к генерации и превращениям АФК. Они ведут и регулируют реакции, которые необходимы как для нормальной жизнедеятельности, так и для предотвращения возникновения патологических состояний, в частности, при воздействии факторов окружающей среды.

Полученные и обсужденные в работе конкретные экспериментальные и клинические материалы и результаты мы предлагаем к рассмотрению в качестве определенных моделей и методических подходов, позволяющих разрабатывать комплексные биологические тест-системы на основе реакций с участием АФК. Рекомендуется использовать эти тест-системы для выявления патологических состояний внутренней среды организмов и их коррекции, для эколого-токсикологического и биохимического анализа водных экосистем, для выделения групп риска среди населения и прогноза развития (ликвидации) нарушений на неблагополучных по состоянию окружающей среды территориях.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Новиков, Кирилл Николаевич, Москва

1. Абилев С.К. Метаболическая активация химических мутагенов. // Итоги науки и техники. Общая генетика, ВИНИТИ, 1986, т. 9, стр 5-96.

2. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М., "Наука", 1975.

3. Арчаков А.И., Девиченский В.М., Карузина И.И., Ивков Н.Н., Александрова Т.А., Доронин П.П., Сорокина М. Влияние концентрации буфера на скорость реакций транспорта электронов в микросомах печени. // Биохимия, 1968, т. 33, № 3, стр. 479-487.

4. Ахалая М.Д., Деев Л.И., Платонов Ф.Г., Хакимов А. Влияние рентгеновского облучения на цитохром Р-450-зависимую монооксигеназую систему печени различных видов животных. // Биол. науки, 1990, №11, стр. 47-52.

5. Бабский Е.Б., Зубков А.А., Косицкий Г.И., Ходоров Б.И. Физиология человека, М., "Медицина", 1972.

6. Багдарасьян Х.С. Теория радикальной полимеризации. М., "Наука", 1966.

7. Барсуков Л.И., Куликов В.И., Иванова В.П., Бергельсон Л.Д. Трансмембранное распределение и флип-флоп фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в микросомах печени крыс. // Биол. мембр., 1984, т. 1, № 8, стр. 868-880.

8. Баскаков И.В. и Воейков В.Л. Роль электрон-возбужденных состояний в биохимических процессах. // Биохимия, 1996, т. 61, № 7, стр. 1169-1181.

9. Бауэр Э. Теоретическая биология. М.-Л., Изд-во ВИЭМ, 1935, стр. 140-144.

10. Бауэр Э. Физические основы биологии. М.-Л., Изд-во ВИЭМ, 1930.

11. Бах А.Н. О роли перекисей в процессах медленного окисления. // Журнал русского физ.-хим. общества (часть химическая), 1897, т. XXIX, отд. I, вып. 6, стр. 373-398.

12. Бах А.Н. Химизм дыхательных процессов. И Журнал русского физико-химического общества, С.-Петербург, 1912, т. XLIV, вып. 2 (Отдельный оттиск, 73 е.).

13. Бах А.Н. О действии перекиси водорода на живую клетку. // Сборник избр. Трудов акад. А.Н.Баха, Л., 1937, стр. 181-184.

14. Бах А.Н. Избранные труды. Л., 1950.

15. Безуглый В.Д. Полярография в химии и технологии полимеров. Л., 1968.

16. Бейм A.M. и Новиков К.Н. Использование биомолекулярных тест-систем при эколого-токсикологическом мониторинге водоемов. // В кн.: Региональный мониторинг состояния оз. Байкал, JL, "Гидрометеоиздат", 1987, стр. 244-249.

17. Белоусов JI.B., Воейков B.JL, Попп Ф.А. (1997) Митогенетические лучи Гурвича. // Природа, 1997, № 3, стр. 64-80.

18. Белоусова JI.B., Братковскя Л.Б., Галущенко И.В., Каган В.Е., Козлов Ю.П. Изучение механизмов дестабилизации мембран фоторецепторов при модифицирующем действии кислорода. // Биохимия, 1977, т. 42, № 10, стр. 1800-1809.

19. Бергельсон Л.Д. Мембраны, молекулы, клетки. М., 1982.

20. Берия В.П. Взаимосвязь эндогенного ПОЛ и окислительного метаболизма 2-ацетиламинофлуорена в мембранах эндоплазматического ретикулума печени. // Автореферат канд.дисс., М., 1975.

21. Берия В.П., Каган В.Е., Архипенко Ю.В., Козлов Ю.П. Антиоксиданты как стабилизаторы цитохромов в мембранах эндоплазматического ретикулума крыс in vivo. II Биофизика, 1975, т. 20, № 2, стр. 238-240.

22. Болдырев А.А. Биологические мебраны и транспорт ионов. М., 1985.

23. Боровягин В.Л., Островский М.А., Федорович И.Б. Фоторецепторная мембрана и нативный родопсин. // Биофизика, 1971, т. 16, № 2, стр. 350-376.

24. Братковская Л.Б., Новиков К.Н., Шведова А.А., Полищук Р.Ф., Каган В.Е., Козлов Ю.П. Пиридиннуклеотидзависимые системы индукции перекисного окисления липидов в фоторецепторах сетчатки. // Биологические науки, 1981, №6, стр. 21-26.

25. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В, Голиченков В.А. Дистантные волновые взаимодействия в раннем эмбриогенезе вьюна. // Онтогенез, 2000, т. 31, № 5, стр. 343-349.

26. Бурлакова Е.Б., Дэюба Н.М., Пальмина Н.П. Синтетические ингибиторы и природные антиоксиданты. 1. Действие ингибиторов свободнорадикальных реакций на антиокислителную активность липидов печени мышей. // Биофизика, 1965, т. 10, № 5, стр. 766-769.

27. Васильев Л.Л. Влияние атмосферных ионов на организм., Л., 1960

28. Велиханова Д.М., Каган В.Е., Биленко М.В. Липидное переокисление и повреждение оксигеназных систем со смешанной функцией в мембранахэндоплазматического ретикулума при ишемии печени. // Бюлл. эксп.биол. и мед., 1981 июль, т. 92, № 7, стр. 50-52.

29. Винер Р.И. Исследование механизма действия продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2 на функциональную активность цитохрома Р-450 в микросомах печени. // Дисс. на соискание ученой степени канд.биол.наук., М., 1987.

30. Владимиров Ю.А. Сверхслабое свечение при биохимических реакциях. М., "Наука", 1966.

31. Владимиров Ю.В. и Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов. М., "Наука", 1972.

32. Владимиров Ю.А., Оленев В .И., Суслова Т.Б., Потапенко А .Я. Механизм перекисного окисления липидов и его действие на биологические мембраны. // В кн.: "Биофизика", 1975, т. 5, стр. 56-117.

33. Владимиров Ю.А. и Шерстнев М.П. Хемилюминесценция животных клеток. М., ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Серия "Биофизика", 1989, т. 24.

34. Воейков В.Л. Научные основы новой биологической парадигмы. В кн.: "От эффекта Кирлиан к биоэлектрографии" П/р. К.Г. Короткова. С. П-б: Издательство "Ольга", 1998, стр. 282-308.

35. Воейков В.Л. Активный кислород, организованная вода и процессы жизнедеятельности. // Труды II Международного конгресса Слабые и сверхслабые излучения в биологии и медицине. Санкт-Петербург. 3-7 июля 2000, стр. 1-4.

36. Воейков В.Л. Благотворная роль активных форм кислорода. // Российский журн. гастроэнт., гепатол., колопрокт., 2001, т. XI, № 4, стр. 155-162.

37. Воейков В.Л. Био-физико-химические аспекты старения и долголетия. // Успехи геронтологии, 2002, Вып. 9, стр. 54-66.

38. Воейков В.Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах. // Дисс. на соискание ученой степени докт. биол. наук, М., 2003.

39. Воейков В .Л, Решетов П.Д., Набиев И.Р. и др. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов. Под. ред. акад. В.Т. Иванова. 1992, М., "Наука", 406 с.

40. Гамалея И.А. и Клыбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула. // Цитология, 1996, v. 38, № 12, pp. 1233-1247.

41. Гамрекели Д.В., Савов В.М., Степанова Л.И., Каган В.Е., Козлов Ю.П. Взаимосвязь ферментативных реакций гидроксилирования бензо(а)пирена и ПОЛ в микросомах печени. // Биол. науки, 1980, № 8, стр. 21-23.

42. Гейровский Я. и Кута Я. Основы полярографии. М., "Мир", 1965

43. Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства. /Коллективная монография./ Под ред. проф. Л.Д.Лукьяновой. М., "Наука", 1985.

44. Головенко Н.Я. Механизмы реакций метаболизма ксенобиотиков в биологических мембранах. Киев, "Наукова думка", 1981. 220 с.

45. Головенко HJL, Галкин Б.Н., Филиппова Т.О. Характеристика монооксигеназных систем иммунокомпетентных клеток. // Успехи соврем, биол., 1984, т. 97, № 2, стр. 268-278.

46. Голубев А.Г. Изнанка метаболизма. // Биохимия, т. 61, вып. 11, стр. 20182039,1996.

47. Гольдиггейн Н.И. Активные формы кислорода как жизненно необходимые компоненты воздушной среды. Биохимия, 2002, т. 67, вып. 2, стр. 194-204.

48. Гольдиггейн Н.И. Биофизические аспекты физиологической активности экзогенного супероксида. Дисс. докт. биол. наук. М., 2000.

49. Гриффит О. и Джост П. Липидные спиновые метки в биологических мембранах. // Метод спиновых меток (под ред. Берлинера Л.М.), М., "Мир", 1979, стр. 489-569.

50. Гуляева Л.Ф., Гуткина Н.И., Мишин В.М. Получение и характеристика множественных форм цитохрома Р-450 из микросом печени крыс линии Вистар, индуцированных метилхолантреном. // Биохимия, 1985 март, т.50, №3, стр. 390-400.

51. Гурвич А. А. Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии. Л., "Медицина", 1968.

52. Данилов B.C., Каган В.Е., Ситковский М.В., Козлов Ю.П. Изучение перекисного окисления липидов в норме и патологии методом полярографии. // Изв. АН СССР, сер. Биол., 1972, № 4, стр. 574-579.

53. Девиченский В.М., Альтерман М.А., Лихарева В.О. Доступность белков микросомальной мембраны для протеазы К. // Биохимия, 1979, т. 44, № 4, стр. 748-754.

54. Деев Л.И., Ахалая М.И., Василенко О.В., Платонов А.Г., Топчишвили Г.И. Влияние рентгена на уровень, состав и пара-нитроанизол-О-деметилазную активность цитохрома Р-450 микросом печени крыс. // Радиобиология, 1984, т. 24, №5, стр. 612-615.

55. Денисов Е.Т. Константы скорости гемолитических жидкофазных реакций. М., "Наука", 1971.

56. Де-Пьер Дж. и Дальнер Г. Выделение, субфракционирование и характеристика эндоплазматической сети. В кн.: Биохимическое исследование мембран, 1979, М., "Мир", стр. 75-124.

57. Донцов А.Е., Сакина Н.Л., Островский М.А. Противоположный эффект гранул липофусцина и меланосом из пигментного эпителия сетчатки глаза человека на фотоокисление кардиолипина. // Биофизика, 1999, т. 44, № 5, стр. 880-886.

58. Доскоч Я.Е., Яковлев А.Р., Тарусов Б.Н. Спонтанная сверх-слабая хемилюминесценция инбредных и гибридных лиий растений. // Биофиика, 1969, т. 14, № 3, стр. 561-564.

59. Дятловицкая Э.В., Петкова Д.К., Бергельсон Л.Д. Изучение зависимой от липидов активности цитохрома Р-450 микросом печени крысы при использовании фосфатидилхолинтранспотрного белка из печени быка. // Биохимия, 1982, т. 47, № 8, ч. 2, стр. 1145-1151.

60. Дятловицкая Э.В., Петкова Д.К., Леменовская А.Ф., Бергельсон Л.Д. Влияние фосфолипидов на дифференциальные спектры связывания цитохрома Р-450 микросом с субстратами.// Биохимия, 1984, т. 49, № 4, стр. 551-555.

61. Дятловицкая Э.В., Синицына Е.В., Леменовская А.Ф., Бергельсон Л.Д. Использование липидпереносящих белков для изучения липидной зависимости цитохрома Р-450 крыс. // Биохимия, 1978, т. 43, № 3, стр. 420423.

62. Дятловицкая Э.В., Янчевская Г.В., Бергельсон Л.Д. Молекулярные виды и мембраннообразующие свойства лецитинов в нормальной печени и гепатоме. // Биохимия 1974, т. 39, № 2, сгр. 132-149.

63. Елуашвили И.А., Пашинова Т.П., Богданова Е.Д., Каган В.Е., Прилипко Л.Л. Действие аминазина на ферментатиавное ПОЛ. // Бюлл. эксп.биол. и мед., 1977, т. 84, № 9, сгр. 323-326.

64. Елуашвили И.А., Прилипко Л.Л., Каган В.Е. Ферментативное перекисное окисление фосфолипидов и гидроксилирование аминазина в микросомальной фракции мозга. // Бюлл. эксп.биол. и мед., 1978, т. 86, № 10, стр. 432-434.

65. Елуашвили И.А., Прилипко Л.Л., Каган В.Е. Ферментативное ПОЛ и окислительный метаболизм аминазина в микросомальной фракции мозга. // Бюлл. Эксп. Биол. и мед., 1978, т. 86, № 10, стр. 432-434.

66. Журавлев А.И. Проблемы биолюминесценции. В кн.: Биолюминесценция. Труды МОИП, 1965, т. XXI, стр. 184-191.

67. Журавлев А.И. Развитие идей Б.Н.Тарусова о роли цепных процессов в биологии. // Труды МОИП, т. LVII, Отдел биологический, Секция биофизики и радиобиологии. М., "Наука", 1982. С. 36.

68. Журавлев А.И. Субстраты и механизмы эндогенной (химической) генерации возбужденных электронных состояний и сверхслабого свечения в тканях. В кн.: Сверхслабые свечения в биологии. Труды МОИП, 1972, т. XXXIX, стр. 17-32.

69. Зотова И.В., Затеке Д., Шыков Д.А., Сидоренко Б.А. Синтез NO и развитие атеросклероза. // Кардиология, 2002, т. 42, № 4, стр. 58-67.

70. Инюшин В.М. К вопросу о биологической активности красной радиации. Алма-Ата. 1965.

71. Кагава Я. Биомембраны (перевод с японского под ред. В.Е.Кагана). М., "Высшая школа", 1985.

72. Каган В.Е., Барыбина Г.В., Новиков К.Н. Перекисное окисление липидов и дегенерация фоторецепторов в сетчатке крыс при Е-авитаминозе. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1977, т. 83, № 4, стр. 411-413.

73. Каган В.Е., Котелевцев С.В., Козлов Ю.П. Роль ферментативного перекисного окисления в механизме разборки мембран эндоплазматического ретикулума печени in vivo. II Докл. АН СССР, 1974, т. 217, №1, стр. 213-216.

74. Каган В.Е., Ситковский М.В., Данилов B.C., Козлов Ю.П. Образование перекисей фосфолипидов мембранных структур и их роль в патогенезе опухолевого роста. // Доклады АН СССР, 1973, т. 208, № 3, стр. 733-735.

75. Каган В.Е., Шведова А.А., Новиков К.Н. Об участии фосфолипаз в «репарации» фоторецепторных мембран, подвергшихся перекисному окислению. // Биофизика, 1978, т. 23, № 2, стр. 279-283.

76. Каган В.Е., Шведова А.А., Новиков К.Н., Козлов Ю.П. Спонтанное и индуцированное автоокисление фосфолипидов при конформационных перестройках мембран наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. // Биофизика, 1975, т. 20, № 6, стр. 1043-1048.

77. Казначеев В.П. и Михайлова Л.П. Сверх-слабые излучения при межклеточных взаимодействиях. Новосибирск, "Наука", 1981.

78. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Менгазетдинов Д.Э., Мясоедова К.И., Жихарева В.О., Кузнецова Г.П., Арчаков А.И. Выделение и свойства цитохрома Р-450 из микросом печени кроликов. // Биохимия, 1979, т. 44, № б, стр. 1049-1057.

79. КарузинаИ.И., Вареница А.И., Арчаков А.И. Сравнительный ингибиторный анализ гидроксилирования анилина цитохромом Р-450 в НАДФН-,гидроперекись кумила-, Н2О2 зависимых системах. // Биохимия, 1983, т. 48, № 11, стр. 1788-1793.

80. Каценович Р.А. Гидроаэроионизация и гидроаэроионотерапия. Ташкент, "Медицина", 1966.

81. Ковалев И.Е. Иммунитет как функция системы организма, инактивирующей чужеродные химические соединения. // Хим.-Фармацевт. журн., 1977, № 12, стр. 3-12.

82. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М.,"Наука", 1985, 303 с.

83. Козлов Ю.П. Привитая сополимеризация как метод исследования свободных радикалов в биологических системах. М., Изд. МГУ, 1970.

84. Козлов Ю.П. Структурно-функциональные аспекты ПОЛ в биологических мембранах. В кн.: Липиды: структура, биосинтез, превращения и функции. М., "Наука", 1977, стр. 80-93.

85. Козлов Ю.П., Данилов B.C., Каган В.Е., Ситковский М.В. Свободнорадикальное окисление липидов в биологических мембранах. М., Изд-во МГУ, 1972.

86. Кондрашова М.Н. Структурно-кинетическая организация цикла трикарбоновых кислот в активно функционирующих митохондриях. // Биофизика, 1989, т. 34, № 3, стр. 450-458.

87. Королев А.А., Богданов М.В., Королев Ал.А., Никитенко Е.И. Медицинская экология. Курс практических занятий: Учебное пособие для студентов медицинсих институтов. М., "Русский врач", 2003.

88. Котелевцев С.В. Функциональный отклик мембранных структур клеток животных на воздействие антропогенных факторов окружающей среды. // Автореферат дисс. на соискание ученой степени докт.биол.наук., М., 1997.

89. Котелевцев С.В., Козлов Ю.П., Степанова Л.И. Эколого-токсикологический контроль за состоянием окружающей среды методами физико-химической биологии. // Биол. науки, 1986, №1, стр. 19-30.

90. Котелевцев С.В., Стволинский С. Л., Бейм А.М. Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран. М., Изд-во МГУ, 1986.

91. Кочергинский Н.М. Каган В.Е., Новиков К.Н., Давыдов P.M. О возможности регуляции мембранами фоторецепторов кинетики неферментативных реакций. // studia biophysica, Berlin, 1976, Band 58, Heft 1, S. 43-50.

92. Кребс E.M. Липиды клеточных мембран. Л., 1981.

93. Кузин А. М. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М., "Наука", 1995, 158 с.

94. Кузин А. М. Электромагнитная информация в феномене жизни. // Биофизика, 2000, т. 41, стр. 144-147.

95. Ланкин В.З. Ферментативная регуляция метаболизма липопероксидов и структурно-функциональные перестройки биомембран в норме и при патологических состояниях. // Автореферат дисс. на соискание ученой степени докт.биол.наук., М., 1985.

96. Ланкин В.З., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбатзависимого переокисления липидов тканей при помощи теста с 2-тиобарбитуровой кислотой. // Труды МОИП, 1975, т. LII, сгр. 73-78.

97. Ленинджер А. Митохондрия. М., "Мир", 1966.

98. Лукьянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М., "Наука", 1982,299 с.

99. Ляхович В.В. и Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. Новосибирск, "Наука", 1981.

100. Мак-Коннел Г. Молекулярное движение в биологических мембранах. // Метод спиновых меток (под ред. Берлинера Л.М.), М., "Мир", 1979, стр. 570607.

101. Маянский А.Н. и Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск, 1989.

102. Маянский А.Н. Кондиционирование нейтрофила. // Успехи совр. биол., 1990, т. 109, № 1, cip. 90-105.

103. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс, профилактика. М., 1981.

104. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами. М., Наука, 1982, 255 с

105. Мишин В.М. и Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. Новосибирск, "Наука", 1985. 180 с.

106. Навратил М., Кадлец К., Даум С. Патофизиология дыхания. М., "Медицина", 1967.

107. Новиков К.Н. Свободнорадикальное окисление липидов в фоторецепторных мембранах сетчатки лягушки. // Дисс. на соискание ученой степени канд.биол.наук, М., 1975.

108. Новиков К.Н. Перекисное окисление липидов в гепатоцитах. // В кн.: Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства. Москва, "Наука", 1985 (гл. 6, стр. 146-169).

109. Новиков К.Н., Винер Р.И., Дудченко A.M., Уголев А.Т., Лукьянова Л.Д., Каган В.Е. Продукты гидроксилирования гидрофобных ксенобиотиков -стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1984, т. 98, № 9, стр. 294-296.

110. Новиков К.Н., Дудченко A.M., Уголев А.Т., Кузнецова З.И., Лукьянова Л.Д., Каган В.Е. Антиоксиданты как стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах. // Бюлл. эксп. биол. мед., 1983, т. 96, N 11, стр. 50-52.

111. Новиков К.Н., Каган В.Е., Шведова А.А., Козлов Ю.П. Белок-липидные взаимодействия при перекисном окислении липидов в фоторецепторной мембране. // Биофизика, 1975, т. 20, № 6, стр. 1039-1042.

112. Новиков К.Н., Шведова А.А., Каган В.Е., Козлов Ю.П.,.Островский М.А. Изучение фотоиндуцированных изменений в фоторецепторной мембране и родопсине методом привитой сополимиризации. // Биофизика, 1974, т. 19, № 2, стр. 280-284.

113. Одум Ю. Экология. М., "Мир", 1986.

114. Осипов А.Н., Савов В.М., Зубарев В.Е., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Участие железа в образовании ОН-радикалов в системе, генерирующей супероксид анион-радикал. // Биофизика, 1981, т.26, № 2, стр. 193-197.

115. Островский М.А., Федорович И.Б., Донцов А.Е. Фотоокислительные процессы в структурах глаза. Защитная функция хрусталика и экранирующих пигментов. // Биофизика, 1987,, т. 32, № 5, стр. 896-909.

116. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. М., "Медицина", 1973.

117. Перелыгин В.В. и Тарусов Б.Н. Вспышка сверх-слабого излучения при повреждении живой ткани. // Биофизика, 1966, т. 11, № 3, стр. 539-541.

118. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М., Изд-во МГУ, 1980. 150 с.

119. Рид С. Возбужденные электронные состояния в химии и биологии. Изд-во иностранной литературы. М., 1960.

120. Риль Н. Миграция энергии (Новый вид передачи энергии в мертвой и живой материи). ОГИЗ. Государственное изд-во технико-теоретической литературы. М.-Л., 1948.

121. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы. М., "Мир", 1967.

122. Саакян И.Р., Гогвадзе В.Г., Сирота Т.В., Ставровская И.Г., Кондрашева М.Н. Физиологическая активация пероксидации отрицательными аэроионами. // Биофизика, 1998, т. 43, № 4, стр.580-587.

123. Самуилов В.Д., Безряднов Д.В., Гусев М.В., Киташов А.В., Федоренко Т.А. Перекись водорода ингибирует фотосинтетический транспорт электронов в клетках цианобактерий. // Биохимия, 2001, т. 66, № 6, стр. 640-645.

124. Сверхслабая люминесценция в биологии. Сборник МОИП. т. XXXIXX. Гл. ред. А.И.Журавлев. М., "Наука", 1972,272 с.

125. Семенов Н.Н. Наука и общество. М., "Наука", 1981, с. 365.

126. Семенов Н.Н. Цепные реакции. М., "Наука", 1986.

127. Сидоров B.C. Экологическая биохимия рыб . Липиды. Л., "Наука", 1983, 240 с.

128. Скулачев В.П. Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. М., Из-во АН СССР, 1962, 152 с.

129. Скулачев В.П. Энергетические механизмы внутриклеточного дыхания. М., "Наука", 1971,184 с.

130. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М.,"Высшая школа", 1989,271 с.

131. Скулачев В.П. Кислород и явления запрограмированной смерти (Первое Северинское чтение, прочитано 21 декабря 1999г.). М., 2000,47 с.

132. Старостин А.В., Федорович И.Б., Островский М.А. Сенсибилизированное ретиналем фотоокисление родопсина. // Биофизика, 1985, т. 30, № 6, стр. 995999.

133. Тарусов Б.Н. Основы биологического действия радиоактивных излучений. // Медгиз, М., 1954.

134. Тарусов Б.Н. Первичные физико-химические механизмы радиационного поражения. // Радиобиология, 1967, т. 7, № 5, стр. 670-677.

135. Тарусов Б.Н. Сверхслабое свечение живых организмов. 1972, М., "Знание".

136. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Сверхслабое свечение биологических систем. 1967, М., Изд-во МГУ, 70 с.

137. Тарусов Б.Н., Козлов Ю.П., Уртиле С., Чоу Ю.Т. Свободнорадикальные процессы в облученных гомогенатах тканей животных. // Докл. АН СССР, 1965, т. 163, № 3, стр.752-753.

138. Тарусов Б.Н., Поливода А.И., Журавлев А.И. Изучение сверхслабой спонтанной люминесценции животных клеток. // Биофизика, 1961, т. 6, стр. 490-492.

139. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов. // Биохимия, 2002, т. 67, № 3, стр. 281-292.

140. Тюрин В.А., Корчагин В.П., Шуколюков С.А., Федосов Ю.В. Температурное обесцвечивание родопсинов рыбы Theragra chalcogramma и быка. // Ж. эволюц. биох. физиол., 1977, т.13, № 1, стр. 18-23.

141. Уайт А., Хэндлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. М., "Мир", 1981, стр. 521-523.

142. Федоров В.Д. и Гильманов Т.Г. Экология. Изд-во МГУ, 1980. 464 с.

143. Хакачка П. и Семеро Дж. Стратегия биохимичесой адаптации. М., "Мир", 1977.

144. Хиншельвуд С. Н. Возможная роль цепных реакций в химии клетки. В кн: Химическая кинетика и цепные реакции. Отв. ред. В.Н. Кондратьев. 1996, М., "Наука", с. 518.

145. Цырлов И.Б., Часовникова О.В., Гришанова В.В., Ляхович В.В. Биосинтез в печени крысы общей формы монооксигеназы, индуцированной ксенобиотиками метилхолантренового ряда. // Биохимия, 1986, т. 51. № 4, стр. 579-589

146. Цырлова И.Г., Козлов В.А., Цырлов И.Б. Экспериментальная модель для изучения участия клеток костного мозга в образовании антител. // Цитология, 1986, т. 28, № 1, стр. 102-106.

147. Челомин В.П., Светашев В.И., Шуколюков С.А. Липидный состав наружных сегментов палочек сетчатки минтая . В сб.: Механизмы сенсорной рецепции ( Материалы III Всесоюзного симпозиума , 17-19 мая 1976г., Пущино). Л., 1977, стр. 132-137.

148. Челомин В.П., Светашев В.И., Шуколюков С.А., Чижевич Е.П., Тюрин В.А. Жирнокислотный состав фосфолипидов фоторецепторов минтая. // Ж. эвол. биохим. физиол., 1978, т. 3, стр. 322-326.

149. Чижевский А. Л. Аэроионификация в народном хозяйстве. М., "Госпланиздат", 1960, 758 с.

150. Чижевский А.Л. Аэроионы и жизнь. М. "Мысль", 1999.

151. Чижевский А.Л. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. 1980. Новосибирск: "Наука", Сиб. отделение. 177 с.

152. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников JI.M., Захаров И.В., Вичутинский А.А., Цепалов В.Ф. // Хемилюминсцентные методы исследования медленных химических процессов. М., «Наука», 1966.

153. Шульцман Ф.М., Петрусевич Ю.М., Тарусов Б.Н. Циркадные ритмы сверхслабой хемилюминесценции корней боба. // Биофизика, 1976, т. 21, № 4, стр. 688-691.

154. Щепеткин И.А., Удут В.В., Карпов А.Б. Влияние излучения He-Ne лазера на хемилюминесценцию нейтрофилов человека. // Радиобиология, 1993, т. 33, № 3, стр. 377-382.

155. Этингоф Р.Н. О биохимических основах рецепции света. // Успехи современной биологии, 1967, т. 67, № 3/6/, стр. 425-443.

156. Abaitey А.К. and Parratt J.R. Cardiovascular effects of diethylcarbamazine citrate. // Br. J. Pharmacol. 1976 Feb, v. 56, № 2, pp. 219-227.

157. Abrahamson E.W. and Fager R.S. The chemistry of vertebrate and invertebrate visual photoreceptors. // Curr. Top. Bioenerg., 1973, v. 5, pp. 125-200.

158. Abrahamson E.W., Fager R.S., Mason W.T. Comparative properties of vertebrate and invertebrate photoreceptors. // Exp. Eye Res., 1974 Jan, v. 18, № 1, pp. 51-67.

159. Adam, W., Baader, W.J., Cilento, G. Enols of aldehydes in the peroxidase/oxidase-promoted generation of excited triplet species. // Biochem. Biophys. Acta, 1986 May 2, v. 881, № 3, pp. 330-336.

160. Adams R.G. Effect of light on extraction of lipid from retinal rods. // Lipids Res., 1967, v. 8, № 3, pp. 245-248.

161. Ahakes J.T., Pelkonen O., Karki N.T. Characterization of benzo(a)pyrene hydroxylase of trout liver. // Cancer Res., 1977 Oct., v. 37, № 10, pp. 3737-3343.

162. Alekseev S.L. Formation of paramagnetic centres in rhodopsin extracts and in outer segments. // StBiophys., 1974, B.43, № 3, S. 193-199.

163. Ali M.A. Temperature and vision.// Rev. Can. Biol. 1975 Sep., v. 34, №3, pp.131-177.

164. Allen C.M., Hockin L.J., Paine A.J. The control of glutathione and cytochrome P-450 concentrations of primary cultures of rat hepatocytes. // Biochem. Pharmacol., 1981 Oct. 1, v. 30, № 19, pp. 2739-2742.

165. Allen R.C. Phagocytic leucocyte oxygenation activities and chemiluminescence: A kinetic approach to analysis. // Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence, 1986, v. 133, pp. 449-493.

166. Allen R.G. and Balin A.K. Oxidative influence on development and differentiation: an overview of a free radical theory of development. // Free Radic. Biol. Med., 1989, v. 6, № 6, pp. 631-661.

167. Allen R.G. and Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. // Free Radic Biol Med., 2000, v. 28, № 3, pp. 463-499.

168. Allred C.D., Margetts J., Hill H.R. Luminol-induced neutrophil chemiluminescence. // Biochim. Biophys. Acta (General Subjects), 1980, v. 631, pp. 380-385.

169. Amemiya T. Effect of vitamin E administration on photoreceptor outer segment and retinal pigment epithelium of vitamin E deficient rats. // Int. J. Vitam. Nutr. Res., 1981, v. 51, №2, pp.114-118.

170. Ames B.N. The detection of chemical mutagens with enteric bacteria. In: Chemical mutagens: Princeples and Methods for their Detection. Ed. Holaender A., v. 1, N.Y., Plenum Press, 1971, pp. 267-282.

171. Ames B.N., Lee F.D., Durston W.E. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, pp. 782-786.

172. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen Т. M. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, pp. 7915-7922.

173. Anderson N.G. The mass isolation of whole cells from rat liver. // Science, 1953, v. 117, № 3040, pp. 627-628.

174. Anderson R.E. and Maude M.B. Lipids of ocular tissues. 8. The effects of essential fatty acid deficiency on the phospholipids of the photoreceptor membranes of rat retina. // Arch. Biochem. Biophys., 1972 Jul., v. 151, № 1, pp. 270-276.

175. Anderson R.E. and Risk M. Lipids of ocular tissues. IX. The phospholipids of frog photoreceptor membranes. Vision Res., 1974 Jan, v. 14, № 1, pp. 129-131.

176. Anderson R.E. and Sperling L. Lipids of ocular tissues. YII. Posionnal distribution of the fatty acids in the phospholipids of bovine retins rod outer segments. // Arch. Biochem. Biophys., 1971, v. 144, № 2, pp. 673-677.

177. Anderson R.E., Benolken R.M., Dudley P.A., Landis D.J., Wheeler T.G. Polyunsaturated fatty acids of photoreceptor membranes. // Exp. Eye Res., 1974 Mar, v. 18, № 3, pp. 205-213.

178. Armstrong D., Santangelo G., Connole E. The distribution of peroxide regulating enzymes in the canine eye. // Curr. Eye Res., 1981, v. 1, № 4, pp. 225-242

179. Babior B.M. NADPH Oxidase: An Update. // Blood, 1999 March 1, v. 93, № 5, pp. 1464-1476.

180. Babior B.M., Kipnes R.S., Cumitte J.T. Biological defense mechanisms: the production by leucocytes of superoxide, a potential antibactericidal agent. // J. Clin. Invest., 1973, v. 52, № 3, pp. 741-744.

181. Bacchiocchi C. and Zannoni C. Energy Transfer in condensed systems. The effect of phase organization. // Chem. Phys. Lett., 1997, v. 268, № 5-6, pp. 541548.

182. Bailey G., Selivonchick D., Hendricks J. Initiation, promotion, and inhibition of carcinogenesis in rainbow trout. // Environ. Health Perspect., 1987 Apr., v. 71, pp. 147-153.

183. Baird M.B. and Hough J.L. Phospholipase A2 catalyzed conversion of hepatic cytochrome P-450 to P-420 in microsomal membranes prepared from young and old rats. // Age, 1987, v. 10, № 3, pp. 90-95.

184. Beckett A.H., Van Dyk J.M., Chissick H.M., Gorrod J.W. Metabolism of amphetamines to oximes as a route to deamination. // J. Pharm. Pharmacol. 1971 Jul., v. 23, № 7, p. 560.

185. Beckman K.B. and Ames, B.N. The Free Radical Theory of Aging Matures. // Physiol. Rev., 1998 Apr., v. 78, № 2, pp. 547-581.

186. Bend J.R., Pohl R.J., Fouts J.R. Further studies of microsomal mixed-function oxidase system of the little skate (.Raja erinacea), including its response to some xenobiotics. // Bui. Mount Desert Island Biol. Lab., 1973, v. 13, pp. 9-13.

187. Berg van den J.J.M., Op den Camp J.J.F., Lubin B.H., Kuypers F.A. Conformational changes in oxidized phospholipids and their preferential hydrolysis by phospholipase A2: a monolayer study. // Biochemistry May 11, 1993, v. 32, № 18, pp. 4962-4967.

188. Bernheim F., Bernheim M.L.C., Wilbur K.M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipids. // J. Biol. Chem., 1948, v. 174, № 1, pp. 257-264.

189. Bidlack W.R. and Tappel A.L. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation. // Lipids, 1973 Apr, v. 8, № 4, pp. 203-207.

190. Bingham E. Global pollution. // Toxicol. Ind. Health., 1991 Sep.-Nov., v. 7, № 5-6,31-33.

191. Bjornstad P. Phospholipase activity in rat-liver microsomes studied by the use of endogenous substrates. // Biochim. Biophys. Acta, 1966 Jun 1, v.l 16, № 3, pp. 500510.

192. Black C. D. V., Samuni A.,. Cook J. A, Krishna C.M., Kaufman D.C., Malech H.L., Russo A. Kinetics of superoxide production by stimulated neutrophils. // Arch. Biochem. Biophys., 1991, v. 286, № 1, pp. 126-131.

193. Blasie J.K. Net electric charge on photopigment molecules and frog retinal receptor disk membrane structure. // Biophys. J. 1972 Feb, v. 12, № 2, pp. 205-213.

194. Blasie J.K. The location of photopigment molecules in the cross-section of frog retinal receptor disk membranes. // Biophys. J., 1972 Feb, v. 12, № 2, pp. 191-204.

195. Blum J. and Fridovich I. Superoxide, hydrogen peroxide, and oxygen toxicity in two free-living nematode species. // Arch. Biochem. Biophys., 1983 Apr. 1, v. 222, № 1, pp. 35-43.

196. Bochev B. G., Magrisso M. J., Bochev P. G., Markova V. I., Alexandrova M. L. Dependence of whole blood luminol chemiluminescence on PMNL and RBC count. // J. Biochem. Biophys. Methods, 1993, v. 27, № 4, pp. 301-309.

197. Bolland J.L., Koch H.P. The course of autooxidation reactions in polyisoprenes and allied compounds. Part IX. The primary thermal oxidation products of ethyl linoleate. // J. Chem. Soc., 1945, v. 7, pp. 445-447.

198. Boobis A.R., Kahn G.C., Whyte C., Brodis M. J., Davies D.S. Biphasic O-deethylation of phenacetin and 7-ethoxycoumarin by human and rat liver microsomal fractions. //Biochem. Pharmacol., 1981, v. 30, № 17, pp. 2451-2456.

199. Borggreven J.M., Daemen F.J., Bonting S.L. Biochemical aspects of the visual process. VI. The lipid composition of native and hexane-extracted cattle rod outer segments. // Biochim. Biophys. Acta, 1970 Mar 10, v. 202, № 2, pp. 374-381.

200. Bors W., Saran M., Lengfelder E., Mishel C., Fuchs C., Frenzel C. Detection of oxygen radicals in biological reactions. // Photochem. Photobiol., 1978 Oct.-Nov., v. 28, № 4-5, pp. 629-638.

201. Boveris A., Cadenas E., Stopanni A.O. Role of ubiquinone in the mitochondrial generation of hydrogen peroxide. // Biochem. J. May 15, 1976, v. 156, № 2 , pp. 435-444.

202. Boveris A. and Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. // Biochem. J., 1973 Jul., v. 134, № 3, pp. 707-716.

203. Bownds D., Gordon-Walker A., Gaide-Huguenia A.C., Robinson W. Characterisation and analysis of frog photoreceptor membranes. // J. Gen. Phyic., 1971, v. 58, № 3, pp. 225-237.

204. Boyer P.D. Biological oxidation. Ed. T.P.Singer. N.Y., J.Willey, 1967.

205. Boyum A. Isolation of granulocyte cells and lymphocytes from human blood. A two-phase system for removal of red cells with methylcellulose as erythrocyte-aggregating agent. // Scand. J. Lab. Invest., 1968, v. 21, suppl. 97, pp. 77-98.

206. Branster M.V. and Morton R.K. Isolation of intact cells. // Nature, 1957, v. 180, №4597, pp. 1283-1284.

207. Brown E.R., Hazdra J.J., Keith L., Greenspan I., Kwapinski J.B., Beamer P. Frequency of fish tumors found in a polluted watershed as compared to nonpolluted Canadian waters. // Cancer Res., 1973 Feb., v. 33, № 2, pp. 189-198.

208. Buhler D.R. and Rasmusson M.E. The oxidation of drugs by fishes. Сотр. Biochem. Physiol. 1968 Apr. v. 25, № 1, pp. 223-239.

209. Burke M.D., Mayer R.L., Kouri R.E. 3-methylcholanthrene-induced monooxygenase (O-deethylation) activity of human lymphocytes. // Cancer Res., 1977 Feb., v. 37, № 2, pp. 460-463.

210. Burlakova E.B., Krashakov S.A., Khrapova N.G. The role of tocopherols in biomembrane lipid peroxidation. // Membr. Cell Biol., 1998, v. 12, № 2, pp. 173211.

211. Burlakova E.B., Molochkina E.M., Palmina N.P. Role of membrane lipid oxidation in control of enzymatic activity in normal and cancer cells. // Adv Enzyme Regul., 1980, v. 18, pp. 163-179.

212. Campbell A. C., Chemiluminescence. Principles and Applications in Biology and Medicine, Ellis Horwood Ltd., Chichester, 1988, 337 p.

213. Carpenter M.P. Antioxidant effects on the prostaglandin endoperoxide synthetase product profile. // Federat. Proc., 1981 Feb., v. 40, № 2, pp. 189-194.

214. Chambers J.E. and Yarbrough A. Xenobiotic biotransformation systems in fishes.

215. Review. // Сотр. Biochem. Physiol. C. 1976, v. 55, № 2, pp. 77-84.

216. Chance В., Schoener В., Oshino R., Itshak F., Nakase Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. // J. Biol. Chem., 1979 Jun. 10, v. 254, № 11, pp. 4764-4771.

217. Chance B. and Williams G.R. Respiratory chain and oxidative phosphorylation. In: Advances in Enzymology. N.Y., Interscience Publishers Inc. 1956, v. 17, p. 65.

218. Chida M., Suzuki K., Nakanishi-Ueda Т., Ueda Т., Yasuhara H., Koide R., Armstrong D. In vitro testing of antioxidants and biochemical end-points in bovine retinal tissue. // Ophthalmic. Res., 1999, v. 31, № 66 pp. 407-415.

219. Cilento G and Adam W. From free radicals to electronically excited species. // Free Radic. Biol. Med., 1995 Jul., v. 19, № 1, pp. 103-114.

220. Cilento G. Excited electronic states in dark biological processes. // Quart. Rev. Biophys., 1973, v. 6, pp. 485-501.

221. Cilento G. Dioxetanes as intermediates in biological processes. // J. Theor. Biol., 1975 Dec., v. 55, № 2, pp. 471-479.

222. Cilento G. Photobiochemistiy without light. // Experientia, 1988 Jul. 15, v. 44, № 7, pp. 572-576.

223. Cilento G. and Adam W. From free radicals to electronically excited species. // Free Radic. Biol. Med., 1995 Jul., v. 19, № 1, pp. 103-114.

224. Cilento G. and Adam W. Photochemistry and photobiology without light. // Photochem. Photobiol., 1988 Sep., v. 48, № 3, pp. 361-368.

225. Clark R. A. The human neutrophil respiratory burst oxidase. // J. Infect. Dis., 1990 Jun., v. 161, № 6, pp. 1140-1147. Review.

226. Cohen G. and Coderbaum A.I. Microsomal metabolism of hydroxyl radical scavenging agents: relationship to the microsomal oxidation of alcohols. // Arch. Biochem. and Biophys., 1980, v.199, № 2, pp. 438-447.

227. Cohen M.S., Shirley P.S., DeChatelet L.R. Further evaluation of luminol-enhanced luminescence in the diagnosis of disorders of leukocyte oxidative metabolism: role of myeloperoxidase. // Clin Chem., 1983, v. 29, № 3, pp. 513-515.

228. Comporti M. and Benedetti A. Carbon tetrachloride induced peroxidation of liver lipids in vitamin E pretreated rats. // Biochem. Pharmacol., 1972 Feb., v. 1, v. 21, №3, pp. 418-420.

229. Conney A.H. Induction of microsomal cytochrome P-450 enzymes: the first Bernard B. Brodie lecture at Pennsylvania State University. Review. // Life Sci., 1986 Dec 29, v. 39 № 26, pp. 2493-2518.

230. Corbett M.D. and Corbett B.R. Nucleic acid binding of arylamines during the respiratory burst of human granulocytes. // Chem. Res. Toxicol., 1988 Nov.-Dec., v. 1, № 6, pp. 356-363.

231. Daemen F.J.M. Vertebrate rod outer segment membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 300, № 3, pp. 255-288.

232. Dalton D.A. Effects of paraquat on the oxygen free radical biology of soybean root nodules. // Bull. Environ. Contain .Toxicol., 1992 May, v. 48, № 5, pp. 721726.

233. Delmelle M. Retinal damage by light: possible implication of singlet oxygen. // Biophys. Struct. Mech., 1977 Jun. 29, v. 3, № 2, pp. 195-198.

234. Di Augustine R.P. and Fouts J.R. The effects of unsaturated fatty acids on hepatic microsomal drug metabolism and cytochrome P-450. // Biochem J., 1969 Nov, v. 115, № 3, pp.547-554.

235. Dillon J. The photophysics and photobiology of the eye. // J. Photochem. Photobiol. B, 1991 Jul., v. 10, № 1-2, pp. 23-40.

236. Dix T.A. and Marnett L.J. Free radical epoxidation on 7,8-dihydrobenzo(a)pyrene by hematin and polyunsaturated fatty acid hydroperoxides. // J. Amer. Chem. Soc., 1981, v. 103, № 22, pp. 6744-6746.

237. Elshourbagu N.A., Guzelian P.S. Separation, purification, and characterization of a novel form of hepatic cytochrome P-450 from rats treated with pregnenolone-16 alpha-carbonitrile. // J. Biol. Chem. 1980 Feb. 25, v. 255, № 4, pp.1279-1285.

238. Elstner E.F. and Heupel A. Involvement of the superoxide free radical ion in photosynthetic oxygen reduction. // Z. Naturforsch. C., 1974 Sep-Oct., H 29C(9-10), S. 559-563.

239. Emmons W.D.J. Preparation and properties of oxiziranes. // J.Amer.Chem.Soc., 1957, v. 79, № 21, pp. 5739-5754.

240. Ermak G. and Davies K.J. Calcium and oxidative stress: from cell signaling to cell death. // Mol. Immunol., 2002 Feb., v. 38, № 10, pp. 713-721.

241. Ernster L. and Lindberg O. Animal mitochondria. // Annual Review of Physiology, 1958, v. 20, p. 13.

242. Eshourbagu N.A. and Guselian P.S. Separation, Purification, and characterization of a novel form of hepatic cytochrome P-450 from rats treated with pregnolone-16a-carbonitrite. // J. Biol. Chem., 1980, v. 225, № 4, pp. 1279-1285.

243. Estabrook R.W. and Werringloer J. The oxygen sensing characteristics of microsomal enzymes. // Adv. Exp. Med. Biol., 1977, v. 78, pp.19-35.

244. Eyring H. The activated complex in chemical reactions. // J. Chem. Phys., 1935, v. 3, pp. 778-785

245. Farnsworth C.C. and Dratz E.A. Oxidative damage of retinal rod outer segment membranes and the role of vitamin E. // Biochim. Biophys. Acta, 1976 Sep 7, v. 443, № 3, pp. 556-570.

246. Folch J., Lees M., Stanley A.H.S., Hoath S.A., Le Bason F.N. Properties of lipid extracts from brain tissues. // J. Biol. Chem., 1951, v. 191, v. 2, pp. 883-891.

247. Fong K.-L., McCay P.B., Poyer J.L., Koele B.B., Misra H. Evidence that peroxidation of lysosomal membranes is initiated by hydroxyl free radicals produced during flavin enzyme activity.// J. Biol. Chem., 1973 Nov. 25, v. 248, № 22, pp. 7792-7797.

248. Foot C.S. Photosensitized oxidation and singlet oxygen. Biological consequences. In: Free Radicals in Biology., 1976, Vol. 2, Ch. 3, New York: Pergamon Press, pp. 85-133.

249. Ford-Hutchinson A.W. Leukotrienes: their formation and role as inflammatory mediators. // Fed. Proc., 1985 Jan., v. 44, № 1, Pt. 1, pp. 25-29. Review.

250. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutase. // Account. Chem. Res., 1972, v. 5, № 10, pp. 321-326.

251. Fridovich I. Superoxide and evolution. // Horiz. Biochem. Biophys., 1974, v. 1, pp. 1-37.

252. Fridovich I. Superoxide dismutases. // Adv. Enzymol., 1974, v. 41, pp. 35-48.

253. Fridovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what's the matter with oxygen? // Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999, v. 893, №, pp. 13-18.

254. Fried R. and Mandel P. Superoxide dismutase of mammalian nervous system. //J. Neurochem., 1975 Mar., v. 24, № 3, pp. 433-438.

255. Fujii H., Yonetani Т., Miki Т., Kakinuma K. Modulation of the heme environment of neutrophil cytochrome b558 to a "cytochrome P450-like" structure by pyridine. // J. Biol. Chem., 1995 Feb. 17, v. 270, № 7, pp. 3193-3196.

256. Fukami J., Shishido Т., Fukunaga K., Casida J.E. Oxidative metabolism of rotenone in mammals, fishes and insects and its relation to selective toxity. // J. Agric. Food Chem., 1969, v. 17, № 6, pp. 1199-1203.

257. Fung B.K., Hurley J.B., Stryer L. Flow of information in the light-triggered cyclic nucleotide cascade of vision. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981 Jan., v. 78, № 1,152-156

258. Furukawa K., Tengler R., Nakamura M., Urwyler A., de Week A.L., Kanegasaki S., Maly F.E. В lymphoblasts show oxidase activity in response to cross-linking of surface IgM and HLA-DR. // Scand. J. Immunol., 1992 May, v. 35, № 56 pp. 561567.

259. Galantsev V. P., Kovalenko S. G., Moltchanov A. A., Prutskov V. I. Lipid peroxidation, low-level chemiluminescence and regulation of secretion in the mammary gland. // Experientia, 1993, v. 49, №10, pp. 870-875.

260. Ganey P.E., Sirois J.E., Denison M., Robinson J.P., Roth R.A. Neutrophil function after exposure to polychlorinated biphenyls in vitro. // Environ. Health Perspect., 1993 Oct., v. 101, № 5, pp. 430-434.

261. Gerhart E.H. and Carlson R.M. Hepatic mixed-function oxidase activity in rainbow trout exposed to several polycyclic aromatic compounds. // Environ. Res., 1978 Oct, v.17, № 2, pp. 284-295.

262. Gennis R.B. Biomembranes. Molecular Structure and Function. In: Springer Advanced Texts in Chemistry. Series Editor: C.R.Cantor, Springer-Verlag (N.-Y., Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo), 1989, pp. 176,192.

263. Gesenius H. Ober die Gur witschstrahlung menschlichen Blutes und ihre Beteutung fiir die Carcinomdiagnostic. // Biochim. Ztschr., 1930, Bd. 226, S. 257272.

264. Gil L., Vasquer H., Orellana M., Selkick J., Wold F., Strobel H. Purification and characterization of liver cytochrome P-446 isolated from protein energy malnourished rats. // Mol. Cell Biochem., 1988 Jan, v. 79, № 1, pp. 5-16.

265. Giusto N.M., Pasquare S.J., Salvador G.A., Castagnet P.I., Roque M.E., Ilincheta de Boschero M.G. Lipid metabolism in vertebrate retinal rod outer segments. // Prog. Lipid Res., 2000 Jul, v. 39, № 4, pp. 315-391

266. Glende E.A. Jr. Carbon tetrachloride-induced protection against carbon tetrachloride toxicity. The role of the liver microsomal drug-metabolizing system. // Biochem. Pharmacol., 1972 Jun. 15, v. 21, № 12, pp. 1697-1702.

267. Goeptar A. R., Scheerens H., Vermeulen N. P. Oxygen and xenobiotic reductase activities of cytochrome P450. // Crit. Rev. Toxicol., 1995, v. 25, pp. 25-65.

268. Goldhaber J.I. and Weiss J.N. Oxygen free radicals and cardiac reperfusion abnormalities. // Hypertension, 1992 Jul., v. 20, № 1, pp. 118-127.

269. Goldstein N.I. and Arshavskaya T.V. Is atmospheric superoxide vitally necessary? Accelerated death of animals in a quasi-neutral electric atmosphere. // Z. Naturforsch. C., 1997, H. 52, N 5-6, pp. 396-404.

270. Goldstein N.I., Goldstein R.H., Merzlyak M.N. Negative air ions as a source of superoxide. // Int. J. Biometeorol., 1992, v. 36, pp. 118-122.

271. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. // J. Biol. Chem., 1949, v. 177, № 2, pp. 751-756.

272. Governa M., Valentino M., Visona I. Chemotactic activity of human polymorphonuclear leukocytes and industrial xenobiotics: a brief review. // Toxicology, 1994 Jul. 1, v. 91, № 2, pp. 165-177.

273. Grady F.J. and Borg D.C. Light-induced free radicals of retinal, retinol, and rhodopsin. // Biochemistry, 1968, v. 7, № 2, pp. 675-682.

274. Green D.E. and Hatefi Y. Mitochondrian and biochemical machines. // Science, 1961 Jan. 6, v. 133, № 3445, pp. 13-19.

275. Green D.E. Electron transport and oxidative phosphorylations. In: Advances in Enzymology, N.Y., Interscience Publishers Inc., 1959, v. 21, p. 73.

276. Gresele P., Arnout J., Vermylen J. Dipyridamole inhibits leukotriene B4 synthesis. // Thromb. Haemost., 1987 Apr. 7, v. 57, № 2, p. 235.

277. Guajardo M., Terrasa A., Catala A. The effect of alpha tocopherol, all-trans retinol and retinyl palmitate on the non enzymatic lipid peroxidation of rod outer segments. // Mol. Cell Biochem., 1999 Jul., v. 197, № 1-26 pp. 173-178.

278. Guengerich F.P. Comparisons of catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily enzymes from different species. // Chem. Biol. Interact., 1997 Oct., v. 106, №3, pp. 161-182.

279. Guillery H. Uber Bedingungen des Wachstums auf Grund von Untersuchungen an Gewebskulturen. // Virchows Archiv., 1929, Bd. 270, S. 311.

280. Gunstone F.D. An introduction to the chemistry and biochemistry of fatty acids and their glycerides. London, 1967.

281. Gurwitsch A. Die mitogenetische Strachlung. Berlin, Springer, 1932.

282. Gurwitsch A. Physikalisches uber mitogenetischen Strahlen. // Arch. Entwicklungsmech., 1924, Bd. 103, H. 3/4, S. 490-498.

283. Habig W., Pabst M., Jacoby W.B. Glutation S-transferases. First enzymic step in mercapturic acid formation. // J. Biol. Chem., 1974, v. 249, № 22, pp. 7130-7139.

284. Hall M.O. and Hall D.O. Superoxide dismutase of bovine and frog rod outer segments. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975 Dec 1, v. 67, № 3, pp. 11991204.

285. Halliwell B. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron chelates: is it a mechanism for hydroxyl radical production in biochemical systems? // FEBS Lett. 1978, Aug. 15, v. 92, № 2, pp. 321-326.

286. Harman D. Aging: A theory based on free radical and radiation chemistry. // J.Gerontol., 1956, v. 11, pp. 289-300.

287. Hasel J.R. The regulation of cell function by temperature induced alterations on membrane composition. In: Effect of Temperature on the Ectotermic Organisms. Berlin, 1973, 55 p.

288. Heinecke J.W. and Shapiro B.M. Respiratory burst oxidase of fertilization. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989 Feb., v. 86, № 46 pp. 1259-1263.

289. Hill H. R., Warwick W. J., Dettloff J., Quie P. G. Neutrophil granulocyte function in patients with pulmonary infection. // J. Pediatr., 1974, v. 84, pp. 55-58.

290. Hirayama S., Ueda R., Sugata K. Evaluation of active oxygen effect on photosynthesis of Chlorella vulgaris. // Free Radic. Res., 1996 Sep., v. 25, № 3, pp. 247-254.

291. Hodgson E. Comparative aspects of the distribution of cytochrome P-450 dependent mono-oxygenase systems: an overview. // Drug Metab. Rev., 1979, v. 10, №l,pp. 15-33. Review.

292. Hogberg J., Moldeus P., Arborgh В., O'Brien P.J., Orrenius S. The consequences of lipid peroxidation in isolated hepatocytes. // Europ. J. Biochem., 1975 Nov. 15, v. 59, № 2, pp. 457-462.

293. Honeycutt R.C. and Krogmann D.W. A light-dependent oxygen-reducing system from Anabaena variabilis. // Biochim. Biophys. Acta, 1970 Mar. 3, v. 197, № 2, pp. 267-275.

294. Hosoda S. and Nakamura W. Role of glutathione in regulation of hexose monophosphate pathway in Ehrlich ascites tumor cells. // Biochim. Biophys. Acta, 1970 Oct. 27, v. 222, № 1, pp. 53-64.

295. Hubbard R. The molecular weight of rodopsin and the nature of the rhodopsin-digitonin complex. // J. Gen. Physiol., 1954, v. 37, № 3, pp. 381-399.

296. Hubbard R. The thermal stability of rhodopsin and opsin. H J. Gen. Physiol., 1958, v. 42, pp. 259-280.

297. Ichikawa J. Cytochrome P-450 linked mixed function oxidase systems (monooxygenasees) of microsomal and mitochondrial types and their substrate specificities. // J. (Seikagagu) Jap. Biochem. Soc., 1981, v. 53, pp. 221. (in Japanese).

298. Imlay J. A. and Fridovich I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. // J. Biol. Chem., 1991 Apr. 15, v. 266, № 11, pp. 6957-6965.

299. Ingi Т., Cheng J., Ronnett G.V. Carbon monoxide: an endogenous modulator of the nitric oxide-cyclic GMP signaling system. // Neuron, 1996 Apr., v. 16, № 4, pp. 835-842.

300. Isselbacher KJ. Enzymic mechanisms of hormone metabolism. II. Mechanism of hormonal glucuronide formation. In Recent progress in hormone research, Ed. G.Pincus, v. 12, pp. 134-151, Academic Press Inc., New York, 1956.

301. Jacob S.T. and Bhargava P.M. A new method for the preparation of liver cell suspensions. // Exp. Cell Res., 1962 Sep., v. 27, № 3 , pp. 453-467.

302. James M.O. and Bend J.R. Polycyclic aromatic hydrocarbon induction of cytochrome Р-450-dependent mixed-function oxidases in marine fish. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 1980 Jun 15, v. 54, № l, pp. 117-133.

303. Janssen P.A.J. The levemisol story. In.: Problem in Drug Research, 1976, v. 20, pp. 347-383.

304. Janzen E.G., Nutter D.E.,Jr., Davis E.R., Blackburn B.J., Poyer J.L., McCay P.B. // Can. J. Chem., 1978, v. 56, № 17, pp. 2237-2242.

305. Jefcoate C.R. Measurements of substrate and inhibitor binding to microsomal cytochrome P-450 by optical-difference spectroscopy. In: Methods in Enzimology. Eds. Fleischer S., Parker L. N.Y.-San Francisko: Academic Press, 1978, v. 52, pp. 258-279.

306. Johannesen K.A.M. and de Piere J.W. Measurements of cytochrome P-450 in the presence of large amounts of contaminating hemoglobin and methemoglobin. // Anal. Biochem., 1978, June 1, v. 86, № 2, pp. 725-732.

307. Jones O.T. The mechanism of the production of superoxide by phagocytes. // Mol. Chem. Neuropathol. 1993 May-Jun., v. 19, № 1-2, pp. 177-84. Review.

308. Jones R.D., Hancock J.T., Morice A.H. NADPH oxidase: a universal oxygen sensor? // Free Radic. Biol. Med., 2000 Sep. 1, v. 29, № 5, pp. 416-424.

309. Jones S.A., O'Donnell V.B., Wood J.D., Broughton J.P, Hughes E.J., Jones O.T. Expression of phagocyte NADPH oxidase components in human endothelial cells. // Am. J. Physiol., 1996 Oct., v. 271, № 4, Pt. 2, H.1626-1634.

310. Joseph C.A. and Dixon P.A.F. A possible cytochrome Р-450-mediated N-oxidation of diethylcarbamazine. // J. Pharm. Pharmacol. 1984 Oct, v. 36, № 10, pp. 711-712.

311. Joseph C.A. and Dixon P.A.F. A possible cytochrome Р-450-mediated N-oxidation of diethylcarbamazine. // J. Pharm. Pharmacol. 1984 Oct, v. 36, № 10, pp. 711-712.

312. Juchau M.R. Drug biotransformation in the placenta. // Pharmacol. Ther., 1980, v. 8, № 3, pp. 134-151.

313. Kaever V., Roitzsch J. Т., Stangel W., Schlienkofer L., Resch K. Simultaneous detection of whole blood chemiluminescence in microtitre plates. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1992, v. 30, № 6, pp. 209-216.

314. Kagan V.E., Kisin E.R., Kawai K., Serinkan B.F., Osipov A.N., Serbinova E.A., Wolinsky I., Shvedova A.A. Toward mechanism-based antioxidant interventions; lessons from natural antioxidants. // Ann N. Y. Acad. Sci., 2002 Apr., v. 959, pp. 188-198.

315. Kagan V.E., Schvedova A.A., Novikov K.N., Kozlov Yu.P. Licht-induced free radical oxidation of membrane lipids in photoreceptors of frog retina. // Biochim. biophys. acta, 1973, v. 330, № 1, p.76-79.

316. Kagan V.E., Schvedova A.A., Novikov K.N., Kozlov Yu.P. Licht-induced free radical oxidation of membrane lipids in photoreceptors of frog retina. // Biochim. biophys. acta, 1973, v. 330, № 1, p.76-79.

317. Kakinuma K., Cadenas E., Boveris A., Chance B. Low level chemiluminescence of intact polymorphonuclear leukocytes. // FEBS Lett., 1979 Jun. 1, v. 102, № 1, pp. 38-42.

318. Kalsi J.K., Clay K., Rickard D., Hall N.D. Suppressive effects of a novel antioxidant compound on human T cell functions in vitro. // Agents Actions, 1993, 39 Spec No CI 10-2

319. Kaltenbach J.P. The preparation and utilization of whole cell suspension obtained from solid mammalian tissues. // Exp. Cell Res., 1954 Nov., v. 7, № 2 , pp. 568-571.

320. Kamataki Т., Kitada M., Shigematsu H., Kitagava H. The involvement of cytochrome P-488 and P-450 in NADH-dependent O-demethylation of p-nitroanisole in rat liver microsomes. // Jpn. J. Pharmacol., 1979 Apr., v. 29, № 2, pp. 191-201.

321. Кати Т. I. Mechanisms of interaction of monochromatic visible light with cells. // Progress in Biomedical Optics. EUROPTO Serias "Photon Migration and Diffuse-Light Imaging.", Chs/Eds. T.LKaru and A.R.Young. Spain, Barcelona, 14-15

322. September 1995. Proceedings of SPIE-OSA Biomedical Optics, 1995, Vol. 2630, pp. 2-9.

323. Kasahara M., Kagawa Т., Oikawa K., Suetsugu N., Miyao M., Wada M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. // Nature, 2002 Dec. 19-26, v. 420, № 6917, pp. 829-832.

324. Kayatz P., Thumann G., Schraermeyer U. Ultrastructural localization of light-induced lipid peroxides. // Methods Enzymol., 2002, v. 352, pp. 378-391.

325. Keller G.M., Christou M., Pottenger L.H., Wilson N.M., Jafcoate C.R. Product inhibition of benzoa.pyrene metabolism in uninduced rat liver microsomes: effect of diol epoxide formation. // Chem. Biol. Interact., 1987 Feb., v. 61, № 2, pp. 159175.

326. Keys S.A. and Zimmerman W.F. Antioxidant activity of retinol, glutathione, and taurine in bovine photoreceptor cell membranes.// Exp. Eye Res., 1999 Jun., v. 68, № 6, pp. 693-702.

327. Khan A.U. Activated oxygen: singlet molecular oxygen and superoxide anion. // Photochem. Photobiol., 1978, v. 28, № 4-5, pp. 615-627.

328. Kimura E. A new method separation the outer segments of rod from retinal tissues. // Jap. J. Physiol., 1952, v. 3, № 1, pp. 25-28.

329. Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intact leukocytes.//Science, 1970, v. 169, pp. 1095-1097.

330. Klebanoff S.J., Foerder C.A., Eddy E.M., Shapiro B.M. Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of a peroxidase mechanism. // J. Exp. Med., 1979 Apr. 1, v. 149, v. 4, pp. 938-953.

331. Kloepper-Sams P.J., Park S.S., Gelboin H.V., Stegeman J.J. Specificity and cross-reactivity of monoclonal and polyclonal antibodies against cytochrome P-450E of the marine fish scup. // Arch. Biochem. Biophys., 1987, Feb 15, v. 253, № l,pp. 268-278.

332. Knowles R.G. and Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. // Biochem. J., 1994 Mar. 1, v. 298, Pt 2, pp. 249-258.

333. Kohn H.Y. and Liversedge M. On a new aerobic metabolite whose production by brain is inhibited by apomorphine, emetine, ergotamine, epinephrine and menadione. // J. Pharmacol .Exp. Therap., 1944, v. 82, № 3, pp. 292-300.

334. Kovalev I.E. The role of associated with cytochrome P-450 immune mechanisms in drug inactivation. In: VIII Intern. Congr. Pharmacol. Tokyo, 1983, abstr. 676, p.427.

335. Krasnovsky A.A. Jr. and Kagan V.E. Photosensitization and quenching of singlet oxygen by pigments and lipids of photoreceptor cells of the retina. // FEBS Lett, 1979 Dec. 1, v. 108, № 1, pp. 152-154.

336. Krinsky N.I. The lipoprotein nature of rhodopsin. Arch. Ophtalm., 1958, v. 60, №4, pp. 688-694.

337. Kulkarni A.P. and Kenel M.F. Human placental lipid peroxidation. Some characteristics of the NADPH-supported microsomal reaction. // Gen. Pharmacol., 1987, v. 18, №5, pp. 491-496.

338. Kurelec В., Protic M., Britvic S., Kezic N., Rijavec M., Zahn R.K. Toxic effects in fish and the mutagenic capacity of water from the Save River in Yugoslavia. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1981 Feb., v. 26, № 2, pp. 179-187.

339. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002 Apr. 2, v. 99, № 7, pp. 4256-4261.

340. Lai C.S. and Piette L.H. Hydroxyl radical production involved in lipid peroxidation of rat liver microsomes. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1977 Sep. 9, v. 78, № 1, pp. 51-59.

341. Lambeth J.D., Camin H., Seyhert P.W. Phosphatidylcholine vesicle reconstituted cytochrome P-450scc. Role of the membrane in control of activity and spin state of the cytochrome. // J. Biol. Chem., 1980 Sep 10, v. 255, № 17, pp. 8282-8288.

342. Leninger A.L. The Mitochondrion. N.Y. Ed. W.A.Benjamin, Inc. 1964.

343. Leninger A.L. Bioenergetics. Ed. W.A.Benjamin, Inc.1965.

344. Levine W.G. Glutathione, lipid peroxidation and regulation of cytochrome P450 activity. // Life Sci., 1982, v. 31, № 8, pp. 779-784.

345. Lewis D.F.V., Ionnides C., Parke D.V. Structural requirements for substrates of cytochromes P-450 and P-448. // Chem.-Biol. Inter., 1987, v. 64, № 1-2, pp. 3960.

346. Lewis R.A. and Austan K.F. The biologically active leukotrienes. Biosynthesis, metabolism, receptors, functions, and pharmacology. // J. Clin. Invest., 1984 Apr., v. 73, № 4, pp. 889-897. Review.

347. Lichtenberg D., Robson R.J., Dennis E.A. Solubilization of phospholipids by detergents. Structural and kinetic aspects. // Biochim. Biophys. Acta, 1983 May 24, v. 737, № 2, pp. 285-304.

348. Lilius E.-M. and Marnila P. Photon emission in phagocytes in relation to stress and disease. // Experientia, 1992 Dec. 1, v. 48, № 11-12, pp. 1082-1091.

349. Lindstrom-Seppa P. and Hanninen O. Sampling and storage conditions of rainbow trout liver affects monooxygenase and conjugation enzymes. // Сотр. Biochem. Physiol., C, 1988, v. 89 № 2, pp. 221-224.

350. Liochev S.I. and Fridovich I. On the role of bicarbonate in peroxidations catalyzed by Cu,Zn superoxide dismutase. // Free Radic. Biol. Med., 1999 Dec., v. 27, № 11-12, pp. 1444-1447.

351. Lisitsa A.V., Gusev S.A., Karuzina I.I., Archakov A.I., Koymans L. Cytochrome P450 database. // SAR QSAR Environ. Res., 2001, v. 12, № 4, pp. 359-366.

352. Litterst C.L., Mimnaugh E.G., Gram Т.Е. Comparative alterations in extrahepatic drug metabolism by factors known to affect hepatic activity. // Biochem. Pharmacol., 1977 Apr 15, v. 26, № 8, pp. 749-755.

353. Liu P.T., Ionniades C., Symons A.M., Parke D.V. Role of tissue glutation in prevention of surgical trauma. // Xenobiotica, 1993, v. 23, pp. 899-911.

354. Longmuir I.S. and ap Rees W.A. Preparation of suspension from rat liver. // Nature, 1956, v. 177, p. 997.

355. Maillard L.C. Action des acides amines sur les sucres: Formation des melanoidines par voie methodique. // Сотр. Rend. Hebd. Seances Acad. Sci., 1912, v. 154, pp. 66-68.

356. Mattheus P.C.S. Quantum chemistry of atoms and molecules. Cambridge: Cambridge University Press, 1986

357. Maulik N., Engelman D.T., Watanabe M., Engelman R.M., Das D.K. Nitric oxide a retrograde messenger for carbon monoxide signaling in ischemic heart. // Mol. Cell Biochem., 1996a Apr. 12-26, v. 157, № 1-2, pp.75-86.

358. May H.E. and McCay P.B.Reduced triphosphopyridine nucleotide oxidase-catalyzed alterations of membrane phospholipids. II. Enzymic properties and stoichiometry. // J. Biol. Chem., 1968 May 10, v. 243, № 9, pp. 2296-2305.

359. McCay P.B., Floyd R.A., Lai E.K., Poyer J.L., Fong K.-L. Hydroxyl radical generation during NADPH oxidation by liver microsomes. // 12 Annual Meeting, Feb. 24-27, 1976, Washington. Abstracts, W-POS-D14. // Biophys. J., 1976, v. 16, № 2, pt. 2, p. 66a.

360. McCord J. M. Superoxide radical: controversies, contradictions, and paradoxes. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1995, v. 209, pp. 112-117.

361. McCord J. M. and Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). // J. Biol. Chem., 1969 Nov. 25, v. 244, № 22, pp. 6049-6055.

362. McKnight R.C. and Hunter F.E. Jr. Mitochondrial membrane ghosts produced by lipid peroxidation induced by ferrous ion. II. Composition and enzymatic activity. // J. Biol. Chem., 1966 Jun 25, v. 241, № 12, pp. 2757-2765.

363. McLean L.R., Hagaman K.A., Davidson W.S. Role of lipid structure in the activation of phospholipase A2 by peroxidized phospholipids. // Lipids, 1993 Jun, v. 28, № 6, pp. 505-509.

364. Meier B. Reactive oxygen intermediates involved in cellular regulation. // Protoplasma, 2001, v. 217, № 1-3, pp. 101-106.

365. Meier В., Cross A.R., Hancock J.T., Каир F.J., Jones O.T. Identification of a superoxide-generating NADPH oxidase system in human fibroblasts. // Biochem. J., 1991 Apr. 1, v. 275, Pt 1, pp. 241-245.

366. Meilin S., Rogatsky G.G., Thom S.R., Zarchin N., Guggenheimer-Furman E., Mayevsky A. Effects of carbon monoxide on the brain may be mediated by nitric oxide. // J. Appl. Physiol., 1996 Sep., v. 81, № 3, pp. 1078-1083.

367. Messerle L. and Curtis M. Antioxidant activity of vitamin E and related phenols, importance of stereoeletronic factors. // J. Amer. Chem. Soc., 1980, v. 102, № 26, pp. 7791-7792.

368. Methods in Enzymology. Biomembranes, PT. C. Biological Oxidation. Microsomal. Cytochrome P-450 and other hemoprotein systems. Ed. S.Fleisher et al. N.-Y., "Acad. Press", 1978, v. 52.

369. Miles P.S., Weight J.R., Bowman L., Colby H.D. Inhibition of hepatic microsomal lipid peroxydation by drug substrates without drug metabolism. // Biochem. Pharmacol,, 1980 Feb. 15, v. 29, № 4, pp. 565-570.

370. Misra H.P. and Fridovich I. The generation of superoxide radical during the autoxidation of hemoglobin. // J. Biol. Chem., 1972 Nov 10, v. 247, № 21, pp. 6960-6962.

371. Moldeus P, Hogberg J, Orrenius S. Isolation and use of liver cells. // Methods Enzymol., 1978, v. 52, pp. 60-71.

372. Moncada S. and Vane J. Pharmacology and endogeneous roles of prostaglandin, tromboxane A2 and prostacyclin. // Pharm. Rev., 1978 Sep., v. 30, № 3, pp. 293331.

373. Morisaki N., Stitts J.M., Bartels-Tomei L., Milo G.E., Panganamala R.V., Cornwell D.G. Dipyridamole: an antioxidant that promotes the proliferation of aorta smooth muscle cells. // Artery, 1982, v. 11, № 2, pp. 88-107.

374. Mullarkey C.J., Edelstein D., Brownlee M. Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990 Dec. 31, v. 173, № 3, pp. 932-939.

375. MUller-Enoch D., Churchill P., Fleischer S., Guengerich F.P. Interaction of liver microsomal cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductase in the presence and absence of lipid. // J. Biol. Chem., 1984 Jul. 10, v. 259, № 13, pp. 8174-8182.

376. Nakagaki M., Komatsu H., Handa T. Effect of saccharides on the freezing and thawing of liposome dispersion. // Chem. Pharm. Bull., 1986, v. 34, № 11, pp. 44794485.

377. Neas N.P. and Hazel J.R. Temperature-dependent deacylation of molecular species of phosphatidylcholine by microsomal phospholipase A2 of thermally acclimated rainbow trout, Salmo gairdneri. // Lipids, 1984 Apr, v. 19, № 4, pp. 258263.

378. Neas N.P. and Hazel J.R. Partial purification and kinetic characterization of the microsomal phospholipase A2 from thermally acclimated rainbow trout (Salmo gairdneri).!/ J. Сотр. Physiol. B., 1985, v. 155, № 4, pp. 461-469.

379. Nebert D.W. and Gelboin H.V. Substrate inducible microsomal arylhydroxylase in mammalian cell culture. I. Assay and properties of induced enzyme. // J. Biol. Chem., 1968, v. 243, № 23, pp. 6242-6252.

380. Netter K.J. and Seidel G.J. An adaptively stimulated O-demethylating system in rat liver microsomes and its kinetic proper// J. Pharmacol. Exptl. Therap., 1964 Oct., v. 146, № 1, pp. 61-65.

381. Nigam S. and Schewe T. Phospholipase A2s and lipid peroxidation. // Biochim. Biophys. Acta, 2000 Oct 31, v. 1488, №1-2, pp. 167-181.

382. Nishikimi M., Yamada H., Yagy K. Generation of superoxide anion with a photoreduced phenoxazine derivate. // Photochem. Photobiol., 1978, v. 27, № 3, pp. 269-272.

383. Nisimoto Y., Otsuka-Murakami H., Iwata S. NADPH-cytochrome с reductase from human neutrophil membranes: purification, characterization and localization. // Biochem. J., 1994 Feb. 1, v. 297, Pt. 3, pp. 585-593.

384. Niviere V. and Fontecave M. Biological Sources of Reduced Oxygen Species. // Analysis of Free Radicals in Biological Systems., 1995.

385. Norimitsu N. Oxidation of ascorbic acid with superoxide anion generated by the xanthine-xanthine oxidase system. // Biochem. Biophys. Res. Com., 1975, v. 63, № 2, pp. 463-468.

386. Novikov K.N. and Kagan V.E. Stabilization of cytochrome P-450 in hepatocytes by free radical scavengers of different nature. // Acta physiol. et Pharmacol., 1985, v. 11,№3, pp. 61-69.

387. O'Donnell V.B. and Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme. // Biochem. J., 1996 Sep. 15, v. 318, Pt 3, pp. 805-812.

388. Ohnishi К. and Lieber C.S. Respective role of superoxide and hydroxyl radical in the activity of the reconstituted microsomal ethanol-oxidizing system. // Arch. Biochem. Biophys., 1978 Dec., v. 191, № 2, pp. 798-803.

389. Omura T. and Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. // J. Biol. Chem., 1964, v. 239, № 7, pp. 2370-2378.

390. Otterbein L.E. Carbon monoxide: innovative anti-inflammatory properties of an age-old gas molecule. // Antioxid. Redox Signal., 2002 Apr., v. 4, № 2, pp. 309319.

391. Oyanagui Y., Sato N., Hagihara B. Spectrophotometric analysis of cytochromes in rat liver during carcinogenesis. // Cancer Res., 1974 Mar., v. 34, № 3, pp. 458462.

392. Paine A.J. and Villa P. Ligands maintain cytochrome P-450 in liver cell culture by affecting its synthesis and degradation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980 Nov. 28, v. 97, № 2, pp. 744-750.

393. Paine A.J., Villa P., Hockin L.J. Evidence that ligand formation is a mechanism underlying the maintenance of cytochrome P-450 in rat liver cell culture. Potent maintenance by metyrapone. // Biochem J. 1980 Jun. 15, v. 188, № 3, pp 937-939.

394. Palmina N.P., Pinzar E.I., Kurnakova N.V., Burlakova E.B. Phorbol ester at concentrations 10",8-10'7 M inhibits lipid peroxidation in rat brain plasma membranes via activation of protein kinase C. // Membr. Cell Biol., 1997, v. 11, № 4, pp. 463-473.

395. Papermaster D.S. and Dreyer W.J. Rhodopsin content in the outer segment membranes of bovine and frog retinal rods. // Biochemistry, 1974 May 21, v. 13, № 11, pp. 2438-2444.

396. Park В. H., Fikrig S. M., Smithwick E. M. Infection and nitroblue-tetrazolium redaction by neutrophils. A diagnostic acid. // Lancet, 1968 Sep. 7, v. 2, № 7567, pp. 532-534.

397. Pattison D.I., Dean R.T., Davies M.J. Oxidation of DNA, proteins and lipids by DOPA, protein-bound DOPA, and related catechol(amine)s. // Toxicology, 2002 Aug. 1, v. 177, № 1, pp. 23-37.

398. Payne Y.P. and Penrose W.R. Induction of aryl hydrocarbon benzo(a)pyrene hydroxylase in fish by petroleum. // Bull. Environ. Contain. Toxicol., 1975, v.14, № 01, pp.112-116.

399. Pelkonen O. and Saarni H. Unusual patterns of benzo(a)pyrene metabolities and DNA-benzo(a)pyrene adducts produced by human placental microsomes in vitro. II Chem. Biol. Interact., v. 30, № 3, pp. 287-296, 1980.

400. Peltola V., Huhtaniemi I., Metsa-Ketela Т., Ahotupa M. Induction of lipid peroxidation during steroidogenesis in the rat testis. // Endocrinology, 1996 Jan., v. 137, № l,pp. 105-112.

401. Phillips G.O. Energy transfer in rdiation processes. Elsvier, Amsterdam, 1965.

402. Poincelot R.P. and Zull J.E. Phospholipid composition and extractibility of light-and dark-adapted bovine retinal rod outer segments.// Vision Res., 1969 Jun., v. 9, № 6, pp. 647-651.

403. Poincelot R.P., Millar P.G., Kimbel R.L. Jr, Abrahamson E.W. Lipid to protein chromophore transfer in the photolysis of visual pigments. // Nature, 1969 Jan 18, v. 221, № 177, pp. 256-257.

404. Porter N.A., Nixon J., Isaac R. Cyclic peroxides and the thiobarbituric assay. // Biochim. Biophys. Acta, 1976 Sep. 27, v. 441, № 3, pp. 506-512.

405. Prough R.A., Burke M.D., Mayer R.T. Direct fluorometric methods for measuring mixed-function oxidase activity. In Methods Enzymol., Eds. Colowick S.P. and Kaplas N.O., v. 52c, pp. 372-377, Academic Press, New York, 1978.

406. Ptashne K.A., Brothers L., Axline S.G., Cohen S.N. Aryl hydrocarbon hydroxylase induction in mouse peritoneal macrophages and blood-derived human macrophages. // Proc Soc Exp Biol Med., 1974 Jun., v. 146, № 2, pp. 585-590.

407. Racker E. Mechanisms in bioenergetics. N.Y., Academic Press, Inc. 1965.

408. Reknagel R. and Glende E., Jr. Carbon tetrachloride hepatotoxicity: An example of lethal cleavage. // CRS Crit. Rev. Toxicol., 1974, v. 2, № 2, p.263.

409. Renoux G. The general immunopharmacology of levamisole. // Drugs, 1980 Aug., v. 20, № 2, pp. 89-99. Review.

410. Rho J.H. Direct fluorometric analysis of benzo(a)pyrene metabolite formation by mouse liver microsomes. // Anal. Biochem., 1980 Jul. 1, v. 105, № 2, pp. 414-423.

411. Richter C. Biophysical consequences of lipid peroxidation in membranes. // Chem. Phys. Lipids, 1987 Jul-Sep., v. 44, № 2-4, pp. 175-189.

412. Robison W.G., Kuwabara Т., Bieri J.G. The roles of vitamin E and unsaturated fatty acids in the visual process. // Retina, 1982, v. 2, №4, pp. 263-281.

413. Roos D., Bot A.A.M., Schaik M.L.J., Boer M., Daha M.R. Interaction between human neutrophils and zymosan particles: the role of opsonins and divalent cations. // J. Immunol., 1981, v. 126, pp. 433-440.

414. Rosenfeld Т., Alchalel A., Ottolenghi M. Triplet states and cis-trans photoisomerization processes in the Schiff bases of retinal isomers. // Photochem. Photobiol., 1974 Aug, v. 20, № 2, pp. 121-125.

415. Rush W.R., Gibson G.G., Parue D.V. The purification and reconstitution of cytochrome Р-450-dependent cholesterol 7 alpha-hydroxylase activity from rat liver microsomal fractions proceedings. // Biochem. Soc. Trans., 1980 Feb., v. 8, № 1, pp. 102-103.

416. Sakaki Т., Soga A.,Yabusaki Y., Ohkawa H. Characterization of three forms of cytochrome P-450 isolated from liver microsomes of rats treated with 3-methylcholanthrene.// J. Biochem. (Tokyo), 1984 Jul., v. 96, № 16, pp. 117-126.

417. Samuelsson В., Borgeat P., Hammarstrom S., Murphy R.C. Leukotrienes: a new group of biologically active compounds. // Adv. Prostaglandin Thromboxane Res., 1980, v. 6, pp. 1-18.

418. Saprin A.N. and Piette L.H. Spin trapping and its application in the study of lipid peroxidation and free radical production with liver microsomes. // Arch. Biochem. Biophys., 1977 Apr. 30, v.180, № 2, pp. 480-492.

419. Saran M., Michel C., Stettmaier K., Bors W. Arguments against the significance of the Fenton reaction contributing to signal pathways under in vivo conditions. // Free Rad. Res., 2000, v. 33, № 5, pp. 567-579.

420. Sauer H., Wartenberg M, Hescheler J. Reactive Oxygen Species as Intracellular Messengers During Cell Growth and Differentiation. // Cell Physiol. Biochem., 2001, v. 11, №4, pp. 173-186.

421. Sbarra A. J. and Karnovsky M. L. The biochemical basis of phagocytosis. I. Metabolic changes during ingestion of particles by polymorphonuclear leukocytes. // J. Biol. Chem., 1959, v. 234, № 6, pp. 1355-1362.

422. Schafer D.A. and Hultquest D.E. Purification of bovine liver microsomal NADPH-cyt. b5-reductase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, v.95, № 1, pp. 381-387.

423. Schaffer A.M., Yamaoka Т., Becker R.S. Visual pigments. V. Ground and excited-state acid dissociation constants of protonated all-trans retinal schiff base and correlation with theory. // Photochem. Photobiol., 1975 May, v. 21, № 5, pp. 297-301.

424. Scheller F., Renneberg R., Mohr P, Janig GR, Ruckpaul K. Peroxidase activity of liver microsomal cytochrome P-450. // FEBS Letters, 1976, v.71, № 2, pp. 309312.

425. Schewe Т., Halangk W., Hiebsch Ch., Rappoport S.M. A lipoxygenase in rabbit reticulocytes which attacks phospholipids and intact mitochondria. // FEBS Lett., v. 60, № 1, pp. 149-152.

426. Scholz S. and Segner H. Induction of CYP1A in primary cultures of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver cells: concentration-response relationships of four model substances. // Ecotoxicol. Environ. Saf., 1999 Jul., v. 43, № 3, pp. 252260.

427. Seglen P.O. Preparation of rat liver cells. II. Effects of ions and chelators on tissue dispersion. // Exp. Cell Res., 1973 Jan., v. 76, № l5 pp. 25-28.

428. Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells. // Meth. Cell Biol., 1976, v. 13, pp. 29-83.

429. Segner H. and Cravedi J.P. Metabolic activity in primary cultures of fish hepatocytes. // Altern Lab. Anim., 2001 May-Jun., v. 29, v. 3, pp. 251-257.

430. Seliger H.H. Some aspects of the luminol light reaction. In: Proceedings of Symposium on Light and Life. McElroy W.D. and Glass В., Eds. Baltimore. The Johns Hopkins Press, 1961, pp. 200-205.

431. Sevanian A., Stein R.A., Vead J.F. Metabolism of epoxidized phosphatidylcholine by phospholipase A2 and epoxidehydrolase. // Lipids, 1981, v. 16, № 11, pp. 781-789.

432. Shiokawa Y. Progress in new immunomodulator research. // Intern. Journ. Immunotherap., 1985, v. 1, pp. 79-83.

433. Shulte-Herbruggen T. and Sies H. The peroxidase/oxidase activity of soyabean lipoxygenase. II. Triplet carbonysl and photoemission during polyunsaturated fatty acid and glutathione oxidation. // Photochem. Photobiol., 1989, v. 49, pp. 705-710.

434. Shum S., Jensen N.M., Nebert D.W. The murine Ah locus: in utero toxicity and teratogenesis associated with genetic differences inthe benzo(a)pyrene metabolism. Teratology, 1979, v. 20, № 3, pp. 365-376.

435. Shvedova A.A., Alekseeva O.M., Kuliev I.Ya., Muranov K.O., Kozlov Yu.P., Kagan V.E. Damage of photoreceptor membrane lipids and proteins induced by photosensitized generation of singlet oxygen. // Curr. Eye Res., 1982-83, v. 2, № 10, pp. 683-699.

436. Shvedova A.A., Sidorov A.S., Novikov K.N., Galushchenko I.V., Kagan V.E. Lipid peroxidation and electric activity of the retina. // Vision Res., 1979, v. 19, № 1, pp. 49-55

437. Silverton S.F., Mesaros S., Markham G.D., Malinski T. Osteoclast radical interactions: NADPH causes pulsatile release of NO and stimulates superoxide production. //Endocrinology, 1995 Nov., v. 136, № 11, pp. 5244-5247.

438. Skulachev V.P. Programmed death phenomena: from organelle to organism. // Ann. N. Y. Acad. Sci., 2002 Apr., v. 959, pp. 214-237.

439. Slawinski J. Luminescence research and its relation to ultraweak cell radiation. // Experientia, 1988 Jul. 15, v. 44, № 7, pp. 559-571.

440. Snyder R. and Remmer H. Classes of hepatic microsomal mixed function oxidase inducers. // Pyarm. Therap., 1979, v.7, № 2, pp. 203- 209.

441. Statham C.N., Elcombe C.R., Szyjka S.P., Lech J.J. Effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on hepatic microsomal enzymes and disposition of methylnaphthalene in rainbow trout in vivo. II Xenobiotica, 1978 Feb., v. 8, № 2, pp. 65-71.

442. Stegeman J.J. and Kloepper-Sams P.J. Cytochrome P-450 isozymes and monooxygenase activity in aquatic animals. // Environ. Health Perspect., 1987 Apr., v. 71, pp. 87-95.

443. Stegeman J.J., Woodin B.R. et al. Microsomal cytochrome P-450 function in fish evaluated with polyclonal antibodies to cytochrome P-450E from scup. // Marine Environm. Res., 1985, v. 17, pp. 83-86.

444. Stegeman J.J. and Woodin B.R. The metabolism of alpha-naphthoflavone (7,8-benzoflavone) by hepatic microsomes from the marine fish Stenotomus versicolor. II Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980 Jul.16, v. 95, № 1, pp. 328-333.

445. Stepanova L.I., Lindstrom-Seppa, HSnninen O.O.P., Kotelevtsev S.V., Glaser V.M., Novikov C.N., Beim A.M. Lake Baikal: biomonitoring of pulp and paper mill waste water. // Aquatic Ecosystem Health and Management, 2000, № 3, pp.259-269.

446. Stephens R.J., Negi D.S., Short S.M., van Kuijk F.J., Dratz E.A., Thomas D.W. Lipid peroxidation and retinal phototoxic degeneration. // Basic Life Sci., 1988, v. 49, pp. 283-299.

447. Stevens D.L., Bryant A. E., Huffman J., Thompson K., Allen R. C. Analysis of circulating phagocyte activity measured by whole blood luminescence: correlations with clinical status. // J. Infect. Dis., 1994 Dec., v. 170, № 6, pp. 1463-1472.

448. Strobel H.W., Lu A.Y., Heidema J., Coon M.J. Phosphatidylcholine requirement in the enzymatic reduction of hemoprotein P-450 and in fatty acid, hydrocarbon, and drug hydroxylation.// J. Biol. Chem., 1970 Sep 25, v. 245, № 18, pp. 4851-4854.

449. Stryer L., Hurley J.B, Fung B.K. Transducin and the cyclic GMP phosphodiesterase of retinal rod outer segments. // Methods Enzymol., 1983, v. 96, pp. 617-627.

450. Sumimoto H., Isobe R., Mizukami Y., Minakami S. Formation of a novel 20-hydroxylated metabolite of lipoxin A4 by human neutrophil microsomes. // FEBS Lett., 1993 Jan. 11, v. 315, № 3, pp. 205-210.

451. Szutowski M.M. Towards standardization of the reconstituted mixed function oxidase systems with cytochrome P-450. // Arch. Toxicol. Suppl. 1980, v. 4, pp. 385-387.

452. Takashi Y., Makino R., Anan F. K. Studies of the microsomal mixed-function oxidase system: mechanism of action of hepatic NADPH-cytochrome P-450 reductase. // Biochemistry, 1981, v. 20, № 7, pp. 1722-1730.

453. Taylor S.L., Lamden M.P., Tappel A.L. Sensitive fluorometric method for tissue tocopherol analysis. // Lipids, 1976 Jul, v. 11, № 7, pp. 530-538.

454. Temnov A.V., Sirota T.V., Stavrovskaya I.G., Foigel A.G., Kondrashova M.N. Effect of superoxide in air on structural organization and phosphorylating respiration of mitochondria. // Biochemistry (Mosc.), 1997 Oct., v. 62, № 10, pp.1089-1095.

455. Tephly T.R. and Burchell B. UDP-glucuronosyl transferases: a family of detoxifaying enzymes. II Trends Pharmacol. Sci., 1990, v. 11, № 7, pp. 276-279.

456. Thomas P.E., Reik L.M., Ryan D.E., Levin W. Regulation of three forms of cytochrome P-450 and epoxide hydrolase in rat liver microsomes. Effects of age, sex, and induction. // J. Biol. Chem. 1981 Jan. 25., v. 256, №2, pp. 1044-1052.

457. Tien M., Svinger B.A., Aust S.D. Superoxide dependent lipid peroxidation. // Federat. Proc., 1981, v.40, № 2, pp. 179-182.

458. Tremoli Y. and Colli F. Dipyridamole inhibits superoxide anion generation by human neutrophils. II Tromb. Haemost., 1988, v. 59, № 2, p. 342.

459. Trush M.A., Kensler T.W., Seed J.L. Activation of xenobiotics by human polymorphonuclear leukocytes via reactive oxygen-dependent reactions. // Adv. Exp. Med. Biol., 1986, v. 197, pp. 311-321.

460. Twerdok L.E. and Trush M.A. Neutrophil-derived oxidants as mediators of chemical activation in bone marrow. // Chem. Biol. Interact., 1988, v. 65, № 3, pp. 261-273.

461. Tyler D.D. Polarographic assay and intracellular distribution of superoxide dismutase in rat liver. // Biochem J. 1975, v. 14, pp. 7493-7504.

462. Ullrich V., Estabrook R.W., Schadelin J., Staudinger H. Hydroxylation of cyclohexane by rat liver microsomes.// Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 1968 Nov., v. 349, v. 11, pp. 1631-1633.

463. Ullrich V. and Weber P. The O-dealkylation of 7-ethoxycoumarin by liver microsomes. A direct fluometric test. // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 1972., Bd. 353, №7, pp. 1171-1177.

464. Van de Werve J. Isolation and characteristics of hepatocytes. // Toxicology, 1980, v. 18, № 3, pp. 179-185.

465. Vaskovsky V.E. and Kostetsky E.Y. Modified spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms. // J. Lipid Res., 1968 May, v. 9, № 3, pp. 396.

466. Vlessis A.A., Bartos D., Muller P., Trunkey D.D. Role of reactive 02 in phagocyte-induced hypermetabolism and pulmonary injury. // J. Appl. Physiol., 1995 Jan., v. 78, № 1, pp. 112-116.

467. Voeikov V.L. Reactive oxygen species, water, photons and life. // Rivista di Biologia/ Biology Forum 94, 2001, pp. 193-214.

468. Vural C. and Gungor A. Nitric oxide and the upper airways: recent discoveries (Turkish). // Kulak Burun Bogaz Ihtis. Derg., 2003 Jan.-Feb., v. 10, № 1, pp. 39-44.

469. Wagner H., HOerhammer L., Wolff P. Thin layer chromatography of phosphatides and glycolipids. // Biochem. Zeitschr., 1961, v. 334, № 1 , pp. 175184.

470. Wahi S., Kaul N., Ganguly N.K., Varma S., Sharma B.K., Wahi P.L. Neutrophil oxygen free radical production proportionates with the degree of myocardial ischemia. // Can. J. Cardiol., 1991 Jun., v. 7, № 5, pp. 229-233.

471. Wald G. The molecular basis of visual excitation. // Nature 1968 Aug 24, v. 219, № 156, pp. 800-807.

472. Walsh C. Enzymatic reaction mechanisms. W.H. Freeman and Company. San Francisco. 1979,978 pp.

473. Wang P., Mason P., Guengerich F.P. Purification of human liver cytochrome P-450 and comparison to the enzyme isolated from rat liver. // Arch. Biochem. Biophys., 1980 Jan., v. 199, № 1, pp. 206-219.

474. Weddle C.C., Hornbrook K.R., McCay P.B. Lipid peroxidation and alteration of membrane lipids in isolated hepatocytes exposed to carbon tetrachloride. J. Biol. Chem. 1976 Aug 25, v. 251, № 16, pp. 4973-4978.

475. Weltzien H. U. Cytolytic and membrane-perturbing properties of lysophosphatidylcholine. // Biochim. Biophys. Acta, 1979 Aug., v. 20, v. 559, № 2-3,pp. 259-287.

476. Wentworth A. D., Jones L. H., Wentworth P., Jr., Janda K. D., Lerner R. A. Antibodies have the intrinsic capacity to destroy antigens. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, v. 97, № 20, pp. 10930-10935.

477. White E.H. The chemiluminescence of luminol. In: Proceedings of Symposium on Light and Life. McElroy W.D. and Glass В., Eds. Baltimore. The Johns Hopkins Press, 1961, pp. 183-199.

478. White E.H. and Roswell D.F. Luminol chemiluminescence. In: Chemi- and Bioluminescence. (Clinical and biochemical analysis, v. 16). Burr J.G., Ed. New York-Basel. Marcel Dekker, Inc., 1985, pp. 215-244.

479. Wiegand R.D., Giusto N.M., Rapp L.M., Anderson R.E. Evidence for rod outer segment lipid peroxidation following constant illumination of the rat retina. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1983 Oct., v. 24, № 10, pp. 1433-1435.

480. Wiliams T.P. and Milby S.E. // The thermal decomposition of some visual pigments.// Vision Res., 1968 Apr., v. 8, № 4, pp. 359-367.

481. Williams СЛ. and Kamin H. Microsomal triphosphopyridine nucleotide-cytochrome С reductase of liver. // J. Biol. Chem., 1962 Feb., v. 237, № 2, pp. 587-595.

482. Williams D.E.and Buhler D.R.Comparative properties of purified cytochrome P-448 from beta-naphthoflavone treated rats and rainbow trout. // Сотр. Biochem. Physiol. C, 1983, v. 75, № 1, pp. 25-32.

483. Wills E.D. Effects of lipid peroxidation on membrane-bound enzymes of the endoplasmic reticulum. // Biochem. J., 1971 Aug, v. 123, № 5, pp. 983-991.

484. Wolf C.R., Slaughter S.R., Markinszyn J.P., Philot R.M. Purification and structural comparison of pulmonary and hepatic cytochrome P-450 from rabbits. // Biochim.Biophys. Acta, 1980, v. 624, № 2, pp. 409-419.

485. Xia Y., Roman L.J., Masters B.S., Zweier J.L Inducible nitric-oxide synthase generates superoxide from the reductase domain. // J. Biol. Chem., 1998 Aug. 28, v. 273, № 35, pp. 22635-22639.

486. Yang C.S. and Kicha L.P. A direct fluometric assay of benzoa.pyrene hydroxylase. // Analyt. Biochem., 1978 Jan., v. 84, № 1, pp. 154-163.

487. Yang C.S., Strickhart F.S., Kicha L.P. Analysis of the aryl hydrocarbon hydroxylase assay. // Biochem. Pharmacol., 1978, v. 27, № 19, pp. 2321-2326.

488. Yang C.S., Strickhart F.S., Kicha L.P. Interaction between NADPH-cytochrome P-450 reductase and hepatic microsomes. // Biochim. Biophys. Acta., 1978 May 18, v. 509, № 2, pp. 326-337.

489. Yeagle P.L. and Albert A.D. A conformational trigger for activation of a g protein by a g protein-coupled receptor. // Biochemistry, 2003 Feb. 18, v. 42, № 6, pp. 1365-1368.

490. Youngman R.J. and Elstner E.F. Oxygen species in paraquat toxicity: the crypto-OH radical. // FEBS-Letters, 1981 Jul. 6, v.129, № 2, pp. 265-268.

491. Zhang H., Agardh E., Agardh C.D. Nitro blue tetrazolium staining: a morphological demonstration of superoxide in the rat retina.// Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 1993 Mar., v. 231, № 3, pp. 178-183.

492. A.А.Конрадову, К.Г.Короткову, С.В.Котелевцеву, В.Б.Кошелеву, В.ЗЛанкину, Л.ДЛукьяновой, С.Н.Орлову, А.Н.Осипову, М.А.Островскому, Л.Г.Охнянской, Л.А.Пирузяну, К.Паскуалю, Н.Ф.Перевощикову, Ф.-А.Поппу, В.М.Розенталю,

493. B.Б.Ритову, В.М. Савову, А.А.Селищевой, ЕЛ.Сербиновой, Л.И.Степановой, Н.И.Сюч, К.Н.Тимофееву, А.Г.Третьяку, ВЛ.Тюрину, А.Т.Уголеву, О.Е.Фадюковой, М.В.Федорову, О.Ханнинену, С.Ф.Чалкину, АЛ.Шведовой, С.Э.Шнолю,1. C.Н.Шуколюкову,

494. Р.РЛсфарамову, Ю.С.Буларгиной, Е.В.Буравлевой, Р.И.Винер, З.Сумбаловой.