Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РНК-белковые взаимодействия при инициации трансляции РНК вируса энцефаломиокардита

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "РНК-белковые взаимодействия при инициации трансляции РНК вируса энцефаломиокардита"

московский Государственный Университет им. м. Б. Ломоносова Биологический Дакультет

УВК 576. 858:577. 217

БОРОБЯГИН Антон Валерьевич

РВК-БЕЛКОШ БЗА1Ш0ЛЕЯСТБЙЯ ПРИ ЖЙПЙАПЙЙ

тттт pes вируса зшешоюшша

оз.со.оз - нолек^лягтая биология

Автореферат

лиссертапии на соискание ученой степени канлипата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в институте Физико-химической биологии вы. А. Н. Белозерского, МГУ.

Научный руководитель :

Официальные оппоненты :

доктор химических наук и. н. Еатския

локтое биологических на^к с. б. свиткин

доктор биологических наук н. П. Родионова

Велушая организация : институт молекулярной биологии РАН

иы. В. А. Энгельгардта

зашита состоится

■В

1992 г. в

ш.

час

на заседании Спепиализированного ученого совета Д. 053. 05. 70 при московском государственном Университете им. ы. Б. Ломоносова

с диссертацией можно ознакомиться Биологического Факультета ИГУ.

Автореферат разослан Р&'^У 1592 г.

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

в библиотеке

Б. Б. каграыанов

Обшая характеристика работа.

Актуальность работы. согласно теории ы. козак,

описывавшей механизм иншшашш трансляции у зукэриот (так называемой "сканирушей модели"), узнавания эукариотическиии рибосомами ияиниаторных AUG колонов больпинства «РНК обязательно предшествует стадия их связывания с 5'-конпевыыи кеп-структураии натрии с последующим сканированием

нуклеотклных последовательностей й'-нетганслируеных районов (НТР! uPHKi которое сопровождается плавлениеы их вторичноя

структурц.

Известно, что инициация трансляции РНК вируса зниееалоииокаряита (бзык) такие, как и других пикорнэвирусов, происходит по необычноау механизму. состояшецу в связывании 40S субчастнп зукариотичесш« рнбосои пгяио с внутренними участками 5'-нетраислируеиого района (НТР) вирусной .рнк. Инипиапия такого типа полэчила название внутренней инипиапии трансляции. Показано, что необычный мезаниза ининиании трансляпии обусловлен свойствами самого 5'-ИТР РШ вэнк. солер^лиего набор особых пис-элементов. образушнх так называвши 1EES (от англ. internal К1Ьо2ошэ Entry site) - сайт внутреннего связывания рибосомы. РНК езук является ояноа из наиболее активных ыатгин, тганслирувкихся в еесклеточннз системах из клеток мпекопитаваих (HeLa. Кребс2. ретикулоиитов). Kpoise того, при вирусной инФекпии РНК ВЗИК способна вытеснять клеточные ¡¡РНК из полисом и тем сашм спеш;®ически ннгибнвовать трансляпии клеточных штрин. это предполагает наличие более высокого сродства неких конпонентов трансляционного аппарата клетки.например, Факторов инипиапии трансляции, к рнк бзик, что лает ел преимущество перед клеточнши ырнк в связывании с ркбосоыами.

отсутствие кеп-структуры у РНК ЕЗШС и. соответственно, зависимости трансляпии этой РНК от кеп-связывавших «акторов, позволяет предполагать участие в пропессе внутренней инипиапии трансляпии РНК взш поииыо обычных Факторов инипиапии также и специфических по отношении к данной РНК клеточных транс-Фактогов, возможно, опосредующих взаимодействие иатрипы с рибосомой или с Факторами инипиапии трансляпии. наличие таких транс-Факторов открыло бы пирокие перспективы в исследовании их роли в собственных клеточных процессах, в том числе и в экспрессии клеточных uPHK. ислользушия механизм внутренней инипиапии. .

Пель и задачи исследования: К моменту начала нашей работы была предсказана вторичная структура для 5'-нетранслируеыых районов РНК некоторых пикорнэвирусов. Согласно созданный моделям. подтверждаемым экспериментально,лилерные последовательности пикорнэеирусных РНК обладают сложной вторичной структурой (сы. рис. 11.

Рис. 1 Вторичная структура 5' -НТР РНК БЗМК «согласно РШрепКо е1. а1. . 1985). Рамками указаны делении участков последовательности 5'-НТР в некоторых конструкциях. I, II*. II III iv, - "субдомены" вторичной структуры 5'-НТР.

Ряд данных свидетельствовал также о важности вторичной структуры для Функциональной активности пис-злементов 5'-НТР РНК, отвечавших за способность этих РНК к использованию внутреннего механизма ишшиании трансляции. Однако при этом оставалось неизвестным, какова роль сложной вторичной структуры 2

в обеспечении механизма внутренней инициации. Было высказано предположение о том, что элементы пространственной структуры IRES могут Формировать специфические сайты связывания Факторов инициации или неких особых клеточных транс-Факторов.

Целью настоящего исследования явилось изучение РНК-белковых взаимодействий в пределах 5'-нетранслигуемого района РНК вируса эннеФаломиокардита. которые, как предполагалось, имеют место как в клетках, так и в бесклеточных системах трансляции,приготовленных на основе иитоплазыатических экстрактов из этих клеток. Кроме того, предполагалось изучение роли этих взаимодействий в процессе внутренней инициации трансляции ланной РНК. Б холе выполнения работы были поставлены и решены следующие задачи:

1. Поиск и обнаружение клеточных белковых Факторов, специфически взаимодействующих с последовательностью 5'-НТР РНК ВЗШ в экстрактах из клеток КРебс2.

2. Характеристика свойств таких белков и попытка определить, принадлежат ли последние к числу известных зукасиотических Факторов инициации трансляции.

3. изучение особенностей взаимодействия специфических Факторов с указанными районами РНК. включая локализации районов последовательности 5'-ЮТ, необходимых и достаточных для их связывания.

4. Изучение влияния данных специфических РНК-белковых взаимодействий на способность 5'-НТР направлять инициацию трансляции РНК ВЗМК in vi tro.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые были обнаружены иРНК-связывающие белки из клеток млекопитающих, специфически связывающиеся с определенными участками 5'-нетранслирусыых районов РНК вируса зниеФаломиокардита и, вероятно, отвечавшие за обеспечение ее высокой трансляционной эффективности на уровне инициации трансляции, являясь белками, по-видимому, отличными от известных Факторов инициации, они могут претендовать на роль первого примера клеточных транс-Факторов. стимулирэтоших трансляцию определенных РНК в зукариотическнх системах на уровне стадии инициации (происходящей по неканоническому, внутреннему механизму) посредством специфического взаимодействия с особыми элементами 5'-НТР этих РНК. Данные исследования представляют собой новое направление в изучении механизма внутренней

инициации у эукэриот. стратегия экспериментов, использованная i дашой работе, может быть применена при изучении специфически; РНК-еелковых взаимодействий.лежащих в основе многих вакнейшн: клеточных пропессов.

Апрдбания работы: материалы лиссертапии были прелставлеш на межлУнЦ>одноы симпозиуме "Fost-transcrlPtional control oj gene espreslfilon*. г. Гослар (ФРГ). 1990. международной конФеренпш "Protein bioWnthesls". г. ияпино. 199í и международной шоле-конФегенпии haIjo-febs asi "Post-tramcriptional control of беш екргезаюп'.спеиаи (ГРепияь 1S92.

структура и \об'ем диссертации: Лиссертания состоит и: введения, трех главлвыволов и списка литературы, она извожена на стванипах\ содержит 18 рисунков и библиографически!

список из названия.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. поиск белков. спепнФически связывающихся с 5'-НТР Fig вируса зндеФадоуиокардата. ^¿ервоочерелнов задачей в данная работе был поиск клеточных белков. специфически взаимодействующих с Б'-иетранслмруеыш районом РНК взьзс в s.. экстрактах из клеток аспитновЧ карниномы КРебсг. слухсакшг природной системой-хозяином для ванного вируса, в качестве основного полхода в работеХ использовался метол ультрафиолетового сшивания белков экстракта из зукариотическик клеток с Р-меченными тшнскриптаиа, представля1шшш собсс различные производные лилерной облает^ РНК бзш. Белки, пришитые жестким ультрафиолетом ) в условиях

бесклеточной трансляции РНК бзик, изучали i¡ полиакрилашлноа геле после обработки проб смесью различных рибонуклеаз. гидролизушия РНК-коипонент уф-сшитого кошлекаа. конструкции. использованные в работе, представляли собой фрагменты 5'-НТР РНК взмк. клонированные в векторе ptz18e пол w-hpouotopoij (рТЕ-конструкнии). Основная. исходная конструкция рте-з содержала последовательность 5"-НТР РНК вируса с 316 по 836 положение, включая природный инипиаторный AUG колон (AUS 1 •

другие конструкции представляли собой производные, укороченные с 3'- или 5'-концов или (и) несущие разнообразные внутренние лелепии последовательности 5J-HTP (см. рис2) \ в качестве кодирующей части конструкций использовались^

Фрагмент 837-1155 природной коднрушей последовательности н-4

шиииаиии у эукэриот. стратегия экспериментов, использованная в lanhofl работе, может быть применена при изучении специфических 'НК-белковых взаимодействий, лежащих в основе многих важнейших слеточных процессов.

Апробация работы: материалы лиссертапии были представлены ia международном симпозиуме "Post-transcriptional control of ¡ene expression". г. Гослар (ФРГ).1990. международной конференции Protein biosynthesis", г. Пушино, 1991 и международной школе-сопФереншш NATO-FEBS ASI "Pcst-transcrlPtional control of gene ixpression".Спецаи (Греция), 1992.

Структура и об'еы диссертации: Диссертация состоит из звеления,трех глав,выводов и списка литературы, она изложена ia страницах, содержит 18 рисунков и библиографический

:писок из названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ :. Поиск белков, специфически связывавшихся с 5'-НТР РНК ¡ируса знцеФаломиокардита. Первоочередной задачей в данной >аботе был поиск клеточных •белков, специфически ¡заимолействуюпих с 5' -нетранслируемым районом РНК ВЗНК в жстрактах из клеток асиитпой карпинош КРебс2, служащих 1РИРодной системой-хозяином для данного вируса, в качестве ¡сковного подхода в работе использовался метол 'льтраФиодетового сшивания белков экстракта из зукаюиотических ;леток с "р-меченншгн транскриптами. представлявшими собой >азличные производные лилевной области РНК ВЭЫК. Белки, 1Ришитые жестким ультрафиолетом (254нм. ) в условиях ¡есклеточной трансляции рнк БЗКК, изучали в полиакриламидном 'еле после обработки проб смесьв различных рибонуклеаз, чшролизуеших РНК-кокпонент уш-сгаитого комплекса. Конструкции, ¡спользованные б работе, представляли собой Фрагменты Б'-НТР 'НК ЕЭШ, клонированные в векторе PTZ18E под Т7-промотором рте-конструкции) . Основная, исходная конструкция рТЕ-3 одержала последовательность 5'-НТР РНК вируса с 315 по 836 изложение, вклкчая лриродннй ининизторный AUG колон (AUGui.

Другие конструкции представляли собой производные, короченные с 3'- или 5'-концов или (и) несущие разнообразные 1нутренние делении последовательности 5J-HTP (см. рис2). В :ачестве колирушей части конструкций использовались:

¡рагмент 837-1155 природной кспирушей последовательности н-

кошевой части полипротеина РНК вэмк или последовательность ренортерного гена GUS (В-глшурошдазы1.

»pal Hind®

_ 1?! 484 ,1a«

рТЕЗ-ви8_Ш.—■-■-^-

»d^ 8оИ

Л5 4M БОО «60 7Ü0 еОО'

«со! I Traracripf«

1 => trJS-SUS

pTE4-tU3_EL j II >i> triflS-BUS

X <65 ieol

1844 1155

pTE8 Ш. j мшит»

485\.''6<7

рТЕЮ

pTE13 A

707 723

pTE K-eilS Ш ,-.. i => tf 315 (i 4I4-4S7VWS

413 428

PTE1S-6USMa и =C> »r315(»3?e-«svsus

plFI7.r.HfiE3a ^ .... .j! ■ <>M78-GUS

I ГШ! rim I I.I и—■■■ О tr378(»4M-427)-«US ©428

ptE19-GUS^, a. ii ...... и..... I sC> tr3!B(»398-44e)-tU3

vs?7-449

Рис.2. Схема основных конструкций, использованных в работе, стрелками указаны только сайты рестрикции, го которым производили линеаризацию ллаэыил перед Т7-транскриппией. Сплошной чертой обозначена кодирующая последовательность гена GUS; крестовой штриховкой-фрагыент 837-1155 кодирующей части РНК ВЗЫК. Заштрихованным прямоугольником-последовательность Т7-промоторэ.

Анализ пришивки белков к Т7-транскриптаы. содержащим последовательность 315-837 Б'-НТР РНК ВЗЫК, позволил обнаружить группу полипептидов, наблюдаемых в виле кластера из четырех близко расположенных мажорных зон на радиоавтографах белковых гелей (рис. 36, дорожка 1 или за, дорожки 3, 4 !. Ланная группа зон не наблюдалась для контрольных препаратов: РНК4 вируса ыозаики люнерны (ВШ11 или антисыысловой РНК ВЗЫК (Рис. Зб, дорожка 4). Обработка смесей перед разделением материала электрофорезом прстеиназой К приводила к полному исчезновению данного квадруплета зон в соответствующих дорожках геля.что доказывало его белковую природу.

Основной (мажорный) компонент квадруплета зон приблизительно соответствовал подвижности полипептила с

молекулярной массой в 58 кла. Положения же остальных зон в геле соответствовали молекулярным массам белков в 54-, 56- и 60 гсЛа (см. рис. 6!. Для удобства весь квадруплет зон, соответствующий слепиФическим по отношению к РНК БЭМК белкам, 5ыл назван "ре8". Для "р58" в отличии от других белков, выявляемых с поыоиью данного метода, наблюдалась высокая специфичность связывания и приешеки к РНК БЭШ. Она выражалась а наличии сродства белков только к данному типу

п'клеотилной последовательности - последовательности 5'-HTF ?НК БЭМК и ,в то re время, к строго определенный участкам шепеотшшой последовательности в составе самого 5'-НТР этой ?НК. которые представлялось возшжн'яи локализовать (сы. ниже).

а h

1,2M5W!S им

"pMk;

'ис. з. (а), уф-пришивка белков экстракта из клеток ®ебс2 к некоторым производный 5'-НТР РНК ВЗШ при разных !онннх условиях: 1,2 - 563-763; 3,4 - 315-11551 484-647); I - 647- 1155; 6,7 - 563-1155; 8,9- антисыысловая РНК ВЭЖ 315-1155). 1, 3, 5, 6. 8-50кМ К+; 2. 4, 7. <Э-171мН К+ (Б). 1- 315-837; ! - 485-837; 3 - 647-837; 4 - антисмысловая РНК БЭМК (315155); 171КЫ К+;

О высокой эффективности, а также специфичности связывания усматриваемых белков также свидетельствовала способность лаже [еболыпих избытков "холодных" РНК-конкурентов, содержапшх сайты :вязывания "р58", избирательно и эффективно ослаблять интенсивность соответствушего квадруплета зон. К тону же

пришивка изучаемых полипептидов к последовательности 5'-HTF. была почти одинаково эффективна при концентрации солей калия 50мИ. 171тН ( Рис. За дорожи 3.4! и ЗООмЫ.и наблюдалась даже при 5оОмы. Все остальные белки не проявляли выраженной ' специфичности пришивки к определенным элементам последовательности 5'-НТР РНК ВЭМК.хотя интенсивность зон некоторых таких белков лля разных трэнскриптов заметно варьировала.

В работе было также , проведено исследование других клеточных систем на содержание в них белков, идентичных или близких (по подвижности в геле) к белкам "Р58" из клеток аспитной карциномы. Такой- анализ продемонстрировал наличие белков, аналогичных "Р58", также в питоплазматических экстрактах из клеток HeLa. где их содержание и подвижность оказались почти идентичными таковым из клеток аспитной карциномы. В лизатах ретикулоиитов соотношение интенсивностей зон кластера, наблюдаемого в соответствующей области геля, было несколько иным, чем в первых двух случаях. В частности, относительная интенсивность зон, соответствующих белкам с мол. весами в районе 57-60 кДа. здесь была заметно меньшей. Впоследствии другими исследователями было показано.что Фактор, аналогичный "р58", в ретикулопитах есть, но в этих клетках его содержится значительно меньше .чем в клетках HeLa и Кребс2. 2. фракционирование S30 экстрактов с целью изучения свойств "Р58". Для того, чтобы охарактеризовать свойства "р58".а

также понять не относится ли он к числу известных Факторов инипиапни трансляции зукагиотических клеток, было предпринято несколько этапов Фракционирования экстракта из клеток аспитной карциномы. Материал, полученный на каждом этапе Фракционирования, исследовался на содержание "Р58" методом УФ-сшивания. Результаты анализа солевого смыва с рибосом (RSW) показали, что "Р58" содержится, главным образом, именно в этой Фракции, что отражает, по-видимому, его принадлежность к числу рибосом-связывающих белков (рис. 4а. дорожка 3 или рис.5. дорожка 11. Дальнейшее Фракционирование белков ESV сульФатоы аммония (са) показало, что "р58", в основномгосаждается при 2540« насыщении са Фракции солевого смыва (рис. 4а. дорожка 1.или 4б. дорожка 5). фракции 25-402 и 40-70« насыщения СА далее Фракционировали на колонке с ДЭАЭ-пеллюлозой. полученные 8

Фракции. содержащие белки с возрастающими кислотными свойствами. Фракционировали далее на колонке с ФосФонеллюлозой (Ш). Результаты такого Фракпионирования позволили установить, что "р58" сшвается с ДЭАЗ-колонки. в основном. 0. 1Ы раствором КС1 и оказывается в самой первой фракции (ФРакши "проскока") (Рис. 46, дорожки 1.2).

г- 12 34гй78э

О

I 2 3 к 5 в

-й5)

„60 -;■

Лы) .

• -<

Рис. 4. Уф-прииивка белков из различных Фракпий солевого смыва с рибосом к некоторым транскриптам. (А). 1.4 - Фракция 25-40« насыщения сульФатом аммония; 2.6 - Фракция 40-70Х насыщения сульфатом аыыония; 3,5 - суммарная Фракпия КЯУ (солевой сиыв с рибосом); 1-3 -ТРанскРИПТ 315-8371 485-647); 4-6 - РНК4 ВНЛ. (Б). 1.2 - 0. 1Н КСИ-сыыв с ЛЗАЗ-пеллюлоэн ФРакпии 25-40Я насышения СА ; 3.4 - 0.1Н КС1-сшв с ПЗАЗ-пеллюлозы Фракции 40-70Х насыщения СА ; 5 - Фракция 25-40« насыщения СА ; 6.7 - Фракция 40-70% насышения СА; 8,9 - 0.2Н КС1-сшв с ФосФопеллвлозы Фракпии 0. ЗЫ КС1-смыва с ДЗАЭ-пеллвлозы ( 25-408 СА-ФРакпии КБЫ ); 1,3, 5,6, 8 - транскрипт 315-837; 2.4.7.9 -ТРанскРИПТ 315-8371 701-763);

Это указывает на сильно основной характер белковых компонентов "р58" и. кроме того, позволяет думать, что "р58"

не является одним из■ известных зукариотических Факторов ннипиапни трансляции,проявляющих обычно иной характер распрелеления между Фракциями рибосоыного солевого смыва.

Благодаря внимательному анализу некоторых DEAE- и ФИ-Фракпий. содержащих в виле приыеси незначительные количества "Р58", удавалось наблюдать индивидуальные зоны компонентов "р58"i отделявшиеся в процессе Фракционирования от других сопутствующих им зон квадруплета. Это видно, например, из рисунка 46 (дорожки 8, 9) для самой верхней зоны (рбО) квадруплета, последнее наблюдение позволяет говорить о том, что зоны квадруплета ("Р58"! соответствуют, скорее всего, самостоятельным полипептидам с несколько различавшимися Физико-химическими свойствами, а не являются следствием неполного гидролиза РНКазаыи УФ-сшитого комплекса РНК с одним белком.

3. Предварительная_локализация района специфической

прмшвки "Р58". Б пелях локализации района 5'-НТР РНК ВЗМК, отвечающего за специфическое связывание и пришивку "р58", различные производные лилерной последовательности,

анализировали на способность пришивать изучаемые белки экстракта. '"Р-и-ыеченные РНК, полученные при транскрипции конструкций, укорочённых с 5'-конца ло 647, 563 или даже до 485 положения последовательности 5'-НТР, не обладали способностью пришивать "Р58* (Рис, За,дорожка 7; Рис. 36, дорожки 3,2). Напротив, трэнскрипты конструкций рте8, рТЕЮ и рте13 (рис. 2), содержащие делении в районе "субдоыенов" III и IV вторичной структуры лидера (рис. i) и даже транскрипт, представленный Фрагментом 315-485 5'-НТР, оказались содержащими участки специфического связывания всех четырех полииептилов "р58" (Рис. 7а, дорожки 2,3; 76, дорожка 2; рис. бб, дорожки 3,4).

Таким образом,на первом этапе исследований сайт пришивки был локализован во Фрагменте 315-484 5'-НТР РНК вируса ЭШ.

в дальнейшем, в пелях уточнения границ района, необходимого и достаточного для взаимодействия специфических Факторов и их пришивки к РНК, трэнскрипт 315-837 подвергли специфическому разрезанию РНКазой Н, направляемому олигодезоксирибонуклеотилом из 25 нуклеотидных остатков, комплементарными району 424-448 5'-НТР РНК БЗШ (рис.1). В Результате гидролиза, проводимого на холоду без предварительного отжига олигонуклеотида с РНК, образовывалось два дискретных на вид Фрагмента ( L-большой, 3'-концевой и S-10

малый, 5'-конпевой) ожидаемого размера (Рис. 5а).

Точный размер L-Фрагмента после его извлечения и зкстаакшш из ПААГ был определен метолом удлинения праймера (priraer extension! и сопоставлением положения полноразмерного продукта реакции с положениями продуктов сиквенсной реакпии по Сзнгеру на исходной РНК 315-837. Олиголезоксирибонуклеотид. использованный в данном случае в качестве прайиера, был комплементарен району 5497534 лидерной РНК БЗИК (Рис.1!.Такой анализ показал,что L-Фрагыент произопел в результате гидролиза исходного транскрипта, главным образом, пд^вязи А^ Д^см. Рис. 1).

Подвижность S-Фрагмента в геле соответствовала длине РНК. приблизительно, в 130 нуклеотидных остатков, то есть, предполагаемому размеру 5'-концевого продукта гидролиза (Фрагмента 315-445).

Результаты эксперимента продемонстрировали, что место связывания и приживки "р58" локализуется исключительно в пределах малого S-Фгагмента ( рис. 56, дорожа 3), 1 е

L- * ,, (£?)

А Ь.

fas

S-

¿23'i

Рис.5. (А). Разрезание транскрипта 315-037 РНКазой н в присутствии (1! и в отсутствии (2) олиго-дезоксирибонуклеотида, комплементарного последовательности 549534 5"-НТР РНК ВЭНК.на два Фрагмента. (Б), пришивка белков солевого смнва с рибосом (КЭМ! к ь- и Б- продуктам гидролиза транскрипта 315-837 РНКазой н в присутствии специфического ДНК-олигонуклеотида. 1. - 315-837 (исходный трэнскрипт) ; 2.- i-Фрагыент; 3. - 3-фрагмент; 4. - РНН4 ВШ. В скобках указаны положения паркеров молекулярного веса.

4. Установление различий в сайтах прививки некоторых полипептидов, составлявших "р58". и обнаружение двух районов независимого связывания белков р58-р60 в пределах 5'-кондевого Фрагмента IRES, в соответствии с моделью вторичной структуры. установленной для 5'-НТР РНК ЕЭЖ (рис. 1). сайтами связывания сПеииФических полипепткпов Р54-Р60 в пределах 5'-концевого района лидёрной последовательности могли бы быть несколько небольших шпилечных структур, одна из которых ("сУбломен II"! содержала в своем составе мотив, высоко консервативный у кардио- и аФтовирусов (вирус яшурэ) . Чтобы установить, не отвечает ли за пришивку "Р58" структура "СУбдоменаП". из конструкции рТЕЗ были сделаны производные, содержащие делепии в последовательности 5J-HTF (рис.1.2). В результате таких делепий удалялись участки, образующие как всю структуру "СУбдоменаП" ( д398-440). так и только ее верхнюю, наиболее консервативную, часть (¿414-427).

Из полученных конструкций рТЕ16 и РТЕ15. а также из исходной конструкции рТЕЭ. за счет укорочения их с 5'-конпа до 378 положения (см. рис. 2) были дополнительно сделаны еше три конструкции, соответственно pTEIS. PTE18 и PTEi7.

Результаты анализа всех полученных производных 5'-НТР на способность пришивать изучаемые белки экстракта показали, что: а). РНК,лишенная последовательности 315-373. но сохраняющая последовательность "субдомена II".способна пришивать в основном два полипептида из четырех-р58 и г60. б). Последовательности, образующие "СУбломен II" и, прежде всего, его 14-нуклеотидная терминальная часть являются элементами, абсолютно необходимыми лля обеспечения способности транскрипта 378-484 специфически пришивать р58- и рбО-коыпоненты "Р58" (Рис. 6а, дорожки 4.51. в). 5J-проксимальная часть лилерной послеловательности 13153771 также способна к самостоятельному пришиванию F58 и р60,однако, пришивка Р60 к данному Фрагменту РНК наблюдается лишь в случае использования А-меченных транскриптов (Рисбб. дорожки 4.5). г). Олин из компонентов "Р587 (р54), которому соответствует нижняя зона квадруплета, в отличии от других полипептилов проявляет специфическое сродство исключительно к 5'-проксимальной (315-373) части лилерной послеловательности. однако. точная локализация сайта его пришивки в пределах установленного района РНК остается неизвестной (Рис. ба. дорожка 3; 66,дорожки 1.21. 12

ъ

Таким образом, можно сделать заключение, что одним из лвух независимых районов пришивки, 'специфических" для РНК БЭЫК белков р58'-р60 (свойства белка р56 в данной работе не изучались), оказывается "субдомеШI" в то время, как другой район связывания и пришивки обнаруживается в 5' -проксимальной части 5'-НТР, предшествушей "субдоыену1I". Характер взаимодействий каждого из указанных белков с районом 315-373, однако, несколько отличается от характера их взаимодействия с районом "субдоменаП". На зто кояет указывать различие в характере ыечения данных белков при их пришивке к каждому из рассматриваемых районов в отдельности. наблюдаемое при использовании и-меченньх проб (Рис. 6а,дорожки 2, э). Кроме того, этот Феномен иожет указывать на то,что зоны, соответствующие белкам с подвижностями как р58 и рба, скорее всего, является не артеФактом, наблюдаемым при пришивке одного белка, а отдельными белками, связывающимися в пределах одного района РНК.

А. Б.

1 2 3 4 5

2 3 4

. . .

рво

'Л а

Рис. 6. УФ-пришивка белков экстракта из клеток КРебс2 к различным производным 5'-проксимальной части лидерной последовательности. (А). 1 - 315-484; 2 - 378-484; 3 - 315-373; 4- 378-4841 414-427!; 5 - 378-4841*398-448); (Б). 1 - 315-484 (¿398-448); 2- 315-4841 д 414-427), 3 - 315-484; 4 - 315-484 транскрипт, меченный по А; 5 - 315-484(¿414-427) транскрипт, меченный по А. в скобках указаны положения маркеров молекулярного веса.

5. Уточнение локализации участков, необходимых для пришивки

р58-р60. в пределах структуры "субдоиенаП". Для более точного

13

картирования района, отвечавшего за связывание и пришивку р58-рбО в пределах "субдоменаП", на следующем этапе работы был использован выше упомянутый кетол направленного гидролиза транскриптов РНКазой Н. идея использования данного подхода состояла в попытке подучить в результате специфического гидролиза транскрипта 378-484, направляемого двуия разными олигодезоксирибонукпеотидаци, Фрагменты РНК, которые

представляли бы собой различные части последовательности "СУблоыенаП". Поииио набора Фрагментов РНК. образующихся в результате специфического гидролиза РНКазой Н. в данных экспериментах также использовались трзнскрипты, получаемые с зжглчески синтезированных ДНК-дуплексов. такие дуплексы содержали перед заданными участками последовательности 5'-НТР РНК B3UK (378-484 и 393-450) ene и последовательность Т7-проиотога.

Разделение в геле продуктов разрезания гоыогенно р-и-ыеченного транскрипта 378-484 в присутствии двух различных лнк-олигонуклеотидов (кокплеиентарных к последовательности 4Í4-437 и 393-417 5'-НТР РНК БЗШ! позволило наблюдать в каждой случае хорошо воспроизводящиеся наборы зон, специфические по отношении к каждому аз используешх лнк-олигонуилеотшюв. Л'еченаеы исходного транскрипта отдельно по каждому из концов (fP-Фосйатом - по 5'- концу или ^Р-шшшш-б'. 3'-лисосФатом -по 3'-концу РНК! перед гидролизом его РНК-азой н было установлено происхождение всех основных продуктов гидролиза, оказалось, что все зоны, за исключением образующих сашй ншший кластер. являются 5'-концевыми продуктами гидролиза, начинающимися с 378 положения последовательности РНК БЗШ. Нижний же кластер состоял из зон,соответствующих 3'-концевым продуктам специфического гидролиза, но мог быть частично представлен также и продуктами неспедиФической деградации более высокомолекулярных Фрагментов РНК, что учитывалось при интерпретации результатов эксперимента.

Нуклеотидную последовательность каждого конкретного Фрагмента гидролиза ид е нтифипиро вали путем сравнения его подвижности в геле с маркерами - продуктами знзиматической (рибонуклеазной) сиквенспой реакции на исходной РНК.Причем отдельное сравнение проводили для 5'- и З'-конпевых продуктов гидролиза, используя лля сиквенса исходную РНК. меченую по 5J-14

или по Э'-конпу соответственно.

Основные (мажорные) Фрагменты РНК. нуклеотилную последовательность концов которых сиоглн илентиФипировать с точностью до 1-2 нуклеотнлов. были очищены в геле, после чего эквиыолярные количества этих Фрагментов. а также тоанскриптов 378-484 и 393-450. били взята в опыт для сравнения их относительной способности прививать изучаемые белки в экстрактах из К®ебс2 клеток.

Полученные в данной серии экспериментов результаты свидетельствуют о том. что: а), последовательность 414-427 необходима для эффективное пришивки обоих полипептидов - Р58 и Р60 в пределах района "субдоменаП". это согласовывалось с ранее полученными данными (см. раздел 4). Действительно. 5'-конпевые продуты гидролиза, начинавшиеся с 378 положения последовательности 5'-НТР н включавшие ее участки приблизительно до 417 или 421 положений (см. рис. 1). не обнаруживали отчетливой пришивки изучаемых белков в то время, как другие, более длинные 5'-конпевые Фрагменты, с З'-конпами в районе положений 428-430 и 431-433 нуклеотидной

последовательности. уже обладали значительно большей способностью припивать белки Р58-Р60. хотя все-таки заметно меньшей, чем исходный транскюипт 378-484.

б). последовательность 414-436. Фориируюпая верхнюю ипильку "СУблоыенаП" и всю большую боковую петлю этой структуры. сама по себе оказывается недостаточной для Формирования полнопенного элемента, отвечавшего за специфическую пришивку р58-р60. в), фрагмент 414(115-484 (см.рис. 1!. являющийся 3'-конпевыа продуктом альтернативного гидролиза транскрипта 378-484 РНКазой н (направляемого шк-олигонуклеотилон. комплементарным последовательности 393-417), оказывается абсолютно не активный в отноиении прививки р58-р60. этот результат хорошо согласуется с выводом о неспособности района 414-436 самостоятельно Формировать участок эффективной пришивки белков, а также указывает на то, что нуклеотилная последовательность правой (нисходяшей) ветви дуплекса "субяоменаП" (си. рис1) такяе не существенна для обеспечения пришивки белков р58-р60. г), фрагмент 378-432(^1). имеюшнй. в отличии от Фрагмента 378-429(11). несколько дополнительных нуклеотидов на 3'-конпе. обладал заметно большей способностью пришивать р58-р60 по сравнению с последним, но все-таки уступал

15

в этой отношении последовательности 393-450. целиком представлявшей "субдоиенП".

таким образом, необходимым:! элементами одного из участков связывания и пришивки р58-р60, локализуемого в пределах последовательности "сублоыена1I". оказываются:

последовательность 414-42?, Формирующая терминальную шпилечную структуру "сублоыенаП", левая (восходяпая) ветвь его основного луплекса и. вероятно, также однотяжевой участок боковой петли, образуемой в структуре данного "субдоыена" правой (нисходяшей) ветвью дуплекса. Однако, ни один из перечисленных элементов. не является достаточным для Формирования сайта приеивки данных белков. Эти выводы, таким образои, супественно дополняют сушествуюше представления об элементак структуры "субдокена П". определяющих пришивку белков р58 и роо.

6. Делении_в_последовательности,_Форщрувией

'субдоыен!У*. сказываются на эффективности связывания р58-р60 с соответствшшш конструкциями. В ланной части работы было обнаружено,что деления Фрагмента последовательности 701-763 приводит к стабильно воспроизводимому специфическому ослаблению на радиоавтографах зон двуя белков - р58 и рбО. которое ыокно было количественно оценить как двух-трех кратное (Рис. 7а. дорожки 1.3). в случае лелепии ыенызего по размеру участка 707723 также наблюдался отрицательный эФФект на эффективность пршивки белков, но заметно меньший, чей в случае делении 701763 (Рис. 7а, дорожки 1,2). Деления в районе "сублоиенап I" вторичной структуры лилерной последовательности, охватывающая нуклеотилы 485-647 и удаляющая больную часть структуры этого пис-элемента (си. рис1). олнако. абсолютно не сказывалась на интенсивности упомянутых зон, что свидетельстовало о специфической характере наблюдаемого гФФекта. для Фрагмента 315-484. лишенного рассматриваемого района вообше. наблюдался, в соответствии с ожидаемым, тот же эФФект ослабления пришивки белков, что и для конструкции с наибольшим размером лелепии в "субломене!У" (Рис. 76.дорожка 3!.

специальные эксперименты показали. что способность упомянутых делепионных вариантов 5'-НТР пришивать р58-р60 прямо коррелирует с их способностью конкурировать за зти белки в экстрактах и специфически ослаблять пришивку р58-р60 к меченому трэнскрипту 315-837. следовательно. Феномен ослабления пришивки 16

отражает снижение именно обшей • эффективности связывания упомянутых белков соответствующими произйолными 5'-НТР РНК ВЭМК. Таким образом, из приведенных выше экспериментальных данных следует, что на специфическое взаимодействие меточных белков р58-р60 с 5 *-НТР РНК ВЭШ может оказывать влияние также район, весьма удаленный от основных сайтов связывания белков по первичной структуре РНК.

р60 <рЗЗ

о60 <р58 -р52

А. 5.

Рис. 7 з«Фект делепий в районе "сублсыена^" вторичной структуры 5J-НТР на эффективность пришивки белков р58-р60 к соответствующим и-меченныи транскриптаи. (А). 1 - 315-837; 2 - 315-837(¿701-723) 3 - 315-837 <а701 - 763! ; (Б). 1 - 315-837; 2 - 315-837(4485-647); 3 - 315-484:

7. Делении в районе "субдоненаП* 5'-НТР. нарушавшие прививку Р58-Р60. приводят к нарушения инициации Трансляции РНК. С целью выяснения зависимости инипиаторноп Функции 5*-НТР РНК ВЭМК от его способности пришивать специфические белки экстракта ?58-рб0. различные производные лилерной последовательности, соединенные с нолирувшей частью

репортегного гена гвпкуронидазы (GUS). были протранслированы в бесклеточной системе трансляции из клеток аспитноа карциномы Кребс2. Удаление района 4Í4-427, нарушавшее нативнув структуру "субдокенаП". приводило к сушественноыу снижении трансляиионноП эффективности ыутантных РНК. опениваеиоиу по сравнению с исходной конструкцией (рТЕЗ! как пятидесяти кратное (Рис. 8а, лорояки 8-10). характерно, что полное удаление последовательности "субдоиенаП" (деления 3S8-448, см. рис. 1) приводило *к дополнительному ( всего 20-25 - кратному) палению трансляционной способности РНК (Рис. 8а,дорожки 1-3). Полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что последовательность 398-448 Формирует еие один, ранее не известный, пис-элемент в составе 1EES РНК ВЭМК.

Причем лаже часть данного элемента, оставшаяся после удаления последовательности 414-427. обладает остаточной способностью стимулировать трансляцию т VI1го. это может об'ясняться тем, что для осуществления 1КЕ2-Функпии важна структура или сама последовательность нижней части "субломенаП".

* 2 5 4 !>

Г а S «

-GUS

6.

/ 2

-gus

Рис. 8. сравнение трансляционной эффективности трэнскриптов. содержащих различные производные 5'-нетранслируеыого района РНК вируса ЭМК. соединенные с кодирующей последовательностью гена Б-ГЛЮКУРОНИЛазы (GUS). (AI. 1-3 - 315(¿398-448!-GUS; 4-6 -

315-GUS; 7 - трансляпия без добавления экзогенной РНК; 8-10 -315<л 414-427)-GUS."Трансляционные пробы (25мкл) содержали 0.25мкг (1,4,8), 0.5 нкг (2,5.9) и 1мкг (3.6.10) каждого транскрипта. (Б). 1 - 315-GUS; 2 - 378-GUS; пробы (25мкл)

содержали по О. 5мкг РНК.

Интересно, что у Фрагмента 315-484 5'-НТР по сравнению с более коротким Фрагментом 376-484 наблюдалась значительно большая способность к конкурентному ингибированию трансляции РНК Э15-сиз. Этот Феномен говорит о более эффективном связывании зтим Фрагментом Фактора или Факторов, вовлеченных в механизм внутренней инициации трансляции РНК ЕЗМК.

Трансляционная эффективность конструкции рТЕЗ-сиэ.содержащей на 5'-конце последовательность 315-377, прямо коррелировала со способностью ее укороченного ШпсИП-производного более эффективно конкурировать за необходимые для трансляции РНК ВЭЫК клеточные транс-Факторы по сравнению с

соответствующий производным рТЕ17. хотя и превышала трансляшюннув эффективность PTE17-GUS не более, чем в 1.5-2 раза (Рис. 8б).

ЭФФект деления в районе "сублоыенаП" на трансляционную способность укороченной (РТЕ17) конструкпии почти полностью повторял эФФект соответствующих делений на эффективность трансляпии исходной (рХЕЗ) конструкции, это указывало на отсутствие стимулируюзего эФФекта данного иис-элемента IRES (315-377) на конструкпии с. нарушенной структурой

"сУблоиенаП".

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о наличии пряьюй корреляции между нарушением способности важных пис-элементов 1hes. обнаруженных в 5'-пРоксииальноы районе лапесной последовательности, спепиФически связывать клеточеные белки р58 - P6G и утратой этими пис-эпенентаии способности стимулировать трансляцию рнк взмклл vitro, это указывает на возможное участие указанных белков в механизме Функционирования данных нис-зле&ентоЕ ires.

Чтобы проверить не являются ли наблюдаемые эФФекты хотя бы отчасти результатом различий в стабильности исходных и ыутантных конструкций. был проведен сравнительный анализ стабильности соответствующих трэнскриптов в бесклеточной системе на основе Кребсг-экстрактор, трансксипты. несупие лелепии в районе 'СУблоиенаП". равно как и интактные транскгипты оказались достаточно устойчивыми к обшей нуклеазной легралапии. Достоверных различий в степени деградации этих трэнскриптов в разные моменты времени (20'. 40'.60') обнаружить не удалось, что делает невозможным об'яснение результатов различиями в стабильности указанных трэнскриптов.

Для окончательного подтверждения того, что трансляционные нарушения нутэнтных конструкций вызваны нарушениями именно на сталии ишшиапни трансляции, был проведен специальный этап исследования. основанный на методе получения 48S преинипиаторного комплекса в тоа же рабочей бесклеточной системе, но при замещении GTF-компонента его нерасшепляемны аналогом GHP-FHP (гуанилил-имилолиФосФатом). Результаты показали, что способность указанных тоанскриптсв образовывать 48Б-преинипиаторный комплекс, в нелои. коррелирует со способностью соответствующих РНК транслироваться в бесклеточной системе и, таким образоы. позволили заключить, что делении в

19

районе "субдоыенаП" сказывается па способности 5*-НТР РНК БЭМК инициировать трансляцию. снижая эффективность образования 48S-прешншиаторного комплекса,

в связи с обнаружением сткьшшругзшего влияния на иншшаншэ трансляции пне-элементов, расположенных в пределах района 315484 ikes РНК ЕЗЖ, весьма интересам представляется тот Сакт,что указанный район способен стимулировать внутреннюю инициацию трансляции даже в Форме РИК-Фрагиента. ковалентно не связанного с остальной частью ЗВЕЗ-элемеита (Фрагментом 485-836).Об этом свидательствует его способность к транс-кошлементашш ла vJ /гонизкой трансляционной способности транскрипта 485-5US.

БКЕОДЫ:

1. в дитоплазштнческом экстракте из клеток аспитной карпинош шязей (КРебс2) впервые обнаружен белковый ©актор "р5в", не являющийся одним из известных Факторов шшпнашш трансляции. который специфически связывается с 5'-нетранслируешш районом ГНК вируса энаеФалоннокардита.

2. "Р58" представлен не единственным, а четырым отдельный! полипептиламн с близкими молекулярными массаш и очень схолнмш свойствами. каждый из которых способен самостоятельно связываться с определенными нуклеотшзшйш последовательностям РНК.

3. Белки f58 и f60. компонента "р58", могут взаимодействовать независимо с двумя разными участками в пределах последовательности 315-484 5'-нетранслируемого района РНК вэык. один из которых представлен элементом вторичной структуы. обозначаемым как "субдоменП". а другой локализуется в районе 315-373 нуклестилной последовательности 5'-HTF.

4. выявлено несколько элементов в составе самой структуры "субдоменаП". каждый из которых является необходимые.но не достаточным для обеспечения специфической пришивки двух белков Р58 И Р60.

5. Б обшую эффективность связывания белков Р58-Р60 с нуклеотшшой последовательностью 5'-HTF могут вносить вклад также участки лидерной последовательности, расположенные за сотни нуклеотилов от обоих сайтов связывания и пришивки данных белков до первичной структуре РНК и представляющие собой Функционально-важные области IKES.

6. Показано.что сайты связывания Р58-Р60 в пределах Фрагмента 315-484 последовательности 5'-нетранслируеыого района одновременно являются ранее не известными пис-элементами IRES. при делении которых существенно снижается эффективность внутренней инипиапии трансляции РНК ВЭИК. Это указывает на возможное участие клеточных Факторов р58-р60 в обеспечении механизма внутренней инипиапии трансляпии РНК БЗИК.

список работ опубликованных по теме диссертапии :

1. a. V. EorovJaßln. a. G. Evstafleva. T. Yu. usarova and I.N. ShatsKy, " a factor that specifically binds to the 5'-untranslated resion of encephalomyocarditls virus SUA, 1990. FEES LETT. Vol 261. N 2. 237-240.

2. I.H. ShatsKy. a. v. Eorovjasin, a. G. Evstafleva. T. Yu. usarova. T.V. Pestova, "internal initiation of translation in eucaryotes: kna-rna. protein-bna interactions within the initiation resion of ehcv kna. "Fost-transcriptlonai control of gene expression", Goslar (West Germany) conference, lsso.

3. A. V. Borovjafiln, H. V. EzroKhl. V.«. Rostapshov. T. Yu. usarova. T.f. Bystrova and I.H ShatsKy. "RHA-proteln interactions within the internal translation initiation resion of encephalomyocarditls virus ENA", 1991. Nucleic Acids Research, vol. ig, H 18, 4999-5005.

4. I.N ShatsKy, A. V. Eorovjasin. H. VE2roKhl. "Organization of the internal ribosome entry site of encephalomyocarditls virus RNA", international conference "Protein biosynthesis", r. nymHHO. 1991.