Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние низких концентраций несимметричного диметилгидразина на активные формы кислорода в объектах окружающей среды

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Влияние низких концентраций несимметричного диметилгидразина на активные формы кислорода в объектах окружающей среды"

На правах рукописи

Кондратьев Андрей Дмитриевич

ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НЕСИММЕТРИЧНОГО ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА НА АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.00.16 - Экология (химические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Краснодар-2005

Работа выполнена на базе «Центра эксплуатации наземной космической инфраструктуры» Федерального космического агентства.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Шпигун Олег Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Боголицын Константин Григорьевич

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится 2} июня 2005 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.05 в Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044 г. Краснодар, ул. Калинина, 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета (Краснодар, ул. Калинина, 13)

Автореферат разослан 2.3 мая 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович

к.б.н.

Кудинова А.Ф.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В космической технике в качестве ракетного топлива десятки лет используется несимметричный диметилгидразин (НДМГ, гептил).

НДМГ относится к первому классу опасности, обладает высокой летучестью, неограниченной растворимостью в воде, способностью к миграции, накоплению, высокой стабильностью в глубоких слоях почвы, при трансформации образует не менее токсичное вещество -нитрозодиметиламин и ряд других менее опасных.

В последние годы ведутся работы по санитарно-гигиенической оценке территорий районов падения ОЧ РН. Однако санитарно-токсикологические критерии комплексной оценки опасности загрязненных территорий отсутствуют. Для разработки таких критериев необходимо выяснить механизм действия НДМГ на экологические системы, а также разработать эффективные методы анализа его токсичности на месте обследования.

Для комплексной оценки степени опасности загрязнения окружающей среды можно использовать активные формы кислорода (АФК), которые по современным данным контролируют процессы деления клеток и апоптоз -так называемую программируемую клеточную смерть, вызываемую специальной программой разборки клетки и присутствующей в эукариотических организмах. АФК включены в каскады многих сигнальных систем клеток.

Активными формами кислорода принято называть высокореакционноспособные молекулы, образующиеся в природе из кислорода и воды. К таковым относятся синглетный кислород (021), гидроксил-радикал (ОН), супероксид-радикал (62Н), который часто существует в форме супероксид иона - (О ), и перекись водорода (Н202) -

ЮС. НАЦИОНАЛЫ! ' I БИБЛИОТЕКА 1 С-Петербург О?**

« О» ШДмгг/.Я)

наиболее устойчивая молекула в ряду этих соединений. Из них могут образовываться все остальные формы АФК. Известно, что АФК образуются внутри клеток и тканей; существуют ферменты, которые их эффективно разлагают. Традиционно считалось, что АФК - это побочный продукт метаболизма, который разрушает биологические структуры, а соответствующие ферменты (каталаза, супероксиддиемутаза и др.), разрушающие АФК, - защищают клетку от окисления.

Эти представления сейчас сохраняют свою силу только в условиях образования очень высоких концентраций АФК, которые иногда имеют место при атаке клетки - мишени лимфоцитами. В нормальных условиях реакции синтеза и разрушения АФК вполне физиологичны -соответствующие ферменты обеспечивают поддержание необходимого уровня АФК в клетке при различных режимах метаболизма.

Особенности данной работы

Для настоящего исследования существенным является следующее обстоятельство: по новым данным не только эндогенные АФК, но также АФК, образующиеся вне организма, во внешней среде, оказываются жизненно необходимыми для нормального функционирования организмов теплокровных живых существ. Это заставляет по-новому рассмотреть характер взаимодействия организма со средой. Имеются факты свидетельствующие о том, что окружающая среда синтезирует гормоны-медиаторы, непосредственно управляющие функционированием стволовых биохимических процессов клетки и гормональными системами высших организмов. Это требует нового подхода к оценке токсичности НДМГ.

Раньше рассматривался только эффект прямого действия НДМГ на организм, новая, более широкая, формулировка, представленная в настоящей работе, акцентирует внимание на возможности воздействия НДМГ на процессы генерации гормонов-медиаторов (АФК) в окружающей среде, определенный уровень которых стабилизирует нормальное существование организмов.

Вышесказанное свидетельствует об исключительной актуальности задачи всестороннего исследования влияния НДМГ, включая его низкие концентрации, на различные объекты окружающей среды и, в первую очередь, на воду, присутствующую практически во всех природных средах.

Цель работы

Цель настоящей работы - исследовать влияние НДМГ на изменение уровня АФК в окружающей среде, прежде всего в водных системах.

Научная новизна исследований заключается в следующем:

- предложен новый подход к оценке токсичности НДМГ, основанный на его способности к изменению гомеостаза АФК в природных объектах;

- показано, что низкие и очень низкие концентрации НДМГ резко повышают нормальный уровень АФК в водных системах;

- экспериментально подтверждена значимость АФК, образующихся и трансформирующихся во внешней среде под воздействием гидразинов, как внешних регуляторов «внутренних» биохимических систем организмов.

Практическая значимость проведенных исследований:

показано опосредованное влияние НДМГ на протекание биологических процессов через повышение уровня АФК в объектах окружающей среды;

- установлено воздействие НДМГ на «нормальный» фон АФК в окружающей среде вплоть до концентрации Ю"10 М;

- предложен подход для определения интегральной токсичности объектов окружающей среды, загрязненных НДМГ и продуктами его превращения;

- показана возможность и продемонстрированы пути подбора препаратов для создания «антидотов гептила», снижающих уровень воздействия НДМГ на обслуживающий персонал и население на объектах и территориях, загрязненных этим токсикантом.

Апробация работы.

Результаты исследований докладывались на Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва, 2004) и международной конференции «Взаимодействие общества и окружающей среды в условиях глобальных и региональных изменений» (Москва-Барнаул, 2003). Представленные в диссертации результаты исследований использованы при планировании исследований в рамках Российско-Казахстанской программы «Оценка влияния запусков ракет-носителей с космодрома «Байконур» на окружающую среду», формировании плана НИОКР Федеральной космической программы на 2006-2014 годы. По материалам диссертации опубликованы 6 статей и 2 тезисов доклада.

На защиту представляются:

новый подход к определению токсичности НДМГ, заключающийся в том, что это соединение нарушает свойства АФК во «внешней» среде, приводящие, в свою очередь, к нарушениям функционирования гормональных систем и гибели живых организмов;

результаты экспериментального подтверждения значимости АФК, образующихся и трансформирующихся во внешней среде под воздействием гидразинов, как «внешних» регуляторов «внутренних» биохимических систем организмов;

предложения по программе создания «антидотов гептила» для снижения уровня влияния НДМГ на здоровье персонала, работающего с гептилом, и населения, временно находящегося на загрязненных территориях.

способ оценки интегральной токсичности территорий, загрязненных НДМГ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты проведенных теоретических и экспериментальных исследований представлены в четырех главах диссертации. Общий объем работы составляет 113 л., в т.ч. список использованных литературных источников из 134 наименований на 10 л.

В первой главе проведен анализ результатов предшествующих исследований по оценке влияния гидразинов на АФК в объектах окружающей среды. Показано, что в ряду гидразинов имеется большое количество соединений, нарушающих нормальное существование и развитие живых организмов, в том числе и человека. В значительной степени повреждающее биологическое действие гидразинов сопряжено с их способностью индуцировать в организме (клетке) образование активных форм кислорода.

До сих пор гидразины не рассматривались как соединения, обладающие пролонгированным канцерогенным действием. В то же время в специальной литературе постепенно сформировалось мнение о том, что гидразины обладают ярко выраженным канцерогенным эффектом.

Определены канцерогенные продукты, образующиеся при распаде (окислении) гидразинов - в первую очередь нитрозодиметиламин и активные формы кислорода (АФК), образующиеся за счет реакции одноэлектронного восстановления кислорода гидразином с образованием супероксид-радикала: 112К-ЫН2 + 02-> [К2К-Ш] + 02Н, (1)

который затем диспропорционируется с образованием пероксида водорода и синглетного кислорода:

2 62Н -»• Н2 02 + 02| (2)

Выделены компоненты клетки, являющиеся объектами атаки гидразинов и продуктов их окисления - это ДНК и система синтеза белка.

Показано, что это воздействие препятствует индукции и синтезу ферментов системы микросомальных оксидаз. Поэтому при отравлениях НДМГ, с одной стороны, должна резко возрастать токсичность других

ксенобиотиков, а, с другой, - должны изменяться терапевтические дозы лекарств. Также крайне существенный эффект гидразинов состоит в нарушении систем защиты клетки от атаки свободнорадикальных форм кислорода. Подавляется активность супероксиддисмутазы и, кроме того, в тканях они вызывают резкое падение уровня восстановленного глютатиона. По существу, реализуется такая же картина, как при окислительном стрессе.

Выявление роли АФК (02Т, НО*, 02~, Н202) в биологии клетки позволит отчетливо представить себе, какое многообразие нарушений метаболизма клеток могут вызывать гидразины при попадании в организм.

Ранее активные формы кислорода рассматривались биологами и биохимиками как побочные продукты окислительного метаболизма, которые нарушают различные биологически значимые структуры в составе клетки. Иная ситуация сложилась к настоящему времени. В течение последних лет стало очевидным, что АФК являются регуляторами основного метаболизма клетки, при этом они принимают участие в работе большого числа регуляторных систем клетки. Соответственно, по-другому рассматривается роль ферментов, разрушающих АФК. Раньше считалось, что супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы присутствуют в клетке для того, чтобы свести к минимуму содержание АФК, теперь мы понимаем, что роль этих ферментов иная. Они являются регуляторами уровня АФК в клетке, и выполняют тонкую функцию подстройки уровня АФК в клетке в соответствии с изменением внешних условий и состоянием метаболизма самой клетки.

Проанализированы процессы образования АФК в клетке при работе трех систем - митохондрий, в которых происходят наиболее интенсивные окислительные процессы, в микросомах - в системе неспецифических оксидаз и в плазматической мембране - при функционировании трансмембранной НАДФН-оксидазы и участие АФК в процессах митоза и апоптоза. Показано, что наиболее сложным моментом в этом явлении является то обстоятельство, что сигнал АФК способен запускать полярно

противоположные процессы. Конечный эффект АФК может зависеть от интенсивности самого сигнала и от степени дифференцировки клеток. Дифференцированные клетки обычно вступают в апоптоз при индукции АФК-сигнала.

На основе недавно полученной информации об исключительно важной роли АФК как факторов, регулирующих основной метаболизм клеток и гормональный статус теплокровных, сделан вывод о необходимости по-новому рассмотреть экологическую значимость этих соединений. Фактически это составляющие окружающей среды, которые контролируют нормальное развитие и существование аэробных организмов.

Показано, что распад АФК в воде из природных источников определяется в основном присутствием бактерий. Фильтрование, автоклавирование воды делает устойчивыми АФК, образующиеся при фотовосстановлении растворенного в воде кислорода.

Изучена реакция В.П. Брускова - образование Н2О2 в воде при температурном скачке. Автор связывает этот процесс с активацией кислорода в процессе микрокавитации:

„ теплота .

о2 -► о2Т (3)

кавитация

По существу, это реакция окисления воды кислородом.

Традиционно считалось, что воздействие на жизнедеятельность организмов оказывают АФК, которые образуются внутри клеток, внутри организмов.

В настоящее время получила подтверждение концепция о влиянии «внешних АФК» на функции организма. Н.И. Гольдштейн показал, что удаление С>2~ ионов из атмосферы при полном сохранении остальных компонент приводит к заболеванию и быстрой гибели животных, у которых нарушается функции гипотоламуса и гипофиза. На клеточном уровне было показано также, что , который синтезируется при работе НАДФН-

оксидазы на внешней поверхности клеток, регулирует внутриклеточный метаболизм, изменяя степень восстановленное™ глутатиона.

Эти результаты показали, что содержание и, вероятно, состав смеси «внешних» АФК играет ключевую роль в регуляции биохимических процессов в живых системах. Именно это свойство «внешних» АФК определило задачу настоящей работы.

Во второй главе проведено обоснование выбора методов, методик и средств аналитического контроля при проведении исследований, необходимого оборудования, приборов, реактивов и материалов. Для обнаружения и исследования низких концентраций НДМГ в воде и в почве был выбран биолюминесцентный метод анализа. При этом использованы две методики: методика определения низких концентраций перекиси водорода и методика определения НДМГ по тушению люминесценции.

Содержание перекиси водорода определяли по методу Шувалова в модификации Брускова. Особенность этого метода заключается в его очень высокой чувствительности. Для обнаружения АФК, индуцируемых теплом, использован высокочувствительный метод определения перекиси водорода с помощью люминол-пероксидазной хемилюминесценции, усиленной пара-йодофенолом с количественной регистрацией величины хемилюминесценции жидкостным сцинтиллярционным счетчиком (Бета-1) для измерения бета-излучения, работающим в режиме счетчика одиночных фотонов.

В полиэтиленовые флаконы «Весктап» (США) вносили по 10 мл

счетного раствора, содержащего 10"2 М ТРИС-НС1 буфера с рН 8.5,5 ■ Ю"5 М

4-йодофенола (ICN), 5 ■ 10"5 М люминола и Ю"10 М пероксидазы хрена «Sigma». Чувствительность метода позволяет определять концентрации не менее 1 нМ пероксида водорода или 10 пикомоль в образце. Исходную концентрацию Н202 определяли спектрофотометрически при длине волны 240 нм с молярным коэффициентом поглощения 43,6 литр/моль-см.

Определение концентрации проводили с использованием метода градуировочного графика. Для учета эффектов гашения и усиления хемилюминесценции в присутствии различных веществ калибровочные графики для определения содержания Н202 строили в присутствии этих веществ.

О токсичности исследуемой среды судят по подавлению бактериальной люминесценции в опытном образце в сравнении с контролем. На приборе «Биотокс-7» измеряли интенсивность свечения контрольного и опытного образцов. После чего с помощью встроенного в прибор микропроцессора рассчитывался показатель токсичности исследуемого образца.

Основным измеряемым параметром методики является интенсивность свечения клеточной суспензии фотобактерий. Основными расчетными параметрами методики являются индекс токсичности опытного образца и его усредненное значение.

Индекс токсичности исследуемого образца рассчитывался по формуле:

1к-1о

П =-х 100 (4)

¡к

где 1К. интенсивность свечения контрольного образца, /0 - интенсивность свечения опытного образца.

Усредненный индекс токсичности определялся в приборе «Биотокс-7» по трем отсчетам и рассчитывается по формуле:

П,+П2 + П3

СР =---х 100 (5)

Величина индекса токсичности и ее усредненное значение характеризуют степень интегральной токсичности исследуемого образца.

В качестве дополнительных средств использовались фотоколориметр «Спекол-11» (Карл Цейс Йена, Германия) для определения поглащения клеточных суспензий при длине световой волны 540 нм и в кювете с длиной оптического пути 10 мм, а также кондуктометр Н1 8733 (НаппГ 1п8й\) для контроля за соленостью водных проб.

Методика основана на измерении интенсивности свечения бактерий РИо!оЬас1егшт 1ею%па1Ы и оценке степени его подавления в присутствии токсического вещества.

Бактериальную культуру поддерживали путем пересева на плотной питательной среде следующего состава (г/л): натрий хлористый - 30,0, гидролизат кильки - 17,9, глицерин - 3,0, агар - 11,2, рН - 7.3.

Перед анализом клетки переводили из плотной среды в 3%-ный раствор хлорида натрия. Затем в опытный образец добавляли исследуемую пробу воды, а в контрольный - такую же дозу чистой воды. После этого суспензию опытных и контрольных клеток поочередно помещали в прибор «Биотокс-7».

Методика анализа интегральной токсичности воды на основе биолюминесценции бактериальных клеток предназначена для сравнительной оценки интегральной токсичности водных сред по подавлению свечения фотобактерий. Она может быть использована для анализа интегральной токсичности различных химических соединений, а также при проведении экологического мониторинга.

В третьей главе разработаны теоретические основы влияния НДМГ на АФК в объектах окружающей среды. Показано, что НДМГ выступает как фактор, изменяющий нормальный уровень АФК в водных системах. При этом нормальный уровень «внешних» гормонов-регуляторов определяется всем гомеостазом среды обитания в условиях не нарушенной экологии.

Ранее токсическое воздействие вещества всегда связывалось только с прямым действием на организм. Однако теперь становится ясно, что возможны ситуации, когда вещество при введении в организм малотоксично,

но обладает «внешним» токсическим эффектом. Это может иметь место, в частности, когда данное вещество изменяет уровень внешних гормонов медиаторов (АФК) в среде обитания организма.

Конкретной задачей работы является попытка проследить влияние НДМГ на уровень АФК (Н202) в водных системах, с целью продемонстрировать влияние одного из антропогенных факторов загрязнения среды на уровень «внешних» гормонов-медиаторов в водных системах. Образовавшийся на внешней поверхности клеток супероксид-анион является регулятором внутриклеточных биохимических реакций в этих клетках. Это позволяет заключить, что не только на уровне клетки, но и целого организма «внешние» АФК выполняют роль регуляторов самого высокого ранга.

Одним из постоянных источников АФК в природе, кроме реакций восстановления кислорода по типу

является реакция радиолиза воды под влиянием жесткого электромагнитного излучения.

Недавно обнаружено образование АФК (перекиси водорода) в насыщенной воздухом воде при повышении температуры. Важно, что после подъема температуры содержание Н202 в воде выходит на новое стационарное состояние.

В основе механизма наблюдаемого явления, лежит процесс кавитации - образование - схлопывание микропузырьков, образующихся при нагревании воды. При этом процессе образуется синглентный кислород, реакция (9). Предполагаемая реакция окисления воды протекает по следующему механизму (реакции 7-11):

{ХН + 02} — X + о2н

(6)

н2о ^ н+ + он

(7)

02

теплота

* (синглентный кислород)

кавитация

ОН- + о2т —► ОН + о2 2 ОН Н202

(10)

202 +2н+» Н202 + 02Т

(И)

2Н202 — 2Н20 +02|

(12)

Цикл реакций 7-12 имеет цепной (автокаталитический) характер. Цикл запускается образованием синглетного кислорода ( 02| ) - реакция (8) и заканчивается выделением синглетного кислорода (реакции 11,12). Цепной механизм реакции вероятно и определяет высокую эффективность ее протекания в водных системах. Следует указать, что запуск процесса окисления воды (реакции 7-9) в предельном случае приводят к циклическому автокаталитическому процессу образования - распада Н202 (реакции 10-12). Формально такой процесс можно рассматривать как обратимый. На самом деле движущей силой является нагревание (кавитация). Изменение температуры меняет соотношение скоростей реакций (7,12).

Полученные в третьей главе результаты явились теоретической базой, позволившей в эксперименте по-новому подойти к проблеме токсичности НДМГ, который, восстанавливая кислород до супероксид-аниона, может включать цикл реакций (11, 12); изменять гомеостаз АФК в воде.

В четвертой главе приведены основные результаты экспериментальных исследований по оценке влияния НДМГ на содержание АФК (на примере перекиси водорода) в водных системах.

Проведены 6 групп экспериментов по изучению особенностей образования Н202 в чистой воде (рис. 1), с определением влияния на этот процесс температурных колебаний, света (рис. 2), органических добавок (рис. 3) и растений (рис. 4), в т.ч. по определению влияния света на уровень Н202 в системе «вода - растение» (рис. 5).

Результаты экспериментов показывают следующее.

1. Реакция образования Н2О2 резко ускоряется под воздействием внешних физических воздействий (температура, свет).

2. При одинаковой температуре и освещенности стационарная концентрация Н2О2 в воде нестабильна. Это проявляется в возникновении низко- и высокоамплитудных колебаний [Н2О2] в воде, которые

11±1,4

т

110,4

■ Г"п ,

Рис 1 Измерение Н2О2 в дистиллированной воде после поднятия температуры от +20"С до +40°С в течении двух часов, интервал измерений 10 минут.

А - экспериментальная кривая, Б- схематическое изображение результатов эксперимента, приведенных на рис. А1- исходная концентрация Н2О2 при +20°С, 2-усредненная конечная концентрация Н2Р2 при +40"С.

наблюдаются на разных масштабах времени (рис. 1). Природа факторов, которые индуцируют такие колебания [Н2О2], строго не доказана. Однако их существование в системе нельзя игнорировать при анализе данных эксперимента. Согласно модели Брускова и проведенному анализу реакций в составе цикла образования - распада Н2О2 процесс, включающий реакции (7-12), должен иметь цепной характер. Весьма вероятно поэтому, что, наблюдаемые колебания уровня Н2О2 в воде связаны с вышеуказанной спецификой механизма протекания самого процесса.

3. Серии опытов с дистиллированной водой, проведенных на коротких интервалах времени, показали, что изменения температуры и света при смене

дня и ночи достаточны, чтобы индицировать суточный ритм изменений концентрации Н2О2 в открытых природных водоемах.

120 100 80

1 2 3 4 5 время (часы)

Рис 2а Эффект света. Динамика накопления Н2О2 (нМ) в дистилляте на рассеянном дневном свету. Условия проведения эксперимента• - постоянная температура + 5°С, - время проведения -5 часов, - посуда кварцевая

10

5 6-

о

х 4

0 12 3

время (часы)

Рис 2 б. Эффект интенсивного электрического освещения на накопление Н202 (нМ) в дистилляте Условия проведения эксперимента■ - постоянная температура + 20"С, - время проведения - 5 часов, - посуда кварцевая.

Эксперименты проведены при постоянном параллельном контроле (нижняя пунктирная линия) - очень слабый рассеянный электрический свет.

4. Свойство «внешних» АФК выступать в роли клеточных медиаторов и гормонов позволяет говорить о том, что суточные измерения АФК в окружающей среде (в нашем случае в воде) могут вызывать суточные колебания гормонального баланса организма, и, соответственно, влиять на суточный ритм соответствующих биохимических систем.

5. Взаимодействие кислорода с органическими соединениями в мягких, выбранных нами условиях, приводит к образованию перекиси водорода.

6. Реакция образования перекиси водорода в присутствии р-нафтола и менадиона протекает не очень эффективно и наблюдается при относительно высоких концентрациях изученных веществ (> 0,2 мкМ). Скорость реакции

образования Н202 падает с уменьшением концентрации органических добавок (рис. 4).

7. Влияние света на генерацию Н202 оказалось противоположным ожидаемому. Оказалось, что количество Н202, измеряемое на свету, ниже концентрации перекиси, которая образуется в темноте (рис. 5).

Ж

X

" 3

5Д5±0,7

70 (0

г ю £

| 40

И М23

Рис 3 Влияние добавки органического соединения (100 нМ (5-нафтола) на содержание Н202 в дистилляте при +20°С (I - содержание Н2О2 в исходной воде, 2 -содержание Н2Р2 в воде с (¡-нафтолом) Измерения проведены через 4 суток после внесения р-нафтола

Рис 4 Влияние менадиона на накопление Н202 (Концентрация менадиона' 1-0,2-20 нМ, 3-0,2мкМ, 4-2мкМ) Условия эксперимента' - поднятие температуры от + 20°С до + 40°С в течение 10 минут, время выдерживания при + 40°С - 3 часа, -темнота)

Важно подчеркнуть, что в темноте генерация Н2О2 (при +20°С) в системе «вода - растение» происходит существенно интенсивнее, чем в таких же условиях в дистиллированной воде.

Наблюдаемые эффекты свидетельствуют в пользу того, что в темноте возрастает относительная активность НАДФН - оксидазы, на свету -пероксидаз.

Далее проведены 8 групп экспериментов по изучению влияния различных концентраций несимметричного диметилгидразина на процесс

генерации Н202 в различных системах: в дистиллированной воде (рис. 6, 7), с определением влияния света в системе «гептил - вода» (рис. 8) и с добавлением в эту систему углеродосодержащих органических примесей (рис. 9), а также растений (рис. 10,11, 12, 13).

7 6 -5 -! 4-з-

X

21 ■ 0-

Рис 5 Влияние света на образование Н2О2 в системе «вода - проростки пшеницы» Особые условия: эксперимент 1 -на свету, эксперимент 2-е темноте Общие условия: рНбО, температура -+20°С, время инкубации растений в воде перед измерением - 2 минуты

Рис 6 Эффект низких концентраций НДМГ на накопление перекиси водорода в чистой воде (I - контрольный опыт, 2 -концентрация НДМГ 0 02 мкг/л, 3 -концентрация НДМГ 0.2 мкг/л )

В этих экспериментах были получены неожиданные результаты. Как видно на рис. 6, низкие концентрации НДМГ оказывают резкое повышение стационарного уровня Н2О2 в системе. В тоже время более высокие концентрации оказывают гораздо меньший эффект.

Результаты опытов, приведенные на рис. 7, показывают, что существует достаточно низкий диапазон концентраций НДМГ, при которых наблюдается максимальный эффект воздействия этого соединения на уровень Н2О2 в системе при +40° С. Эффект света (рис. 8) показывает, что в дневных условиях НДМГ способен гораздо сильнее изменять уровень АФК в водных системах.

Рис. 7. Влияние НДМГ на концентрацию Н202 в водной фазе, возникающую при подъеме температуры раствора «НДМГ - вода» с +20° до +40°С в течение 10 минут и последующего нагревания при +40° С в течение 3-х часов в условиях темноты (приведены средние значения концентраций Н202 из 4-х измерений для каждой точки, -концентрация НДМГ дана в мкг/л, - шкала на оси абсцисс -логарифмическая)

Рис. 8. Влияние света на генерацию Н202 в водном растворе очень малых количеств НДМГ. Условия опыта: освещение - лампа 60 м>,расстояние от лампы до кюветы -0,3 м, время экспозиции - 2 часа, поставлен тепловой фильтр, температура +23Х?, А - чистая вода(контроль), Б-добавлен НДМГ-0,02мкг/л, С - добавлен НДМГ-20мкг/л.

Интересно отметить, что аномальная концентрационная зависимость процесса генерации Н202 от концентрации НДМГ при освещении такая же, как в темноте при температурном скачке. Это можно рассматривать как косвенное указание на то, что существенные стадии механизма реакций в разных условиях не различаются.

Сопоставление данных, приведенных на рис. 8 и 9 показывает, что присутствие в воде углеродсодержащей органики не вносит существенных изменений на генерацию Н202 в присутствии НДМГ в воде - как в темноте, так и при освещении.

Система «вода - растение» качественно отличается по своей реакции на воздействие НДМГ. Синтез Н202 в такой системе при добавлении низких

концентраций НДМГ не усиливается. Эффективными, как генераторы Н202, оказываются относительно высокие концентрации НДМГ (рис. 10,11).

Рис 9 Эффект воздействия НДМГ и менадиона на регенерацию Н202 в воде под влиянием света при температуре + 20°С (I- вода; менадион -02 мкМ, НДМГ-0 02мкг/л, свет, 2- вода; менадион -0.2 мкМ, НДМГ-0.02мкг/л, темнота, 3- вода, свет, 4- вода, темнота)

Рис 10 Влияние НДМГ на генерацию Н202 в системе «этиолированные проростки пшеницы - вода - гептил» (1 - контроль, 2-0 002 мкг/л НДМГ, 3 -0 02 мкг/л НДМГ, 4 -0.2 мкг/л НДМГ)

3.53-

„ 2,5-х

4 2

О

= 1,51 -0,50

1.5М.5

110,1 Н

I

. И, I

м±1

»±0,6

3,2±0,8

2 3

Рис 11. Влияние НДМГ на генерацию Н202 в системе «вода - зеленые проростки пшеницы» (1 контроль, 2-0 002 мкг/л НДМГ, 3-0.02мкг/л НДМГ, 4-02мкг/л НДМГ)

Рис 12 Влияние НДМГ на генерацию Н202 в системе «вода - проростки пшеницы», выращенные в темноте (1- контроль, 2- проростки, выращенные на среде, содержащей 0.2 мкг/л НДМГ, 3- к проросткам (из опыта 2) после промывки перед измерением добавлена новая порция НДМГ (0.02 мкг/л) Условия проведения опыта -0 02 мкг/л- конечная концентрация НДМГ в среде измерения, экспозиция - 2 минуты)

На рис. 12 видно, что выращивание растений в присутствии НДМГ мало влияет на содержание Н2О2 в системе. С другой стороны, можно видеть, что в такой системе, когда растения выращены на гептиле, новая порция НДМГ, добавленная перед измерением в систему, выступает как ингибитор генерации Н2О2. Наблюдаемое качественное изменение воздействия НДМГ следует, очевидно, рассматривать как следствие адаптации растений к гептилу.

Сопоставление данных рис. 8 и 11 показывает снижение растениями эффектов усиления генерации Н202 в водной среде, которые наблюдаются при внесении НДМГ в чистую воду.

Специально проведенные измерения показали, что растения обладают способностью быстро разлагать (в течение 2-3 минут) перекись водорода, добавленную в систему «вода - растение». Они эффективно осуществляют этот процесс и в темноте, и на свету, при этом на свету этот процесс протекает несколько быстрее (рис. 13).

Новым направлением работ является поиск соединений, снижающих влияние НДМГ на уровень АФК в водных средах.

Стационарная концентрация АФК в клетке определяется, с одной стороны, собственными внутриклеточными системами, с другой, - внешними факторами, в том числе, загрязнениями среды и ксенобиотиками, попавшими в ткани организма. Одним из таких загрязнений является НДМГ, который в очень низких концентрациях повышает уровень Н202 в разных водных средах.

Раньше речь шла о непосредственном воздействии кислородных радикалов, разрушающих клеточные структуры, на новом уровне знаний стало очевидным, что «внешние» АФК обладают прямым действием на организмы и клетки - они могут выступать в роли медиаторов в составе сигнальных систем внутри клетки.

Можно указать на известную корреляцию, существующую между способностью НДМГ генерировать свободнорадикальные формы кислорода

и повышенной долей онкологических заболеваний среди персонала, имеющего прямые контакты с НДМГ. Поскольку зоны загрязнения НДМГ ограничены и контингент людей в таких зонах невелик, представляется возможной программа создания «антидотов гептила».

В работе проведен поиск нетоксичных антидотов гептила, блокирующих изменения уровня АФК в водных системах, вызванные этим соединением.

Использованы два вещества, экстрагированные из растений, применяемых в качестве пищевых добавок - это имбирь и куркума. Из них были выделены соединения: куркумин и дженерол . Как видно из рис. 14, оба препарата проявляют ярко выраженную активность, как блокаторы образования АФК (Н202) в системе «гептил - кислород - вода».

>,>±0.32

1,510,15

Т з

100-, >8112

80 ■ М ГА

60- Щ

ад- Щ

го-

0-

¿6X4,1 1

2112,1

9,912,0

I п

4 опыт

Рис 13 Опыты с добавлением 10 нМ перекиси водорода в системе «вода - проростки пшеницы» (I - на свету, 2-е темноте)

Инкубация растений с Н2О системе «вода - растение Н2О2» составляет - 2 минуты

Рис. 14 Влияние куркумина (№ 1) и смеси дженерола и куркумина (№ 2) в соотношении Г 1 на генерацию Н202 в присутствии НДМГ. (1- вода + 0 02 мкг/л НДМГ, 2 - вода + 0.02 мкг/л НДМГ + куркумин (№ 1), 3 - вода + 0.02 мкг/л НДМГ + смесь (N9 2), 4 - вода дистиллированная) Вещество № 1 взято в концентрации 0.48 мкг/10 мл Смесь № 2 - в концентрации 034мкг/10мл Условия опыта' температурный скачок с +20°С до + 40°С в течение 10 минут, затем -выдерживание при + 40°С в течение 3-х часов.

Они снижают концентрацию Н202 до уровня, который наблюдается в чистой воде (рис. 14). При этом сами они (в отсутствие НДМГ) не повышают уровня Н202 в воде в выбранных нами условиях.

Полученный результат показывает принципиальную возможность создания блокаторов внешней токсичности в системе «гептил - вода».

Таким образом, показано, что отмеченный выше «буферный» эффект растений обусловлен существованием ферментов (каталазы, пероксидазы) в поверхностных структурах растений, разлагающих перекись водорода в воде; в том числе перекись водорода, образующуюся в системе под влиянием НДМГ.

Предложенный автором биолюминесцентный метод оценки экологического состояния среды экспериментально апробирован в полевых условиях при обследовании района падения первой ступени ракеты-носителя «Протон».

Пробы воды отбирали на местах падения первой ступени и близлежащих территориях из различных источников. Во пробах воды определяли рН. Измерения показали что рН в местах отбора проб был нейтральным или сдвинут в кислотную область. Биолюминесцентный анализ проводили с использованием в качестве тест-организма морских бактерий, светимость которых зависит от концентрации в среде хлорида натрия. Поэтому был необходим контроль за соленостью отобранных проб и приведение ее к солености морской воды. О солености водных проб судили по их электропроводности. Наибольшей электропроводимостью обладают пробы 5 и 9. Вероятно, это связано с сильной засоленностью в местах отбора. После выравнивания электропроводности водных проб приступали к измерению показателя токсичности на приборе «Биотокс-7».

Результаты измерений приведены в таблице.

Пробы воды из различных потенциально загрязненных гептилом источников _1_в результате падения первых ступеней ракетоносителя_

№ про б Места взятия проб воды Расстояние от места падения ступени РН «Протон» км. (сент. 1999 г.), Значения рН Электро провод-ность, мв Интеграль ная токсичность

1. Река Сулу 230 5,0 3.5 2.1

2. Река Аксу 190 6,5 4.2 2.5

3. Река Кенсаз (2 км. на сев.-зап. От п. Тогускен) 144 5,0 41 1.9

4. Река Диссенбай (переправа) 27 5,5 4.3 1.6

5. Вода из ямы (1км к сев.-зап. от триго-пункта Карамолы (47'10"44.5"'-66'32"23.1'") 19 6,0 23.1 12.4

6. Родник(47'17"4.9"'-66'35"43.6"') 9 5,5 1.3 0.7

7. Колодец (глубина 2 м; 3,5 км на юг.-вост.от триго-пункта Биктобе) 10 7,0 4.2 1.5

8. Колодец (2,5 м); (47'13"52.5'"- 66'38"1.7"') 11 6,0 2.7 1.9

9. Пересохшая река в 100 м от места падения ступени РН «Протон» в 1992 г. (47'32"1.4"'-66'43"15.6"') 13 5,0 15.8 19.7

10. Родник(47'32"1.4"'-66'43"15.6"') 13 6,5 3.0 0.9

11. Ручей (47'32" 1.4"' -66'43"15.6"') 13 7,0 3.8 0.9

12. Ручей (ниже плотины; 47'34"3.7"' -66'43"39.6"') 29 6,0 3.7 1.1

13. Водоснабжение гостиницы «Металлург» г. Джезказган 210 6,0 1.9 0.5

Примечание: пробы воды из источников № 1-4, 12 и 13 взяты за границами района падения. Эти пробы были использованы в качестве контроля фона.

Из таблицы видно, что наибольшей интегральной токсичностью обладают пробы воды 5 и 9, в пробах 8, 10-12 интегральная токсичность воды невелика.

Выводы.

1. Обнаружено свойство НДМГ резко повышать уровень АФК (Н202) в системе «вода - воздух». Реакция реализуется в мягких условиях в температурном диапазоне +20°С - +40°С при низких концентрациях гептила

(10"8 - 10"10 М, что составляет 0.1-0.001 ПДК).

2. Путем сопоставления полученных данных по синтезу Н202 в воде с данными литературы по биологической активности АФК (Н202) выявлен новый потенциально важный канал воздействия на экосистемы низких концентраций НДМГ, обусловленный свойством этого соединения резко нарушать нормальный фоновый уровень АФК в водоемах и в атмосферной влаге.

3. Показано, что в системе «вода - гептил - растение» измеряемое количество Н202 существенно снижено по сравнению с системой «чистая вода - гептил». Дано экспериментально подтвержденное объяснение механизма этого явления.

4. Предложена методика оценки токсичности территорий для выявления загрязнений НДМГ, основанная на эффекте тушения люминисценции бактерий в присутствии этого токсиканта. Эффективность методики продемонстрирована в полевых условиях.

5. Обоснована возможность защиты организмов от воздействия низких концентраций НДМГ. Предложен подход для выявления биологически активных веществ, эффективно снижающих воздействие низких доз НДМГ.

Показана перспективность использования биологически активных добавок на основе куркумина (в концентрации 0,048 мкг/мл) и на основе сочетания соединений дженерола и куркумина в соотношении 1:1 (по 0,017 мкг/мл) для защиты населения и персонала.

6. Результаты исследований могут служить основой для формирования требований к методам и средствам обнаружения НДМГ в объектах окружающей среды, а также к НИОКР, направленных на обеспечение экологической безопасности ракетно-космической деятельности.

Основные публикации автора по теме диссертации:

1. Брусков В. И., Кондратьев А. Д., Калиниченко Е. Н., Чалкин С. Ф., Шатров Я. Т., Ягужинский JI. С. "Новый подход к оценке механизма токсического действия гептила." Материалы 6-го научно-практического семинара "Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники", Москва СИП РИА 2004 г.

2. А. Д. Кондратьев "Исследование процессов образования активных форм кислорода под влиянием низких концентраций гептила." НТО, НТЦ "Экон ЦНИИмаш", 2004 г, 83 с.

З.О.А. Шпигун, А.Д. Кондратьев «Особенности оценки воздействия низких концентраций гептила на объекты окружающей среды при эксплуатации ракетной техники» Экологический вестник научных центров черноморского экономического сотрудничества №4 2004г.

4. Д.Г. Артамонов, Т.Б.Зайцева, Б.М. Ласкин, В.Г. Пимкин, А.Д. Кондратьев, В.Ф. Писарев «Термические методы обезвреживания грунта и отделяющихся частей ракет-носителей в местах их падения» Материалы научно-практической конференции 19-22 сентября 1995г. Экологические аспекты воздействия компонентов жидких ракетных топлив на окружающую среду. Санкт -Петербург 1996г.

5. А.Д. Кондратьев, Т.В. Королева, П.П. Кречетов, О.В. Черницова «Разработка системы экологического мониторинга при осуществлении ракетно-космической деятельности.» Материалы международной конференции «Взаимодействие общества и окружающей среды в условиях глобальных и региональных изменений» Москва-Барнаул 2003 г.

6. А.Д. Кондратьев, O.A. Шпигун. Новый биотест на содержание несимметричного диметилгидразина./ Тезисы Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004». Москва, 2004. С.330.

7. А.Д. Кондратьев «Концепция создания комплексной системы мониторинга, оценки, прогнозирования и контроля экологической обстановки при осуществлении ракетно-космической деятельности.» Материалы научно-практического семинара "Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники", Двойные технологии №2 Москва 2002 г.

В. А.Д. Кондратьев «Экологический мониторинг районов, подверженных воздействию ракетно-космической деятельности» Вестник Каз ГУ им. Аль-Фараби. Серия экология №3 Алма-ата 2005 г. 9. Кондратьев А.Д., Королева Т.В., Кречетов П.П., Черницова О.В. «Почвенный экологический мониторинг в районах падения отделяющихся частей ракет-носителей». Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв». Москва, 2004 г., с. 228-229

И 085 ?

РНБ Русский фонд

2006-4 7608

Подписано в печать 19 мая 2005 г. Заказ 465. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ. Тел. 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кондратьев, Андрей Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.1 Гидразины и активные формы кислорода (АФК) -биологические свойства.

1.2 Гидразины - онкология - мутагенез.

1.3 Канцерогенные продукты, образующиеся при распаде (окислении) гидразинов.

1.4 Компоненты клетки, являющиеся объектами атаки гидразинов и продуктов их окисления.

1.5 Образование АФК в клетке.

1.6 Участие АФК в процессах митоза и апоптоза.

1.7 ДНК - вторая очевидная мишень АФК в клетке.

1.8 Активные формы кислорода (АФК) - экологически значимые составляющие окружающей среды.

2. ВЫБОР МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ, ОБОРУДОВАНИЯ

И РЕАКТИВОВ.

2.1 Выбор методов и средств аналитического контроля для проведения исследований.

2.2 Методики.

2.3 Оборудование и приборы.

2.4 Реактивы и материалы.

3. РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Гептил, как фактор, изменяющий нормальный уровень АФК в водных системах.

3.2 Проблема «внешней» токсичности.

3.3 Конкретная задача работы.

3.4 Роль гомеостаза АФК.

3.5 Базовая реакция. Образование АФК в воде.

4. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Качественная характеристика водных систем, как генераторов Н

4.1.1 Особенности процесса образования Н в чистой воде.

4.1.2 Влияние органических добавок на процессы генерации Н202 в воде.

4.1.3 Влияние света на уровень Н202 в системе «вода - растение».

4.2 Генерация Н202 в водных системах, содержащих гептил.

4.2.1 Влияние низких концентраций гептила на генерацию Н202 в дистиллированной воде.

4.2.2 Исследование влияния света на генерацию Н в системе «гептил — вода».

4.2.3 Совместное влияние гептила и углеродсодержащих органических примесей на генерацию АФК в водных системах на свету и в темноте.

4.2.4 Изучение влияния гептила на образование Н202 в системе «вода -растение - гептил».

4.2.5 Поиск соединений, снижающих эффект гептила на уровень АФК в водных средах.

5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД ЗАГРЯЗНЕННЫХ ГЕПТИЛОМ.

5.1 Использования метода биолюминесцентного анализа при экологическом мониторинге территорий загрязненных гептилом

5.2 Результаты экспериментальной отработки метода в полевых условиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние низких концентраций несимметричного диметилгидразина на активные формы кислорода в объектах окружающей среды"

Как известно [18, 28, 34, 35] на многих отечественных и зарубежных ракетах-носителях (РН), разгонных блоках (РБ), космических аппаратах (КА), межконтинентальных баллистических ракетах (МБР) в качестве одного из компонентов ракетного топлива (КРТ) десятки лет используется и будет продолжать использоваться еще длительный период несимметричный диметилгидразин (НДМГ), другое название - гептил.

НДМГ относится к первому классу опасности. Токсичен при любых путях поступления в организм — через желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, кожу и слизистые [11, 111, 120, 130]. Обладает отдаленными эффектами воздействия. Потенциальная опасность при попадании в объекты окружающей среды определяется высокой летучестью, неограниченной растворимостью в воде, способностью к миграции, накоплению, высокой стабильностью в глубоких слоях почвы, образованием при разложении не менее опасного вещества — нитрозодиметиламина (НДМА) и ряда других менее опасных.

Применение гептила на ракетах носителях типа «Протон», «Циклон», «Космос», «Днепр», «Рокот», разгонных блоках типа «Бриз», «Фрегат» и др., обуславливает необходимость специальных мер защиты персонала при работе на наземных объектах, стендово-испытательной базе, космодромах, хранилищах и т.п. Многолетний опыт эксплуатации токсичных КРТ показывает, что комплекс разработанных и внедренных технологий, а также организационно-технических мероприятий, в основном, обеспечивает их безопасную транспортировку, хранение, заправку и слив из изделий. Несмотря на это в процессе эксплуатации имеют место небольшие проливы и газообразные выбросы при заправках различных типов изделий и испытаниях их двигателей на стендах [ 34, 35].

В последние годы начаты работы по санитарно-гигиенической оценке экологической ситуации и анализу заболеваемости в районах, загрязненных токсичными компонентами ракетных топлив. Однако пока практически не разработаны санитарно-токсикологические критерии комплексной оценки опасности загрязненных объектов окружающей среды. Существенные климато-географические и социально-экономические различия регионов, где расположены загрязненные территории, обуславливают необходимость разработки специфических подходов к проведению эколого-гигиенических обследований с учетом особенностей конкретных районов. Полученные предварительные гигиенические нормативы допустимого содержания загрязненных веществ и продуктов их трансформации в почвах, водоемах, растительности, продуктах питания требуют экспериментального подтверждения и теоретического обоснования [34].

Проливы и выбросы значительных количеств токсичных КРТ могут происходить в районах падения (РП) отработавших ступеней ракет носителей и при авариях РН (на старте, в полете, при транспортировке).

Проведенные в последние годы исследования состояния экосистем в местах проливов токсичных КРТ свидетельствует о серьезности экологической ситуации на территориях РП первых ступеней РН «Протон»,

Космос», «Циклон» [26]. В местах падения ступеней в ряде случаев выявлены геохимические аномалии НДМГ и его метаболитов в растительном покрове, почве и донных отложениях с содержаниями, превышающими нормативные показатели (ПДК, ОБУВ) [8, 9, 10, 15, 16, 25, 27,]. В результате атмосферного переноса паров и аэрозолей КРТ может происходить вторичное загрязнение растительного покрова и почвы низкими концентрациями НДМГ. Имеются случаи обнаружения НДМГ в кормовой растительности, овощах, что может приводить к попаданию его в организм человека.

Таким образом, гептил, как большинство ксенобиотиков, нарушает экологический статус среды [13, 14, 17, 23] и токсичен для человека. Гептил относительно быстро исчезает с поверхности почвы и из водоемов, однако гептил в низких концентрациях в донных отложениях и под поверхностным слоем почвы сохраняется достаточно долго и может оказывать влияние на экологический статус территорий.

Такие свойства гептила требуют выяснения механизмов действия низких концентраций его на живые системы, а также определяют необходимость разработки эффективных методов анализа его токсичности на местности.

Токсикология и фармакология выделяют два типа воздействия физиологически активных соединений на организмы. К первому типу веществ, которые условно можно назвать факторами прямого действия, относятся вещества, непосредственно взаимодействующие с системами основного метаболизма клетки. Соединения второго типа воздействуют на системы регуляции клетки, нарушают или усиливают гормональные сигналы системы передачи информации на уровне клетки и целого организма.

Такая классификация отчасти условна, однако она удобна тем, что отражает различные принципы формирования биологического ответа живой системы на внешнее химическое воздействие.

Примером биологически активных соединений первой группы являются, например, различные электрофильные агенты (аналоги иприта), структурные аналоги субстратов основного метаболизма (препараты сульфамидного ряда, структурные аналоги пуринов и пирамединов и другие типы ксенобитиков). Ко второй группе соединений относятся аналоги гормонов (например, аналоги стероидных гормонов, гормонов растений и т.д.), а также соединения, нарушающие синтез гормонов и прохождение гормональных сигналов.

Совершенно очевидно, что воздействие на гормонозависимые, сигнальные системы является мощным фактором, влияющим на функционирование организма и клетки. Сигналы гормонов в живом организме часто имеют системы усиления. Благодаря этому гормоны и их медиаторы вызывают весьма значительный биологический эффект, в очень низких концентрациях они очень эффективны как регуляторы метаболизма.

На протяжении последнего десятилетия происходит качественное изменение наших представлений о гормонах как эндогенных регуляторах метаболических процессов клетки и организма, быстро накапливаются экспериментальные результаты, свидетельствующие о том, что соединения, непрерывно синтезирующиеся во внешней среде - в воде и воздухе, играют в живых системах роль гормонов - клеточных медиаторов самого высокого ранга. Речь идет об активных формах кислорода (АФК), которые по современным данным [44, 66, 82, 83, 88] контролируют процессы деления клеток и апоптоз - так называемую программируемую клеточную смерть, вызываемую специальной программой разборки клетки и присутствующей в эукариотических организмах. При этом АФК включены в каскады многих сигнальных систем клеток [45, 47, 63, 65, 82, 99, 104, 110, 118, 123].

Активными формами кислорода принято называть высокореакционноспособные молекулы, образующиеся в природе из кислорода и воды. К таковым относятся синглетный кислород (02|), гидроксил-радикал (ОН), супероксид-радикал (62Н), который часто г г существует в форме супероксид-иона - ( 02 ), и перекись водорода (Н202) — наиболее устойчивая молекула в ряду этих соединений. Из них могут образовываться все остальные формы АФК. Иногда к группе АФК причисляют озон (03). Известно, что АФК образуются внутри клеток и тканей [76], существуют ферменты, которые их эффективно разлагают. Традиционно считалось, что АФК - это побочный продукт метаболизма, который разрушает биологические структуры, а соответствующие ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза и др.), разрушающие АФК, - защищают клетку от окисления.

Эти представления сейчас сохраняют свою силу только в условиях образования очень высоких концентраций АФК, которые иногда имеют место при атаке клетки - мишени лимфоцитами.

В нормальных условиях реакции синтеза и разрушения АФК вполне физиологичны - соответствующие ферменты обеспечивают поддержание необходимого уровня АФК в клетке при различных режимах метаболизма.

Для настоящего исследования наиболее существенным является следующее обстоятельство: по новым данным [12] не только эндогенные АФК, но также АФК, образующиеся вне организма, во внешней среде, оказываются жизненно необходимыми для нормального функционирования организмов теплокровных живых существ.

Эти наблюдения заставляют по-новому рассмотреть характер взаимодействия организма со средой. Настоящий этап развития знаний свидетельствует в пользу того, что среда (в широком смысле) синтезирует гормоны-медиаторы, непосредственно управляющие функционированием стволовых биохимических процессов клетки и гормональными системами высших организмов.

Последнее обстоятельство потребовало нового подхода к оценке токсичности гептила.

Если раньше рассматривался только эффект прямого действия гептила на организм, то новая, более широкая, формулировка, представленная в настоящей работе, акцентирует внимание на возможности воздействия гептила на процессы генерации гормонов-медиаторов (АФК) в окружающей среде, определенный уровень которых стабилизирует нормальное существование организмов.

Таким образом, все вышесказанное свидетельствует об исключительной актуальности задачи всестороннего исследования влияния гептила, включая его низкие концентрации, на различные объекты окружающей среды и, в первую очередь, на воду, присутствующую практически во всех природных средах.

Исходя из этого, сформулирована цель настоящей работы - исследовать теоретически и экспериментально продемонстрировать эффект влияния гептила на уровень АФК в окружающей среде, прежде всего в водных системах.

Научная новизна исследований заключается в следующем:

- выявлена определяющая роль АФК в протекании биологических процессов в окружающей среде при воздействии малых и сверхмалых концентраций НДМГ;

-показано, что низкие и очень низкие концентрации гептила резко изменяют нормальный уровень АФК в водных системах;

- предложен новый подход к определению токсичности гептила, основанный на его способности к восстановлению кислорода до супероксид-аниона и на изменении гомеостаза АФК в воде;

Практическая значимость проведенных исследований в том, что:

- предложен механизм воздействия НДМГ на биологические формы жизни, оценено влияние гептила на уровень АФК (Н202) в водных системах;

-установлено воздействие НДМГ на биологические формы вплоть до очень низких концентраций (ЮМ); предложена методика оценки интегральной токсичности объектов окружающей среды, загрязненных, в первую очередь, гептилом и продуктами его превращения;

- предложена программа создания «антидотов гептила» для снижения уровня воздействия гептила на обслуживающий персонал и население на объектах и территориях, загрязненных гептилом.

Результаты исследований реализованы:

- при формировании программы НИР и ОКР Росавиакосмоса в части разработки технических заданий на проведение оценок влияния гептила на окружающую среду и обоснования методов и характеристик средств экологического мониторинга загрязненных гептилом территорий (комплексная НИР «Эколог», ОКР «Экое - К» [24 , 33]);

- при определении облика и состава технических средств системы экологического мониторинга, создаваемой в рамках совместной Российско -Казахстанской программы «Оценка влияния запусков ракет-носителей с космодрома «Байконур» на окружающую среду» [1, 30 ].

На защиту представляются:

- новый подход к определению токсичности гептила, заключающийся в том, что гептил нарушает свойства АФК во «внешней» среде, приводящие, в свою очередь, к нарушениям функционирования гормональных систем живых организмов;

- результаты экспериментального подтверждения значимости АФК, образующихся и трансформирующихся во внешней среде под воздействием гидразинов, как «внешних» регуляторов «внутренних» биохимических систем организмов;

- предложения по программе создания «антидотов гептила» для снижения уровня влияния гептила на здоровье персонала, работающего с гептилом, и населения, временно находящегося на загрязненных территориях.

Обзорная и теоретическая части исследования, а также экспериментальная отработка метода определения токсичности объектов окружающей среды в условиях эксплуатации выполнены автором во ФГУП ЦЭНКИ. Экспериментальные исследования по оценке влияния гептила на АФК в различных экологических системах проводились в НТЦ «Экон ЦНИИМаш», с использованием лабораторной базы химфака МГУ им. М.В. Ломоносова. Автор выражает искреннюю благодарность специалистам этих организаций за содействие и помощь в проведении исследований.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Кондратьев, Андрей Дмитриевич

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ.

1. Направление настоящей работы определено недавним открытием новых свойств активных форм кислорода, образующихся в окружающей среде и способных регулировать секрецию гормонов у теплокровных [12] и играть роль клеточных медиаторов [65].

Неожиданным в этом открытии явилось то обстоятельство, что указанной активностью обладает фракция АФК, образующаяся вне организма - в среде обитания: воде, воздухе [12].

Было показано также [65], что АФК, находящиеся вблизи наружной поверхности клеток, могут регулировать их внутренние биохимические реакции

Эффекты «внешних» АФК настолько существенны, что резкое нарушение их уровня, в частности, в воздухе, согласно [12] вызывает гибель животных вследствие нарушения функционирования гормональных систем.

2. В теоретической части данной работы показано, что вышеуказанное свойство АФК выполнять роль «внешних» гормонов заставляет качественно по-новому взглянуть на роль среды обитания для живых систем, которая является генератором ключевых гормонов.

Анализ такой ситуации приводит к заключению, что нормальное существование организмов в экосистемах возможно только при поддержании определенного уровня (гомеостаза) АФК во «внешней» среде. Соответственно, вещества, нарушающие этот уровень, следует рассматривать как «внешние» токсины.

3. В развитие двух важных особенностей реакции «спонтанного» образования АФК в воде (реакция Брускова [5]), в работе экспериментально показана зависимость скорости этой реакции от освещения. Тем самым получено экспериментальное обоснование возможности существования периодического изменения концентрации Н202 (АФК) (в течение суток при смене дня и ночи) в открытых водоемах.

Кроме того, в воде и в системе «вода — гептил» были обнаружены спонтанные высокоамплитудные колебания уровня АФК в большой шкале времени. Таким образом, была получена новая важная информация о свойствах системы генерации Н202 (АФК) в чистой воде.

4. В экспериментальной части работы проведено также детальное изучение генерации Н202 под действием гептила в водных системах в условиях температурного скачка, при освещении, в присутствии органических примесей и в присутствии растений. Эффект гептила наблюдается практически всегда. Растения, как было показано, обладают способностью разлагать Н202, снижать эффект гептила как стимулятора генерации Н202 в водных системах и могут поэтому выступать в роли протекторов, защищающих среду (водную) от нарушений, вызванных низкими концентрациями гептила.

Впервые показано, что гептил в предельно низких концентрациях

10~3 М) способен в определенных условиях искажать (повышать) «нормальный» фон АФК (Н202) в окружающей среде.

5. Впервые проведен поиск нетоксичных антидотов гептила, блокирующих изменения уровня АФК, вызванных гептилом в водных системах. Полученные результаты показывают принципиальную возможность создания блокираторов внешней токсичности (в частности в системе «гептил-вода») для профилактики заболеваний персонала, работающего с гептилом.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы, имеющие важное практическое значение:

1. Обнаружено свойство гептила резко повышать уровень АФК (Н202) в системе «вода - воздух». Реакция реализуется в мягких условиях в температурном диапазоне +20°С - +40°С при очень низких концентрациях гептила (10"8 - Ю~10 М, что составляет 0.1-0.001 ПДК).

2. Путем сопоставления полученных данных по синтезу Н202 в воде с данными литературы по биологической активности АФК (Н202) был выявлен новый потенциально важный канал воздействия на экосистемы сверхнизких концентраций гептила, обусловленный свойством этого соединения резко нарушать нормальный фоновый уровень АФК в водоемах и в атмосферной влаге.

3. Показано, что в системе «вода - гептил - растение» измеряемое количество Н202 существенно снижено по сравнению с системой «чистая вода - гептил». Дано экспериментально подтвержденное объяснение механизма этого явления.

4. Предложена методика определения гептила и токсических продуктов его разложения, основанная на эффекте тушения люминесценции бактерий сильно разбавленными водными растворами гептила. Эффективность методики продемонстрирована в полевых условиях.

5. Обоснована возможность защиты организмов от воздействия низких концентраций НДМГ. Предложен подход для выявления биологически активных веществ, эффективно снижающих воздействие низких доз НДМГ. Показана перспективность использования биологически активных добавок на основе куркумина (в концентрации 0,048 мкг/мл) и на основе сочетания соединений дженерола и куркумина в соотношении 1:1 (по 0,017 мкг/мл) для защиты населения и персонала.

6. Результаты исследований могут служить основой для разработки специфических тактико-технических требований к методам и средствам обнаружения гептила, включая низкие концентрации в объектах окружающей среды, а также к проведению НИОКР, направленных на обеспечение экологической безопасности ракетно-космической деятельности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кондратьев, Андрей Дмитриевич, Москва

1. Бекина P.M., Шувалов В.А., Лысенко Г.Г. и др. Исследование механизма фотоокислительных превращений органических кислот в хлоропластах //

2. Физиология растений 1975. - Т. 22, выпуск 4. - С. 680-687.

3. Благодатская Е.В., Ананьева Н.Д. «Оценка устойчивости микробных сообществ в процессе разложения поллютантов в почве.». Почвоведение, 1996 г.

4. Брусков В.И., Масалимов Ж.К., Черников А.В. Образование активных форм кислорода под действием тепла при восстановлении растворенного кислорода воздуха //

5. Докл. РАН. 2001. - Т. 381, № 2. - С. 1-3.

6. Большаков Г. Ф. «Химия и технология компонентов жидкого ракетного топлива». Л. Химия 1983 г., 256 с.

7. Ворожейкин А.П., Касимов Н.С., Королева Т.В., Проскуряков Ю.В. «Геохимическое воздействие ракетно-космической техники на окружающую среду». Геохимия ландшафтов и география почв. «Ойкумена», Смоленск, 2002 г., с. 223-242.

8. Горшкова Р.Б., Кушнева B.C. «Современные токсиколого-гигиенические критерии безопасности населения в районах осуществления ракетно-космической деятельности». Космонавтика и ракетостроение, 1999г. №15, с. 80-85

9. Гольдштейн Н.И. Применение газофазного супероксида 02 в клинике // Рос. мед. журн. 2003. - № 4. - С. 49-52.

10. Еронин Ф.Т. «Влияние НДМГ на процессы аммонификации в почве». Бюллетень токсикологии и гигиены ракетных топлив, 1974 г., №20, с. 88-91.

11. Касимов Н.С., Гребенюк В.Б., Королева Т.В., Проскуряков Ю.В. «Поведение ракетного топлива в почвах, водах и растениях». Почвоведение, 1994 г.,№9, с. 110-121

12. Касимов Н.С., Ворожейкин А.П., Королева Т.В., Кречетов П.П., Проскуряков Ю.В. «Ракетно-космическая деятельность как источник воздействия на окружающую среду». География, общество, окружающая среда. Том 4, Москва, 2004 г. с. 467-474.

13. Киселев А. И., Медведев А. А., Меньшиков В. А. "Космонавтика на рубеже тысячелетий. Итоги и перспективы." М., "Машиностроение", 2001, 670 с.

14. Кондратьев А.Д., Шпигун О.А. Новый биотест на содержание несимметричного диметилгидразина./ Тезисы Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004». Москва, 2004. с.330.

15. Кондратьев А.Д. «Экологический мониторинг районов, подверженных воздействию ракетно-космической деятельности» Вестник Каз ГУ им.Аль-Фараби. Серия экология. №3 Алма-ата 2005 г.

16. Кондратьев А. Д. "Исследование процессов образования активных форм кислорода под влиянием низких концентраций гептила."

17. НТО, НТЦ "Экон ЦНИИмаш", 2004 г., 83 с.

18. Королева Т. В., Самброс М.В., Кречетов П.П. «Особенности загрязнения бурых пустынно-степных почв несимметричным диметилгидразином на местах падения первых ступеней ракет-носителей (Центральный Казахстан)».

19. Двойные технологии, 2002 г. №2, с. 35-36.

20. Королева Т.В. «Ландшафтно-геохимический анализ загрязнения несимметричным диметилгидразином районов падений первых ступеней космических ракет». Автореферат диссертации кандидата географических наук. Москва, МГУ, 1995 г., 22 с.

21. Королева Т. В., Проскуряков Ю.В., Ворожейкин А.П., Самойлова Г.С. «Загрязнение почв несимметричным диметилгидразином и проблема их детоксикации в районах падения остаточных частей ступеней ракет-носителей».

22. Тезисы докладов 3 Международного совещания «Геохимия биосферы». Ростов-на-Дону. 2001 г., с. 103-105.

23. Кузнецов А. Н., Болысов А. И., Шатров Я. Т. "Обзор итогов десятилетних работ по обеспечению экологической безопасности ракетно-космической деятельности."

24. Материалы научно-практического семинара в 4 ЦНИИ МО, СИП РИА, "Двойные технологии", 2001, №3, с. 5 8.

25. Радилов А.С., Туржова Е. Бю «Биотестирование в решении экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды жидкими ракетными топливами». Материалы научно-практической конференции 19-22 сентября 1995 г.

26. Экологические аспекты воздействия компонентов жидких ракетных топлив на окружающую среду.» Санкт-Петербург 1996г. 57-60 с.30