Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и эволюция генов рРНК у лишайников семейства Umbilicariaceae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и эволюция генов рРНК у лишайников семейства Umbilicariaceae"

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 582.291: 577.135

Иванова Наталья Владимировна

Структура и эволюция генов рРНК

у лишайников семейства имвилсашасеае.

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте Физико-Химической Биологии им. А. Н. Белозерского и в Центре Поддержки Музея, Смитсоновский Институт, Вашингтон, США.

Научный руководитель:

кадидат биологических наук А. В. Троицкий. Оффициальные оппоненты

доктор биологических наук А. А. Колесников кадидат биологических наук В. В. Гречко

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН.

Защита состоится 7 апреля 1998г. в К) час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Введение

Актуальность проблемы. Система классификации грибов базируется в основном на морфологии плодовых тел, спор и таллома, что распространяется и на существующую систему лишайников. Однако, в силу большой полиморфности лишайников использования морфологических признаков при определении бывает недостаточно, в особенности это касается тех случаев, когда отсутствуют или неизвестны плодовые тела. Хемотаксономические признаки, широко использующиеся при определении лишайников, тоже не всегда позволяют в полной мере решить возникающие проблемы, кроме того один и тот же вид может формировать химические расы. В отдельных случаях отсутствие плодовых тел приводит к затруднениям при определении положения вида в системе. Поэтому поиск и применение дополнительных критериев в систематике лишайников в последнее время получили широкое распространение.

Таксономическую структуру семейства Umbilicariaceae неоднократно подвергали ревизии многие авторы, выделяя в его составе от одного до четырех - пяти родов или подродов с секциями. Вопрос о самостоятельности рода Lasallia в течении 150 лет оставался дискуссионным, однако в настоящее время общепринятой яшшется система с выделением двух родов Lasallia Merat and Umbilicaria Hoffm. em. Poelt в составе этого семейства. Поэтому актуально было найти подходящий молекулярный маркер для исследования филогении лишайников семейства Umbilicariaceae и оценить корреляцию полученных результатов с существующими схемами классификации.

Гены рДНК представляют собой мозаику консервативных и вариабельных участков и являются продуктом согласованной эволюции, что позволяет использовать их для исследования филогении как на уровне таксонов высокого ранга, так и на уровне отдельных популяций. Интроны 1 группы часто присутствуют в ядерной 18S рДНК ли-хенизированных грибов. Интроны расположены в определенных участках нуклеотидной последовательности 18S рДНК. Нуклеотидные последовательности интронов могут являться индикаторами эволюционных процессов, происходящих не только на видовом, но и на геномном уровне. У представителей филогенетически удаленных таксонов интроны в общих позициях, как правило, не гомологичны и возникли в результате независимых событий. В то же время, у близких видов интроны в общих позициях предположительно гомологичны.

Цели и задачи исследования. Целями данной работы был поиск подходящих молекулярных маркеров для исследования филогении лишайников семейства Umbilicariaceae, оценка корреляции полученных результатов с существующими схемами классификации, а также анализ наличия и распределения интронов I группы в 18S рДНК.

Для этого были поставлены следующие задачи:

Определить информативность ITS1 и ITS2 для исследования внутрисемейственной филогении Umbilicariaceae.

Оценить уровень вариабельности у гена р-тубулина и возможность его использования в качестве альтернативного молекулярного маркера.

Определить нуклеотидные последовательности участка, выбранного в качестве молекулярного маркера и включающего часть 18S, ITS1, 5.8 и ITS2, для различных представителей семейства Umbilicariaceae.

В рамках проекта по происхождению лишайникового симбиоза определить полные нуклеотидные последовательности 18S рДНК двух представителей семейства Umbilicariaceae для определения положения этого семейства в системе аскомицетов.

Картировать распределение интронов в 18S рДНК, определить их нуклеотидные последовательности и вторичную структуру, а также оценить перспективность применения гомологичных интронов для филогенетических исследований.

Научная новизна и практическая ценпость работы. Произведена оценка информативности генов р-тубулина а также ITS1, 5.8S и ITS2 рДНК для исследования филогении. Исследовано положение этого семейства в системе аскомицетов. По результатам филогенетического анализа последовательностей 18S рДНК сделан вывод, что это семейство не входит в порядок Lecanorales, куда его ранее включали. Филогенетический анализ последовательностей ITS1, 5.8S и ITS2 видов Lasallia и Umbilicaria показал, что Lasallia формируют монофилетич-ную группу, которая заслуживает родового статуса, что согласуется с существующей схемой классификации. Виды Umbilicaria парафиле-тичны по отношению к Lasallia, однако монофилетичные группы внутри Umbilicaria, выделенные в нашем исследовании на основе анализа ITS последовательностей, не отражают ни одной из существующих дробных схем классификации этого рода. Впервые у этого семейства обнаружены и исследованы интроны I группы в 18S рДНК. Ин-троны в двух из четырех обнаруженных позиций впервые отмечены у лихенизированных грибов. Показана гомологичность интронов в каж-

дой из обнаруженных позиций, а также то что гомологичные интроны несут филогенетическую информацию, согласующуюся с результатами анализа ITS последовательностей.

Теоретическая ценность работы обусловлена ее вкладом в применение методов геносистематики к лишайникам, а также в разработку вопросов, связанных с эволюцией генов рДНК и интронов I группы.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 6 международных конференциях. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ и отдела эволюционной биохимии Института физико-химической биологии им А. Н. Белозерского (МГУ) в октябре 1997 г.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, экспериментальной части, результатов и их обсуждения и выводов. Работа изложена на 110 страницах, содержит 21 рисунок и 5 таблиц. Список литературы включает 115 источников.

Материалы и методы

Выделение ДНК

Для выделения ДНК использовали гербарные образцы лишайников из коллекции «G. В. Feige et H. Т. Lumbsch: Umbilicariaceae Exsiccatae», распространяемой Эссенским Университетом; часть образцов была самостоятельно собрана на Украине и в США Суммарная геномная ДНК была выделена с использованием двух стандартных протоколов (Moller et al. 1992; Grube et al. 1995) с небольшими модификациями. Этими методами из небольшого количества исходного материала (30 - 60 мг) можно получить достаточное количество препарата чистой ДНК (< 1 мкг). Применение методов молекулярной биологии к лишайниковым симбионтам встречает на своем пути важнейшую проблему - отделение грибной ДНК от водорослевой в случае прямого выделения из лишайника. В данной работе была использована амплификация генов рРНК с применением ПНР (полимеразной цепной реакции) и праймеров при помощи которых можно избирательно амплифицировать только грибной компонент.

ПЦР амплификация

Различные разведения препарата ДНК использовали для амплификации 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 рДНК и гена р-тубулина (Glass & Donaldson, 1994). Праймеры для рДНК приведены в табл. 1. Расположение праймеров и соответствующие ПЦР-продукты отображены на рис. 1.

Таблица 1. — Праймеры, использованные для амплификации 18S, ITS1, 5.8S и ITS2 рДНК._

локализация название нуклеотидная последовательность

1) 0004 - 0021 2) 0054 - 0072 3) 0871 - 0852 4) 0802 - 0819 5) 1312 - 1293 6) 1769 - 1750 7) 1566 - 1583 8) 1769 - 1787 9) LSU rDNA (nu-SSU-0021-5') (nu-SSU-0072-5') (nu-SSU-0852-3') (nu-SSU-0819-5') (nu-SSU-1293-3') (nu-SSU-1750-3') (nu-SSU-1583-5') (nu-SSU-1787-5') (ITS4-3") CTG GTTG ATTCTG CCAGT- 5' CATGTCTAAGTTTAAG CAA- 5' CGTCCCTATTAATCATTACG-3' GAATAATAGAATAGGACG-5' AATTAAGCAGACAAATCACT-3' AAACCTrACGACTTTTA-3' CACGAGGAATTCCTAGT-5' TCCGTAG GTGAACCTG CG G -5' TCCTCCG CTTATTG ATATG C- 3'

1) Gargas & DePriest (1996); 2-6) Gargas & Taylor (1992); 7) DePriest (1993); 8-9) White et al. (1990). Все названия праймеров для амплификации 18S рДНК приведены в соответствии с номенклатурой Гаргас и ДеПрист (Gargas & DePriest 1996); локализация праймеров дана относительно нуклеотидной последовательности S. cerevisiae.

Секвенирование и филогенетический анализ

ПЦР-продукты осаждали в 13% ПЭГ-8000, 1.25 M NaCl и использовали для проведения реакций циклического секвенирования. В случае получения двойных или множественных полос в ПЦР продуктах (при амплификации интронсодержащих образцов) был применен

0021-5' 0072-5'

0819-5'

1583-5' 1787-5'

18S рДНК

ITS1 ITS2

26S рДНК

X.

0852-3' 1293-3'

1750-3'

5.8S

its4-3'

Рис. 1. — Локализация праймеров в единице тандемного повтора рДНК и соответствующие продукты амплификации (изображены в виде линий под схемой единицы тандемного повтора). Аббревиатура «пи-ЭБи-» в названиях праймеров опущена

коплавкой 1% агарозе фирмы NuSieve с последующей очисткой набором GeneClean Bio 101 или реамплификацией из разбавленной агаро-зы.

Реакции секвенирования проводили с использованием двух наборов реактивов и оборудования:

1. DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) и анализировали при помощи автоматического секвенато-ра модели 373А Stretch (Applied Biosystems). Первичную обработку последовательностей проводили при помощи программы Sequence Navigator 1.0 (Applied Biosystems).

2. AmpliTaq Cycle Sequencing Kit фирмы Perkin Elmer для ручного секвенирования от меченого праймера. В качестве метки использовали [у -32Р] дезоксиаденозин трифосфат с молярной активностью 1000 Ci на моль. Каждая из последовательностей была прочитана с обеих цепей ДНК и с использованием нескольких праймеров.

Последовательности участка содержащего около 200 ht. 18S и ITS1, 5.8S и ITS2 рДНК были выравнены при помощи программы PileUP (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, September, 1994) и затем вручную. Выравненные нуклеотидные последовательности этого участка были использованы для филогенетического анализа. Эволюционные деревья строили с использованием двух методов: MP - максимальной иарсимонии (maximum parsimony) при помощи программы PAUP 3.1.1 (Swofford, 1993) и NJ - по методу ближайшего соседства (neighbor-joining) при помощи программы TREECONW (Van de Peer & DeWachter, 1994). Для каждой филогенетической реконструкции были подсчитаны индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп.

На основе литературных данных по морфологии и хемотаксо-номии (Llano 1950; Wei & Jiang 1993, 1992, 1989, 1988; Narui et al. 1996; Голубкова с соавт. 1978) была составлена матрица состояния 30 признаков для этих же видов Umbilicariaceae. Данные были проанализированы при помощи эвристического поиска программы PAUP 3.1.1. Признаки были поляризованы, для укоренения деревьев использовался гипотетический предок.

Результаты и обсуждение

Оценка информативности выбранного участка

Определены нуклеотидные последовательности, включающие часть 18S, ITS1, 5.8S и ITS2, для 17 видов Umbilicaria и трех видов

Lasalllia — положение исследованных видов в разных классификационных схемах приведено в таблице 2. Уровень межвидовой вариабельности для ITS1 + ITS2 составил от 3.3 до 14 %. При сравнении средних уровней вариабельности участков ITS1 и ITS2 отмечено, что ITS2 у Umbilicariaceae более консервативен (2.63 - 12%), чем ITS 1(4 -15%).

Внутривидовая вариабельность оценена для U. deusía и U. cylindrica из разных мест сбора. У образцов U. deusta уровень вариабельности незначителен и составил несколько нуклеотидных замен, в то время как у сравненных U. cylindrica из Украины и Гренландии была отмечена значительная вариабельность (до 8%), которая даже превысила межвидовую вариабельность при сравнении с U. umbilicarioides (3.3 и 7.3 % соответственно). Эти различия вариабельности могут свидетельствовать о том, что образцы, относимые по морфологическим признакам к одному виду, могут представлять разные виды. Межвидовая вариабельность у Lasallia составила от 11 до 15%. По контрасту, проамплифицированный и отсеквенированный участок гена р-тубулина у тех же двух видов Lasallia оказался более консервативным чем ITS1 и ITS2 и содержал только 4.35% различий.

ITS последовательности U. rígida и U. leiocarpa оказались почти идентичными, хотя и содержали несколько нуклеотидных замен, находящихся главным образом в интроне, найденном в позиции 1767. При морфологическом анализе талломов было обнаружено, что морфологические признаки образцов формально соответствуют определительным признакам этих двух видов. Одним из основных отличий между ними является ареолированность нижней поверхности U. rígida и гладкая нижняя поверхность таллома у U. leiocarpa. Для объяснения этих морфологический отличий и сходства последовательностей необходимо исследование дополнительных образцов.

Филогенетический анализ

Для укоренения деревьев в нашем филогенетическом анализе мы использовали последовательности ITS1, 5.8S и ITS2 представителей порядка Eurotiales. Семейство Umbilicariaceae до недавнего времени обычно рассматривали в составе порядка Lecanorales, хотя исследователи и отмечали, что тип структуры сумки у умбиликариевых лишайников является особой категорией внутри Lecanorales (Wei & Jiang, 1993).

В рамках проекта по исследованию возникновения лишайникового симбиоза у грибов определены нуклеотидные последовательности

18S рДНК для двух представителей Umbilicariaceae (L. rossica и U. subglabra), которые были использованы для филогенетического анализа вместе с последовательностями 18S рДНК различных аскомице-тов и базидиомицетов, включая лихенизированных представителей (DePriest et al. 1997). По результатам этого анализа умбиликариевые лишайники возможно должны быть исключены из состава порядка Lecanorales, куда их включали ранее (DePriest et al. 1997). В соответствии с этими гипотезами порядок Eurotiales, как сестринская группа, должен быть подходящей внешней группой для филогенетического анализа. Поэтому из генетического банка для использования в качестве внешней группы были взяты нуклеотидные последовательности ITS1, 5.8S и ITS2 пяти представителей порядка Eurotiales.

100

42

50

j*- U. dec

U.cylindrica СЮ U. cylindrica 48 U. umbilicarioides ' U. nylanderiana U. hyperborea U. vellea U. cristulosa

Г-i

95

U. decussata U.antarctica U. subglabra U. ruebeliana

Eupennicillum javannicum

Thermoascus crustaceus 74_I-

"■¡1_| U. leiocarpa

,tH_ U- ri9ida

47 1— U. lyngei J U. muehlenbergii U. deusta U. americana

L. rossica L. pertusa L. pennsylvanica U. spodochroa

-t!

85 I-

40

Eurotium rubrum

Monascus purpureus Eremascus albus

10

Рис. 2. — Консенсусное дерево, представляющее 16 деревьев длиной 705 шагов, полученных при анализе методом максимальной парсимонии при помощи PAUP, каждое из деревьев имело CI 0.597, RI 0.566. Индексы бугстрэпа выше 40, полученные при анализе 200 повторностей , показаны на каждой из выделенных ветвей. Под рисунком показан масштаб (соответствует 10 заменам).

Для филогенетического анализа были использованы выравненные нуклеотидные последовательности участка, включающего часть 18S, ITS1, 5.8S и ITS2 рДНК двадцати видов умбиликариевых лишайников и пяти видов порядка Eurotiales в качестве внешней группы, содержащего приблизительно 300 информативных признаков без учета инсерций и делеций.

Поскольку ITS последовательности образов U. cylindrica значительно различались, было проанализировано влияние этих различий на результаты анализа. При включении в анализ обоих образцов U. cylindrica методом MP с использованием опции эвристического поиска программы PAUP было получено 16 максимально экономных (МЭ)

100

52

58

U. subglabra U. ruebeliana

97jU. leiocarpa -| U. rigida 45 U. lyngei

_Г U. nylanderiana

U. hyperborea —Г~ U. cylindrica 48 99 U. umbilicarioides

49 I-и. vellea

U. crustulosa

J4ZZ

■р и. dec

U. decussata U. antarctica

U. muehlenbergii " U. deusta U. americana

91

L. rossica L. pertusa L. pennsylvanica

~ U. spodochroa Eupennicillium javanicum

- Thermoascus crustaceus

-— Eurotium rubrum

- Monascus purpureus

-Eremascus albus

77

10

Рис. 3. — Одно МЭ дерево длиной 687 шагов, С1=0.604, 141=0.572, полученное при анализе методом макимальной парсимонии с использованием программы РА1)Р, включая только один образец и. суНпйпса 48. Индексы бутстрэпа выше 40, полученные при анализе 200 повторностей , показаны на каждой из выделенных ветвей.

деревьев каждое длиной 705 шагов, С1=0.597 (индекс устойчивости), RI (retention index)=0.566. Консенсусном дерево показано на рис. 2.

При анализе, включающем только образец U. cylindrica 48, было получено лишь одно МЭ дерево длиной 687 шагов, С1=0.604, RI=0.572 (Рис. 3).

При анализе с образцом U. cylindrica СЮ было получено два МЭ дерева с длиной 697 шагов CI=0.600, RI=0.559. Эти два дерева отличались от предыдущего главным образом во взаиморасположении U. antarctica и U. decussata. В этом анализе по сравнению с предыдущими отличалось положение U. deusta и U. americana. Все незначительные отличия топологии деревьев имели низкие значения индекса бутстрэпа. Во всех случаях виды Lasallia формировали монофилетич-ную группу с высокими индексами бутстрэпа. Род Umbilicaria был па-рафилетичен по отношению к Lasallia. Следует отметить, что моно-

ioorU. rígida 7гРи. leiocarpa

'-U. lyngei

I-U. americana

58|-и. deusta

Р-U. muehlenbergii

57j— U. decussata

'-U. antarctica

S8j— U. umbilicarioides U. cylindrica 48 U. cylindrica СЮ

57

¡sij-U. ruebeliana

'-U. subglabra

I-U. crustulosa

U. vellea U. spodochroa

100

fit

-™°48j-U. hyperborea

гС

~l83|-

U. nylanderiana

771-L. pennsylvanica

76j-L. pertusa

'-L. rossica

59i-Monascus рифигеиэ

54p-Eurotium rubrum

Thermoascus crustaceus Eupennicillum javanicum

Eremascus albus

Рис. 4. — Результаты филогенетического анализа данных при помощи Ю-метода по р-расстоянию с учетом инсерций и делеций. Представители ЕигоНа^э — внешняя группа, как и на рис.-2, 3.

филия ишЫ1сапасае относительно внешней группы имела высокий индекс бутстрэпа (100%).

Данные проанализировали также Ш-методом (включая оба образца и. суИпёпса). Первая опция анализа (/ьсМапсез) с принятием в счет инсерций и делеций построила филогенетическое дерево, где итЬШсапа были сестринской группой по отношению к ЬсиаШа. Обе группы, таким образом были монофилетичны. Монофилия итЬШсапа была поддержана индексом бутстрэпа равным 57% (Рис. 4).

Анализ без учета инсерций и делеций привел к филогенетическому дереву сходному с деревьями, построенными МР-методом. итЬШсапа в этом случае были парафилетичны, а К хрос1осИгоа занимала базальное по отношению ко всему семейству положение. Деревья, построенные Ш-методом на основе расстояний Кимуры (Кшшга 1980), отличались главным образом в базальном по отношению ко всему семейству положении и. пу1ап(1епапа вместо V. зройосНгоа.

U. subglabra U. muehlenbergii U. nylanderiana U. deusta U. spodochroa U.vellea U. cylindrica U. leiocarpa U. lyngei U. rígida

U. umbilicarioides U. antarctica U. decussata U. crustulosa U. americana U. ruebeliana U. hyperborea L. rossica L. pertusa L. pennsylvanica

Рис. 5. — Консенсусное дерево представляющее 97 деревьев длиной 143 шага (CI = 0.448, RI = 0.521) полученных при анализе морфологических и хемотаксономических признаков методом максимальной парсимонии.

В результате анализа морфологических признаков МР-методом было получено 97 наиболее коротких деревьев длиной 143 шага. La-saliia сформировали сестринскую группу относительно UmbUicaria. Группировка из трех видов U. leiocarpa, U. rígida и U. lyngei сохранилась, однако структура дерева внутри Umbilicaria отличалась от предыдущих филогенетических реконструкций (Рис. 5).

Сравнение полученных результатов с существующими схемами классификации

Монофилетичные группы, выделенные в нашем исследовании на основе анализа ITS последовательностей, не отражают ни одной из существующих схем классификации, за исключением выделения трех видов Lasallia в монофилетичнуто группу, которая имела высокие уровни индекса бутстрэпа (87-91% в MP и 77-81% в NJ-деревьях).

Оставшиеся виды Umbilicaria во всех проведенных филогенетических реконструкциях образовывали четыре монофилетичные группы: 1. U. subglabra и U. ruebeliana (индексы бутстрэпа в MP — 48 и 60%, в NJ — 75 и 77%); 2. U. nylanderiana и U. hyperborea (индексы бутстрэпа в MP — 58 и 50%, в NJ — 47 и 43%); 3. U. leiocarpa и U. lyngei (индексы бутстрэпа в MP — 40 и 42%, в NJ — 69 и 72%); 4. U. cylindrica 48 и U. umbilicarioides (индексы бутстрэпа 98-99% в обоих анализах) или U. cylindrica СЮ и U. umbilicarioides (индексы бутстрэпа в MP - 45%, в NJ - 42 и 43 %).

Виды U. subglabra (Agyrophora) и U. ruebeliana (Omphalodiscus) относятся к секции Фрея Anthracinae. Ллано (1950) разделил эту секцию на Agyrophora и Omphalodiscus. Эти сестринские таксоны не формируют монофнлетичную группу с другими представителями Anthracinae sensu Frey. Например, U. leiocarpa, U. rígida и U. lyngei, помещенные Ллано в Agyrophora образуют отдельную монофилетичную группу во всех проведенных нами анализах. Другие представители секции, помещенные Ллано в Omphalodiscus, включают парафилетичную группу, в которую входят U. antarctica, U. crustulosa, U. decussata и базальный вид U. spodochroa. Таким образом, ни секция Anthracinae sensu Frey, ни рода Agyrophora и Omphalodiscus sensu Llano не были монофилетичны-ми по результатам наших анализов.

Таблица 2. — Схемы классификации семейства Umbilicariaceae и виды, использованные для анализа 18S, ITS1, 5.8S и ITS2 рДНК последовательностей.

Wei & Jiang (1993)

род подрод секция

L. pennsylvanica Lasallia Lasallia

L. pertusa

L. rossica

U. cylindrica Umbilicaria Umbilicaria Umbilicaria

U. umbilícarioides Umbilicaria

U. hyperborea Umbilicaria

U. nylanderina Umbilicaria

U. deusta Umbilicaria

U. vellea Umbilicaria

U. americana Umbilicaria

U. muehlenbergii Actinogyra

U. spodochroa Omphalodiscus Spodochroa

U. crustulosa Spodochroa

U. antaretica Omphalodiscus

U. decussata Omphalodiscus

U. ruebeliana Omphalodiscus

U. subglabra Agyrophora Agyrophora

U. leiocarpa

U. tyngei

U. rígida

Две оставшиеся монофилетичные группы, присутствовавшие во всех построенных нами деревьях, являются представителями Umbili-caria sensu Llano. U. nylanderiana и U. hyperborea являются морфологически близкими видами. U. cylindrica и U. umbilícarioides оба входят в секцию Фрея Polymorphae, однако среди отсеквенированных видов других представителей этой секции не было и, следовательно протестировать монофилию Polymorphae было невозможно. Эти две пары и другие представители Umbilicada sensu Llano оказываются парафиле-тичными. U. vellea входит в состав монофилетичной группы, включающей представителей Omphalodiscus sensu Llano. U. deusta и U. americana в одних случаях являлись сестринскими таксонами, а в других — объединялись с представителями Agyrophora sensu Llano. Один из оставшихся родов — Actinogyra, выделенный Ллано, был

Таблица 2. — Продолжение

Llano (1950) Frey (1933)

род секция род подрод секция

Lasallia Obscurae Pallidae Pallidae Umbilicaria Lasallia

Umbilicaria Simplices ?Simplices Simplices ?Simplices Simplices Simplices Simplices Gyrophora Polymorphae Polymorphae Glabrae Glabrae Glabrae Vellae Vellae

Actinogyra Vellae

Omphalodiscus Spadochroae Spadochroae Decussatae Decussatae Decussatae Anthracinae Anthracinae Anthracinae Anthracinae Anthracinae

Agyropkora Antkracinae Anthracinae Anthracinae Anthracinae Antkracinae Anthracinae Anthracinae Anthracinae

представлен в работе единственным видом — U. muehlenbergii, что наложило ограничение на исследование монофилии этого рода.

Таким образом, несмотря на устойчивые группы, филогенетические деревья не содержат подтверждений ни для одной из существовавших схем деления внутри Umbilicaria. В противоположность этому, Lasallia монофилетичны во всех деревьях с высоким значением бутстрэпа (91, 87% в МР-методе и 86, 81% в NJ-методе).

Интроны первой группы в 18S рДНК Umbilicariaceae

При амплификации было выявлено, что отдельные виды Umbilicariaceae содержат вставки в 18S рДНК. Ни один из четырех проанализированных видов рода Lasallia не содержал вставок в 18S рДНК. Среди Umbilicaria они были просеквенированы у пяти из 19 исследованных видов (Табл. 3).

Таблица 3. — Виды исследованные на предмет наличия интронов в 18S рДНК. Отсеквенированные интроны помечены жирным шрифтом.

Виды

Присутствие интронов и их длина в нуклеотидах

403 [330] 1165 [943] 1269 [1052] 1767 [1506]

L. papulosa

L. pennsylvanica

L. pertusa

L. rossica

U. arctica

U. caroliniana (+) (+)

U. cyiindrica 214 iit. 257 ht. 289 (249) ht.

U. deusta 238 ht.

U. leiocarpa прибл. 200 ht. 200 ht.

U. lyngei 199 ht.

U. microphylla

U. muehlenbergii

U. nylanderiana

U. polyphylta

U. polyrrhiza (+) (+)

U. spodochroa

U. subglabra

U. umbilicarioides 76 пт. 205 ht. 289 ht.

U. vellea

За счет использования нескольких пар праймеров перекрывание амплифицированных фрагментов обеспечивало полное картирование вставок на протяжении всей 18S рДНК (Рис. 1).

Недавно была предложена новая модель вторичной структуры интронов I группы (Cech et al. 1994), отражающая третичные взаимодействия (Michel & Westhof 1990), однако для простоты в данной работе приводятся модели в соответствии с ранее предложенной обобщенной моделью (Cech 1988, Burke et al. 1987).

Небольшая вставка в позиции 403 [330].

Было выявлено, что увеличение длины продукта амплификации у U. umbilicarioides обусловлено присутствием небольшой (76 нт.) вставки, локализованной между 403 и 404 нт. относительно последовательности S. cerevisiae. Гаргас с соавторами (Gargas et al. 1995) предположили, что небольшие вставки, встречающиеся в позициях известных для интронов первой группы, могут представлять собой

Рис. 6. — Модель вторичной структуры небольшой вставки, обнаруженной у U. umbilicarioides. Здесь и далее последовательности экзона в каждой из моделей выделены строчными буквами, ин-трона — ПРОПИСНЫМИ БУКВАМИ. Канонические пары оснований во вторичной структуре обозначены знаком «-», пары G-U — знаком «•», Р1 - Р9 — шпильки интронов I группы. Предположительные 5'- и З'-сайты сплайсинга обозначены стрелками. Спаривание фланкирующих последовательностей (Р1 - Р10) в каждой из моделей заключено в рамку. Большая точка «•» — спаривание фланкирующего U и внутреннего G у 5'-сайта сплайсинга.

«прото-» или дегенерировавшие интроны I группы. За исключением U. umbilicarioides, ни один из исследованных видов не содержал вставки в позиции 403 [330].

Небольшая вставка, найденная у U. umbilicarioides может быть уложена во вторичную структуру, состоящую из двух шпилек и спаривания фланкирующих последовательностей интрона (Рис. 5).

У предположительной границы интрона на 5'- конце отсутствовал U-нуклеотид, в то время как G-нуклеотид на З'-конце сохранялся в противоположность дегенерировавшему интрону у Arthonia lapidicola (Grube et al. 1996). Тем не менее похожими особенностями обладали интроны, найденные в этой же позиции у Cladonia, Cladina, Stereocaulon, Pertusaria и Physcia (DePriest & Stenroos, submitted). Спаривание фланкирующих последовательностей может быть интерпретировано как Р10, а две шпильки как PI, Р2 интронов первой группы, также как и в интроне Arthonia lapidicola по Грубе.

Интроны I группы в позициях 1165 [943], 1269 [1052] и

1767 [1506].

Все интроны в позициях 1165, 1269 и 1767 имели девять консервативных элементов вторичной структуры (Р1-Р9) и консервативные последовательности «Р», «Q», «R» и «S», характерные для интронов группы I. У всех обнаруженных интронов отсутствовали дополнительные стебли между элементами Р7 и РЗ, характерные для IA груп-

0 »

о с

с с

с & е • о

ti ■ G

L G - С *

Ц • J

и • g etaag -5'

С - б GONXCCOUGOCtBGGcuace -3'

и-» t

С - G 1

а - о

С - в О - А U • G G - С Ц - А С О S С

И о

G G С 0 0

<; о с - С

с - а с - С

с - с Р5 6 - с

с - с и и

С с - с и • с

С и с - с с - с

с - и 0 • в с - с

-►с - С с 0

а • с А А и

9 • с и • с С А

Р1 с • с Р2 и • с Р4 С - с

Я - с О • с РЗ с - С К

9 - с 6 - с с - с

5'- а - ЦССОААЗДССС - едзссиазиедлахх: - СААССССЛА

1ИП-Ч мми*

ссалзаас иисазога

1 ре САСС / г с с

в с / А А А

АйССб ссссс С III! 11111

ссссс жж; и АС

01511 АСОАС С

СМ IН II I

охсссшсгклцлших: азе с • с ■

Р7

Р1

5' - а?дсди<ХС

Н1!1«Г_

-рисйкосиис "ТТТ

---("оса;

-----

I

йАСЦССОКСаЮ

= 9

с д

в »

а д

и Р9 с

С с ■

гш нитронов группы I. Выступающий нуклеотид А в последовательности элемента И и пара С-С, следующая за этим нук-леотидом в Р7, присутствовали у всех интронов; некоторые интроны имели также в-и и С-О в начале Р6. Эти признаки позволяют отнести интроны, найденные у итЫНсапа, к группе 1С1 вместе с интронами, найденными в 18Б рДНК других организмов.

В позиции 1165 интроны присутствуют у и. итЬШсаг'ю'к1ез,

1}. суНпйпса, II. Шосагра. Полностью были определены последовательности у интронов и.

итЬШсапо1йе$, II. суНпйпса. (Рис. 7).

Предварительные исследования указывают на присутствие вставок в этой же позиции у и. ро1уггЫ1а и V. сагоИшапа. В позиции 1269 интроны обнаружены у V. суИпйпса, II. йешЛа и, по предварительным данным, у и. сагоНтапа и II. ро1уггЫю. Интроны в позиции 1269 содержат во вторичной структуре сходный элемент Р2.1, который отсутствовал среди интронов в позициях 1165 и 1767 (Рис. 8).

и. суНпёгка, II. Шосагра, и. 1уще1 и II. итЬШсапо'к1е$ содержат интроны в позиции 1767. Основные различия во вторичной структуре между двумя размерными классами (приблизительно 200 нуклеотидов у и. Шосагра, и. 1у^е1 и 289 нуклеотидов у и. суНпйпса и и. итЬШсагю1с1еи). в позиции 1767 обнаружены главным образом в элементах Р1 и Р8 (Рис. 9, 10) — элементы Р1 и Р8 удлинены в нитронах у I/. суИпйпса и I/. итЬШсагтйег;. Помимо этого отдельные образцы и. суИпйпса из Гренландии имеют интроны с укороченным на 40 нуклеотидов элементом Р8.

Рис. 7. — Модель вторичной структуры интрона в позиции 1165 у и. суНпдпса

и

и. п ч о с

С - G О - Л G - С G - С Р2.1

j и

y

Для 18S рДНК лихенизированных грибов ранее была показана внутривидовая вариабельность присутствия интронов в различных позициях. У исследованных видов Umbilicaria участок между 802 и 1313 нуклеотидами содержит два возможных места локализации интронов (позиции 1165 и 1269). Этот участок проамплифицирован для нескольких (до 10) образцов двух видов из одного места сбора. При амплификации U. cylindrica получены продукты длиной около 700 и 900 нт. Более длинные продукты содержат интроны в обеих позициях, более короткие — только в позиции 1269. У другого вида — U. deusta внутривидовой вариабельности присутствия интронов не выявили, во всех образцах интрон был локализован только в позиции 1269.

У некоторых видов, имеющих вставки, продукты амплификации содержат двойные или множественные полосы. Это явление может быть объяснено наличием более чем одного типа повтора рДНК за счет вариабельного присутствия или отсутствия интрона в конкретной позиции. Таким образом, выявленная гетерогенность свидетельствует о том, что высокий уровень подвижности интронов может конкурировать с процессом гомогенизации в единицах тандемно повторяющихся генов рДНК.

Все интроны, найденные у

Umbilicaria в пози-

Рис. 8. — Модель вторичной структуры интрона в по- циях П69, 1269 и зиции 1269 у U. cylindrica . Нуклеотиды, обведенные 1767 значительно кружочком со стрелкой, соответствуют заменам в по- отличаются по дли-следовательностях интрона обнаруженным у различных образцов U. cylindrica из одного места сбора. не и нуклеотиднои

с А А

и Vе

с с га- с

А А С - G

А II G - С G G А - 0 .А - 0 U - А u • G Р2 G - С g - С С - G 11g - С С - G л - А С g - С G - С 5' -g - С ЧАСА - Ш

РЗ

С

• G

• G

OCGAOОТЕСКОЙ IMIII GUGAGGG

С A

Г

• G

• A

■ G P5

■ GA

A G 0

ПА

■ С

■ A P4

■ G

• С

' G GCCG0 C93CQCC0CA ■III- IIIIIIM 0GGCG GCCGCGGGGC 0 С С

PS

A A

G AGGGG GAGGCGGG AOOG С

G Mil lllllll- lllll I

G«"® OTCCC CTXCGACDGXAGAOAIÎAGOC GAACC ■

î

a -3'

¥

а • в

О«-©

Р1 д -

Р2 V

С - в РЭ ♦ с «-и СТ • в Д. с

5'- с - ослссссде - стдсисдаос^о^д о 11 ММ ^ отовсив I С

Рв

СС О - А Р6

<=д <=

Осааа с

з евсссв АСиАв

111*I ши* III I

сссис ссввои О С ЛЯАИХООАСС

5'~е&ддегиЦСАСС~

, ЧИ1«1--

сииссвААвссвссс! -III I' п

ОООиисадиад^* 3'

—и.

с?

сдссс!___У

по

последовательности от интронов других организмов в тех же позициях. Эти отличия позволяют предположить, что эти интроны имеют независимое происхождение и были приобретены уже после начальной радиации аскомице-тов. Следуя терминологии Дюджона относительно «ранних» и «поздних» интронов (Бит, 1989) эти интроны следует рассматривать как «поздние».

В целом, текущая мобильность интронов может являться результатом процессов инсерции

и делеции. Интроны, содержащие в последовательности закодированную эндонуклеазу, являются мобильными генетическими элементами и обладают наиболее эффективной формой встраивания интрона — хомингом. Интроны 1 группы могут быть также встроены или перенесены путем обратной реакции сплайсинга, последующей обратной транскрипции и дальнейшим встраиванием в рДНК путем гомологичной рекомбинации. Процесс обратной транскрипции и гомологичной рекомбинации с последовательностью, в которой отсутствует интрон, может привести у утрате интрона. У всех исследованных интронов ПтЫИсапа, отсутствует открытая рамка считывания или последовательность, кодирующая эндонуклеазу, следовательно их распределение по позициям не может быть обусловлено активным «хомингом». Вариабельная встречаемость интронов в отдельных позициях может является результатом мобильности интронов в прошлом,

Рис. 9. — Модели вторичной структуры интронов в позиции 1767 у и. Шосагра и 11. 1упде/. Полные последовательности интрона в моделях приведены для и. 1ею-сагра. Нуклеотиды, обведенные кружочком со стрелкой, соответствуют заменам в последовательности у и. 1упде'1

UO ■ А А

о u\ei о V- А

А А А — U

V

но вероятнее всего генерировано утратой интрона в конкретной позиции путем делеции.

Сходство последовательностей и особенностей вторичной структуры интронов указывает на их гомологичное происхождение

Интроны I группы не «разбросаны» хаотично по 18S рДНК, их можно обнаружить в конкретных, повторяющихся позициях. Эти позиции являются общими даже для представителей различных типов, хотя присутствие интронов в одной и той же позиции у филогенетически удаленных организмов может

лс °1 являться результа-

том независимых инсерций. Сходство нуклеотидных последовательностей и вторичной структуры: интронов, в каждой . из позиций у Umbili-caria позволяет предположить, что интроны в данном случае гомологич-* ны и поэтому фи-

логенетически информативны. Было отмечено, что эта информация согласуется с данными, полученными при анализе ITS последовательностей, так

„ _ как многие интрон-

Рис. 10. — Модели вторичнои структуры интронов в позиции 1767 у U. cylindrica и U. umbilicarioides). Полные содержащие виды с последовательности интрона в модели приведены для наибольшей гомо-U. cylindrica. Нуклеотиды, обведенные кружочком со Л0гнел последова-стрелкой, соответствуют заменам в последовательности у U. umbilicarioides. тельностеи интро-

U — А С О в А

'иве С — в О • О

9 - С 92 А ~ V О - С

9 — С и—А МО — А

л — и С - а РЗ С-в р<

ж — U О • О в-С V

а — еслхлгосАо - слАсАОселсхиавии - а оссос I И И

:саг t

coqaа

Mill I I 11 II I I 11 I

ACCUC ССЭЭОСО С А ОАПАПвАСС а - с

нов были объединены по результатам анализа ITS последовательностей.

Таким образом, в результате проведенного нами исследования установлено отсутствие интронов в 18S рДНК у изученных представителей рода Lasallia. У видов рода Umbilicaria интроны группы I и дегенерировавшие интроны присутствуют в четырех позициях — 403 (330), 1165 (943), 1269 (1052) и 1767 (1506). Позиции 403 и 1165 являются общими для лихенизированных грибов. Две из позиций (1269 и 1767) впервые обнаружены у лихенизированных грибов, хотя по предварительным данным Grube, возможно, что представители другого порядка лишайников Arthoniales тоже содержат интрон в этой же позиции 1767. Интроны, обнаруженные в каждой из позиций у Umbilicaria, характерны для этого рода как по локализации, так и по нуклеотидной последовательности и являются, по-видимому, гомологичными.

ВЫВОДЫ

В 18S рДНК у пяти видов Umbilicaria обнаружены вставки в четырех позициях — 403, 1165, 1269 и 1767. Ни один из четырех видов Lasallia не содержал вставок.

Вставки в позициях 1269 и 1767 впервые отмечены для лихенизированных грибов.

Вставки в позициях 1165, 1269 и 1767 — интроны I группы.

Небольшая вставка в позиции 403 может являться дегенерировавшим интроном I группы.

Интроны в каждой из позиций гомологичны и несут филогенетическую информацию.

По результатам филогенетического анализа 18S рДНК семейство Umbilicariaceae не входит в состав порядка Lecanorales, куда его ранее включали.

Последовательности гена ß-тубулина у двух исследованных видов Lasallia оказались более консервативными, чем последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров.

Кладистический анализ последовательностей ITS1, 5.8S и ITS2 трех видов Lasallia и 17 видов Umbilicaria показал, что Lasallia формируют монофилетичную группу, заслуживающую родового статуса. Виды Umbilicaria в большинстве реконструкций оказывались парафилетич-ными по отношению к Lasallia.

В филогенетической реконструкции на основе морфологических и хемотаксономических признаков виды рода ЬачаШа формируют монофилетичную сестринскую группу относительно ЛтЫИсапа.

Кладистнческого обоснования для существования подродовых группировок в^пределах 11тЬШсапа получить не удалось, ни "морфологических, ни Молекулярных данных.

Возможно, что статус некоторых видов, например; С/. суИЫпса, должен быть пересмотрен с привлечением комплексных данных, включая морфологические, хемотаксономические и молекулярные.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н. В. Иванова, П. Т. ДеПрист, В. К. Боброва, А. В. Троицкий. 1998. Интроны группы I в грибной 18S рДНК лишайников семейства Umbilicariaceae. Доклады Российской Академии Наук (в печати).

2. DePriest, Р. Т., Stenroos, S., Ivanova, N.. and Gargas, A. 1997.

Origins of the lichen association in the fungi: phylogenetic analyses of nuclear small subunit ribosomal DNA sequences. Invited presentation, Bridging the Gap between Phylogeny and Classification of Lichen-Forming Ascomycetes: Annual AIBS Meeting, Montreal, Canada, August 1997. Abstract, American Journal of Botany 84 (suppl.): 9.

3. Ivanova, N.V., & Bobrova, V.K. 1996. The Use of 18S rDNA Sequences in the Phylogenetic Analysis of the Lichen family Umbilicariaceae. Abstracts p.108. 3rd. TAL Symposium, Progress and Problems in Lichenology in the Nineties, Salzburg, Austria 1 -7 September 1996.

4. Bobrova, У. K., & Ivanova, N. V. 1996. The Distribution of Group I Introns in the SSU rDNA among the Representatives of the Lichen Family Umbilicariaceae. Abstracts p.98. 3rd. IAL Symposium, Progress and Problems in Lichenology in the Nineties, Salzburg, Austria 1 -7 September 1996.

5. Ivanova, N. V., & Bobrova, V. K. 1995. Using 18S rDNA of Lichen Family Umbilicariaceae for the Phylogenetic Analysis. Abstracts. International conference "Problems of studing algae, fungi and mosses biodiversity in Arctic", 12-14 Desember 1995, St.Petersburg, Russia

6. Gargas, A., P. T. DePriest & Ivanova, N. 1994. Glacier-Covered Lichens — Source of Ancient DNA, Abstracts. Amer. J. of Botany, June, vol. 181, N6, p.92.

7. Gargas A., DePriest,P. T. & Ivanova, N. 1994. Glacier-Covered Lichens — Source of Ancient DNA. Int. Mycological Congress, Abstracts, August 14-21, Vancouver, Canada, p.69.

8. Gargas, A., DePriest, P. T & Ivanova, N. 1993. Extracting DNA and Amplifying rDNA from Glacier-Covered Lichens. 2nd International Conference on Ancient DNA, Smithsonian Institution, Washington, D.C.

9. DePriest, N.V. Ivanova, D. Fahselt, V. Alstrup, J. Fell and A. Gargas.

Basidiomycetous yeast Sequences associated with Subfossil Ascolichens (submitted).