Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Родственные отношения различных групп солнечников с другими группами простейших на основе маркёров 18S рДНК и актинового гена

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Родственные отношения различных групп солнечников с другими группами простейших на основе маркёров 18S рДНК и актинового гена"

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.212.3:57.086

Николаев Сергей Игоревич

Родственные отношения различных групп солнечников с другими группами простейших на основе маркёров 18S рДНК и актинового гена.

03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003 г.

Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Петров Н.Б.

доктор биологических наук, Подлипаев С.А.

кандидат биологических наук Асеев В.В.

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится 10 декабря 2003 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 6 ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук А/ Калинина Н.О.

™Т8?5Ь

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Молекуяярно-филогенетические исследования выявили колоссальное разнообразие одноклеточных эукариот, которые формируют на эукариотическом эволюционном дереве как минимум восемь основных групп (Baldauf, 2003). Это разнообразие может оказаться еще более широким в свете недавних исследований природных субстратов, выявивших путём анализа ДНК ряд эукариогических таксонов высокого ранга (Dawson, Расе, 2002; Edgcomb et al., 2002; Massana et al., 2002; Moreira, Lopes-Garcia, 2002) Точная оценка такого разнообразия затруднена тем, что до сих пор существует ряд групп легко определяемых и культивируемых простейших, для которых нет или недостаточно данных о последовательностях ДНК (Baldauf, 2003) Бедно представлены в молекулярных базах данных амебоидные зукариоты (Bolivar et al., 2001; Peglar et al., 2003).

Использование последовательности гена 18S pPHK как универсального филогенетического маркёра позволило установить родственные отношения между одноклеточными эукариотами на разном таксономическом уровне, однако в силу особенностей эволюции этого гена филогенетическое положение ряда таксонов остаётся невыясненным. В таких случаях требуется привлечение дополнительных групп данных, например, анализа последовательности других генов или изучения вторичной структуры гена 18S pPHK (Billoud et al., 2000; Rokas, Holland, 2000; Петров, Алёшин, 2002). Эти методы, применяемые параллельно, приводят к более чётким и достоверным результатам и позволяют постепенно переходить от изучения эволюции конкретного гена к эволюции генотипов.

В настоящее время данные о филогенетическом положении многочисленных таксонов солнечников в системе протистов остаются весьма противоречивыми. Исторически солнечники (Heliozoa Haeckel, 1866) были определены как свободноживущие амебоидные простейшие, объединяемые наличием мощной радиальной системы из расходящихся от

всего тела лучей, снабжённых стрекательными органеллами для заякоривания и доставки добычи. Солнечники - это пассивные хищники, питающиеся, в основном, мелкой подвижной добычей и являющиеся консументами высшего порядка в морских и пресноводных микробентосных сообществах. Даже в самых последних системах эукариот солнечники по-прежнему занимают высокий ранг типа НеНогоа, хотя на основании различий ультраструктурной организации было высказано предположение, что они являются сборной группой, включающей представителей эволюционно далёких таксонов, которые приобрели сходный внешний облик из-за сходства условий обитания (Шульман, Решетняк, 1980, 1981;

Febvre-Chevalier, 1982; Smith, Patterson, 1986; Микрюков, 1998 a; Mikjukov et al., 2000; Patterson, 1994). Для решения этого вопроса целесообразно было бы применить методы геносистематики (Антонов, 1974).

К настоящему времени имеется очень мало молекулярных данных для определения положения солнечников на дереве жизни. Так, у представителя Centroheliozoa описано слияние генов дегидрофолат редуктазы и тимидилат синтезы, что является сильным аргументом в пользу представлений о положении этой группы внутри Bikonta (Stechmann, Cavalier-Smith, 2002), и, как следствие, указывает на наличие у них двужгутикового предка. В связи этим можно вспомнить об описании Шаудинном двужгутиковой зооспоры для ¿

центрохелидного солнечника (Shaudinn, 1896). Сравнение последовательностей генов 18S рРНК и rbcL указывает на положение цилиофриидных солнечников Ciliophrys и ^

Pteridomonas в составе разных групп пединеллидных хелиофлагеллят, относящихся к группе Stramenopiles, что говорит в пользу полифилетичности таксона Ciliophryida (Sekiguchi et al., 2002). Исследование гена 18S рРНК представителей рода Nuclearia (сем. Nucleariidae) выявило родственные связи этих простейших с группой Opisthokonta (Amaral Zettler et al., 2001).

Несмотря на ультраструктурные и цитологические свидетельства полифилии солнечников, этот таксон всё ещё сохраняется в некоторых современных системах (Lecointre, Le Guiader, 2001), что говорит об отсутствии надёжного маркёра, способного прояснить структуру родственных отношении этой группы, а также о недостатке молекулярных данных. В случае солнечников молекулярные данные могут стать тем надёжным критерием, с помощью которого можно было бы построить их естественную систему.

Цели и задачи исследования

Целью работы является определение места солнечников в общей системе протистов и разработка естественной системы солнечников и родственных им групп организмов с применением ряда молекулярно-филогенетических маркёров и методов геносистематики.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить последовательности генов 18S рРНК и актина у ряда ключевых видов солнечников, а также их предполагаемых родственников среди групп Cercozoa и Discocristata.

2. Оценить возможность применения последовательностей генов 18S рРНК и актина для исследования взаимоотношений таксонов солнечников между собой и с другими родственными организмами.

3. Реконструировать филогенетическую историю различных групп солнечников и связанных с ними таксонов с помощью как традиционных методов филогенетического анализа, так и с помощью поиска синапоморфий во вторичной структуре 18S рРНК.

4. Сопоставить полученные результаты с данными морфологических и молекулярных исследований, оценить их и предложить естественную классификацию солнечников, построенную с учётом достижений молекулярной филогенетики, кладистики и геносистематики.

Научная новизна и практическая ценность рабо!ы

Были определены последовательное ги генов 18S рРНК и/или актина у десяти видов солнечникообразных организмов (центрохелиды Chlamydaster sterni, Heterophryг marina, Pterocystis erinaceoides, и Raphidiophrys ambigua, десмоторацид Clathrulina elegans и Hedriocystis reticulata, актинофрииды - Actinosphaerium eichhornii, Actinosphaerium nucleofllum, Actmophrys sol и простейшего - Multicilia marina неясного таксономического положения), а также у одиннадцати представителей таксонов, чьё родство различным i руппам солнечников предполагалось на основании ультраструктурных признаков (гимнофрииды - Gymnophrys cometa, церкомонады - Lecithium sp., Alias sp., дискокристаты -Stephanopogon colpoda, Stephanopogon apogon, Percolomonas cosmopolites, Klosteria bodomorphis, Bodo sorokini, аталамиды - Gymnophrydium sp., апузомонады -Amastigomonas sp. и ротосфериды - Micronucleana podoventralis).

Сопоставление полученных последовательностей позволило установить филогенетические связи большинства таксонов солнечников. Построенные кладограммы были сопоставлены с традиционной таксономической системой солнечников, основанной на морфологических признаках. Молекулярными методами показана полифилия солнечников.

Сделаны выводы о границах применимости данных о строении генов 18S рРНК и актина как маркёров для установления родственных отношений в пределах основных таксонов простейших и между ними.

В свете полученных молекулярных данных оценена таксономическая значимость ряда морфологических и ультраструктурных признаков солнечников.

Полученные данные являются вкладом в разработку филогенетической системы эукариот и методологию филогенетического анализа.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на международной конференции "Ломоносов-2003" (Москва, 2003), 4-ом международном конгрессе протистологии и 10-ой европейской конференции по биологии инфузорий (Сан Бенедетто дель Тронто, Италия, 2003).

По результатам работы был сделан доклад на совместном семинаре отдела эволюционной биохимии Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского и кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на /У/? страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит Ъ таблицы и ÎJt рисунков. Список литературы включаетнаименований цитированных работ.

Содержание работы Материалы и методы

Происхождение образцов и выделение ДНК и РНК

В данной работе были использованы культуры организмов взятые из коллекций А П. Мыльникова (ИБВВ РАН) и АТСС. Морские культуры выращивали на среде Шмальца-Пратта, а пресноводные - на среде Пратта. Бактериорофные организмы питались бактериями Aerobacter aerogenes, пресноводные хищники - бодонидой Bodo saltans, морские хищники -бодонидой Bodo sorokini. Список изученных видов и происхождение образцов, из которых была выделена ДНК и/или РНК, а также размеры секвеиированных фрагментов генов 18S рРНК и актина приведены в таблице 1.

Таблица 1. Данные об анализированных в работе простейших.

Таксон Видовое название Ген 18S pPHK Ген актина

Выделение ДНК/ РНК Длина фрагмент а Номера GenBank Выделение ДНК/РНК Длин а фраг мента Номера GenBank

Центрохе лидные солнечни ки Chlamydasler stermi (п, a) ДНК, РНК 1719 AY268042 ДНК, РНК 789 AY283744

Heterophrys manna (м; b) днк 2036 AY268041 - -

Pterocystis ennaceoides (n, a) ДНК 1713 AY268043 ДНК, РНК 789 AY283745

Rhaphidiophrys ambigua (п, c) днк 2123 AY305008 ДНК 967 AY283746

Актиноф риидные солнечни ки Actmophrys sol (n; c) ДНК, РНК 556+ 196 (част) XXX ДНК 784 AY283758 AY283759 AY283760

Actinosphaerium eichhormi (п, c) ДНК, РНК 2776 AY305011 ДНК 869 AY283757

A ctinosphaermm nucleofiium (п, c) - ДНК 784 AY283761 AY283762

Десмотор ацидные солнечни ки Clathrulina elegens (n; a) РНК 2073 AY305009 РНК 784 AY283754

Hedrioiystis reticulata (11; a) ДНК 2022 AY305010 дпк 784 AY283755

Роюсфер идные солнечни ки Micronutlearia podoventrahs (n; d) ДНК, РНК 1709 AY268038 ДНК, РНК 784 AY283747

Гимносфе рида Gymrtophiys cometa (n; d) ДНК 1814 AJ514866 - -

Аталамид а Gymnophrydium sp (m, d) ДНК 1753 AY268044 - -

Pscudocili ata Stephanopogon apogon (m, b) - ДНК 784 AY283752 AY283753

Stephanopogon coipoda (m, b) РНК 1394 (част) XXX ДНК, РНК 784 AY283751

Percolozo а Pertolomonas cosmopohtus (m, b) ДНК 1809 AF519443 ДНК 784 AY283748

Euglenozo а Bodo sorokim (м, b) ДНК 784 AY283749 AY283750

Klosteria bodomorphis (м; d) ДНК 2072 AY268046 - •

Amoeboz оа Mulucilia marina (м,е) ДНК 2746 AY268037 - -

Cercozoa Alias sp. (m, d) ДНК 1793 AY268040 -

Lecythmm sp. (м; d) ДНК 1767 AJ514867 ДНК 768 AY283756

Apusozoa Amastigomonas sp (м;<1) днк 1732 AY268039 ДНК 884

Част - частичная последовательность М - морской организм П - пресноводный организм

При культивировании простейших в качестве жертвы использовались следующие организмы: а - Bodo saltans Ь - Bodo sorokim с - Tetrahymena sp. d ■ Aerobacter aerogenes e - Vannella sp

Амплификация ДНК, клонирование и секвенирование

Для определения последовательности генов из культур клеток проводили выделение ДНК и РНК. Амплификацию участков исследуемых генов проводили, используя концевые и внутренние универсальные эукариотические праймеры, специфические праймеры, комплементарные вариабельным участкам последовательностей генов исследуемых организмов, или антиспецифические праймеры, некомплементарные участкам последовательностей генов жертвы или присутствующим в культуре минорным организмам. При использовании РНК в качестве матрицы синтезировали кДНК с 3' концевым праймером исследуемого гена, затем проводили реакции амплификации и реамплификации с внутренними универсальными праймерами.

Амплифицированные продукты очищали с помощью набора High Pure PCR Purification Kit (Roche, Rotkreuz, Switzerland), лигировали в pGEM-T Vector System (Promega, Wallisellen, Switzerland) и клонировали в XL-2 ультракомпетентные клетки. От 4 до 20 отобранных колоний секвенировали с помощью набора ABI-PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit и анализировали при помощи секвенатора ABI-377 (Perkin- Elmer- Rotkreuz, Switzerland) в соответствии с протоколом производителя.

Филогенетический анализ

Последовательности были выравнены с помощью программы ClustalX, после чего выравнивание корректировали вручную, учитывая модели вторичной структуры (Neefs et al., 1993; Wuyts et al., 2000). Последовательности для выравнивания были выбраны из международных баз данных так, чтобы, во-первых, были представлены все основные таксономические группы эукариот и доступных амебоидных организмов, и во-вторых, подборка таксонов соответствовала организмам, для которых доступны и последовательности актиновых генов.

В целях определения родственных связей организмов с неизвестным филогенетическим положением сначала анализировали большой набор видов, включающий широкое таксономическое разнообразие эукариот, а затем создавали частное выравнивание, включающее всех доступных представителей отдельной группы.

Филогенетический анализ проводили с использованием разных методов реконструкции филогении: метода объединения ближайших соседей (neighbor-joining, NJ), метода максимальной экономии (maximum parsimony, MP), метода максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) и байесианского метода вычисления постериорных вероятностей (Bayesian inference, BI). Для этого использовали следующие пакеты программ:

Phylip 3.6.a2.1 (Felsenshtein, 1993), PAUP* 4.0Ы0 (Swofford, 2002), PUZZLE 4.0 (Shimmer, von Haesler, 1996) и MrBayes 2.0 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). В качестве статистического критерия при построении филогенетических деревьев использовали показатель бутстрепа (Felsenstein, 1985).

Анализ вторичных структур рибосомных РНК

Для анализа вторичной структуры рРНК использовали модели, приведённые в Европейской базе данных. Нумерацию шпилек производили в соответствии с моделью Ван де Пира (Van de Peer et al., 2000). Вторичную структуру гена 18S рРНК для некоторых организмов с неясным филогенетическим положением на эукариотическом дереве представляли с помощью программы RnaViz 2.0 (De Rijk, De Wächter, 1997).

Результаты

Характеристика полученных последовательностей

Были впервые определены последовательности гена 18S рРНК 7 видов солнечникообразных организмов, а также восьми представителей таксонов, чьё родство различным ipyuiiaM солнечников предполагалось на основании ультраструктурных признаков (Табл 1).

Размер этих последовательностей (исключая области праймеров) варьирует у центрохелид от 1713 п.о. у P. erinaceoides до 2036 п.о. у Я. marina и 2123 п.о. у R. ambigua (Табл. 1). Два последних вида имеют вставки в вариабельных областях V2, V4, V5 и V8, a R. ambigua - также и в V3 и V7. Длина 18S рРНК у рафидиофрииды М. podoventralis составляет 1709 п.о., в то время как у десмоторцид - 2022 п.о. у Н. reticulata и 2073 у С. elegans из-за наличия общих вставок в вариабельных областях V4, V5 и V7. Из изученных нами видов самые длинные гены малой рРНК имеют A. eichhornii (2776 п.о.) и М marina (2746 п.о.) из-за вставок в вариабельных областях.

Последовательности значительно различаются по нуклеотидному составу. Г+Ц состав варьирует от 26 % Г+Ц у A. eichhornii из-за А+Т - богатых вставок в вариабельных областях до 50.6 % Г+Ц у Я. marina. Однако эти вариации состава гораздо меньше в консервативных сайтах, выбранных для филогенетического анализа (от 43.4 % Г+Ц у A. eichhornii до 49.7 % у Я. marina).

Последовательности кДНК или генов актинов были получены из центрохелид С. sterni, P. erinaceoides и R. ambigua', десмоторацид С. elegans и Я. reticulata; актинофриид А. eichhornii, A. nucleofllum, A. sol, ротосфериды М. podoventralis-, дискокристат S. colpoda, S.

apogon, P. cosmopolitus, B. sorokini; амастигомонады Amastigomonas sp. и церкомонады -Lecythium sp. Три различные последовательности гена актина выявлены у A. sol, две - у А. nucleofilum и по одной у всех остальных видов. Интрон длиной 183 п.о. был обнаружен в гене центрохелиды R. ambigua и длиной 99 п.о. у апузомонады Amastigomonas sp. Эти вставки не имеют никакой позиционной гомологии ни с одной известной последовательностью актина. В других полученных последовательностях интронов обнаружено не было.

Филогенетический анализ

В работе были проанализированы 13 выравниваний, включающих разное количество таксонов и внешних групп. В автореферате приведены результаты обсчёта только наиболее информативных наборов.

Филогения основных групп солнечников

На рисунке 1 показано положение трёх основных таксонов солнечников на эукариотическом дереве, реконструированном с помощью программы RadCon из консенсусного дерева байесианского анализа 99 последовательностей 18S рРНК и 66 актиновых последовательностей. Поскольку положение корня эукариотического дерева до сих пор является предметом обсуждения (Stechmann, Cavalier-Smith, 2002), дерево на рисунке 1 представлено в неукоренённой форме с базальной трифуркацией, разделяющей Bikonta, Opisthokonta и Amoebozoa. Топология дерева в основном соответствует предыдущим широкомасштабным филогенетическим реконструкциям эукариот, и все хорошо определяемые таксоны высокого ранга выявлены с надёжной статистической поддержкой при анализе как 18S рРНК, так и актиновых генов. Такое совпадение вселяет надежду на то, что топология дерева при привлечении новых данных существенных изменений не претерпит.

На дереве, показанном на рисунке 1, три основные таксона Heliozoa ответвляются независимо или в составе различных таксонов эукариот, подтверждая полифилетическое происхождение солнечников. Актинофриидные солнечники попадают внутрь группы Stramenopiles (рис.1, 2), десмоторацидные солнечники образуют базальную ветвь внутри ядра Cercozoa, рядом с видами G. cometa и М. marina (рис.1, 3), центрохелидные солнечники образуют независимую линию эукариот, что согласуется с недавними результатами (Cavalier-Smith, Chao, 2003). Полученные нами четыре новые последовательности гена 18S рРНК центрохелид достоверно группируются с полученными ранее и с последовательностью

неопределённого вида морского солнечника. Вместе они формируют слабо поддержанную группировку с глаукофитовыми и криптофитовыми водорослями. На актиновом дереве группы Glaucophyta, Cryptophyta, Centrohelida и Haptophyta образуют ряд независимых линий в основании Bikonta.

Большинство амебоидных простейших, включённых в наш анализ, группируются в составе двух основных ветвей. Первая ветвь соответствует типу Amoebozoa, а вторая -группе, обозначенной на рисунке 1 как Rhizaria, включающей десмоторацидных солнечников, всех радиолярий, фораминифер и большинство филозных и ретикулозных амёб, за исключением Nucleariidae, которые относятся к Opisthokonta (Amaral Zettler et al., 2001).

Филогения ротосферидных солнечников и Discocristata

Discocristata - одна из обширных групп простейших, выделенная по набору ультраструктурных признаков. Она включает одноклеточных и многоклеточных эукариог с жизненными формам гетеротрофных или фототрофных жгутиконосцев, амёб, солнечников и слизевиков. Филогенетическое положение и состав Discocristata остаётся спорным. Например, род Stephanopogon, первоначально описанный как примитивная инфузория, рассматривается либо как таксон высокого ранга внутри Discocristata (Gordon Leedale, Keith Vickerman, 2000), либо в составе Cercozoa (Cavalier-Smith, 2002). Для уточнения положения Percolomonas и Stephanopogon, впервые полученных в этой работе последовательности генов малой рРНК и актина Percolomonas cosmopolitas, Stephanopogon apogon и S. colpoda, были использованы для сравнения с основными таксонами дискокристат, в том числе Euglenozoa и Heterolobosea, представленных семействами Schizopirenidae, Gruberellidae, Acrasidae. Результаты филогенетического анализа показывают (рис. 4), что последовательности Stephanopogon и Percolomonas группируется с высоким показателем статистической поддержки (ПВ=1.00). Эта группа оказывается внутри клады Heterolobosea. Принадлежность Percolomonas к Heterolobosea подтверждается и наличием характерной для Heterolobosea уникальной инсерции в рРНК (Wuyts, et al., 2001). Моделирование вторичной структуры этой области молекулы выявило, что вставленная последовательность представляет несовершенный палиндром, способный образовать дополнительную спираль 17_1, положение которой соответствует положению неспаренного пуринового основания в составе стебля шпильки 17, имеющегося у представителей всех других доступных эукариотаческих таксонов (рис. 5).

C<>el'>detHÍmm ramantstmum Auloyhaera irisonopa Aulaiantha scolyinanlha

Lecyíhium sp.

f\euííidif/Ju^ta tf gracilis Paul mella cwomalopbora b uglypha rotunda Cercomonas sp. ATCC50318

Gymnophrys cometa

Clathfutínq elegans Heariocystts reticulata

Mass me ría marina ¡jOthan.Ua amotbofiirmts fiigefawtella na tuns Nuclear la-like N-Por ¡Hatmodtopknra breastcac Phagomyxa odnntetíae Haphiporidium ncisom Vrtixp-iridium treicens immonut sp i

RetKidonryxa filosa 1 AUogromia sp I

Gromta ovtformjs

Acanihome/ra sp

undet Acantharea OLM 1032

undel symphyacanthid

Sticholonche sp

Coilozoum pe¡a£Kum Hhaphido-'oum acuferum

Phaeodarea

core Cercozoa

Desmothoracida

Plasmodium falciparum toxoplasma sonáu Cryptosporidium parvum Crypthccodimum cuhnu Ktxhluca jcmtillam Oxytricka nota Loxophj Hum vinculare tílepnamma ameruanum I ucui dtsticltut Costana co Vat a (ihoplirvi mfuitonum

| Phytomyxea | Haplosporidia

Foraminifera Gromiidae

Acantharea

Taxopodida

Polycystinea

Alveolata

Achlya biiLXUülis Phyiophthoro ¡nfeslans Cafetería roenbérgens/s Pseudubodo triMuíum ¡jibyrotikuiotdes hahotuii<¡ SchiziKhytrtum mmutum tmil tama huxleyt I

PUuroch/ysit carterae I Pavkna u/irnei I

He/ian'hwi annuus Psi/oium nudum MesoUigma viride Vohax cárteri DunahcUa *ahna ScherJJclia dubia Palmaria pálmala (i lauco \pnac ra vacuo/ai a Comp\t>pof>o*i (.oerutvw

Stramenopiles

Haptophyta

Viridiplantae Rhodophyta

9ч г-

-тЧЁЕ

УУ

£

rit

4*ç

_Ш2.

огттС

■ 7/y/JiWJcwowa iruzi

• I it^lenu grt/uht

• Otpfanemu ambuluiot

■ ¡vat g! una grub err

• /(iLnbatnivru.ru/cj

• Jukobu I ¡her и

• i'ttiiiwmurtos чтегмпа

• Mala* типа* jakob iformt*

• blr^blumastix stru

- Jrimattu morina

- Heterophils marina

'îelerqp/oys c£ mannu

Rapmmophrys ambii Pterocystts егмасеЫ Chlamydasier sterm

• urnlei nucrphchozoan TCS 2002

• ( \uni iph 01 a puruihuu

• (janopiychc gloeocyvit

• i r)f./nmona\ ф I

■ (.niiHarJia ihefa |

■ (jomomowit iruncata I - Apusomonai probou uiea

• mill ob ¡Its

• ' Matugamueba* invert cru

• Ancyromomr\ srgmaufc\

• Amoeba protein

■ НаПтаткИа caniabn^iem « ixptomvxa reticulata

• / chtnumoebu ехшйапч

• Pelomyxa paluartt

• Kfavigamowba batamuth

• KlayoreUa sp

• /'h} su rum po!y(.ephuIum

• Dicfyostt/tium discoideuirr

• Thecomoeba vmtlx

• t'Jatyamotba tiem/podta

• Acunlhamoisbti niucliann

Discicristates

Jakobids, Malawimonas, Oxymonads, Trimastix

Centrohelida

Glaucophyta

Cryptophyta

Apusozoa

Amoebozoa

• / ¡muhf р</!урНс>гшч

• ! umbt tern rubeUus ■ Hrunchio^'omu flortJaii

• Poducor) ne ¡.arcta I

• S4omv,iga bi evii nth \

• Coprinop<n uncruis

• \anthophyllomyce\ rientirnrhous

• / ihbuiufielia neo/oi mam

• Siicchuroinyte* tcrevwae

• Ntumbpora ira^a

• Sihi:a\aciharomya.<> ptmbg

• iVuv/шпо tunplex

Metazoa

Choanoflagellata Fungi Nucleariidae

00

00

00

94

100

84

99

Рис I. Супердерево, реконструированное с помощью программы RadCon при включении всех групп, представленных одновременно и на 18S, и на актиновом деревьях Числа около узлов означают постериорную вероятность байесианского анализа с гамма - коррекцией 99 последовательностей 18S рРНК (сверху) и анализа МБ с гамма - коррекцией 66 последовательностей актина (снизу) Звёздочки означают, что рассматриваемый узел отсутствует на одном из деревьев в связи с различиями в наборе таксонов двух генов Поддержка бутстрепа обозначена тирс в тех случаях, когда она меньше 50% Базальная трихотомия соответствует трём основным группам э> кариот» предложенным недавним исследованием (Stechmann and Cavalier-Smith, 2002, Science, 297,89-91) Жирным помечены последовательности полученные в этой работе

Фоготрофные гетероконты

JSL

9f

"О

«е

и

а

tu

Bacrllariophyta

Apedinelia Pteridomonas Pedinella Rhizohromulina Ciiiophrys Dictyocha ■Bacitlaria Skelefotoema

■ Bolidomonas

Fücus | Phaeophyceae Tribowma | Xanthophyceae

■ Olkomonas I Oikomonadaceae . Nannoehloropsis |Eustigmatophypeae

■Phaemanas | Pinguiophyceae ■Pdagomonas 1 Pelagophyceae

ДП^gphgidj

100

JOSL

- Pythium -Achlya -Eurychasma

- Hyphochytrium

- Caecitalius

- Siluania

- Cafeteria -Pseubodo

- Labyrinthuloides

- Ulkenia -Schizochytrium

- Thraustochitrium -Blepharisma

- Oxytriha

- Gromia ■ Chlorarachnion

Oomycetes

Bicosoecids

Labirin thulids

Alveolata

Cercozoa

Рис. 2. Дерево 18S pPHK, полученное метолом ML анализа 32 полных последовательностей эукариот(1369 нуклеотидных позиции) Показанная топология выявлена с помощью программы PAUP* с использованием модели GTR с учетом коррекции по скоростям эволюции и пропорции инвариантных сайтов с 8 категориями. Все параметры были установлены программой MODELTEST. Числа около узлов представляют поддержку бутстрепа при анализе ML (сверху) и NJ с гамма-коррекцией (снизу), с использованием 100 и 1000 реплик бутстрепа, соответственно. Поддержка бутстрепа не указана в тех случаях, когда она меньше 50% Жирным помечены последовательности, полученные в этой работе.

Cercozoa

л Mb—-м Trinema enchelys оэзп-е^. Wpchelacorythion pulchellum -v • -;musc<?hon "

„ypkMCmthophora

chKomatiiphera ampulla

■teromita globosa

- PfoJeptomonas faecicola , "Leeythium sp. Cryotjiecomonas aestivalis Ciyotheeómanas langipes -r PséudodifflUgia gracilis

Euglyphidae, .

Cercomonadea

Cläthruttha elegans ffedtfiocystis sp.

Mussisteria 'manila

• •• * l.QOr- chlorarachniophyle sp. -т.ооГгЦ— Chlorarachnion sr.. о93j,'t-ChVorarachnibn reptans

- Lotharella globosa

— Lotharella vacuolate , ■ --Oymnochlora stellata

JVucIearitz-like N-For

Desmothoracid Heliozoa + Млшп'па

Chiorarachnea + Nuclearia-like N-Por

I oo i— Gromia oviformis | ...

i-Gromia sp. I Gromnda

о 88i-Polymyxa graminis

i ООП— Spongospora subterráneo

Í-ÜS—Г I-Plasmodiophora brassicae

Spongospora nasturtii 1 00 г- Phagomyxa odontellae

i— i-nagumyxa oaonieuae Phagomyxa bellerocheae Chaunacanthid sp. 1 » .„„л,,.. Acanthometra sp. | Acaranarea

Stramenopiles

Phytomyxea

Apodachlya brachynema Ectocarpus siliculosus

-Cafeteria roenbergensis

Prorocentrum concavum

— Pavlova salina ■ Coccolithus i

Oxytricha nova

Alveolate

pelagicus Dunaliella satina Helianthus annuus Nuclearia simplex ' anoeca grandis '.aerens

Schisosaccharomyces pombe

I Haptophyta Viridiplantae

Ц Ul| i IUi.iC(4> tu J»»<

o 571 I-Diaphanoeca grt

wJI-Tnchoplax adhc

I-Schizosaccharnmvi

Opisthokonta

Рис. 3 Дерево I8S рРНК, полученное методом баесианского анализа 52 полных последовательностей эукариот (2741 нуклеотидных позиции) Показанная топология выявлена с помощью программы MrBayes с использованием модели GTR с учетом коррекции по скоростям эволюции и пропорции инвариантных сайтов с 8 категориями Все параметры были установлены программой MODELTEST. Числа около узлов представляют значение постсриорной вероятности при использовании 400000 реплик. Жирным помечены последовательности, полученные в этой работе

Г 01р1опета Euglena

0.89

1.00 I

Р. созтороШив

0-99|^ ^сситороИйк

УаЫкатрйа Рага1е1гат1й15

1.00

0.58

0.93

1.00 1.00

1.ео£

.00

ШёавсаЬк*

0.8:

1.00

- 0.90

1.00

1.00

ЬеагатоеЬа 'ШгагшШя

_Г 81г^11атоеЬа

131- УаЫкатрйа WШaertia ~~ Naegleria, 1.00 [г Naegleria 1.00Х Ыаей^па

- Асгаэ^в

0.98 Г ЯТ5т38 с!

РагауаЫкатрйа 1.00 г Не1егатоеЬа

0.89 0.93 1.00

Р1ае81аЬиз1га

81ас11уатоеЬа, '•00 ' , . _Г РБанепотопав

Sawyeria

Г Мопорукусувйв о1

1.00 РвешкнпазйёатоеЬа

- КсоуаЫкатрйа

- МасгорЬагуп§отопак

Нае§1епа

Рис 4 Деревья 188 рРПК (слева) и актина (справа) получены методом баесианского анализа. Показанная топология выявлена с помощью программы МгВауея с использованием моделей СТИ (для 18Я рРНК) и НММ (для актина) с учетом коррекции по скоростям эволюции и пропорции инвариантных сайтов с 8 категориями Числа около узлов соответствуют значению постериорной вероятности. Укоренение обоих деревьев произведено по множественным внешним группам (не приведены)

Этот уникальным признак указывает па наличие тесных родственных связей между Petcolomonas и Heterolobosca и обнаруживайся во всех известных последовательностях таксона за исключением МасгорИигупцотопиь haluphila, представляющего самую базальную исшь Hctcrulobosea.

Анализ актинокою iсна нодшсрдил родс!во Percolomonas и Hctcrolobosea. В противоположность лому, последовательности амина Stephanopogon apogon и S. colpoda лнаергировали сильнее, что затрудняет выявление правильном 'юпологии дерева. Так, на рисунке 4 видно, то S apogon и .У. colpoda, формируя монофилетическую ветвь, ipyiiuiipyiuiCH с liiigleno/un Однако и аминокиишшых нослсдопагельносшх актина lluglciuuoa ecib синапочорфные нриншки, коюрые отсутствуют у Stephanopogon и других l'ercolozoa (рис. 6).

Филогсиетичсскии анали) носледопатслыюсш I8S рДНК друюю дискокристатно! о ешленоидного жгутиконосца, обладающею набором уникальных морфологических признаков, приведших нас к описанию новою рода Klasleria Nikolaev & Mylnikov & Bemsy & Falimi & Peirov & Pawlowski, 2003, выявил ею положение в составе группы Kinetoplastida, сестринское по отношению к роду Rhynchohodo (данные не приведены).

Представители ссм. NuclearHdac, входящего в состав отряда Rotosphaerida, не формируют монофилетической ве!ви, но ветвятся в разных частях эукариотического дерева. Положение Aticronudearia podovenlralis не удается надежно определи и. ни на актиновом дереве, ни на дереве I8S рДНК. В зависимости or подборки таксонов и от применяемого филогенетического алгоритма, на дереве 18S рДНК M. podovenlralis группируется с Masligamoeba invertans, положение которой на дереве нестабильно, или с группой Apusozoa, или ветвится независимо в базаньной части группы Bikonta (данные не приведены). Во всех случаях положение M. podovenlralis на дереве leim 18S рРНК не имеет надёжной ьы гистическом поддержки.

Для юго, чтобы проверить надежность объединения Micronuclearia и Apusozoa на актиновом дереве, мы определили первичную структуру актинового гена у представителя Apusozoa, Amastigomanas, который, по результатам анализа проявляет наибольшее сходство с актином M. podovenlralis. однако положение ной фумпиронки па дереве непостоянно: они может группироваться с Amoebo/oa или с гпшофикшмми водорослями, или с цсшрохелидамн.

\v5pecies Hélix литЬепг^. Naegleria Neovahlkampfia Psaltenornonas Willaertia Percolomonas Retortamonas lovaniensis damarlscottae lanterna magna cosmopohius Sp

17 ffi « Й fê II 1 P ^ й г P CG fig CG £6 Bï

17_1 G G I G y G | AUUAUCAU ACUlP'À ACUGUuuAuy AGCAAUUCCGG. GGCCUu i DAAUAGiiU UGAGaiA | UGACuAAUAtT UUG'JUGGGGGAA CCGGGC |

UU Ли AU AU A IJ AU GU CU G U G U rtU U Cf. |ЛАО A ^u 1jAGP5 ipG С AA ^ „дАА^ с ^Ц^ с -cCA^ g дЦА A с Аи Я aUa а С X ДЗАА А / 5 GAA H 5 и 5 и g S'А 5 6 £ 5* g 2 § ô ï

18 UUUGGGl/^A GAUGG^A UAACGAALUA GAGGAGUUUA Ulj^tGUCU ACGGGUULCa AUUOCC/уцА CUAUCHj/ AUUGCUUAjAe CUCCUC^f G££AAA U^CAGGCfcA

U A (j G y G ô S | â s â g GU A С | g ? * £ g si A A £ £ A G 3A $ * 3' Heterolobosea + Percolomonas Outgroup

Рис S Вторичная структура шпилек 27, IТ_1 н 18 молекулы 1SS рРНК представленная в сравнительном аспекте для Р cosmopolites и других видов Heterolobosea. Relortamonas sp

представляет состояние внешней группы. Горизонтальные линии служат границами гомологичных участков в первичной структуре 18S рРНК

Филогения Multicilia marina

Вид M. marina вначале был описан как организм, промежуточный между солнечниками и жгутиконосцами (Cienkowski, 1881), а позднее выделен в таксон высочайшего ранга - тип Multiflagellata (Mikrjukov, Mylnikov, 1996; 1998). Сравнение определённой нами первичной структуры гена 18S рРНК с большой базой данных, включающей широкое таксономическое разнообразие простейших, позволило выявить родственные связи М. marina с группой Amoebozoa. Более детальный анализ, проведённый в окружении большинства представителей типа, показал родство этого многожгутикового простейшего с амёбой Gephyramoeba sp. и пелобионтами. Этот результат наглядно иллюстрирует перспективность молекулярных методов в систематике простейших.

Филогения Gvmnovhrvdium sp.

Gymnophrydium sp. Dangeard - это голая филозная ретикулоподиальная амёба, предполагаемое родство которой группе Cercozoa мы проверили молекулярными методами. Сравнение полученной последовательности гена 18S рРНК с базой данных, включающей основных представителей Cercozoa, позволило выявить родственные связи Gymnophrydium sp. с группой, включающей Foraminifera и Gromia.

Обсуждение

Полифилии солнечников

Данные о независимом происхождении солнечников Actinophryida, Centrohclida, Desmothoracida получены как при анализе генов 18S рРНК, так и генов актинов и служат свидетельством того, что солнечники представляют собой искусственный таксон, что согласуется с результатами ультраструктурных исследований (Smith, Patterson, 1986; Patterson, 1999; Mikrjukov, Patterson, 2001).

Различное происхождение отдельных групп солнечников подтверждает предположение, что их аксоподии - это не гомологичные структуры, но конвергентные адаптации, возможно, к пассивному хищничеству - основному способу питания большинства солнечников (Микрюков, 1998). Соответствие молекулярных и ультраструктурных данных, относительно филогенетических связей некоторых ветвей солнечников подтверждает важность ультраструктурного анализа для филогении простейших (Taylor, 1999).

Положение актинофриид на молекулярных деревьях подтверждает родство этой группы солнечников с группой пединеллидных хелиофлагеллят, показанное ранее

ультраструктурными исследованиями (Davidson, 1982; Smith, Patterson, 1986; Mikijukov, Patterson, 2001). Актинофрииды и пединеллиды имеют ряд общих ультраструктурных признаков, таких как терминация аксонем на ядре, трубчатые кристы в митохондриях, экструсомы сходного строения (Mikijukov, Patterson, 2001). В соответствии с молекулярными данными, актинофрииды и пединеллиды входят в состав группы Stramenopiles (Saunderset al., 1995; Sekigushi et al., 2002), но на данный момент их отношения лучше разрешаются с помощью ультраструктурного анализа, чем молекулярными методами. Анализ гена 18S рРНК, проведённый для 28 представителей Stramenopiles и включающий 1369 однозначно выровненных позиций, показал, что актинофрииды формируют ветвь внутри терминальной радиации автотрофных гетероконтных водорослей. Однако порядок ветвления между всеми линиями, составляющими эту группу, однозначно не установлен. Возможно, в последовательности рДНК актинофриид из-за необычно высокой скорости эволюции 01сутствует сигнал, указывающий на близкое родство между пединеллидами и Actinosphaerium eichhomii (рис. 2). Несмотря на то, что последовательности гена актина строго поддерживают положение актинофриид среди Stramenopiles, создаётся такое впечатление, что эти гены не являются многообещающим филогенетическим маркёром родственных отношений внутри группы, о чём свидетельствует отсутствие разрешения в порядке ветвления группы Oomycetes, бурых водорослей и различных видов актинофриид. Дальнейшее накопление сведений о первичной структуре белок-кодирующих генов актинофриид и пединеллид должно обеспечить лучшее разрешение филогенетических отношений между этими группами.

Ультраструктурные и молекулярные данные также согласуются друг с другом в случае десмоторацидных солнечников, которые напоминают представителей Cercozoa по наличию трубчатых крист в митохондриях и одинакового типа экструсом (Mikijukov, 2000). На дереве 18S рРНК Clathrulina elegans и Hedriocystis reticulata находятся рядом с Gymnophrys cometa и Massisteria marina, амёбофлагеллятами со сложным жизненным циклом, включающем, как и у десмоторацид, двужгутиковую и амебоидную стадии. Таким образом, эти данные опровергают предположение К. А. Микрюкова о близком родстве гимнофриидных амёб центрохелидным солнечникам, но выявляют родство с другой группой солнечников -десмоторацидными (рис. 3). Анализ гена актина также подтверждает включение десмоторацид в состав Cercozoa, где они группируются вместе с другой базальной группой Cercozoa, хлорарахнеофитовыми водорослями.

Ни ультраструиурные, ни молекулярные данные не смогли надежно установить происхождение центрохелид, которые по некоторым данным образуют независимую линию протестов (Cavalier-Smith, Chao, 2003). Этот результат подтверждается нашим анализом

актиновых последовательностей центрохелид, который показывает, что Centroheliozoa образуют независимую кладу вблизи групп Cryptophyta, Glaucophyta и Haptophyta. Результатами дистанционного анализа обычно является слабо поддержанная группировка Centrohelida + Haptophyta, реконструируемая по обоим генам - 18S рРНК и актина. Под группировку Centrohelida + Haptophyta трудно подвести морфологическую базу. Вместе с тем байесианский анализ с включением более широкого разнообразия таксонов эукариот поддерживает родственные отношения между Centrohelida, Cryptophyta и Glaucophyta, хотя и с небольшой постериорной вероятностью (67 %). Родство между Centrohelida и Cryptophyta невозможно однозначно исключить в связи с наличием некоторых общих морфологических черт у представителей обеих групп, таких как наличие кремниевых чешуек в покровах, отсутствие клеточной стенки и наличие пластинчатых крист в митохондриях.

Полифилия ротосферидных солнечников и структура Discocristata

Уникальная форма крист в митохондриях, сходная с дисковидной (Микрюков 1999), объединяет филозных амёб сем. Nucleariidae и солнечникоподобных амёб сем. Porapholyxophryidae в составе отряда Rotosphaerida, который в свою очередь является членом супергруппы Discocristata. Молекулярные данные для Rotosphaerida на данный момент представлены только последовательностями гена 18S рРНК (Amaral Zettler et al., 2001) и актина для рода Nuclearia. Ввиду того, что ультраструктурные характеристики Rotosphaerida, за исключением формы крист в митохондриях, варьируют в пределах группы (например, тип митоза), мы проверили её монофилию, секвенировав гены 18S рРНК и актина другого, сильно отличающегося по всем ультраструктурным признакам представителя Rotosphaerida, вида Micronuclearia podoventralis. Для ответа на вопрос о принадлежности Nucleariidae и Rotosphaerida к группе Discocristata мы определили первичные структуры генов 18S рРНК и актина представителей неисследованного молекулярными методами таксона дискокристат Pseudociliata и занимающего по некоторым предположениям базальное положение среди Percolozoa вида Percolomonas cosmopolitus.

Филогенетический анализ соответствующих генов этих видов в окружении репрезентативной выборки из представителей группы показал на дереве 18S рДНК наличие группировки, включающей Percolomonas и Stephanopogon, подтверждая выдвинутую ранее гипотезу об их близости (Simpson, 1997), основанную на наличии сцепленных микротрубочек под всей поверхностью клеточной мембраны (исключая только участки около жгутиков и рта), дисковидных крист в митохондриях и отсутствии в жизненном цикле амебоидной стадии. Анализируя выявленные в этой работе близкородственные связи между группировками Percolomonas + Stephanopogon и Tetramitus + Vahlkampfla в составе сем.

Vahlkampfiidae, можно отметить ряд общих черт в строении жгутиковой стадии Tetramitus и Percolomonas: 1) количество, характер расположения и функции жгутиков; 2) форма и размеры тела; 3) способ питания; 4) наличие вентральной борозды.

В связи с отсутствием репрезентативной базы данных по актинам дискокристатных организмов и с аномально длинными ветвями, ведущими к видам Stephanopogon, актиновое дерево не полностью соответствует дереву 18S рРНК. Так, группировка Naegteria и Percolomonas подтверждает монофилию Percolozoa, а объединение видов рода Stephanopogon с Euglenozoa может быть следствием действия феномена притяжения длинных ветвей. Помимо этого мы выявили ряд синапоморфных для Euglenozoa признаков, которых нет, ни у ,

Percolozoa, ни у Pseudociliata. На основании полученных нами результатов, а также их анализа в свете ультраструктурных данных, мы считаем, что роды Stephanopogon и

%

Percolomonas являются ближайшими родственниками. Таксон, который они формируют, мы назвали Tubulocorticata, он входит в состав типа Percolozoa, сем. Vahlkampfiidae, а ближайшим предковой группой оказывается ветвь Naegleria + Willaertia. Анализ последовательностей генов 18S рРНК и актина Micronuclearia podoventralis однозначно опровергает монофилию группировки Rotosphaerida и Nucleariidae и говорит об отсутствии близкого родства между этим видом и Nuclearia. M. podoventralis не проявляет какого-либо родс1ва с группой Discocristata, существование которого предполагал Микрюков (Микрюков, 1999). Эти два факта однозначно свидетельствуют, что дискоидные кристы в митохондриях появились в эволюции эукариот независимо как минимум 3 раза.

При анализе полученных генов M. podoventralis нами не выявлено чёткого сигнала, позволяющего локализовать положение на дереве этого загадочного простейшего. Очевидно, ei о происхождение связано с базальной радиацией эукариот. Ветви, ведущие к М. podoventralis, на обоих деревьях генов актина и 18S рРНК относительно короткие, что говорит о низкой скорости эволюции сё генома, и, как следствие, слабой подверженности влиянию артефактов при построении дерева. На 18S рРНК дереве M. podoventralis группируется с разными организмами с нестабильным положением, такими как виды •

Apusozoa, M. invertans, или ветвится независимо. На актиновом дереве M. podoventralis всегда группируется с представителем Apusozoa, Amastigomonas sp., внутри группы лобозных амёб. Не отрицая возможность группировки M. podoventralis + Amastigomonas sp , мы считаем ошибочным их положение среди амеб, т.к. это противоречит наличию у Apusomonas (ближайшего родственника Amastigomonas) характерного для представителей Bikonta слияния генов дегидрофолат редуктазы и тимидилат синтазы (Stechmann, Cavalier-Smith, 2002).

Toxoplasma gondii Naegleria fowlery Naegleria grubery Percolomonas cosmopolitus Stephanopogon apogonX Stephanopogon spogon'l Stephanopogon colpoda Euglena gracilis Bodo soroJcinil Bodo sorokini2 Leishmania major Trypanosoma brucei Trypanosoma cruzi

LD GD LD 3D LD GD ME 3D LC GD LD GD LN|GD

LDCGD LDAGD LDAGD LDAGD LDAGD LDAGD

GY GY

LP LP

GY LP GY LP

LP LP

GYSLP GYSLP GYSLP GYSLP GYSLP GYSLP

Рис 6 Локализация информативных молекулярных признаков Discocnstata на фрагменте аминокислотного выравнивания актина Предковое состояние признака показано для вида Toxoplasma gondii Виды, последовательности которых получены в этой работе, обозначены жирным шрифтом

Положение Multicilia marina

Положение M. marina было определено в составе группы Amoebozoa с большой статистической поддержкой. Внутри Amoebozoa M. marina группируется с Gephyramoeba sp. и пелобионтами, входя, таким образом, в состав группы Conoza (Archamoeba и Mycetozoa), что подтверждается наличием у исследуемой амёбы характерной для Conoza кинетиды с конусом микротрубочек, своим широким концом противолежащим ядру. Положение Multicilia marina на дереве генов 18S рРНК среди Amoebozoa не противоречит гипотезе Кавалье-Смита, который в качестве типичной характеристики группы выделил признак униконтности (кинетосома состоит из одного жгутика и одной центриоли), потому что исследованный нами организм также обладает этим признаком (Mikrjukov, Mylnikov, 1996; 1998).

Положение Gymnophrydium sp.

Как и предполагалось на основании ультраструктурных признаков, Gymnophrydium sp. на основании последовательности гена 18S рРНК попадает в состав Cercozoa, при этом он оказывается ближайшим безраковинным родственником группы Forammifera + Gromia. Представители новой морфологически столь разнородной группы обладают тем не менее рядом общих ультраструктурных признаков, например, наличием ретикулоподий с проходящими внутри них микротрубочками и отсутствием характерных для большинства групп Cercozoa стрекательных органелл.

Выводы

1. Гены 18S рРНК и актина являются высокоинформативными маркёрами для филогенетических исследований солнечников и амебоидных простейших в целом.

2. Топологии кладограмм, построенные на основании последовательностей генов 18S рРНК и актина, конгруэнтны и сходным образом отражают филогенетическую историю солнечников.

3. На основании филогенетических реконструкций с использованием генов 18S рРНК и актина установлена полифилия солнечников, а также выяснено положение ряда других организмов.

4. Определено филогенетическое положение основных групп «солнечников» на дереве жизни: актинофриид - в составе Stramenopiles, десмоторацид - в составе Cercozoa, центрохелид - как из одной из групп высокого ранга, возникшей при базальной радиации Bikonta.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Nikolaev S.I., Вегпеу С., Fahrni J., Mylnikov А.Р., Aleshin V.V., Petrov N.B., Pawlowski J. Gymnophrys cometa and Lecythium sp. are core Cercozoa: Evolutionary implications. Acta Protozool. (2003)42: 183-190.

2. Николаев С.И., Верней С., Фарни Ж., Мыльников А.П., Петров Н.Б., Павловский Я. Родственные отношения десмоторацидных солнечников и гимнофриидных амёб на основании сравнения последовательностей генов 18S рРНК. ДАН, (2003), том 393, № 4, с. 1-4.

3. Nikolaev S.I., Mylnikov А.Р., Вегпеу С., Fahrni J., Petrov N.B., Pawlowski J. The taxonomic position of Klosteria bodomorphis gen. and sp.nov. (Kinetoplastida) based on ultrastructure and SSU rRNA gene sequence analysis. Protistologica (2003) (in press).

4. Nikolaev S.I., Вегпеу C., Fahrni J., Mylnikov A.P., Petrov N.B., Pawlowski J. The twilight of sun animalcules. Abstracts of the 4th European Congress of Protistology and 10th European Conference on Ciliate Biology, August 31 - September 5, 2003, san Benedetto del Tronto, Societa Italiana di Protozoologia, University of Camerino.

5. Николаев С.И. Анализ гена 18S рРНК Percolomonas cosmopolites подтверждает монофилию типа Percolozoa. Тезисы VIII международной студенческой конференции год эгидой ЮНЕСКО «Ломоносов - 03» Апрель 20-23, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 403 тираж 100 экз. Подписано в печать 29. 10. 2003 г.

i 18 Л 5 g

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Николаев, Сергей Игоревич

Выводы

1. Гены 18S рРНК и актина являются высокоинформативными маркёрами для филогенетических исследований солнечников и амебоидных простейших в целом.

2. Топологии кладограмм, построенные на основании последовательностей генов 18S рРНК и актина, конгруэнтны и сходным образом отражают филогенетическую историю солнечников.

3. На основании филогенетических реконструкций с использованием генов 18S рРНК и актина установлена полифилия солнечников, а также выяснено положение ряда других организмов.

4. Определено филогенетическое положение основных групп «солнечников» на дереве жизни: актинофриид - в составе Stramenopiles, десмоторацид - в составе Cercozoa, центрохелид - как из одной из групп высокого ранга, возникшей при базальной радиации Bikonta.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаев, Сергей Игоревич, Москва

1. Антонов, A.C. 2000. Основы геносистематики высших растений.

2. Москва. МАИК. «Наука/интерпериодика», 135.

3. Микрюков, К. А. 1994. Морские и солоноватоводныецентрохелидные солненчики (Centroheliozoa, Sarcodina) Кандалакшкского залива Белого моря. Зоол. Журн. 73(6):5-17

4. Микрюков, К. А. 1998. К биологии солнечников: феноменобразования лучистых форм у бентосных саркодовых. Зоол. Журн. 76(4): 389-401.

5. Микрюков, К.А. 2000. Система и филогения солнечников (Heliozoa)должен ли существовать этот таксон в современных системах Protista? Москва, 79:883-897

6. Мыльников, А.П. 1988. Ультраструктура экструсом жгутиконосцев.

7. Цитология. Ленинград, 30: 1402-1408.

8. Мыльников, А.П., Мыльникова, З.М., Цветков, А.И., и Елизарова,

9. В.А. 1998. Ультраструктура хищного жгутиконосца Phyllomitus amylophagus, Биология внутренних вод. Москва. Наука. 2:21-27.

10. Остроумов, A.A. 1917. О новом виде солнечников в морскомпланктоне (.Acanthocystis Wiasemskii). Тр. Карадагск. Научн. Ст. им. Т.Н. Вяземского. 1:62-65

11. Петров, Н.Б., Алёшин, В.В. 2002. Условно-нейтральныефилогенетические признаки крупных таксонов новый аспект эволюции макромолекул. Генетика, Т. 38(8): 1043-1062.

12. Сопина, В.А. 1997. Акразиевые (Acrasea) грибы или простейшие?1. Зоол. Журн. 76:1266-1276.

13. Фролов, А.О., Мыльников, А.П и Малышева М.Н. 1997. Электронмикроскопические исследования нового свободноживущего жгутиконосца Dimastigella mimosa sp.n. Цитология. 39(6):442-448.

14. Шульман, С.С., Решетняк, В.В. 1980. Реально ли существование всистеме простейших надкласса Actinopoda? Принципы построения макросистемы одноклеточных животных. Труды ЗИН АН СССР. Т. 94:23-41.

15. Шульман, С.С., Решетняк, В.В. 1981. Явление конвергенции уфлотирующих саркодовых. Эволюция и филогения одноклеточных животных. Труды ЗИН АН СССР. 107:5-18.

16. Adachi, J., and Hasegawa, M. 1996. MOLPHY version 2.3: programs formolecular phylogenetics based on maximum likelihood. Comput. Sci. Monogr. 28:1-150.

17. Amaral Zettler, L.A., Nerad, T.A., O'Kelly, C. J., Peglar, M.T., Gillevet,

18. P.M., Silberman, J.D. and Sogin, M.L. 2000. A molecular reassessment of the leptomyxid amoebae. Protistologica 151:275-282.

19. Amaral Zettler, L.A., Nerad, T.A., O'Kelly, C. J., Sogin, M. L. 2001. Thenucleariid amoebae: more protists at the animal-fungal boundary. J. Eukaryot. Microbiol 48(3): 293-297.

20. Amaral Zettler, L.A., Sogin, M.L., Caron, D.A. 1997. Phylogeneticrelationship between the Acantharea and the Polycystinea: A molecular perspective on Haeckel's Radiolaria. Prot. Natl. Acad. Sci. USA 94:11411-11416.

21. Andersen, E., Beams, H.W. 1960. The fine structure of the heliozoan,

22. Actinosphaerium nucleofilum. J. Protozool. 7: 190-199

23. Andersen, R.A., Saunders, G.W., Paskind, M. P., Sexton, J. P. 1993.

24. Ultrastructure and 18S rRNA gene sequence for Pelagomonas calceolata gen. et sp. nov. and the description of a new algal class, the Pelagophyceae classis nov. J. Phycol. 29: 701-715

25. Anderson, C.L., Canning, E.U., Okamura, B. 1998. A triploblast origin for1. Myxozoa? Nature 392:346

26. Anderson, J.O., Sjogren, A.M., Davis, L.A.M., Embly T.M., Roger A.J.2003. Phylogenetic Analises of Diplomonas Genes Reveal Frequent1.teral Gene Transfers Affecting Eukaryotes. Current Biology, 13: 94100.

27. Archibald, J. M., Teh, E. M. and Keeling, P. J. 2003. Novel ubiquitinfusion proteins: ribosomal protein PI and actin. J. Mol. Biol., 328: 771778.

28. Archibald, J. M. and Keeling, P. J. 2002. Recycled plastids: a "greenmovement" in eukaryotic evolution. Trends Genet., 18: 577-584.

29. Arisue, N., Hashimot, T., Lee, J. A., Moore, D.V., Gordon, P., Sensen,

30. C.W., Gaasterland, T., Hasegawa, M. and Muller, M. 2002. The phylogenetic position of the pelobiont Mastigamoeba balamuthi based on sequences of rDNA and translation elongation factors EF-1 alpha and EF-2. J. Eukaryot. Microbiol. 49:1-10.

31. Atkins, M.S., McArthur, A.G., Teske, A.P. 2000. Ancyromonadida: Anew phylogenetic lineage among the protozoa closely related to the common ancestor of metazoans, fungi, and choanoflagellates. J. Mol. Evol. 51:278-285

32. Baldauf, S.L. 2003. The Deep Roots of Eukaryotes. Science. 300:17031706.

33. Baldauf, S.L. and Palmer, L.D. 1993. Animals and fungi are each other'sclosest relatives: congruent evidence from multiple proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11558- 11562.

34. Baldauf, S.L., Doolittle, W.F. 1997. Origin and Evolution of the Slime

35. Molds (Mycetozoa). Prot. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12007-12012.

36. Baldauf, S.L., Palmer, L.D., Doolitttle W.F. 1996. The root of theuniversal tree and the origin of Eukaryotes based on elongation factor phylogeny. Prot. Natl. Acad. Sci. USA 93:7749-7754

37. Baldauf, S.L., Roger, A. J., Wenk-Siefert, L. and Doolittle, W.F. 2000. Akingdom-level phylogeny of eukaryotes based on combined protein data. Science 290:972-977.

38. Bapteste, E., Brinkmann, H., Lee, J.A., Moore, D.V., Sensen, C.W.,

39. Bardele, C. F. 1972. Cell cycle, morphogenesis, and ultrastructure in thepseudoheliozoan Clathrulina elegans. Zeitschrift fur Zellforschung 130:219-242.

40. Bernard, C.A., Simpson, G. B. and Patterson, D. J. 1997. Anultrastructural study of a free-living retortamonad, Chilomastix cuspidata (Larsen and Patterson, 1990) n. comb. (Retortamonadida, Protista). European Journal of Protistology 33:254-265.

41. Berney, C., Pawlowski, J. 2003. Revised small subunit rRNA analysisprovides further evidence that Foraminifera are related to Cercozoa. J. Mol. Evol. (in press)

42. Bhattacharya, D., Oliveira, M.C. 2000. The SSU rDNA coding region of afllose amoeba contains a group I intron lacking the universally conserved G at the 3'-terminus. J. Eukaryot. Microbiol. 47: 585- 589

43. Bock, W., Hay, W., Lee, J.J. 1985. Order Foraminiferida D'Orbigny,1826. In: An Illustrated Guide to the Protozoa (Eds. J. J. Lee, S. H. Hutner, E. C. Bovee). Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas, 252-273.

44. Bolivar, I., Fahrni, J., Smirnov, A. and Pawlowski, J. 2001. SSU rRNAbased Phylogenetic Position of the Genera Amoeba and Chaos (Lobosea, Gymnamoebia): The Origin of Gymnamoebae Revisited Mol. Biol. Evol. 18(12):2306-2314.

45. Bovee, E.C. 1985 a. Class Filosea Leidy, 1879. In: An Illustrated Guide tothe Protozoa (Eds. J. J. Lee, S. H. Hutner, E. C. Bovee). Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas, 228-245

46. Bovee, E.C. 1985 b. Class Granuloreticulosea De Saedeleer, 1934. In: An1.lustrated Guide to the Protozoa (Eds. J. J. Lee, S. H. Hutner and E. C. Bovee). Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas, 246-252

47. Briderre, C., Pages, M., Metenier, G., Canning, E.U. and Vivares C.P.1995. Evidence for the smallest nuclear genome (2.9Mb) in the microsporidium Encephalitozoon cunicili Mol. Biochem. Parasitol. 74: 229-231.

48. Brugerolle, G., Mignot, J.-P. 1984. The cell characters of twohelioflagellates related to the centroheliozoan lineage: Dimorpha and Tetradimorpha. Origins of life. 13:305-314.

49. Brugerolle, G. 1985a. Ultrastructure d'Hedriocystis pellucida (Heliozoa

50. Desmothoracida) et de sa forme megratiree flagellee Protistologica 21(2): 259-265.

51. Brugerolle, G. 1985b. Des trichocystes chez les bodonidés, un caractèrephylogénétique supplémentaire entre Kinetoplastida et Euglenida. Protistologica 21(3):339-348.

52. Bulman, S.R., Kühn, S.F., Marshall, J.W., Schnepf E. 2001. Aphylogenetic analysis of the SSU rRNA from members of the Plasmodiophorida and Phagomyxida. Protist 152: 43-51

53. Burki, F., Berney, C., Pawlowski, J. 2002. Phylogenetic position of

54. Gromia oviformis Dujardin inferred from nuclear-encoded small subunit ribosomal DNA. Protist 153: 251-260

55. Burzell, L.A. 1975. Fine structure of Bodo curvifilus Griessmann

56. Kinetoplastida: Bodonidae). J.Protozool. 22(l):35-39.

57. Cachon, J. and Cachon, M. 1978. Sticholonche zanclea Hertwig: areinterpretation of its phylogenetic position based upon new observations on its ultrastructure. Archiv fur Protistenkunde 120:148-168.

58. Cachon, J. and Cachon, M. 1985a. Class Phaeodarea Haeckel emend

59. Haeckel, Reschetnyak. Pages 295-302 in: J. J. Lee, S. H. Hutner, and E. C. Bovee, eds. An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologists, Lawrence, Kans.

60. Cachon, J. and Cachon, M. 1985&. Class Polycystinea Ehrenberg 1838,emend Riedel 1967. Pages 283-295 in J. J. Lee, S. H. Hutner, and E. C. Bovee. eds. An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologists, Lawrence, Kansas.

61. Cachon, J., Cachon, M. 1982. Actinopoda. In: Synopsis and Classificationof Living Organisms. (Ed. S. P. Parker) McGraw-Hill, New York, 553568

62. Cachon, J., Cachon, M. and Estep, K.W. 1990. Phylum Actinopoda

63. Classes Polycystina (=Radiolaria) and Phaeodaria. Pages 334-346 in L. Margulis, J. O. Corliss, M. Melkonian, and D. J. Chapman. Handbook of Protoctista. Jones and Bartlett, Boston.

64. Callahan, H.A., Litaker, R.W. and Noga, E.J. 2002. Molecular Taxonomyof the Suborder Bodonina (Order Kinetoplastida), Including the Important Fish Parasite, Ichthyobodo necator. Journal of Eukaryotic Microbiology 49: 119-128.

65. Cavalier-Smith, T. 1981. Eukaryotic kingdoms: seven or nine?1. Biosystems 14:461-481.

66. Cavalier-Smith, T. 1983. A six-kingdom classification and a unifiedphylogeny. Endocytobiology 2:1027-1034.

67. Cavalier-Smith, T. 1987. Eukaryotes with no mitochondria. Nature1.ndon) 326:332-333

68. Cavalier-Smith, T. 1989. Archaebacteria and Archezoa. Nature (London)339:100-101.

69. Cavalier-Smith, T. 1991. Cell diversification in heterotrophic flagellates.1.: Patterson, D.J., Larsen, J., (eds). The biology of free living heterotrophic flagellates. Oxford University Press, New York pp. 113131.

70. Cavalier-Smith, T. 1993a. Kingdom Protozoa and its 18 Phyla.

71. Microbiological Reviews 57:953-994.

72. Cavalier-Smith, T. 1993b. Percolozoa and the symbiotic origin of themetakaryote cell. Pp.399-406 in H. Ishikawa, M. Ishida, and S. Sato, eds. Endocytobyology V. Tübingen University Press, Tübingen.

73. Cavalier-Smith, T. 1998. A revised six-kingdom system of life. Biol. Rev.

74. Camb. Philos. Soc. 73:203-266

75. Cavalier-Smith, T. 1999. Principles of protein and lipid targeting insecondary symbiogenesis: euglenoid, dinoflagellate, and sporozoan plastid origins and the eukaryote family tree. J. Eukaryot. Microbiol. 46:347-366.

76. Cavalier-Smith, T. 2000. Flagellate megaevolution: the basis foreukaryote diversification. In: The Flagellates: Unity, Diversity and Evolution (Eds. B. S. C. Leadbeater, J. C. Green). Taylor and Francis Limited, London, 361-390

77. Cavalier-Smith, T. 2002. The phagotrophic origin of eukaryotes andphylogenetic classification of Protozoa. Int. J. Syst and Evol. Microb. 52:297-354.

78. Cavalier-Smith, T. and Chao, E.E. 1995. The opalozoan Apusomonas isrelated to the common ancestor of animals, fungi and choanoflagellates. Proceedings of the Royal Society of London B, Biological Sciences 261:1-6.

79. Cavalier-Smith, T. and Chao, E.E. 2003. Phylogeny of Coanozoa,

80. Apusozoa, and Other Protozoa and Early Eukaryote Megaevolution. J. Mol. Evol. 36:540-563.

81. Cavalier-Smith, T., Chao, E. E. 1997. Sarcomonad ribosomal RNAsequences, rhizopod phylogeny and the origin of euglyphid amoebae. Arch. Protistenkd. 147: 227-236

82. Cavalier-Smith, T., Chao, E.E. 2003. Molecular phylogeny of centrohelidheliozoa, a novel a novel lineage of bikont eukaryotes that arose by ciliary loss. J.Mol.Evol. 56:387-396.

83. Cienkowski, L. 1881. An account on the White Sea excursion on 1880.

84. Proc. St.-Petersb. Imp. Soc. Nat. 12:130-171

85. Clark, C.G., Roger, A.J. 1995. Direct evidence for secondary loss ofmitochondria in Entamoeba histolitica Prot. Natl. Acad. Sci. USA 92:6518-6521.

86. Cleveland, L.R. 1956. Brief account of the sexual cycles of the flagellatesof Cryptocercus. J. Protozool. 3:161-180. DACKS, J., and A. J. ROGER. 1999. The first sexual lineage and the relevance of facultative sex. J. Mol. Evol. 48:779-783.

87. Corliss, J. O. 1984. The Kingdom Protista and its 45 phyla. Biosystems17:87-126.

88. Corliss, J.O. 1975. The ciliated protozoacharacterization, classificationand guide to the literature. 2. ed. Pergamon Press, Oxford.

89. Dacks, J.B., Jeffrey, D., Silberman, J.D., Simpson, A.G.B., Shigeharu, M.,

90. Kudo, T., Ohkuma, M. and Redfield, R.J. 2001.0xymonads Are Closely Related to the Excavate Taxon Trimastix. Mol. Biol. Evol. 18(6): 1034— 1044.

91. De Rijk, P. & De Wächter, R. 1997. RnaViz, a program for thevisualisation of RNA secondary structure. Nucleic Acids Res. 25:46794684.

92. De Saedeleer, H. 1934. Beitrag zur Kenntnis der Rhizopoden:morphologische und systematische Untersuchungen und eine Klassifikationsversuch. Mem. du Mus. Roy. d'Hist. Nat. de Belgique 60: 1-112

93. Dolezel, D., Jirku, M., Maslov, D.A. and Lukes, J. 2000. Phylogeny of thebodonid flagellates (Kinetoplastida) based on small-subunit rRNA gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50:1943-1951.

94. Edgcomb, V.P., Simpson, A.G., Zettler L.A., Nerad, T.A., Patterson, DJ.,

95. Holder, M.E., Sogin, M.L. 2002. Pelobionts are degenerate protests: Insights from molecules and morphology. Mol. Biol. Evol. 19:978-982.

96. Elbrächter, M., Schnepf, E., and Balzer, I. 1996. Hemistasiaphaeocysticola (Scherffel) comb.nov., redescription of a free-living, marine, phagotrophic kinetoplastid flagellate. Arch.Protistenkd. 147(2): 125-136.

97. Eyden, B.P. 1977. Morphology and ultrastructure of Bodo designis

98. Skuja,1948. Protistologica 13(2): 169-179.

99. Fast, N. M. and Keeling, P. J. 2001. A common origin for alveolate andheterokont plastids. (translated to Japanese by K. Ishida) Jpn. J. Phycol. 49:137-140.

100. Fast, N. M., Kissinger, J. C., Roos, D. S. and Keeling, P. J. 2001. Nuclearencoded, plastid-targeted genes suggest a single common origin for apicomplexan and dinoflagellate plastids. Mol. Biol. Evol., 18:418-426.

101. Fast, N. M., Xue, L., Bingham, S. and Keeling, P. J. 2002. Re-examining

102. Alveolate Phylogeny Using Multiple Protein Molecular Phylogenies . J. Eukaryot. Microbiol. 49:30-37.

103. Febvre, J. 1990. Phylum Actinopoda, Class Acantharia. Pages 363-379 in

104. Margulis, J. O. Corliss, M. Melkonian, and D. J. Chapman, eds. Handbook of Protoctista. Jones and Bartlett, Boston.

105. Febvre-Chevalier, C. 1982. Revision of the taxonomy of the Heliozoawith attention to electron microscopical criteria. Ann. Inst. Oceanogr., Paris 58(Suppl.): 173-178

106. Febvre-Chevalier, C. 1985. Class Heliozoea Haeckel 1866. In: An1.lustrated Guide to the Protozoa. (Eds. J.J. Lee, S.H. Hutner and E.C. Bovee) Society of Protozoologists, Kansas, 302-317

107. Febvre-Chevalier, C. 1990. Phylum Actinopoda, class Heliozoa. In.

108. Handbook of Protoctista (Eds. L. Margulis, J.O. Corliss, M. Melhonian and D. J. Chapman) Jones and Bartlett, Boston, 347- 362

109. Febvre-Chevalier, C., Febvre, J. 1984. Axonemal microtubule pattern of

110. Cienkowskya mereschkowskyi and a revision of heliozoan taxonomy. Origins of Life 13: 315-338

111. Felsenstein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach usingthe bootstrap. Evolution 39:783-791.

112. Felsenstein, J. 2002. PHYLIP (phylogeny inference package) version3.6a3. Distributed by the author. Department of Genetics, University of Washington, Seattle.

113. Fenchel, T. and Patterson, D. J. 1986. Percolomonas cosmopolitus

114. Ruinen) n. gen., a new type of filter feeding flagellate from marine plankton. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 66:465-482.

115. Finlay, M., Fenchel, T. 1989. Hydrogenosomes in some anaerobicprotozoa resemble mitochondria. FEMS. Microbiol. Lett. 65:311-314.

116. Flegel, T.W., and Pasharawipas, T. 1995. A proposal for typicaleukaryotic meiosis in Microsporidias. Can. J. microbial.41:l 1-14

117. Foissner, W, Blatterer, H, Foissner, I. 1988. The Hemimastigophora

118. Hemimastix amphikineta nov. gen., nov. spec), a new protistan phylum from Gondwanian soils. Eur J Protistol 23:361- 383

119. Frolov, A.O., Karpov S.A.and Mylnikov A.P. 2001. The ultrastructure of

120. Procryptobia sorokini (Zhukov) comb.nov. and rootlet homology in kinetoplastids. Protistology. 2(2): 85-95.

121. Funes, S., Davidson, E., Reyes-Prieto, A., Mallagon, S., Herion, P., King,

122. M.P., Gonzalez-Halphen, D. 2002. A green Algal Apicoplast Ancestor. Science. 289:2155

123. Gibbs, S.P. 1978. The chloroplasts of Euglena may have evolved fromsymbiotic green algae. Can. J. Bot. 56(22): 2883-2889.

124. Goodey, T. 1914. A preliminary communication on three newproteomyxian rhizopods from soil. Arch. Protistenk. 35:80- 102.

125. Grell, K. G. 1989. The life-cycle of the marine protist Reticulosphaerasocial is Grell. Arch.Protistenkd. 137:177-197.

126. Grell, K. G. 1990. Reticulosphaera japonensis n.sp. (Heterokontophyta)from Tide pools of the Japanese coast. Arch.Protistenkd. 138:257-269.

127. Grell, K. G. 1991. Leucodictyon marinum n.gen.,n.sp., a plasmodialprotist with zoospore formation from the Japanese coast. Arch.Protistenkd. 140:1-21.

128. Grell, K. G. 1994a. Reticulamoeba gemmipara n.gen., n.sp., an "amoeboflagellate" with reticulopodia and zoosporogenesis. Arch.Protistenkd. 144:55-61.

129. Grell, K. G. 1994b. The feeding community of Synamoeba arenarian.gen., n.sp. Arch.Protistenkd. 144:143-146.

130. Grell, K. G. 1995. Reticulamoeba minor n.sp.and its reticulopodia.

131. Arch.Protistenkd. 145(2):3-9.

132. Grell, K. G., Heini,A., Sshüller,S. 1990. The ultrastructure of

133. Reticulosphaera social is Grell (Heterokontophyta). Europ.J.Protistol. 26(l):37-54.

134. Grell, K. G., Schüller, S. 1991. The ultrastructure of the plasmodial protist1.ucodictyon marinum Grell. Europ.J.Protistol. 27:168-177.

135. Groome, R.L. 1986. Observations of the heliozoan genera Acanthocystisand Raphidiocystis from Australia. Arch. Protistenkd. 131:189-199.

136. Haeckel, E. 1866. Generelle Morphologie der Organismen. B., Reimer,2:462.

137. Hartmann, M. 1913. Rhizopoda. In: Handwörterbuch der

138. Naturwissenschaften, Jena 8: 422-446

139. Hertwig R. 1899. Über Kerntheilung, Richtungskörperbildung und

140. Befruchtung von Actinosphaerium eichhornii. Abhandl. math.-phys. Königl. Bayer. Akad. Wiss. München 19: 631-734

141. Hasegawa, M., Kishino, H. 1994. Accuracies of the simple methods forestimating the bootstrap probability of a maximum likelihood tree. Mol. Biol. Evol. 11:142-145.

142. Hasegawa, M., Kishino, H., Yano, T. 1985. Dating of the human-apesplitting by a molecular clock of mitochondrial DNA. J. Mol. Evol. 22: 160-174

143. Hausmann, K., Hulsmann, N. 1996. Protozoology, 2nd edn. Stuttgart:1. Thieme.

144. Huelsenbeck, J.P. and Ronquist, F. 2001. MRBAYES: Bayesian inferenceof phylogenetic trees. Bioinformatics 17:754-755

145. Hughes, A.L. and Piontkivska H. 2003. Phylogeny of Trypanosomatidaeand Bodonidae (Kinetoplastida) Based on 18S rRNA: Evidence for Paraphyly of Trypanosoma and Six Other Genera. Molecular Biology and Evolution. 20(4):644-52.

146. Jones, D.T., Taylor, W.R., and Thornton, J.M. 1992. The rapid generationof mutation data matrices from protein sequences. Comput. Appl. Biosci. 8:275-282.

147. Kamaishi, T., Hashimoto, T., Nakamura, Y., Murata, S., Okada, N.,

148. Okamoto, K.-I., Shimuzu, M. and Hasegava, M. 1996. Protein phylogeny of translation elongation factor EF1-A suggests Microsporidias are extremely ancient eukaryotes. J. Mol. Evol. 42:257263.

149. Karpov, S. A. 2000. Flagellate phylogeny: an ultrastructural approach. In:

150. The Flagellates: Unity, Diversity and Evolution (Eds. B. S. C. Leadbeater, J. C. Green). Taylor and Francis Limited, London, 336-360

151. Keeling, P. J. 2001. Foraminifera and Cercozoa are related in actinphylogeny: two orphans find a home? Mol. Biol. Evol. 18: 1551- 1557

152. Keeling, P. J., Deane, J. A., McFadden, G. J. 1998. The phylogeneticposition of alpha- and beta- tubulins from the Chlorarachnion host and Cercomonas (Cercozoa). J. Eukaryot. Microbiol. 45: 561-570

153. Keeling, P.J. 1998. A Kingdom's progress: Archezoa and the origin ofeukaryotes. BioEssays 20:87-95.

154. Keeling, P.J. 2003. Congruent evidence from alpha-tubulin and betatubulin gene phylogenies for a zygomycete origin of microsporidia. Fung. Genet. Biol., 38:298-309.

155. Keeling, P.J. and Palmer, J.D. 2000. Parabasalian flagellates are ancienteukaryotes. Nature 405:635-63.

156. Keeling, P.J. and Palmer, J.D. 2001. Lateral transfer at the gene andsubgenic levels in the evolution of eukaryotic enolase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10745-10750.

157. Keeling, P.J., and Doolittle, W.F. 1997. Widespread and ancientdistribution of a noncanonical genetic code in diplomonads. Mol. Biol. Evol. 14:895-901.

158. Keeling, P.J., and Fast, N.M. 2002. Microsporidia: Biology and evolutionof highly reduced intracellular parasites. Ann. Rev. Microbiol. 56:93116.

159. Keeling, P. J., and McFadden, G.I. 1998. Origins of microsporidia. Trends1. Microbiol. 6:19-23.

160. Keeling, P.J., Deane, J.A., Hink-Schauer, C., Douglas, S., Maier, U.-G.and McFadden, G.I. 1999. The secondary symbiont of the cryptomonad Guillardia theta contains alpha, beta, and gamma-tubulins. Mol. Biol. Evol. 16:1308-1313.

161. Keeling, P.J., Luker, M.A. and Palmer, J.D. 2000. Evidence from betatubulin that microsporidia evolved from fungi. Mol. Biol. Evol. 17:1-9.

162. Kishino, H. and Hasegawa, M. 1989. Evaluation of the maximumlikelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in hominoidea. J. Mol. Evol. 29:170-179.

163. Kishino, H., Miyata T. and Hasegawa, M. 1990. Maximum likelihoodinference of protein phylogeny, and the origin of chloroplasts. J. Mol. Evol. 31:151-160.

164. Kuhn, S., Lange, M., Medlin, L.K. 2000. Phylogenetic position of

165. Cryothecomonas inferred from nuclear-encoded small subunit ribosomal RNA. Protist 151:337-345

166. Kumar, R. 1980. Morphology and taxonomy of the protist

167. Gymnophrydium marinum Dangeard from the North Sea. Botanica Marina. 23:353-360.

168. Lanave, C., Preparata, G., Saccone, C., Serio, G. 1984. A new method forcalculating evolutionary substitution rates. J. Mol. Evol. 20: 86-93

169. Lang, B.F., Burger, G., O'Kelly, C. J., Cedergren, R., Golding, G.B.,1.mieux, C., Sankoff, D., Turmel, M. and Gray, M.W. 1997. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature 387: 493-497.

170. Levine, N.D., Corliss, J.O., Cox F.E.G., Deroux, G., Grain, J., Honigberg,

171. B.M., Leedale, G.F., Loeblich, A.R., Lom, J., Lynn, D., Merinfeld, E.J., Page, F.C., Poljansky, G., Sprague, V., Vávra, J., Wallace, F.G., Weiser, J.A. 1980. A new revised classification of the Protozoa. J. Protozool. 27: 37-58

172. Lipscomb, D., Corliss, J. O. 1982. Stephanopogon, a phylogeneticalyimportant "ciliate", shown by ultrastructural studies to be a flagellate. Science, 215:303-304.

173. Lopes-Garcia, P., Rodrigues-Valera, F., Moreira, D. 2002. Toward themonophyly of Haeckel's Radiolaria: 18S rRNA environmental DNA support the sisterhood of polycystinea and acantharea. Mol. Biol. Evol. 19:118-121.

174. Lukes, J., Guilbride, D.L., Votypka, J., Zikova, A., Benne, R. and

175. Englund, P.T. 2002. The kinetoplast DNA network: Evolution of an improbable structure. Eukaryotic Cell, 1:495-502.

176. Martin, W., Stoebe, B., Goremykin, V., Hansmann, S., Hasegava, M.,

177. Kovallik, K. 1998. Gene transfer to the nucleus and the evolution of the evolution of chloroplasts. Nature. 393:162-165.

178. Maslov, D.A, Podlipaev, S.A. and Lukes, J. 2001. Phylogeny of the

179. Kinetoplastida: Taxonomic Problems and Insights into the Evolution of Parasitism. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 96(3):397-402.

180. Medina, M, Collins, A.G., Silberman, J.D., Sogin, M.L. 2001. Evaluatinghypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proc Natl Acad Sci USA. 98(17):9707-12.

181. Medlin, L., Elwood, H. J., Stickel, S., and Sogin, M. L. 1988 Thecharacterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene 71:491-499

182. Meisterfeld, R. 2000. Testate amoebae with filopodia. In: The Illustrated

183. Guide to the Protozoa (Eds. J. J. Lee, G. F. Leedale, P. Bradbury). 2 ed. Allen Press, Lawrence, KS, 2: 1054-1084

184. Mikrjukov, K.A. 1996a. Revision of genera and species composition inlower Centroheliozoa. I. Family Heterophryidae Poche. Arch. Protistenkd. 147: 107-113

185. Mikrjukov, K.A. 1996b. Revision of genera and species composition inlower Centroheliozoa. II. Family Raphidiophryidae n. fam. Arch. Protistenkd. 147: 205-212

186. Mikrjukov, K.A. 1999. Taxonomic revision of scale-bearing heliozoonlike amoebae (Pompholyxophryidae, Rotosphaerida). Acta Protozool. 38: 119-131

187. Mikrjukov, K.A. 2000a. Taxonomy of heliozoa. I. The order

188. Desmothoracida Hertwig et Lesser, 1874. Acta Protozool. 39: 81-97

189. Mikrjukov, K.A. 2000b. Taxonomy of heliozoa II. Dimorphidhelioflagellates (Dimorphida, Cercomonadea classis n.): biodiversity and relatedness with cercomonads. Acta Protozool. 39: 99-115

190. Mikrjukov, K.A., and Mylnikov, A.P. 1998a. The fine structure of acarnivorous multiflagellar protist, Mulicilia marina Cienkowski, 1881 (Flagellata Incertae sedis). European Journal of Protistology 34:391401.

191. Mikrjukov, K.A., Mylnikov, A.P. 2001. A study of the fine structure andthe mitosis of a lamellicristate amoeba, Micronuclearia podoventralisgen. et sp. n. (Nucleariidae, Rotosphaerida). Europ. J. Protistol. (submitted).

192. Milyutina, I.A., Aleshin, V.V., Mikrjukov, K.A., Kedrova, O.S., Petrov,

193. N.B. The unusually long small subunit ribosomal RNA gene found in amitochondriate amoeboflagellate Pelomyxa palustris: its rRNA predicted secondary structure and phylogenetic implication. Gene. 2001 Jul 11 ;272(l-2): 131-9.

194. Moreira, D., Guyader, L. E., and Philippe, H. 2000. The origin of redalgae and the evolution of chloroplasts. Nature 405:69-72.

195. Mylnikov, A.P. 1986. Ultrastructure of a colourless flagellate Phyllomitusapiulatus Skuja, 1948 (Kinetoplastida). Arch.Protistenkd. 132:1-10.

196. Nichols, K.H. 1983. Little-known an ew heliozoan: the Centrohelidiangenus Acanthocystis, including description of nine new taxa. Can. J.Z00I. 61(6):1369-1386

197. Olsen, G. J., Matsuda, H., Hagstrom, R. & Overbeek, R. 1994.fastDNAml: A tool for construction of phylogenetic trees of DNA sequences using maximum likelihood. Comput. Appl. Biosci. 10:41-48.

198. Ostenfeld, C.D. 1904. On the new marine Heliozoa occurring in theplankton of the Noth Sea and Scager Rak. Medd. Komm. Havunters ogelzer. Ser. Plankton. 1:3-5.

199. Page, F.C., and Blanton, R.L. 1985. The Heterolobosea (Sarcodina:rhizopoda), a new class uniting the Schizopyrenida and the Acrasidae. Protistologica. 21:121-132.

200. Patterson, D.J. 1988. The evolution of Protozoa. Mem. Inst. Oswaldo

201. Cruz. Rio de Janeiro. Supl 1.83: 588-600.

202. Patterson, D.J. 1989. Stramenopiles: chromophytes from a protistanperspective. Pages 357-379In: The Chromophytes Algae: Problems and Perspectives (eds) Green, G.C., Leadeater, B.S.C., Diver, W.L. Clarendon. Oxford.

203. Patterson, D.J. 1994. Protozoa: evolution and systematics. In:Progress in

204. Protozoology. Proc. IXth Int. Congr. Protozool., Berlin 1993. (Eds. K. Hausmann and N. Hülsmann) Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-Jena-New York 1-14

205. Patterson, D.J. 1999. The diversity of eukaryotes. Am. Nat. 154: 96-124

206. Patterson, D.J. and Brugerolle, G. 1988. The ultrastructural identity of

207. Stephanopogon apogon and its relatedness to other kinds of protists. European Journal of Protistology 23:279-290.

208. Patterson, D.J., Sogin, M. 1992. Eukaryote origin and protistan diversity.

209. Eds. Hartman H., Matsuno K. The origin and evolution of the cell. Proc. Conf. On the Origin and Evolution of Prokariotic and Eukaryoticcells. Shimoda, Japan. P. 13-46.

210. Pawlowski, J., Bolivar, I., Fahrni, J. F., De Vargas, C. 1999. Molecularevidence that Reticulomyxa filosa is a freshwater naked foraminifer. J. Eukaryot. Microbiol. 46: 612-617

211. Philippe, H. 2000. Opinion: Long Branch Attraction and Protist

212. Phylogeny. Protist. 151(4):307-16

213. Philippe, H., and Germot, A. 2000. Phylogeny of eukaryotes based onribosomal RNA: long-branch attraction and models of sequence evolution. Mol. Biol. Evol. 17:830-834.

214. Philippe, H., Germot, A. and Moreira, D. 2000. The new phylogeny ofeukaryotes. Curr. Opin. Genet. Dev. 10:596- 601.

215. Posada, D., Crandall, K. A. 1998. Modeltest: testing the model of DNAsubstitution. Bio informatics 14: 817-818

216. Pussard, M, Pons R. 1976. Etude des Leptomyxa et Gephyramoeba

217. Protozoa, Sarcodina) lll-Gephyramoeba delicatula Goodey, 1915. Protistologica, 7(2):351-383.

218. Rainer, H. 1968. Urtiere, Protozoa; Wurzelfüßler, Rhizopoda;

219. Sonnentierchen, Heliozoa. Die Tierwelt Deutschlands (Ed. F. Dahl) Jena: Gustav Fischer Verlag. Bd. 56: 176.

220. Rodriguez, R., Olivier, J. L., Marin, A., Medina, J. R. 1990. The generalstochastic model of nucleotide substitution. J. Theor. Biol. 142: 485-501

221. Roger, A.J., Smith, M.W., Doolittle, R.F., Doolittle W.F. 1996. Evidencefor the Heterolobosea from phylogenetic analysis of genes encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Eukaryotic Microbiol. 43:475-485.

222. Rokas, A., and Holland, P. W. Rare genomic changes as a tool forphylogenetics Trends Ecol Evol. 15:454-459

223. Ruinen, J. 1938. Notizen über Sazflagellaten. II. Uber die Vertebreiungder Sazflagellaten. Archiv fur Protistenkunde, 90: 210-258.

224. Saitou, N., Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method forreconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425

225. Saldarriaga, J., Taylor, F.J.R., Keeling, P.J. and Cavalier-Smith T. 2001.

226. Dinoflagellate nuclear SSU rDNA phylogeny suggests multiple plastid losses and replacements. J. Mol. Evol. 53: 204-213.

227. Sekiguchi, H., Moriya, M., Nakayama, T., Inoye, I. 2002. Vestigalchloroplasts in heterotrophic Stramenopiles Pteridomonas dantica and Ciliophrys infusionum (Dictiohophyceeae). Protist 153: 157-167.

228. Shaudinn, F. 1896. Uber das Centra;korn der Heliozoen. Ein Beitrag zur

229. Centrosom enfrage. Verhande Deutsh. Zool. Ges. Bonn, 6:113-130.

230. Siddal, M.E., Martin, D.S., Bridge, D., Desser, S.S. and Cone, D.K. 1995.

231. The demise of a phylum of protists: phylogeny of Myxozoa and other parasitic cnidarians. J. Parasitol. 81:961-967.

232. Silberman, J.D., Clark, C.G., Diamond, L.S. and Sogin, M.L. 1999.

233. Phylogeny of the genera Entamoeba and Endolimax as deduced from small-subunit ribosomal RNA sequences. Mol. Biol. Evol. 16:1740— 1751.

234. Simpson, A.G., Patterson, D.J. 1999. The ultrastructure of Carpediemonasmembranifera (Eukaryota) with reference to the Excavate hypothesis. Europ. J. Protistol. 35: 357-370.

235. Simpson, A.G., Patterson, D.J. 2001. On core jakobiids and excavate taxa:the ultrastructure of Jacoba incarcerata J.Eukaryot. Microbiol. 48: 480492.

236. Simpson, A.G., Roger, A.J., Silberman, J.D., Leipe, D.D., Edgcomb, V.P.,

237. Jermiin, L.S., Patterson, D.J., and Sogin, M.L. 2002. Evolutionary history of "early-diverging" eukaryotes: the excavate taxon Carpediemonas is a close relative of Giardia. Mol. Biol. Evol. 19:17821791.

238. Simpson, A.G.B. 1997. The identity and composition of the Euglenozoa.

239. Arch. Protistenkd. 148:318-328.

240. Simpson, A.G.B., Hoff, J., Van den, Bernard C., Burton H.R. and

241. Patterson D. J. 1997. The ultrastructure and systematic position of the euglenozoon Postgaardi managerens is, Fenchel et al. Arch.Protistenkd. 147(3-4): 213-225.

242. Simpson, A.G.B., Lukes, J. and Roger, A.J. 2002. Evolutionary history ofkinetoplastids, and their kinetoplasts. Molecular Biology and Evolution 19:2071-2083.

243. Smith, R., Patterson D.J. 1986. Analysis of heliozoan interrelationships:an example of the potential and limitations of ultrastructural approaches to the study of protisten phylogeny. Proc. Roy Soc. London B 277: 325366

244. Smothers, J.F., Von Dohlen, C.C., Smith, L.H. and Spall, R.D. 1994.

245. Molecular evidence that the myxozoan protists are Metazoans. Science 265:1719-1721

246. Sogin, M.L. 1989. Evolution of Eukaryotic microorganisms and theirsmall subunit ribosomal RNAs. Am. Zool. V.29. P. 487-489. organelle origins; energy-producing symbionts in early eukaryotes? Curr. Biol. 7: 315-317.

247. Sogin, M.L., Gunderson, J.H., Elwood, H.J., Alonso, R.A., Peattie, D.A.1989. Phylogenetic meaning o the Kingdom concept: An unusual ribosomal RNA from Giardia lamblia. Science. 243:75 77.

248. Stechmann, A., Cavalier-Smith, T. 2002. Rooting the eukaryote tree byusing a derived gene fusion. Science 297: 89-91

249. Strimmer, K., and von Haeseler, A. 1996. Quartet puzzling: a quartetmaximum likelihood method for reconstructing tree topologies. Mol. Biol. Evol. 13:964-969.

250. Swofford, D.L. 1998. PAUP*: phylogenetic analyses using parsimonyand other methods). Sinauer Associates, Sunderland, Mass.

251. Tamura, K. and Nei, M. 1993. Estimation of the number of nucleotidesubstitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10:512-526.

252. Taylor, F.J.R. 1976. Flagellate phylogeny: a study in conflicts. J.1. Protozool. 23: 28-40

253. Taylor, F.J.R. 1999. Ultrastructure as a control for protistan molecularphylogeny. Am. Nat. 154 (Suppl. 4): S125-S136.

254. Thomsen, H. A., Buck, K. R., Bolt, P. A., Garrison D. L. 1991. Finestructure and biology of Cryothecomonas gen. nov. (Protista incertae sedis) from the ice biota. Can. J. Zool. 69: 1048-1070

255. Thorley, J.L., Page, R.D.M. 2000. RadCon: phylogenetic tree comparisonand consensus. BIOINF: Bioinformatics.

256. Trégouboff, G. 1953. Classe de Heliozoaires. In: Traité de Zoologie (Ed.

257. P.-P. Grassé) Paris: Masson et Cie. 1: 437-489

258. Van de Peer, Y., De Rijk, P., Wuyts, J., Winkelmans, T. and De Wachter,

259. R. 2000. The European Small Subunit Ribosomal RNA database. Nucleic Acids Res. 28:175-176.

260. Van de Peer, Y., Rensing, S.A., Maier, U.G. and De Wachter, R. 1996.

261. Substitution rate calibration of small subunit ribosomal RNA identifies chlorarachniophyte endosymbionts as remnants of green algae. Proc Natl Acad Sci USA. 93(15):7732-6

262. Vickerman, K. 1991. Organisation of the bodonid flagellates. The Biologyof Free-living Heterotrophic Flagellates. Eds. Patterson, J. David, Larsen, Jacob. Oxford. Clarendon Press. 159-176.

263. Visvesvara, G., Martinez, A., Schuster, F., Leitch, G., Wallace, S.,

264. Sawyer, T. and Anderson, M. 1990. Leptomyxid amoeba, a new agent of amoebic meningoencephalitis in humans and animals. J. Clin. Microbiol. 28:2750-2756.

265. Visvesvara, G., Schuster, F. and Martinez, A. 1993. Balamuthiamadrillaris, n. g., n. sp., agent of amebic meningoencephalitis in humans and other animals. J. Eukaryot. Microbiol. 40:504-514.

266. Vivares, C., Biderre, C., Duffieux, F., Peyret, P., Metenier, G. and Pages,

267. M. 1996. Chromosomal localization of five genes in Encephalitozoon cunicili (Microsporidia). J.Eukaryot. Microbiol. 43:97.

268. Voigt, K, Wostemeyer, J. 2000. Reliable amplification of actin genesfacilitates deep-level phylogeny. Microbiol. Res. 155:179-195.

269. Von Benwitz, G., and K. G. Grell. 1971a. Ultrastruktur mariner Amo"ben.1.. Stereomyxa ramosa. Arch. Protistenk. 113: 51-67.

270. Von Benwitz, G., and K. G. Grell. 19716. Ultrastruktur mariner Amo"ben.

271. I. Stereomyxa angulosa. Arch. Protistenk. 113:68-79.

272. Vossbrinck, C.R., Maddox., J.V., Friedman, S., Debrunner-Vossbrinck,

273. B.A. and Woesse, C.R. 1987. Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely ancient eukaryotes. Nature 326:411-414.

274. Weekers, P.H.H., Kleyn, J. and Vogels, G.D. 1997. Phylogenetic positionof Psalteriomonas lanterna deduced from the SSU rDNA sequence. J. Euk. Microbiol. 44:467-470.

275. Wu, G., Henze, K., Muller, M. 2001. Evolutionary relationships of theglucokinaze from the amitochondriate protist Trichomonas vaginalis. Gene. 264-265.

276. Wuyts, J., De Rijk, P., Van de Peer, Y., Pison G., Rousseeuw, P., De

277. Wachter, R. 2000. Comparative analysis of more than 3000 sequences reveals the existence of two pseudoknots in area V4 of eukaryotic small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 28: 4698-4708.

278. Wuyts, J., Van de Peer, Y. and De Wachter, R. 2001. Distribution ofsubstitution rates and location of insertion sites in the tertiary structure of ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 29:5017-5028.

279. Wylezich, C., Meisterfeld, R., Meisterfeld, S., Schlegel, M. 2002.

280. Phylogenetic analyses of small subunit ribosomal RNA coding regions reveal a monophyletic lineage of euglyphid testate amoebae (order Euglyphida). J. Eukaryot. Microbiol. 49: 108-118

281. Yoon, H.S., Hackett, J.D., Bhattacharya, D. 2002. A single origin of theperidinin- and fucoxanthin- containing plastids in dinoflagellates through tertiary endosymbiosis. Prot. Natl. Acad. Sci. USA 99:11724-11729.